Técnicas generales

en Microbiología
Microbiología y parasitología
CONTENIDO
1. Objetivos
Objetivos generales
Objetivos específicos
2. Procesamiento de muestras microbiológicas

3. Tipos de muestras microbiológicas

4. Técnicas de siembra

5. Tinciones específicas en Microbiología

6. Técnicas actuales de identificación de microorganismos

Pruebas bioquímicas
Sistemas comerciales y galerías multiprueba
Espectrometría de masas MALDI TOF
Pruebas moleculares
Diagnóstico serológico de infecciones microbianas
7. Bibliografía
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Objetivos En la petición de coprocultivo, es importante

que se refleje cualquier hecho ambiental,
viaje al extranjero, antecedentes familiares de
Objetivos generales parasitosis, etc. Se debe reflejar de forma explícita
la investigación de C. difficile, C. perfringens, S.
• Presentar los aspectos generales referentes al
aureus, C. jejuni y Y. pestis.
procesamiento de las muestras.
• Iniciar al alumno en los conocimientos La muestra fecal debe contener al menos 50 gr de
consecuentes a la fase preanalítica y el comienzo esta para su correcto procesamiento (Figura 1). El
de la fase analítica del diagnóstico microbiológico. aspirado duodenal es empleado para la detección
• Comprender que la calidad y las condiciones de de Giardia intestinalis, Strongyloides stercolaris y
transporte de la muestra son esenciales para el Ascaris lumbricoides (3).
correcto diagnóstico.

Objetivos específicos
• Identificar los distintos tipos de muestra que es
posible encontrar en el Laboratorio de Microbiología.
• Conocer las técnicas de siembra y las principales
tinciones específicas en Microbiología.
• Presentar las actuales técnicas en la identificación
de microorganismos bacterianos.

Procesamiento de muestras
microbiológicas
El procesamiento se inicia desde el momento en el que
se obtiene la muestra, se aísla e identifica el agente
causal, obteniéndose de este modo el diagnóstico
etiológico de la enfermedad infecciosa. Algunos
microorganismos no son susceptibles de ser aislados,
por lo que el diagnóstico debe establecerse mediante Figura 1. Muestra fecal. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Stool_transport.JPG.
otros procedimientos. En cualquier caso, los resultados
del diagnóstico dependerán en gran medida de la calidad
y las condiciones de transporte de la muestra (2). -- Exudado rectal
En general se desaconseja este tipo de muestra,
Tipos de muestras aunque se puede recurrir a ella si no se puede
disponer de heces, como en neonatos o adultos
microbiológicas debilitados. Es eficaz en el aislamiento de
N. gonorrhoeae, Campylobacter spp., Shigella
A continuación se describen los diferentes tipos de spp., C. difficile, HSV y en portadores anales
muestras que pueden ser tomados para un análisis de S. pyogenes. No es útil para la búsqueda de
microbiológico, clasificados de acuerdo con el área de antígenos (3) (Figura 2).
toma de la muestra:

• Exudados del tracto gastrointestinal

-- Coprocultivos
Conjunto de técnicas de cultivo de la materia fecal,
encaminadas a la identificación de la mayoría de
los enteropatógenos que cursan con enfermedad
gastrointestinal (ya sean bacterias coliformes
o enteroparásitos, la mayoría producidas por
protozoarios o helmintos). La materia fecal
debe estar libre de contaminantes como papel
higiénico u orina. La indicación para que se
realice este tipo de estudio debe tener en cuenta
las características del cuadro clínico que el
paciente padezca (diarreas agudas, persistentes o
Figura 2. Exudado rectal. Fuente: https://pixnio.com/es/ciencia/
recurrentes, con causa desconocida o asociadas imagenes-microscopia/gonorrea-neisseria-gonorrhoeae/histopatologia-
al consumo de tratamientos antibióticos). aguda-caso-gonococica-uretritis-gramo-mancha-la-tecnica
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• Exudados del tracto genital • Exudados oculares

-- Exudado vaginal -- Frotis conjuntival
Se utiliza para conocer la etiología en casos de Sirve para el diagnóstico de conjuntivitis
pacientes con vaginosis bacteriana, vaginitis de etiología bacteriana. Para detección de
(inflamación de la vagina) o candidiasis Chlamydia trachomatis, entre otros. Las muestras
vulvovaginal. En embarazadas, se utiliza para preoperatorias no son de gran utilidad, ya que la
saber si la madre es portadora de S. agalactiae, microbiota de la conjuntiva varía diariamente (3).
en cuyo caso, deberá seguir un tratamiento
antibiótico. La muestra en suero fisiológico se • Líquido cefalorraquídeo (LCR)
destinará para el cultivo de Trichomonas vaginalis Es esencial que tanto los materiales para la obtención
(Figura 3). Otro tipo de muestra relacionada es el como para la recolección de la muestra estén
exudado uretral en el aparato genital masculino, totalmente estériles para evitar falsos positivos.
debe ser recogida preferentemente antes de la El LCR puede obtenerse mediante punción sobre
primera micción de la mañana. Se suele prescribir la zona lumbar o mediante reservorio Ommaya. Es
en caso de sospecha de gonorrea y C. trachomatis. suficiente 1 ml. Debe enviarse inmediatamente al
(Figura 4) Cuando se sospeche de C. trachomatis, laboratorio, debido a que agentes etiológicos como
M. hominis, U. urealyticum o N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae, pueden lisarse rápidamente. Si no
debe obtenerse muestra endocervical, ya que el es posible su estudio inmediato, se mantendrá en
exudado vaginal no es la localización habitual de estufa de 35-37º C, y una parte se incubará en un
la infección. El exudado endocervical se emplea frasco de hemocultivo. Nunca debe refrigerarse. En
en casos de sospecha de cervicitis (inflamación caso de sospecha de meningitis se tomará además,
del cuello uterino) (3). frasco de hemocultivo (3) (Figura 5).

Figura 3. Muestra en suero fisiológico. Fuente: https://commons.

wikimedia.org/wiki/File:ClueCell_de_vaginose_%C3%A0_Gardnerella.jpg

Figura 5. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:4_vials_of_

human_cerebrospinal_fluid.jpg

• Exudados del tracto respiratorio

-- Esputo
Se debe obtener tras una expectoración profunda,
preferentemente durante la mañana al despertarse.
De no producirse expectoración espontánea,
puede inducirse. Se obtienen 3 muestras en 3 días
consecutivos (2-10 mL). Las muestras que sólo
contengan saliva no deben ser aceptadas para su
estudio (3).

Figura 4. Fuente: https://pixnio.com/es/ciencia/imagenes-microscopia/

gonorrea-neisseria-gonorrhoeae/uretral-exudado-neisseria-gonorrhoeae-
paciente-gonococica-uretritis
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-- Broncoaspirado (BAS) y aspirado traqueal • Catéteres y drenajes

La aspiración traqueal o endotraqueal es el método La muestra deberá procesarse en un periodo inferior
más simple de obtener secreciones respiratorias a 30 minutos, sino debe almacenarse en nevera (3).
del tracto inferior en pacientes intubados y con
ventilación mecánica. Con frecuencia estas • Urocultivos
muestras son erróneamente denominadas BAS. Se recomienda obtener la primera micción de la
Sin embargo, estas últimas se realizan mediante mañana ya que permite la multiplicación de bacterias
aspiración por broncoaspirado selectivo (3). durante la noche. Se desechan los primeros 20-25
mL, y se recoge el resto sin interrumpir la micción
-- Lavado broncoalveolar (BAL) (3) (Figura 8).
Para obtener la muestra se instala el broncoscopio
en el bronquio, y se añaden volúmenes variables
de suero fisiológico estéril. Después se hace una
aspiración para recuperar el máximo volumen de
líquido, formado por una mezcla del suero fisiológico
y secreción broncoalveolar (3). (Figura 6).

Figura 6. Broncoscopia terapéutica. Fuente: https://commons.

wikimedia.org/wiki/File:Broncoscopia_terapeutica.jpg

• Hemocultivos
Deben obtenerse tres hemocultivos por paciente,
previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo
entre las extracciones debe ser superior a una
hora, aunque cuando exista una gran urgencia para
Figura 8. Uroocultivos. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/
iniciar el tratamiento, puede acortarse a 15 minutos. File:Pyuria2011.JPG
Nunca debe refrigerarse (3) (Figura 7).

Técnicas de siembra
La siembra, en Microbiología, se refiere al acto de
trasladar material biológico a un medio de cultivo que
promueve su crecimiento y multiplicación. El resultado
de este proceso es el cultivo (4).

Existen los siguientes tipos de siembra:

• Primaria: cuando el material se inocula en el medio

por primera vez.
• Secundaria: cuando el material que se inocula
procede de una siembra primaria.

Figura 7. Hemocultivos. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/

File:Bloodculturetubes.JPG
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En cuanto a los métodos de siembra se pueden distinguir La tinta china y la nigrosina no poseen afinidad por
los siguientes: los constituyentes celulares. El azul de metileno
puede adicionarse a preparaciones en fresco de
• Siembra por dilución: se carga un asa de siembra heces para observar leucocitos (Figura 10).
con muestra bacteriológica, y se siembra en un
tubo de ensayo con medio de cultivo.
• Siembra por estría, agotamiento o aislamiento:
la muestra se recoge con el asa de siembra y se
extiende en el medio de cultivo formando varias
estrías. En la última estría, se tienen que obtener
colonias aisladas, a partir de las cuales, se puede
hacer una nueva siembra para obtener cultivos
puros (axénicos) o para identificar directamente la
colonia que nos interese.
• Siembra por extensión o recuento: se extiende con el
asa una cantidad conocida de la muestra. Se utiliza
mucho para recuento de bacterias en urocultivo.
• Siembra por picadura: la muestra se recoge con
una aguja y se introduce en un tubo con medio
semisólido. Se utiliza para estudiar la movilidad de
las bacterias (Figura 9).
Figura 10. Tinciones simples. Fuente: https://commons.wikimedia.org/
wiki/File:Cryptococcus_neoformans.jpg

• Tinciones compuestas o diferenciales: utilizan

varios colorantes combinados. Ejemplo: tinción de
Gram y Ziehl Neelsen. Una variante de la tinción
Ziehl Neelsen, para microorganismos ácido-alcohol
resistentes, es la tinción de Kinyoun, en la que el
reactivo principal es la fucsina fenicada que se une
a la pared celular. A diferencia de la tinción Ziehl
Neelsen, fija el colorante mediante frío, no por calor,
debido a la alta concentración de fenol de la fucsina
fenicada empleada (5). Los microorganismos ácido-
alcohol resistentes toman el color rojo, mientras
que todo lo que no es ácido alcohol resistente se
Figura 9. Fuente: https://pixabay.com/es/photos/agar-caldo-de-cultivo- decolora y se tiñe de azul (4).
rojo-60571/
• Tinciones fluorescentes. DAPI (4',6-diamidino-2-
fenilindol), marcador fluorescente que atraviesa
Tinciones específicas la membrana celular y se une al ADN en células
en Microbiología muertas o apoptóticas. Se observa al microscopio
electrónico. Puede utilizarse para marcar células
La dificultad de identificación de bacterias mediante el vivas, aunque no es lo recomendable, debido a que
microscopio óptico por la falta de contraste hace que hay que utilizar altas concentraciones. Naranja
sea necesaria la utilización de colorantes (5). Teniendo de acridina, para bacterias y hongos. Blanco de
los siguientes tipos de tinción posibles: calcoflúor, tinción auramina-rodamina, utilizada
para visualizar bacilos por microscopía electrónica,
• Examen en fresco: no se utiliza ningún tipo de especialmente del género Mycobacterium o para
colorante. Las muestras se extienden directamente ver ooquistes de Cryptosporidium. (Figura 11).
sobre un portaobjetos. Se puede utilizar agua
destilada (4).
• Tinciones simples: utilizan un solo tipo de colorante.
Ejemplos: tinta china, azul de metileno y azul de
lactofenol. La tinta china y nigrosina se utilizan
para observar células levaduriformes capsuladas,
como Cryptococcus neoformans en LCR, sobre
todo. Es una tinción denominada negativa en
las que se tiñe el medio, pero no las células (5).
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• Pruebas de óxido-fermentación, reducción de

nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, agar hierro
de Kligler, etc. Consiste en pruebas más lentas con
lectura de 18-48 h.
• Pruebas de resistencia a antibacterianos o sustancias.
La bacitracina inhibe el crecimiento a S. pyogenes. O
prueba de β-lactamasa para resistencias.

Sistemas comerciales y galerías

multiprueba
Se trata de placas con pocillos o celdillas individuales que
contienen un sustrato liofilizado, y que permiten realizar
de forma simultánea entre 10 y 50 pruebas bioquímicas.
Las pruebas y las especies están codificadas según la
galería (1,7).
Figura 11. Tinciones simples. Fuente: https://commons.wikimedia.org/
wiki/File:Cryptococcus_neoformans.jpg Espectrometría de masas MALDI TOF
La espectrometría de masas surge como una alternativa
Técnicas actuales rápida y eficaz a los métodos convencionales para la
de identificación identificación de microorganismos. Es un método que
permite la identificación mediante la medición de iones
de microorganismos derivados de moléculas, separándolos en función de su
relación masa/carga (m/z). Los tres componentes básicos
de un espectrómetro de masas son: la fuente de ionización,
Pruebas bioquímicas el analizador de masas y el detector. La espectrometría
A continuación se describen los tipos de pruebas de masas (EM) tiene dos aplicaciones principales: la
bioquímicas que existen: caracterización de proteínas y de ácidos nucleicos. Por sus
siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
• Prueba de la catalasa y oxidasa: lectura inmediata (desorción/ionización por láser asistida por matriz) y TOF
para identificación preliminar. Las bacterias positivas por el analizador Time of Flight (tiempo de vuelo); tiene un
a la prueba de catalasa hidrolizan el peróxido rango de detección de proteínas que oscila entre 2 000-200
de hidrógeno en agua y oxígeno, observándose 000 Da. En primer lugar, se obtiene una colonia aislada a
burbujas en señal de desprendimiento de gas. la que se le aplica una matriz en la placa de identificación
Diferencia a los Staphylococcus (catalasa positiva) multipocillo, específica para MALDI TOF. La identificación se
de Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativo) consigue por la comparación del espectro o perfil proteico
(5). En cuanto a la prueba de la oxidasa, se usa obtenido con la base de datos que ofrece cada casa
papel impregnado con N,N-Dimetil-p-fenilendiamina comercial (9) (Figura 13).
(DMFD). Si la bacteria es positiva, el papel torna a
coger un color púrpura. Las enterobacterias son
oxidasa negativas (Figura 12).

Figura 12. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Catalase.

jpg

• Pruebas del indol, ureasa, galactosidasa, hidrólisis

del hipurato y aminopeptidasas.
Figura 13. Espectometria. Fuente: https://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Espectrometr%C3%ADa_de_masas_MALDI-TOF.png
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Pruebas moleculares gen rpoB

Actualmente, el análisis del ARNr 16S constituye el Corresponde a la subunidad ß de la ARN polimerasa. Las
marcador inicial para establecer estudios filogenéticos ventajas que presenta frente a los otros marcadores son
y taxonómicos de microorganismos. Sin embargo, la sus secuencias, las cuales presentan mayor calidad que
alta homología genética de algunos géneros supone un las obtenidas por ARNr 16S, al ser de reciente obtención.
problema porque no permite diferenciar entre algunas Tiene aplicación en estudios de genotipificación y
especies y/o géneros (8). filogenia (10).

ARNr 16S gen gyrB

Es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs o Subunidad ß de la ADN girasa o topoisomerasa II,
ADN ribosomal ARNr 16S, localizado en la subunidad implicada en la replicación del ADN de bacterias. El
30S del ribosoma. Presenta alto grado de conservación. gen gyrß está presente en monocopia, lo que permite la
Las secuencias de la colección de fragmentos discriminación en especies fuertemente relacionadas.
correspondientes a diferentes bacterias se alinean y se
comparan para calcular los coeficientes de asociación
(8) (Figura 14). Diagnóstico serológico
de infecciones microbianas
Se detectan niveles de anticuerpos contra antígenos
específicos de la bacteria que se sospecha. Algunas
pruebas serológicas, como la detección de anticuerpos
mediante técnicas rápidas de aglutinación (RPR), pueden
ser negativas en las fases iniciales de la infección como
es en el caso de la sífilis primaria (6). Otras técnicas
rápidas, como las de detección de antígeno de Chlamydia
trachomatis o del HSV, han caído en desuso por su baja
sensibilidad.

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