Técnicas básicas en
Biología Molecular
1. Síntesis y amplificación de ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Secuenciación de ADN (método de Sanger).
2. Hibridación de ADN.
Hibridación en soportes sólidos (Blots).
Hibridación masiva (microarreglos).
1. Síntesis y amplificación de ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y variantes.
Secuenciación de ADN (método de Sanger).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Amplificación de un fragmento de ADN situado entre dos
Componentes oligonucleótidos mediante el uso de una ADN polimerasa.
ADN molde (1 – 50 ng). Los oligonucleótidos (primers) son diseñados y
sintetizados químicamente.
Oligonucleótidos (0.5 μM).
dNTP’s (0.2 mM).
Buffer con Mg2+ (0.5 – 2 mM).
ADN Polimerasa (1-5 U).
Termociclador.
Etapas
Desnaturalización:
Se calienta la mezcla a >93°C.
Alineamiento:
Se enfría la mezcla entre 50-60°C para que hibriden los primers.
Pasos adicionales en una PCR
Extensión o elongación: Iniciación
Se calienta la mezcla a 72°C para que la polimerasa replique el ADN. Elongación final
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Diseño de oligonucleótidos
▪ Temperatura de fusión/alineamiento
▪ Contenido de GC
▪ Tamaño
▪ Extremo 3’
▪ Formación de homodímeros
▪ Formación de heterodímeros
Primers degenerados
2x3x2
100 / 12 = 8.3%
Primers degenerados
Aplicaciones
Adición de sitios de corte a los productos de PCR
Método ampliamente usado para clonar
genes o fragmentos de ADN en vectores de
clonación o plásmidos y obtener
moléculas de ADN recombinante.
Actividad en clase.
Diseñar un par de primers (F y R) para amplificar el ORF en la siguiente secuencia.
Insertar un sitio NdeI en el extremo 5’
Inserta el sitio HindIII en el extremo 3’
Después validar la Tm y el contenido de GC en el sitio PCR Biosystems (Tm Calculator) para
ver la compatibilidad.
BamHI
G^GATCC
CCTAG^G
Actividad 2 en clase.
Diseñar un par de primers (F y R) para fusionar el ORF a myc epitope/His Tag.
Debes eliminar el codón de Stop.
Insertar el sitio de corte de EcoRI en el 5’, y ApaI en el 3’.
Algunas variantes de la PCR
https://old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_reaction_introduction.php
https://old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_variation_system.php
qPCR (reacción en cadena de polimerasa cuantitativa)
RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa)
RT-qPCR (reacción en cadena de polimerasa cuantitativa con transcripción inversa)
La PCR cuantitativa permite obtener una
medida cuantitativa de la acumulación del
producto durante los ciclos de una PCR.
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-
center/real-time-pcr-basics/taqman-vs-sybr-chemistry-real-time-pcr.html
Métodos de análisis para ADN
Indirectos
Cambios en la movilidad electroforética
Productos de digestión con enzimas de restricción.
Productos de PCR (amplicones).
Directos
Secuenciación
Métodos de análisis para ADN
Electroforesis de ácidos nucleicos
Técnica para separar fragmentos de
ADN/ARN de acuerdo al tamaño y carga
eléctrica utilizando un campo eléctrico.
La agarosa es una polisacárido
constituido por unidades
repetidas de una molécula
llamada agarobiosa. Este material
se extrae en general de las algas
marinas.
Hay dos soluciones tampón muy usadas para separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis, son el
buffer TBE y buffer TAE, que sólo se diferencian en un compuesto, ácido bórico y ácido acético, respectivamente.
El pH (~8.2 – 8.4 a 25°) es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por completo y éste se
mantenga cargado negativamente.
Secuenciación: método de Sanger
Esta técnica se base en la utilización de terminadores:
moléculas de didesoxinucleótidos que al incorporarse a la
cadena del ADN se detiene la PCR
Adición al azar de moléculas de didesoxinucleótidos.
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
Detección de la fluorescencia emitida por los fluorocromos
Resultado de secuenciación
Electroferograma
2. Hibridación de ADN.
Hibridación en soportes sólidos (Blots):
Southern Blot
Northern Blot.
Hibridación masiva (microarreglos).
Southern blot: ADN
Northern blot: ARN
Western blot: Proteínas
ARN
PROTEINA
ADN
Southern blot
Southern blot
Es una técnica para la detección de fragmentos de
ADN los cuales son separados por electroforesis,
posteriormente son transferidos a un filtro de
celulosa y son hibridados con sondas
complementarias marcadas.
Aplicaciones del Southern blot
Identificación y mapeo de genes dentro de una
mezcla de ADN.
Detección de secuencias específicas dentro del
genoma.
Identificación de número de copias.
Southern blot
Solución alcalina
Northern blot
Northern blot
Es una técnica para la detección de fragmentos de
ARN los cuales son separados por electroforesis,
posteriormente son transferidos a un filtro de celulosa
y son hibridados con sondas complementarias
marcadas.
Es una técnica modificada del Southern Blot.
Aplicaciones del Northern blot
Permite analizar la expresión de genes.
Identifica diferentes tipos de ARN codificicantes.
Northern blot
Western blot
Western blot
Técnica analítica para la detección de proteínas dentro de una muestra biológica.
La especificidad se logra mediante el uso de un anticuerpo que reconoce y se une a un
epítopo único de la proteína de interés.
Permite obtener información sobre la expresión de proteínas.
Uso de marcador de peso molecular
Uso de controles positivo y negativo
Pasos:
1.Preparación de la muestra
2.Electroforesis
3.Transferencia a una membrana
4.Inmunotinción
5.Detección de las bandas
El beta-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores
que rompen sus enlaces sulfuro, y también descomponen
la proteína en una estructura lineal de aminoácidos
primarios.
Es muy difícil saber qué proteína es la de interés, y sería
aún más difícil intentar comparar la cantidad de esa
proteína entre las muestras. Por lo tanto, se usan
anticuerpos específicos para visualizar la proteína
diana.
Microarreglos
▪ Es una tecnología diseñada para estudiar la
expresión de múltiples genes a la vez.
▪ Consiste en colocar miles de secuencias génicas
en un microchip, una muestra con ARN se pone
en contacto con el chip.
▪ El apareamiento de las bases complementarias
entre la muestra y las secuencias de genes en el
chip produce una cantidad de luz que se puede
cuantificar.
▪ Esta técnica permite identificar genes
sobre-expresados y sub-expresados.
