UNIVERSIDAD POLITCNICA SALESIAN INGENIERA EN BIOTECNOLOGA DE LOS RECURSOS NATURALES TRABAJO DE BIOTECNOLOGA VEGETAL Integrantes: Andrea Bravo Omar

Carrasco Jonathan Chacn Sebastin Espinel Dennis Ortiz Fecha: 04/06/2013

PCR (Polymerase Chain Reaction) La reaccin en cadena de la polimerasa permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA. El requisito fundamental es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirn como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucletidos complementarios a la cadena molde. La reaccin en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary Mullis. Su utilidad: resulta ms fcil identificar virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Componentes de la PCR El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde. Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa (taq polimerasa). La reaccin se lleva a cabo en un tampn apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Buffer: como cofactores de la polimerasa se aaden cationes divalentes, generalmente en forma de MgCl2. Ayudan a la especificidad y rendimiento de la reaccin. Iniciadores de la reaccin: Las DNA polimerasas nicamente aaden nucletidos al extremo 3 libre de una doble cadena de DNA. Son necesarios por tanto molculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas molculas son los cebadores o primers de la reaccin que delimitan el fragmento a amplificar. Nucletidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporacin de nucletidos al extremo 3 libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucletidos se aaden en forma de desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs).

PASOS Desnaturalizacin: se deben separar las cadenas de DNA. Temperatura a alrededor de 94C entre 30- 60 segundos.

Hibridacin: descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60C de 30-60 seg. Elongacin o extensin: la enzima polimerasa incorpora nucletidos complementarios a partir del extremo 3 libre de la regin en que han hibridado los cebadores. La temperatura depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa, suele ser de 72C. Los ciclos se repiten de 25 a 45 veces. La estandarizacin del funcionamiento del termociclador es esencial para garantizar la calidad y repetibilidad de los resultados. Los productos de la reaccin se separan por tamao (peso) en un gel de electroforesis. ELECTROFORESIS La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta. Las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de

polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos. Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras.

MICROSATELITES Los microsatlites son regiones hipervariables del genoma que contienen arreglos de secuencias simples en tndem de mono, di, tri, tetra o pentanucletidos que se repiten entre 10 y 100 veces, se cree que pueden estar relacionados con el empaquetamiento y condensacin de ADN en los cromosomas y nos da la medida de los alelos en cada una de las regiones. Los microsatlites se detectan mediante su amplificacin por PCR usando iniciadores especficos de 20 a 30 pb de longitud que hibridan en la regin que flanquea al tandem de repeticiones (microsatlite). Estos marcadores se resuelven por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, mediante tincin con plata o por autoradiografa (en el caso de usar un iniciador marcado radioactivamente). Si se dispone de un secuenciador automtico, se pueden resolver por tamao en este equipo mediante el empleo de un iniciador marcado con un fluorforo, posibilitando un anlisis automatizado. La base gentica del polimorfismo detectado en microsatlites se basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tndem y, consecuentemente, en el tamao del microsatlite amplificado en individuos de una especie.

Pueden ser fuente de error o disminuir la sensibilidad de este como marcadores de eleccin: patrn de mutacin, alelos nulos y homoplasia. RAPDS RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNAs) o ADN polimrfico amplificado Aleatoriamente. La tcnica de RAPD es una variante de PCR que utiliza un solo oligonucletido de 10 pb que hibrida al azar con el ADN en estudio. Para que se genere un fragmento RAPD es necesario que el oligonucletido iniciador hibride en las dos cadenas del ADN en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000 bp) como para permitir la amplificacin. La secuencia del oligonucletido es aleatoria al igual que los sitios de hibridacin en el ADN, por lo tanto la secuencia amplificada es desconocida. El iniciador puede hibridar en distintos sitios del ADN sin necesidad de complementariedad exacta de bases, dado que la PCR se hace con temperaturas de unin del iniciador bajas, generando varios fragmentos que son resueltos mediante electroforesis y posterior tincin. Cada banda del patrn de amplificacin es considerada un locus RAPD, definido por la secuencia del iniciador y el peso molecular. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado debido a mutaciones en el sitio de reconocimiento del iniciador, deleciones, inserciones. Este marcador no permite diferenciar individuos heterozigotas, por lo que es un marcador dominante. BIBLIOGRAFA Prez, Ana (2013). Reaccin en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Extrado el 26/05/2013 desde http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reaccin%20encadendepolimerasa.pdf Levitus, G; Echenique, V; Rubinstein,C ; Hopp, E; Mroginski, L; 2008. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal IIINSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGA AGROPECUARIA ARGENBIO Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa. Extrado el 30/05/2013, Disponible en ibone.unne.edu.ar/novedades/pdf/biotecnologia.pdf. Mendez, A; Bravo, R; Isea, W; Yasmil, Y; Jordana, J. 2005. Los microstelites (STRs), marcadores moleculares de ADN por excelencia para programas de conservacin: Una revisin.