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BIOLOGIA CELULAR MOLECULAR

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PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
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7.1. LOGROS

1. Comprender los fundamentos de la PCR y su utilidad en Biología Molecular

2. Interpretar un corrido electroforético con muestras amplificadas mediante PCR.
3. Conocer los fundamentos básicos de la técnica de PCR.
4. Reconocer las diferentes aplicaciones clínicas de la técnica de PCR

7.2. GLOSARIO

• Amplificación
• Hibridación
• Desnaturalización
• Ciclo

7.3. CONTENIDO

La tecnología de PCR, ideada por Kary Mullis, y desarrollada por un equipo de científicos
de la Corporación Cetus, fue publicada por primera vez el año 1985 en la revista científica
Science y es reconocida como una de las herramientas más poderosas de la Biología Mole-
cular. El Dr. Mullis se hizo acreedor del Premio Nobel en Química 1993 por este aporte.

La reacción en cadena de la polimerasa es un sistema para replicación de ADN que permite

que una secuencia de ADN determinada sea amplificada de modo selectivo varios millones
de veces en unas pocas horas.

En una célula que se encuentra en división activa, la replicación comprende una serie de
reacciones mediadas por enzimas que resulta en una copia fiel del genoma completo. Den-
tro de un único tubo de reacción, la PCR utiliza solo una enzima indispensable, la Taq po-
limerasa, para amplificar una fracción específica del genoma a temperaturas en las cuales
el ADN todavía permanece como cadenas simples.

Durante la replicación del ADN celular, las enzimas primero desenrollan y desnaturalizan la
doble hélice del ADN para generar ADN de simple cadena. Luego, la ARN polimerasa sinte-
tiza un pequeño tramo de ARN complementario a una de las cadenas de ADN al comienzo
del sitio de replicación. Este complejo ADN-ARN sirve de sitio de iniciación para la unión de
la ADN polimerasa, la enzima que produce la cadena complementaria de ADN. Durante la
PCR, se utilizan altas temperaturas para lograr que las moléculas se separen en cadenas
simples. Secuencias de ADN de simple cadena sintéticas de 20 a 30 nucleótidos se utilizan
como iniciadores de la replicación. Dos secuencias de iniciadores diferentes se utilizan para
restringir la región que va a ser amplificada. Un iniciador es un fragmento complementario
a una cadena de ADN al comienzo de la zona de interés; el segundo iniciador es un frag-
mento complementario a la secuencia en el ADN de la cadena opuesta al final de la zona
de interés.
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Cuando se realiza una reacción de PCR, se agrega una pequeña cantidad del ADN de in-
terés a un tubo de ensayo que contiene una solución reguladora con la Taq polimerasa,
los cuatro nucleótidos, los iniciadores y el cofactor de la enzima, cloruro de magnesio. La
mezcla de la reacción es llevada a través de varios ciclos de replicación que consisten en:

Un ciclo de uno a varios minutos a 94-96ºC, durante la cual el ADN se desnaturaliza, y se

separa la doble hélice en las cadenas simples de ADN.

Un ciclo de uno a varios minutos a 50-65ºC durante el cual los iniciadores se unen a sus
secuencias complementarias a cada lado de la secuencia de interés.

Un ciclo de uno a varios minutos a 72ºC, durante el cual la Taq polimerasa se une y extien-
de la cadena complementaria de ADN entre cada iniciador. La clave de este paso es que
esta polimerasa específica puede ser activa a esta temperatura, cualidad que otras polime-
rasas no poseen (las polimerasas presentes en otros organismos se inactivan a altas tem-
peraturas). A medida que la amplificación continúa, la secuencia de ADN que se encuentra
entre los iniciadores se duplica luego de cada ciclo de replicación. Luego de treinta de estos
ciclos, se alcanza un factor de amplificación teórico de mil millones. Luego de la amplifica-
ción, los productos obtenidos, son sometidos a una electroforesis en geles de agarosa.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar

los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (94ºC en algunos momentos) suponen la inmediata
desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas
de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de
los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyro-
coccus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). General-
mente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección
de errores (Pfu, Vent).

7.3.1. APLICACIONES

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mu-
cho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una
enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN
amplificado.

La primera aplicación de esta técnica fue la detección de mutaciones genéticas. La PCR es

un método rápido y eficaz para detectar todo tipo de mutaciones asociadas con enferme-
dades genéticas, inserciones, deleciones y mutaciones puntuales. La distrofia muscular o
enfermedad de Duchenne es un ejemplo de enfermedad genética cuya detección ha sido
muy simplificada por el uso de la PCR.

La PCR también puede utilizarse para detectar la presencia de material genético no desea-
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do, como es el caso de infecciones bacterianas o virales. La sensibilidad de esta técnica es

tan grande que se pueden obtener señales de muestras de ADN parcialmente degradado y
a veces de ADN proveniente de una sola célula.

7.3.2. FUNDAMENTO DE LA TECNICA DE PCR

Se fundamenta en TRES principios:

DESNATURALIZACIÓN (Annealing)
HIBRIDACIÓN (Template)
ELONGACIÓN (Replicación)

Ciclo de amplificación
La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 mi-
nutos, en el cual se activa la Taq polimerasa, en caso de necesitarlo. Posteriormente tiene
tres pasos:

1. Desnaturalización: La desnaturalización por calor (usualmente mayor o igual 90°C)

separa la doble hebra de DNA en dos hebras sencillas rompiendo los enlaces de hidró-
geno que unen a las bases, mientras que los enlaces entre la deoxirribosa y los grupos
fosfato permanecen intactos.
2. Hibridación o Unión del cebador o Templado: El cebador se unirá a su secuencia com-
plementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda
(generalmente entre 55 ºC, 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la re-
gión de la molécula que va a ser amplificada.
3. Extensión de la cadena o elongación o alargamiento: Por último actúa la ADN polime-
rasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del
cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la
temperatura hasta 72ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN poli-
merasa presenta su máximo de actividad, aumentando exponencialmente la cantidad
de fragmentos de ADN en la muestra.

Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la
cadena a la temperatura óptima de la Taq polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar
enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.

Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de veces de-

pendiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30
ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento.

Con esta técnica se tiene un alto rendimiento, muy corta duración del proceso, una es-
pecificidad elevada, aunque se presentan los falsos positivos cuando se baja la Tº y una
capacidad de detección alta pero de muy fácil contaminación; la fidelidad de las copias es
alta si se usa una buena enzima polimerasa.
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Figura 15
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7.4. MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar la técnica se necesitan:

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a
una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nu-
cleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitien-
do iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (no
más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
• Iones de magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algún otro catión divalente. Este es un cofactor de la polimerasa.
• Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas (la más común es la Taq polimera-
sa). También llamado ADN problema.
• ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar.
• Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada paso
del ciclo.
Se prepara una master-mix en un tubo eppendorf que contenga.

Buffer: 2.5 ul X 4 = 10 ul
Primers: 2.5 ul X 4= 10 ul
Taq. pol.: 0.15 X 4 = 0.6 ul
Agua estéril: 17,35 ul X 4 = 69.4 = 70ul

Una vez preparada la master-mix se toman los tubos de reacción y allí se pone 22 ul de
muestra + 2.5 de ADN se cierran los tubos y se llevan al termociclador.
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NOMBRE__________________________
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FECHA__________________ GRUPO____ Programa de Medicina
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NOTA_____

ESTE DESPRENDIBLE LE SERÁ EVALUADO

1. ¿A qué se llama un falso positivo? ¿Cuál cree usted que sea la razón de este resulta-
do?

2. ¿Es posible que también se presente un falso negativo? Explique cuál sería la razón.

3. Haga una lista de las diferentes variantes de esta técnica.

4. De una copia de ADN que se ha sometido a PCR deseo obtener 1.024 copias. Para esto
es preciso realizar

4 CICLOS 8 CICLOS 10 CICLOS 20 CICLOS

5. A la técnica de PCR que usted ha realizado olvidó añadirle Mg++ ¿Qué resultados
obtendrá en la electróforesis?