VERIFICACIONES Y MANTENIMIENTOS EN CABINAS DE FLUJO LAMINAR

Miguel Cantero

INTRODUCCIN
La fabricacin de medicamentos estriles est sujeta a requisitos especiales para minimizar los riesgos de contaminacin microbiana, de partculas y de pirgenos (NCF, 1999). Esta fabricacin debe realizarse en zonas limpias. Las diversas operaciones de preparacin de los componentes, preparacin del producto y llenado deben realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia (EPE, 1992). En nuestro laboratorio farmacutico, la preparacin de componentes se realiza en cabina de flujo laminar vertical, en donde se consigue una concentracin de partculas en el aire controlada (Grado A), tal como se indica en la Tabla 1. En la cabina de flujo laminar, el aire ultrafiltrado hace un barrido total del rea de trabajo ya que se desplaza siguiendo unas lneas de flujo paralelas y a velocidad uniforme con lo cual desplaza a todos los contaminantes. El correcto mantenimiento y control de la cabina de flujo laminar es fundamental para garantizar la ausencia de contaminacin en los componentes utilizados en la preparacin de los medicamentos, y es una parte del programa de Garanta de Calidad de nuestro laboratorio farmacutico (VPP, 1990). Esta cabina est equipada con ventiladores centrfugos de alta eficacia con sistema automtico de regulacin de velocidad. El aire impulsado por estos ventiladores es descargado en una cmara o plnum y a travs del filtro absoluto HEPA (High Efficiency Particulate Air) es filtrado y en rgimen laminar entra en la zona de trabajo, obtenindose el Grado A (NCF, 1999). Las cabinas de flujo laminar vertical (modelos 30/70) proporcionan una extraccin del 30% de volumen de aire y un reciclado del 70%, creando depresin en la zona de trabajo y ofreciendo as elevada proteccin al operador y al medio ambiente, adems de total proteccin al producto. Estas cabinas incorporan filtro absoluto HEPA en la extraccin (Figura 1).

MATERIAL Y MTODOS
En la gua ENAC (1997) se indica que en las cabinas de flujo laminar se debe verificar peridicamente la velocidad del aire, el estado de los filtros y debe realizarse un control microbiolgico de esterilidad del aire. En la Tabla 2 se muestran las verificaciones y mantenimientos peridicos recomendables en una cabina de flujo laminar. Cabina de flujo laminar En nuestra instalacin disponemos de una cabina de flujo laminar vertical AV 30/70 (TELSTAR).
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Figura 1. Funcionamiento de la cabina de flujo laminar AV 30/70

Ensayo de integridad de filtros HEPA El objetivo de este ensayo es demostrar la ausencia de fugas puntuales en el papel filtrante, la estanqueidad de la junta elstica entre el filtro y el marco de

ajuste y del medio filtrante con la estructura del filtro. Para realizar este ensayo se necesita un equipo generador de aerosol y un fotmetro detector (TDA 2G aerosol photometer de ATI). - Con la cabina de flujo laminar funcionando se realiza el siguiente proceso: - Inyectar aerosol a la corriente de aire antes del filtro (plenum) y ajustar la escala del 100 % del fotmetro con este aerosol. - Medir con el fotmetro la concentracin de aerosol despus del filtro. - Medir alrededor de toda la periferia del filtro y rastrear su superficie. Se permite una fuga al 0.01 % de la concentracin antes del filtro. Tambin se conoce este ensayo como la prueba del D.O.P (Dioctilftalato monodispersado), haciendo referencia al producto utilizado para generar un aerosol de tamao de partcula definido. Ensayo de velocidad y uniformidad del aire El objetivo es determinar la velocidad promedio del aire as como el rango de uniformidad a lo largo de toda la zona laminar. Para ello se necesita un anemmetro (EDRA6 100 mm Hd Dual). Con la cabina de flujo laminar funcionando se realiza el siguiente proceso: - Se mide la velocidad en distintos puntos de la superficie de trabajo y se calcula la media aritmtica de los valores obtenidos. - Las medidas se realizan a una distancia aproximada de 15 cm de los filtros. La velocidad media del aire de impulsin deber ser de 0.45 m/s 20 %, y ninguna lectura individual deber diferir en ms del 20% de la velocidad media. Contaje de partculas La finalidad de esta medida es comprobar que se cumple el grado A en la zona de trabajo. Para ello necesitamos un contador de partculas (Met One - 3313 de Pacific Scientific). Con la cabina de flujo laminar funcionando se realiza el siguiente proceso: - Se localizan varios puntos de contaje, y se realizan 3 medidas en cada punto. - Se coloca la sonda del contador en direccin del flujo del aire. El resultado debe ser inferior a 3500 partculas/ m3 para partculas 0.5 mm , y ausencia de partculas para partculas de 5 mm . Ensayo de humo El objetivo es comprobar que la cabina cumple con el requisito de flujo laminar sin que aparezcan

turbulencias en el flujo de aire, protegiendo as el producto, el operario y el ambiente. Para ello se inyecta humo dentro de la cabina, en el exterior de la cabina junto al cristal protector y en el interior de la cabina a unos 5 cm por encima del borde del cristal protector. Debe haber ausencia de turbulencias durante el ensayo, fluyendo el humo de forma laminar. Control microbiolgico del ambiente Se realiza el siguiente procedimiento: - Limpiar todas las superficies internas con un trapo hmedo que no ceda partculas ni fibras y desinfectar la superficie de trabajo con etanol de 70%. - Esterilizar la cabina con la lmpara UV durante 20 minutos con el flujo en marcha. - Disponer 5 placas Petri con medio de cultivo no selectivo (por ejemplo columbia agar sangre) en los extremos y en el centro de la cabina. - Abrir las placas y dejar la tapa superior boca abajo apoyada sobre el borde de la placa sin que cubra el medio de cultivo. Dejar las placas abiertas durante 30 minutos. - Cerrar todas las placas e incubarlas en posicin invertida en estufa de cultivo (Estufa Digitronic de Selecta) a 33 C ( 1 C) durante 72 h. - Hacer el recuento de colonias en cada placa. En el recuento de las placas se permite un crecimiento de 1 ufc por placa o de 5 ufc en la suma de las cinco placas. Eficacia de la lmpara UV Los microorganismos expuestos a radiacin UV sufren un dao en su material gentico debido a un proceso de fotolisis, el cual impide la divisin celular y por tanto el crecimiento de estos microorganismos. La mxima efectividad de la luz UV para conseguir esta accin germicida se ha demostrado que ocurre a 265 nm, esta longitud de onda se encuentra en la regin conocida como Ultravioleta C (200-280 nm). Las lmparas UV de mercurio a baja presin muestran una lnea de emisin a 254 nm, lo cual est bastante prximo al mximo efecto germicida y, adems, muestran un 40 % de conversin elctrica en radiacin UV-C, por lo que se consideran las ms apropiadas para la mayora de aplicaciones convencionales (UV-LTD, 2003). La lmpara UV instalada en nuestra cabina tiene una potencia de 30 W. Para comprobar la eficacia de la luz UV se ha seguido el siguiente procedimiento (Jardiel 2000): Se utilizan dos cepas, una Gran positiva (Staphi-

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lococcus aureus) y una Gran negativa (Escherichia coli). A partir de un cultivo de 16 a 24 h en columbia agar sangre de cada una de las cepas, se realiza una emulsin en agua de peptona tamponada, y mediante patrn de la escala de Mac Farland se aproxima la densidad a 108. Esta opacidad se confirma mediante una lectura de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm en un espectrofotmetro SPECTRONIC (Bausch & Lomb). Una lectura entre 0.1 y 0.2 nos asegura una concentracin aproximada de 108 microorganismos/mL. A partir de esta emulsin, se realizan diluciones decimales para llegar hasta la concentracin de 103 microorganismos/mL. Para cada cepa se preparan dos placas de PCA (Standard Methods Agar), una de ellas se expondr a la luz UV y la otra servir como control. Se toman 100 L de la dilucin anterior y se siembran en la placa de PCA, distribuyndolo de manera uniforme con asa de Drigalsky. A continuacin, dos placas se exponen a la luz UV durante 2 minutos, y las otras dos placas restantes servirn como control para confirmar la correcta concentracin de los microorganismos expuestos. Segn recomendacin de la FAO (1992), las placas de control de la dilucin apropiada deben contener entre 200-250 colonias. Transcurrido el tiempo de exposicin, se cierran las placas y se incuban a 33C ( 1 C) durante 48 h (Estufa Digitronic de Selecta). Tras el tiempo de incubacin, se extraen las placas y se realiza el recuento de las colonias crecidas en cada placa. Se calcula el porcentaje de reduccin que ha supuesto el exponer las placas sembradas a las lmparas UV mediante la siguiente ecuacin:
Porcentaje de reduccin (%) = colonias en placa control - colonias en placa UV x100 colonias en placa control

solucin de CoCl2 0.17 M, se realizaron diluciones a 1/ 2, 1/4 y 1/8 y se comprob que la lectura de absorbancia decreca de forma lineal.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en los diferentes ensayos de verificacin de la cabina AV 30/70 se muestran en la Tabla 3. Los resultados obtenidos en la ltima verificacin anual nos indican que hay ausencia de partculas en el interior de la cabina, corroborando por tanto el Grado A (Tabla 1). Se comprueba adems la ausencia de fugas en el filtro HEPA, as como la correcta velocidad del aire y su laminaridad. En cuanto al control microbiolgico del ambiente, todos los controles mensuales muestran un recuento total inferior a 5 ufc (en las cinco placas). Si el recuento fuera superior, se debera repetir el ensayo para determinar si la contaminacin se debe a un funcionamiento deficiente de la cabina o a una mala ejecucin del ensayo. Los resultados obtenidos en la comprobacin del espectrofotmetro utilizado en el ensayo de eficacia de la lmpara UV son satisfactorios. Por un lado, la escala de longitud de onda est correctamente ajustada ya que el mximo de absorbancia estaba localizado en 510 nm (Figura 2), valor que se encuentra dentro del intervalo

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% Transmitancia

30 20 10 0 460 470 480 490 500 505 510 515 520 530 540 550

Para realizar las medidas de absorbancia se ha utilizado un espectrofotmetro SPECTRONIC 20 (Bausch & Lomb). Este equipo permite trabajar entre 340950 nm mediante un monocromador de red de difraccin de 600 trazos/nm. Tiene una exactitud de la longitud de onda de 2.5 nm, una exactitud en la lectura de 1 nm, y una banda de paso de 20 nm. Para comprobar el ajuste de la escala de longitud de onda se han realizado medidas de % Transmitancia con una solucin de CoCl2 0.17 M entre 495 nm y 535 nm, ajustando el 100% de Tansmitancia con agua destilada. La escala de longitud de onda est perfectamente ajustada cuando la mxima absorbancia est entre 505 y 515 nm. Para comprobar el medidor de lecturas se realizaron medidas en el mximo de absorbancia con una
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Longitud de onda (nm)

Figura 2. Comprobacin del ajuste de la escala de longitud de onda del espectrofotmetro

establecido por el fabricante. Por otra parte, el medidor de lecturas funciona correctamente, pues se observ un comportamiento lineal al realizar diluciones a partir de una solucin 0.17 M de CoCl2 (y = 0.2 x 0.005; r = 0.9996). Estos resultados nos permiten asegurar la fiabilidad de la medida de absorbancia para preparar la suspensin de 108 microorganismos/mL.

GRADO

A B C D

N mximo permitido de partculas/m3 EN REPOSO EN FUNCIONAMIENTO 0.5 mm 5 mm 0.5 mm 5 mm 3500 0 3500 0 3500 0 350000 2000 350000 2000 3500000 20000 3500000 20000 Sin definir Sin definir

Tabla 1. Grados de limpieza del aire segn las Normas de Correcta Fabricacin (NCF)

VERIFICACIN/MANTENIMIENTO Integridad de filtros HEPA Velocidad y uniformidad del aire Contaje de partculas Ensayo de humos Control microbiolgico del ambiente Limpieza de la lmpara UV Eficacia de la lmpara UV Cambio de la lmpara UV

PERIODICIDAD Anualmente Anualmente Anualmente Anualmente Mensualmente Cada 500 h de funcionamiento Cada 6 meses Cada 7500 h de funcionamiento o cuando lo recomiende el

control de eficacia. Sustitucin de los filtros absolutos de impulsin y Cada 3000-4000 extraccin funcionamiento h de

Tabla 2. Verificaciones y mantenimientos peridicos en la cabina de flujo laminar AV 30/70

Ensayo Integridad de filtros HEPA Velocidad y uniformidad del aire 0.01 %

Resultado

Velocidad lenta: 0.32 m/s Velocidad rpida: 0.42 m/s Uniformidad: correcta

Contaje de partculas

0 p/m3 0.5 mm 0 p/m3 5 mm

Ensayo de humos Control microbiolgico del ambiente Eficacia de la lmpara UV

Ausencia de turbulencias < 5 u.f.c. en cinco placas Resultados para la cepa Escherichia coli: Recuento en placa control: 205 ufc Recuento en placa expuesta a UV: 0 ufc Porcentaje de reduccin: 100 % Resultados para la cepa Staphilococcus aureus: Recuento en placa control: 235 ufc Recuento en placa expuesta a UV: 0 ufc Porcentaje de reduccin: 100 %

Tabla 3. Resultados obtenidos en la ltima verificacin de la cabina AV 30/70

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Con respecto a la comprobacin de la eficacia de la luz UV, el recuento de colonias en las placas control estaba de acuerdo con la recomendacin de la FAO (1992). El porcentaje de reduccin observado en las placas expuestas a la luz UV fue del 100 % tanto para la cepa de Escherichia coli como para la cepa de Staphilococcus aureus (Figura 3). El resultado es conforme a la indicacin de la FAO (1992), segn la cual este porcentaje debe ser del 99%, y slo cuando sea menor del 80% debe ser reemplazada la lmpara UV. Podemos concluir por tanto, que los resultados obtenidos son aceptables y que el trabajo en la cabina de flujo laminar se realiza en condiciones de esterili-

BIBLIOGRAFA
ENAC; Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos. G-ENAC-04. Rev 2; 1997. EPE. Elaboracin de Productos Estriles. Asociacin espaola de farmacuticos de la industria. 1992. FAO 1992. Manuales para el control de calidad de los alimentos 12. La garanta de calidad en el laboratorio microbiolgico de control de los alimentos. Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin. Italia. 1992. Jardiel E, Sanchis V, Allaert C. Validacin, verificacin y mantenimiento de las estufas de incubacin y de las cabinas de flujo laminar en un laboratorio de microbiologa de aguas y alimentos. Alimentaria, Enero-Febrero: 29-54, 2000. MIF: Manual de Instrucciones y Funcionamiento de Cabinas Estriles por Flujo Laminar Vertical. TELSTAR 1998. NCF. Normas de Correcta Fabricacin: medicamentos de uso humano y medicamentos veterinarios. Normas sobre medicamentos de la Unin Europea, Vol. 4. Comisin Europea. Direccin General III; 1999. UV-LTD. UV Disinfection. UV Light Technology Limited. 2003. VPP. Validacin de Campanas de Flujo Laminar. En: Validacin de Procesos de Produccin. Asociacin espaola de farmacuticos de la industria. 1990.

Figura 3. Recuento de colonias en el ensayo de eficacia de la lmpara UV

Miguel Cantero Centro Andaluz de Diagnstico PET. Sevilla.

dad. El establecimiento de un Programa de Verificaciones y Mantenimientos en nuestra cabina de flujo laminar nos permitir introducir medidas correctoras cuando exista una disconformidad en alguno de los ensayos y de esta forma mantener las condiciones de esterilidad en la cabina.

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