Microscopa

(Iluminacin de Khler)
Las micro tcnicas incluyen el uso de microscopio de luz para visualizar imgenes de preparaciones de tejidos cortados. Es imperativo por tanto, que el estudiante as como el cientfico experimentado entender los principios bsicos de los microscopios pticos en vez de ver claramente las estructuras morfolgicas ocultas dentro de las clulas y tejidos. Es ms importante que uno se familiarizarse con los principales componentes del microscopio y con las tcnicas ms utilizadas habitualmente en microscopa ptica. Amplificadores y microscopios Cuando una lente ptica se usa para incrementar la imagen de un objeto nos referimos a un amplificador. Cualquier amplificador incrementa el tamao aparente de un objeto incrementando la imagen del objeto en la retina del ojo. Generalmente el tamao de la imagen retinal est limitada a cuan cerca puede ser emplazado un objeto visto con un solo ojo. En la prctica este ha sido estandarizado en 25 cm se ha llamado distancia de distincin de visin. Como un objeto es trado desde infinitamente cerca al ojo, el ngulo entre una lnea horizontal y la altura del objeto (ngulo visual) se ve incrementado. Esta amplificacin podemos decir que es proporcional al ngulo sostenido del objeto y Normal. Un ngulo sostenido de menos de 1 no puede ser visto por el ojo; entonces para ver dicho objeto el ngulo debe ser incrementado. En la actualidad, y saltndonos la historia de los microscopios compuestos, podemos decir que consiste en dos componentes pticos (por ello el trmino compuesto): el sistema de lentes objetivo, que tiene una distancia focal muy corta y est emplazado muy cerca del objeto; y el ocular, que tiene mayor longitud de distancia focal, menor amplificacin, y que proyecta la imagen ms all, sobre la retina del ojo. Las lentes del objetivo proyectan una imagen real (la imagen intermedia) del objeto hacia arriba en el cuerpo del microscopio sobre el plano de la imagen del objetivo conjugado imagen primaria. La distancia desde el plano focal anterior del objetivo al primer plano de la imagen dentro del cuerpo del microscopio se refiere a la longitud ptica del tubo. Dependiendo del tipo de microscopio y del ocular, el plano de imagen primaria debe estar dentro del cuerpo del microscopio o dentro del ocular. Las lentes del objetivo forman una imagen real en el cuerpo del microscopio que acta como el objeto para la lente ocular. El ocular en cambio acta como un amplificador simple para formar una gran imagen virtual a la distancia en la que el ojo puede distinguir de la mejor manera (25 cm). Finalmente, la imagen virtual se convierte en objeto para el ojo y es proyectada como una imagen real sobre la retina. Desde que las lentes objetivo y ocular actan en serie, la amplificacin total de un microscopio compuesto es funcin de la amplificacin del objetivo multiplicdo por la amplificacin del ocular. Podra ser posible tener cualquier combinacin de objetivo y ocular. Sin embargo, es ms eficiente incrementar la amplificacin incrementando la amplificacin de la lente objetivo (y esto incrementa la apertura numrica, NA) en vez de los oculares. Desde que la amplificacin del sistema se centra en los oculares la amplificacin objetiva, la amplificacin de la imagen total ser el mismo pero la resolucin se aumentar cuando se usan una amplificacin alta y el objetivo de la apertura numrica alta con un ocular de amplificacin bajo. La ventaja de tener sistemas compuestos de lentes en oposicin a los amplificadores simples que es que se puede llegar a una mayor amplificacin con dos lentes en vez de con una. Para lograr grandes

amplificaciones con un amplificador de lentes simple, las lentes mismas deben estar emplazadas muy cerca del ojo para incrementar el ngulo de visin, trabajando slo de una manera. La mayora de microscopios tienen una pieza giratoria, el revlver sobre el que hay montados distintos objetivos con diferentes amplificaciones. Mientras que el punto focal frontal de los objetivos vara, la longitud del tubo ptico debera variar para mantener la imagen enfocada. Esto es, los microscopios estn diseados para mantener el foco cuando cambian de un objetivo con una potencia a otro con una distancia fsica fija entre el objeto y el primer plano de imagen. esta distancia total igua a la distancia parafocal (Distancia entre la parte superior de la lente y el plano de la muestra). ms la distancia m ecnica del tubola distancia entre el objetivo sobre el plano primario de la imagen. La mayora de los microscopios han sido estandarizados a una longitud mecnica del tubo de 160 mm (170 mm en Europa). pticas de correccin infinita. Los diseadores de microscopios han adoptado diferentes diseos en las pticas de los microscopios que llaman correccin infinita. En estos diseos, los objetivos no forman una imagen real pero tienen una longitud de tubo ptico infinita. Con estas lentes se requiere una lente formadora de imagen en el tubo del microscopio (emplazado en diferentes posiciones pticas en diferentes modelos de microscopios) que convergen los rayos del objetivo sobre el primer plano de imagen. Una ventaja de este diseo es que se pueden aadir componentes pticos como filtros polarizadores, variadores de amplificacin, y otros complementos que hacen converger los haces de luz de forma conveniente. El segundo sistema de componentes del microscopio, el ocular, acta como un amplificador simple de la imagen intermedia. Las lentes del ocular amplifican la imagen intermedia y crean una mayor, imagen virtual que aparece sobre el ojo y que yace ms all del plano del espcimen a la distancia en la que se puede distinguir con la visin. Iluminacin Khler Aspectos prcticos La funcin de la iluminacin Khler es iluminar un espcimen con un campo uniforme de luz que sea del mismo dimetro que el rea de captura del objetivo. Una imagen del campo diafragma se enfoca por la lente condensadora sobre el plano del espcimen, iluminando de esta manera con un cono slido de luz homognea. El ajuste del campo iris limita el dimetro del cono de luz de manera que slo el campo de visin (y no ms) de cualquier lente objetivo dada sea iluminada. Iluminando slo el campo de visin disminuye la degradacin de luz por dispersin. La iluminacin Khler es un prerrequisito para todos los otros mtodos de visualizacin.

Pasos para el ajuste de iluminacin Khler:

1.- Enfoca el espcimen. 2.- Con el diafragma completamente cerrado localizado lo ms cerca del origen de luz (campo iris) de manera que puedas ver los lmites del diafragma. 3.- Trae los mrgenes del campo iris a enfoque aumentando o disminuyendo el enfoque con la rueda del condensador. Tanto el espcimen como el iris deben estar en foco. 4.- Centra la imagen del campo iris usando las ruedas de condensador-centrador.

5.- Abre el centrado y enfoca el campo iriso de maneras que los mrgenes del campo iris estn ms all del campo de visin. 6.- Ajusta el condensador iris para incrementar o disminuir el contraste de la imagen. La apertura ptima depende del espcimen. Nunca uses esta apertura para controlar la intensidad de luz. 7.- Ajusta la intensidad de luz con el potencimetro o con filtros de densidad neutra (para fotografa en color). En un microscopio con un ajuste Khler adecuado, el contraste del espcimen se obtiene ajustando el condensador del diafragma. La intensidad de iluminacin se vara ajustando el voltaje de la fuente luminosa o poniendo filtros de densidad neutra frente al iluminador. Obtencin de medidas microscpicas La obtencin de medidas espaciales (longitud, altura, rea, etc.) de objetos microscpicos es conocida como morfometras. Existen varios mtodos por los cuales pueden ser medidos los objetos, con el mtodo ms comn ahora usando adquiridores y procesadores de imagen. En este caso, una imagen de un espcimen es digitalizada y guardada como un archivo de ordenador usando tcnicas estndar. Como consecuencia, o simultneamente, la imagen puede ser calibrada espacialmente, y, con el uso de herramientas de procesado de imagen, el o los objetos en cuestin pueden ser medidos. Un paso crtico en este y otros procedimientos de medicin es la calibracin espacial. Para precisar la calibracin se usa un porta microscopio especial. Este porta tiene una regla calibrada con una medida conocida (frecuentemente) 2 mm, con esta graduacin de 0.1 y 0.01 mm. El estado del micrmetro se visualiza a travs del microscopio para calibrar el micrmetro ocular (medido contra la imagen del micrmetro) y teniendo el programa calculado el nmero de pixeles por unidad conocida. La calibracin espacial de la imagen debe ser analizada usando morfometras simples. Los anlisis complejos tales como el recuento de partculas y determinacin de volmenes requieren tcnicas ms sofisticadas de estereologa.