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Aislamiento de cepas de Rhizobium spp., asociados a dos leguminosas forrajeras.

Artculo Original

Aislamiento de cepas de Rhizobium spp., asociados a dos leguminosas forrajeras en el Centro Biotecnolgico del Caribe Isolation of Rhizobium spp., associated two forage leguminous in the Caribbean Biotechnological Center
Jorge L. Hernndez1, Juan G. Cubillos-Hinojosa2*, Pablo E. Milian3

RESUMEN El propsito de esta investigacin fue aislar cepas nativas de Rhizobium spp., a partir de ndulos de las plantas leguminosas forrajeras, Leucaena (Leucaena leucocephala) y Matarratn (Gliricidia sepium) en cultivos establecidos en el Centro Biotecnolgico del Caribe, ubicado en el valle del Cesar, Colombia. Los ndulos obtenidos se llevaron al laboratorio y se sembraron en Levadura Manitol Agar (YMA). Se realizaron pruebas de identificacin fisiolgica en YMA + Azul de Bromotimol (AB), YMA + Rojo Congo, Peptona Glucosa Agar (PGA) + Purpura de Bromocresol, prueba de cetolactasa en Levadura Lactosa Agar (LLA), tincin de Gram, y pruebas de crecimiento en agar XLD y Hektoen. Se aislaron 22 cepas nativas de Rhizobium spp., 11 a partir de L. leucocephala y 11 a partir G. sepium. Las cepas seleccionadas se sometieron a pruebas de tolerancia como pH, temperatura, concentracin de NaCl y antibiticos. Se observaron bacilos cortos mviles gram negativos, con reaccin acida en el medio YMA + AB. Algunas cepas, no toleraron las sales biliares presentes en agar XLD y en agar Hektoen. Las pruebas de tolerancia a factores abiticos demostraron mejor crecimiento en pH entre 9.0 y 11, entre 30 y 37C, y crecimiento moderado en concentraciones de NaCl 1% y 2%, todas las cepas presentaron resistencia al cloranfenicol. Estos resultados afianzan la posibilidad de establecer estudios que permitan evaluar en una etapa de invernadero y campo el potencial de fijacin de nitrgeno y promocin de crecimiento en plantas leguminosas utilizadas como forraje para ganado bovino. Palabras clave: cepas nativas, Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium, ndulos, Rhizobium spp. ABSTRACT The purpose of this research was to isolate native strains of Rhizobium spp. from nodules of leguminous forage leucaena (Leucaena leucocephala) and matarratn (Gliricidia sepium) in
1. Microbilogo Agroindustrial. Universidad Popular del Csar, Balneario Hurtado va a Patillal. Valledupar, Colombia. 2. Microbilogo Agroindustrial. Instructor SENA Distrito Capital. Carrera 30 No. 14- 53, Complejo Paloquemao, Bogot. Colombia. <jcubillosh@misena.edu.co> 3. Microbilogo Agroindustrial. Proambiente S.A.S. Carrera 60 No. 70 31. Barranquilla, Colombia.

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Revista Colombiana de Microbiologa Tropical. Vol. 2 N 2. Enero Junio 2012.

crops grown in the Caribbean Biotechnology Center, located in the valley of Cesar, Colombia. The nodules obtained were taken to the lab and grown in Yeast Mannitol Agar (YMA). Identification tests were conducted physiological YMA + bromthymol blue (AB), YMA + Congo Red, Glucose Peptone Agar (GPA) + bromocresol purple, evidence in Yeast Lactose Agar cetolactasa (ALL), Gram staining and tests XLD agar growth and Hektoen. We isolated 22 native strains of Rhizobium spp., 11 from L. leucocephala and 11 from G. sepium. The selected strains were tested for tolerance as pH, temperature, concentration of NaCl and antibiotics. There were gram-negative bacilli mobile short, with acid reaction in YMA + AB. Some strains, did not tolerate the bile salts present in XLD agar and Hektoen agar. Evidence of tolerance to abiotic factors showed better growth at pH between 9.0 and 11 at temperatures between 30 and 37 C, and moderate growth in NaCl concentrations of 1% and 2%, all strains were resistant to chloramphenicol. These results entrench the possibility of studies to evaluate in a greenhouse and field phase of the potential for nitrogen fixation and growth promotion of leguminous plants used as fodder for cattle. Keywords: native strains, Leucaena leucocephala, Gliricidia sepium, nodules, Rhizobium sp. 2007). Rhizobium sp infecta y forma ndulos en huspedes especficos, porque la bacteria contiene un plsmido grande que codifica la informacin que no se utiliza cuando crece en el suelo como organismo de vida libre, pero por otra parte es vital para infectar a la planta husped susceptible (Rincn et al., 2000; Atlas & Bartha, 2005). Es por esto que en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, resulta una interaccin muy especfica entre la bacteria y la planta. La formacin del ndulo es un proceso inducido por un intercambio de seales entre los dos participantes de la interaccin; sustancias con efecto mitgeno (factores de nodulacin) son sintetizados por los genes de nodulacin del microsimbionte (genes nod), en respuestas a la excrecin por la planta de sustancias de tipo flavonoide. Los genes codificados por plsmidos influyen tambin en la variedad de plantas huspedes en las que Rhizobium sp., puede formar ndulos (Atlas & Bartha, 2005; Marco et al., 2009). Algunas de las leguminosas capaces de asociarse con Rhizobium sp son por ejemplo, judas, trboles, alfalfa, guisantes, entre otras. Estas plantas poseen en sus races pequeos 52

1. INTRODUCCIN El gnero Rhizobium sp., hace parte del reino de las Proteobacteria, pertenece al orden Rhizobiaceae, y a la subdivisin Proteobacterias, los cuales se caracterizan por fijar nitrgeno atmosfrico, se asocia simbiticamente con las plantas, especficamente aquellas perteneciente al grupo de las leguminosas; dentro de este orden tambin se ubica el gnero Agrobacterium, una eubacteria gram negativa aerobia, que se diferencia del gnero Rhizobium en que no estimula la formacin de ndulos de la raz ni la fijacin de nitrgeno (Atlas & Bartha, 2005; Kuykendall et al., 2005). Las bacterias pertenecientes al gnero Rhizobium son bacilos mviles gram negativo miden de 0.5 a 0.9 por 1.2 a 3.0 m, y a menudo contiene grnulos de hidroxibutirato y son pleomorfos en situaciones adversas. Es considerado un habitante prominente de la rizosfera. (Kuykendall et al., 2005; Ferrera y Alarcn,

engrosamientos llamados ndulos que contienen internamente bacteroides o rizobios, conocidos tambin como organismos infectivos de races. Durante esta simbiosis, la planta suministra nutrientes y proteccin a los rizobios a cambio de nitrgeno atmosfrico fijado (Atlas & Bartha, 2005). Las leguminosas revisten especial importancia en la agricultura, debido que contribuyen a aumentar la fertilidad de los suelos a travs de la fijacin de nitrgeno; se estima que la simbiosis Rhizobiumleguminosa puede fijar de 24 hasta ms de 584 kg de nitrgeno/ha y abastecer en algunos casos hasta 90% de las necesidades de las plantas (Ferrera y Alarcn, 2007; Mayz et al., 2010; Lindstrm et al., 2010). Para lograr un aislamiento efectivo de cepas nativas de Rhizobium spp., se recomienda realizar extraccin directa de los ndulos de las plantas en estudio, ya que se puede obtener un aislado de altas proporciones. Para ello, es necesaria la utilizacin de medios de cultivos especficos que faciliten la diferenciacin bioqumica de las especies de acuerdo con sus componentes. Entre los ms conocidos y utilizados se encuentran: Levadura Manitol Agar (YMA), agar XLD y Hektoen, especficos para determinar crecimiento de bacterias Gram negativas YMA con Rojo Congo, permite diferenciar de Agrobacterium sp., que absorbe el colorante, comportamiento que no es evidenciado por Rhizobium sp., tambin, evaluacin de crecimiento en LLA, con produccin de cetolactosa (; Kuykendall, 2005; Kk, . Y M. Kivan, 2008; Prez et al., 2008). De acuerdo con lo anterior el propsito de esta investigacin consisti en el aislar cepas nativas de Rhizobium spp., a partir de ndulos de Leucaena (Leucaena leucocephala) y Matarratn (Gliricidia sepium), con potencial biopromotor de leguminosas forrajeras utilizadas para la alimentacin bovina.

2. MATERIALES Y MTODOS Muestreo de ndulos El muestreo se realiz en el Centro Biotecnolgico del Caribe ubicado en el valle del Cesar, en el Km 7 va la Paz, Valledupar Colombia, que cuenta con un rea aproximada de 1005.000 m2, equivalente a 100,5 ha, de las cuales existen 3.584 m2, es decir, aproximadamente 0,4 ha plantadas con G. sepium, distribuidos en tres lotes de la siguiente manera: el primero es de 392 m2; el segundo de 1.596 m2, y el tercero de 1.596 m2. Las plantas de L. leucocephala actualmente se encuentran distribuidas en todo el rea del centro; es decir, no existe un cultivo establecido. Prospeccin de ndulos. Se recolectaron ndulos a partir de Matarratn (G. sepium) y Leucaena (L. leucocephala), durante periodo de lluvia comprendido entre los meses de septiembre y octubre del ao 2009. Esto facilit la extraccin del sistema radicular sin ocasionar daos mecnicos, obteniendo de esta manera una muestra representativa de ndulos. Para el muestreo de G. sepium, se seleccionaron plantas jvenes y vigorosas, para lo cual se realiz un muestreo aleatorio simple en X, en cada lote cultivado. Se tomaron 3 plantas por cada punto, para un total de 15 plantas por lote. Para L. leucocephala se seleccionaron plantas jvenes en estado de floracin. El muestreo se realiz en forma estratificada. Se dividi la poblacin en 5 puntos; se realizo un muestreo aleatorio simple en Zig-zag, tomando, 8 plantas/punto. Para un total de 40 plantas de L. leucocephala y 45 de G. sepium. Se realiz el conteo de ndulos y se evalu la nodulacin segn la estructura, la abundancia, el tamao, el color interno y la nodulacin en la raz principal (Salazar et al., 2001; Lpez, 2005; Martnez, 2005; Westermeyer, 2006). Los ndulos 53

seleccionados se empacaron en bolsas de polietileno con cierre hermtico y se transportaron a temperatura ambiente (Jimnez, 2007; Pea & Reyes, 2007) hasta el Laboratorio de Microbiologa del CBC. Procesamiento de los ndulos. Los ndulos se desinfectaron por inmersin sucesiva en alcohol al 70% por un minuto e hipoclorito de sodio al 2,5% durante cuatro minutos y posterior enjuague con agua destilada estril (Matos et al., 2007). Se midi la viabilidad del bacteroide en el ndulo, tomando ndulos al azar, que luego se seccionaron, y posteriormente se realiz un extendido en fresco sobre placas porta objeto a las cuales se les aplic tincin de Gram Matos & Ziga, 2002; Ferrera & Alarcn, 2007). Aislamiento primario de Rhizobium spp., a partir de ndulos de Leucaena y Matarratn. Los ndulos se seccionaron con un bistur estril, luego transferidos a placas con Levadura Manitol Agar con Azul de Bromotimol como indicador (YMA + AB), y se incubaron a 30C, por 7 das hasta observar crecimiento abundante alrededor de los ndulos (Mora, 1995; Bcquer et al., 2000; Rincn et al., 2000; Salazar et al., 2001; Matos y Ziga, 2002; Jimnez, 2007; Prez et al., 2008). Para el recuento de las colonias crecidas y para determinar el porcentaje de ndulos obtenidos para cada especie de leguminosa se propuso la siguiente frmula: 100 Donde: %R = porcentaje de recuperacin NNC = nmero de ndulos con crecimiento TNS = total de ndulos sembrados Aislamiento secundario. Se realiz mediante siembra por agotamiento en cajas estriles con YMA + AB a partir de las

colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas fueron incubadas a 30C por 7 das, se observ el crecimiento, la morfologa de las colonias, y de las clulas por tincin de Gram (Bcquer et al., 2000). Se realizaron observaciones cada dos das repicando las colonias tpicas de Rhizobium spp., (Matos et al., 2007). Las cepas que presentaron crecimiento en el segundo aislamiento se codificaron para hacer posible la diferenciacin. Identificacin de las cepas de Rhizobium sp. Se tomaron las colonias obtenidas en el aislamiento secundario. El criterio para la seleccin se bas en las caractersticas planteadas por Martnez et al., 2005; colonias con reaccin cida en el medio de cultivo YMA + AB y morfologa bacilar Gram negativa; luego se realiz siembra por agotamiento en cajas con agar YMA sin Azul de Bromotimol y se incubaron a 30C durante 7 das. Durante este tiempo se estudi las caractersticas de las colonias como forma, tamao, color, textura y la tasa de crecimiento (Prez et al., 2008). Este ltimo se realiz midiendo el dimetro de 10 colonias/placa y calculando las medias correspondientes (Bcquer et al., 2000). Para la evaluacin se seleccionaron los inculos acuerdo a las caractersticas planteadas por Prez et al., 2008 y Rojas, 2009. Se evalu el crecimiento de las cepas en diferentes medios para lograr la caracterizacin de las cepas (Prez et al., 2008). Se tomaron inculos a partir de cada cepa y se realiz siembra por agotamiento en cajas con PGA + PB (Peptona Glucosa Agar + Purpura de Bromocresol), luego se incubaron a temperatura de 30C. Los resultados se valoraron acuerdo al crecimiento, como (+) o (-), (Bcquer et al., 2000). La cepas tambin fueron evaluadas segn la metodologa planteada por Kk & Kvan, 2008; Rojas et al., 2009, tomando inculos y realizando siembra por agotamiento en medio YMA + RC (Levadura Manitol Agar + Rojo Congo), la colonias se evaluaron en base a la absorcin 54

del rojo congo. (Kuykendall et al., 2005; Matos et al., 2007). Por otra parte las cepas se sembraron en cajas con LLA (Levadura Lactosa Agar) y se incubaron a 30C durante 3 das; luego se realizaron extendidos y se adicion reactivo de Benedict; los resultados se valoraron de acuerdo a la produccin de cetolactosa, como (+) o (-). (Martnez et al., 2005; Kuykendall et al., 2005; Matos et al., 2007). Evaluacin del crecimiento de las cepas en Agar XLD y Hektoen. Se tomaron inculos, realizando siembra por agotamiento en placas con agar XLD (Xilosa Lactosa Desoxicolato) y Hektoen, para lograr determinar la especificidad de crecimiento de bacterias Gram negativas y posteriormente se realizaron pruebas de motilidad. Tolerancia de las cepas a factores abiticos. Las cepas seleccionadas se evaluaron con respecto a la habilidad para crecer bajo diferentes niveles de pH (4.5; 6.8; 9.0 y 11), concentracin de NaCl (0.01%; 1% y 2%) y diferentes temperaturas (4.5C, 30C, 37 y 44C) (Bcquer et al., 2000; Kk & Kvan, 2008; Mouraud et al., 2009). Para la prueba de pH, se ajust el medio YMA, con NaOH y HCl 1N. Para las concentraciones de NaCl, se prepararon tubos con caldo Levadura-Manitol, incubando a 30C por 3 das en ambos casos. Para la prueba de tolerancia a diferentes temperaturas, se realiz siembra por agotamiento en cajas con YMA. Luego fueron incubadas a diferentes temperaturas. Resistencia de las cepas a antibiticos. Las cepas seleccionadas se sometieron a pruebas de resistencia a los antibiticos Tetraciclina (5,0 g/ml) y Cloranfenicol (10,0 g/ml) (Kk & Kvan, 2008). Los antibiticos se obtuvieron comercialmente y las soluciones se prepararon con agua destilada estril. Posteriormente, se adicion el vial al medio de cultivo YMA y se realiz siembra por

agotamiento. Las placas fueron incubadas a 30C durante 7 das, se evalu la formacin de colonias; tomando el criterio resistente (+), o no resistente (-) (Bcquer et al., 2000). Conservacin de las cepas de Rhizobium sp. Se cultivaron en medio YMA + AB en plano inclinado y en caldo Levadura Manitol. Se incubaron a 30C por 5 das; luego se llevaron a una nevera a temperatura entre 4 y 5C (Matos et al., 2007). La prueba de viabilidad se realiz cada 30 das durante 6 meses mediante siembra por agotamiento en placas con YMA. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN Se obtuvieron 21 plantas noduladas para G. sepium correspondiente al 46.7% del total muestreado. Con respecto a la prospeccin de ndulos se encontr un total de 599, distribuidos en cada lote: en el primero se tomaron 39; en el segundo, 81; y, en el tercero, 479. Entre tanto para L. leucocephala se obtuvieron 9 plantas noduladas, el 22.5% de las plantas evaluadas. En los puntos uno y dos no se encontraron plantas con ndulos. La prospeccin de ndulos fue muy escasa en comparacin a G. sepium; encontrando slo 110 ndulos distribuidos en todos los puntos de muestreo. La prospeccin de ndulos fue mejor en G. sepium, destacndose en los lotes 2 y 3 el mayor nmero de plantas noduladas. Las races mostraron poca nodulacin en la raz principal pero alta en las races secundarias, los ndulos presentaron coloracin rojiza en su interior; estos ltimos resultados tambin se presentaron en L. leucocephala (Tabla 1). En el caso de L. leucocephala, la explicacin a la escasa nodulacin en algunos puntos de muestreo puede deberse a que no existe un cultivo constante que permita establecer especies de rizobios especficos que la nodulen. Segn lo propuesto por Rincn et al, 55

2000; Ferrera & Alarcn, 2007, sta planta presenta alta especificidad en sus requerimientos de rizobios, ya que no todas las cepas que la nodulan pueden producir una eficiente fijacin del nitrgeno atmosfrico, esto es un factor limitante para su establecimiento. Prueba de viabilidad del bacteroide en el ndulo. Con la tincin de Gram se constat la viabilidad de los ndulos y adems permiti continuar con el proceso de aislamiento (Fig. 1). Ferrera & Alarcn, 2007 afirman que algunos factores ambientales como la temperatura, pH, estrs salinos y la presencia de compuestos fenlicos en extractos de races, pueden causar la muerte de los rizobios establecidos en los ndulos de L. leucocephala. Aislamiento primario de rizobios. Los porcentajes de recuperacin fueron relativamente satisfactorios para cada especie leguminosa obteniendo 86% en G. sepium, y en L. leucocephala 94 % (Tabla 1). En este primer aislamiento se obtuvo un crecimiento ligeramente moderado de cepas con caractersticas fermentativas en el medio de cultivo YMA + AB (Fig. 2). A partir de aqu se seleccionaron las cepas que presentaron reaccin cida en el medio. Aislamiento secundario de rizobios. Las cepas seleccionadas presentaron caractersticas propias de rizobios. Las colonias observadas fueron convexas con bordes regulares, de color lechoso y consistencia gelatinosa, algunas de ellas con abundante goma. (Bcquer et al, 2000). As mismo se observ mediante la tincin de Gram, bacilos Gram negativos, finos no esporulados. (Salazar et al., 2001). Se observ en general, crecimiento lento, encontrando crecimiento a los 3 das de incubacin con colonias de menos de 2mm de dimetro, con produccin de cido (Fig. 3). Por ello se agruparon en grupos correspondientes a cada leguminosa.

Test fisiolgico y bioqumico. Para la seleccin de las colonias, un elemento esencial fue la falta de absorcin del colorante rojo congo en el medio YMA + RC. Por lo general, las colonias de Rhizobium sp se observan blancas o rosadas, debido a que no absorben el colorante; sin embargo Rojas et al., 2009, seala que toman color rojo intenso luego de 8 das de incubacin; evento que se registr al realizar las caracterizaciones bioqumicas. La absorcin de rojo congo es caracterstico del gnero Agrobacterium sp., a diferencia de Rhizobium sp., que no absorbe (Kuykendall et al., 2005). Como resultado se aislaron 22 cepas en total: 11 procedentes de G. sepium, y 11 de L. leucocephala. De todas las cepas sembradas en el medio mnimo PGA + PB se descartaron cuatro aisladas a partir de G. sepium, y dos de L. leucocephala; debido a que presentaron un elevado crecimiento y poca produccin de acido (Tabla 2). De acuerdo a lo planteado por Matos et al, 2007, la fermentacin de la glucosa en un medio mnimo carente de minerales no es tpica para el gnero Rhizobium sp, por lo que no se tuvieron en cuenta. La reaccin a la tincin de Gram permiti observar bacilos Gram negativos; sin embargo, al realizar los ensayos de crecimiento en agar XLD y Hektoen, algunas cepas no crecieron; este comportamiento se debe a que algunas especies de Rhizobium no toleran la presencia de sales biliares, Rincn et al., 2000. Las pruebas de tolerancias a factores abiticos como el pH demostraron que la totalidad de las cepas de G. sepium y L. leucocephala crecieron en pH 9.0 y 10, lo que puede estar vinculado a las exigencias del microorganismo al adaptarse a condiciones adversas de su microhbitad. Resultados similares fueron reportados por Bcquer et al., 2000. Se encontr que las cepas presentaron mejor crecimiento a 30 y 37C; 56

presentaron mejor crecimiento a temperaturas extremas, 5 y 44C, no se observ crecimiento. La tolerancia a NaCl al 1% y 2% fue un criterio adicional que permiti diferenciar cepas de Rhizobium sp., de cepas pertenecientes Bradyrhizobium sp. En la tolerancia al pH se evidenci crecimiento abundante en los rangos 9.0 y 11.0 para todas las cepas seleccionadas tanto G. sepium como L. leucocephala (Tabla No 3). La totalidad de las cepas evaluadas presentaron resistencia al cloranfenicol (Tabla 2). 4. CONCLUSIONES Las cepas nativas de Rhizobium spp., se observaron como bacilos cortos mviles Gram negativos, que presentaron reaccin cida en el medio YMA + AB. Algunas cepas de Rhizobium spp., nativas no toleraron la presencia de sales biliares presentes en el medio XLD y Hecktoen. Las cepas nativas de Rhizobium spp., no degradaron la cetolactasa en el medio LLA. Las pruebas de tolerancia a factores abiticos demostraron mejor

crecimiento en los pH entre 9,0 y 11, a temperaturas de entre 30 y 37C, crecimiento moderado en concentraciones de NaCl de 1% y 2%. Se aislaron 22 cepas de Rhizobium spp, nativas: de la cuales 11 fueron especficas para Matarratn (Gliricidia sepium) y 11 para Leucaena (Leucaena leucocephala), las cuales presentaron mejor resistencia al cloranfenicol. Se pretendi con este estudio obtener cepas de Rhizobium sp, para facilitar una segunda etapa orientada a la evaluacin de invernadero y en campo en donde se evale el efecto de las cepas nativas de Rhizobium spp., sobre la promocin de crecimiento en plantas leguminosas utilizadas como forraje para la alimentacin de ganado bovino. 5. AGRADECIMIENTOS Los autores de este trabajo expresan sus agradecimientos al Centro Biotecnolgico del Caribe, SENA Regional Cesar donde se desarroll esta investigacin y al Semillero de Investigacin Agroecolgico por el apoyo.

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Figura 1. Prueba de viabilidad del bacteroide en el ndulo a travs de la tincin de Gram, obsrvese la presencia de rizobios viables Gram negativos (A) Ndulos de Gliricidia sepium. (B) Ndulos de Leucaena leucocephala A B

Foto: Hernndez J, 2009. Figura 2. Aislamiento primario de rizobios en YMA + AB, obsrvese la reaccin cida (A/A)

Foto: Hernndez J, 2009. Figura 3. Crecimiento en YMA + AB, reaccin cida (A/A) y alcalina (K/K). (A): colonias observadas despus de 3 das de incubacin. (B): colonias observadas despus de 7 das de incubacin.

A Foto: Hernndez J, 2009.

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Tabla 1. Recuento de ndulos con crecimiento y porcentaje de recuperacin para G. sepium y L. leucocephala
Ndulos aislados o sembrados 25 56 153 234 18 25 5 48 Ndulos con crecimiento 19 42 140 201 18 22 5 45 Porcentaje de recuperacin 76 75 92 86* 100 88 100 94*

Leguminosa G. sepium

Lote/punto Lote 1 Lote 2 Lote 3 Total Punto 2 Punto 3 Punto 4 Total

L. leucocephala

*Porcentaje de recuperacin con respecto al total de ndulos con crecimiento en cada leguminosa Tabla No 2. Caracterizacin bioqumica y fisiolgica de cepas Rhizobium sp, aisladas a partir de G. sepium y L. leucocephala.
Crecimiento en: N 1 Gliricidia sepium 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Leucaena leucocephala 1 2 3 4 5 6 7 8 Cepa G-21* G-22 G-24 G-26 G-32* G-34* G-35* G-36* G-38* G-39 G-310 L-01 L-24 L-27 (1)* L-27 (2) L-32* L-34* L-35* L-36* PGA + LLA Pb (-) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+/-) (+/-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) YMA + Rc (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) XLD Hektoen (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Rx. YMA + Ab (-) (-) (+/-) (+/-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+/-) (+/-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Resist. Rx Antib Bene dict Tetra. Clor. (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+/-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+)

YMA + Rc Rosadas Rosadas Traslucidas Rosadas Traslucidas Traslucidas Traslucidas Traslucida Rosadas Rosadas Traslucidas Rojizas Rojizas Rosadas Rojizas Rosadas Rosadas Rosadas Rosadas

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9 10 11 CC 1

L-38 (2)* L-38 (3) L-47 a CC

(-) (+) (-) (+/-)

(+) (+) (+) (+)

(+) (+) (+) (+)

(-) (-) (-) (+)

(-) (-) (-) (+)

(-) (-) (+/-) (-)

Rosadas Rosadas Rojizas Rosadas

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(+) (+) (+) (+)

PGA: Peptona-glucosa Agar; Pb: Prpura de bromocresol; Ab: Azul de bromotimol; LLA: Levadura-Lactosa-Agar; YMA: Levadura-Manitol-Agar; Rc: Rojo congo; Rx: Reaccin; Tetra: Tetraciclina; Clor: Clorafenicol; (+/-): Dbilmente. * Cepa nativa de Rhizobium spp., seleccionadas. a Cepa comercial.

Tabla 3. Tolerancia a factores abiticos para G. sepium y L. leucocephala.


Tolerancia a factores abiticos [ ] de NaCl Cdigo cepa Gliricidia sepium 0,01% G-21 G-32 G-34 G-35 G-36 G-38 Leucaena leucocephala L-27 (1) L-32 L-34 L-35 L-36 L-38 (2) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 1% 2% 4,5 6,8 9,0 11,0 5C 30C 37C 44C (-) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Niveles de pH Niveles de temperatura

(+) (+)

(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+)

(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (+)

Cepa (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) C-ICA J-01 comercial (+) Crecimiento positivo, (-) Crecimiento negativo; [ ] Concentracin.

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