C-GMP Brasilero

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MIRELLA ARAÚJO MAGALHÃES
DETERMINACIÓN DEL FRAUDE DE LECHE DE SUERO

POR CMP Y ANÁLISIS PSEUDOCMP POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA EN FASE
REVERSA CON DETECCIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE
PASTA
Tesis presentada en la Universidad Federal de

Viçosa, como parte de los requisitos del Programa
de Postgrado en Ciencia y Tecnología de Alimentos,
para obtener el título de Magister Scientiae.
VICIOSO
MINAS GERAIS BRASIL
2008
AGRADECIMIENTOS
A Dios que siempre está conmigo y dándome la fuerza necesaria para vencerlo todo.
mis metas.
La Universidad Federal de Viçosa y el Departamento de Tecnología de Alimentos para
oportunidad de realizar el curso.
El Decano de Administración de la Universidad Federal de Viçosa, en la persona de
Fátima Luísa, por el apoyo durante el viaje.
A Geralda – DTA, por ayudarme en todo lo que necesitaba.
Al Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento por la oportunidad de realizar
del experimento en las instalaciones del Laboratorio Nacional Agrícola de Minas
Gerais (LANAGROMG), y por el apoyo financiero.
Al profesor Sebastião César Cardoso Brandão, por su orientación en mi trabajo,
por la amistad, la paciencia, la perseverancia y el ánimo.
Al profesor Mauro, por sus orientaciones y aportes.
Al Oficial de la Policía Federal Jorge Jardim Zacca, por participar en mi panel y por la
aportes dados.
Al profesor Luis Minim por su ayuda y aportes a la tesis.
Profesora Edimar, por su inmensurable colaboración en los análisis estadísticos.
de este trabajo y por sus contribuciones a la tesis.
Mi madre Ana Rita Araújo Ferreira Magalhães, verdadero amor de mi vida,
por sus oraciones diarias, consejos, amistad, apoyo en mis estudios y mi
vida. Muchas gracias por ser mi "refugio seguro".
A mi Padre Absalão Ferreira Magalhães, que siempre me brindó todo el apoyo en mis estudios,
por oraciones y cariño.
A mi hermana Melissa, mi cuñado Vanderley por su cariño y por estar presentes en
la vida de mis padres cuando estaba fuera de casa estudiando.
A mi sobrina Melina, por sus verdaderas oraciones y amables palabras.
Mis amigas Helisa, Fernanda, Flávia Andrade y Ângela, por su amor y amistad.
eterno.
A los amigos de Pedro Leopoldo, Saulo Mussa, Jordana Hissa, Katinha, Camila, Doña
Geralda, por recibirme tan bien en Pedro Leopoldo, por tu apoyo, amistad, cariño.
y por aliviar mi nostalgia con palabras de cariño. Sin ti todo seria mejor
difícil.
ii
La familia de Pedro Leopoldo, Fernando Braga, Martha Braga, Antônio Braga, Eliane
Braga y Rodrigo Braga. Gracias por vuestro cariño, amistad, calidez familiar y tantas
otros momentos que fueron fundamentales para aliviar mi nostalgia y darme
Fuerza para continuar mi trabajo.
A mi amigo Iván Salvador, por su cariño incondicional, atención, preocupación y
sin haber escatimado nunca esfuerzos para ayudarme, desde el comienzo de este viaje.
A las amigas del Departamento de Tecnología de Alimentos, Geruza, Maria Patrícia,
Mateus, Alexandre y Adenilson, por su amistad y conocimiento compartido.
Maninha, Breno, Pâmela, Alcione, por recibirme siempre en Viçosa
A María Patrícia, amiga que estuvo presente en todo momento durante el evento
de este trabajo, ayudar en el experimento, compartir apartamento, momentos de alegría,

tristeza y conocimiento.
A Flávia Malaquias, por el cariño, amistad y cuidado que siempre me mostró. Por
pasar noches sin dormir, cuando no podía dormir preocupándome por el
experimento. Mi madre de Pedro Leopoldo.

A LOS AMIGOS DE LANAGRO:
Eugênia y Ricardo por las oportunidades y el apoyo financiero.
A María Helena por el uso del equipo.
A Leonardo Souza, por su amistad y ayuda incondicional durante todo el experimento.
Tu ayuda fue fundamental para que este trabajo llegara a buen término.
A mi amigo Ronaldo Sanches por su amistad y consejos.
A Sergio Dracz, por sus enseñanzas, paciencia y orientación.
A Rodrigo Ramos, Josefa, Junior, Gilsara, Caio, Lucimere, Moisa, Bruna, Cristiane,
Ruth, por tu apoyo y amistad.
A Eduardo por poner a disposición el laboratorio del POA para realizar el experimento.
Finalmente, a todos los que, de alguna manera, contribuyeron a la realización de este trabajo.
III
BIOGRAFÍA
MIRELLA ARAÚJO MAGALHAÃES, hija de Absalão Ferreira Magalhães y

Ana Rita Araújo Ferreira Magalhães, nació en Coronel Fabriciano, Minas Gerais, en
19 de febrero de 1981.
En julio de 2004 se graduó en Ciencia y Tecnología Láctea, de la

Universidad Federal de Viçosa.
En agosto de 2005 inició la Maestría en Ciencia y Tecnología.

Alimentación, de la Universidad Federal de Viçosa.
IV
RESUMEN
LISTA DE FIGURASviii
LISTA DE MARCOS xi
RESUMEN xii
ABSTRACTO xiv
1. INTRODUCCIÓN 1
2OBJETIVOS3
3REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 3
3.1 – UAT de leche. 3
3.2 Importancia de las bacterias psicrotróficas en la proteólisis de la leche4
3.3 Métodos para el seguimiento de la proteólisis de la leche7
3.4 Caseinomacropéptido. 10
3.5 Efecto de la concentración de ácido tricloroacético (TCA) sobre la solubilización de CMP
13
3.6 Métodos para detectar el fraude en el suero de leche 14
4 MATERIALES Y MÉTODOS 17
4.1 Recolección de leche UAT sin CMP 17
4.2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche18
4.3 Análisis de muestras de leche UAT mediante HPLCFG18
4.4 Obtención del suero 19
4.5 Adición de suero a la leche UAT sin CMP 19
4.6 Cultivo de leche UAT sin CMP con Pseudomonas fluorescens20
en
4.7 Leche UAT sin CMP adicionada con suero después del cultivo con Pseudomonas
fluorescente 21
4.8 Preparación de muestras de leche UAT para análisis CMP mediante HPLCFG y HPLC
FR/EM 21
4.9 Detección de CMP por HPLCFR/EM 22
4.9.1 Descripción del equipo 22
4.9.2 Análisis de muestras de leche UAT preparadas para HPLCFR/EM23
4.9.3 Determinación del Tiempo de Retención y curva de calibración CMP23
4.9.3.1 En CLAEFR/EM 23
4.9.3.2 En CLAEFG 24
4.10 Análisis de leche cultivada con Pseudomonas fluorescens y adicionada
diferentes concentraciones de suero por HPLCFR/EM24
4.11 Análisis estadístico 25
4.11.1 – Efecto de la adición de suero y tiempo de incubación de un cultivo de Pseudomonas
fluorescens en métodos de detección de CMP 25
4.11.2 – Efecto de la adición de suero y tiempo de incubación de un cultivo de Pseudomonas
fluorescens en la detección de CMP a partir de suero y pseudo CMP
de proteasas de Pseudomonas fluorescens mediante HPLCFR/EM 26
5RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27
5.1 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche UAT libre de CMP27
5.2 Análisis microbiológicos de leche UAT cultivada con Pseudomonas fluorescens28
5.3 Detección de CMP por CLAEFG 28
5.4 Análisis del patrón CMP en agua mediante HPLCFR/EM.29
5.5 Análisis del patrón CMP en leche mediante HPLCFR/EM32
nosotros
5.6 Aplicación de HPLCFG para detectar la presencia de suero añadido al
leche UAT 34
5.7 Aplicación de HPLCFR/EM para detectar la presencia de suero
añadido a la leche UAT 35
5.8 Análisis de leche UAT sin CMP adicionada con diferentes concentraciones de suero
leche por CLAEFG y CLAEFR/EM 37
5.9 Análisis de leche UAT sin CMP cultivada con Pseudomonas fluorescens,
suero añadido por CLAEFG 38
5.10 Análisis de leche UAT sin CMP, cultivada con Pseudomonas fluorescens
suero añadido por CLAEFR/EM 42
5.11 Variación en la concentración de iones con relación masa/carga 1697.4+4, 1301.2+5 y
1358.2+5 en muestras de leche UAT sin CMP, cultivadas con Pseudomonas fluorescens
añadido con suero, determinado por HPLCFR/EM46
6. CONCLUSIÓN 50
7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 51
viii
LISTA DE FIGURAS
1 Sitio de acción de la quimosina sobre la κcaseína 11
2 Estructura primaria del glicomacropéptido 11
3 Esquema del experimento de detección de fraude en el suero de leche
CLAEFREM y por CLAEFG 20
4 Esquema del experimento de detección del fraude lácteo con la adición de diferentes
concentraciones séricas por HPLCFR/EM y HPLCFG, después de la incubación con
Pseudomonas fluorescens. 22
5 Cromatograma (HPLCFG) de leche UAT adicionada con 90 mg/L del estándar
CMP 29
6 Curva analítica del estándar CMP (0, 30, 45, 60, 75 y 90 mg/L) en leche analizada
por CLAEFG 29
7 Cromatograma de iones monitoreados obtenidos del análisis del estándar CMP en agua
(45 mg/L) por HPLCFR/EM 30
8 Curva analítica del CMP en agua obtenida mediante el seguimiento del ion específico
1697,4+4m /z 31
9 Cromatogramas del estándar CMP en agua en concentraciones de 0, 30, 75 y 90
mg/L, monitoreado a una relación masa/carga de iones de 1697,4+4, analizado por HPLC
FR/EM 31
10 Cromatogramas del estándar CMP en leche en concentraciones de 0, 30, 75 y 90
mg/L, monitoreado a una relación masa/carga de iones de 1697,4+4, analizado por HPLC
FR/EM 32
viii
11 Curva analítica de CMP en leche UAT sin CMP obtenida mediante monitorización de iones
específico 1697,4+4 m/z 33
12 Análisis por cromatografía líquida de alta resolución espectrometría de masas
Ionización por electropulverización de CMP (variante A) obtenida mediante el seguimiento de los iones.
específico 1698.4+4, 2264.3+3 de aglicoCMPA 33
13 Exploración masa/carga del pico correspondiente al tiempo de retención de 26,8
minutos obtenidos analizando muestras de mantequilla por HPLC/EM34
14 Cromatogramas (HPLCFG) de leche UAT adicionada con 15% (v/v) (A) y 20%
(v/v) (B) suero 35
15 Cromatogramas del análisis de leche UAT sin CMP adicionada con 15% (v/v) de suero
de leche, monitoreada con una relación masa/carga de iones de 1697,4+4 y 2263,3+3 m/z
analizado por CLAEFR/EM 36
16 Cromatogramas del estándar CMP en leche UAT sin CMP adicionada con suero
leche en concentraciones de 0, 5, 10, 15 y 20% (v/v), monitoreadas en el ion en relación
masa/carga de 1697,4+4, analizado por CLAEFR/EM 37
17 Variación en el área de detección de CMP dependiendo de diferentes concentraciones de
suero utilizando CLAEFG y CLAEFR/EM como métodos de análisis38
18 Variación en el área de detección de CMP dependiendo del tiempo de incubación de un
cultivo psicrotrófico en presencia de diferentes concentraciones de suero utilizando
como método de análisis CLAEFG. 39
19 Cromatogramas, por HPLCFG, de leche UAT cultivada con Pseudomonas
fluorescens y se incubaron a 7 ºC durante 4 días (A) y 6 días (B) y 8 días (C)41
ix
20 Resultados del análisis del CMP verdadero (ion 1697,4+4 m/z) por HPLCFR/EM
en leche UAT sin CMP, inoculada con P. fluorescens, incubada durante 0, 2, 4, 6 y 8 días,
y se agregaron diferentes concentraciones de suero (0, 5, 10, 15 y 20% (v/v))43
21 Cromatogramas obtenidos mediante el seguimiento de iones específicos 1697.4+4, 2263.3+3,
1358+5, 1301.2+5, característico de leche cortada con Pseudomonas fluorescens y
incubado durante 4 días (A), 6 días (B) y 8 días (C) 44
22 Variación en el área de los iones (1697,4+4 m/z)(A), 1301,2+5 (B) y 1358,2+5 (C) dependiendo de
del tiempo de incubación de muestras de leche UAT sin CMP, inoculadas con P.
Fluorescens, población inicial de 103 UFC/ml y luego agregada
diferentes concentraciones de suero analizadas por HPLCFR/EM48
X
LISTA DE MARCOS
1 Composición teórica de los aminoácidos presentes en el glicomacropéptido 12
2 Resultados de análisis físicoquímicos y microbiológicos de leche UHT sin CMP27
3Efecto del tiempo de almacenamiento de la leche UAT, inoculada con Pseudomonas
fluorescens sobre el crecimiento de microorganismos psicrotróficos28
4 Resumen del análisis de varianza de dos métodos utilizados en la detección de CMP en
muestras de leche adulterada con diferentes concentraciones de suero38
5 Resumen del análisis de varianza en la detección de CMP por HPLCFG en muestras de
leche adulterada con diferentes concentraciones de suero cultivado con
Pseudomonas fluorescens con diferentes tiempos de incubación39
6 Valores medios de las áreas de los picos de CMP y su concentración (mg/L), obtenidos por
análisis de muestras de leche cultivadas con Pseudomonas fluorescens en función de
tiempo de incubación por HPLCFG 42
7 Valor de concentración (mg/L) de CMP, obtenido analizando la leche sin cultivo y
cultivadas con Pseudomonas fluorescens, en diferentes tiempos de incubación y
concentraciones de suero por HPLCFR/EM. 45
8 Resumen del análisis de varianza en la detección de CMP (1697.4+4) y relación de iones
masa 1301,2+5 y 1358,2+5 m/z en muestras de leche añadidas de diferentes
concentraciones séricas después del período de incubación con Pseudomonas fluorescens para
CLAEFR/EM 49
xi
RESUMEN
MAGALHÃES, Mirella Araújo, M.Sc., Universidad Federal de Viçosa, noviembre de 2008. Determinación del fraude en el
suero de leche por CMP y análisis PseudoCMP por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa con detección
por espectrometría de pasta. Asesor: Mauro Mansur Furtado. Codirectores: Sebastião César Cardoso Brandão y Nélio José
de Andrade
El objetivo principal de este trabajo fue el desarrollo de un método de
análisis de laboratorio mediante cromatografía líquida de alta resolución con Fase Inversa y
Detección por espectrometría de masas para determinar adulteración de leche con suero
de leche mediante la detección de caseinomacropéptido (CMP), y determinar el efecto de
cultivo de leche con Pseudomonas fluorescens para verificar la aparición de CMP o
PseudoCMP producido por enzimas termorresistentes de bacterias psicrotróficas.
A las muestras de leche se les añadió suero en concentraciones de 0;
5; 10; 15 y 20% (v/v) y analizados mediante cromatografía líquida de alta resolución –
Filtración en gel (HPLCFG) y cromatografía líquida de alta resolución en fase
Invertir con detección por espectrometría de masas (HPLCFR/EM). Fue observado
que hubo una diferencia entre los métodos de análisis (p<0,05) y hubo un efecto de
concentración de suero por ambos métodos (p<0.05), es decir, el aumento en
La concentración sérica provoca un aumento en el área correspondiente al CMP por ambos
métodos. CMP fue detectado por HPLCFG con un tiempo de retención de alrededor de 5,7
minutos. Cuando se analizó por HPLCFR/EM, se detectó CMP en el momento de
Retención de alrededor de 19 minutos y caracterizada por una relación masa/carga de iones.
1697,4+4 y 2263,3+3.
Se incubaron muestras de leche cultivadas con Pseudomonas fluorescens.
para diferentes días (0, 2, 4, 6 y 8) a 7 ºC, adicionados con diferentes concentraciones de
suero (0; 5; 10; 15 y 20 % (v/v)) y analizado por HPLCFG y HPLCFR/EM. En el
muestras de leche adicionadas con Pseudomonas fluorescens y sin suero añadido.
leche, analizada por HPLCFG, cuando se incubó hasta por 2 días, no se verificó
presencia de CMP. Sin embargo, las muestras de leche incubadas durante más de 2 días fueron
Se verificó la presencia de CMP, no resultante de la adulteración de la leche con suero.
leche. Las mismas muestras de leche adicionadas con Pseudomonas fluorescens y sin
La adición de suero, analizada por HPLCFR/MS e incubada durante hasta 2 días no mostró
xiii
mayor área de detección del CMP. Sin embargo, en muestras de leche incubadas por
En un tiempo superior a 2 días, se verificó la presencia de CMP, caracterizado por iones con
relaciones másicas de carga 1697,4+4 y 2263,3+3 y otros iones 1358+5 y 1301,2+5. Estos
Los últimos iones provienen de la hidrólisis de la κcaseína por las enzimas termorresistentes de
Pseudomonas fluorescens
El método de análisis HPLCFG no diferenció CMP del suero
leche, CMP y/o pseudoCMP producidas por proteasas de P. fluorescens. A
El análisis de CMP en la leche mediante HPLCFR/MS fue eficaz para detectar la adición de suero.
leche a leche sin proteólisis. Además, cuando la leche fue proteolizada por enzimas lácteas,
P. fluorescens este método pudo indicar que hubo proteólisis. Sin embargo, cuando el
La leche es proteolizada por P. fluorescens y se le ha añadido suero, no hay
cómo cuantificar la CMP que era producida únicamente por P. fluorescens y que se debía
únicamente a la adición de suero. Por lo tanto, el resultado del Índice CMP, como
previsto en la EN 69/2006, es un excelente indicador de la intensidad de la proteólisis
proteínas de la leche, o la adición fraudulenta de leche con suero, cuando
analizado por HPLCFR/EM, siendo un indicador eficiente de la calidad de la leche.
xiii
ABSTRACTO
MAGALHÃES, Mirella Araújo, M.Sc., Universidad Federal de Viçosa, noviembre de 2008.

Determinación de Fraude de Leche con Suero mediante Análisis de CMP y PseudoCMP mediante
Cromatografía Líquida de Alta Resolución en fase reversa con detección por espectrometría de masas.
Asesor: Mauro Mansur Furtado. Coasesores: Sebastião César Cardoso Brandão y Nélio José de Andrade
El objetivo principal de este trabajo fue el desarrollo de un método de análisis por
Cromatografía Líquida de Alta Resolución con fase reversa y detección por masa
espectrometría para determinar la adulteración de la leche con suero mediante detección
caseinomacropeptídio (CMP), y determinar el efecto en el cultivo de leche con
Pseudomonas fluorescens para verificar la aparición de pseudoCMP o CMP producida por
enzimas termorresistentes de bacterias psicrotróficas.
A las muestras de leche se les añadió suero en concentraciones de 0, 5, 10, 15 y 20%.
(v/v) y analizado por Cromatografía Líquida de Alta Resolución Filtración Gélica
(GFHPLC) y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa con
detección por Espectrometría de Masas (HPLCRP/MS). Se observó que había una
diferencia entre los métodos de análisis (p <0,05) y hubo un efecto de la
concentración de suero por dos métodos (p <0,05), es decir, el aumento en el suero
La concentración también causa un aumento en el área correspondiente de CMP por los dos
métodos. El CMP fue detectado por HPLCGF con un tiempo de retención de alrededor de 5,7
minutos. Cuando se analizó por HPLCRP/MS, el CMP se detectó en un tiempo de retención de
alrededor de 19 minutos y se caracterizó por iones de masa/carga 1697,4+4 y 2263,3+3.
Las muestras de leche cultivada con Pseudomonas fluorescens fueron incubadas
en diferentes días (0, 2, 4, 6 y 8) a 7 ºC, adicionados en diferentes concentraciones de suero (0,
5, 10, 15 y 20 % (v/v)) y analizados por HPLCFG y HPLCRP/MS. En muestras
de leche adicionada con Pseudomonas fluorescens y sin adición de suero, analizada por
HPLCFG, cuando se incubó durante hasta 2 días, no se encontró CMP. Aunque en muestras
de la leche incubada durante más de 2 días se encontró CMP; no procedente de la adulteración
de leche con suero. Las mismas muestras de leche agregadas a Pseudomonas fluorescens y no
el suero, analizado por HPLCRP/MS e incubado hasta por 2 días no presentó ninguna
aumentando en el área de detección de CMP. Sin embargo, en muestras de leche incubadas durante más de
xiv
A los 2 días se encontró CMP, caracterizado por iones de relación masa/carga 1697,4+4 y 2263,3+3
y otros iones 1358+5 y 1301,2+5. Estos últimos iones derivan del
hidrólisis de κcaseína por enzimas termorresistentes de Pseudomonas fluorescens.
El método de análisis de LAEFG no diferenció el CMP derivado de
suero, a partir de CMP y/o pseudoCMP producido por proteasis de P. fluorescens. El
Los análisis de CMP en la leche por CLAEFR/EM fueron eficientes para detectar la adición de
suero a la leche sin proteólisis. Además de eso, cuando la leche fue proteolizada por
enzimas de P. fluorescens este método podría indicar que hubo proteólisis.
Sin embargo, cuando la leche es proteolizada por P. fluorescens y cuando se agrega suero,
no había forma de cuantificar la CMP que era producida únicamente por P. fluorescens y
lo cual se debió únicamente a la adición de suero. En tal caso, el resultado del Índice de CMP,
Según lo previsto en la EN 69/2006, es un gran indicador de la intensidad de la proteólisis de la leche.
proteína, o luego, de la adición fraudulenta de leche y suero, cuando se analiza por
CLAEFR/EM, siendo entonces un gran indicador de la calidad de la leche.
xvi
1. INTRODUCCIÓN
La adulteración de leche, líquido y polvo, mediante la adición intencionada de suero.
La leche es un problema que viene preocupando a autoridades nacionales e internacionales.
Esto ocurre como consecuencia del bajo valor comercial del suero, su reducido
utilización en derivados y subproductos lácteos y el elevado coste de su eliminación.
Según proyecciones del Ministerio de Agricultura, Ganadería y
Oferta (2008), para la agroindustria global y para Brasil, entre derivados
De la leche, el queso es el de mayor volumen de producción. producción mundial
Se espera que aumente a 21,3 millones de toneladas en 2016.
Según RICHARDS (1997), la cantidad de suero generada en el
La elaboración del queso está en función del tipo de queso producido y de las técnicas de elaboración.
empleadas, pero en promedio, para hacer un kilo de queso se necesitan diez
litros de leche y, dependiendo del agua utilizada en la fabricación, de nueve a

doce litros de suero.
Normalmente se detecta una adición fraudulenta de suero a la leche y
cuantificado mediante la determinación del caseinomacropéptido (CMP), un fragmento
Kcaseína hidrofílica, liberada por la acción de la quimosina durante la coagulación.
Enzima láctea que permanece soluble en el suero y que debe estar ausente en la leche.
El CMP se puede cuantificar de forma no específica determinando
espectrofotométrico, basado en la reacción del ácido siálico presente en CMP, con p
dimetilaminobenzaldehído o ninhidrina ácida, formando complejos coloreados. El puede
También puede determinarse mediante métodos cromatográficos como HPLC.
(Cromatografía Líquida de Alta Resolución) en fase reversa (FR),
Exclusión molecular e intercambio iónico. Más recientemente, los métodos que utilizan
La electroforesis capilar se ha utilizado con éxito en la identificación y cuantificación de este
caseinomacropéptido en la leche.
Sin embargo, la actividad proteolítica de las enzimas termorresistentes, liberadas por
bacterias psicrotróficas, en la leche cruda y aquellas que permanecen activas en UAT (Ultra
Alta temperatura), puede provocar la liberación y aparición de una cierta cantidad de
CMP y un pseudoCMP. Esto se debe a la capacidad, aunque no tienen especificidad,
de enzimas proteolíticas para hidrolizar la caseína en sitios similares a los sitios
hidrolizado por quimosina.
1
La quimosina es una enzima utilizada en la producción de queso. Se hidroliza
concretamente el enlace 105106 de la κcaseína, generando dos péptidos diferentes: el
paraκcaseína (fragmento 1105 de κcaseína) que queda retenida en la masa del queso, y
otra es la parte residual de la caseína, la CMP (fragmento 106169 de κcaseína), que pasa al suero
(MOLLÉ y LÉONIL, 1995).
Las proteinasas psicrotróficas hidrolizan la caseína en el enlace 105106, lo que lleva a
formación de CMP, a pesar de ser menos específica que la quimosina y también
escindir los enlaces 103104, 104105, 106107 y 107108. El pseudoCMP puede diferir
de CMP por un solo aminoácido (metionina terminal en CMP, residuo 106 – alanina
terminal en pseudoCMP, residuo 107). PseudoCMP tiene un aminoácido
menos que CMP (fragmento 106169 de kcaseína) (RECIO et. al., 2000) . Por lo tanto, la
La liberación de esta pseudo CMP puede ocurrir naturalmente en la leche en condiciones de
almacenamiento y transporte, y varios factores, como el tiempo postordeño y
Las condiciones de transporte interfieren con su liberación. De esta manera, cualquier análisis basado en
en la identificación de CMP puede dar lugar a una clasificación errónea de las muestras, es decir,
Resultados falsos positivos respecto a la adición de otra cantidad de suero a la leche.
La presencia de concentraciones de CMP de hasta 30 mg/L, la leche podrá destinarse a
suministro directo. Cuando el índice CMP de la leche está entre 30 mg/L y 75
mg/L, esto sólo se puede utilizar para la producción de productos lácteos.
El índice CMP de la leche es superior a 75 mg/L, se puede utilizar para alimentación animal, para la
industria química en general, de acuerdo con las INSTRUCCIONES.
NORMATIVA Nº 69, de 13 de diciembre de 2006 (BRASIL, 2006).
Esto se debe a que tanto la leche con adición de suero como la leche cultivada por
Los psicrotrofos, que tienen una concentración de CMP superior a 30 mg/L, ahora pueden ser
considerada leche fraudulenta o de mala calidad.
El objetivo de esta investigación es el desarrollo de un método analítico mediante
Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas para
cuantificar la adulteración de la leche con suero y diferenciación de la proteólisis
causada por enzimas termorresistentes producidas por bacterias psicrotróficas.
2
2 OBJETIVOS
• Desarrollar un método de análisis mediante cromatografía líquida.
Alta eficiencia con detección por espectrometría de masas para
determinación de fraude de suero de leche y determinación de
proteólisis causada por enzimas termorresistentes producidas por
Pseudomonas fluorescens.
• Comparar metodología desarrollada por cromatografía líquida de alta resolución.
eficiencia con detección por espectrometría de masas con el
Cromatografía líquida de alto rendimiento con filtración en gel para
Determinación del fraude de suero de leche y proteólisis causados.
por enzimas termorresistentes producidas por Pseudomonas fluorescens.
3 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
3.1 – Leche UAT
La leche, desde el punto de vista nutricional, se considera uno de los alimentos más
equilibrados y completos. Se consume en todas partes del mundo, tanto en su
forma líquida como en forma de sus más diversos derivados, proporcionando la
satisfaciendo gran parte de nuestras necesidades diarias (CALDEIRA et al., 2006).
Se entiende por leche UAT (Ultra Alta Temperatura) aquella leche homogeneizada que
se sometió, durante 2 a 4 segundos, a una temperatura entre 130 ºC y 150 ºC,
a través de un proceso térmico de flujo continuo, inmediatamente enfriado a una
temperatura inferior a 32 ºC y envasado en condiciones asépticas en envases
estéril y herméticamente cerrado (BRASIL, 1997).
El tratamiento UAT ha sido ampliamente adoptado en productos lácteos, siendo bastante
aceptado por los consumidores, debido a la facilidad de almacenamiento a temperatura ambiente y
vida útil más larga. Esto permite incluir leche en la compra mensual de
consumidor, no necesitando comprarlo diariamente como la leche pasteurizada
(VIEGAS et. al. 2006).
La creciente producción y consumo de leche UAT en Brasil ha despertado, cada
creciente interés en la investigación relacionada con la calidad de este producto. Éste
El control de calidad debe realizarse mediante evaluaciones periódicas de la composición.
3
físicoquímico y microbiológico para tener una idea sobre la calidad del
materia prima utilizada y la eficiencia del procesamiento térmico (COELHO, 2000).
3.2 – Importancia de las bacterias psicrotróficas en la proteólisis de la leche
Los microorganismos que normalmente contaminan la leche crecen en una amplia gama de
faixa de temperatura, podendo ser divididos em psicrófilos, mesófilos, termófilos.
Los microorganismos psicrófilos son aquellos que tienen una temperatura de multiplicación.
entre 0 °C y 20 °C, con un óptimo entre 10 °C y 15 °C. Los mesófilos constituyen el
grupo que incluye la mayoría de los microorganismos acidificantes de la leche, y puede ser
caracterizado por desarrollarse entre temperaturas de 20 ºC y 45 ºC, con
Temperatura óptima de crecimiento entre 30 ºC y 40 ºC. Las bacterias termófilas son
se definen como aquellos cuya temperatura óptima de crecimiento está entre 45 ºC y 65
ºC, y para algunas especies consideradas termófilas extremas, las temperaturas
el crecimiento puede alcanzar los 90 ºC y la mínima alrededor de los 35 ºC (LORENZETTI, 2006).
El término psicrotrófico fue introducido en 1960 y mejor definido en 1976 por
FIL (Federación Internacional de Lácteos) como microorganismos que tienen la
capacidad de crecer a 7ºC o menos sin considerar su temperatura óptima
crecimiento (HAJDENWURCEL, 2004).
Los psicrotrofos son potencialmente la causa más importante de productos con
Baja calidad, constituyendo un factor limitante en el tiempo de almacenamiento de la leche.
crudo con procedimientos de manipulación. En la industria láctea, donde grandes
grandes volúmenes de leche se almacenan a temperaturas de refrigeración entre 1 y 6 ºC por
Durante largos períodos, las bacterias psicrotróficas encuentran las condiciones óptimas para su
desarrollo y puede causar cambios indeseables en la leche y sus
derivados (LORENZETTI, 2006).
La implementación del almacenamiento refrigerado de leche cruda en el origen de producción.
comenzó en Brasil, en los años 90, y es obligatorio, salvo excepciones (hasta dos horas
después del ordeño), por el Ministerio de Agricultura en 2002 (BRASIL, 2002).
El uso de refrigeración se ha adoptado en todos los niveles de procesamiento.
leche en la industria. La introducción de depósitos isotérmicos en la explotación permite almacenar la leche
de varios ordeños. La descentralización de los puestos de leche permitió su transporte
refrigerados en camiones cisterna para largas distancias. Los problemas relacionados
con el crecimiento de la microflora mesófila se redujeron considerablemente. Esta condición, en
4
Sin embargo, selecciona el desarrollo de organismos psicrotróficos, que tienen
considerable poder de deterioro. La mayoría de las bacterias psicrotróficas no
patógenos, pero cuando crecen en leche o productos lácteos, pueden producir un
serie de problemas que incluyen proteólisis incontrolada, problemas de textura, aromas
y sabores desagradables (FUKUDA, 2003).
Además de las precauciones relativas a la obtención de leche, la temperatura y
tiempo de almacenamiento, ya que si la leche permanece por mucho tiempo en tanques con
temperatura de aproximadamente 4ºC, provoca la multiplicación de psicrotrofos
(FAGUNDES et.al., 2006). A temperaturas de almacenamiento superiores a 4°C,
entre 5º y 10ºC, el tiempo necesario para que las bacterias psicrotróficas alcancen un aumento
La velocidad de su población es inferior a 48 horas. Estas condiciones pueden causar la
aumento de la proteólisis. En la mayoría de las granjas lecheras, la temperatura
la refrigeración oscila entre 5 y 10ºC, lo que constituye un “enfriamiento marginal de la leche”,
contribuyendo a la multiplicación de microorganismos psicrotróficos (FONSECA y
SANTOS, 2000).
La mayoría de los microorganismos psicrotróficos están presentes en la leche y los productos lácteos.
Proviene del suelo, el agua y la vegetación. Sin embargo, la principal fuente de
La contaminación de la leche y los productos lácteos con bacterias psicrotróficas sigue siendo el principal problema.
utensilios y equipos que no fueron lavados y desinfectados eficientemente,
utilizado en el manejo de leche en granjas y plantas procesadoras (ALVIM,
1992).
Una característica importante de los psicrotrofos que se encuentran en la leche y los productos lácteos.
derivados es su capacidad para sintetizar, durante la fase logarítmica, enzimas extracelulares
que degradan los componentes de la leche. Aunque durante la pasteurización de la leche el
La gran mayoría de psicrotrofos son destruidos, este tratamiento térmico tiene poco
efecto sobre la actividad de las enzimas termorresistentes producidas por estos microorganismos
(CUNHA y BRANDÃO, 2000). bacterias psicrotróficas,
aparentemente, no son significativos para la proteólisis a menos que la población supere las 106
UFC/mL (FOX, 19, 89).
Las proteasas son producidas por una serie de bacterias psicrotróficas, siendo
predominantemente bacilos Gram negativos responsables del deterioro de la leche
(FUKUDA, 2003).
Las bacterias del género Pseudomonas se encuentran entre las que producen enzimas.
Los hidrolíticos y las proteasas y lipasas producidas por ellos ya están bien caracterizados.
5
(CARDOSO, 2006). Este género incluye especies que tienen un tiempo de generación.
corta entre 0°C y 7°C, y una temperatura mínima de crecimiento baja de hasta 10°C
(SORHAUG y STEPANIAK, 1997).
Las especies más comunes de psicrotrofos que se encuentran en la leche son
Pseudomonas spp; particularmente Pseudomonas fluorescens. Como proteasas
procedentes de Pseudomonas pueden degradar las caseínas κ, β y α, mientras que
Estas enzimas no afectan a las proteínas séricas (SHAH, 1994).
En un trabajo de revisión, DATTA y DEETH (2001) informaron que la
proteinasas termoestables producidas por contaminantes bacterianos psicrotróficos de
leche cruda, también son capaces de hacer que la leche UAT se gelifique. LEY y otros (1977)
investigó la gelificación de la leche UAT por proteinasas de cepas de
Pseudomonas fluorescens aisladas de leche cruda y concluyeron que conducían a
formación de un gel en un tiempo que depende del grado de crecimiento del organismo,
antes del tratamiento térmico.
(DATTA y DEETH, 2001) informaron que los fragmentos peptídicos resultantes
de esta proteólisis tienen una masa molar similar a la del CMP, es decir, una pseudo
CMP. PseudoCMP se diferencia de CMP por un solo aminoácido (metionina terminal en el
CMP, residuo 106 – alanina terminal en pseudoCMP, residuo 107). Sin embargo algunos
Las proteasas de P. fluorescens también pueden producir una cierta cantidad de CMP (RECIO
te. al, 1996 a).
Según DESAMASURES y GUEGUEN (1997), en un extenso trabajo que informa
los resultados del seguimiento de la calidad de la leche cruda refrigerada, señaló el
microorganismos psicrotróficos del género Pseudomonas como los más importantes en
términos de contaminación microbiológica. Otros microorganismos aislados en este estudio.
fueron lactococos, lactobacilos y levaduras. Este género incluye especies que
caracterizado por presentar alta diversidad genética y mecanismos fisiológicos de
adaptación y crecimiento a bajas temperaturas (LORENZETTI, 2006).
Varios problemas de calidad de los productos lácteos pueden estar asociados con
acción de proteasas y lipasas de origen microbiano tales como: cambios en el sabor y olor de
leche, pérdida de consistencia en la formación del coágulo para la elaboración del queso y
gelificación de leche de larga duración (KOHLMANN et al., 1991 a). Estas enzimas son
también relacionado con defectos sensoriales (DOGAN y BOOR, 2003), inestabilidad
temperatura de la leche (ADAMS et al., 1975) y reducción del rendimiento en la producción de queso
(STOFER y HICKS, 1983).
6
3.3 Métodos de seguimiento de la proteólisis de la leche
Los métodos más utilizados en el estudio de la proteólisis fueron los basados en
determinación del nitrógeno soluble (método Kjedhal), un elemento liberado cuando
La proteína se hidroliza utilizando un agente precipitante (por ejemplo,
ácido tricloroacético), y en la determinación de grupos αamino libres y aminoácidos
aromáticos, con énfasis en los métodos de Hull y TNBS (Trinitrobencenosulfona).
Entre estos métodos, la determinación de nitrógeno es el que tiene menor sensibilidad en
detección de proteólisis en la leche y, por lo tanto, rara vez se utiliza en la actualidad.
El uso del reactivo trinitrofluorobenceno (TNBS) en la estimación de la proteólisis.
de leche fue evaluado por McKellar (1981), en un estudio que buscó correlacionar la
grado de proteólisis de la leche (pasteurizada y UAT) con apariencia de no
característica (“mal sabor”) en los productos. El autor destaca que esta metodología es capaz de
para monitorear la proteólisis de la leche UAT almacenada debido a su capacidad para medir
pequeños aumentos en los grupos αamino libres al comienzo del almacenamiento, y con estos
Con estos datos es posible preestablecer la vida útil del producto. Sin embargo esto
El procedimiento analítico tiene algunas desventajas tales como: duración del análisis,
La contaminación del reactivo por ácido pícrico promueve un aumento en los valores de
“Blanco” y la interferencia de algunos componentes como azúcares y amoníaco.
(SILVESTRE, 1997)
El procedimiento que utiliza el reactivo de ninhidrina se basa en la reacción de
compuesto con grupos αamino libres, favoreciendo la aparición del color, cuyo
La intensidad se puede medir mediante espectrofotometría a 570 nm (GOMES, 1996). A pesar de
Aunque es un método con buena sensibilidad, tiene algunas deficiencias como alta
sensibilidad a la acción del oxígeno y la duración del análisis es extensa debido a la
Pasos de calentamiento y enfriamiento, necesarios para la formación del cromóforo.
(SILVESTRE, 1997).
Ácido Nacetilneuramínico (NANA o ácido siálico), un componente de
caseinomacropéptido (CMP), se puede utilizar para controlar la proteólisis de
leche. GOMES (1996) utilizó el método de la ninhidrina ácida, desarrollado inicialmente
para detectar fraude en el suero (FUKUDA, 1992), para evaluar la proteólisis
de leche UAT, obteniendo buenos resultados. MOTTAR et al. (1985) comparando los niveles de
ciertos productos de la proteólisis de la leche debido a la acción de proteasas bacterianas,
determinado por el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con el
7
valores de ácido siálico en las mismas muestras, observaron una correlación significativa
entre estos compuestos (mayor que 0,8, p < 0,001). Sin embargo, el método del ácido siálico
sufre interferencia de la leche de vacas con mastitis.
La cromatografía líquida de alta resolución se ha utilizado ampliamente en la actualidad,
en el análisis de detección CMP, que tiene una masa molar de alrededor de 8000 Dalton,
permitiendo su separación de otros péptidos de la leche, utilizando
HPLC – filtración en gel. El método consiste en un sistema de bombeo isocrático,
estando compuesta la fase móvil por una solución tampón fosfato, a pH 6,0. La columna
Generalmente se utiliza el ZORBAX GF 250 (Du Pont), cuyo principio de separación
Se basa en la exclusión molecular. La detección se realizará mediante espectrofotometría UV, en el
longitud de onda de 205 nm, cuantificándose los compuestos mediante integración
Electrónica de las zonas de pico (ALVIM, 1992). El análisis de filtración por HPLCgel se puede
realizar de acuerdo con la INSTRUCCIÓN NORMATIVA N° 68, de 12 de diciembre de
2006 del Ministerio de Agricultura (BRASIL, 2006).
Un artículo de revisión escrito por GONZÁLEZLLANO et al. (1990) informa la
Uso de la cromatografía líquida de alta resolución en la evaluación de compuestos.
Nitrógeno en productos lácteos. Según los autores, esta metodología se caracteriza
debido a su versatilidad, tiempo de análisis relativamente corto, buena resolución y eficiencia en
separación de componentes.
Para el análisis de la proteólisis en leche y productos lácteos se ha utilizado la HPLC en
fase inversa y filtración en gel (MOTTAR et al., 1985), LÓPEZFANDIÑO et al., (1993).
RECIO et al. (1996 b) utilizaron UAT de fase inversa para determinar la ubicación de
hidrólisis de κcaseína por quimosina y enzimas microbianas. Fueron capaces de
obtener la separación de las variantes genéticas A y B de κcaseína mediante precipitación
con TCA 4%. Sin embargo, esta metodología presenta algunas dificultades en su
empleo a escala industrial, debido al costo relativamente alto en su
implementación y la necesidad de personal capacitado, ya que no es una técnica fácil
ejecución.
Los principales péptidos procedentes de la acción de las proteinasas bacterianas.
Las cepas psicrotróficas en κcaseína se separaron mediante cromatografía de fase inversa y
electroforesis capilar e identificado por espectrometría de masas con ionización
electrospray en estudios realizados por RECIO et al. (2000b). Se observó un
coincidencia con productos de degradación encontrados previamente en la leche UAT
abastecido. Los resultados demostraron que las proteinasas psicrotróficas hidrolizan
8
caseína en el enlace 105106, dando lugar a la formación de CMP, a pesar de ser menos
específico que la quimosina y también escinde los enlaces 103104, 104105, 106107 y
107108. Por lo tanto, no se puede considerar la presencia de CMP en la leche UAT.
indicador exclusivo de adulteración de la leche con suero.
Otro método de análisis de CMP, la electroforesis capilar, es un sistema
electroforético que presenta algunas ventajas en relación a los procedimientos convencionales
Electroforesis convencional. Este método utiliza pequeños tubos capilares, con
diámetros internos que varían entre 20 a 200 μm, y altos voltajes (20 a 25 kV), que
Permite una separación eficiente, con buena resolución, tanto de pequeños como de grandes.
moléculas de proteínas. Algunos investigadores han utilizado actualmente esta técnica.
análisis para el seguimiento de la proteólisis de la leche UAT, recomendándolo tanto para
trabajos de investigación como control de calidad de productos a escala industrial,
debido a su excelente resolución, fácil ejecución y velocidad de análisis (RECIO et al.,
1996b).
JONG et al., (1993) concluyeron que la electroforesis capilar es una técnica para
gran potencial en la evaluación de proteínas de la leche, siendo capaz de realizar cientos de
análisis, debido a la buena durabilidad del tubo capilar utilizado para este fin.
Algunas investigaciones han desarrollado pruebas inmunoenzimáticas, con énfasis en
“Prueba de Inmunoabsorción Enzimática” (ELISA), con el fin de estimar el grado
de la proteólisis de la leche. Para evaluar este fenómeno, los métodos ya desarrollados
se basan en la cuantificación de productos de proteólisis, principalmente CMP o
GMP, o proteasas bacterianas que se encuentran en la leche (PICARD et al., 1994).
SYMONS & EWINGS (1990), utilizando anticuerpos monoclonales producidos
a partir de proteasas de cepas de la bacteria Pseudomonas fluorescens, desarrolladas
un método ELISA para monitorear la proteólisis de la leche con sensibilidad a
detectar niveles de hasta 3,0 ng de proteasa bacteriana por mililitro de leche. De acuerdo con
un estudio realizado previamente, niveles reducidos de proteasas (3 a 30 ng/mL de
leche) puede causar gelatinización de la leche UAT después del almacenamiento
durante 3 a 15 días a una temperatura de 23 ºC (MITCHEL y EWINGS, 1985).
PICARD y cols. (1994) desarrollaron una prueba ELISA para la detección de CMP
en leche con el fin de evaluar el grado de proteólisis de la kcaseína debido a la
acción de enzimas proteolíticas de microorganismos psicrotróficos en la leche cruda almacenada en
temperatura de refrigeración. El ensayo utilizó un péptido sintético similar al CMP.
como antígeno y el límite de detección de la prueba fue de 0,1 µg/mL y con un coeficiente de
9
variación inferior al 10%. Esta metodología se utilizó posteriormente para evaluar la
Grado de proteólisis de la leche cruda y UAT. Según los investigadores, la leche UAT no debería
gelatinizar cuando el nivel de CMP en la leche cruda es inferior a 5 µg/mL de leche
(PICARD et al., 1996).
3.4 Caseinomacropéptido
La caseína (CN) constituye la principal fracción proteica de la leche, tanto por su
concentración ya que es una proteína de alta calidad biológica.
Las caseínas de la leche de vaca se componen aproximadamente de un 50% de αcaseína.
(incluyendo αs1 caseína y αs2 caseína), 30% βcaseína, 15% kcaseína y 5%
γcaseína (BURAGLIA, 2001).
La κcaseína es la fracción más soluble de las caseínas, en presencia de una amplia
rango de concentración de iones calcio. Representa el 15% del total de caseínas, actuando como
agente estabilizante de la micela de caseína. Consiste en un polipéptido de
169 aminoácidos (DRACZ, 1996).
GOURSAUD (1985) citado por ALVIM (1992) comprobó que existen dos
variantes genéticas de κcaseína, A y B. Estas variantes constituyen una masa molar
equivalente a aproximadamente 19.000 Daltons. La variante A (κCN A) difiere de
variante B (κCN B) reemplazando un residuo de treonina con isoleucina en la
posición 136 y un residuo de ácido aspártico por alanina en la posición 148
(ASCHAFFENBURGO, 1968).
Varias enzimas proteolíticas hidrolizan la κcaseína, lo que merece atención
especialmente quimosina (EC.3.4.23.4) que la hidroliza entre los aminoácidos fenilalanina
(105) y metionina (106) (FOURNET et al., 1979). Dos fragmentos o péptidos son
producido a partir de esta hidrólisis: un Nterminal llamado paraκcaseína (aminoácidos 1
105); y otro soluble en ácido tricloroacético (TCA) al 8%, llamado
caseinomacropéptido (aminoácidos 106169), que contiene diferentes
contenidos de fosfato y carbohidratos (VREEMAN et al., 1986). La figura 1 representa la ubicación.
de la acción de la quimosina sobre la κcaseína.
10
123 103 104 105 106 107 108 167 168 169
GluGluGlnLeuSerPhe____MetAlaIIeThrAlaVal
quimosina
parakcaseína glicomacropéptido
FUENTE: FENNEMA (2000)
Figura 1 Sitio de acción de la quimosina sobre la κcaseína
El caseinomacropéptido (CMP) es un polipéptido de 64 residuos de aminoácidos
(106169) derivados de la parte Cterminal de la κcaseína bovina. en lanzamiento
por la acción de la quimosina (EC 3.4.23.4) durante la fase primaria de la coagulación de la leche
(MOLLÉ y LÉONIL, 1995). Caseinomacropéptido es uno de los numerosos nombres para
péptidos resultantes de la descomposición de la κcaseína. El péptido también se conoce como
glicomacropéptido (GMP), glicomacropéptido de caseína (CGMP) o péptido derivado
de caseína (CDP). Generalmente, la forma glicosilada se llama GMP,
debido a su alto contenido de carbohidratos, y CMP es la forma no glicosilada de
péptido (TULLIO, 2007). La Figura 2 muestra la estructura primaria del GMP.
106 110 120

H.MetAlaIleProProLysLysAsnGlnAspLysThrGluIleProThrIleAsnThrIle
130 140
AlaSerGlyGluProThrSerThrProThr[Thr]GluAlaValGluSerThrVarAlaThr
Variante B [IIe]
150 160
LeuGlu[Asp]SerProGluValHeGluSerProProGluIleAsnThrValGlnValThr
Variante B[Ala] P
169
SerThrAlaVal.OH
FUENTE: BRODY (2000)
Figura 2 Estructura primaria del glicomacropéptido
En la tabla 1 se muestra la composición teórica de los aminoácidos encontrados.

sin BPF.
11
Tabla 1 Composición teórica de aminoácidos presentes en el glicomacropéptido
AMINOÁCIDOS ABREVIATURA VALOR TEÓRICO* (%)
Ácido aspartico Áspid 8,5

Treonina tr 18,2
Ácido Ser 7,8
glutámico serina glu 19,2
Glicina Gly 0,9
Alanina Tierra 5,3
valina vale 8,9
Metionina De 2,0
isoleucina IIe 10,1
leucina León 1,7
Tirosina tiro
Fenilalanina phe
Histidina Su
lisina Luz 00
arginina Arg
Prolina Pro 0 5,7 0 11,6
FUENTE: CHU, MACLEOD, OZIMEK (1996)

*Valor Teórico calculado según la estructura primaria GMP
La CMP derivada de la κcaseína es muy heterogénea y puede presentar cuatro
variaciones genéticas; A, B, C y E. Formularios A y B (CMPA y CMPB, respectivamente)
son las variantes más comunes de la κcaseína procedente de la leche de vaca. La APMC y
El CMPB puede estar en forma glicosilada o aglicosilada. Las formas A y B del aglico
CMP, tiene una masa molar de 6787 y 6755 Daltons, respectivamente. El promedio masivo
molar del CMP total es de aproximadamente 7500 Da y se puede encontrar un valor superior de hasta
9631 Da (MOLLÉ y LÉONIL, 2005). La forma glicosilada representa el 5060%
de CMP total y está compuesto por Gal (galactosa), GalNAc (Nacetilgalactosamina),
El NeuAc (ácido acetilneuramínico), este último conocido como ácido siálico, es el más frecuente (THOMÄ,
KRAUCE, KULEZIK, 2006). estudios dalgleish
(1986) demostraron que la acción de la renina sobre las variables genéticas A y B es independiente de
Región glicosilada de la proteína, presente en la micela. Encontró además que el
La concentración de CMP liberada no varía con la proporción entre variantes genéticas.
A e B da k caseína.
12
CHERVOVA et al. (1988) determinaron la estabilidad térmica, composición
contenido de aminoácidos y el peso molecular del CMP, concluyendo que su estabilidad térmica
alto se debe principalmente al alto contenido de ácido siálico en su estructura.
El CMP está presente en el suero en una concentración de 1,2 g/l a 1,5 g/l y se
Rico en aminoácidos de cadena ramificada (valina e isoleucina) y libre de aminoácidos.
aromáticos (OLIVA, ESCOBAR, PONCE, 2002).
La principal pseudoCMP (CMP que surge de la proteólisis de la κcaseína por enzimas
producida por bacterias psicrotróficas) se diferencia de la CMP por un solo aminoácido
(metionina terminal en CMP, residuo 106 – alanina terminal en pseudoCMP, residuo
107). Este pseudoCMP tiene un aminoácido menos que el CMP. A pesar de
algunas proteasas de P. fluorescens también pueden producir una cierta cantidad de CMP
(RECIO et. al., 1996 a).
3.5 Efecto de la concentración de ácido tricloroacético (TCA) sobre la solubilización de
CMP
El ácido tricloroacético (TCA) se utiliza en diferentes concentraciones para
Separar péptidos de proteínas, debido a diferencias en solubilidad. La naturaleza heterogénea de
Se ha sugerido que se libera material nitrogenado soluble de la κcaseína por la acción de la quimosina.
por ALAIS et al. (1953), quienes informaron que la cantidad de nitrógeno no proteico
(NPN) recuperado varía con la concentración de TCA utilizada como agente precipitante.
ARMSTRONG y cols. (1967) observaron que el material soluble formado por
La acción de la quimosina sobre la κcaseína consiste en una serie de macropéptidos y que
Estos pueden fraccionarse mediante precipitación cuando se utilizan concentraciones crecientes.
de TCA. Según los resultados, concluyeron que la solubilidad del CMP en TCA
está relacionado con el contenido de carbohidratos del péptido. La porción soluble en TCA
El 12% comprende péptidos más pequeños, más cargados negativamente y ricos en

carbohidratos.
HOOYDONK y OLIEMAN (1982) realizaron pruebas con CMP derivadas de
κcaseína y con suero, verificando que la concentración final óptima de
El TCA para la preparación de muestras para ser analizadas por HPLC es del 8%. Usando esto
Se precipitan la concentración de TCA, las caseínas y las proteínas del suero.
Las concentraciones más bajas de TCA resultan en una eliminación ineficiente de proteínas y
Concentraciones superiores al 8% provocan un aumento en la precipitación de CMP.
13
HOOYDONK et al. (1984) informaron que la solubilidad de CMP en TCA depende
carga y contenido de carbohidratos. Los péptidos más cargados negativamente o más ricos.
en carbohidratos son los más solubles en TCA, y la solubilidad de CMP
disminuye sustancialmente al aumentar la concentración de ácido, ya que alrededor del 50%

de CMP es soluble en TCA 8% y sólo alrededor del 25% en TCA 12%.
YVON et al. (1992) estudiaron los mecanismos de precipitación de péptidos.
en TCA. Concluyeron que el ácido interactúa con los péptidos, induciendo un aumento en
hidrofobicidad de estas fracciones proteicas. Una mayor hidrofobicidad puede provocar
agregación de péptidos. Los factores que condicionan la solubilidad de un péptido
son: tamaño (número de residuos o masa molar), hidrofobicidad y carga a pH
ácido. Con base en sus resultados, concluyeron que no es posible establecer una relación
entre el tamaño del péptido y su solubilidad. Sin embargo, cada péptido que contiene
menos de 7 residuos de aminoácidos eran solubles en concentraciones de TCA
utilizados (2, 4, 8 y 12%). Este resultado puede tener algún interés práctico, ya que
Por ejemplo, en el análisis de hidrolizados comerciales que contienen pequeños péptidos se utilizan.
en nutrición parenteral. Los autores señalan que la solubilidad del péptido en TCA
disminuye, tanto al aumentar la concentración de TCA como al aumentar
concentración del péptido, y sugiere que este hecho se debe a la competencia entre moléculas
de TCA y agua.
3.6Métodos para detectar el fraude en el suero de leche
Uno de los métodos utilizados para cuantificar CMP detecta la presencia de
ácido siálico, también llamado NANA (ácido Nacetilneuramínico), uno de los
carbohidratos vinculados al CMP, que se pueden medir cuantitativamente a través de
densidad óptica a 549 nm según WARREN (1959). Este método ha sido modificado.
por WOLFSCHOONPOMBO y PINTO (1985) reemplazando el agente complejante
resorcinol propuesto por WARREN (1959) utilizando el reactivo de Erlich. El método
modificado permite detectar la adulteración de la leche fresca pasteurizada con, al menos,
2% de suero, pero requiere excesivo tiempo de análisis. Otro
La desventaja de este método es que aún puede sufrir interferencias causadas por la leche.
vacas con mastitis, interferencia provocada por la presencia de células somáticas en la leche.
HOOYDONK y OLIEMAN (1982) desarrollaron un método de
Cromatografía Líquida de Alta Resolución por filtración en gel (HPLCFG), con el
14
objetivo de controlar la acción de la renina en la leche. El método permite cuantificar el CMP
liberado a una longitud de onda de 205 nm. OLIEMAN y BEDEM (1983) utilizaron
el mismo método para cuantificar la adición de sólidos de suero de queso a la leche en polvo,
este método fue adoptado como oficial por el Mercado Común Europeo (MEC).
BRANDÃO et al. (1988) utilizaron el método de filtración gelínica HPLC para la
análisis de muestras de leche pasteurizada, tipo C, comercializada en algunos estados del
Brasil. Descubrieron que a partes de estas muestras se les añadió suero.
VILELA (1987) desarrolló un método para detectar CMP en leche en polvo.
y leche pasteurizada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para
realizar separación y densitometría para cuantificación. A pesar de la metodología
presentan alta sensibilidad (0,5% de suero de queso añadido), el total
El análisis puede considerarse largo en comparación con la técnica HPLC.
filtración en gel.
En experimentos realizados por OLIEMAN y RIEL (1989), utilizamos
HPLC en columna de fase reversa (HPLCFR) para estudiar el comportamiento de
Proteólisis extensa en la leche, causada por bacterias psicrotróficas. En 1990, este método
fue considerado oficial para la detección de suero de queso en muestras de leche por el
MCE.
ALVIM (1992) realizó un estudio de la influencia de la calidad de la leche en
Resultados del método HPLCFG, cuando se utiliza para detectar suero.
agregado a este producto, y concluyó que los resultados positivos, en cuanto a la presencia de
CMP, puede interpretarse como la adición de suero a la leche, o como proveniente de
detección de productos derivados de una proteólisis excesiva provocada por Pseudomonas. oh
El Ministerio de Agricultura de Brasil adoptó este método como oficial en 1991 (Ordenanza
No. 124, de 23 de septiembre de 1991 y republicado el 20 de noviembre de 1991 en el Diário
Funcionario sindical, página. 2624526246).
MOLLÉ y LÉONIL (1995), realizaron el primer uso de dos métodos
combinados, HPLCFR y Espectrometría de Masas, para el análisis y caracterización de los
CMP. A través de los resultados obtenidos, concluyeron que el uso de estos métodos
combinado ofrece una alternativa muy prometedora para el análisis de mezclas
complejo, especialmente cuando existe cierta dificultad para separarlo sólo por
CLAE.
NONI y RESMINI (2005) utilizaron HPLCespectrometría de masas
ionización por electropulverización para detectar la presencia de CMP A, presente en la fase acuosa de
15
mantequilla, procedente de una posible adición de suero en la fabricación de mantequilla. Él era
Se analizó la nata fresca y la nata madurada. Los resultados demostraron que aquellos
péptidos distintos de CMPA, que interfieren con el perfil de HPLC, pueden haber sido
formado en la crema después de una maduración prolongada con cultivos iniciadores bacterianos
ácidos lácticos. Además, la proteólisis causada por Pseudomonas fragi ATCC 4973 fue
estudiado en crema. En este caso, la κcaseína libera diferentes péptidos, incluido el CMPA, cuando
la flora bacteriana alcanza >106 UFC/g. Para éstos
razones, sólo la cromatografía líquidaespectrometría de masas (LC/MS) puede mostrar
inequívocamente la presencia de compuestos CMPA y luego el uso de suero en
fabricación de mantequilla.
El método HPLC: espectrometría de masas de ionización por electropulverización.
propuesto por NONI & RESMINI (2005) demostró ser seguro y no se vio afectado por
Fenómenos de proteólisis que pueden ocurrir en la crema durante la fabricación de
manteca. Sólo es inaceptable la contaminación de la crema por bacterias.
Los psicrotrofos pueden producir APLV y, por lo tanto, no proporcionan un resultado falso positivo.
MOLLÉ y LÉONIL (2005) propusieron un método para cuantificar la
aglicoCMPA y CMP total (incluidas las formas aglico y glicosilada) en diferentes
tipos de productos lácteos comerciales que utilizan HPLCFR con detección espectrométrica
de masa de ionización por electrospray. Análisis cuantitativo por Espectrometría
masa (MS) se basaron en la detección de aglico
CMPA y aglicoCMPB. Debido al alto grado de sensibilidad y selectividad de
espectrometría de masas, es posible detectar fragmentos de iones característicos de
CMP, permitiendo su identificación inequívoca en productos lácteos.
Se han estudiado y propuesto varios otros métodos para detectar
adulteración de la leche con suero. Estos métodos requieren trabajo excesivo.
laboratorio, tiempo de análisis prolongado y baja sensibilidad.
FENG y CUNNINGHAMRUNDLES (1989) informaron sobre la producción de
anticuerpo monoclonal contra la κcaseína, que fue probado por "enzima ligada
ensayo inmunoabsorbente" (ELISA) y demostró ser específico contra la κcaseína bovina.
Mediante radioinmunoensayo se pueden detectar 0,3 x 104 nM/ml de κcaseína. el anticuerpo
no mostró interacción con otras proteínas de la leche ni contra la κcaseína humana,
contra el cual también fue probado.
Se realizó el aislamiento de dos anticuerpos monoclonales contra la κcaseína bovina.
informado por KUZMANOFF et al. (1990). Se utilizaron anticuerpos para mapear la
dieciséis
Región del epítopo de la proteína. El estudio demostró que el reconocimiento de la
La unión del anticuerpo puede depender de la estructura terciaria y no simplemente
de la estructura primaria de la κcaseína. También demuestran que cuando se trató con κcaseína
con quimiosina, las fracciones solubles e insolubles fueron reconocidas por los anticuerpos, que
lo que sugiere que pueden estar presentes regiones similares en ambas fracciones. Después de
eliminación de carbohidratos, uno de los anticuerpos mostró un aumento en el grado de interacción
con κcaseína. Los autores sugieren que la secuencia de aminoácidos (ProThrThr)
aparecer en las posiciones 92 a 94 y 134 a 136 representaría el posible sitio de unión
de anticuerpos. Las posiciones 131, 133, 135 y 136 son reconocidas como los sitios de
unión de carbohidratos en la molécula de κcaseína.
PICARD y cols. (1994) desarrollaron un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas mediante ELISA
para la detección de CMP en la leche para estimar la proteólisis de Kcaseína
debido a la acción de enzimas de bacterias psicrotróficas en la leche cruda almacenada a baja temperatura.
temperatura. El ensayo se desarrolló utilizando un péptido sintético de 11
aminoácidos, representativos de la región Nterminal de CMP bovina, como inmunógeno. oh
El péptido sintético se conjugó con una proteína portadora por su parte Cterminal,
y el antisuero se obtuvo de conejos. El límite de detección de CMP en la leche fue de 0,1
g/ml.
DRACZ (1996), desarrolló un método inmunoenzimático para determinar
de suero añadido a la leche. La técnica “inmunodotblot” desarrollada debido a
Debido a su gran sensibilidad, demostró ser adecuado para la detección de suero.
agregado a la leche hasta un límite del 1% (v/v) de suero agregado, esta es una ventaja de
método desarrollado en relación al método oficial que utiliza cromatografía líquida de
exclusión molecular.
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Recogida de leche UAT sin CMP
Se recolectó leche UAT comercial sin CMP de una fábrica de lácteos en
el mismo día de elaboración, e inmediatamente congelado a – 23 °C. La determinación de la
La exención de CMP en la leche se llevó a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Filtración en gel (HPLCFG).
17
4.2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche
Leche UAT libre de CMP fue sometida a análisis fisicoquímicos
(densidad, crioscopia, acidez, sólidos totales y sólidos no grasos) y análisis
microbiológicos (recuento en placa estándar y recuento psicrotrófico). Los análisis fisicoquímicos
se realizaron de acuerdo con la INSTRUCCIÓN NORMATIVA N° 68,
de 12 de diciembre de 2006 (Métodos Analíticos Fisicoquímicos Oficiales para
Control de Leche y Productos Lácteos) (BRASIL, 2006). Los análisis microbiológicos se realizaron
de acuerdo con la INSTRUCCIÓN NORMATIVA N° 62, del 26 de agosto.
2003 (Métodos Analíticos Oficiales de Análisis Microbiológico para el Control de Productos de
Origen Animal y Agua) (BRASIL, 2003). Todos los análisis fueron
realizado por triplicado.
4.3 Análisis de muestras de leche UAT mediante HPLCFG
Todos los análisis para determinar CMP por HPLCFG se llevaron a cabo de acuerdo con
según la metodología desarrollada por ALVIM (1992).
Para determinar la concentración de CMP en la leche se utilizó un cromatógrafo.
líquido de alto rendimiento (HPLC) modelo Prominence de Shimadzu, compuesto por
siguientes módulos; Desgasificador DGU 20A5, Bomba Prominence LC 20AT, Inyector
Automático SIL 10AF, Interfaz CBM 20A y Detector UV – visible SDP 20A.
La columna cromatográfica utilizada para el análisis de CMP por HPLCFG fue la
Zorbax GF250 (250 mm de largo, 4,6 mm de diámetro interior y tamaño
partícula de 4 µm) de Agilent.
Se inyectaron 20 µL de muestra (según el método de preparación descrito en
ítem 4.8) para determinar la concentración de CMP en la leche, siendo la fase móvil un tampón
fosfato pH 6,0, caudal de 0,5 ml/min y detección UV en longitud de onda
210 nm. La cromatografía se realizó durante 15 minutos y el tiempo de retención de CMP fue
alrededor de 5,7 minutos.
Los resultados se integraron utilizando el software de solución LC.
18
4.4 Obtención del suero
La leche con la que se obtiene el suero procede de la granja modelo.
del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento, con sede en Pedro Leopoldo
MG, recogido en el tanque de equilibrio inmediatamente después del ordeño, antes de ser
enfriado en el tanque de expansión. La determinación de la exención de CMP en la leche fue
llevado a cabo mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución Filtración en Gel (HPLCFG).
La leche fue sometida al proceso de pasteurización a 72 ºC durante 15 minutos.
En 1 L de leche entera no homogeneizada, a una temperatura de 32°C,
Se añadió 1 mL de cuajo bovino líquido (HALA). Después de revolver, la leche con el
Se dejó reposar el cuajo durante 40 minutos. Luego el coágulo se cortó en cubos.
0,5 cm de cada lado y se agitó lentamente durante 30 segundos. Luego se dejó la masa
descanse por otros 2 a 3 minutos. La masa se agitó nuevamente lentamente, hasta que
el suero era claro, sin presencia de materia lechosa. El suero finalmente fue
Se separa, se filtra y se pasteuriza a 72 °C/15 minutos, para inactivar la enzima.
cuajo, luego se enfría hasta su uso.
4.5 Adición de suero a la leche UAT sin CMP
Se añadió suero pasteurizado a la leche UAT descongelada sin CMP.
en concentraciones de 0; 5; 10; 15 y 20% (v/v). Luego se tomaron muestras de esta leche.
tratado según el punto 4.8 y analizado por HPLCFREM y HPLCFG. Con eso
Se verificó y comparó la eficacia de las dos técnicas para detectar el fraude lácteo.
con suero. La Figura 3 ilustra esta parte del experimento.
19
Leche UAT descongelada sin CMP
0% difícil 5% difícil 10% difícil 15% difícil 20% difícil
Análisis HPLCFREM y HPLCFG para la detección de CMP
Figura 3 Esquema del experimento de detección de fraude en el suero de leche mediante
CLAEFREM y por CLAEFG
4.6 Cultivo de leche UAT sin CMP con Pseudomonas fluorescens
Cuando fue necesario, la leche UAT sin CMP se descongeló en un baño de agua a
temperatura de 23ºC.
En un ambiente aséptico, un inóculo de cultivo de Pseudomonas fluorescens
(ATCC 13525), se transfirió a un tubo de ensayo con 10 mL de caldo nutritivo
BHI (infusión de cerebro y corazón), previamente esterilizada. Estas culturas fueron
previamente activado en caldo nutritivo BHI a 28 ºC ± 1 ºC durante 48 horas. Después de
incubación, se transfirió 1 ml de caldo BHI a una botella de dilución que contenía 99
mL de leche UAT descongelada, libre de CMP. La población de Pseudomonas de este inóculo

fue de 103 UFC/mL. Se utilizó leche UAT sin CMP inoculada con P. Fluorescens.
Se incubaron a 7 ºC ± 1 ºC durante 48 horas. Luego, se transfirió 1 ml de esta leche a
un frasco de dilución que contiene 99 mL de leche UAT descongelada libre de CMP, obteniendo
así un inóculo de leche con una población de P. fluorescens de 103 UFC/mL
con 0 horas de incubación. Luego, se transfirió 1 ml de este inóculo a frascos.
dilución que contiene 99 mL de leche UAT descongelada, libre de CMP, e incubada en
una DBO a 7 ºC ± 1 ºC durante 2, 4, 6 y 8 días.
20
Además después de incubar las muestras de leche durante 0, 2, 4, 6 y 8 días, se
Se realizó el recuento en placa de la población de bacterias psicrotróficas, utilizando
Se utilizó cetrimida como medio de cultivo, un medio selectivo para bacterias psicrotróficas.
4.7 Leche UAT sin CMP adicionada con suero después del cultivo con
Pseudomonas fluorescens
A la leche UAT libre de CMP se le adicionó el inóculo de Pseudomonas fluorescens , obteniendo
un inóculo con una población de 103 UFC/mL. Entonces fue entonces
incubados en DBO a 7 ºC ± 1 ºC, durante 0, 2, 4, 6 y 8 días. Después de la incubación, la leche UAT
descongelado se le añadió 0, 5, 10, 15 y 20% (v/v) de suero (Figura 4). A
A continuación, las muestras de todas estas leches fueron tratadas como en el punto 4.8 y analizadas por
CLAEFR/EM de CLAEFG.
4.8 Preparación de muestras de leche UAT para análisis CMP por HPLCFG y
CLAEFR/EM
En una alícuota de 10 mL de la muestra de leche, se agregaron 5 mL de ácido.
Ácido tricloroacético (TCA) al 24% (m/v) gota a gota y en agitación constante. Las muestras
Se dejaron reposar durante 60 minutos a temperatura ambiente y se filtraron a través de papel.
filtro cualitativo. Luego el filtrado se filtró nuevamente sobre una membrana
Millipore de 0,22 µm de diámetro de poro.
21
Leche UAT sin CMP
Leche libre de CMP con 103 UFC/mL de Pseudomonas fluorescens
Incubación a 7 ºC ± 1 ºC durante 0, 2, 4, 6 y 8 días
0% difícil 5% difícil 10% difícil 15% difícil 20% difícil
Figura 4 Esquema del experimento

HPLCFR/EM y HPLCFGdepara
detección de fraude
la detección lácteo
de CMP (agregado por
Pseudomonas análisis
fluorescens)
con suero de leche por HPLCFR/EM y HPLCFG.
Figura 4 Esquema del experimento de detección de fraude lácteo con la adición de
diferentes concentraciones de suero mediante HPLCFR/EM y HPLCFG, después
incubación con Pseudomonas fluorescens
4.9Detección de CMP por HPLCFR/EM
4.9.1 Descripción del equipo
Para el análisis de la determinación de CMP por HPLCFR/MS, un
Cromatógrafo líquido Agilent Technologies, modelo Serie 1100, con capacidad
para gradiente. La columna utilizada fue la Zorbax 300 SBC18 (4,6 mm de diámetro, 150
mm de longitud y tamaño de partícula de 5 µm). El detector utilizado fue un
Espectrómetro de masas de Applied Biosystems, modelo 4000 Q TRAP. oh
El espectrómetro de masas consta de un triple cuadrupolo. La TRAMPA API 4000 Q fue
operado en modo positivo. La ionización de las moléculas y la nebulización de las muestras fueron
Realizado por electrospray (ESI). El gas de nebulización utilizado fue Nitrógeno. A
La temperatura de la fuente se fijó en 450 ºC. El vacío dentro del espectrómetro de masas era de
106 mmHg.
Se acopló una válvula VICCI entre el HPLC y el espectrómetro de masas.
para la eliminación inicial de la fase móvil con la muestra de leche después de la columna, para evitar
22
acumulación de residuos en el espectrómetro de masas (posición A). justo antes de partir
de los picos de CMP de la columna, la válvula VICCI se gira automáticamente a 14
minutos (posición B), y la fase móvil y la muestra (según el método de preparación descrito en
ítem 4.8), ahora comienza a ir directamente al espectrómetro de masas. en el tiempo de
30 minutos, la válvula VICCI se gira automáticamente (posición A) para su eliminación.
final de la fase móvil, hasta 40 minutos. Esta válvula fue instalada con el objetivo de obtener
mejores resultados, ya que la muestra inyectada obstruía la entrada del
espectrómetro de masas, por lo que no llega suficiente señal al detector de masas.
El inyector utilizado fue un autoinyector Agilent Technologies G1329A.
Serie 1100. Se inyectaron 20 µL de la muestra preparada. La carrera cromatográfica
duró 40 minutos y el tiempo de retención de CMP fue de alrededor de 20 minutos.
Los resultados de las señales del espectrómetro de masas se integraron utilizando el
Analista de sistemas versión 1.4.2 Applied Biosystems.
4.9.2Análisis de muestras de leche UAT preparadas para HPLCFR/EM
Se inyectaron 20 μL de muestra preparada como en el punto 4.8. La fase móvil
Se usó un gradiente de la mezcla de disolvente A y disolvente B. El disolvente A era agua Milli Q que
contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % (v/v). El disolvente B era agua.
Milli Q con acetonitrilo, en proporción 20:80 (v/v), que contiene 0,1% (v/v) de ácido
trifluoracético (TFA).
La columna se equilibró inicialmente con la fase móvil que contenía 80% (v/v) del
disolvente A y 20% (v/v) de disolvente B. Después de la inyección de la muestra tratada, la fase móvil
inicial (20% (v/v) de B) se mantuvo durante 3 minutos. Posteriormente se inició un gradiente.
lineal del 20 al 55% (v/v) de B, de 3 minutos a 25 minutos. Luego otro gradiente
lineal del 55 al 80% (v/v) de B, de 25 minutos a 28 minutos, y finalmente un gradiente
linear de 80% (v/v) de B para 20% (v/v) de B, de 28 a 40 minutos. Esta última etapa
reequilibra la columna.
4.9.3 – Determinación del Tiempo de Retención y curva de calibración CMP

4.9.3.1 En CLAEFR/EM
Para determinar el tiempo de retención de CMP mediante HPLCFR/EM, se
preparó una solución del estándar CMP (Arla Foods) en agua MilliQ en el
23
concentraciones de 30, 45, 60, 75 y 90 mg/L de CMP y se comparó el resultado con el
estándar preparado en leche UAT descongelada sin CMP en las mismas concentraciones.
El estándar en solución acuosa se filtró a través de un filtro miliporo de 0,22 µm (MILEX) y
inyectado según las condiciones cromatográficas y de espectrometría de masas, descritas en
ítem 4.9.2 La curva de calibración se realizó en tres repeticiones por duplicado.
La detección de CMPA se basó en el reconocimiento de iones con relaciones masa/carga de
1697,4+4 y 2263,3+3 mediante el seguimiento de los iones seleccionados. La CMPA se cuantificó
evaluando la intensidad del ion 1697,4+4 m/z. Los espectros de masas se determinaron basándose en la
medición de moléculas protonadas ([M+ + nH] n+ ) con el software Analyst versión 1.4.2 de Applied
Biosystems.
La precisión de la masa en el rango m/z 15002500 se aseguró mediante la calibración
con estándar CMP (Arla Foods) al 89,72% (m/v), (aproximadamente 100 ng/μL en
Acetonitrilo: agua 1:1), infundido por separado.
Para calcular la concentración real de CMP en la muestra se utilizó una curva
analítica a partir de una solución estándar de CMP (Arla Foods) al 89,72% (m/v). Ellos eran
Se agregaron volúmenes de CMP al 89,72% (m/v) a la leche para obtener estándares en
concentraciones de 30, 45, 60, 75 y 90 mg/L de CMP.
Las muestras fueron preparadas según la metodología descrita en el punto 4.8 y
inyectado en las condiciones cromatográficas y de espectrometría de masas descritas en el ítem
4.9.2. La curva analítica se realizó con tres repeticiones por duplicado.
4.9.3.2 En CLAEFG
Para calcular la concentración real de CMP en la muestra se utilizó una curva
analítica a partir de una solución estándar de CMP (Arla Foods) al 89,72% (m/v). Ellos eran
Se agregaron volúmenes de CMP al 89,72% (m/v) a la leche para obtener estándares en
concentraciones de 30, 45, 60, 75 y 90 mg/L de CMP.
Las muestras fueron preparadas según la metodología descrita en el punto 4.8 y
inyectado en las condiciones cromatográficas descritas en el punto 4.3. La curva analítica fue
Realizado con tres repeticiones por duplicado.
4.10 Análisis de leche cultivada con Pseudomonas fluorescens y adicionada
diferentes concentraciones de suero por HPLCFR/EM
Detectar la relación masa/carga de iones característicos de la leche cultivada con
bacterias psicrotróficas, una muestra de leche inoculada con Pseudomonas fluorescens,
24
incubado a 7 ºC durante 6 días (preparado como se describe en el punto 4.6), y tratado como en
ítem 4.8, fue analizado por HPLCFR/EM.
El escaneo completo de la masa del espectro se obtuvo escaneando las relaciones
masa/carga de 2002500 m/z durante 40 minutos de ejecución cromatográfica. Mediante el
escaneo completo se verificó la presencia de dos iones con relación masa/carga de 1358.2+5 y
1301.2+5 m/z en mayor intensidad y estos no se observaron con intensidad significativa.
en leche adicionada con estándar CMP.
La detección del pseudo CMP se basó en el reconocimiento del ion con una relación
masa/carga de 1358,2+5 y 1301,2+5 mediante el seguimiento de los iones seleccionados. A
No se realizó la cuantificación porque no existía un pseudo estándar CMP. Los espectros de
masas se determinaron con base en la medición de moléculas protonadas ([M+ + nH] n+ ) con
el software Analyst versión 1.4.2 Applied Biosystems.
4.11 – Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el SAS (Statistical
Analysis System – SAS Intitute Inc., Cary, NC, EE. UU.), versión 9.1, con licencia para
Universidad Federal de Viçosa.
4.11.1 – Efecto de la adición de suero y tiempo de incubación de un cultivo
Pseudomonas fluorescens en métodos de detección de CMP.
En la prueba experimental del efecto de añadir suero después del período de incubación.
de Pseudomonas fluorescens en la detección de CMP en muestras analizadas por HPLC
FR/EM y CLAEFG, se montó un esquema factorial (5x5x2), con 5 niveles de
concentración sérica (0, 5, 10, 15 y 20% (v/v)), 5 niveles para el tiempo de incubación del
Cultivo de Pseudomonas fluorescens (0, 2, 4, 6 y 8 días) y 2 niveles para los métodos de
análisis de la presencia de CMP (HPLCFR/EM y HPLCFG). Los 50 tratamientos fueron
dispuestos en un diseño completamente al azar, con 3 repeticiones por duplicado,
teniendo como fuente de variación: método, suero, tiempo, método x suero, método x tiempo,
suero x tiempo, método x suero x tiempo. Los resultados fueron interpretados utilizando
análisis de varianza, utilizando la prueba F al nivel de probabilidad del 5%.
25
4.11.2 – Efecto de la adición de suero y tiempo de incubación de un cultivo
Pseudomonas fluorescens en la detección de CMP en suero lácteo y
pseudo CMP de proteasas de Pseudomanas fluorescens mediante HPLC

FR/EM.
En el análisis de CMP de suero y pseudo CMP de
de proteasas de Pseudomanas fluorescens mediante HPLCRP, se montó un experimento
donde se trataron muestras de leche con un cultivo de Pseudomanas fluorescens
durante diferentes tiempos de incubación y después de la adición de diferentes concentraciones de
suero. Se utilizó un esquema factorial (5x5), en un diseño completamente al azar.
instalado, con 5 niveles para el tiempo de incubación del cultivo de Pseudomanas
fluorescens (0, 2, 4, 6 y 8 días) y 5 niveles de concentración sérica (0, 5, 10, 15 y 20%
(v/v. Los 25 tratamientos, con 3 repeticiones por duplicado, tuvieron como fuente de
variación: tiempo, suero, tiempo x suero. Los resultados fueron interpretados usando
análisis de varianza, utilizando la prueba F al nivel de probabilidad del 5%.
26
5RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de leche UAT libre de CMP.
Los resultados de los análisis físicoquímicos y microbiológicos de la leche UAT.
Producto comercial sin CMP recolectado en una industria láctea, el mismo día de su
producción, e inmediatamente congelados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 – Resultados de los análisis físicoquímicos y microbiológicos de la leche UAT sin

CMP
Analítica 1ra repetición* 2da repetición* 3ra repetición*
Grasa (g/100g) 3,6 ± 0,1 3,6 ± 0,1 3,5 ± 0,2
Densidad Relativa 15ºC (g/mL) 1.030 ± 0.002 1,028 ± 0,001 1.030 ± 0.005
Acidez titulable, expresada en g de 0,15 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,15 ± 0,01
ácido láctico/100 mL de leche
°H Índice crioscópico 0,530 ± 0,003 0,530± 0,003 0,530± 0,003
Estabilidad al etanol 68% (v/v) Estable Estable Estable
ESD (%) (m/m) 8,4± 0,05 8,4± 0,05 8,4± 0,05
1 1
Recuento en placa estándar (CPP), 1,0 X 101 ± 0,001 1,0 X 10 ± ,001 1,0X10 ± 0,5
(UFC/mL)
Población de bacterias 0 0 0
Psicrótrofo en Placas (UFC/mL)
* Media ± Desviación Estándar
Todos los resultados obtenidos estuvieron dentro de los estándares establecidos por la Ordenanza no.
370 (BRASIL,1997), indicando que la leche utilizada en este experimento estaba en buenas condiciones.
condiciones y aptos para el consumo.
27
5.2 – Análisis microbiológicos de leche UAT cultivada con Pseudomonas fluorescens
Se inoculó leche UAT sin CMP con Pseudomonas fluorescens obteniendo una población de 103
UFC/mL después de 0 horas de incubación. Esta leche fue incubada en
estufa a 7 ºC ± 1 ºC por 2, 4, 6 y 8 días y se contaron los psicrotrofos. Tú
Los resultados se encuentran en la Tabla 3.
Tabla 3 – Efecto del tiempo de almacenamiento de leche UAT inoculada con Pseudomonas fluorescens
sobre el crecimiento de microorganismos psicrotróficos.
Tiempo de incubación (días) Recuento (log UFC/mL)*
0 3,30 ± 0,5
2 4,22 ± 1,0
4 6,12 ± 0,5
6 7,12 ± 0,5
8 7,22 ± 0,5
* Media ± Desviación Estándar
Se observa que el tiempo de almacenamiento a 7 ºC de la leche UAT añadida
Pseudomonas fluorescens es un factor determinante en la multiplicación de estas bacterias.
En sus estudios ALVIM (1992), observó el efecto del tiempo y la temperatura sobre
almacenamiento de leche esterilizada, inoculada con tres cepas de Pseudomonas, en el
crecimiento de microorganismos psicrotróficos y observó que un
Crecimiento de microorganismos psicrotróficos al aumentar el tiempo de incubación.
Según el autor, la actividad proteolítica fue intensa a medida que aumentaba el tiempo de
incubación, lo que resulta en la liberación de péptidos en concentraciones muy altas.
5.3 – Detección de CMP por CLAEFG
El tiempo de retención de CMP fue de alrededor de 5,7 minutos, lo que podría ser
observado en la Figura 5, que ilustra el resultado de agregar 90 mg/L de estándar CMP
a la leche UAT. La producción de CMP se destacó por un aumento en su pico correspondiente,
sin cambios en otros picos. La alta absorbancia, registrada durante el
retención de 7,6 minutos, proviene de la detección de TCA en la muestra y otros
componentes de la leche no analizados (ALVIM, 1992).
28
Figura 5 Cromatograma (HPLCFG) de leche UAT adicionada con 90 mg/L de

patrón CMP
La curva analítica del CMP en Leite UAT presentó un coeficiente de regresión de

0,9994 (Figura 6).
1400000
1200000 y = 13439x 11942

R2 = 0,9994
1000000
800000
600000
Área
Pico
de
400000
200000
0
0 20 40 60 80 100
200000
Concentración en CMP (mg/L)
Figura 6 Curva analítica del estándar CMP (0, 30, 45, 60, 75 y 90 mg/L) en
leche analizada por HPLCFG
5.4 – Análisis del patrón CMP en agua mediante HPLCFR/EM
El cromatograma del estándar CMP (Arla Foods) solubilizado en agua, obtenido

análisis por Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Inversa con detección
por espectrometría de masas (HPLCFR/EM), presentó tiempo de retención, alrededor
19,7 minutos. En la Figura 7 se puede observar la presencia de dos iones con diferente
Masa/Carga (m/z) en este tiempo de retención, el principal con m/z de 1697,4+4 y el
29
segundo con m/z de 2263,3+3. MOLLÉ y LÉONIL (2005) ya habían determinado que
Estos iones son característicos del análisis CMP, todos originados de CMPA (CMP
de la variante genética A).
La curva analítica de la relación masa/carga del ion 1697,4+4, que va desde 0 mg/L
hasta 90 mg/L, como se muestra en la Figura 8, y presentó un coeficiente de correlación de 0,9923.
La adición cada vez mayor del estándar CMP solo aumentó las áreas de pico en el tiempo de
retención de 19,7 minutos (1697,4+4 ), como se puede ver en la Figura 9.
Figura 7 Cromatograma de iones monitoreados obtenidos en el análisis del
Estándar CMP en agua (45 mg/L) por HPLCFR/EM
30
Figura 8 – Curva analítica de CMP en agua obtenida mediante monitoreo de iones

específico 1697,4+4 m/z.
Figura 9 – Cromatogramas del estándar CMP en agua en concentraciones de 0, 30,

75 y 90 mg/L, monitoreados en el ion con una relación masa/carga de 1697,4+4, analizados
por CLAEFR/EM
31
5.5 – Análisis del patrón CMP en leche mediante HPLCFR/EM
Se encuentra el cromatograma del estándar CMP en leche UAT sin CMP, en
concentraciones que van de 0 a 90 mg/L, monitoreado para masa/carga 1697,4+4 m/z.
en la Figura 10. Se observa que monitoreando este ion, en el tiempo de retención 19,7
minutos, su área cromatográfica aumenta proporcionalmente al aumento del estándar
de CMP, demostrando que la matriz (agua o leche) donde se encontraba el patrón CMP
disuelto no afectó su tiempo de retención. La curva analítica de los resultados obtenidos.
en la Figura 10 está en la Figura 11, presentando un coeficiente de correlación de

0,9881.
Figura 10 – Cromatogramas del patrón CMP en leche en
concentraciones de 0, 30, 75 y 90 mg/L, monitorizadas con una relación masa/carga de iones
de 1697,4+4, analizadas por HPLCFR/EM
32
1,20E+06 y = 11721x + 68292

R2 = 0,9881
1,00E+06
8,00E+05
Área
6,00E+05
4,00E+05
2,00E+05
0,00E+00
0 20 40 60 80 100
Concentración de CMP (mg/L)
Figura 11 – Curva analítica de CMP en leche UAT sin CMP obtenida
monitorizando el ion específico 1697,4+4 m/z
En sus estudios de determinación cuantitativa de macropéptidos de κcaseína,
bovinos en productos lácteos mediante cromatografía líquida de alta resoluciónespectrometría
de masas de ionización por electropulverización (HPLCFR/EM), MOLLÉ y
LEÓNIL (2005), también comprobó la presencia de los iones específicos 1698+4 y 2264+3
m/z como forma de cuantificar AglicoCMPA. Y lo mismo se observó en el
tiempo de retención alrededor de 20 minutos (Figura 12).
FUENTE: MOLLÉ y LÉONIL (2005)
Figura 12 Análisis por cromatografía líquida de alta resolución
Espectrometría de masas por ionización por electropulverización de CMP (variante A) obtenida
mediante el seguimiento de iones específicos 1698.4+4, 2264.3+3 de aglicoCMPA.
NONI y RESMINI (2005) en sus estudios identificando la adición de suero
leche en polvo en mantequilla tradicional mediante cromatografía líquida de alta resolución
La espectrometría de masas de ionización por electropulverización con aglicoCMPA supervisó la
33
iones 1697,5+4 y 2263,2+3 m/z como indicativos de la presencia de CMPA en sus muestras
(Figura 13). Sin embargo, utilizaron otras condiciones para la separación cromatográfica,
lo que provocó la elución de CMP a un tiempo de retención de 26,8 minutos.
FUENTE: NONI e OFICIAL (2005)

Figura 13 Exploración de masa/carga del pico correspondiente
al tiempo de retención de 26,8 minutos obtenido analizando muestras de mantequilla mediante
CLAE/EM (NONI y OFICIAL 2005).
5.6 – Aplicación de HPLCFG para detectar la presencia de suero

añadido a la leche UAT
Los cromatogramas en la Figura 14 representan la adición de 15 y 20% (v/v) de suero.
de leche a leche UAT sin CMP, lo que confirma que la adición de suero a la leche
presenta un pico cromatográfico con el mismo tiempo de retención (5,7 minutos) que el
Estándar CMP cuando se agrega a la leche. Como la concentración de suero
Se aumentó la UAT de leche a leche, también se aumentó el área característica del pico de CMP
aumentó. Con esto podemos ver que la adición de suero a la leche puede ser
detectado mediante análisis de CMP mediante HPLCFG. ALVIM (1992), observó en su
estudios que al agregar suero pasteurizado a la leche pasteurizada, hubo
aumento proporcional en el área del pico de glicomacropéptido.
34
Figura 14Cromatogramas (HPLCFG) de leche UAT adicionada con 15% (v/v)

(A) y 20% (v/v) (B) suero.
5.7 – Aplicación de HPLCFR/EM para detectar la presencia de suero

añadido a la leche UAT
Se analizaron muestras de leche UAT sin CMP adicionada con suero
por CLAEFR/EM. Se verificó que el perfil cromatográfico (Figura 15) es el mismo que el del
leche agregada del estándar CMP. La adición de suero a la leche UAT se cuantificó
monitoreando la relación masa/carga del ion 1697,4+4.
Se observó que el pico característico de CMP (1697,4+4) aumentó proporcionalmente
con adición creciente de suero a la leche en concentraciones de 0, 5, 10, 15 y 20% (v/v)
(Figura 16). Con esto, podemos concluir que la adición de suero a la leche se puede detectar
analizando el CMP (1697,4+4) mediante HPLCFR/EM.
35
Figura 15 Cromatogramas del análisis de leche UAT sin CMP adicionada con
15% (v/v) de suero, monitoreados a la relación masa/carga de iones de 1697.4+4 y
2263.3+3 m/z analizados por CLAEFR/EM.
36
Figura 16 – Cromatogramas del patrón CMP en leche UAT sin
CMP agregado con suero en concentraciones de 0, 5, 10, 15 y 20% (v/v), monitoreado en el
ion con una relación masa/carga de 1697,4+4, analizado por HPLCFR/MS.
5.8 – Análisis de leche UAT sin CMP adicionada con diferentes concentraciones de
suero por HPLCFG y HPLCFR/EM
Los resultados de los análisis de leche UAT libre de CMP, analizados por HPLCFG
y HPLCFR/EM se muestran en la Figura 17. Se puede observar que hubo un aumento en
área del pico en relación con CMP en función del aumento de la concentración de suero en el
muestra.
37
4500000
4000000
3500000 yGel = 184434x + 158762
3000000 R2 = 0,9893
2500000
Área
2000000
1500000 yMasa = 178153x + 24933
1000000 R2 = 0,9975
500000
0
0 5 10 15 20
Hablar (%)
Pasta Gel
Figura 17 Variación en el área de detección de CMP dependiendo de diferentes
concentraciones de suero usando HPLCFG y HPLC

FR/EM
La Tabla 4 muestra el resumen del análisis de varianza de dos métodos (CLAEFG y
CLARFR/EM) utilizado en la detección de CMP en muestras de leche adicionadas con
diferentes concentraciones de suero.
Tabla 4 – Resumen del análisis de varianza de dos métodos utilizados para detectar
CMP en muestras de leche adulterada con diferentes concentraciones de suero
Fuente de variación Grado de libertad 1 Cuadrado mediano

Método 2900E8*
Concentración sérica 1,2358E13*
Método*suero 44 2214E8*
Residuo 20 * Significativo al nivel de probabilidad del 5% 6541E6
usando la prueba F.
Existe una diferencia significativa entre los métodos de análisis (p<0,05) por HPLC
FG y CLARFR/EM. El efecto de la concentración del suero fue significativo en
análisis de muestras por ambos métodos (p<0,05), el aumento de la concentración sérica
conduce a un aumento en el área correspondiente al CMP por ambos métodos.
5.9 – Análisis de leche UAT sin CMP cultivada con Pseudomonas fluorescens,
suero añadido por CLAEFG
La Tabla 5 muestra el resumen del análisis de varianza en la detección de CMP por
HPLCFG en muestras de leche adulterada con diferentes concentraciones de suero
leche cultivada con Pseudomonas fluorescens con diferentes tiempos de incubación.
38
Tabla 5 Resumen del análisis de varianza en la detección de CMP por HPLCFG en
Muestras de leche adulteradas con diferentes concentraciones de suero cultivado.
con Pseudomonas fluorescens con diferentes tiempos de incubación.
Fuente de variación Grado de libertad 4 4 Cuadrado mediano

Difícil 2,5089E13*
Tiempo de incubación 5,1509E14*
Suero*Tiempo de incubación 16 4,3018E11*
Residuo 50 2,4753E9
* Significativo al nivel de probabilidad del 5% usando la prueba F.
Cuando se agregaron diferentes concentraciones de suero a la leche,
se observó que hubo un aumento en el área del pico característico de CMP (p< 0,05), la
a medida que aumentaba la concentración de suero en la muestra. El aumento del tiempo para
la incubación de muestras de leche fue significativa en los resultados de las muestras (p<0,05).
Los resultados de los análisis de la leche UAT libre de CMP, descongelada,
inoculado con 103 UFC/mL de Pseudomonas fluorescens, incubado en estufa a 7 ºC ±
1 ºC por 0, 2, 4, 6 y 8 días, más 0; 5; 10; 15 y 20% (v/v) de suero y
analizados por HPLCFG se muestran en la Figura 18. Se puede observar que no hay
hubo un aumento en el área del pico en relación con CMP en función del tiempo de incubación hasta
dos días de incubación. En el período comprendido entre dos días y cuatro días de incubación,
observe un rápido aumento en el área del pico en relación con el CMP. El aumento de superficie
en relación con CMP continuó aumentando hasta los 6 días de incubación, pero con menor
intensidad. Después de 6 días de incubación, el área relativa al pico de CMP tendió a
disminución, posiblemente debido a la extensa proteólisis que estaba ocurriendo.
Cuando se analiza por otros métodos, se puede observar que la leche incubada por
Después de 6 días ya estaba alterado, con la viscosidad ya muy aumentada, lo que indica que el
la proteólisis ya había alterado completamente su calidad. ALVIM (1992) ya había
determinó que la leche incubada a 7°C durante 6 días ya mostraba una reacción de coagulación
a alizarol 72%, y ya tenia olor pútrido. ALVIM (1992) también destacó
que la elevada tasa de proteólisis observada puede deberse a la falta de competencia de
sustrato por otras bacterias, lo que no ocurre en la leche cruda comercial.
39
Figura 18Variación del área de detección de CMP en función del tiempo de incubación
un cultivo psicrotrófico en presencia de diferentes concentraciones de suero

utilizando HPLCFG como método de análisis.
La leche, después de ser incubada durante cuatro días a 7°C, mostró un aumento en el área
relacionados con el CMP. Por tanto, se observa que la concentración de CMP en la leche es un
excelente indicador de su calidad, ya que puede determinar el alcance de su proteólisis.
EN 69 determina que la concentración máxima de CMP en la leche debe ser de 30 mg/L.
En la Figura 19 se puede observar que hubo un indicio de la presencia de CMP en el
leche, a partir de 4 días de incubación a 7 ºC. La ocurrencia de este resultado, registrada
como pico al mismo tiempo de retención que CMP, se debió a la acción de las proteasas
producido por bacterias psicrotróficas, en las caseínas de la leche, liberando péptidos
que se separaron al mismo tiempo de retención de CMP (OLIEMAN y Van RIEL,
1989).
40
Figura 19 Cromatogramas, por HPLCFG, de leche UAT cultivada con
Pseudomonas fluorescens y se incubaron a 7 ºC durante 4 días (A) y 6 días (B) y 8 días (C).
La Tabla 6 muestra el área del pico de CMP obtenida al analizar la leche cultivada.
con Pseudomonas fluorescens e incubadas durante 0, 2, 4, 6 y 8 días a 7 ºC, sin añadir
suero, y el valor de concentración de CMP correspondiente (mg/L). la concentración de
La CMP en mg/L se obtuvo mediante la ecuación de regresión lineal (Y= 13439 X – 11942).
41
Tabla 6Valores promedio de las áreas de los picos de CMP y su concentración (mg/L), obtenidos
analizando muestras de leche cultivada con Pseudomonas fluorescens en función
del tiempo de incubación por HPLCFG
Tiempo de incubación Área Concentración de CMP (mg/L)
0 0 0
2 0 0
4 638,62
8594363,3
6 909,26
12231485,7
8 882,01
11865335
Concentración de CMP en leche sin suero añadido a los 0 y 2 días de incubación
fue 0, por lo que no se detectó la presencia de CMP o pseudoCMP en la muestra. El Leche
con 4, 6 y 8 días de incubación presentó concentraciones de 638.62, 909.26 y 882.01
mg/L (m/v) de CMP, no de la adición de suero a la leche UAT. La técnica
HPLCFG, no diferencia CMP de suero, CMP y/o pseudo
CMP producida por proteasas de P. fluorescens. La extensa proteólisis observada fue
suficiente para que la leche cambie su viscosidad después de 6 días de
incubación
Estos resultados demuestran la importancia de las condiciones de almacenamiento de la leche.

oh
materia prima requerida por la Norma EN 51/2002, que es un máximo de 4 C por un máximo de 48 horas. Leche
a mayor temperatura, o almacenado por más tiempo, y con presencia de
bacterias psicrotróficas, presenta alta proteólisis, caracterizada por la presencia de
CMP. La leche de buena calidad, adecuadamente conservada, tiene una concentración de CMP igual a
0 mg/L. De esta manera, el resultado del Índice CMP, según lo previsto en el IN
69/2006, es un excelente indicador de la intensidad de la proteólisis de las proteínas de la leche, o
luego la adición fraudulenta de suero de leche.
5.10 – Análisis de leche UAT sin CMP, cultivada con Pseudomonas fluorescens
añadido con suero por CLAEFR/EM
Los resultados del análisis HPLCFR/MS de leche UAT sin CMP, a la que se le añadió
Pseudomonas fluorescens con una población inicial de 103 UFC/mL,
se incubó a 7 ºC ± 1 ºC, durante 0, 2, 4, 6 y 8 días, y después de la incubación se añadió 0; 5; 10;
42
15 y 20% (v/v) de suero, se puede encontrar en la Figura 20. En esta Figura se puede observar que el
ion con masa/carga de 1697.4+4, correspondiente al verdadero CMP,
producido por el cuajo durante la producción de queso, y presente en el suero, también
aumentó durante la proteólisis que ocurrió durante la incubación de leche UAT sin CMP
inoculado con P. fluorescens, incluso cuando se le añade suero. Estos
Los resultados demuestran que P. fluorescens también produce CMP verdadera, obtenida
por hidrólisis enzimática de κcaseína entre los aminoácidos 105106, como ocurre con
La acción enzimática del renino en la producción de queso.
7.000.000
6.000.000
5.000.000
4.000.000
Área
3.000.000
2.000.000
1.000.000
0
012345678
1.000.000
Tiempo (días)
seguir 0% soro5% soro 10% seguir 15% soro20%
Figura 20 Resultados de análisis CMP verdaderos (ion 1697,4+4 m/z)
por HPLCFR/EM en leche UAT sin CMP, inoculada con P. fluorescens, incubada
durante 0, 2, 4, 6 y 8 días, y se agregaron diferentes concentraciones de suero (0, 5, 10, 15 y
20% (v/v)).
Se añadió Pseudomonas fluorescens a la leche después de 0 y 2 días de incubación.
Se observó que hubo un aumento en el área de detección de CMP cuando se agregó al
leche, suero en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v). Cuando la leche no estaba
agregado suero, el área de detección de CMP fue igual a cero, lo que demuestra que no hubo
ni CMP ni pseudoCMP son producidos por las proteasas de bacterias psicrotróficas.
Sin embargo, la Figura 21 muestra los resultados de los análisis HPLCFR/MS de otros iones
de masa/carga, como 2263,3+3, 1358+5 y 1301,2+5, además de 1697,4+ 4.
En esta Figura se puede observar que la proteólisis por P. fluorescens, además de producir el ion
carga/masa 1697.4+4, también produjo otros iones, incluso en cantidades
mucho mayor que el primero, cuando la incubación tuvo lugar durante un período de tiempo más largo.
43
prolongado. Estos otros iones probablemente provienen de la hidrólisis de otros
enlaces peptídicos en κcaseína, incluidos los enlaces entre los aminoácidos 103104,
104105, 106107 y 107108 (RECIO et.al., 2000).
Figura 21 Cromatogramas obtenidos al monitorear los iones específicos 1697.4+4,
2263.3+3, 1358+5, 1301.2+5, característicos de leche cortada con Pseudomonas
fluorescens y se incubaron durante 4 días (A), 6 días (B) y 8 días (C).
44
Cabe señalar, sin embargo, que el tiempo de retención en el análisis HPLCFR/MS
fue diferente para el ion con una relación carga/masa de 1301,2+5. Leche con 4, 6 y 8
Los días de incubación con P. fluorescens, sin adición de suero, mostraron la presencia de dos
picos, además de los dos característicos de CMP (1697,4+4 y 2263,3+3), otro con una relación
de carga másica de 1301,2+ 5, tiempo de retención alrededor de 16
minutos y otro con el mismo tiempo de retención CMP, alrededor de 20 minutos, con una
relación másica de carga de 1358+5. Los iones 1301,2+5 m/z y 1358+5 m/z eran, como
determinado en este trabajo, característico de la leche cultivada con P. fluorescens con una
población superior a 106 UFC/mL, siendo así característico de la hidrólisis de caseína.
por proteasas de P. fluorescens. Según MITCHELL y EWINGS (1985), la
Las proteasas son capaces de hidrolizar toda la caseína disponible en la leche en péptidos
soluble. A medida que aumentó el tiempo de incubación de las muestras de leche, hubo un
aumento en las áreas correspondientes a los iones 1301,2+5 m/z y 1358+5 m/z.
La Tabla 7 muestra el valor de concentración de CMP (ion 1697,4+4 m/z) obtenido
en leche con Pseudomonas fluorescens, en diferentes tiempos de incubación a 7º C en
diferentes concentraciones de suero (0, 5, 10, 15 y 20% (v/v)). la concentración de
La CMP en mg/L se obtuvo mediante la ecuación de regresión lineal (Y= 11721 X – 68292).
Tabla 7Valor de concentración (mg/L) de CMP, obtenido al analizar la leche sin
cultivo y cultivado con Pseudomonas fluorescens, en diferentes tiempos de incubación y
concentraciones de suero por HPLCFR/EM
Concentración de CMP (mg/L)

Tiempo (días)
0% soro 5% soro 10% soro 15% soro 20% soro
sin incubación
0 76,9 151,7 228,6 300,4
0 0 78,3 147,4 215,7 305,5
2 0 76,9 146,6 219,4 305,6
4 97,1 142,6 207,4 280,9 380,6
6 161,4 236,1 312,9 386,3 460,0
8 135,5 211,4 295,0 368,1 444,9
45
Leche UAT sin CMP y sin cultivar, cuando se le agrega suero en
concentraciones de 0, 5, 10, 15 y 20% (v/v), presentaron una concentración de 0, 76,9; 151,7;
228,6 y 300,4 mg/L de CMP.
Se agregaron diferentes concentraciones de suero (0, 5, 10, 15 y 20% (v/v))
a la leche después de la proteólisis con el objetivo de verificar la posibilidad de cuantificar
suero en presencia de proteólisis. En el Cuadro 7 se puede observar que la medida
que aumenta la concentración de suero sin incubación y se incuba durante 0, 2, 4, 6 y 8
días, hay un aumento en la concentración de CMP en la muestra.
Concentración de CMP en leche sin suero añadido a los 0 y 2 días de incubación
fue de 0 mg/L, por lo que no se detectó la presencia de CMP en leche donde la población de P.
fluorescens es menor o igual a 104 UFC/mL. Cuando se añade a la leche, se incuba durante
0 y 2 días, sueros en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v), estos presentaron
Concentración de CMP proporcional a la de la leche sin cultivo y adicionada con suero
leche, en las mismas concentraciones.
La leche con 4, 6 y 8 días de incubación presentó una concentración de 97,1; 161.4 y
135,5 mg/L de CMP, respectivamente, no por la adición de suero al
Leche UAT. Cuando la leche se incubó durante 4, 6 y 8 días se agregaron diferentes
concentraciones de suero (5, 10, 15 y 20% (v/v), la concentración de CMP en estos
Las muestras aumentaron proporcionalmente a la concentración de suero añadido.
5.11– Variación en la concentración de iones con relación masa/carga 1697,4+4, 1301,2+5
y 1358,2+5 en muestras de leche UAT sin CMP, cultivadas con Pseudomonas
fluorescens añadido al suero, determinado por HPLCFR/MS.
La Figura 22 muestra la variación en el área de detección del CMP (1697.4+4) (A), y de los
iones con relación masa/carga 1301.2+5 (B) y 1358.2+5 (C) en función de la tiempo de incubación de
leche UAT sin CMP con una población inicial de 103 UFC/ml de
Pseudomonas fluorescens, en presencia de diferentes concentraciones de suero utilizando
HPLCFR/EM como método de análisis. Se puede observar que el ion con masa/carga 1697.4+4 (Figura
22 (A)) mostró un aumento en su concentración durante el
incubación hasta el sexto día, para todas las concentraciones séricas añadidas (0% hasta
20%). Sin embargo, después del sexto día de incubación, la concentración del ion masa/carga
(1697,4+4) (Figura 22 (A)) mostró una reducción en su concentración, también para todos
las concentraciones de suero añadido, probablemente debido a la extensa proteólisis que
46
ocurrió en la leche. En este caso, la proteólisis fue tan extensa que el propio CMP también lo fue,
parcialmente hidrolizado. Al sexto día de incubación la leche ya estaba viscosa.
cambió y al octavo día ya estaba coagulado.
Por otro lado, los iones con masa/carga 1301,2+5 y 1358,2+5 no aumentaron
sus concentraciones, cuando se agregaron diferentes concentraciones de suero a la leche,
la concentración de estos iones es independiente de la concentración de suero añadido a la leche.
El aumento en el área de la carga/masa del ion 1358.2+5 (Figura 22 (C)) comenzó a
ocurrió después del segundo día de incubación y se aceleró hasta el octavo día. El área del ion con carga/
masa 1301,2+5 (Figura 22 (B)) también comenzó a aumentar su área
después del segundo día de incubación, pero hubo un aumento más pronunciado en el área después del
cuarto día de incubación. Estos resultados demuestran que la leche no debe ser
almacenarse durante más de dos días a esta temperatura, ya que la leche ya comienza a proteolizarse,
incluso cuando la contaminación inicial por P. fluorescens es de 103
UFC/ml.
47
Figura 22Variación en el área de iones (1697.4+4 m/z)(A), 1301.2+5 (B) y 1358.2+5 (C) en función del tiempo de incubación de muestras de
leche UAT sin CMP, inoculadas con P. Fluorescens, población inicial de 103 UFC/ml, y posteriormente adicionada en diferentes concentraciones
de suero analizado por HPLCFR/EM.
48
La Tabla 8 muestra el resumen del análisis de varianza en la detección de CMP (1697,4+4) y la relación de
masa de los iones 1301,2+5 y 1358,2+5 en muestras de leche agregadas.
de diferentes concentraciones de suero después del período de incubación con Pseudomonas
fluorescens mediante HPLCFR/EM.
Tabla 8 Resumen del análisis de varianza en la detección de CMP (1697.4+4) y relación de masa de los iones
1301.2+5 y 1358.2+5 en muestras de leche adicionadas con diferentes
concentraciones séricas después del período de incubación con Pseudomonas fluorescens para
CLAEFR/EM
Fuente de variación gl Cuadro promedio

1358,2+5 1301.2+5 CMP(1697,4+4)
*
Tiempo 7,0215E14* 1.0070E14* 1,9440E13
Difícil 4 3.5578E11n.s 4 2,0013E10n.s 2,1212E13*
Suero*tiempo 2.4333E11n.s 16 50 2,3622E10n.s 9,6917E11n.s
Residuo 6.4436E11 Significativo al 1,0533E11 8,0285E11
*
nivel de probabilidad del 5%.
ns
No significativo al nivel de probabilidad del 5%.
En la Tabla 8 se puede observar que el tiempo de incubación (0, 2, 4, 6 y 8 días) es significativo (p<0,05) en
la detección de iones con una relación masa/carga, 1358,2+5, 1301,2 . +5 y CMP(1697,4+4). Por lo tanto, el tiempo de
almacenamiento de muestras de leche cultivadas con
Pseudomonas fluorescens es un factor determinante en la detección de CMP, y de los iones 1301.2+5 y 1358.2+5. A
medida que aumentó el tiempo de incubación, hubo un aumento en el área del pico correspondiente de CMP y los
iones 1301.2+5 y 1358.2+5 (Figura
22). Este aumento de área se produce después de 2 días de incubación. Con estos datos
podemos concluir que este aumento de área se debe a la acción de las proteasas bacterianas
Efectos psicrotróficos sobre la caseína.
El aumento de la concentración sérica (0% a 20% de adición) no provocó un aumento en el área de respuesta
de los iones con relación masa/carga 1358,2+5 y 1301,2+5 (p>0,05). Sin embargo, la concentración sérica incrementó
(p<0,05) el área CMP (1697,4+4), en función del tiempo.
de incubación del cultivo de Pseudomonas Fluorescens.
49
6. CONCLUSIÓN
Análisis HPLCFG y HPLCFR/MS de leche UAT sin CMP, sin añadidos
de P. fluorescens, sin incubación, o incubada hasta por 2 días, adicionada con
Las concentraciones crecientes de suero (desde 0% hasta 20%) demostraron que solo aumentaba
el pico correspondiente al verdadero CMP (1697,4+4). Esto demuestra que la adición
de suero a leche UAT no cultivada por P. fluorescens puede detectarse mediante
análisis del CMP mediante estos dos métodos de análisis.
A la leche se le añadió Pseudomonas fluorescens con 0 y 2 días de incubación, sin
En el suero, el área de detección de CMP fue igual a cero, demostrando que cuando el recuento de
psicrotrofos en la leche es menor a 106 UFC/mL, no hay producción de CMP, y
ni pseudoCMP (masa/carga de 1358,2) por proteasas de bacterias psicrotróficas.
Sin embargo, a la leche se le añadió Pseudomonas fluorescens y se incubó durante 4, 6 y 8
Los días a 7°C, y sin adición de suero, mostraron un aumento en el tiempo pico de retención.
característica de CMP, que no surge de la adición de suero a la leche UAT, para los dos
métodos de análisis. Por lo tanto, el método de análisis HPLCFG no diferenció los
CMP de suero, CMP y/o pseudoCMP producidas por proteasas
de P. fluorescens.
Leche UAT sin CMP, sin suero añadido, Pseudomonas añadido
fluorescens, incubados durante 4, 6 y 8 días a 7°C, y analizados por HPLCFR/EM, mostraron la
presencia del ion relación masa/carga característico del verdadero CMP (1697,4+4) y otros dos
iones, uno con el mismo tiempo de retención que el CMP, con masa/carga 1358,2+5, y con masa/
otro , carga de 1301,2, con un tiempo de retención de 16 minutos. Los iones 1301,2+5 m/z (con
tiempo de retención HPLCFR/EM de 16 minutos) y 1358+5 m/z (con tiempo de retención
tiempo de retención de 20 minutos, igual al tiempo de retención del CMP verdadero) fueron,
según se determinó en este trabajo, característico de leche cultivada con P. fluorescens con una
población superior a 106 UFC/mL, siendo así característico de la hidrólisis de caseína.
por proteasas de P. fluorescens.
El aumento en el tiempo de incubación de la leche UAT sin CMP de 4 días a 6 días, cuando
el recuento de bacterias psicrotróficas aumentó de 106 a 107 UFC/mL, el ion con
50
masa/carga de 1697,4+4, correspondiente al verdadero CMP, producido por el cuajo
durante la producción de queso, y presente en el suero, también aumentó. Estos
Los resultados demuestran que P. fluorescens también produce CMP verdadera, obtenida por
hidrólisis enzimática de kcaseína entre los aminoácidos 105106, como ocurre con la acción
Enzima renina en la producción de queso. Después de 8 días de incubación hubo una reducción en
concentración de CMP, probablemente debido a la extensa proteólisis que ocurrió en el
leche. En este caso, la proteólisis fue tan extensa que el propio CMP se hidrolizó y la leche ya estaba
estaba coagulado. Los iones con masas 1301,2 y 1358,2 siempre aumentaron su área con la
mayor tiempo de incubación.
El análisis de CMP en leche mediante HPLCFR/MS fue efectivo para detectar la adición de
suero para leche sin proteólisis. Además, cuando la leche fue proteolizada por
Enzimas de P. fluorescens , este método pudo indicar que se produjo proteólisis. A pesar de,
cuando la leche esté proteolizada por P. fluorescens y se le haya añadido suero, no
Es posible cuantificar la CMP que fue producida únicamente por P. fluorescens y la que se debió
únicamente a la adición de suero. De esta manera, el resultado del Índice CMP, como
previsto en la EN 69/2006, es un excelente indicador de la intensidad de la proteólisis de proteínas
de leche, o la adición fraudulenta de leche con suero, cuando se analizan mediante
CLAEFR/EM, siendo un indicador eficiente de la calidad de la leche.
7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ADAMS, DM; BARACH, JT & SPECK, ML Proteasas resistentes al calor producidas en la leche por bacterias
psicrotróficas de origen lácteo. Revista de ciencia láctea. v.58, n.6, pág. 828834, 1975.
ALAIS, C. Estudio de sustancias nitrogenadas no proteicas (NPN) separadas de la caseína de la leche

de vaca bajo la acción del cuajo. 14º Interno. Dairy Congr., Roma, v.2, p.823,1956.
ALVIM, TC Efecto de la calidad de la leche en la detección de suero mediante Cromatografía Líquida

de Alta Resolución – Filtración en Gel (GFHPLC). 1992. 69.f. Disertación (Maestría en Ciencia y
Tecnología de Alimentos) – Universidad Federal de Viçosa, ViçosaMG, 1992.
51
ARMSTRONG, CE; MACKINLAY, AG; COLINA, RJ; WAKE, RG La acción del renino sobre la Kcaseína: la
heterogeneidad y origen del producto soluble. Biochim. Biofísica.
Acta, 140 123131, 1967.
ASCHAFFENBURG, R. Reseñas del progreso de la ciencia láctea. Variantes genéticas de las proteínas de la
leche: su distribución racial. J. Dairy Res., 35(3): 447460, 1968.
BRANDÃO, SCC; PARREIRA, JFM & ALVIM, T. da C. Detección de la adición de suero de queso a la leche. En:
Actas del X Congreso Nacional Lácteo. Juiz de Fora, 1988. 41 p.
BRASIL. Ordenanza N° 370, de 4 de septiembre de 1997. Aprueba la Inclusión del Citrato de Sodio en el
Reglamento Técnico para el Establecimiento de la Identidad y Calidad de la Leche UHT (UAT).
BRASIL. Instrucción Normativa No. 51, de 18 de septiembre de 2002. Aprueba el Reglamento

Técnico para la Producción, Identidad y Calidad de la Leche Tipo A, Leche Tipo B, Leche Tipo C, Leche
Pasteurizada y Leche Cruda Refrigerada y el Reglamento Técnico de Recolección de Leche Cruda
Refrigerada y su Transporte a Granel.
Diario Oficial de la Unión, 20 de septiembre de 2002, Sección 1, Página 13. Ministerio de Agricultura y
Abastecimiento.
BRASIL. Instrucción Normativa N° 68, de 12 de diciembre de 2006. Oficializa los Métodos Analíticos Físico
Químicos Oficiales para el Control de Leche y Productos Lácteos. Diario Oficial de la Unión, 14 de diciembre de
2006, Sección 1, Página 8. Ministerio de Agricultura y Abastecimiento.
BRASIL. Instrucción Normativa N° 69, de 13 de diciembre de 2006. Establece criterios para evaluar la calidad de la leche
fresca, concentrada en polvo, reconstituida, con base en el método analítico físicoquímico oficial denominado “Índice CMP”,
al cual aborda la Instrucción Normativa N° 68 de 12 de diciembre de 2006. Diario Oficial de la Federación, 15 de diciembre de
2006, Sección 1, Folio 67. Secretaría de Agricultura y Abastecimiento.
BRODY, EPActividades biológicas del glicomacropéptido bovino. Revista británica de nutrición. v.84,
supl. 1, páginas 3946, 2000.
BURAGLIA, B. M.; Detección de caseinato y suero en leche y productos lácteos mediante técnicas
electroforéticas, cromatográficas y espectroscópicas. 2001. 227 f.
Tesis (Facultad de Farmacia)Universidad Complutense de Madrid, Madrid, 2001.
CARDOSO, RR Influencia de la microbiota psicrotrófica en el rendimiento del queso Minas Frescal elaborado con
leche almacenada en refrigeración. 2006. 43.f. Disertación (Maestría en Microbiología Agrícola) – Universidad
Federal de Viçosa, ViçosaMG, 2006.
52
CHERNOVA, Luisiana; SHATAEVA, LK; ABRASHAEV, L; VELCHEVA, P. & SAMSONOV, GV

Glicomacropéptido de Kcaseína como sustrato de neuramidasa.
La leche de vaca. abst. v.50, n.3, p.160, 1988.
CUNHA, MF; BRANDÃO, SCC La recolección masiva puede aumentar los riesgos de bacterias
psicrotróficas. Industria láctea. julio/agosto, pág. 7173, 2000.
DALGLEISH, DG Análisis mediante cromatografía líquida rápida de proteínas de variantes de κcaseína y su

relevancia para la estructura micelar y el cuajo. J. Res. láctea. v.53, n.1, p.3451, 1986.
DATTA, N.; DEETH, HC Gelificación por edad de leche UAT: una revisión. Institución Química de
Ingenieros, v. 79, pág. 197210, 2001.
DESAMASURES, N., GUEGUEN, M. Seguimiento de la microbiología de la leche de alta calidad

mediante muestreos mensuales durante 2 años. J. Res. láctea. v.64, pág. 271280, 1997.
DOGAN, B.; BOOR, KJ Diversidad genética y potencial de deterioro entre Pseudomonas spp. Aislado de
Productos Lácteos Fluidos y Plantas Procesadoras de Lácteos. Microbiología Aplicada y
Ambiental. v.69, n.1, p.130138, 2003.
DRACZ, S. Desarrollo de un método inmunoenzimático para análisis de suero de queso en leche. 1996.
63 y sigs. Disertación (Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos) – Universidad Federal de Viçosa,
MG, 1996
FAGUNDES, CM; FISCHER, V; SILVA, WP; CARBONERA, N; ARAÚJO, SR.

Presencia de Pseudomonas spp dependiendo de diferentes etapas del ordeño con diferente manejo
higiénico y en leche refrigerada. Ciencia rural. Santa MaríaRS, v. 36, núm. 2, pág. 568572, marzo/
abril. 2006.
FENNEMA, O Química de los Alimentos. Español: Editora Acribia SA, 2000.
FONSECA, LFL; SANTOS, MV Calidad de la leche y control de mastitis. São Paulo: Lemos Editorial,
2000. 175p.
FOURNET, B.; FIAT, AM; LAÍS, C.; JOLLES, P. Estructura de kcasseína de vaca de la porción de
carbohidrato. Bioch. Biofísica. Acta (Estructura de proteínas), v.576, p.339346, 1979.
FOX, PF Proteólisis durante la elaboración y maduración del queso. J. Dairy Sci., v.72, páginas 13701400,
1989.
FUKUDA, SP Estudio de metodología cuantitativa para la determinación espectrofotométrica de ácido

siálico en leche. 1992. 142 y siguientes. Disertación (Maestría en Tecnología de Alimentos) – Universidad
Estadual de Campinas, Campinas – SP, 1992.
53
FUKUDA, SP; Estudio de la correlación entre el método de la ninhidrina ácida y la

cromatografía líquida de alta resolución para la medición de Glicomacropéptido y
Caseinomacropéptido en leche. 2003. 135 y sigs. Tesis (Doctorado en Tecnología de
Alimentos) – Universidad Estadual de Campinas, Campinas – SP, 2003.
GOMES, M.l. FV Contribución al estudio de la actividad proteolítica residual sobre la estabilidad

proteica de la leche esterilizada "larga vida". 1996. 108 y sigs. Tesis (Doctorado) Universidad
Estadual de Campinas, CampinasSP, 1996.
GONZÁLEZLLANO, D.; POLO, C.; RAMOS, M. Actualización sobre análisis HPLC y FPLC de
compuestos nitrogenados en productos lácteos. Lait. v.70, n.3, pág. 255277, 1990.
GOURSAUD, J. Composición y propiedades físicoquímicas. En: LUQUET, FM (ed.)

Leches y productos lácteos. Vaca, Oveja, Cabra, v.1, de la Ubre al Lechería. Técnica y Documentación
Lavoisier, París, 1985.
HAJDENWURCEL, JR Atlas de Microbiología de Alimentos. Vol.1.. São Paulo: Fonte

Comunicações e Editora Ltda, 2004.
HOOYDONK, furgoneta ACM; OLIEMAN, C. Un método de cromatografía líquida de alto rendimiento

rápido y sensible para seguir la acción de la quimosina en la leche. Neth. Milk Dairy J. v.36, n.2,
p.153158, 1982.
HOOYDONK, furgoneta ACM; OLIEMAN, C.; HAGEDOORN, HG Cinética de la proteólisis catalizada

por quimosina de kcaseína en leche. Neth. Leche Dairy J. v.37, n.(4): 207
222, 1984.
JONG, de N.; VISSER, S. & OLIEMAN, C. Determinación de proteínas de la leche mediante

electroforesis capilar. Revista de cromatografía A. v.652, pág. 207213, 1993.
KOHLMANN, KL; NIELSEN, SS; STEENSON, LR & LADISCH, MR Producción de proteasas por
microorganismos psicrotróficos. Revista de ciencia láctea. v.74, n. 10, pág. 32753283, 1991a.
DERECHO, BA; ANDREWS, AT y Sharpe,ME, 1977, Gelificación de leche esterilizada

a temperatura ultraalta mediante proteinasas de una cepa de Pseudomonas fluorescens
aislada de leche cruda, J Dairy Res., v.44, n.1, p.145–148.
LOPEZFANDIÑO, R.; RAMOS, M. Revision: El caseinomacropeptideo bovino. II Detection de Ia

presencia de suero de queseria en produtos lácteos. Ver. Esp. Cienc.
Tecnol. Alimento., v. 33, n.1, p.112, 1993.
LORENZETTI, DK Influencia del tiempo y la temperatura en el desarrollo de microorganismos

psicrotróficos en leche cruda de dos estados de la región sur. 2006. 71 y sigs.
Disertación (Maestría en Tecnología de Alimentos) – Universidad Federal de Paraná, Curitiba, PR,
2006.
54
McKELLAR, RC Desarrollo de mal sabor en leche pasteurizada y de temperatura ultraalta en función de la

proteólisis. Revista de ciencia láctea. v.64, n.11, pág. 21382145, 1981.
MINISTERIO DE AGRICULTURA, GANADERA Y ABASTECIMIENTO. ASESORÍA EN GESTIÓN

ESTRATÉGICA. Proyecciones para el agronegocio global y Brasil de 2006/07 a 2017/2018. Disponible en:
< www.agricultura.gov.br>. Consultado en septiembre de 2008.
MITCHELL, GE; EWINGS, KN Cuantificación de la proteólisis bacteriana que causa gelificación en leche
tratada con UAT. J. Ciencia láctea. Tecnología. v.20, n.1, p.6576, 1985.
MOLLÉ, D.; LEONIL, J.; Heterogeneidad del caseinomacropéptido de Kcaseína bovina, resuelta
mediante cromatografía líquida en línea con espectrometría de masas de ionización por electropulverización.
Journal of Chromatography A. v.708, p.223230, 1995.
MOLLÉ, D.; LEONIL, J.; Determinación cuantitativa del macropéptido kcaseína bovina en productos
lácteos mediante cromatografía líquida/Electrospray acoplada a espectrometría de masas (LCESI/MS)
y Cromatografía líquida/Electrospray acoplada a espectrometría de masas tamdem (LCESI/MS/MS).
Revista Láctea Internacional. v.15, p.419428, 2005.
MOTTAR, J.; VAN RENTERGHEM, R.; VILDER, J. Evaluación de la materia prima para leche UAT
mediante la determinación del grado de degradación de proteínas mediante HPLC.
Ciencia láctea. v. 40, n.12, pág. 717721, 1985.
NONI, cédula; RESMINI, P.; Identificación de sólidos de cuajosuero en ''mantequilla tradicional'' mediante
HPLC/ESIMS de caseinomacropéptido A no glicosilado. Química de los Alimentos. v.93, n.1, pág.
6572, 2005.
OLIEMAN, C.; BENDEM, JW, VAN DEN. Un método sensible para detectar y estimar los sólidos totales
del suero de cuajo en la leche desnatada en polvo. Neth. Leche Lácteos J., v.37, p.27
36, 1983.
OLIEMAN, C.; VAN RIEL, JAM Detección de sólidos de suero de cuajo en leche desnatada y suero de
leche en polvo con HPLC de fase reversa. Neth. Leche y Lácteos J., v.43, n.2, p. 171
184, 1989.
OLIVA, Y.; ESCOBAR, A.; PONCE, P. Caseinomacropeptído bovino: una alternative para la salud. Rev.
Salud Anim. v.24, n.2, p. 7381, 2002.
PICARD, C.; PLARD, l.; RONGDAUXGAIDA, D. & COLLIN, JC Detección de proteólisis de leche
almacenada a baja temperatura mediante ELISA de inhibición. J. Dairy Res., v.61, n.3, p.395404, 1994.
PICARD, C.; PLARD, l. & COLLIN, JC Aplicación del método ELISA de inhibición al estudio de la proteólisis
causada por proteinasas de Pseudomonas resistentes al calor específicas de Kcaseína en leche
calentada. Milchwissenschaft, v.51, n.8, p. 438442, 1996.
55
RECIO, l; LÓPEZFANDINO, R,; OLANO, A.; OLIEMAN, C. & RAMOS, M. Estudio de la formación de caseinomacropéptidos en leche
almacenada tratada a temperaturas ultraaltas mediante electroforesis capilar. Revista de Química Agrícola y Alimentaria 44 (12):
38453548;
RECIO, I.; FRUTOS de, M.; OLANO, A.; RAMOS, M. Cambios proteicos en leches almacenadas tratadas a
temperaturas ultraaltas estudiados mediante electroforesis capilar y cromatografía líquida de alta resolución.
Revista Agrícola de Química de los Alimentos 44 (12): 39553959, 1996 b.
RECIO, I.; GARCÍARISK, SR; RAMOS, M.; LÓPEZFANDINO, R.; Caracterización de péptidos producidos por la
acción de psicrotróficos sobre kappacaseína.
Journal of Dairy Research, v.67, n.4, p.625630, 2000 a.
RECIO, I.; GARCÍA RIESGO, SR; LÓPEZFANDINO, R.; OLANO, A.; RAMOS, M.; Detección de sólidos de
suero de cuajo en leche UAT mediante electroforesis capilar; Revista Láctea Internacional 10,
pág. 333338, 2000b.
RICHARDS, NSPS Uso racional del suero. Revista de la Industria Láctea, v.2, n.9, p. 6769, 1997.
SHAH, NP Psicrotrofos en la leche: una revisión. Ciencia láctea. v.8, n.8, pág. 432437, 1994.
SILVESTRE, MPC Revisión de métodos para el análisis de hidrolizados de proteínas. Química de Alimentos. v.60,
n.2, pág. 263271, 1997.
SIUZDAK, WMA Espectrometría de masas para biotecnología. Prensa académica. 1996.
SORHAUG, T.; STEPANIAK, L. Psicrotrofos y sus enzimas en leche y productos lácteos: aspectos
de calidad. Tendencias en ciencia y tecnología de los alimentos. v.8, n.2, pág. 3537, 1997.
STOFER, W.; HICKS, CL Psicrófilos perniciosos: su efecto sobre el rendimiento y la composición del queso.
Diario de producción de lácteos cultivados, v. 18, pág. 1114, 1983.
SIMONES, MH; EWINGS, KN Anticuerpos monoclonales reactivos a algunas proteasas de Pseudomonas

fluorescens . Agosto. J. Tecnología láctea. v.45, n.1, pág. 3133, 1990.
THOMÄ, C.; KRAUSE, I.; KULOZIK, U. Comportamiento de precipitación de caseinomacropéptidos y su

determinación simultánea con proteínas del suero mediante RPHPLC. En t. Lácteos J. v.16, n.4, p. 285293,
2006.
TULLIO, LT, Aislamiento y caracterización de glicomacropéptido de suero. 2007. 97 y sigs. Disertación (Maestría
en Tecnología de Alimentos) – Universidad Federal de Paraná, CuritibaPR, 2007.
56
VIEGAS, RP; RESENDE, MFS; CALDEIRA, Luisiana; PENNA, CFAM;

CREQUEIRA, MMOP; LEITE, MO SOUZA, SRA; Evaluación de la calidad
físicoquímica de la leche desnatada UAT comercializada en Belo Horizonte
MG. Anales del XXII Congreso Nacional Lácteo, Cándido Tostes, N° 351, Vol.
61, 8587; Juiz de Fora; JULIO/AGOSTO 2006
VILELA, S.C. Deteccion de suero de queseria agregado a leche pasteurizada y leche en

polvo. Determinacion del glicomacropeptído por electrophoresis. 1987, 81f.
Tesis de Maestría Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile 1987
VREEMAN, HJ; VISSER, S.; SLANGEM, CJ; RIEL, JAM Caracterización de la fracción de k
caseína bovina y la cinética de la liberación de macropéptidos inducida por quimosina a partir
de fracciones libres de carbohidratos y que contienen carbohidratos determinada mediante
cromatografía de permeación en gel de alta resolución. Bioquímica. J. v.240, p.8797, 1986.
WALSTRA, P.; JENNES, R. Química y Física de los Lácteos. Nueva York, John Wiley and
Son. 1984, 467 pág.
WARREN, L. El ensayo del ácido tiobarbitúrico del ácido silaico. J. Biol. Química. v.234, n.8,
p.19711975, 1959.
WOLFSCHOOPOMBO, AF; PINTO, APE de F. Un método cualitativo para la detección de

cuajo en leche. Ciencia y tecnología. de comida. v.5, n.2, p.111115, 1985.
YVON, M.; CHABANET, C.; PELISSIER, JP Solubilidad de péptidos en soluciones de ácido

tridoroacético (TCA). En t. J. Peptide Protein Rés., v.34, p.116176, 1992.
57

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MIRELLA ARAÚJO MAGALHÃES

DETERMINACIÓN DEL FRAUDE DE LECHE DE SUERO

Tesis presentada en la Universidad Federal de

La Universidad Federal de Viçosa y el Departamento de Tecnología de Alimentos para

oportunidad de realizar el curso.

El Decano de Administración de la Universidad Federal de Viçosa, en la persona de

Fátima Luísa, por el apoyo durante el viaje.

A Geralda – DTA, por ayudarme en todo lo que necesitaba.

Al Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento por la oportunidad de realizar

del experimento en las instalaciones del Laboratorio Nacional Agrícola de Minas

Gerais (LANAGRO­MG), y por el apoyo financiero.

Al profesor Sebastião César Cardoso Brandão, por su orientación en mi trabajo,

por la amistad, la paciencia, la perseverancia y el ánimo.

Al profesor Mauro, por sus orientaciones y aportes.

Al profesor Luis Minim por su ayuda y aportes a la tesis.

Profesora Edimar, por su inmensurable colaboración en los análisis estadísticos.

de este trabajo y por sus contribuciones a la tesis.

Mi madre Ana Rita Araújo Ferreira Magalhães, verdadero amor de mi vida,

por sus oraciones diarias, consejos, amistad, apoyo en mis estudios y mi

vida. Muchas gracias por ser mi "refugio seguro".

por oraciones y cariño.

A mi hermana Melissa, mi cuñado Vanderley por su cariño y por estar presentes en

la vida de mis padres cuando estaba fuera de casa estudiando.

A mi sobrina Melina, por sus verdaderas oraciones y amables palabras.

otros momentos que fueron fundamentales para aliviar mi nostalgia y darme

Fuerza para continuar mi trabajo.

A mi amigo Iván Salvador, por su cariño incondicional, atención, preocupación y

A las amigas del Departamento de Tecnología de Alimentos, Geruza, Maria Patrícia,

Mateus, Alexandre y Adenilson, por su amistad y conocimiento compartido.

Maninha, Breno, Pâmela, Alcione, por recibirme siempre en Viçosa

de este trabajo, ayudar en el experimento, compartir apartamento, momentos de alegría,

pasar noches sin dormir, cuando no podía dormir preocupándome por el

experimento. Mi madre de Pedro Leopoldo.

Eugênia y Ricardo por las oportunidades y el apoyo financiero.

A María Helena por el uso del equipo.

A Leonardo Souza, por su amistad y ayuda incondicional durante todo el experimento.

A mi amigo Ronaldo Sanches por su amistad y consejos.

A Sergio Dracz, por sus enseñanzas, paciencia y orientación.

Ruth, por tu apoyo y amistad.

MIRELLA ARAÚJO MAGALHAÃES, hija de Absalão Ferreira Magalhães y

En julio de 2004 se graduó en Ciencia y Tecnología Láctea, de la

En agosto de 2005 inició la Maestría en Ciencia y Tecnología.

LISTA DE MARCOS­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­xi

3­REVISIÓN BIBLIOGRAFICA­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­3

3.1 – UAT de leche.­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­3

3.2­ Importancia de las bacterias psicrotróficas en la proteólisis de la leche­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­4

3.3­ Métodos para el seguimiento de la proteólisis de la leche­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­7

3.4 ­ Caseinomacropéptido.­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­10

3.5 ­ Efecto de la concentración de ácido tricloroacético (TCA) sobre la solubilización de CMP

­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­13

3.6 ­ Métodos para detectar el fraude en el suero de leche ­­­­­­­­­­­­14

4 ­ MATERIALES Y MÉTODOS ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­17

4.1 ­ Recolección de leche UAT sin CMP­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­17

4.2 ­ Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­18

4.3 ­ Análisis de muestras de leche UAT mediante HPLC­FG­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­18

4.4 ­ Obtención del suero­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­19

4.5 ­ Adición de suero a la leche UAT sin CMP ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­19

4.6 ­ Cultivo de leche UAT sin CMP con Pseudomonas fluorescens­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­20

fluorescente ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­21

FR/EM ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ 21

4.9 ­ Detección de CMP por HPLC­FR/EM ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­ ­­­­­­­­­­­22

4.9.1 ­ Descripción del equipo ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­ ­­­­­­­­­­­­­­­­­­22

Gerais (LANAGROMG), y por el apoyo financiero.

LISTA DE MARCOS xi

3REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 3

3.1 – UAT de leche. 3

3.2 Importancia de las bacterias psicrotróficas en la proteólisis de la leche4

3.3 Métodos para el seguimiento de la proteólisis de la leche7

3.4 Caseinomacropéptido. 10

3.5 Efecto de la concentración de ácido tricloroacético (TCA) sobre la solubilización de CMP

13

3.6 Métodos para detectar el fraude en el suero de leche 14

4 MATERIALES Y MÉTODOS 17

4.1 Recolección de leche UAT sin CMP 17

4.2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche18

4.3 Análisis de muestras de leche UAT mediante HPLCFG18

4.4 Obtención del suero 19

4.5 Adición de suero a la leche UAT sin CMP 19

4.6 Cultivo de leche UAT sin CMP con Pseudomonas fluorescens20

fluorescente 21

FR/EM 21

4.9 Detección de CMP por HPLCFR/EM 22

4.9.1 Descripción del equipo 22

4.9.2 Análisis de muestras de leche UAT preparadas para HPLCFR/EM23

4.9.3 Determinación del Tiempo de Retención y curva de calibración CMP23

4.9.3.1 En CLAEFR/EM 23

4.9.3.2 En CLAEFG 24

4.10 Análisis de leche cultivada con Pseudomonas fluorescens y adicionada

diferentes concentraciones de suero por HPLCFR/EM24

4.11 Análisis estadístico 25

fluorescens en métodos de detección de CMP 25

de proteasas de Pseudomonas fluorescens mediante HPLCFR/EM 26

5RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27

5.1 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos de la leche UAT libre de CMP27

5.2 Análisis microbiológicos de leche UAT cultivada con Pseudomonas fluorescens28

5.3 Detección de CMP por CLAEFG 28

5.4 Análisis del patrón CMP en agua mediante HPLCFR/EM.29

5.5 Análisis del patrón CMP en leche mediante HPLCFR/EM32

5.6 Aplicación de HPLCFG para detectar la presencia de suero añadido al

leche UAT 34

5.7 Aplicación de HPLCFR/EM para detectar la presencia de suero

añadido a la leche UAT 35

leche por CLAEFG y CLAEFR/EM 37

suero añadido por CLAEFG 38

suero añadido por CLAEFR/EM 42

5.11 Variación en la concentración de iones con relación masa/carga 1697.4+4, 1301.2+5 y

añadido con suero, determinado por HPLCFR/EM46

6. CONCLUSIÓN 50

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 51

1 Sitio de acción de la quimosina sobre la κcaseína 11

2 Estructura primaria del glicomacropéptido 11

3 Esquema del experimento de detección de fraude en el suero de leche

CLAEFREM y por CLAEFG 20

concentraciones séricas por HPLCFR/EM y HPLCFG, después de la incubación con

Pseudomonas fluorescens. 22

5 Cromatograma (HPLCFG) de leche UAT adicionada con 90 mg/L del estándar

por CLAEFG 29

(45 mg/L) por HPLCFR/EM 30

1697,4+4m /z 31

9 Cromatogramas del estándar CMP en agua en concentraciones de 0, 30, 75 y 90

FR/EM 31

10 Cromatogramas del estándar CMP en leche en concentraciones de 0, 30, 75 y 90

FR/EM 32

específico 1697,4+4 m/z 33

12 Análisis por cromatografía líquida de alta resolución espectrometría de masas

específico 1698.4+4, 2264.3+3 de aglicoCMPA 33

13 Exploración masa/carga del pico correspondiente al tiempo de retención de 26,8

minutos obtenidos analizando muestras de mantequilla por HPLC/EM34

(v/v) (B) suero 35

analizado por CLAEFR/EM 36

masa/carga de 1697,4+4, analizado por CLAEFR/EM 37

17 Variación en el área de detección de CMP dependiendo de diferentes concentraciones de

suero utilizando CLAEFG y CLAEFR/EM como métodos de análisis38

18 Variación en el área de detección de CMP dependiendo del tiempo de incubación de un

como método de análisis CLAEFG. 39

19 Cromatogramas, por HPLCFG, de leche UAT cultivada con Pseudomonas

fluorescens y se incubaron a 7 ºC durante 4 días (A) y 6 días (B) y 8 días (C)41

y se agregaron diferentes concentraciones de suero (0, 5, 10, 15 y 20% (v/v))43

21 Cromatogramas obtenidos mediante el seguimiento de iones específicos 1697.4+4, 2263.3+3,

diferentes concentraciones de suero analizadas por HPLCFR/EM48

1 Composición teórica de los aminoácidos presentes en el glicomacropéptido 12

2 Resultados de análisis físicoquímicos y microbiológicos de leche UHT sin CMP27