Laboratorio de Biocatálisis

Enzimática ICB 536

Cecilia Guerrero
Cecilia.guerrero@pucv.cl

Abril 2019
Reactor enzimático

• El Reactor Enzimático (Biorreactor) es la unidad de proceso en

la que efectúa la conversión de sustratos en productos, en
condiciones ambientales controladas.
Fundamentos del diseño

• El diseño y selección de un reactor enzimático deberá

considerar como aspectos esenciales:

❖ La naturaleza del biocatalizador

❖ La cinética de la reacción
❖ La naturaleza de sustratos y productos de la reacción
❖ Las propiedades del biocatalizador
❖ Requerimientos de control

Un análisis cualitativo de la incidencia de estos factores permite

muchas veces seleccionar o discriminar entre, distintas
(posibles) configuraciones de un reactor.
Reactores Enzimáticos

❖ Enzimas libres (disueltas en el medio de reacción)

❖ Enzimas inmovilizadas (insolubilizadas)

por lotes continuo de

c/recirculación ultrafiltración

por lotes agitado

continuo de
continuo lecho fijo
agitado continuo de lecho
fluidizado
Diseño Reactores Enzimáticos

Modelo Cinético Balance Materia

V = f (E, X)

Modelo de Restricciones
inactivación Difusionales
E = f (t, T)  = f (So, )

Modelo de Comportamiento
*k * E = f (So , X)
F*K
Diseño y operación de reactores bajo
condiciones de idealidad

 Régimen de flujo ideal

 Operación isoterma
 Ausencia de partición
 Ausencia de restric. difusionales
 Ausencia de inactivación
Diseño Reactores Enzimáticos

Modelo Cinético Balance Materia

V = f (E, X)

Modelo de Restricciones
inactivación Difusionales
E = f (t, T)  = f (So, )

Modelo de Comportamiento
*k * E = f (So , X)
F*K
 S Productos
Vs X =
si - s
v =
K+s si

Reactor por Lotes (Batch)

k e s i (1 - X) dX
v = = si
K + s i (1 - X) dt

si k e m cat  ae
X − ln(1 - X) = t= t
K K K
Reactor por lotes

𝑘 ∙ 𝐸 ∙ 𝑡 𝑆0 ∙ 𝑥
= − ln 1 − 𝑥
𝐾𝑚 ∙ 𝑉𝑅 𝐾𝑚

Ecuación de diseño
Permite calcular el volumen de
reacción (VR) a partir de E, X y S0.

Ecuación de operación
Permite establecer para una
determinada carga enzimática, la
relación X vs t a distintos S0.
Inmovilización enzimática
Inmovilización enzimática
Inmovilización enzimática
β-galactosidasa de Aspergillus oryzae

pH óptimo 4.5
Temperatura 40 y 60 °C
 Lactasa (β-galactosidasa)
Lactosa
Glucosa Galactosa

H2O

Complejo
β-galactosidasa
β-galactosidasa E-Gal

• La lactasa se encuentra en las células epiteliales del tracto digestivo.

• La reacción de hidrólisis de la lactosa, permite romper la lactosa en sus
monómeros constituyentes glucosa y galactosa y de esta forma absorberla
en el intestino.
Objetivo Experiencia 4

“Desarrollar un experiencia práctica de la

operación de un reactor enzimático en
modalidad discontinua con enzimas
soluble e inmovilizada”
Experiencia Laboratorio N°4

Reactor por lotes

Reactor
por Lotes
Hidrólisis de lactosa a 40 ºC, pH,
4.5, 10 % p/p de lactosa.
Experiencia Laboratorio N°4
Reactor por lotes

e
S P

dS
= Entrada − Salida + Genera − Consume
dt
dS
= 0−0+0−v V  S
dt
v= max

dS S
Km + S
− = Vm 
dt Km + S
Puesta en marcha del reactor por lotes
Actividades 1: Puesta en marcha del
reactor por lotes

1. Instalar el reactor de acuerdo al esquema de la Figura 1.

2. Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los

sellos del sistema de calefaccción.

3. Evaluar la potencia de agitación.

4. Poner en marcha el sistema de calefacción, etc.

Sistema de calefacción
Termocupla
Sistema de Agitación
Cierre del Reactor
Instaslación termocupla y electrodo pH
Sistema de calefacción

Tener PRECAUCIÓN al
instalar las mangueras,
electrodo y termocupla
en el reactor. Estos se
deben posicionar lo más
alejado del agitador de
hélic
 Actividad: Hidrólisis enzimática de
lactosa
Antes de comenzar la experiencia los alumnos deberán calcular la cantidad
de enzima ha adicionar al reactor de tal forma que se alcance un grado de
conversión de 80% en 1 horas de operación.

Procedimiento:
1. Preparar una solución de lactosa 100 g/L p/p a pH 4,5.
2. Tomar una muestra para determinar la concentración de lactosa y
glucosa inicial (tiempo cero).
3. Poner en marcha el sistema de agitación y calentamiento (40° y 300
rpm).
4. Esperar que el sistema de reacción alcance la temperatura deseada y
adicionar la enzima.
5. Cada 10 minutos sacar muestras de 0,5 ml y determinar el grado de
hidrólisis de la lactosa.
6. Detener la reacción cuando se alcance un 100% de hidrólisis.
 Actividad: Metodología Experimental,
Determinación del grado de hidrólisis de la lactosa.
1. Las muestras se reciben en viales los cuales son colocados en un baño
con agua a 80°C para detener la reacción.
2. Se toman 0.1 ml de la solución y se le adicionan 1 ml del reactivo
enzimático para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra se
debe diluir con agua destilada antes de realizar la determinación de
glucosa.
3. Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37°C y se determina la
absorbancia a 505nm.
4. Se realiza un blanco utilizando agua destilada como muestra y una
muestra Standard con una solución de glucosa de 0.1 g/l.

5. La determinación de la concentración de glucosa en la muestra se

hace a través de la relación entre las absorbancias y las concentraciones
de la muestra y la de la muestra Standard.
 Actividad: Metodología Experimental,
Determinación del grado de hidrólisis de la lactosa.

Consideraciones importantes:

Para esta enzima los valores de los parámetros cinéticos Km y Vm,

obtenidos en los laboratorios previos.

El grado de conversión (moles de glucosa/moles de lactosa) se

determina a cada tiempo por lo que durante la experiencia
deberán ir graficando el grado de conversión en función del tiempo
obtenido experimentalmente, para llevar un seguimiento del curso
de la reacción.
Reactor por lotes

𝑘 ∙ 𝐸 ∙ 𝑡 𝑆0 ∙ 𝑥
= − ln 1 − 𝑥
𝐾𝑚 ∙ 𝑉𝑅 𝐾𝑚

Ecuación de diseño
Permite calcular el volumen de
reacción (VR) a partir de E, X y S0.

Ecuación de operación
Permite establecer para una
determinada carga enzimática, la
relación X vs t a distintos S0.
Resultados esperados

1. Curva de producto versus tiempo de operación.

2. Comprar la curva experimental con una curva teoríca.

1
Concentración de glucosa

0,8
(mmol/L)

0,6

0,4

0,2

0
0 20 40 60 80 100
Tiempo (minutos)