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ARTÍCULO
La proteína HilE similar a Hcp inhibe la homodimerización y el ADN
unión del regulador transcripcional asociado a la virulencia
HilD en Salmonella
Recibido para publicación el 12 de diciembre de 2017 y en forma revisada el 27 de febrero de 2018 Publicado en artículos en prensa el 13 de marzo de 2018, DOI 10.1074/jbc.RA117.001421
Claudia C. Paredes­Amaya‡1, Gilberto Valdés­García§ , Víctor R. Juárez­González§ , Enrique Rudiño­Piñera§, y
Víctor H. Bustamante‡2
‡ §
De los Departamentos de Microbiología molecular y Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología,
Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos 62210, México
Editado por Chris Whitfield.
HilD es un regulador transcripcional similar a AraC que desempeña un papel
papel central en la virulencia de Salmonella. HilD controla la expresión de los
genes dentro de la isla de patogenicidad de Salmonella 1
(SPI­1) y de varios genes ubicados fuera de SPI­1, que son
Se requiere principalmente para la invasión de Salmonella a las células huésped. El
La expresión, cantidad y actividad de HilD están estrictamente controladas.
por la actividad de varios factores. La proteína HilE reprime
la expresión de los genes SPI­1 a través de su interacción con
HilD; sin embargo, el mecanismo por el cual HilE afecta a HilD es
desconocido. En este estudio, utilizamos ensayos genéticos y bioquímicos.
revelando cómo HilE controla la actividad transcripcional de HilD.
Descubrimos que HilD necesita ensamblarse en homodímeros para inducir
expresión de sus genes diana. Nuestros resultados indicaron además que
HilE interactúa individualmente con las regiones HilD central y C­ter­minal,
mediando la dimerización y la unión al ADN.
respectivamente. También observamos que estas interacciones inhiben
consistentemente la dimerización de HilD y la unión al ADN. Curiosamente, un
análisis computacional reveló que HilE comparte
secuencia y similitudes estructurales con las proteínas Hcp, que
actúan como componentes estructurales de los sistemas de secreción tipo 6 en
Bacterias Gram­negativo. En conclusión, nuestros resultados revelan la
Mecanismo molecular mediante el cual la proteína HilE similar a Hcp controla la
dimerización y la unión al ADN de la proteína promotora de virulencia.
regulador transcripcional HilD. Nuestros hallazgos pueden indicar que
La actividad de HilE representa una adaptación funcional durante el
Evolución de la patogenicidad de Salmonella.
El género Salmonella agrupa bacterias patógenas para el ser humano.
y muchos animales; comprende sólo dos especies, Salmonella
Este trabajo fue apoyado por la Beca 254531 (a VHB) y la Beca Predoctoral 290934 (a CCP­A.)
del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.
Beca IN203415 (a VHB) y una beca postdoctoral (a GV­G.) de
Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la Universidad
Nacional Autónoma de México, y fondos del Posgrado en Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México (al CCP­A.).
Los autores declaran no tener conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Este artículo contiene las Tablas S1 y S2 y las Figs. S1 y S2.
1
Este trabajo se completa como cumplimiento parcial de los requisitos para obtener el título de
doctorado del Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad.
Nacional Autónoma de México.
2
A quién debe dirigirse la correspondencia: Departamento de Microbiología
Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de
México, Cuernavaca, Morelos 62210, México. Tel.: 52­777­329­1627; Fax:
52­777­313­8673; Correo electrónico: victor@ibt.unam.mx.
6578 J. Biol. Química. (2018) 293(17) 6578 –6592
© 2018 por la Sociedad Estadounidense de Bioquímica y Biología Molecular, Inc. Publicado en EE. UU.
cro
enterica y Salmonella bongori, la primera se divide a su vez
en seis subespecies y más de 2500 serovares. Dependiendo de
el huésped, S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)
puede causar enfermedades que van desde gastroenteritis hasta infecciones
sistémicas potencialmente mortales (1, 2). Por ejemplo, en humanos, los terneros,
y pollos, S. Typhimurium causa gastroenteritis autolimitada, mientras que en
ratones de laboratorio causa una infección sistémica.
parecido al producido por S. Typhi en humanos; de este modo,
S. Typhimurium se utiliza frecuentemente como modelo para estudiar la
mecanismos moleculares que median la virulencia de Salmonella (1,
3, 4). Los eventos de transferencia horizontal de genes han contribuido en gran medida
a la evolución de la patogenicidad de Salmonella (5, 6). La mayoría de
Los genes adquiridos por Salmonella se agrupan en cromosomas.
regiones denominadas islas de patogenicidad de Salmonella (SPI)3 (4, 5).
SPI­1 es una región de 40 kb conservada en las dos especies de Salmonella,
que incluye 39 genes que codifican un sistema de secreción tipo 3
(T3SS­1), sus chaperonas y proteínas efectoras, así como
algunos reguladores transcripcionales que controlan la expresión de
muchos genes de virulencia ubicados dentro y fuera de SPI­1 (4, 7).
Los T3SS son jeringas moleculares que se extienden desde las membranas de
varias bacterias, compuestas por un cuerpo basal y un complejo en forma de
aguja, a través del cual se inyectan proteínas efectoras.
Del citoplasma bacteriano al citoplasma de eucariotas.
celdas (8). Salmonella inyecta las proteínas efectoras SPI­1 en el
células epiteliales intestinales a través del T3SS­1, que induce
reordenamientos citoesqueléticos que promueven la invasión de Salmonella de
estas células eucariotas y conducen a enteritis (1, 4, 8).
La expresión de los genes SPI­1 está controlada por varios
pistas ambientales, como osmolaridad, tensión de oxígeno, pH,
concentración de ácidos grasos cortos y largos, y bilis (4, 9­11). En
vitro, la expresión de los genes SPI­1 se induce en la fase estacionaria
temprana cuando Salmonella se cultiva en caldo lisogénico (LB) rico en
nutrientes (12, 13). Varios reguladores controlan la expresión de los genes
SPI­1, incluidos HilD, HilA e InvF, todos
codificados en SPI­1, que actúan en forma de cascada: HilD, un miembro
3
Las abreviaturas utilizadas son: SPI, islas de patogenicidad de Salmonella ; SPI­1,
Isla 1 de patogenicidad de Salmonella ; T3SS, sistema de secreción tipo 3; T6SS,
sistema de secreción tipo 6; LexADBDwt, dominio de unión al ADN LexA de tipo salvaje;
LexADBDmut, dominio de unión al ADN LexA mutado; MBP, unión a maltosa
proteína; Trx, tiorredoxina; LZ, cremallera de leucina; Hcp, corregulado por hemolisina
proteína; CAT, cloranfenicol acetiltransferasa; LB, caldo lisogénico;
Ni­NTA, níquel­ácido nitrilotriacético; EMSA, ensayo de movilidad electroforética;
IPTG, isopropil ­D­tiogalactopiranósido; ­gal, ­galactosidasa; APB,
Banco de datos de proteínas.
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El miembro de la familia de reguladores transcripcionales AraC/XylS, induce
directamente la expresión de HilA, que a su vez activa la expresión de InvF;
HilA e InvF activan la expresión de todos los componentes de T3SS­1, sus
chaperonas y proteínas efectoras (4, 14). HilD induce la expresión de HilA
directamente o mediante un bucle de retroalimentación positiva que forma
con HilC y RtsA (15, 16). HilC y RtsA son reguladores transcripcionales
similares a AraC que se unen a la misma secuencia de ADN reconocida por
HilD; HilC está codificado en SPI­1, mientras que RtsA está codificado en
otra isla. HilD también controla la expresión de muchos otros genes de
virulencia ubicados fuera de SPI­1, incluidos genes adquiridos y ancestrales,
directa o indirectamente a través de HilA, InvF u otros reguladores (12,
17­25). De acuerdo con su papel como regulador transcripcional maestro
para una gran cantidad de genes, la expresión, concentración y actividad de
HilD están estrictamente controladas. La transcripción de hilD está
autorregulada positivamente (15, 26) y está reprimida por H­NS (27),
mientras que su traducción está reprimida por CsrA (28). Además, Fur y FliZ
controlan HilD a nivel postraduccional (29, 30); la proteasa Lon degrada
HilD, mediando así su concentración (31, 32); y el sistema de dos
componentes CpxR/A disminuye la estabilidad de HilD a través de
mecanismos independientes y dependientes de Lon (33).
Además, varios compuestos afectan a HilD: el propionato y las sales biliares
disminuyen su estabilidad (9, 10); el butirato y el oleato afectan
negativamente su actividad reguladora, mientras que el acetato y el formiato
la mejoran (11, 34­36); y la L­arabinosa afecta la expresión de HilD a nivel
postranscripcional (37).
La actividad de HilD también está controlada negativamente por HilE a
través de la interacción proteína­proteína (38). Sin embargo, se desconoce
el efecto específico de esta interacción sobre HilD.
El gen hilE reside en una región del cromosoma de Salmonella similar a
una isla de patogenicidad (38), lo que respalda que fue adquirido por
transferencia horizontal. La expresión de hilE está regulada positivamente
por los sistemas de dos componentes PhoPQ y PhoBR, así como por FimZ
y LeuO (39, 40), mientras que está regulada negativamente por Mlc y el
pequeño ARN IsmR (41, 42), que proporciona entradas adicionales que
controlan la actividad de HilD.
Aquí mostramos que HilE afecta negativamente la dimerización y la unión
al ADN de HilD, al interactuar con las regiones central y C­terminal de HilD,
que median la dimerización y la unión al ADN, respectivamente. Por lo tanto,
nuestros resultados demuestran cómo HilE regula la actividad de HilD.
Además, nuestros resultados revelaron que HilE comparte similitudes
estructurales y de secuencia con proteínas llamadas Hcp (proteína
corregulada por hemolisina), que son componentes estructurales de los
sistemas de secreción tipo 6 en bacterias Gram­negativas, lo que apoya la
hipótesis de que HilE se adaptó para actuar como un importante Proteína
reguladora durante la evolución de la patogenicidad de Salmonella.
Resultados
HilE interactúa con la región central y con la región C­terminal de HilD
Investigar cómo HilE afecta negativamente la actividad de
HilD, analizamos la interacción de HilE con diferentes regiones de HilD
utilizando el sistema genético basado en LexA para la heterodimerización,
que es similar a un sistema de dos híbridos para
HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD
analizar las interacciones proteína­proteína (43, 44). Es importante destacar
que la interacción entre HilE y HilD fue demostrada previamente con este
sistema (38). En el sistema genético de heterodimerización basado en LexA,
el dominio de unión al ADN WT LexA (LexADBDwt) y un mutante derivado
de este (LexADBDmut) se expresan a partir de dos plásmidos diferentes en
la cepa informadora SU202 de Escherichia coli, que porta un sulA
cromosómico. –Fusión transcripcional lacZ que contiene un operador
híbrido LexA (43, 44). LexADBDwt y LexADBDmut no pueden afectar la
expresión de sulA­lacZ; sin embargo, cuando se fusionan con proteínas que
interactúan entre ellos, se forma un dímero activo de LexADBDwt y
LexADBDmut que es capaz de unirse al operador híbrido LexA en sulA­lacZ
y así reprimir la expresión de esta fusión. Se generaron y evaluaron
proteínas de fusión de LexADBDwt con regiones distintas o de longitud
completa de HilD y de LexADBDmut con HilE de longitud completa. Las
fusiones LexADBDwt­ HilD se denominaron según la posición de los
aminoácidos de los extremos del fragmento HilD transportado (Fig. 1A).
Como era de esperar, la combinación LexADBDwt–HilD1–309 (HilD de larga
duración)
LexADBDmut – HilE (HilE completo), pero no LexADBDwt LexADBDmut
o LexADBDwt – HilD LexADBDmut, represión mediada de sulA – lacZ (Fig.
1B), lo que confirma aún más la interacción entre HilD y HilE. Curiosamente,
las proteínas de fusión LexADBDwt–HilD1–220 o LexADBDwt–HilD221–
309, en combinación con LexADBDmut–HilE, también reprimieron la
expresión de sulA­lacZ (Fig. 1B), lo que indica que HilE interactúa con las
regiones de HilD que abarcan aminoácidos 1–220 y 221–309. Por el
contrario, la combinación LexADBDwt–HilD1–130 LexADBDmut– HilE no
reprimió la expresión de sulA–lacZ, lo que respalda que HilE no interactúa
con la región N­terminal de HilD de los aminoácidos 1 al 130. Sin embargo,
la falta de interacción entre LexADBDwt–HilD1–130 y LexADBDmut–HilE
podría deberse a un plegado incorrecto de LexADBDwt–HilD1–130. Como
se esperaba, la combinación LexADBDwt–HilD1–130LexADBDmut,
LexADBDwt–HilD1–220 LexADBDmut o LexADBDwt– HilD221–309
LexADBDmut, utilizada como control negativo, no afectó la expresión de
sulA–lacZ (Fig. 1B). El análisis de transferencia Western mostró señales de
expresión para todas las proteínas de fusión LexADBDwt­HilD analizadas
(Fig. 1C). Cabe señalar que la fusión LexADBDwt­ HilD221­309 reprimió la
fusión sulA­lacZ, en combinación con LexADBDmut­HilE (Fig. 1B), incluso
cuando su nivel de expresión era más bajo que el de LexADBDwt­HilD1­309
y LexADBDwt­. Fusiones HilD1­220 (Fig. 1C), lo que indica que las
diferencias en la cantidad de proteínas de fusión LexADBDwt­HilD evaluadas
no afectaron los resultados de estos ensayos. De acuerdo con un informe
anterior (45), no se detectó la expresión de LexADBD en nuestro análisis
de transferencia Western (Fig. 1C). Estos resultados respaldan que HilE
interactúa con regiones que abarcan los aminoácidos 130–220 y 221–309
de HilD.
Se realizaron ensayos desplegables para confirmar las interacciones de
HilE con HilD. Para ello, purificamos HilE fusionada a la proteína Trx y una
etiqueta His6 (Trx­His­HilE) como se describe en "Procedimientos
experimentales". La proteína de fusión Trx­His­HilE reprimió el perfil de
secreción de proteínas mediada por SPI­1 de la cepa WT S. Typhimurium
(Fig. 2A), lo que respalda que puede afectar negativamente a HilD. Se utilizó
Trx­His­HilE como proteína de cebo en los ensayos de extracción; Primero,
se inmovilizó en resina Ni­NTA y luego en extractos de células completas
que contenían
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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 1. HilE interactúa con dos regiones diferentes de HilD. A, representación esquemática de las proteínas de fusión LexADBDwt­HilD y LexADBDmut­HilE analizadas.
Los números indican los residuos de LexADBD, HilD o HilE transportados en la proteína de fusión respectiva. B, la expresión de la fusión sulA­lacZ se determinó en el
Cepa informadora SU202 de E. coli que contiene el par de plásmidos pSR658 y pSR659 (LexADBDwt LexADBDmut), pSR658 –HilD1 y pSR659­HilE1 (LexADBDwt–
HilD1–309 LexADBDmut–HilE), pSR658 –HilD1 y pSR659 (LexADBDwt–HilD1–309 LexADBDmut), pSR658 –HilD2 y pSR659­HilE1 (LexADBDwt–HilD1–130 LexADBDmut–HilE), pSR658 –HilD2 y
pSR659 ( LexADBDwt–HilD1– 130 LexADBDmut), pSR658 –HilD4 y pSR659­HilE1 (LexADBDwt–HilD1–220 LexADBDmut–
HilE), pSR658 –HilD4 y pSR659 (LexADBDwt–HilD1–220 LexADBDmut), pSR658 –HilD5 y pSR659­HilE1 (LexADBDwt–HilD221–309 LexADBDmut–HilE), o
pSR658 –HilD5 y pSR659 (LexADBDwt–HilD221–309 LexADBDmut). La actividad ­gal se determinó a partir de muestras recolectadas de cultivos bacterianos cultivados en LB
a 37 °C hasta un A600 de 1,0. La expresión de las proteínas de fusión LexADBD se indujo añadiendo IPTG 1 mM al medio. Los datos son los promedios de tres
experimentos independientes realizados por duplicado. Las barras representan las desviaciones estándar. ***, expresión estadísticamente significativamente diferente en comparación
con el alcanzado en ausencia de HilE (p 0.001); ns, no hay diferencias significativas. C, expresión de LexADBDwt, LexADBDwt–HilD, LexADBDwt–HilD1–130,
Las proteínas LexADBDwt – HilD1 – 220 y LexADBDwt – HilD221 – 309 se analizaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos policlonales anti­LexA. Los lisados de células completas fueron
preparado a partir de muestras de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de 1,0. Como control de carga, también se determinó la expresión de GroEL utilizando
Anticuerpos policlonales anti­GroEL. MW, estándares de peso molecular de proteínas (Precision Plus ProteinTM; Bio­Rad). Las puntas de flecha indican las bandas esperadas.

ya sea LexADBD o LexADBDwt–HilD1–309, LexADBDwt–HilD1– que HilE se une tanto a la región central como al C­terminal
130, se cargaron proteínas presa LexADBDwt – HilD1 – 220, LexADBDwt – región de HilD.
HilD221 – 309 en la resina Ni – NTA que transportaba Trx – His – HilE.
Como era de esperar, Trx–His–HilE capturó el LexADBDwt–HilD1– HilE no afecta la estabilidad de HilD

309 y proteínas presa LexADBDwt – HilD1 – 220 , pero no
LexADBDwt–HilD1–130 o LexADBDwt (Fig. 2B), confirmando la
interacción de HilE con HilD completo y la región central
de HilD. LexADBDwt–HilD221–309 mostró interacción con HilE
en el sistema genético basado en LexA (Fig. 1B); sin embargo, en el
ensayos pulldown, esta interacción no fue evidente (Fig. 2B),
lo cual podría explicarse por el bajo nivel de expresión mostrado
por LexADBDwt – HilD221–309 (Fig. 1C). Como control, se realizaron
ensayos desplegables paralelos utilizando Trx­His como proteína cebo,
que no pudo capturar ninguna de las presas de LexADBDwt­HilD
proteínas analizadas (Fig. 2C). En conjunto, estos resultados indican
La interacción con HilE podría afectar la estabilidad de HilD, a
Al investigar esto, determinamos la vida media in vivo de HilD.
en presencia o ausencia de HilE o la proteasa Lon, que
degrada HilD. Los niveles celulares de HilD etiquetado con Myc (HilD–
Myc) expresado a partir del plásmido pBAD­HilD, bajo un promotor inducible
por nariz arábiga, se monitorearon en los mutantes hilD, hilD hilE y hilD lon
de S. Typhimurium, a diferentes niveles.
veces después de agregar una mezcla de inhibidores de la transcripción y la
traducción. Los niveles de HilD­Myc fueron similares a lo largo del tiempo en el
mutantes hilD y hilD hilE, que muestran una vida media de HilD–
Myc de 12,60 y 11,68 min, respectivamente; Como era de esperar, la esta­

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 2. Ensayos desplegables que muestran la interacción entre HilE y HilD. A, la secreción de las proteínas SipA, SipB, SipC y SipD codificadas por SPI­1 se probó en la
cepa WT S. Typhimurium y su mutante isogénico hilD , así como en la cepa WT S. Typhimurium que porta el plásmido pET32­HilE. expresando Trx–His–HilE o el vector
pET32b() que expresa Trx–His. Los cultivos bacterianos se cultivaron durante 9 h en LB a 37 °C, en presencia () o ausencia () de IPTG 1 mM para inducir o no la expresión
de Trx­His­HilE o Trx­His. Los sobrenadantes de los cultivos se analizaron en SDS­PAGE al 12%. FliC es una proteína flagelar cuya secreción es independiente de SPI­1. B
y C, las proteínas de cebo Trx­His­HilE (B) o Trx­His (C) inmovilizadas en resina Ni­NTA se incubaron con extractos de células enteras que contenían LexADBDwt,
LexADBDwt­HilD1­309, LexADBDwt­HilD1­130, Proteínas presa LexADBDwt – HilD1 – 220 o LexADBDwt – HilD221 – 309 . Después del lavado, las proteínas capturadas
por las proteínas de cebo Trx­His­HilE o Trx­His se analizaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos policlonales anti­LexA. Las proteínas cebo Trx–His–
HilE o Trx–His también se detectaron con anticuerpos monoclonales anti­His6.MW , estándares de peso molecular de proteínas (Precision Plus ProteinTM; Bio­Rad). Las
puntas de flecha indican las bandas esperadas. Los asteriscos indican bandas que muestran reacción cruzada con los anticuerpos policlonales anti­LexA.

La capacidad de HilD­Myc aumentó drásticamente en el mutante hilD lon
(Fig. 3, A y B). Estos resultados demuestran que la interacción con HilE no
afecta la estabilidad de HilD.
HilD actúa como un dímero y su región central media la interacción
misma.
Varios reguladores transcripcionales similares a AraC actúan como
dímeros (46–49). Por lo tanto, pensamos que la interacción de HilE con la
región central de HilD podría afectar la dimerización de HilD. Para investigar
esta posibilidad, primero analizamos si HilD realmente dimeriza utilizando
el sistema genético basado en LexA para la homodimerización (43, 44).
En este caso, LexADBDwt se expresa a partir de un plásmido en la cepa
informadora SU101 de E. coli, que porta una fusión transcripcional
cromosómica sulA­lacZ que contiene el operador LexAWT (43, 44).
LexADBDwt no afecta la expresión de sulA­lacZ; sin embargo, cuando se
fusiona con una proteína que a su vez interactúa, se forma un dímero
activo de LexADBDwt , que es capaz de unirse al operador WT LexA en
sulA­lacZ y, por lo tanto, reprime la expresión de esta fusión. El
Las mismas proteínas de fusión LexADBDwt­HilD utilizadas anteriormente
en el ensayo de heterodimerización ahora se probaron en el ensayo de
homodimerización. LexADBDwt solo y la proteína de fusión LexADBDwt­
H­NS, cuya capacidad de dimerización se ha probado anteriormente (50),
se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente.
Tanto LexADBDwt – H­NS como LexADBDwt – HilD1–309, pero no
LexADBDwt, reprimieron la expresión de sulA – lacZ (Fig. 4A), lo que
indica que HilD se dimeriza. Un análisis de transferencia Western mostró
señales de expresión para las proteínas de fusión LexADBDwt – HilD1 –
309 y LexADBDwt – H­NS (Fig. 4B). Para confirmar la dimerización de
HilD, se analizó mediante cromatografía de filtración en gel el tamaño de
la fusión proteína de unión a maltosa (MBP)­HilD, purificada en condiciones
nativas. La proteína de fusión MBP­HilD eluyó de la cromatografía de
filtración en gel como un producto de 178 kDa (Fig. S1), que corresponde
a un tamaño similar al esperado para un dímero de esta proteína.
LexADBDwt – HilD1 – 220 también reprimió la expresión de sulA – lacZ
(Fig. 4C), lo que indica que la región que abarca los aminoácidos 1 a 220
media la dimerización de HilD. A diferencia de,

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 3. HilE no afecta la estabilidad de HilD. A, la estabilidad de HilD­Myc se determinó en los mutantes hilD, hilD hilE y hilD lon de S. Typhimu­rium que porta el plásmido
pBAD­HilD1, cultivado en LB a 37 °C. La expresión de HilD­Myc, del promotor inducible por arabinosa de pBAD­HilD1, se indujo con L­arabinosa al 0,05% durante 45
minutos; luego se detuvo la transcripción y traducción mediante la adición de una mezcla de antibióticos y glucosa, y se tomaron muestras de cultivos bacterianos en los
momentos indicados. HilD­Myc se detectó a partir de lisados de células completas de las muestras mediante transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales
anti­Myc. Como control de carga, también se determinó la expresión de GroEL utilizando anticuerpos policlonales anti­GroEL. Se muestra una transferencia Western
representativa de tres experimentos independientes. La figura está compuesta por cuatro borrones diferentes. B, el análisis densitométrico de las bandas HilD­Myc de la
transferencia Western se indica como el porcentaje relativo de HilD­Myc en cada momento con respecto al tiempo 0. Los valores de intensidad de las bandas HilD­Myc se
normalizaron con los respectivos de las bandas GroEL. Los datos son los promedios de tres experimentos independientes. Las barras representan la desviación estándar
y t1∕2 indica la vida media de HilD. MW, estándares de peso molecular de proteínas (Precision Plus ProteinTM; Bio­Rad).

LexADBDwt–HilD1–130, LexADBDwt–HilD221–309 y el control negativo La actividad de esta fusión también se determinó en el WT S.

LexADBDwt no afectaron la expresión de sulA­lacZ (Fig. 4C), lo que respalda
que las regiones entre los aminoácidos 1 y 130 y los aminoácidos 221 y 309
no participan en la dimerización de HilD. Estos resultados sugieren que la
dimerización de HilD parece estar mediada por la región que comprende
los aminoácidos 130­220. Para investigar más a fondo esta afirmación,
construimos y probamos la proteína de fusión LexADBDwt­HilD130­309 ,
que contiene una región HilD N­terminal extendida con respecto a
LexADBDwt­HilD221­309. Como era de esperar, LexADBDwt – HilD130–
309 pudo reprimir la expresión de sulA – lacZ (Fig. 4C), lo que indica que
interactúa entre sí. En conjunto, estos resultados indican que HilD se
dimeriza a través de su región central que va desde los aminoácidos 130 al
220.
A continuación, intentamos determinar si se requiere
dimerización para la actividad regulatoria de HilD. Para esto, se
probó la capacidad de inducir la expresión de una fusión
transcripcional hilA­cat de LexADBDwt–HilD1–309, LexADBDwt–
HilD221–309 y LexADBDwt–HilD130–309, que llevan el dominio
de unión al ADN de HilD. en una cepa de E. coli K­12. Porque hilA
es un gen controlado directa y positivamente por HilD (4, 51) y
HilD no está presente en E. coli K­12. Como control negativo
también se evaluó LexADBDwt ; Además, como referencia para la
expresión de hilA–cat en presencia o ausencia de HilD, el
Cepa Typhmurium y su mutante hilD isogénico. La expresión de
hilA–cat fue inducida en presencia de LexADBDwt– HilD1–309 o
LexADBDwt–HilD130–309, que muestran dimerización, pero no
fue inducida por LexADBDwt–HilD221–309 que no dimeriza (Fig.
5). Como se esperaba, la expresión de hilA­cat también se indujo
en la cepa WT S. Typhimurium, pero no en el mutante hilD o en
presencia de LexADBDwt (Fig. 5).
Estos resultados respaldan que HilD necesita formar dímeros para
inducir la expresión de genes diana. Para confirmar esto,
generamos y analizamos la proteína quimérica LexADBDwt–LZ–
HilD221–309, que es una fusión de LexADBDwt, el motivo de
cremallera de leucina (LZ) del factor transcripcional GCN4 de
Saccharomy­ces cerevisiae y el dominio de unión al ADN. de HilD
(aminoácidos 221–309) (Fig. 6A). El motivo LZ se ha utilizado
anteriormente como módulo de dimerización (52). La capacidad
de la proteína de fusión LexADBDwt­LZ­ HilD221­309 para
someterse a dimerización e inducir la expresión de hilA se evaluó
y se comparó con la de las proteínas de fusión LexADBDwt­
HilD221­309 y LexADBDwt­HilD1­309 . Tanto LexADBDwt–LZ–
HilD221–309 como LexADBDwt – HilD1–309, pero no LexADBDwt–
HilD221–309, reprimieron la expresión de sulA–lacZ en la cepa
informadora SU101 de E. coli (Fig. 6B), lo que indica que
LexADBDwt–LZ– HilD221–309 se dimeriza a través del motivo LZ heterólogo

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 4. HilD forma homodímeros a través de su región central. A, la expresión de la fusión sulA­lacZ se determinó en la cepa indicadora SU101 de E. coli que contiene los
plásmidos pSR658 (LexADBDwt), pSR658 –HilD1 (LexADBDwt–HilD1–309) o pSR658 –HNS (LexADBDwt–H­NS). B, la expresión de LexADBDwt, LexADBDwt– HilD1–309
y LexADBDwt–H­NS se analizó mediante transferencia Western utilizando anticuerpos policlonales anti­LexA. Como control de carga, también se determinó la expresión de
GroEL utilizando anticuerpos policlonales anti­GroEL. MW, estándares de peso molecular de proteínas (Precision Plus ProteinTM; Bio­Rad). Las puntas de flecha indican las
bandas esperadas. C, la expresión de la fusión sulA­lacZ se determinó en la cepa indicadora SU101 de E. coli que contiene los plásmidos pSR658 (LexADBDwt), pSR658 –
HilD1 (LexADBDwt–HilD1–309), pSR658 –HilD2 (LexADBDwt–HilD1–130), pSR658 –HilD4 (LexADBDwt–HilD1–220), pSR658 –HilD5 (LexADBDwt–HilD221–309), o pSR658
–HilD3 (LexADBDwt–HilD130 –309). La actividad ­gal se determinó a partir de muestras recolectadas de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de 1,0.
La expresión de LexADBDwt y las proteínas de fusión LexADBDwt se indujo añadiendo IPTG 1 mM al medio. Los datos son los promedios de tres experimentos
independientes realizados por duplicado. Las barras representan las desviaciones estándar. ***, expresión estadísticamente significativamente diferente respecto a la
alcanzada en presencia de LexADBDwt (p 0,001).

HilD221–309 y LexADBDwt–HilD1–309, pero no LexADBDwt– HilD221–
309, indujeron la expresión de la fusión hilA­cat en E. coliK­12 (Fig. 5), lo
que muestra que el motivo LZ genera dímeros del ADN­ dominio de unión
de HilD, que puede inducir la expresión de genes diana. En general, estos
resultados demuestran que HilD se dimeriza a través de su región central
que abarca los aminoácidos 130 a 220, que es esencial para la actividad
reguladora de HilD.
HilE afecta negativamente la dimerización de HilD Según
los resultados descritos anteriormente, ahora analizamos si HilE afecta
la dimerización de HilD. Para ello, se analizó la homodimerización de la
puede afectar negativamente a HilD. También se evaluó como controles
negativos el efecto de HilE sobre LexADBDwt – LZ – HilD221–309 y
LexADBDwt – H­NS, que se dimerizan a través del motivo LZ y el dominio
de dimerización H­NS, respectivamente. Curiosamente, HilE afectó la
represión de sulA­lacZ mediada por la dimerización de LexADBDwt­
HilD1­309; por el contrario, no afectó la represión de sulA­lacZ mediada por
la dimerización de LexADBDwt­LZ­HilD221­309 o LexADBDwt­H ­NS (Fig.
7B).
Estos resultados indican que HilE afecta negativamente a la dimerización
de HilD pero no a la de H­NS o al motivo LZ probado.
HilE afecta directamente el dominio de unión al ADN de HilD

proteína de fusión LexADBDwt­HilD1­309 , que porta el dominio de
dimerización de HilD, en presencia del plásmido pA6­HilE1 que expresa
HilE o en presencia del vector pMPM­A6. La expresión de HilE de pA6­HilE1
redujo drásticamente el perfil de secreción de proteínas mediada por SPI­1
de la cepa WT S. Typhimurium (Fig. 7A), lo que respalda que la cantidad de
HilE alcanzada por este plásmido
Los resultados descritos anteriormente indican que HilE afecta la
dimerización de HilD al interactuar con la región central de este regulador,
lo que a su vez inhibiría indirectamente su actividad reguladora. Sin
embargo, nuestros resultados revelaron que HilE también interactúa con la
región C­terminal de HilD (Fig. 1B), que lleva el dominio de unión al ADN, lo
que sugiere que HilE también podría afectar directamente la unión al ADN
de HilD. Para investigar esto, analizamos

J. Biol. Química. (2018) 293(17) 6578 –6592 6583

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 5. Se requiere dimerización para la actividad regulatoria de HilD. La

expresión de la fusión hilA­cat contenida en el plásmido philA­cat1 se probó en el
WT S. Typhimurium SL1344 y su mutante isogénico hilD , así como en la cepa de
E. coli MC4100 que porta los plásmidos pSR658 (LexADBDwt), pSR658. –HilD1
(LexADBDwt–HilD1–309), pSR658 –HilD5 (LexADBDwt–HilD221–309), pSR658 –
HilD3 (LexADBDwt–HilD130 –309), o pSR658 –HilD6 (LexADBDwt–LZ– HilD221–
309). La actividad específica de CAT se determinó a partir de muestras
recolectadas de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de
1,2. La expresión de LexADBDwt, LexADBDwt – HilD1–309, LexADBDwt –
HilD221–309, LexADBDwt – HilD130 –309 y LexADBDwt – LZ – HilD221–309 se
indujo agregando IPTG 1 mM al medio. Los datos son los promedios de tres
experimentos independientes realizados por duplicado. Las barras representan
las desviaciones estándar. ***, expresión estadísticamente significativamente
diferente comparada con la alcanzada en presencia de LexADBDwt (p 0,001).
Lizaron el efecto de HilE sobre la capacidad de LexADBDwt – HilD1–
309 y LexADBDwt – LZ – HilD221–309 para inducir la expresión de
la fusión hilA­cat en E. coli K­12. La presencia de HilE bloqueó
completamente la actividad de hilA–cat inducida por LexADBDwt–
HilD1–309, que transporta la proteína HilD de longitud completa e
inhibió parcialmente la actividad de esta fusión mediada por
LexADBDwt–LZ–HilD221–309, que contiene la proteína de unión al
ADN. dominio de HilD fusionado al motivo de dimerización heterólogo
LZ (Fig. 8). Estos resultados, junto con los resultados que indican
que HilE no afecta a la dimerización mediada por el motivo LZ (Fig.
7B), muestran que HilE puede afectar directamente al dominio de
unión al ADN de HilD, independientemente de su efecto sobre la
dimerización de este regulador. Por lo tanto, el mayor efecto negativo
de HilE sobre la actividad reguladora de LexADBDwt–HilD1–309 que
el de LexADBDwt–LZ–HilD221–309 (Fig. 8) podría ser el resultado
de un doble efecto de HilE sobre LexADBDwt–HilD1–. 309, sobre la
dimerización y el dominio de unión al ADN, y solo un efecto de HilE
en LexADBDwt – LZ – HilD221–309, sobre el dominio de unión al ADN.
MBP­HilD (Fig. 9, A y B), lo que indica que Trx­His­HilE interfiere con
HilE inhibe la unión al ADN de HilD la unión al ADN de MBP­HilD. Reacciones de unión adicionales
Nuestros resultados respaldan firmemente que HilE inhibe la descartaron una posible actividad de unión al ADN de Trx­His­HilE,
actividad de unión al ADN de HilD. Para confirmar esto, realizamos incluso a la concentración más alta probada (2,0 M) (Fig. 9C).
ensayos de cambio de movilidad electroforética competitivos (EMSA) con
Figura 6. LexADBDwt–LZ–HilD221–309 dimeriza. A, representación esquemática
de LexADBDwt–LZ–HilD221–309. Los números indican los residuos de Lex­
ADBD o HilD transportados en esta proteína de fusión. B, la expresión de la fusión
sulA­lacZ se determinó en la cepa indicadora SU101 de E. coli que contiene los
plásmidos pSR658 (LexADBDwt), pSR658 –HilD1 (LexADBDwt–HilD1–309),
pSR658 –HilD5 (LexADBDwt–HilD221–309), o pSR658 –HilD6 (LexADBDwt–LZ–
HilD221–309). La actividad ­gal se determinó a partir de muestras recolectadas
de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de 1,0. La
expresión de LexADBDwt, LexADBDwt – HilD1–309, LexADBDwt – HilD221–309
y LexADBDwt – LZ – HilD221–309 se indujo agregando IPTG 1 mM al medio. Los
datos son los promedios de tres experimentos independientes realizados por
duplicado. Las barras representan las desviaciones estándar. ***, expresión
estadísticamente significativamente diferente a la alcanzada en presencia de
LexADBDwt (p 0,001); ns, no hay diferencias significativas.
proteínas Trx­His­HilE y MBP­HilD purificadas y un fragmento de 50
pb de la región reguladora de hilC que lleva un sitio de unión a HilD.
Como se muestra arriba, Trx­His­HilE purificado interactúa con HilD
(Fig. 2B) y, por otro lado, en un estudio previo demostramos que
MBP­HilD purificado se une a genes diana en EMSA (12). El
fragmento hilC se incubó con una concentración constante de MBP­
HilD (0,5 M) sin o con concentraciones crecientes de Trx­His­HilE
(0,3, 0,5, 1,0, 1,5 y 2 M). Se realizaron reacciones de unión paralelas
con Trx­His purificado en lugar de Trx­His­HilE, como controles
negativos. A partir de la concentración de 1,0 M, Trx­His­HilE, pero
no Trx­His, redujo drásticamente la formación del complejo ADN/

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 7. HilE inhibe la dimerización de HilD. A, la secreción de las proteínas SipA, SipB, SipC y SipD codificadas por SPI­1 se probó en la cepa WT S. Typhimurium
y su mutante isogénico hilD , así como en la cepa WT S. Typhimurium que porta el plásmido pA6 –HilE1. expresar HilE a partir de un promotor inducible por
arabinosa, o portar el vector pMPM­A6, en presencia () o ausencia () de concentraciones crecientes de L­arabinosa. Los cultivos bacterianos se cultivaron durante 9
h en LB a 37 °C y los sobrenadantes se analizaron en SDS­PAGE al 12%. FliC es una proteína flagelar cuya secreción es independiente de SPI­1. MW, estándares
de peso molecular de proteínas (Precision Plus ProteinTM; Bio­Rad). B, la expresión de la fusión sulA­lacZ se determinó en la cepa indicadora SU101 de E. coli que
contiene el par de plásmidos pSR658 y pA6 –HilE1 (LexADBDwt HilE), pSR658 y pMPM–A6 ( vector LexADBDwt), pSR658 –HilD1 y pA6 – HilE1 (LexADBDwt–
HilD1–309 HilE), pSR658 –HilD1 y pMPM–A6 (vector LexADBDwt–HilD1–309 ), pSR658 –HNS y pA6 –HilE1 (LexADBDwt–H­NS HilE), pSR658 –HNS y pMPM–A6
( Vector LexADBDwt–H­NS ), pSR658 –HilD6 y pA6 –HilE1 (LexADBDwt–LZ–HilD221–309 HilE), o pSR658­HilE6 y pMPM–A6 ( vector LexADBDwt– LZ–HilD221–
309 ). La actividad ­gal se determinó a partir de muestras recolectadas de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de 1,0. La expresión de
LexADBDwt, LexADBDwt – HilD1–309, LexADBDwt – HN­S y LexADBDwt – LZ – HilD221–309 se indujo agregando IPTG 1 mM al medio. También se añadió L­
arabinosa al 0,1% para inducir la expresión de HilE a partir de pA6 –HilE1. Los datos son los promedios de tres experimentos independientes realizados por
duplicado. Las barras representan las desviaciones estándar. ***, expresión estadísticamente significativamente diferente respecto a la alcanzada en ausencia de
HilE (p 0,001); ns, no hay diferencias significativas.

Por lo tanto, estos resultados confirman aún más la interacción de HilE con
HilD y demuestran que esta interacción inhibe la unión de HilD al ADN.
HilE comparte similitudes de secuencia y estructura con las
proteínas Hcp de T6SS
HilE fue reportada hace varios años como una proteína que no presenta
homología con ninguna otra proteína en las bases de datos (38).
Sin embargo, nuestro reciente análisis BLASTp reveló que la secuencia HilE
presenta una identidad del 30% con las proteínas Hcp de los sistemas de
secreción tipo 6 (T6SS) de diferentes bacterias Gram­negativas (Fig. 10A y
datos no mostrados). Para determinar si HilE también presenta analogía
estructural con las proteínas Hcp, se modeló mediante el servidor I­TASSER
(53, 54). HilE fue exitoso
modelado produciendo una estructura con una puntuación C de 1,07 y una
puntuación TM de 0,86. La estructura predicha está compuesta por un
dominio de barril apretado con dos láminas, con cuatro y cinco hebras
cada una, flanqueado en un lado por una hélice (Fig. 10B).
La estructura modelada general de HilE se parece mucho a la descrita para
las subunidades monoméricas de las proteínas Hcp: Hcp1 de Pseudomonas
aeruginosa (55), Hcp1 de Acinetobacter bauman­nii (56), EvpC de
Edwardsiella tarda (57), un efector de T6SS (T6SSe). de Yersinia pestis y
4
Hcp2 de S. Typhimurium (58)
(Fig. 10C), mostrando valores de TM de 0,95, 0,89, 0,88, 0,86 y 0,78,
respectivamente, con estas proteínas. Los valores de TM de 0,5 indican
4
EV Filippova, A. Halavaty, G. Minasov, L. Shuvalova, I. Dubrovska, J. Winsor,
L. Papazisi y WF Anderson, observaciones no publicadas.

J. Biol. Química. (2018) 293(17) 6578 –6592 6585

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD
Figura 8. HilE afecta directamente al dominio de unión al ADN de HilD. La
expresión de la fusión hilA­cat contenida en el plásmido philA­cat1 se probó en la
cepa de E. coli MC4100 que porta el par de plásmidos pSR658 –HilD1 y pK6 –
HilE1 (LexADBDwt–HilD1–309 HilE), pSR658 –HilD1 y pMPM–. K6 ( vector
LexADBDwt–HilD1–309), pSR658 –HilD6 y pK6 –HilE1 (LexADBDwt– LZ–HilD221–
309 HilE), pSR658 –HilD6 y pMPM–K6 (vector LexADBDwt–LZ– HilD221–309 ),
pSR658 y pK6 – HilE1 (LexADBDwt HilE), o pSR658 y pMPM – K6 ( vector
LexADBDwt). La actividad específica de CAT se determinó a partir de muestras
recolectadas de cultivos bacterianos cultivados en LB a 37 °C hasta un A600 de
1,2. La expresión de LexADBDwt, LexADBDwt–HilD1–309 y LexADBDwt– LZ–
HilD221–309 se indujo agregando IPTG 1 mM al medio. También se añadió La­
rabinosa al 0,1% para inducir la expresión de HilE a partir de pK6 –HilE1. Los
datos son los promedios de tres experimentos independientes realizados por
duplicado. Las barras representan las desviaciones estándar. ***, expresión
estadísticamente significativamente diferente respecto a la alcanzada en
ausencia de HilE (p 0,001).
estructuras que comparten la misma topología. Estos resultados son
consistentes con la similitud estructural compartida entre las proteínas
HilE y Hcp.
Discusión
La regulación negativa de HilE en los genes de virulencia SPI­1 es
importante para la aptitud de Salmonella (59). Anteriormente, se
demostró que HilE controla negativamente la expresión de los genes
SPI­1 al interactuar con HilD, un regulador positivo central de SPI­1
(38). En este estudio, mostramos que HilE regula específicamente la
actividad de unión al ADN de HilD al inhibir la dimerización y actuar
directamente sobre el dominio de unión al ADN de este regulador. De
acuerdo con esto, un estudio reciente también encontró que HilE
bloquea la unión de HilD al ADN (60). Nuestros resultados indican que
HilD requiere dimerización para inducir la expresión de genes diana.
Consistentemente, los sitios de unión de HilD en diferentes genes
tienen dos secuencias repetidas directas (21, 27, 51). Varios otros
reguladores transcripcionales similares a AraC actúan como dímeros,
como ToxT, ExsA, UreR y AggR, que controlan la expresión de genes
de virulencia en Vibrio cholerae, P. aeruginosa, Proteus mira­bilis y E.
coli (45, 48, 49, 61, 62). HilE interactúa con la región central de HilD y
así inhibe su dimerización, lo que indirectamente afectaría la actividad
de unión al ADN de este regulador. Además, HilE interactúa con la
región C­terminal de
6586 J. Biol. Química. (2018) 293(17) 6578 –6592
HilD que contiene el dominio de unión al ADN, que afecta negativamente
a la actividad transcripcional de HilD independientemente de su
dimerización. Esta doble interacción y efecto respalda un estricto
control de la actividad de HilD por parte de HilE. En E. coli
enteroagregativa, la proteína Aar interactúa con la región central de
AggR, que contiene el dominio de dimerización, inhibiendo la
dimerización y la unión al ADN de este regulador similar a AraC (62).
De manera similar, en P. aeruginosa, la proteína ExsD interactúa con
la región N­terminal de ExsA, que contiene el dominio de dimerización,
impidiendo así la dimerización y la unión al ADN de este regulador (45,
61, 63). Ni Aar ni ExsD parecen comprometer directamente el dominio
de unión al ADN de sus reguladores objetivo. Un ejemplo de una
proteína que actúa directamente sobre el dominio de unión al ADN de
un regulador transcripcional es el control ejercido por CarS sobre el
represor CarA en Myxococcus xan­thus. CarS se une al dominio de
unión al ADN de CarA y, por tanto, inhibe su interacción con los genes
diana; Curiosamente, la estructura de CarS imita el ADN del operador
reconocido por CarA (64). Se requieren estudios adicionales, como
análisis tridimensionales, para determinar la estequiometría precisa y
los aminoácidos que median en la interacción entre HilE y HilD, que es
un tema de nuestra investigación actual.
Se ha demostrado que la interacción proteína­proteína regula la
estabilidad de los reguladores transcripcionales. Por ejemplo, FliT
interactúa con el complejo FlhD4C2, el regulador positivo central de los
genes flagelares, lo que mejora la degradación de la subunidad FlhC
por la proteasa ClpXP (65). Nuestros resultados descartaron un efecto
negativo de HilE sobre la estabilidad de HilD en las condiciones de
crecimiento probadas, lo que respalda aún más que HilE solo controla
la actividad reguladora de HilD. Sin embargo, debido a que HilD se
autorregula positivamente (15, 26), HilE controla indirectamente la
expresión y, por tanto, la cantidad de HilD.
Curiosamente, encontramos que HilE comparte identidad de
secuencia y analogía estructural con proteínas Hcp de diferentes
bacterias Gram­negativas; por tanto, HilE podría postularse como una
proteína similar a Hcp. Es importante señalar que las proteínas
similares a Hcp, incluida HilE, conservan una alta similitud estructural
pero una baja identidad de secuencia entre ellas (55) (Fig. 10A). Las
proteínas Hcp son componentes estructurales de los T6SS, que son
máquinas de translocación que se asemejan a una cola de fago
invertida, involucradas en diferentes funciones como la actividad
antibacteriana y la virulencia (66, 67). Curiosamente, los componentes
de los T6SS, incluidas las proteínas Hcp, están estrechamente
relacionados con los de la cola de los fagos, que funcionan como
canales para la entrega de ADN a las bacterias (66, 67).
Específicamente, las proteínas Hcp forman una estructura de anillo
hexamérica que se apila de cabeza a cola, formando el tubo a través
del cual las proteínas efectoras T6SS se inyectan desde el citoplasma
bacteriano a la célula presa o se liberan al medio extracelular (66). –
68). Además, las proteínas Hcp también pueden actuar como
chaperonas que ayudan a la translocación de las proteínas efectoras
T6SS (69). S. Typhimurium posee un T6SS funcional, que está
codificado en SPI­6 (70). Queda por determinar si HilE tiene un papel estructural/a
El gen hilE está ubicado en una región genómica que muestra
características adquiridas por Salmonella (Fig. S2) (38); El análisis
BLASTp indicó que las otras proteínas también codificadas en esta isla
genómica de Salmonella no muestran homología con ninguna proteína
relacionada con los T6SS. Es tentador especular que
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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 9. HilE inhibe la actividad de unión al ADN de HilD. Se realizaron EMSA no radiactivos competitivos para analizar el efecto de HilE sobre la actividad de
unión al ADN de HilD. A y B, se incubó un fragmento de ADN de 50 pb de hilC, que contenía un sitio de unión a HilD, con MBP­HilD purificada (0,5 M) y
concentraciones crecientes (0, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 M) de proteínas Trx­His­HilE (A) o Trx­His (B) purificadas. C, se realizó EMSA para evaluar la actividad de
unión al ADN de HilE. El fragmento de ADN de 50 pb de hilC se incubó con concentraciones crecientes de Trx­His­HilE purificado (0, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 M). Los
complejos ADN­proteína están indicados con un asterisco y se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 6% no desnaturalizante y se tiñeron con bromuro de etidio.

HilE divergió de una proteína ancestral T6SS o del fago Hcp.
Así, nuestros resultados podrían ilustrar la adaptación de una proteína
estructural, durante la evolución de Salmonella, para actuar como regulador
de la expresión de genes de virulencia.
Procedimientos experimentales
Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano
Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla S1.
Los cultivos bacterianos se cultivaron en LB que contenía 1% de triptona,
0,5% de extracto de levadura y 1% de NaCl a pH 7,5. Cuando fue necesario,
los medios se complementaron con los siguientes antibióticos: ampicilina
(200 g/ml), estreptomicina (100 g/ml), tetraciclina (12 g/ml) o kanamicina (20
g/ml). Los cultivos para la determinación de la actividad de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) y para los ensayos del sistema genético basados en
LexA se realizaron como describimos anteriormente (12, 28, 50).
Construcción de plásmidos
Los plásmidos y cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la
Tabla S1. y Tabla S2, respectivamente. Para construir los plásmidos
pSR658–HilD1, pSR658–HilD2, pSR658–HilD3, pSR658–HilD4 y pSR658–
HilD5, se amplificaron fragmentos del gen hilD mediante PCR utilizando los
pares de cebadores HilD­SacI/HilDexR­PstI, HilD­SacI/. HilD­130, HilD130– pSR658 – HilD3, pSR658 – HilD4 o pSR658 – HilD5 se transformaron en la
2/HilDexR­PstI, HilD­SacI/HilD­220 y HilD­221/HilDexR­PstI, respectivamente. misma cepa informadora. Los transformantes se cultivaron en LB con
Los productos de PCR resultantes se digirieron con SacI y PstI y se clonaron
en el vector pSR658 digerido con las mismas enzimas de restricción.
Para construir el plásmido pSR659­HilE1, el gen hilE se amplificó mediante
PCR utilizando los cebadores HilE­SacI y HilE­HindIII­3. El producto de la
PCR resultante se digirió con SacI y HindIII y se clonó en el vector pSR659
digerido con las mismas enzimas de restricción. Para construir el plásmido
pSR658­HilD6, el fragmento de ADN que codifica 35 aminoácidos del motivo
LZ de GCN4 de S. cerevisiae se amplificó mediante PCR utilizando los
cebadores LZ­F y HilD221LZR y el ADN del plásmido pUT18C­zip como
plantilla. El fragmento que codifica la región de HilD de los codones 221 a
309 (HilD221–309) también se amplificó mediante PCR utilizando los
cebadores LZ­HilD221F y HilDexR­PstI. Luego, los fragmentos LZ y HilD221–
309 fueron fusionados por
PCR de extensión de superposición utilizando los cebadores LZ­F y
HilDexR­PstI. El producto de PCR resultante se digirió con XhoI y PstI y se
clonó en el vector pSR658 digerido con las mismas enzimas de restricción.
Para construir los plásmidos pA6­HilE1 y pK6­HilE1, el gen hilE se amplificó
mediante PCR utilizando los cebadores HilE­NcoI­2 y HilE­His6. El producto
de PCR resultante se digirió con NcoI y HindIII y se clonó en los vectores
pMPM­A6 o pMPM­K6 digeridos con las mismas enzimas de restricción.
Para construir el plásmido pET32­HilE que expresa la proteína de fusión Trx­
His­HilE, el gen hilE se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores
HilE­NcoI­2 y HilE­PUT­BamHI. El producto de la PCR resultante se digirió
con NcoI y BamHI y se clonó en el vector pET32b() digerido con las mismas
enzimas de restricción.
Ensayos de dimerización HilD.
Para probar la dimerización de HilD, los plásmidos pSR658, pSR658­
HilD1 o pSR658­HNS se transformaron en la cepa informadora SU101 de E.
coli para ensayos de homodimerización, que porta la fusión transcripcional
cromosómica A­lacZ (43, 44).
Asimismo, para determinar la región de HilD que contiene el dominio de
dimerización, los plásmidos pSR658, pSR658 – HilD1, pSR658 – HilD2,
tetraciclina e IPTG 1 mM para inducir la expresión de las proteínas de fusión
LexADBD y LexADBD .
Las muestras se recogieron a un A600 de 1,0 y se utilizaron para la
determinación de la actividad de ­gal.
Para probar si HilE afecta la dimerización de HilD, la cepa informadora
SU101 de E. coli se transformó primero con los plásmidos pSR658, pSR658–
HilD1, pSR658–HNS o pSR658–HilD6 y luego se transformó con el vector
pMPM–A6 o el vector pA6–. Plásmido HilE1 que expresa HilE del promotor
inducible por arabinosa. Los transformantes se cultivaron en LB con
tetraciclina y ampicilina, así como con IPTG 1 mM para inducir la expresión
de LexADBD y las proteínas de fusión LexADBD y con L­arabinosa al 0,1%
para inducir la expresión de HilE. Las muestras se recogieron a un A600 de
1,0 y se utilizaron para la determinación de la actividad de ­gal.

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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD

Figura 10. Comparación de secuencia y estructura de HilE con proteínas Hcp. A, alineación de secuencia de HilE y cinco proteínas Hcp: Hcp1 de P. aeruginosa
(Hcp1­Pa), Hcp1 de A. baumannii (Hcp1­Ab), EvpC de E. tarda (EvpC­Et), T6SSe de Y. pestis ( T6SSe­Yp), y Hcp2 de S. Typhimurium (Hcp2­Stm). B, representación
en cinta de la estructura predicha de HilE con el servidor I­TASSER, coloreada por estructura secundaria: hebras (azul), hélice (naranja) y bucles (gris). C,
superposición de la estructura predicha de HilE (azul) con la estructura cristalográfica de las proteínas Hcp1­Pa (código PDB 4KSR) (rojo), Hcp1­Ab (código PDB
4W64) (verde), EvpC­Et (código PDB 3EAA) (amarillo), T6SSe­Yp (código PDB 3V4H) (cian) y Hcp2­Stm (código PDB 5XEU) (magenta).

Ensayos de heterodimerización HilD­HilE Ensayos

Para probar la interacción entre HilD y HilE, la cepa indicadora SU202
de E. coli para ensayos de heterodimerización, que porta la fusión
transcripcional sulA­lacZ con un operador híbrido LexA (43, 44) se
transformó primero con los plásmidos pSR658, pSR658­HilD1, pSR658–
HilD2, pSR658–HilD4 o pSR658–HilD5 y luego se transformaron con el
vector pSR659 o el plásmido pSR659­HilE1. Los transformantes se
cultivaron en LB con tetraciclina y ampicilina y con IPTG 1 mM para inducir
la expresión de LexADBD y las proteínas de fusión LexADBD . Las
muestras se recogieron a un A600 de 1,0 y se utilizaron para la
determinación de la actividad de ­gal.
­ensayos gal
El ensayo ­gal y la cuantificación de proteínas para calcular actividades
específicas se realizaron como se describió anteriormente (71).
CAT Los ensayos CAT y la cuantificación de proteínas para calcular las
actividades específicas de CAT se realizaron como se describió
anteriormente (72).
Transferencia
Western Se prepararon extractos de células enteras a partir de muestras
bacterianas recolectadas en los momentos indicados de cultivos LB. Se
sometieron 10 g de cada extracto a electroforesis en geles de SDS­
poliacrilamida al 12% y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
con un tamaño de poro de 0,45 m (Merck), utilizando un aparato de
transferencia semiseca (Bio­Rad). Las membranas que contenían las
proteínas transferidas se bloquearon en leche descremada al 5% durante
la noche y luego se incubaron con anticuerpos monoclonales anti­c­Myc
(Sigma, n.° de catálogo M4439) o anti­His6 (Roche, n.° de catálogo
11922416001) a diluciones 1:5000 y 1:1000, respectivamente, o con anti­
LexA (Abcam, n.º de catálogo ab14553) o anti­GroEL (Sigma, cat­

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análogo no. G6532) anticuerpos policlonales en diluciones 1:10.000 y 1:100.000,
respectivamente. Como anticuerpos secundarios se utilizaron anti­ratón conjugado con
peroxidasa de rábano picante (Sigma, número de catálogo A9044) o anti­conejo
(Rock­land, número de catálogo 611­1302) en una dilución de 1:10.000. Las bandas
en las membranas transferidas se revelaron mediante incubación con el reactivo de
luminiscencia Western Lightning Chemi­luminiscencia plus (PerkinElmer) y se
expusieron a películas Kodak X­Omat o Amersham Imager 600 (GE Healthcare).
Expresión y purificación de MBP – HilD.
La expresión y purificación de MBP­HilD se realizaron como describimos
anteriormente (12).
Expresión y purificación de Trx–His y Trx–His–HilE
Las proteínas Trx­His y Trx­His­HilE se expresaron en E. coli BL21/DE3 que portaba
los plásmidos pET32b() o pET32­HilE, respectivamente, y se purificaron a partir de
extractos bacterianos solubles mediante el uso de columnas Ni­NTA­agarosa ( Qiagen).
Los cultivos bacterianos se cultivaron en 250 ml de LB con ampicilina hasta un A600
de 0,6, a 37 °C. Luego se indujo la expresión de Trx­His o Trx­His­HilE añadiendo IPTG
1 mM y los cultivos se incubaron a 30 °C durante 4 h. Las bacterias se recogieron
mediante centrifugación a 4 °C y los sedimentos se lavaron una vez con tampón de
unión enfriado con hielo (imidazol 5 mM , NaCl 500 mM , Tris­HCl 20 mM , pH 8,0) y
se resuspendieron en 30 ml del mismo. buffer. Las células se lisaron con prensa
francesa y los restos bacterianos se eliminaron mediante centrifugación a 4 °C. Los
extractos bacterianos solubles se cargaron en columnas de Ni­NTA­agarosa
previamente equilibradas con 50 ml de tampón de unión. Las columnas se lavaron con
100 ml de tampón de unión y luego con 100 ml de tampón de lavado ( imidazol 20 mM ,
NaCl 500 mM , Tris­HCl 20 mM , pH 8,0). Las proteínas se eluyeron con tampón de
elución ( imidazol 250 mM , NaCl 500 mM , Tris­HCl 20 mM , pH 8,0).
Las fracciones recogidas se analizaron en un SDS­PAGE al 12%.
Aquellas fracciones que contenían las proteínas Trx­His y Trx­His­HilE purificadas se
cargaron en un casete Slide­A­Lyzer 7K (Thermo) y se dializaron a 4 °C en un tampón
que contenía Tris­HCl 20 mM , pH 8,0, 40 mM. KCl, EDTA 1 mM y glicerol al 20% (v/
v). La concentración de proteínas se determinó mediante el procedimiento de
Bradford. Se almacenaron alícuotas de las proteínas Trx­His y Trx­His­HilE purificadas
a 70 °C.
Ensayos de movilidad electroforética.
Las EMSA se realizaron utilizando las proteínas MBP­HilD, Trx­His­HilE o Trx­His
purificadas y un fragmento de ADN de 50 pb de hilC que contiene un sitio de unión de
HilD. El fragmento hilC de 50 pb se generó mediante la hibridación de los cebadores
complementarios HilCRR­F y HilCRR­R. Para ello, los cebadores, cada uno a una
concentración final de 15 M, se hirvieron juntos a 95 °C durante 10 minutos y luego se
enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente. Se realizaron reacciones de unión
competitiva mezclando 100 ng del fragmento hilC con MBP­HilD (0,5 M) y cantidades
crecientes de Trx­His­HilE o Trx­His (0,3, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 M), en un volumen total de
20 l de tampón de unión que contiene 100 g/ml de BSA, HEPES 30 mM , pH 7,5, EDTA
5 mM , DTT 3 mM , KCl 200 mM , MgCl2 25 mM y glicerol al 5%. Para EMSA no
competitivos, solo se utilizaron cantidades crecientes de proteína purificada Trx­His­
HilE (0,3, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0 M). Proteína­ADN
HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD
Las reacciones de unión se incubaron a 37 °C durante 20 minutos y luego se separaron
electroforéticamente en geles de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% en tampón
Tris borato­EDTA al 0,5, a temperatura ambiente. Los fragmentos de ADN se tiñeron
con bromuro de etidio y se visualizaron con un transiluminador UV Alpha­Imager (Alpha
Innotech Corp.).
Ensayos de estabilidad HilD
Los ensayos de estabilidad de HilD se realizaron como describimos anteriormente
(33). Los valores de las bandas HilD­Myc se normalizaron con respecto a los de las
bandas GroEL, y luego se calculó el porcentaje relativo de HilD­Myc en cada momento
indicado, con respecto al tiempo 0. El tiempo de vida media (t1/2) de HilD se calculó
mediante una ecuación de desintegración de fase.
Análisis de secreción de proteínas.
Los ensayos de secreción de proteínas se realizaron como describimos
anteriormente (28). Las muestras se analizaron en SDS­PAGE al 12% y se
tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R­250.
Ensayo de filtración en gel
La proteína purificada MBP­HilD se sometió a análisis de cromatografía de
filtración en gel utilizando el sistema AKTA­FPLC ( columna Superdex 200 HiLoadTM
26/60; GE Healthcare Life Sciences), con un caudal de 0,5 ml/min y un límite de
presión de 0,3 MPa, en un tampón que contiene Tris­HCl 200 mM , pH 8,0, NaCl 150
mM a 20 °C. La columna se precalibró utilizando un kit de marcadores de peso
molecular de filtración en gel (Sigma­Aldrich) que incluía citocromo c de corazón de
caballo (12,4 kDa), anhidrasa carbónica de eritrocitos bovinos (29 kDa), albúmina de
suero bovino (66 kDa), alcohol deshidrogenasa de levadura (150 kDa) y ­amilasa de
batata (200 kDa). La masa molecular relativa de MBP­HilD se determinó comparándola
con la curva de calibración de peso molecular de cinco puntos.
Ensayos desplegables
Los ensayos de extracción se realizaron con proteínas de fusión Trx­His­
HilE o Trx­His purificadas y extractos de células completas de E. coli SU101
que expresan LexADBDwt, LexADBDwt­HilD1­309, LexADBDwt­HilD1­130,
LexADBDwt­HilD1­220 o LexADBDwt. – HilD221–309. Para inmovilizar la
proteína del cebo, se incubaron 15 g de Trx­His­HilE o Trx­His purificado
durante 1 h a 10 °C con 80 l de resina Ni­NTA (Qiagen) previamente
equilibrada con tampón de lisis (NaH2PO4 50 mM , 300 NaCl mM , imidazol
5 mM , pH 8,0) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. La resina que
contenía la proteína cebo inmovilizada se lavó con 1 ml de tampón de
lavado ( NaH2PO4 70 mM , NaCl 300 mM , imidazol 35 mM , pH 8,0)
mediante centrifugación a 4000 g durante 1 min. El sobrenadante se eliminó
cuidadosamente y luego la resina se incubó durante 1 hora a 10 °C con 80
l del extracto de células completas que contenía la proteína presa respectiva.
Para eliminar las proteínas no unidas, la resina se lavó cinco veces con 1
ml de tampón de lavado mediante centrifugación a 4000 g durante 1 min.
Finalmente, la resina se resuspendió con 20 l de tampón de carga SDS
que contenía 1,5% de ­mercaptoetanol y se hirvió durante 5 min a 99 °C.
Después de esto, las muestras se analizaron mediante transferencia
Western.
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HilE controla la dimerización y la unión al ADN de HilD
Alineación de secuencias y predicción de estructuras de HilE.
La secuencia de HilE y la de algunas proteínas Hcp se alinearon
utilizando el servidor Clustal Omega (73). La secuencia de HilE se envió
al servidor I­TASSER para el modelado estructural (53, 54) y se seleccionó
un modelo final con una puntuación C de 1,07, una puntuación TM de
0,86 y una desviación cuadrática media de 2,7 Å. Todos los gráficos
moleculares se realizaron en PyMOL versión 1.8 (PyMOL Molecular
Graphics System, versión 1.8).
análisis estadístico
Los datos de los ensayos CAT y ­gal se analizaron utilizando un
análisis de varianza unidireccional con la prueba de comparación múltiple
de Tukey. Se consideró significativo un valor de p de 0,05. Este análisis
estadístico se realizó utilizando el programa Prism 6 versión 6.01
(GraphPad Software, San Diego, CA).
Contribuciones de los autores: CCP­A. y análisis formal VHB; Investigación
CCP­A., GV­G., VRJ­G., ER­P. y VHB; PCC­A. visualización; PCC­A.
metodología; PCC­A. y borrador original escrito por VHB; CCP­A., GV­G.,
ER­P. y VHB redacción­revisión y edición; conceptualización de VHB;
supervisión de VHB; Adquisición de financiación de VHB.
Agradecimientos: Agradecemos a FJ Santana y M. Fernández­Mora por la
asistencia técnica, a I. Gómez­Gómez por su asesoramiento y asistencia en
los ensayos de purificación de proteínas, a D. Pérez­Morales por la
estandarización de los ensayos de estabilidad de proteínas y a G. Soberón­
Chavez. y I. Martínez­Flores por la lectura crítica del manuscrito.
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