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El estudio de bacterias, virus, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser
patógenos para el hombre y los animales comporta riesgos que varían según el agente infeccioso
y los procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un
nivel aceptable el riesgo derivado de la manipulación de material peligroso. Por otra parte, el
personal de Laboratorio de Microbiología está expuesto a riesgos no biológicos. El
equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología contribuyen a la seguridad sólo si las
personas que trabajan en él están motivadas, conocen las normas de seguridad y las aplican.
Los laboratorios de Microbiología se clasifican en niveles de contención (que van del 1
al 4) en función del tipo de microorganismos con que se trabaje. Los laboratorios de
Universidad suelen encontrarse en el nivel 1 o en el nivel 2. El nivel 1 corresponde a
laboratorios en los que se trabaja con microorganismos que no suelen causar enfermedades en el
hombre. En el nivel 2 se encuentran aquellos laboratorios en los que se trabaja con
microorganismos que pueden causar enfermedades al ser humano, pero con una baja
probabilidad de que se propague a la colectividad y para los que existe una profilaxis o
tratamiento eficaz.
El nivel 3 se corresponde con la manipulación de microorganismos que causan patología
grave, de tratamiento largo y difícil, que pueden causar secuelas. El nivel 4 se requiere cuando
se procesan agentes patógenos infectocontagiosos que producen alta mortalidad y para los que
no existe tratamiento o éste es poco fiable (virus Ebola, Lassa, Machupo).
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación
a la que es sometido. Por ello, es básico:
a) Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
b) Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.
c) Conocer el equipamiento del laboratorio.
d) Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
e) Conocer las leyes de seguridad biológica.
f) Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.
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Existen unas normas básicas que permiten que el trabajo en el laboratorio sea seguro y
eficaz.
El espacio de trabajo debe estar libre de objetos que puedan interferir, lo mismo que el
suelo. Deben evitarse los movimientos bruscos.
El suelo debe ser plano y el material que lo revista será antideslizante, silencioso, de
limpieza fácil y resistente al contacto con sustancias químicas.
La ventilación es especialmente importante cuando se utilizan mecheros de gas.
Es imprescindible el uso de bata de laboratorio y ésta no debe llevarse cuando se acceda
a áreas “limpias” . Debe llevarse el pelo recogido. Está terminantemente prohibido comer, beber
o fumar en el Laboratorio.
Las manos deben lavarse cuidadosamente antes de abandonar el laboratorio y en
cualquier otro momento en que sospechemos que hemos podido contaminarnos.
En caso de derramarse accidentalmente alguna muestra contaminada, debe desinfectarse
inmediatamente la zona en cuestión.
La mayoría de los accidentes relacionados con el laboratorio de Microbiología pueden
evitarse si se combinan un adecuado entrenamiento, una buena realización de las técnicas, un
estado de los aparatos apropiado y unas medidas de seguridad correctas.
El material contaminado puede seguir dos vías, según sea de un solo uso o reutilizable.
Normalmente los artículos de un solo uso se depositan en bolsas especiales de polipropileno,
que luego se esterilizan. El material de vidrio contaminado suele dejarse doce horas en
desinfectante, y posteriormente se esteriliza en autoclave, se lava y se seca. Las jeringas,
portaobjetos de cristal, agujas, etc., deben depositarse en contenedores específicos y no
directamente en las bolsas ya que éstas pueden romperse o alguna persona pincharse.
Nunca se pipetean reactivos peligrosos o cultivos líquidos con la boca. Se emplea una
perilla de goma, una propipeta o se coloca algodón en el cuello de la pipeta.
Las placas de Petri deben estar en todo momento boca abajo, excepto en aquellos casos
en que se indique expresamente lo contrario. Deben rotularse adecuadamente en la parte que
contiene el agar, mientras que los tubos deben rotularse en el cristal y no en la tapa. Para rotular
debe emplearse un rotulador que escriba en vidrio y plástico, que sea impermeable al agua y que
no se borre con facilidad. Generalmente para borrarlo se frota con alcohol.
El asa de siembra se flameará antes y después de usarla, asegurándose de que se pone al
rojo vivo. Los hisopos deben meterse de nuevo en su funda. Las agujas de inyección se
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depositan en recipientes especiales sin tocarlas con las manos.
☺MATERIAL DE LABORATORIO
1.- MICROSCOPIO:
El microscopio óptico permite observar objetos invisibles a simple vista, pero de tamaño
superior a 2 micras. Posee una fuente de iluminación con un condensador para regularla, y un
sistema de lentes para amplificar las imágenes, formado por el objetivo y los oculares. La
pletina es la superficie donde se coloca la preparación para ser observada.
Los microscopios poseen un revólver en el que se hallan dispuestos varios objetivos con
lentes de diferente capacidad de aumento que pueden intercambiarse.
Los aumentos obtenidos con el microscopio óptico son los siguientes:
Para observar a mil aumentos debe ponerse una gota de aceite de inmersión entre la
preparación y el objetivo para unificar la refringencia del sistema.
Para enfocar se dispone de un tornillo macrométrico y otro micrométrico, que permiten
adecuar la distancia entre el objetivo y la preparación. Hay que tener cuidado al descender el
objetivo para enfocar ya que puede golpearse la preparación y romperse tanto ésta como la
propia lente.
La intensidad de la luz debe ajustarse a las necesidades de la observación, controlando
tanto la emitida por la fuente como su regulación por la altura del condensador y el ajuste de su
diafragma.
Al acabar la observación después de retirar la preparación debe limpiarse con cuidado el
aceite de inmersión del objetivo y la platina.
2.- ESTUFA:
Se emplea en el laboratorio de bacteriología, para producir la temperatura adecuada para
el crecimiento de los microorganismos. Generalmente se utilizan en bacteriología clínica estufas
de 37 grados, que es la temperatura óptima para el crecimiento de la mayoría de las bacterias
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asociadas a mamíferos.
A veces se emplean otras temperaturas para hacer los medios selectivos, por ejemplo 42
grados para Salmonella.
3.- NEVERA:
Se emplea en muchos casos para conservar determinados medios y reactivos. También
para mantener las muestras hasta el momento de su siembra, impidiendo que aumente mucho el
número de bacterias.
c) Material de plástico:
Actualmente se utiliza mucho material de plástico en sustitución del material de vidrio
de uso general, pero no para medir. Es especialmente importante el uso de placas de Petri
desechables, así como de tubos de centrífuga.
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☺DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO
☺RECOGIDA DE MUESTRAS
1.- VOLANTE:
Toda muestra que llega al laboratorio debe ir acompañada de un volante en el que se
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especifique como mínimo la siguiente información:
*Tipo de muestra, técnica de recogida, orientación diagnóstica, tratamiento.
*Datos del animal: especie, raza, edad, sexo,..
*Datos del dueño: Nombre, dirección y teléfono.
*Fecha de recogida de la muestra y de realización del análisis.
El procesamiento de la muestra y el tipo de medios que se utilizan varían según el
producto patológico de que se trate y la "sospecha" que se tenga.
☺MEDIOS DE CULTIVO
Para el aislamiento primario de los microorganismos a partir de las muestras clínicas,
se siembran en medios de cultivo. Las condiciones de incubación (tiempo, temperatura y
atmósfera) dependen de cada microorganismo. La mayoría de las bacterias crecen en 24-48
horas, a 35º-37 ºC y en atmósfera aerobia. Cada bacteria depositada sobre la superficie de un
medio de cultivo sólido se multiplica y da lugar a una enorme acumulación de bacterias que
forman una colonia visible microscópicamente.
El tema de cultivos de los microorganismos se ha explicado con bastante profundidad en
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las clases teóricas. Sin embargo, conviene repasar los conceptos básicos.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO:
1) Por su consistencia:
a) líquidos: Nutrientes + sol. tampón. Ej. agua de peptona, tioglicolato
b) sólido: líquido + agar. Ej. Agar McConkey
2) Por su origen:
a) sintéticos: Químicamente definido. Ej. Agar McConkey
b) Semisintético: sintético + extracto orgánico (ej. extracto de levadura)
c) Naturales: Composición no siempre constante (ej. agar patata-zanahoria)
3) Por su composición:
a) Comunes: Microorganismos poco exigentes
b) Enriquecidos: Medios comunes a los que se añaden sustancias que actúan como
factores de crecimiento o neutralizan inhibidores. Para bacterias exigentes.
4) Otros medios:
a) Medio de enriquecimiento: Medio LIQUIDO que favorece el desarrollo de una
bacteria e inhibe el de otras. ej. Caldo de Selenito
b) Medio Selectivo: Medio SÓLIDO que inhibe el desarrollo de unas bacterias y
favorece el de otras.
* alterando el pH: Básico para Vibrio
* alterando la temperatura: ej. Yersinia, Listeria...
* Aumentando la Presión Osmótica: Staphylococcus (MSA)
* Adición de antisépticos: Agar McConkey (cristal violeta que inhibe las Gram
+)
* Adición de Antibióticos: Thayer-Martin VCN
c) Medios diferenciales: Las bacterias actúan sobre uno o mas de sus componentes
poniendo de manifiesto sus características. Únicos (Agar McConkey) o Combinados
(Kligler)
d) Medios especiales
e) Medios de transporte
f) Medios de conservación
EJEMPLO: Agar McConkey: sólido, sintético, común, selectivo, diferencial.
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☺PROCESA MIENTO DE LAS MUESTRAS
a) Orina:
Generalmente se hace en principio un examen físico de la orina (aspecto, color, olor,...)
y químico (pH, glucosa, nitritos, etc.). Luego se estudia el SEDIMENTO URINARIO, que nos
dará una indicación de lo que podemos obtener en el cultivo, y además nos proporcionará otros
datos (levaduras, cristales, bacterias, células, etc.). Se ponen de 10 a 15 mL. de orina en un tubo
de centrífuga de fondo cónico, se centrifuga a 1000 r.p.m. durante 5 ó 10 minutos. Se elimina el
sobrenadante, se colocan unas gotas entre porta y cubre y se observa al microscopio óptico.
La presencia de bacterias en el cultivo se valorará en función del número y el tipo.
Teóricamente, si todo el proceso se ha desarrollado correctamente, en una punción suprapúbica
cualquier número de bacterias es indicativo de infección. En el resto de los casos (sondaje y
recogida directa), la valoración dependerá del número de bacterias y del tipo, ya que puede
haber bacterias provenientes de la flora de arrastre de uretra y piel. En la mayoría de los casos
en que existe infección de orina, ésta se debe a un solo tipo de bacterias, y en un 10% de los
casos, a dos tipos. Si hay mas de dos tipos, existe una elevada probabilidad de que sea una
contaminación y conviene repetir el análisis. En cuanto al número, se considera que hay
infección cuando hay mas de 105 u.f.c./ml. de orina, siendo u.f.c.= unidades formadoras de
colonias. Si encontramos entre 104 y 105 u.f.c./ml. conviene repetir el análisis. Si hay menos de
103 u.f.c./ml. se considera contaminación.
Existen algunas excepciones a estas reglas. En general, se considera que puede haber
infección por levaduras o algunos gram positivos con cantidades inferiores a 105 u.f.c./ml.
Asimismo hay que considerar el estado general del animal. Por ejemplo en animales diabéticos,
tratados con inmunosupresores, etc. se valorará cualquier cantidad de bacterias que aparezca,
incluso si hay mas de dos tipos diferentes.
b) Heces:
En heces existe una flora habitual, por lo que normalmente se buscan microorganismos
patógenos. En este caso tenemos en cuenta exclusivamente presencia/ ausencia, sin considerar el
número de bacterias. Así, un elevado número de colonias de "flora habitual" no es indicativo de
infección, mientras que una sola colonia de una bacteria patógena (ej. Salmonella) si es
indicativo de infección.
Existe un gran número de bacterias que pueden ser patógenas en heces, por lo que es
importante la orientación diagnóstica del clínico.
En algunos casos existe la posibilidad de que las alteraciones se deban a
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DISBACTERIOSIS, es decir a desequilibrios de la flora habitual del intestino causados
generalmente por un excesivo consumo de antibióticos. Estos destruyen la mayor parte de la
flora normal, lo que permite la proliferación de otras bacterias muy resistentes o de levaduras
c) Sangre:
La sangre es un líquido estéril, por lo que teóricamente cualquier bacteria que aparezca
puede considerarse indicativa de infección si todo el procedimiento ha sido realizado en las
condiciones apropiadas.
d) Exudados:
Los microorganismos que se pueden encontrar varían según la zona del cuerpo y
también difieren en los diversos animales.
En los TUBOS, el medio puede ser sólido o líquido. El medio sólido puede estar en pico
de flauta, plano inclinado o recto.
a) Orina:
Se siembra generalmente en dos tipos de medios. Un medio rico (ej. CLED, agar
sangre,..) en el cual puedan crecer tanto Gram positivos como Gram negativos, o incluso
levaduras; y un medio selectivo, como el Agar McConkey, donde crecen las Gram negativas
(básicamente Enterobacterias y Pseudomonas) pero no las Gram positivas ni las levaduras. Se
intenta aislar Enterobacterias o Pseudomonas porque son los agentes causales de la mayoría de
las infecciones urinarias.
En el CLED, la orina la sembramos para recuento, ya que en este medio crecen todos los
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microorganismos. En el McConkey sembramos para aislamiento, ya que en este caso lo que
deseamos es separar los distintos tipos bacterianos para identificarlos y estudiar su sensibilidad.
Para hacer el recuento, se hace una regla de tres. Si conocemos el tamaño de la gota de
orina que pusimos y sabemos cuantas colonias han crecido, podremos deducir cuantas crecerían
a partir de un mililitro de muestra. Los bucles de las asas suelen ser de 1/100 o 1/500 ml.
Ambos medios son diferenciales. Permiten diferenciar las bacterias que fermentan la
lactosa (Lac +) de las que no la fermentan (Lac -). En el CLED, las Lac+ son amarillas y las
negativas de su color. En McConkey las Lac+ son de color rojo o rosado y las negativas son
transparentes o de su color, si producen pigmentos.
b) Heces:
Las heces presentan una flora habitual, por lo que deben sembrarse en medios que
faciliten la detección de microorganismos patógenos. Existe un protocolo básico con el que se
intenta detectar los microorganismos patógenos mas frecuentes. Siempre se intenta tener en
cuenta la orientación diagnóstica a fin de añadir otros medios especiales para determinadas
bacterias.
Normalmente utilizamos 5 medios sólidos y 1 medio líquido.
El medio líquido es un medio de enriquecimiento, el CALDO DE SELENITO, que favorece el
crecimiento de Salmonella. Se incuba a 370C durante 24 horas y posteriormente se resiembra en
un medio sólido, generalmente Agar SS, para poder observar las colonias.
Los medios sólidos tienen distintos grados de selectividad y son:
* Agar McConkey. Es un medio poco selectivo. Permite el crecimiento de las bacterias
Gram negativas. Se emplea básicamente para estudiar el equilibrio de la flora intestinal. Nos
permite diferenciar las bacterias Lac+ (colonias rojas) de las Lac-.
* Agar Salmonella - Shigella (SS): Es un medio moderadamente selectivo para
Salmonella y Shigella. Shigella tiene escaso interés veterinario, aunque tiene importancia en
Microbiología de alimentos. En agar SS, las colonias lac + son de color rojo o rosado, mientras
que las lac- son de su color. Salmonella es una bacteria lactosa negativa; las colonias
SOSPECHOSAS de Salmonella serán transparentes y presentan en muchos casos un punto
negro. Esto se debe a la producción de SH2 que interacciona con las sales de hierro que hay en
el medio de cultivo y precipita.
* Agar Verde Brillante (BG): Es un medio altamente selectivo para Salmonella. En agar
verde brillante, las colonias Lac + son de diversos colores (amarillo, verdoso, etc.), mientras que
las Lac- son de color rojo. Por tanto, se consideran SOSPECHOSAS de ser Salmonella
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aquellas colonias que tengan una coloración rojiza.
* Agar con sal y manitol (MSA). Es un medio con una elevada concentración salina, lo
que lo hace selectivo para Staphylococcus. La fermentación del manitol permite diferenciar las
colonias SOSPECHOSAS de Staphylococcus aureus, ya que son de color amarillo cremoso.
* Agar Sabouraud: Es un medio diseñado para favorecer el desarrollo de levaduras,
aunque también pueden crecer otros microorganismos. Las levaduras crecen lentamente, por lo
que las colonias se observan mejor tras 48 horas de incubación. Las colonias sospechosas son de
color blanco y aspecto nacarado. El cultivo huele a pan.
El CALDO DE SELENITO se siembra con el asa de bucle. Como siempre, se flamea el
asa, se deja enfriar y se toma una gota de la muestra de heces. Se destapa el tubo y se inclina
ligeramente. Se apoya el bucle del asa en el interior del tubo y se deposita la gota. Se flamea la
boca del tubo antes y después de realizar este proceso. Se flamea el asa. Se tapa el tubo y se
mueve suavemente para mezclar el inóculo con el medio.
Todos los medios de cultivo sólidos usados para el cultivo de heces se siembran por
aislamiento, ya que nos interesa detectar los diferentes tipos de bacterias que aparecen, sin que
influya su número.
En todos los casos, el aspecto de las colonias nos da una identificación PRESUNTIVA,
sin que podamos afirmar que se trata de una bacteria concreta. En condiciones normales solo
identificaremos los "presuntos" patógenos.
En los casos en que la orientación diagnóstica lo aconseje, incorporaremos otros medios
selectivos y otros protocolos. Por ejemplo, agua de peptona tamponada para Vibrio, o
incubación a 40C durante una semana para Yersinia.
La incubación suele realizarse durante 24 horas a 37 0C, aunque las levaduras suelen
dejarse 48 horas. Algunas veces se incuba a 42ºC para seleccionar.
c) Heridas, pus:
Normalmente las sembramos en Cled y McConkey. Se siembran por aislamiento ya que
lo que importa es el tipo de bacterias que aparecen. A veces se añade Agar Chocolate si se
sospecha la existencia de bacterias exigentes. En caso de sospecharse la presencia de anaerobios,
debe evitarse el contacto del aire con la muestra, sembrándose a continuación en Agar Sangre
con amikacina y procesándose en anaerobiosis como explicaremos posteriormente.
d) Sangre:
Normalmente se toman tres muestras el mismo día, con un intervalo de varias horas.
Cada una de las muestras se siembra en un medio de cultivo para aerobios, otro para anaerobios
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y un tercero con un medio de cultivo para Brucella (ej. medio de Castañeda). Los dos primeros
se incuban alrededor de 7 a 10 días a 370C, haciendo pases a agar sangre y agar chocolate. El
medio de Castañeda se incuba durante un mes aproximadamente, haciendo resiembras cada
semana.
* ANAEROBIOS:
El estudio de las bacterias anaerobias se efectúa según la secuencia clásica: examen
directo (ej. Gram), cultivo e identificación y antibiograma. Pero todo el proceso debe efectuarse
en ausencia de oxígeno, desde la recogida de la muestra hasta los cultivos y antibiogramas.
Las muestras no deben tomarse con hisopo sino con jeringa y evitando inmediatamente
la entrada de aire. Es importante evitar la contaminación de la muestra por la flora de las
superficies mucosas adyacentes, ya que éstas tienen su propia flora anaerobia normal.
El examen directo del material, teñido por el método de Gram, posee un gran valor para
orientar el diagnóstico de las infecciones por anaerobios. La morfología de las bacterias
anaerobias es en muchos casos bastante típica.
Los medios de cultivo deben sembrarse de inmediato, efectuando las manipulaciones
preferentemente en una campana con atmósfera anaerobia. Como medio selectivo puede usarse
agar sangre con amikacina. La amikacina, como otros aminoglicósidos, inhibe gran parte de la
flora aerobia, lo que favorece el crecimiento de los anaerobios.
La incubación en anaerobiosis se efectúa colocando las placas de Petri en jarras para el
cultivo de anaerobios. Se puede eliminar el oxígeno extrayendo el aire y reemplazándolo por
otro gas. También puede obtenerse la anaerobiosis por métodos químicos, mediante sobres
comercializados que contienen un reactivo que al añadirle agua genera hidrógeno, que en
presencia de un catalizador reacciona con el oxígeno produciendo agua y eliminando por tanto
el oxígeno libre.
La identificación de anaerobios se realiza en muchos casos de forma presuntiva, por su
morfología colonial, aspecto en la tinción de Gram, sensibilidad a antibióticos etc. Una
identificación mas precisa puede realizarse mediante cromatografía de gases de los productos de
su metabolismo.
☺IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
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Al observar el aspecto de las colonias bacterianas crecidas en los medios de cultivo
sólido, podemos darnos cuenta de las diferencias en tamaño, forma, textura, bordes, etc.
Además podemos obtener información a partir de tinciones, de su crecimiento o no en
determinados medios, o de las propiedades que muestran en los medios diferenciales (ej.
Hemólisis en agar sangre). Para identificar el género y la especie a la que pertenece una
determinada bacteria, hay que realizar diversas pruebas metabólicas, pero siempre teniendo en
cuenta el tipo de bacteria con el que estamos trabajando (cocos Gram positivos o Gram
negativos, bacilos Gram positivos o Gram negativos, Corinebacterias, etc.). Cada prueba tendrá
sentido dentro de su esquema. Nos vamos a centrar en los dos grupos más frecuentes en
patología clínica veterinaria: Bacilos Gram negativos (concretamente Enterobacterias y Bacilos
No fermentadores) y Cocos Gram positivos.
Agar Hierro de Kligler: En este medio, de color rojo, tenemos una cantidad limitante de
glucosa y una cantidad 10 veces superior de lactosa. Además hay tiosulfato, peptonas y rojo
fenol (indicador de pH). Podemos observar diferentes pruebas bioquímicas: fermentación de
glucosa, fermentación de lactosa, producción de SH2 y producción de gas. El medio tiene una
parte recta y una zona en plano inclinado. Se siembra el fondo por picadura y luego se hacen
estrías en el plano inclinado. Se incuba a 37ºC durante 18-24 h (nunca se leen las reacciones
antes) y se leen los resultados de las pruebas. Pueden darse múltiples combinaciones de
resultados de las diferentes pruebas.
a) Fermentación de azúcares: Como hemos dicho hay una concentración de glucosa
limitante y diez veces inferior a la de lactosa. Las bacterias pueden utilizar los azúcares
por vía oxidativa (aceptor final de electrones es el oxígeno) y/o fermentativa (no
requiere oxígeno). Los productos finales de la oxidación son ácidos menos estables que
los de la fermentación. Pueden darse diversas situaciones en función de las capacidades
metabólicas del microorganismo en estudio.
1) Inicialmente la utilización de la glucosa se lleva a cabo de forma aerobia en la
zona de plano inclinado. Los productos finales serán ácidos que causan un
cambio del indicador de pH de color rojo a amarillo. Por lo tanto, a las 6 horas
aproximadamente, se ha acabado la glucosa y la zona del plano inclinado está de
color amarillo. ¿qué habrá pasado en el fondo del tubo, donde no hay
Citrato: En este medio, de color verde, tenemos citrato sódico como única fuente de carbono
y sales de amonio como fuente de nitrógeno. El indicador de pH es el azul de bromotimol, que a
pH alcalino vira de verde (neutro) a azul. Sembramos por todo el plano inclinado e incubamos
24 h a 37ºC. Los microorganismos capaces de crecer utilizando el citrato como única fuente de
carbono, utilizarán las sales de amonio como fuente de nitrógeno, provocando una
alcalinización del medio. Por tanto, si el color del medio cambia de verde a azul, la reacción
será positiva, lo que significa que el microorganismo es capaz de crecer utilizando el citrato
como única fuente de carbono.
Fenilalanina desaminasa: En este medio, de color amarillo pálido, analizamos la capacidad
de la bacteria para desaminar la fenilalanina. Es decir, queremos saber si la bacteria posee el
enzima fenilalanina desaminasa. Sembramos el tubo por todo el plano inclinado e incubamos 24
h a 37ºC. El producto de la desaminación de la fenilalanina es el ácido fenilpirúvico, que es
incoloro. Añadimos un reactivo, el cloruro férrico, que produce un cambio de color,
observándose color verde si la reacción es positiva, es decir, si la bacteria posee fenilalanina
desaminasa.
Voges-Proskauer: El medio de Clark-Lubs es un caldo que contiene glucosa y permite
estudiar la vía metabólica por la que es atacado este azúcar. Algunas bacterias utilizan la
fermentación butilénglicólica ( también llamada butanodiólica) y producen butilénglicol, que
posteriormente se transforma en acetil-metil-carbinol (acetoína). Inoculamos los tubos y los
incubamos 24 horas a 37ºC. Para detectar la acetoína producida utilizamos la reacción de
Voges-Proskauer. Añadimos los reactivos, que en este caso son KOH y α-naftol. A los 20
minutos, si la reacción es positiva, se forma un anillo de color rojo intenso., lo que significa que
la bacteria lleva a cabo la fermentación butilén-glicólica. Si no se forma este anillo, la reacción
se considera negativa.
Una vez realizadas y leídas las pruebas, buscamos la identificación en la tabla 1. Con las
pruebas que realizaremos en las prácticas de laboratorio, no podemos llegar a identificar géneros
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o especies; nos quedaremos a nivel de grupo. Recordar como ya hemos explicado, que siempre
hay que tener en cuenta las características iniciales de las que partimos (morfología, tinción de
gram, crecimiento en los diferentes medios de cultivo...). Si aplicamos estas pruebas a
microorganismos que no pertenezcan a los grupos descritos (Enterobacterias o Pseudomonas)
los resultados no serán coherentes.
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Tabla 1: Identificación bioquímica de Enterobacterias y Bacilos no fermentadores.
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mas oxígeno libre. Para la realización de esta prueba colocamos en un portaobjetos una gota de
una suspensión de la colonia que queremos probar. Añadimos una gota de agua oxigenada al
3%. Si la bacteria posee el enzima catalasa, desdoblará el agua oxigenada y se liberará oxígeno,
que se observa en forma de burbujas. Si no posee el enzima, no se formarán burbujas. Cocos
Gram positivos catalasa positivos en una muestra clínica, podemos considerar que pertenecen al
género Staphylococcus; si son catalasa negativos, pueden ser Streptococcus o Enterococcus.
► Antibiograma:
El medio de cultivo de elección para llevar a cabo el antibiograma es el Agar Mueller-
Hinton. En algunos casos especiales pueden utilizarse otros medios, si la bacteria en estudio no
es capaz de crecer en Agar Mueller-Hinton.
El primer paso para realizar la técnica es preparar una suspensión de la bacteria en
solución salina estéril. Esta suspensión debe tener una turbidez concreta (igual a un patrón
determinado) para evitar resultados erróneos. A continuación, con un hisopo extendemos la
suspensión bacteriana por toda la superficie de la placa de Agar Mueller-Hinton, haciendo lo
que se llama una siembra en césped. El siguiente paso es añadir los antibióticos, que se
encuentran impregnados en discos de papel de filtro. Incubamos las placas en estufa 24 horas a
37ºC y a continuación leemos los resultados. El antibiótico habrá difundido desde los bordes del
disco, y la concentración de antibiótico irá siendo menos a medida que nos alejamos del disco.
Se formará un halo de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco. El
diámetro del halo depende de diversos factores, incluyendo la capacidad de difusión del
antibiótico y la sensibilidad del microorganismo.
Para saber si un microorganismo es sensible a un antibiótico debemos medir el diámetro
(en milímetros) del halo formado alrededor del disco de antibiótico y comparar el resultado con
una Tabla. Se consideran tres categorías: Sensible, moderadamente sensible y resistente. Si no
se forma halo de inhibición del crecimiento, la bacteria es resistente al antibiótico. Si se forma
halo, hay que medirlo y en función del diámetro del halo, del antibiótico y del microorganismo
que estemos estudiando veremos en la Tabla si la bacteria es sensible, moderadamente sensible
o resistente a dicho antibiótico.
☺VALORACIÓN DE DESINFECTANTES:
El test en uso, cuyo prototipo es el de Kelsey-Maurer, intenta la comprobación de la
eficacia del desinfectante en las condiciones reales de uso (por ejemplo, la solución de
desinfectante en la que ponemos el instrumental en el quirófano). Comprueba si hay o no
crecimiento de colonias tras la siembra en placas de agar nutritivo (por ejemplo Agar Brain-
Heart) de una dilución 1/10 del producto en cuestión. Se toman dos placas de agar nutritivo y
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se colocan 10 gotas de la dilución del desinfectante en cada placa. Se incuba una placa a
temperatura ambiente durante 7 días y la otra a 37ºC durante 72 horas. Si al final hay
crecimiento bacteriano en 5 o mas de las gotas, se considera que el desinfectante no funciona
adecuadamente.
Agar Brain-
Heart
Incubar a Incubar
temperatura a 37ºC
ambiente 7 72 horas
días
Si hay crecimiento en 5
gotas o menos, el
desinfectante funciona
adecuadamente.
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☺DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRECTO. Pruebas serológicas.
Como ya habíamos dicho, podemos considerar dos tipos de diagnóstico microbiológico:
1) Directo, basado en la puesta de manifiesto de la presencia del microorganismo
(tinción y cultivo), que es lo que hemos explicado hasta ahora.
2) Indirecto, demostrar la "huella" que el microorganismo deja en el enfermo. Ej.
Técnicas inmunológicas o genéticas.
Existen numerosas pruebas que pueden utilizarse para demostrar la “huella” que el
microorganismo deja en el enfermo: aglutinación, ELISA, RIA, inmunofluorescencia, PCR,
etc.
* Técnicas inmunológicas:
Algunas pruebas serológicas permiten el diagnóstico de enfermedades infecciosas
mediante la detección de los anticuerpos frente a los antígenos de los microorganismos
infectantes. Para su realización es necesario tomar una muestra de sangre del paciente, para
obtener de ella el suero. Se extraen 5 o 10 mL de sangre y se pone en un tubo en el que se
separa el suero por centrifugación suave. Algunas técnicas no permiten diferenciar la clase de
inmunoglobulina que produce la reacción, mientras que otras permiten la diferenciación entre
IgM e IgG, con lo que podremos saber si la infección es reciente o se trata de una enfermedad
pasada.
En las prácticas de laboratorio vamos a realizar una prueba de aglutinación para la
detección de anticuerpos frente a bacterias del género Brucella.
►Técnica de Aglutinación para Brucella (Brucelloslide-Test®):
La brucelosis humana es una antropozoonosis ampliamente distribuida causada por
bacterias del género Brucella. El hombre es un huésped accidental; Brucella puede causar
infecciones en numerosas especies animales, tanto domésticos como salvajes.
El test que vamos a usar detecta anticuerpos específicos (aglutininas) frente a Brucella
melitensis, abortus ovis y suis en el suero. Para poder detectarlos, ponemos en un portaobjetos
una gota del reactivo consistente en una suspensión concentrada de Brucella inactivada por
calor y fenol y coloreada con Rosa de Bengala. Añadimos una gota del suero problema y
mezclamos suavemente. La aparición de grumos evidentes indica una reacción positiva. La
lectura de resultados debe realizarse antes de 4 minutos, ya que luego pueden aparecer falsos
positivos. También pueden aparecer falsos positivos por reacciones cruzadas en pacientes
vacunados de cólera o infectados con Yersinia o Francisella tularensis. Siempre hay que utilizar
un suero control positivo para garantizar los resultados.
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Para cuantificar las aglutininas hacemos la aglutinación con distintas diluciones del
suero. Cuanto mas grande es la dilución a la que sigue habiendo aglutinación, mayor cantidad de
anticuerpos debe haber en el suero.
Esta prueba permite detectar y cuantificar anticuerpos, pero no diferenciar la clase de
inmunoglobulina que produce la reacción, por lo que no podemos saber si se trata de una
infección activa (IgM) o ya pasada (IgG). Para poder diferenciarlo, usando esta técnica,
necesitamos dos muestras del suero del paciente para poder ver las variaciones en los títulos de
anticuerpos (seroconversión). Tomamos una muestra en una fecha dada y la comparamos con
otra que tomamos dos o tres semanas después. Se considerará que existe enfermedad actual
cuando el título (cantidad) de anticuerpos de la segunda muestra se incrementa como mínimo en
4 veces con respecto a la primera. Si el título de anticuerpos es el mismo en las dos muestras de
suero, se considerará que se trata de una infección ya pasada. Las dos muestras de suero deben
procesarse conjuntamente para evitar diferencias metodológicas.
En la actualidad existen diversas técnicas que permiten conocer la cantidad de
anticuerpos y su clase (IgM, IgG). Esto permite un diagnóstico mas rápido.
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