José Antonio Giráldez Ortiz, Bioquímica I

Práctica 2: Determinación cuantitativa de proteínas

Objetivos
Elaborar una recta de calibrado en función de la concentración (conocida) de distintas
disoluciones y su respectiva absorbancia (medida en laboratorio).

Determinar la concentración de las disoluciones problema X e Y mediante las expresiones

matemática y gráfica de la recta de calibrado.

Fundamento teórico
A la hora de determinar cuantitativamente proteínas, encontramos dos tipos de métodos:
los turbidimétricos (relacionados con la turbidez) y los espectrofotométricos,
fundamentados en la variación de la absorbancia en función de la concentración de cierto
analito (según la ley de Lambert-Beer).

El azul de Coomassie es un colorante que puede unirse a aminoácidos aromáticos y básicos

rápidamente. Puede presentarse de color marrón (no se ha producido la unión) o azul (sí se
ha producido), pues varía la absorbancia máxima de 464 a 595 nm.

Emplearemos el método de Bradford (espectrofotométrico). Se utiliza el reactivo de

Bradford, preparado a partir de azul de Coomassie, y el método se basa en el fenómeno
descrito anteriormente.

La ley de Lambert-Beer permite relacionar la absorbancia de una disolución de analito con

su concentración. Podemos expresarla como: 𝐴 = 𝜀 𝑑 𝐶, donde A es la absorbancia de la
disolución (adimensional), 𝜀 es el coeficiente de extinción molar, d es la longitud de paso de
la cubeta y C es la concentración de la disolución.

Como no conocemos el coeficiente de extinción molar, elaboramos una recta de calibrado

tal que 𝑦 = 𝑚𝑥 mediante ajuste por el método de mínimos cuadrados, con la concentración
como variable independiente y la absorbancia como variable dependiente.

Obtendremos así las concentraciones de las disoluciones problema por interpolación en la

gráfica. Esto es, una calibración mediante patrón externo.

Procedimiento
En primer lugar, preparamos las disoluciones patrón de BSA (seroalbúmina bovina)
requeridas por el patrón externo. Pipeteamos 500 μL de agua destilada en 4 tubos de
ensayo iniciales (1-i, 2-i, 3-i y 4-i). Posteriormente, pipeteamos 500 μL de una disolución
inicial de BSA 0,8 mg/mL (5-i) en el tubo 4-i, y homogeneizamos con el vórtex, obteniendo
una disolución 0,4 mg/mL.

A continuación, pipeteamos 500 μL de la disolución 4-i en la 3-i, homogeneizamos con el

vórtex y obtenemos una disolución 0,2 mg/mL. Procedemos análogamente para el resto de
tubos (de 3-i a 2-i, de 2-i a 1-i), resultando en una serie disoluciones de concentración de
BSA creciente:

Disolución Concentración de BSA (mg/mL)

1-i 0,05
2-i 0,1
3-i 0,2
4-i 0,4
5-i 0,8

Una vez preparadas las disoluciones patrón, procedemos sistemáticamente de la siguiente

manera para cada disolución (1-i, 2-i, 3-i, 4-i, 5-i y disoluciones problema X e Y): pipeteamos
100 μL de disolución n-i (o X/Y si procede) en dos tubos de ensayo distintos n y n’.

Además, preparamos un tubo de ensayo con 100 μL de agua destilada (0). En la tabla del
apartado ‘resultados’ apreciamos los tubos resultantes.

Vertemos 3 mL de reactivo de Bradford en cada uno de los 15 tubos de ensayo y los dejamos
reposar unos minutos, de forma que se produzca la unión entre el azul de Coomassie y los
aminoácidos básicos o aromáticos de las proteínas en disolución.

Finalmente, medimos la absorbancia a 595 nm de cada una de las soluciones en el

espectrofotómetro, siempre de menor a mayor concentración. La primera a introducir en el
espectrofotómetro será la del tubo 0, cuya concentración de BSA es 0 mg/mL, y pulsamos
el botón ‘auto cero’. Es el conocido ‘blanco’; forzamos que la recta de calibrado pase por el
punto 0.

Resultados
La siguiente tabla recoge la distribución de las disoluciones patrón en los distintos tubos
de ensayo, así como la concentración y absorbancia correspondientes.

Disolución patrón [BSA] (mg/mL) Tubo rotulado Absorbancia medida

0 0 0 0
1 0,032
1-i 0,05
1' *
 2 0,103
2-i 0,1
2' 0,11
3 0,251
3-i 0,2
3' 0,254
4 0,547
4-i 0,4
4' 0,536
5 0,956
5-i 0,8
5' 1
X 0,036
X ** ?
X' 0,028
Y 0,131
Y ** ?
Y' 0,156

*La lectura espectrofotométrica era de -0.02. Desestimamos este valor, pues se trata de un outlier.
**En el cálculo de las concentraciones de X e Y, utilizaremos la media aritmética de los valores obtenidos para
cada una. X: 0.032; Y: 0.1435.

Análisis y conclusiones
Presentamos la recta de calibrado construida mediante ajuste por el método de mínimos
cuadrados con los valores de concentración y absorbancia anteriores, desestimando el
outlier (en la gráfica aparecen otros elementos que comentaremos a continuación):

Recta de calibrado y = 1,2512x

R² = 0,9942
1,2

0,8
Absorbancia

0,6 Disolución problema X

0,4

0,2 Disolución problema Y

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Concentración (mg/mL)
El coeficiente de determinación, R2, es muy cercano a 1, hecho que denota la calidad de la
recta en relación con la obtención de nuevos puntos. En este caso (ajuste lineal), R2 es el
cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson, R. La pendiente es 𝑚 = 1.2512.

Inicialmente, la ecuación de la recta era 𝑦 = 1,2512𝑥 − 0,027. Ajustamos la recta, de forma

que pase por el origen de coordenadas.

Así pues, la ecuación de la recta es 𝑦 = 1,2512𝑥. Sustituyendo y despejando según lo

expuesto en el fundamento teórico, determinamos matemáticamente la concentración de
ambas disoluciones problema:
𝑦 𝐴𝑏𝑠
𝑦 = 1,2512𝑥 → 𝑥 = →𝐶=
1,2512 1,2512
𝐴𝑏𝑠𝑥 0.032 𝒎𝒈
𝐶𝑥 = = → 𝑪𝒙 = 𝟎, 𝟎𝟐𝟓𝟔
1,2512 1,2512 𝒎𝑳
𝐴𝑏𝑠𝑦 0.1435 𝒎𝒈
𝐶𝑦 = = → 𝑪𝒚 = 𝟎, 𝟏𝟏𝟒𝟕
1,2512 1,2512 𝒎𝑳