Universidad de Córdoba: Tesis Doctoral

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
Programa de Doctorado en Biomedicina
TESIS DOCTORAL
Sistemas de detección ultrasensible de moléculas

de distinta naturaleza para la detección temprana
del cáncer
Ultrasensitivity detection system of different nature

molecules to early cancer detection
Memoria presentada por
Tania García Maceira
Los directores,
Dr. José Antonio González Reyes Dra: Fé Isabel García Maceira
Córdoba 2022
TITULO: SISTEMAS DE DETECCIÓN ULTRASENSIBLE DE MOLÉCULAS DE
DISTINTA NATURALEZA PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA DEL
CÁNCER
AUTOR: Tania García Maceira
© Edita: UCOPress. 2022

Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396 A
14071 Córdoba
https://www.uco.es/ucopress/index.php/es/
ucopress@uco.es
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
Don José Antonio González Reyes, Doctor en Ciencias y Catedrático de la Universidad del Área
de Biología Celular del Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología de la
Universidad de Córdoba y Dra. Fé Isabel García Maceira, Doctora en Genética y directora de
I+D de la empresa Canvax Biotech
INFORMAN
Que Dª Tania García Maceira, Licenciada en Microbiología, ha realizado bajo su dirección el

trabajo titulado “Sistemas de detección ultrasensible de moléculas de distinta naturaleza
para la detección temprana del cáncer”, y que a su juicio reúne los méritos suficientes para
optar al Grado de Doctora en Biomedicina
Y para que conste, firmo la presente en Córdoba, a 20 de febrero de 2022.
Fdo.: Dr. José Antonio González Reyes Fdo.: Dra. Fé Isabel García Maceira
TÍTULO DE LA TESIS: Sistemas de detección ultrasensible de moléculas de distinta
naturaleza para la detección temprana del cáncer
DOCTORANDO/A: TANIA GARCÍA MACEIRA
INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS

(se hará mención a la evolución y desarrollo de la tesis, así como a trabajos y publicaciones derivados de la misma).
Los inmunoensayos para la detección de biomarcadores continúan siendo hoy en día

los ensayos más utilizados en la clínica, tanto para la detección como para la
monitorización de enfermedades. El trabajo de tesis de la doctoranda ha estado
enfocado hacia el desarrollo de sistemas ultrasensibles de medición de moléculas de
diversa naturaleza asociadas a procesos tumorales. Se ha planteado como objetivo
general del proyecto desarrollar una metodología para la obtención de un ELISA más
sensible y multiplex que permita reducir el impacto de la baja afinidad de un anticuerpo
por su analito específico y, además, sea capaz de detectar simultáneamente analitos
de distinta naturaleza.
La Memoria de tesis está bien estructurada, presentándose en distintos capítulos los

distintos enfoques planteados para la consecución del objetivo central del trabajo. Para
ello, la introducción que les precede expone de manera clara la compleja temática de
los inmunoensayos y es exhaustiva en lo relativo a la inmovilización de anticuerpos a
las superficies soporte. Cada capítulo incluye su propia discusión de los resultados lo
que permite un mayor análisis de estos dentro del contexto científico actual.
El trabajo realizado ha exigido de la ejecución de un amplio abanico de técnicas que

incluyen metodologías de biología molecular, de expresión y purificación de proteínas,
así como de procedimientos químicos de modificación de superficies y de
derivatización de moléculas.
Como resultados del trabajo fueron desarrolladas dos estrategias de inmovilización de
anticuerpos a un sustrato sólido: una que involucra la reacción de alta eficiencia y
especificidad entre la tetracina y el trans-cicloocteno con el fin de aumentar la
densidad del anticuerpo en la superficie; y otra, la afinidad del dominio de unión a
quitina por su sustrato, como método para lograr la correcta orientación del anticuerpo
inmovilizado. En ambos casos se logra un aumento significativo de la sensibilidad del
ensayo a través del anclaje covalente y orientado de los anticuerpos a la superficie.
También con resultados muy interesantes, se obtiene un sistema multiplex que permite
la medición paralela de dos analitos de distinta naturaleza: una proteína (el antígeno
carcinoembrionario) y un ácido nucleico, el miRNA-29b.
Parte de los resultados obtenidos han sido publicados en dos artículos: uno en la
revista Biosensors (2021) (https://doi.org/10.3390/bios11120524) (Q1, JCR 2021) y el
otro en la revista BMC Biotechnology (2020) (https://doi.org/10.1186/s12896-020-
00640-z) (Q3, JCR 2020). En ambos casos el doctorando fue primer autor. Estas
publicaciones avalan la originalidad, la calidad de los resultados y ofrece una nueva
perspectiva para el desarrollo de ELISAs más sensibles, incluso cuando se dispone de
anticuerpos de baja afinidad.
Durante el desarrollo de la presente tesis doctoral, la doctoranda Tania García Maceira

ha superado satisfactoriamente los objetivos formativos y de investigación exigidos. De
tal modo y por todo lo anteriormente expuesto, consideramos que la Tesis presentada
por Dña. Tania García Maceira cumple los requisitos necesarios para optar al Grado
de Doctor, por lo que se autoriza su presentación.
Córdoba, 8 de febrero de 2022-02-06
Firma de los directores

Firmado
GONZALEZ digitalmente por Firmado por GARCIA MACEIRA FE
ISABEL - 46071710L el día
REYES JOSE GONZALEZ REYES 11/02/2022 con un certificado
emitido por AC FNMT Usuarios
JOSE ANTONIO -
ANTONIO - 30419898Y
30419898Y Fecha: 2022.02.13
13:11:05 +01'00'
Fdo. José Antonio González Reyes Fdo. Fé Isabel García Maceira
“Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow.
The important thing is not to stop questioning.”
Albert Einstein
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, querría agradecer a mi tutor de tesis, el Dr José Antonio González Reyes, por
el esfuerzo y el tiempo que me ha dedicado. He tenido la suerte de contar en dos ocasiones
con este excelente profesor, como tutor de Máster y como tutor de Doctorado, y en ambas ha
sido un gran apoyo para llegar a cumplir mis objetivos. Muchas gracias.
Mi más profundo agradecimiento a mi directora de tesis, la Dra Fé Isabel García Maceira, y al

director de Canvax Biotech, Elier Paz Rojas, por ser mis guías profesionales desde mis primeros
estudios universitarios. Han sido siempre mi ejemplo, mi voluntad, han dirigido mi
desarrollado como científica y por supuesto, me han llevado hasta la culminación de este
trabajo doctoral. Además, de pertenecer ambos a mi vida personal donde siempre han sido un
espacio de confianza.
Me gustaría agradecer a todos los compañeros de Canvax Biotech que de alguna manera han
contribuido al desarrollo de esta tesis: María del Valle, María José Piedras, Ana Quesada,
Vanesa Ramírez, Verónica Luna, Aurora Márquez. Y en especial, a quienes han estado
directamente involucrados directamente en el desarrollo técnico de esta tesis: Ana Belén
Aragón y Rafel Almagro. Finalmente, a Sara Gómez por instarme a continuar hacia adelante a
pesar de los obstáculos.
Agadecer en especial a toda mi familia, mis padres y hermanas, quienes son mi compañía en
los buenos y malos momentos, siempre tienen palabras positivas de aliento y optimismo.
Agradezco a mi esposo Luis, mi sustento emocional, y a mi hijo Enzo, mi mayor alegría.
Muchas gracias a todos.

Abreviaturas y acrónimos empleados en esta Memoria
APTES: 3-(aminopropil)-trietoxisilano
BSA: Albúmina de suero bovino
ChBD: Dominio de unión a quitina
(Chitin binding domain)
DBCO: Dibenzo-ciclooctino
DTT: Ditiotreitol
EC50: Concentración media máxima efectiva
EDTA: Ácido etilenodiaminatetraacético
ELISA: Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas
(Enzyme linked immunosorbent assay)
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
GST: Glutation S-transferasa
HRP: Peroxidasa de rábano
IgG: Inmunoglobulina G
IL6h: Interleuquina 6 humana
IL8h: Interleuquina 8 humana
IPTG: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
Kd: Constante de disociación
LOD: Límite de detección
LOQ: Límite de cuantificación
miRNA: micro ácido ribonucleico
MW: Peso molecular promedio en peso
NHS: N-hidroxisuccinimida
PBS: Tampón fosfato salino
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
TAMRA: Tetrametil-rodamina
TCO: Trans-cicloocteno
TMB: 3,3 ', 5,5′-tetrametilbencidina
VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana
En esta memoria se empleó el anglicismo anti mouse, usado ampliamente en Inmunología.

Índice
INDICE
RESUMEN 1
ABSTRACT 3
I. INTRODUCCIÓN 5
1.1. Sistemas de detección de moléculas para el diagnóstico temprano del cáncer 5
1.2. Inmunoensayos 7
1.2.1. ELISA 8
1.2.2. AlphaLISA 12
1.2.3. Ensayos multiplex 13
1.3. Anticuerpos 16
1.3.1. Estructura de los anticuerpos 17
1.4. Estrategias de inmovilización de un anticuerpo a una superficie 19
1.4.1. Modificación de las superficies 21
1.4.1.1. Tratamiento con gases ionizados 22
1.4.1.2. Monocapas auto ensambladas 22
1.4.1.3. Química en mojado 23
1.4.2. Inmovilización covalente de los anticuerpos 25
1.4.2.1. Uniones a la superficie utilizando los grupos NH2 y COOH de los anticuerpos 27
1.4.2.2. Uniones covalentes a través de los grupos SH creando enlaces tipos tiol 30
1.4.2.3. Uniones covalentes a través de los grupos carbohidratos 31
1.4.2.4. Uniones de los anticuerpos a través del sitio de unión a nucleótidos 32
1.4.2.5. Uniones de los anticuerpos utilizando reacciones de química clic 32
1.4.3. Inmovilización de los anticuerpos a las superficies por afinidad o inmovilización sitio 35
específica
1.4.3.1. Inmovilización de los anticuerpos a través de la unión avidina-biotina 36
1.4.3.2. Inmovilización de anticuerpos a través de péptidos de unión específica a 36
materiales
1.4.3.3. Inmovilización de los anticuerpos a las superficies recubiertas con proteína A, 38
proteína G y proteína L
1.4.3.4. Inmovilización de los anticuerpos a través de la unión entre sustratos y 39
enzimas
1.5. Detección de ácidos nucleicos mediante reacciones inmunoenzimáticas 40
1.5.1. Ensayos inmunoenzimáticos para la cuantificación de productos de PCR 40
1.5.2. Ensayos inmunoenzimáticos para la detección de micro RNA 43
HIPÓTESIS 46
OBJETIVOS 47
i
Índice
II. AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA ELISA MEDIANTE QUÍMICA CLIC 48

2.1. INTRODUCCIÓN 48
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS 50
2.2.1. Obtención de proteínas recombinantes utilizadas en los ELISAs modelos para la 50
validación de las superficies
2.2.1.1. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-IL6h en células de 50
mamíferos. Cuantificación y detección mediante ELISA
2.2.1.1.1. Análisis de los resultados obtenidos en ensayos tipo ELISA 51
2.2.1.2. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en 52
Escherichia coli. Purificación usando columna de afinidad y detección mediante ELISA
2.2.2. Modificación de anticuerpos y BSA para la incorporación de grupos funcionales 53
involucrados en reacciones de tipo química clic
2.2.2.1. Incorporación del grupo funcional trans-ciclooctano en los anticuerpos anti c- 53
myc y anti CEA a través de la reacción N-hidoxisuccinimida con los grupos amino libres
del anticuerpo
2.2.2.1.1. Detección de la actividad del anticuerpo modificado anti c-myc-TCO 54
mediante ELISA
2.2.2.1.2. Detección de la actividad del anticuerpo modificado anti CEA-TCO 55
mediante ELISA
2.2.2.2. Incorporación del grupo funcional tetracina en la albúmina de suero bovina 55
2.2.3. Preparación de superficies con alta densidad del grupo funcional tetracina 56
2.2.3.1. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno previamente 56
aminadas mediante química en mojado
2.2.3.2. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno aminadas 57
usando poli-lisina-tirosina
2.2.3.3. Exposición del grupo tetracina en superficies estándar de ELISA mediante la 58
proteína BSA-Tetracina
2.2.4. ELISAs desarrollados para la evaluación de las superficies activadas con tetracina 58
2.2.4.1. ELISA para la detección del anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) uniéndose a 58
superficies tratadas con tetracina
2.2.4.2. ELISA comparativo de detección de la proteína CEA en superficies estándar y 59
en superficies tratadas con tetracina
2.2.4.3. ELISA para la detección del anticuerpo anti c-myc-TCO uniéndose a superficies 60
tratadas con tetracina
2.2.4.4. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h 61
en superficies estándar y en superficies tratadas con tetracina
2.2.4.5. ELISA comparativo de detección de la proteína c-myc-IL6h en superficies 62
estándar y en superficies tratadas con tetracina
2.3. RESULTADOS 64
2.3.1. Obtención de proteínas recombinantes utilizadas en los ELISAs modelos para la 64
2.3.1.1. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-IL6h en células de 64
ii
Índice

2.3.1.2. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en E. coli. 65
Purificación usando columna de afinidad y detección mediante ELISA
2.3.2. Modificación de anticuerpos y BSA para la incorporación de grupos funcionales 67
2.3.2.1. Incorporación del grupo funcional trans-cicloocteno en los anticuerpos anti c- 67
myc y anti CEA a través de la reacción N-hidroxisuccinimida con los grupos amino
libres del anticuerpo
2.3.2.1.1. Detección de la actividad del anticuerpo anti c-myc-TCO mediante 68
ELISA
2.3.2.1.2. Detección de la actividad del anticuerpo anti CEA-TCO mediante ELISA 70
2.3.2.2. Incorporación del grupo funcional tetracina en la albúmina de suero bovina 70
2.3.3. Preparación de superficies con alta densidad del grupo funcional tetracina 71
2.3.3.1. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno previamente 71
aminadas mediante la técnica de química en mojado
2.3.3.2. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno aminadas 72
usando poli-lisina-tirosina
2.3.3.3. Exposición del grupo tetracina en superficies estándar de ELISA usando la 74
proteína BSA-Tetracina
2.3.4. ELISAs desarrollados para la evaluación de las superficies activadas con tetracina 75
2.3.4.1. ELISA para la detección del anticuerpo anti CEA-TCO uniéndose a superficies 75
2.3.4.2. ELISA comparativo de detección de la proteína CEA en superficies estándar y 76
2.3.4.3. ELISA para la detección del anticuerpo anti c-myc-TCO uniéndose a superficies 78
2.3.4.4. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h 79
en superficies estándar y en superficies tratadas con tetracina
2.3.4.5. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h en 82
superficies estándar y en superficies tratadas con tetracina
2.4. DISCUSIÓN 84
III. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS 89

3.2.1. Unión de BSA con oligos a través de una reacción de tipo química clic 91
3.2.1.1. Incorporación del grupo reactivo DBCO en la proteína albúmina de suero 91
bovina
3.2.1.2. Unión de diferentes oligos con la proteína BSA-DBCO 91
3.2.2. Detección de un oligo por complementariedad a través de la técnica de ELISA 92
3.2.2.1. Prueba de concepto de la detección a través de una reacción 92
inmunoenzimática de la hibridación in situ de dos oligos complementarios
iii
Índice
3.2.2.2. Optimización del tampón utilizado en el paso de unión de los oligos por 93
complementariedad
3.2.2.3. Ensayo 2 PLEX de detección de la unión entre dos oligos. Bases para el 94
multiplexado
3.2.2.4. Detección del miRNA-205 a través de una técnica de hibridación in situ ligado 94
a un ensayo inmunoenzimático
3.2.3. Detección de un miRNA a través de una PCR ligada a la técnica ELISA 95
3.2.3.1. Amplificación del miRNA-29b mediante PCR con cebadores marcados 95
3.2.3.2. Eliminación del exceso del cebador marcado con hapteno usando partículas 96
magnéticas de estreptavidina
3.2.3.2.1. Preparación de las partículas magnéticas de estreptavidina 96
3.2.3.2.2. Eliminación del cebador marcado con el hapteno 97
3.2.3.3. ELISA de cuantificación del miRNA amplificado por PCR 97
3.2.4. ELISA de 2 plex para detectar moléculas de distinta naturaleza en el mismo ensayo 98
3.2.4.1. ELISA de detección de CEA y miRNA-29b 98
3.3. RESULTADOS 99
3.3.1. Unión de BSA con oligos a través de una reacción de tipo química clic 99
3.3.1.1. Incorporación del grupo reactivo DBCO en la proteína BSA 99
3.3.1.2. Unión de diferentes oligonucleótidos con la proteína BSA-DBCO 99
3.3.2. Detección de la hibridación entre dos oligos mediante la técnica ELISA 100
3.3.2.1. Prueba de concepto para la detección de hibridación entre dos oligos usando 100
la técnica ELISA
3.3.2.2. Optimización del tampón utilizado en el paso de hibridación de los 101
oligonucleótidos por complementariedad
3.3.2.3. Ensayo 2 PLEX de detección de la hibridación entre dos oligos. Bases para el 102
multiplexado
3.3.2.4. Detección del miRNA-205 a través de una técnica de hibridación in situ ligado 103
a un ensayo inmunoenzimático
3.3.3. Detección de miRNA a través de una PCR ligada a la técnica ELISA 104
3.3.3.1. Amplificación del miRNA-29b mediante PCR con cebadores marcados 104
3.3.3.2. Eliminación del exceso de oligos usando partículas magnéticas de 104
estreptavidina
3.3.3.2.1. Preparación de las partículas magnéticas de estreptavidina 104
3.3.3.3. ELISA de cuantificación del miRNA-29b amplificado por PCR 105
3.3.4. ELISA de 2 plex para detectar moléculas de distinta naturaleza en el mismo ensayo 106
3.3.4.1. ELISA de detección de CEA y miRNA-29b 106
3.4. DISCUSIÓN 108
IV. AUMENTO DE LASENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA ELISA MEDIANTE UNA TECNOLOGÍA 113

BASADA EN LA QUITINA Y EL DOMINIO DE UNIÓN A QUITINA
iv
Índice

4.2.1. Obtención de proteínas recombinantes 116
4.2.1.1. Obtención de la proteína recombinante Cys-His6-ChBD 116
4.2.1.2. Obtención del anticuerpo anti c-myc-CHBD en células de mamíferos 117
4.2.2. Unión del anticuerpo anti c-myc con el dominio de unión a quitina químicamente 119
4.2.2.1. Modificación química del anticuerpo anti c-myc y de la proteína de unión a 119
quitina
4.2.2.2. Detección de la unión química entre ChBD y el anticuerpo anti c-myc 120
4.2.3. Preparación de superficies de quitosano acetilado 120
4.2.4. ELISAs para la validación del aumento de sensibilidad de las superficies de 121
quitosano acetilado con respecto a las superficies estándar
4.2.4.1. Optimización de la unión de la proteína de unión a quitina a la superficie de 121
quitosano acetilado
4.2.4.2. Comparación del ELISA de detección de c-myc-GST -IL8h realizado en placas 122
con superficies preparadas con quitosano acetilado o superficies estándar
4.2.4.3. Influencia del tipo de muestras sobre el ELISA 123
4.3. RESULTADOS 124
4.3.1. Obtención de proteínas recombinantes 124
4.3.1.1. Obtención de la proteína recombinante His6-Cys-ChBD 124
4.3.1.2. Obtención del anticuerpo anti c-myc-ChBD en células ExpiCHO 125
4.3.2. Unión del anticuerpo anti c-myc con el dominio de unión a quitina químicamente 127
4.3.2.1. Modificación química del anticuerpo anti c-myc y de la proteína de unión a 127
quitina
4.3.2.2. Detección de la unión química entre ChBD y el anticuerpo anti c-myc 128
4.3.3. Preparación de superficies de quitosano acetilado 129
4.3.4. ELISAs para la validación del aumento de sensibilidad de las superficies de 130
quitosano acetilado con respecto a las superficies estándar
4.3.4.1. Optimización de la unión de la proteína de unión a quitina a la superficie de 130
quitosano acetilado
4.3.4.2. Comparación del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h realizado en placas 131
con superficies preparadas con quitosano acetilado o superficies estándar
4.3.4.3. Influencia del tipo de muestras sobre el ELISA 133
4.4. DISCUSIÓN 135
V. CONCLUSIONES 138
VI. BIBLIOGRAFÍA 139
VII. ANEXOS
v
Resumen
RESUMEN
La técnica ELISA (del inglés “enzyme-linked immunosorbent assay”) es el método de rutina más
utilizado y fiable para la detección de marcadores proteicos relevantes en la asistencia sanitaria.
Aumentar la sensibilidad de este ensayo es crucial para detectar biomoléculas relacionadas con
trastornos de salud y facilitar el diagnóstico en las primeras etapas de enfermedades como el
cáncer, permitiendo de esta manera una posible disminución de la mortalidad. Así, se han
desarrollado varios métodos para mejorar la sensibilidad del ELISA mediante la inmovilización de
anticuerpos en las placas de poliestireno.
En este trabajo hemos desarrollado dos estrategias de inmovilización de anticuerpos a un

sustrato sólido con el fin de aumentar la sensibilidad en el ensayo ELISA. En una de las
estrategias hemos involucrado la reacción de alta eficiencia y especificidad entre la tetracina y el
trans-cicloocteno con el fin de aumentar la densidad del anticuerpo en la superficie; y en la otra,
la afinidad del dominio de unión a quitina por su sustrato como método para lograr la correcta
orientación del anticuerpo inmovilizado. Para la primera estrategia se prepararon superficies
con tetracina, mientras que el anticuerpo fue modificado con TCO. La preparación de las
superficies se llevó a cabo de tres formas diferentes: 1) partiendo de placas aminadas
comerciales tratadas con glutaraldehído y lisina para aumentar el número de grupos NH2 en
superficie, 2) partiendo de placas aminadas mediante un proceso de química en mojado y 3)
recubriendo placas MaxiSorp con la proteína BSA marcada con 20 tetracinas por molécula. Para
la evaluación de las superficies se utilizaron tres modelos de ELISA, dos de ellos recubriendo con
el anticuerpo de baja afinidad anti c-myc (9E10) marcado con TCO, donde se detecta la proteína
c-myc-GST-IL8h o c-myc-IL6h, y como anticuerpo de detección el específico para la citoquina
correspondiente. El otro ELISA, para la evaluación de las superficies, se utilizó para detectar la
proteína CEA, relacionada con el diagnóstico del cáncer colorrectal. En todos los casos se
observó un aumento de la sensibilidad del ELISA desarrollado en las superficies preparadas con
tetracina comparado con la superficie estándar. En la detección de c-myc-GST-IL8h se obtuvo un
aumento de sensibilidad del ELISA, comparado con las superficies estándar, de 2,6 veces para las
superficies preparadas a partir de placas aminadas comerciales, de 11 veces partiendo de placas
aminadas mediante química en mojado y de 13,7 veces en placas previamente recubiertas con
BSA-tetracina. Del mismo modo, en el ELISA de detección de c-myc IL6h se aumentó la
sensibilidad 9 veces en placas con tetracina a partir de placas aminadas mediante química en
1
Resumen
mojado y, por último, el ELISA de detección de CEA tuvo un aumento de 12 veces en placas
previamente recubiertas con BSA-tetracina.
En la segunda estrategia fueron preparadas superficies de poliestireno con quitosano acetilado

mediante un proceso de acetilación in situ, mientras que, por otro lado, fue preparado el
anticuerpo anti cmyc (9E10) unido a ChBD. Esta unión fue realizada de forma química a través
de una reacción de tipo química clic y de forma recombinante fusionando ChBD al carboxilo
terminal del anticuerpo. Ambos anticuerpos fueron evaluados mediante el ELISA de detección
de la proteína c-myc-GST-IL8h, en las placas de quitosano acetilado, observándose un aumento
de la sensibilidad de 6 veces (p<0,0001) con respecto al ELISA realizado en la superficie estándar
usando el anticuerpo obtenido de forma recombinante.
Asimismo, se diseñó un método de detección de dos moléculas de distinta naturaleza en un

ensayo tipo multiplex de spot en placas de ELISA. El objetivo fue determinar la concentración de
dos moléculas relacionadas con el cáncer colorrectal, el miRNA-29b y la proteína CEA. Para la
detección del miRNA mediante un ensayo inmunoenzimático, se desarrolló un método directo
de hibridación in situ y otro basado en la técnica PCR-ELISA. Con esta última técnica de
detección de ácidos nucleicos se logró la detección del miRNA-29b con un LOD de 1358
moléculas totales simultáneamente con la proteína CEA, con un LOD de 2,54 ng/ml.
En este trabajo se demuestra, a través de la reacción tetracina - TCO, que la sensibilidad del
ensayo ELISA mejora de forma significativa usando un sistema de inmovilización de anticuerpos
que permita que estos queden fijados mediante un enlace covalente a la superficie. Además, la
correcta orientación de los anticuerpos en la superficie de un ensayo de ELISA mejora la
sensibilidad de la técnica. Se demuestra también la detección simultánea de dos moléculas de
distinta naturaleza (un miRNA y una proteína) en un ensayo inmunoenzimático.
2
Abstract
ABSTRACT
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most widely used and reliable clinical
routine method for the detection of essential protein markers in healthcare. Improving ELISAs is
crucial to detect biomolecules related to health disorders and facilitating diagnosis at the early
disease stages such as cancer, thus allowing the possibility of a decrease in mortality. Several
methods have been carried out to improve the ELISA sensitivity through antibodies
immobilization on the microtiter plates.
In this work we have developed two strategies of antibodies immobilization on a solid support
to improve the ELISA sensitivity. To increase antibody density on the surface, one strategy was
related to the highly efficient and specific reaction between tetrazine and trans cyclooctene. The
second strategy was based on the affinity between chitin binding domain and its substrate to
promote the adequate capture antibody orientation. To develop the first strategy, surfaces with
exposed tetrazine groups were prepared, while antibody was modified with TCO. The surfaces
with tetrazine were carried out in three different ways: 1) from commercial aminated plates
treated with glutaraldehyde and lysine to increase the NH2 groups, 2) from aminated plates after
a wet chemical process and 3) from Maxisorp plates coated with BSA modified with 20 tetrazine
per molecule. The surfaces were evaluated using three ELISA models, two of them using the low
affinity antibody anti c-myc (9E10) modified with TCO as a capture antibody. This procedure was
carried out to detect the recombinant proteins c-myc-GST-IL8h and/or c-myc-IL6h, and the
detection was performed with the corresponding specific cytokine biotinylated antibody. The
third ELISA for the evaluation of surfaces was a CEA detection ELISA, a protein related with
colorectal cancer. The sensitivity increased in all the surfaces treated with tetrazine in
comparison with the standard unmodified surfaces. Thus, in commercial aminated plates
treated with tetrazine, the detection sensitivity of c-myc-GST-human IL8 was 2.6-fold increase,
on tetrazine surfaces previously aminated with a wet chemical process 11-fold and 13.7-fold on
plates coated with BSA-tetrazine. On the other hand, the sensitivity of c-myc IL6h detection
ELISA increased 9-fold in tetrazine treated surfaces using aminated plates after a wet chemical
process, while CEA ELISA detection increased 12-fold on surfaces plates previously coated with
BSA-tetrazine.
For the second strategy, we combined polystyrene surfaces coated with acetylated chitosan
prepared by an in-situ acetylation process. In this case, the anti-cmyc antibody (9E10) was linked
to ChBD. The anti c-myc-ChBD antibody was obtained using a click chemistry reaction or cloning
3
Abstract
a recombinant protein with ChBD attached to the end carboxyl of anti c-myc. Both anti cmyc-
ChBD antibodies were evaluated on chitosan acetylated surfaces using a sandwich detection
ELISA to detect c-myc-GST-IL8h. The ELISA assays developed on chitin surfaces were 6-fold more
sensitive (p<0.0001) than those performed on standard surface.
Besides, a spot multiplex ELISA was designed to detect two molecules of different nature in the
same assay: the CEA protein and the miRNA-29b, both related with colorectal cancer. The
immunoenzymatic detection of miRNA was developed through in situ hybridization or by a PCR-
ELISA technique. Using a PCR-ELISA a LOD of 1.358 molecules to miRNA-29b was obtained, while
the LOD of CEA detection was 2.54 ng/ml, both molecules were simultaneously detected in the
same well.
In this work we show that it is possible to improve the ELISA sensitivity using an immobilization
system through a tetrazine-TCO reaction, which allow the capture antibodies to bind covalently
on to surfaces. Moreover, the adequate capture antibody orientation on surfaces also improves
the ELISA technique sensitivity. On the other hand, we also demonstrate, the simultaneous
detection of a miRNA and a protein, two different nature molecules, by mean of an
immunoenzymatic assay.
4
I. INTRODUCCIÓN
Introducción
CAPÍTULO 1
1.1. Sistemas de detección de moléculas para el diagnóstico temprano del cáncer
El cáncer es la segunda enfermedad con más incidencia del mundo con una tasa de mortalidad
creciente en los últimos años. Muchos factores como la exposición a productos químicos, a
radiaciones ionizantes y las infecciones, entre otros, pueden alterar las células y dar como
resultado una modificación y proliferación anómala provocando la generación de cáncer en
diferentes partes del organismo. Aunque necesario, el diagnóstico clínico basado en
sintomatologías puede en ocasiones llevarse a cabo sólo en etapas más avanzadas de la
enfermedad, cuando ya no es posible la aplicación eficaz de terapias. Por lo tanto, sería
deseable el desarrollo de herramientas que permitieran un diagnóstico temprano para lograr
una supervivencia más prolongada de los pacientes (Walter et al., 2019). Con este objetivo, los
investigadores han propuesto como tal, la detección de proteínas y oligonucleótidos liberados
en el organismo durante las primeras etapas del cáncer, los cuales no están presentes en las
mismas concentraciones en individuos sanos. Estas moléculas son conocidas como
“biomarcadores” y son específicas de diferentes tipos de cánceres, por lo que su detección y
estimación pueden proporcionar información muy valiosa sobre el tipo de cáncer y su estadio
(Gion, Trevisiol and Fabricio, 2020).
Durante los últimos 15-20 años, los biomarcadores han desempeñado un papel cada vez más
destacado en el desarrollo de fármacos y en la evaluación de pacientes con cáncer. Estos se
utilizan en todas las etapas del desarrollo de fármacos, desde el enriquecimiento, la
estratificación y la selección de pacientes hasta la evaluación de la seguridad, la eficacia y el
rendimiento. Si bien en algunos ensayos clínicos se reclutan pacientes en función de la
presencia de biomarcadores específicos ("enriquecimiento"), otros ensayos examinan
biomarcadores específicos para el uso en investigación que generan un panel de datos clínico-
genómicos que permitan la toma interna de decisiones (Vivot et al., 2017).
Los biomarcadores tienen muchas aplicaciones potenciales en oncología, incluida la evaluación

de riesgos, el cribado, el diagnóstico diferencial, la determinación del pronóstico, la predicción
de la respuesta al tratamiento y el seguimiento de la progresión de la enfermedad (Henry and
Hayes, 2012; van Brummelen et al., 2017; Doroshow et al., 2021). Algunos ejemplos de
biomarcadores y su relación con su aplicación se detallan en la Tabla 1.
5
Introducción
Tabla 1. Potencial uso de los biomarcadores de cáncer

Usos Ejemplos de biomarcadores Tipo de cáncer
Estimación del riesgo del  BRCA1 Cáncer de ovario y mama
desarrollo del cáncer
Cribado  PSA Cáncer de próstata
 Mutación de KRAS y anticuerpo Cáncer colorrectal
anti EGFR
 Expresión de HER2 y terapia Cáncer de mama y gástrico
Predicción de la respuesta a las anti HER2
terapias  Expresión del receptor de Cáncer de mama
estrógenos
 PD-1 y PD-L1 Tumores sólidos
 BRAF Melanoma
Monitoreo de la recurrencia de la  CEA Cáncer colorectal
enfermedad  AFP, LDH, bHCG Tumor de células madres
 HE4 Cáncer de ovario
Monitoreo de la respuesta o  CA15-3 y CEA Cáncer de mama
progresión en metástasis
BRCA1: proteína de susceptibilidad al cáncer de mama 1; PSA: antígeno específico de próstata; EGFR: receptor del
factor de crecimiento epidérmico; HER2:Receptor del factor de crecimiento epidémico humano; CEA: antígeno
carcinoembrionario; AFP: α fetoproteína; hCG: gonadotropina coriónica humana; LDH: lactato deshidrogenasa; HE4:
proteína secretora 4 del epidídimo humano; PD-1: proteína 1 de muerte celular programada; PD-L1: ligando 1 de la
proteína de muerte celular programada; BRAF: B-Raf quinasa
Los biomarcadores son fundamentales en el desarrollo de medicamentos personalizados y han

agregado más complejidad al diseño, ejecución y análisis de datos de ensayos clínicos.
Comprender el panorama de los biomarcadores, incluida la actividad de investigación clínica,
es crítico a medida que los departamentos de I + D de los sistemas de salud y de la industria
farmacéutica se alinean con los avances científicos (Gion, Trevisiol and Fabricio, 2020).
Debido al papel fundamental que tiene la detección de los biomarcadores, ha sido importante
el desarrollo de sistemas de detección que sean simples, de bajo coste y que puedan
proporcionar una estimación sensible y específica de dichos biomarcadores. Además, teniendo
en cuenta la variabilidad de la población, la etapa del cáncer y los bajos niveles de
biomarcadores en las primeras etapas del cáncer, es recomendable identificar y probar
paneles de múltiples biomarcadores para una mejor precisión en el diagnóstico (Ranjan,
Esimbekova and Kratasyuk, 2017).
En la actualidad, los métodos para el diagnóstico del cáncer incluyen análisis de biopsias,
imágenes del tumor mediante radiografías, monitorización de biomarcadores a través de
inmunoensayos ya sea ligados a enzimas, radio inmunoensayos o inmunoensayos
electroforéticos y técnicas proteómicas basadas en espectroscopia de masas (Marrugo-
Ramírez, Mir and Samitier, 2018). Los inmunoensayos para la detección de biomarcadores
continúan siendo hoy en día los ensayos más utilizados en la clínica, tanto para la detección
como para la monitorización de enfermedades (Vashist and Luong, 2018b).
6
Introducción
1.2. Inmunoensayos
Los inmunoensayos son métodos bioanalíticos altamente selectivos que detectan y

determinan la presencia o concentración de analitos, que incluyen desde pequeñas moléculas
hasta macromoléculas en una solución, a través de una reacción antígeno-anticuerpo.
En las últimas décadas, los inmunoensayos han jugado un papel significativo en el análisis
biológico en diferentes ámbitos como son el diagnóstico clínico (Dixit and Twyman, 2019), el
análisis biofarmacéutico (Allinson, 2011; Dinis-Oliveira, 2014), el monitoreo medioambiental
de herbicidas, fungicidas e insecticidas (Lee and Kennedy, 2007), así como la seguridad y la
alimentación (Ahmed et al., 2020). Este gran número de aplicaciones permite prever que el
mercado de los inmunoensayos tenga un crecimiento anual de un 6% en el período 2018-2023,
estimando una generación de unos 27 mil millones de dólares en 2023 (“Immunoassay Market
by Product & Service. Global Forecast to 2023 : Markets and Markets”, 2018). Estas previsiones
son atribuidas al incremento de la incidencia de enfermedades crónicas e infecciosas, a los
avances tecnológicos en los dispositivos de lectura de inmunoensayos, al crecimiento de la
industria biotecnológica y biofarmacéutica y al aumento de la adopción de inmunoensayos
para análisis rápidos tipo POC (POC, point of care) (Dave et al., 2019).
Los primeros inmunoensayos fueron implementados en el año 1960 por Rosalyn Yalow y
Salomon Berson, quienes desarrollaron la técnica de radioinmunoensayo (Radio ImmunoAssay,
RIA) para la detección de antígenos o anticuerpos marcados con radioisótopos tales como 14C,
3H, 32P, 125I, 57Co (Yalow and Berson, 1960). Esta técnica fue posteriormente mejorada por las
empresas Pierce y Stratis Avrameas, con los ensayos por inmunoadsorción ligado a enzimas
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA), eliminando la necesidad de usar radioisótopos
(Engvall and Perlmann, 1971). A partir de este momento, fueron desarrolladas múltiples
técnicas que permiten la detección de analitos de forma cualitativa, semicuantitativa o
cuantitativa.
Gracias a los avances de la bioingeniería, la microfluídica y los biosensores han surgido

diversos sistemas inmunoanalíticos (Turner, 2013; Karle et al., 2016; Vashist and Luong, 2016).
Concretamente, los avances en microfluídica han permitido el desarrollo de los dispositivos de
inmunoensayos de flujo lateral (Lateral Flow Immunoassays LFIA) (Mohammed and
Desmulliez, 2011) los cuales han sido ampliamente utilizados en los llamados “test rápidos”
(embarazo, COVID, alergia al gluten, glucosa, etc). También la resonancia por plasmones
superficiales (Surface Plasmon Resonance, SPR) se ha convertido en una técnica que, además
de permitir la detección de los analitos, permite la búsqueda de interacciones entre diferentes
7
Introducción
moléculas además de conocer el grado de afinidad entre ellas (Jason-Moller, Murphy and
Bruno, 2006; Thillaivinayagalingam et al., 2010).
Por su parte, los nuevos conceptos sobre microgravimetría han permitido el desarrollo de
inmunoensayos basados en espectroscopía de masa, que han sido extensamente usados en la
clínica y la industria para un gran número de analitos (Vashist and Vashist, 2011).
Entre los distintos formatos de inmunoensayos que son usados actualmente podemos citar el
ELISA, el AlphaLISA, los inmunoensayos basados en nanopartículas (Counting immunoassays),
los inmunoensayos turbidimétricos, los inmunoensayos en microarrays, los inmunoensayos de
flujo lateral (LFIA), entre otros (Beaudet et al., 2008; Kuramitz, 2009; Cinquanta, Fontana and
Bizzaro, 2017; Vashist and Luong, 2018b). Dada lo extenso de la temática, en este capítulo solo
abordaremos los inmunoensayos relacionados con nuestro trabajo.
1.2.1. ELISA
Los ensayos ELISA son inmunoensayos bien conocidos y uno de los más utilizados en clínica
para el seguimiento y detección de enfermedades debido a su alta especificidad, sensibilidad,
precisión y trazabilidad. Estos ensayos son realizados generalmente en placas de 96 pocillos y
permiten la detección y cuantificación de sustancias solubles como son péptidos, proteínas,
anticuerpos y hormonas. La alta especificidad de un anticuerpo con la macromolécula a
cuantificar es el elemento crucial de este tipo de ensayos y la detección está asociada a la
medida de la actividad de una enzima reportera tras ser incubada con su sustrato.
Esta reacción de la enzima reportera con su sustrato, a su vez, está acoplada a una reacción
colorimétrica, de fluorescencia o luminiscencia, determinando de este modo tres tipos de
ELISAs diferentes dependiendo de la señal obtenida. Esta enzima puede ir unida directamente
al anticuerpo que se emplea en la detección del analito o puede estar unida a la
estreptavidina, que a su vez se une por afinidad a la biotina que ha sido incorporada a los
anticuerpos de detección del analito. Entre las enzimas utilizadas en los inmunoensayos están
la peroxidasa de rábano picante (HRP, horseradish peroxidase), la fosfatasa alcalina de gamba y
la β-D-galactosidasa (Vashist and Luong, 2018b) La peroxidasa es la enzima más extendida en
los ELISA. Esta es la más pequeña de estas enzimas y posee la ventaja de que no se encuentra
en la mayoría de las células de mamíferos, lo que evita reacciones inespecíficas. En presencia
de H2O2, la HRP promueve la oxidación de ciertos sustratos para dar lugar a productos con
propiedades ópticas fácilmente detectables, siendo los más habituales el TMB (3,3’,5,5’-
tetrametilbencidina) y la OPD (o-fenilenodiamina) entre los cromogénicos; el luminol (5-
8
Introducción
amino-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona) entre los quimioluminiscentes y la fluoresceína, la

rodamina y la umbeliferona, entre los fluorescentes.
En todos los formatos de ELISA, tras el recubrimiento con el anticuerpo de captura o con el
antígeno, las superficies son bloqueadas con el objetivo de eliminar cualquier sitio que pueda
ser ocupada por alguna de las proteínas a emplear en los pasos subsiguientes. Para esto se
utiliza una solución tampón, generalmente proteica, que se adsorbe de forma pasiva a la
superficie. Esta solución es efectiva si mejora la sensibilidad del ELISA debido a la reducción de
la interferencia del fondo y, por consiguiente, la mejora de la relación señal: fondo. El tampón
de bloqueo debería unirse a todos los sitios potenciales de la superficie que no queden
cubiertos por la proteína de recubrimiento, los cuales pudiesen tener una interacción
inespecífica con los anticuerpos de los pasos subsiguientes. Entre las soluciones tampón
podemos citar la albúmina de suero bovino (1-5% BSA en PBS), la caseína o la leche desnatada
(0.1-3%) y/o el suero animal completo (10%), entre otros. Algunos tampones de bloqueo no
proteicos también han sido utilizados. Entre estos destacan el polietilenglicol (PEG), el alcohol
polivinilo (PVA) y la polivinilpirrolidona, que se caracterizan por recubrir superficies
hidrofóbicas inhibiendo las uniones inespecíficas (Studentsov et al., 2002).
Debido a la extensa utilización de los ELISA, muchas investigaciones se han centrado en la

mejora de la tecnología a través de la automatización de los ensayos usando robots de manejo
de líquidos, la disminución del coste de los lectores de señales del ELISA, la ampliación del
formato de las microplacas de titulación, que han pasado de 96 pocillos a formatos de 384 y
1536 pocillos, etc. Asimismo, el desarrollo de los ELISAs ha mejorado de forma significativa
gracias a una mejor inmovilización de los anticuerpos (Sandeep Kumar Vashist et al., 2014;
Wild & Kodak, 2013; Hermanson, 2013); al desarrollo de substratos más sensibles para las
enzimas ligadas al ensayo y al uso de micro o nanomateriales (Vashist et al., 2012; Ge et al.,
2014), entre otros.
Aunque el ELISA manual aún sigue en uso en países en desarrollo debido a las infraestructuras
existentes, la mayoría de los inmunoensayos que se realizan en la clínica en los países
desarrollados están completamente automatizados, usando equipamiento comercializado por
grandes compañías como Roche, Abbott y Siemens. No obstante, aún quedan muchos
biomarcadores asociados a enfermedades de menor prevalencia que no son determinados de
forma automatizada. Las compañías líderes en el desarrollo de nuevos ELISA manuales son,
entre otras, R&D Systems, BD Biosciences, Bio-Rad Laboratories, Life Technologies Corporation,
Millipore Corporation y BioLegend.
9
Introducción
Atendiendo al procedimiento utilizado, los ELISAs pueden ser clasificados en cuatro tipos:
directo, indirecto, sándwich y de competencia (Fig. 1). El ELISA directo es el más sencillo de
todos. En este, el analito se fija a la superficie de la placa mediante adsorción y posteriormente
un anticuerpo acoplado con la enzima, generalmente la peroxidasa, forma el complejo inmune
(Fig. 1).
Figura 1. Esquemas de los diferentes tipos de ELISA en base a su diseño.
En el ELISA indirecto, al igual que en el directo, el analito se fija a la superficie de la placa y

posteriormente se añade el anticuerpo de detección específico del antígeno (Fig. 1). Se
diferencia del ELISA directo en que el anticuerpo de detección no está marcado con la enzima,
por lo que es necesario el uso de un anticuerpo secundario, el cual reconoce la región
constante del anticuerpo específico y, a su vez, está acoplado a la enzima. Este ELISA ha sido
ampliamente utilizado para la detección de anticuerpos en suero de pacientes. Un ejemplo de
ELISA indirecto es el utilizado para la detección de la presencia de anticuerpos séricos contra el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En este ELISA, las proteínas VIH-1 y/o VIH-2 del virus son
absorbidas como antígenos en la superficie de los pocillos. El anticuerpo específico, que se
encuentra en el suero de las personas afectadas de VIH, reconoce el antígeno y
posteriormente el ELISA es revelado con un anticuerpo secundario anti IgG humano o anti IgM
humano marcado con la peroxidasa (Workowski and Bolan, 2015).
10
Introducción
Los ELISA tipo sándwich son los ensayos inmunoenzimáticos más utilizados en la clínica, por lo
que existe una amplia cartera de kits diagnósticos para la cuantificación de biomarcadores.
Este ELISA involucra dos anticuerpos específicos para la detección del antígeno de interés, lo
que favorece la especificidad del ensayo. En este caso, en el revelado puede usarse el
anticuerpo secundario o de detección unido a la enzima de la reacción, aunque en la mayoría
de los casos los anticuerpos están unidos a biotina. Este paso adicional, que comprende la
unión de alta afinidad de la biotina con la estreptavidina, mejora la sensibilidad de la mayoría
de los ELISAs ya que la estreptavidina empleada tiene un alto número de moléculas de
peroxidasa acopladas, con lo que se consigue una amplificación de la señal (Fig. 1). El
procedimiento ha sido automatizado usando estaciones robóticas comerciales para un
procesamiento de muestras de pacientes muy eficiente.
Actualmente los biomarcadores conocidos para la detección de enfermedades inflamatorias y

del cáncer son detectados mediante ELISAs tipo sándwich realizados de forma automatizada
(Tabla 2) (Vashist and Luong, 2018b). Sin embargo, continuamente van descubriéndose nuevos
marcadores que no están incluidos en plataformas automatizadas y para los cuales los
anticuerpos a emplear son de baja afinidad o no están disponibles (El-Khoury et al., 2020).
Tabla 2. Biomarcadores analizados mediante inmunoensayos automatizados para la detección del

cáncer y enfermedades inflamatorias
Biomarcadores de inflamación Biomarcadores relacionados con cáncer
IL-1β, IL-10, IL-2R, IL-6, IL-8, LBP, ASLO, TNFα, AFP, PSA libre, PSA, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA
C3c, C4, CRP, IgA, IgE, IgG, IgM, IgA CSF, IgM CSF, 72-4, calcitonina, CEA, Cyfra 21-1 (KRT-19), β-
prealbúmina, procalcitonina, cadena ligera kappa, hCG, HE4, cadena ligera kappa libre, cadena
cadena ligera λ ligera λ libre, NSE, proGRP, TPS, TPA
IL: interleuquina; LBP: Proteína de unión a AFP: α fetoproteína; PSA: Antígeno específico de
lipopolisacáridos; ASLO: Antiestreptolisina O; TNFα: próstata; CA: Antígeno de carcinoma; CEA: Antígeno
Factor de necrosis tumoral; C: Complemento; CRP: carcinoembrionario; KRT: Queratina; hCG:
Proteína C reactiva; Ig: Inmunoglobulinas; CSF: Fluido Gonadotropina coriónica humana; HE4: Proteína del
cerebroespinal; epidídimo humana; NSE: Enolasa neurona específica;
proGRP: Péptido de liberación de progastrina; TPS:
Antígeno polipéptido tisular específico; TPA: Antígeno
polipéptido tisular
Los ELISAs de competencia implican la cuantificación de una sustancia que es capaz de

competir con el analito que será cuantificado existiendo, por tanto, una relación inversa entre
las señales del ELISA y la concentración del analito de interés. Este formato podría ser
desarrollado basándose en el ELISA directo, indirecto o sándwich (Fig. 1). Teóricamente el
ELISA de competencia puede ser utilizado para cualquier analito. Sin embargo, este formato es
muy común para moléculas pequeñas como son los esteroides y las moléculas que presentan
pocos epitopos en su superficie. Un ejemplo de ELISA de competencia es el reportado por
11
Introducción
Broto et al., 2017 para el monitoreo de Tegafur (pro droga del 5-fluorouracilo), uno de los
principales medicamentos utilizados en la terapia del cáncer.
1.2.2. AlphaLISA
A diferencia de los ELISA, la tecnología basada en perlas AlphaLISA es un ensayo homogéneo.

El ensayo desarrollado por PerkinElmer (AlphaScreen®) se basa en la transferencia de
electrones del oxígeno entre dos perlas muy próximas (Fig. 2) (Hou et al., 2016). Estos ensayos
no requieren de lavados entre los diferentes pasos, poseen una alta sensibilidad y un amplio
rango dinámico. Comparado con el protocolo de un ELISA estándar, los AlphaLISA incrementan
el rendimiento a la vez que disminuyen el tiempo de ensayo y la manipulación. La plataforma
AlphaLISA ha sido desarrollada para la inmunodetección de biomarcadores y es actualmente
una tecnología de inmunoensayos de nueva generación para la investigación básica y estudios
pre-clínicos, entre otros.
Figura 2. Detección de un analito mediante la tecnología AlphaLisa de PerkinElmer. La partícula aceptora

(615 nm) está recubierta por un anticuerpo que reconoce el antígeno, mientras que la partícula
donadora está recubierta por estreptavidina. El anticuerpo biotinilado de reconocimiento del antígeno
se encuentra en la solución junto con este. Una vez que ambas partículas se acerquen debido a la
detección del antígeno, ocurre la emisión de luz. Imagen tomada de Perkin Elmer.
Los ensayos AlphaLISA pueden ser tipo sándwich o de competencia y se basan en la emisión de
luz de una partícula de 615 nm que ocurre debido a la excitación provocada por la cercanía con
otra partícula de 680 nm a través de la formación de un flujo de oxígenos entre ambas. En un
ensayo de detección del analito tipo sándwich, este es detectado por un anticuerpo específico
biotinilado. Este anticuerpo se une a unas partículas donadoras de 680 nm recubiertas de
estreptavidina. El segundo anticuerpo, que reconoce al antígeno, se encuentra recubriendo las
partículas aceptoras (615 nm). Cuando el analito está unido a ambos anticuerpos provoca que
las partículas donadoras y aceptoras se acerquen formándose un canal de oxígeno que
provoca que emisión de luz por parte de las partículas aceptoras (Fig. 2) (Beaudet et al., 2008).
12
Introducción
Actualmente Perkin Elmer cuenta con un catálogo que incluye cientos de kits de AlphaLISA
para la detección de proteínas vinculadas con diversas enfermedades como cardiovasculares,
oncológicas, diabetes, inflamatorias (interleuquinas), para la detección de marcas epigenéticas
y para la determinación de fosforilaciones. Si bien todos estos ensayos se caracterizan por su
elevada sensibilidad, tienen la desventaja de que es necesario un equipo de elevado coste para
la lectura del ensayo.
1.2.3. Ensayos multiplex
Aunque existe un significativo número de ensayos diseñados para detectar un único analito,
desde hace pocos años la multiplexación ha adquirido gran popularidad ya que este formato
no solo permite ahorrar tiempos de trabajo, sino que permite el análisis simultáneo de
distintos analitos en una misma muestra. La multiplexación consiste en la detección
simultánea de varios analitos de una misma muestra y en un solo ensayo.
Los métodos más comúnmente utilizados para el desarrollo de ensayos multiplex pueden ser
englobados en dos categorías: 1) aquellos que se desarrollan sobre una superficie sólida plana
y el ensayo para cada analito se dispone de forma separada en el soporte y 2) aquellos que son
desarrollados sobre partículas y en cada una de ellas se desarrolla un ensayo diferente.
Los primeros ensayos multiplex fueron desarrollados sobre superficies sólidas y son similares al
proceso de un ELISA tradicional excepto que las distintas parejas de anticuerpos, es decir, los
diferentes ensayos, comparten el mismo volumen de reacción. Existen múltiples variaciones de
este esquema, pero todos comparten el aislamiento físico de los anticuerpos de captura sobre
la superficie de recubrimiento. Entre las diversas plataformas que incluyen este formato
podemos citar la Mesoscale Discovery Technology Platform (MSD®) y la Q–PlexTM array
(Quansys Biosciences) (Fig. 3).
13
Introducción
Figura 3. Representación de una placa de ELISA multiplex de Quansys con 17 spots. Cada spot
representa un ELISA independiente. El anticuerpo de captura ha sido colocado usando un robot
dispensador (20-50 nl del anticuerpo). El ensayo es determinado mediante la intensidad de luz en cada
spot: si la muestra es positiva hay emisión de luz, de lo contrario el spot no es visible. Imagen tomada de
Quansys Biosciences.
En los ensayos multiplex en suspensión, la muestra se aplica a una mezcla de partículas y cada
partícula actúa como soporte de ensayo para un determinado antígeno. Para hacer
corresponder cada analito con su partícula se utilizan diferentes marcadores de fluorescencia.
La tecnología xMAP® (Multiple Analyte Profiling, MAP) de Luminex Corporation, es una
combinación de citometría de flujo e inmunoensayos tipo sándwich. Esta técnica implica 100
conjuntos de partículas de distintos colores creados con dos colorantes fluorescentes
(infrarrojo y rojo-naranja) en distintas proporciones (Cook et al., 2019). La coloración de la
partícula identifica el anticuerpo de captura que recubre cada microesfera, mientras que los
anticuerpos de revelado están unidos a ficoeritrina para cuantificar los niveles del antígeno. La
lectura se realiza con dos láseres: uno de clasificación rojo (635 nm), que identifica el código de
la partícula, y un láser reportero verde (532 nm) que mide la intensidad de fluorescencia y
determina la concentración del analito (Fig. 4).
Las principales ventajas del ensayo multiplex en comparación con el ELISA son el bajo volumen
de muestra que es utilizado (20 μL), las condiciones idénticas de análisis, el ahorro de costes y
tiempo y la amplia información obtenida sobre el proceso patológico (Adamcova and Šimko,
2018). Esta tecnología permite, con respecto a los ensayos realizados sobre superficies sólidas,
la lectura simultánea de un rango más amplio de analitos usando la misma muestra. La
tecnología xMAP® permite la detección simultánea de hasta 500 analitos diferentes. Sin
embargo, esta tecnología tiene la limitación de requerir un equipamiento especializado ya que
la lectura de las partículas exige de un citómetro de flujo especial con un elevado coste.
14
Introducción
Figura 4. Representación de la tecnología Luminex® xMAP. Las partículas de poliestireno o

paramagnéticas, están marcadas internamente con la combinación de dos fluróforos (rojo e infrarojo) a
diferentes cantidades. Cada grupo de partícula que comparte un color determinado está recubierto con
un anticuerpo específico para un analito. Sobre la superficie de la partícula se desarrolla un
inmunoensayo tipo sandwich de detección del antígeno. Las partículas son detectadas a través de un
láser a 633nm mientras que la unión del antígeno se mide a través de la ficoeritrina a 532 nm. Imagen
tomada de Luminex Corporation.
Aunque los ensayos multiplex sobre partículas pueden ser leídos también en citómetros de
flujo no especializados, ello penaliza el número de analitos que pueden ser analizados con la
misma muestra. Un ejemplo de este tipo de ensayos son el FirePlexTM (Abcam) (Perea et al.,
2019). En ambos tipos de ensayos multiplex, la heterogeneidad de las superficies donde se
desarrolla el ensayo, obligan a una exhaustiva validación para la eliminación de los posibles
falsos positivos (Tighe et al., 2013).
A pesar de la capacidades de multiplexación teórica de las plataformas, los paneles disponibles

parecen aprovechar solo una fracción de esta capacidad y rara vez superan los 20 analitos
individuales (Backen et al., 2009; Bastarache et al., 2014). Actualmente en el mercado hay
disponibles varios ensayos multiplex (Tabla 3) (Tighe et al., 2015). Sin embargo, de estos,
relativamente pocos han sido validados en aplicaciones de diagnóstico in vitro (IVD).
15
Introducción
Tabla 3. Ejemplos de ensayos multiplex disponibles comercialmente para una variedad de

indicaciones. FDA (U.S. Food and Drug Administration).
FORMATO
INDICACIONES ANALITO COMPAÑÍA PRODUCTO FDA
PLATAFORMA
Enfermedades +
INOVA ® Luminex
Autoinmunes Anticuerpos QUANTA Plex
Diagnostics xMAP
(lupus, celiaquía)
Immune Luminex +
Alergia Anticuerpos MyAllergyTest
Tech xMAP
Soporte sólido +
Múltiple (Ej. drogas) Proteínas Randox Biochip Array
plano
Perfil de proteínas de Soporte sólido -
Proteínas Quansys Q–PlexTM array
fase aguda plano
TM
FlowCytomix Citometría de -
Múltiple Proteínas eBioscience
Multiplex flujo
Enfermedades TM +
Focus Plexus Luminex
infecciosas Anticuerpos
Diagnostics Multiplexed xMAP
(EBV, HSV 1 y 2)
FDA: Food and Drug administration; EVB: virus Epstein-Barr; HSV: virus herpes simple 1 y 2
1.3. Anticuerpos
Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son el componente crítico de un

inmunoensayo ya que son los que ofrecen la sensibilidad y especificidad de detección del
analito de interés. Poseen una alta afinidad de unión por su correspondiente antígeno lo cual
los hace excelentes para el desarrollo de biosensores. Se ha demostrado que los anticuerpos
pueden ser inmovilizados sobre diversos soportes manteniendo su estructura y actividad en la
mayoría de los casos. Por tanto, para el desarrollo de cualquier inmunoensayo, el primer paso
es la búsqueda y generación de uno o más anticuerpos que reconozcan de forma específica al
analito.
Los anticuerpos utilizados en los inmunoensayos pueden ser policlonales o monoclonales. Los
anticuerpos policlonales son producidos por diferentes clones de linfocitos B en un animal
(conejo, cabra, oveja, etc) que ha sido inyectado con un inmunógeno. Como resultado los
mismos reconocen varios sitios (epitopos) de un mismo antígeno y son una mezcla
heterogénea de anticuerpos. Por otro lado, los anticuerpos monoclonales son producidos en
el laboratorio mediante cultivos de hibridomas o de forma recombinante en células de
mamíferos (Zhang and Shen, 2012) u otros sistemas de células superiores como levaduras,
células de insecto y plantas (Diamos et al., 2020). Para el desarrollo de métodos
inmunoenzimáticos, los anticuerpos monoclonales son preferibles a los policlonales debido a
que presentan una alta especificidad de unión, ya que reconocen un solo epitopo del
antígeno, y a que tienen una estructura homogénea y su producción puede ser escalada.
16
Introducción
Para su uso en inmunoensayos, los anticuerpos deben ser caracterizados por su especificidad
y afinidad, además de por las posibles reacciones cruzadas que pueda tener con otros analitos
relacionados con el de interés. Una pareja de anticuerpos para un ensayo tipo sándwich
consiste en dos anticuerpos que reconocen diferentes epitopos de un mismo antígeno. Esta
pareja debe de ser compatible, de forma que no haya impedimento estérico en el
reconocimiento (Gao et al., 2018).
1.3.1. Estructura de los anticuerpos
Existen distintos tipos de anticuerpos o isotipos basados en el tipo de cadena pesada que
posean. En mamíferos, se conocen cinco clases diferentes de isotipos que desempeñan
funciones diferentes: IgA, IgG, IgD, IgE e IgM. La IgG es la inmunoglobulina predominante en
humanos, constituyendo el 75% del total de las inmunoglobulinas presentes en el suero. En
humanos existen 4 subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 (Salfeld, 2007).
Estructuralmente, los anticuerpos contienen cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas

pesadas idénticas (50 kDa) y dos cadenas ligeras idénticas de menor tamaño (25 kDa). Cada
cadena pesada contiene un dominio variable (V H ) y tres dominios constantes (C H 1, C H2 y
C H 3) mientras que cada cadena ligera contiene solo un dominio variable (V L) y un
dominio constante CL. Las cadenas pesadas y ligeras se une entre sí mediante enlaces
disulfuro intracatenarios además de otras interacciones no covalentes (Fig. 5) (Frazer and
Capra, 1998). Las regiones variables de los anticuerpos se encuentran en el extremo amino
terminal de las cadenas, mientras que las regiones constantes están hacia el carboxilo
terminal.
17
Introducción
Figura 5. Esquema de la estructura de un anticuerpo tipo IgG. Se muestra la región variable y constante
del anticuerpo. FC: fracción constante; Fab: Fragmento de unión al antígeno. Imagen adaptada de Shen,
Rusling and Dixit, 2017.
Han sido descritas dos tipos de cadenas ligeras: Cκ (cadena ligera kappa) y Cλ (cadena ligera
lambda). Como consecuencia de que las cadenas ligeras son idénticas entre sí, en mamíferos
sólo un tipo de cadena ligera, κ o λ, está presente en el mismo anticuerpo. En cepas de
ratones de laboratorio, las cadenas ligeras lambda representan sólo el 5% de las cadenas
ligeras mientras que en humanos, las cadenas ligeras lambda son mucho más abundantes
(alrededor de 40%) (Salfeld, 2007).
La región variable de una cadena ligera y de una cadena pesada forman entre ellas el sitio de
reconocimiento del antígeno y como son cuatro cadenas, existen dos sitios de unión del
antígeno por anticuerpo, lo que determina que los anticuerpos de tipo IgG sean bivalentes. El
epítopo es el sitio del antígeno donse se une el anticuerpo, mientras que el paratopo es el
sitio del anticuerpo donde se une el antígeno. En el estudio molecular de los anticuerpos,
estos han sido divididos en dos regiones: los dominios de reconocimiento del antígeno (Fab) y
el dominio o fragmento cristalizable (Fc) (Fig. 5). Las regiones Fab son distintas en
composición, punto isoeléctrico y estructura física de la región Fc (Welch, Scoble, et al., 2017).
En las inmunoglobulinas aparece, además de las cuatro cadenas polipeptídicas básicas, un

componente glucídico que representa el 2-14 % del peso total de la molécula. Estos
carbohidratos se encuentran en la región Fc de los anticuerpos, específicamente en el dominio
CH2 (Yoo et al., 2002).
18
Introducción
Al igual que otras proteínas, los anticuerpos presentan grupos funcionales como carboxilo,
amino, hidroxilo, sulfhidrilo, alquilo y arilo (Maruani et al., 2015). Sin embargo, a través de
ingeniería genética han sido añadidos otros grupos funcionales a los anticuerpos, así como
también han sido obtenidos derivados de estos, entre los que podemos mencionar los
fragmentos de unión al antígeno (Fab), los anticuerpos de simple cadena de fragmento
variable (ScFv) y los dominios simples de anticuerpos (sdAb), entre otros.
1.4. Estrategias de inmovilización de un anticuerpo a una superficie
El método más simple de inmovilización de un anticuerpo a una superficie sólida como el

poliestireno o el oro, es mediante adsorción física, la cual ocurre debido a interacciones
hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals e interacciones π-π y electrostáticas (Jung, Jeong and
Chung, 2008). La adsorción pasiva de los anticuerpos es el método más empleado para el
desarrollo de inmunoensayos clínicos y de investigación, así como para la preparación de
partículas de oro con fines farmacológicos o diagnósticos (Jazayeri et al., 2016). La
inmovilización pasiva generalmente da como resultados que los anticuerpos queden
orientados al azar, pierdan su conformación nativa y en algunos casos su actividad. Además,
los anticuerpos pueden experimentar desplazamiento sobre las superficies debido a los
sucesivos pasos de lavados requeridos de los diferentes ensayos (Butler, 2000; Kausaite-
Minkstimiene et al., 2010).
La orientación correcta del anticuerpo en una superficie, lo que asegura su completa

funcionalidad, ocurre cuando la fracción constante de ambas cadenas pesadas interacciona
con la superficie de modo que los sitios de reconocimiento del antígeno quedan libres para la
actividad de detección (end on), mientras que la actividad de anticuerpo es parcial cuando uno
de los sitios de unión queda enmascarado y el otro queda libre (side on). Las otras
orientaciones posibles de los anticuerpos hacen que estos pierdan completamente su
actividad, ya que ambos sitios de unión al antígeno quedan interaccionando con la superficie
(head-on y lying-on) (Fig. 6) (Welch, Scoble, et al., 2017).
19
Introducción
Figura 6. Dimensiones de un anticuerpo y posibles orientaciones en una superficie tras una

inmovilización pasiva por adhesión. End on: la fracción constante de ambas cadenas están sobre la
superficie; head on: ambos sitios de unión al antígeno están sobre la superficie; side on: un sitio de
unión al antígeno y una fracción constante están sobre la superficie; lying on: tanto las fracciones
constantes como las variables están sobre la superficie. Los anticuerpos de tipo IgG son glicoproteínas
globulares en forma de Y de alto peso molecular (150 kDa) y dimensiones aproximadas de 14 x 10 x 4
nm. Imagen tomada de Crivianu-Gaita and Thompson, 2015.
La eficiencia de unión al antígeno de un anticuerpo que ha sido inmovilizado mediante

adsorción física a una superficie es muy baja, de forma que, aunque un anticuerpo posee dos
sitios de unión al antígeno, la relación de unión no supera el valor de 0,1 en situaciones
prácticas. Esta relación tan baja se debe al impedimento estérico en la superficie y a la
inadecuada orientación de los anticuerpos sobre ella (Xu, Lu and Williams, 2006). Por ello se
han estudiado diferentes condiciones para la optimización de la adsorción física de los
anticuerpos como son el pH, la concentración de sales y el tiempo de incubación,
observándose que a pesar que aumenta la densidad del anticuerpo en las superficies a pH
cercanos al punto isoeléctrico de este, la orientación resultante que predomina mantiene los
sitios de unión sobre la superficie en forma lying on (Zhao et al., 2012).
Las estrategias de inmovilización de un anticuerpo a una superficie pueden condicionar la

orientación específica o al azar del mismo. La orientación depende de la capacidad de
organización del anticuerpo, la cual puede ser dirigida a través de grupos reactivos sobre la
superficie, sobre el anticuerpo o sobre ambos. La orientación adecuada de un anticuerpo no es
un objetivo fácil de lograr dado que los grupos reactivos de este no son únicos en la molécula.
Además, en el proceso de inmovilización de los anticuerpos es necesario evitar cambios en su
estructura para mantener su actividad y especificidad de unión al antígeno. Por este motivo las
estrategias de unión a las superficies deben contemplar condiciones medias, como pH neutro y
baja concentraciones de sales, y ser compatibles con los diferentes materiales de las
superficies de ensayo.
20
Introducción
Con el objetivo de disminuir los efectos adversos de la inmovilización pasiva de los

anticuerpos, se han trazado diferentes estrategias para que mantengan su capacidad de unión
al antígeno y su especificidad, además de aumentar su densidad sobre las superficies. Entre
estas estrategias están las que solamente modifican la superficie permitiendo así una mayor
densidad de los anticuerpos sobre ellas. En otros casos, la estrategia consiste en la
modificación química, tanto del anticuerpo como de la superficie, que permita la formación de
enlaces covalentes entre ambos. Por último, existen opciones en las que se utilizan reacciones
de afinidad entre compuestos en la superficie y anticuerpos modificados ya sea de forma
química o mediante ingeniería (Dixit, 2011; Shen, Rusling and Dixit, 2017; Welch, Scoble, et al.,
2017; Vashist and Luong, 2018a).
1.4.1. Modificación de las superficies
En el desarrollo de los inmunoensayos intervienen dos elementos fundamentales. En primer

lugar, la reacción antígeno-anticuerpo y, en segundo lugar, la superficie de ensayo. Los
inmunoensayos han sido desarrollados en diversas superficies tales como oro, vidrio, cobre,
partículas magnéticas, silicona y las más comunes, las de polímeros tales como poliestireno y
polivinilo , entre otros (Yang et al., 2013; Damborska et al., 2017).
Tradicionalmente, los inmunoensayos son realizados en placas de poliestireno debido a que

esta superficie es barata, estable y fácilmente reproducible con precisión. El poliestireno es
una superficie hidrofóbica que permite la adsorción de una amplia variedad de proteínas,
entre ellas los anticuerpos. Sin embargo, cuando las superficies son más hidrofílicas hay un
incremento en la unión de los anticuerpos a esta, aumentando la densidad de los anticuerpos
en la superficie y disminuyendo la cantidad de proteína desnaturalizada.
Con el objetivo de mejorar la inmovilización de los anticuerpos a las superficies, se

desarrollaron diferentes métodos para la modificación específica de estas. Estos métodos
pueden ser utilizados como único paso de mejora de la inmovilización, o más comúnmente,
pueden ser utilizados en combinación con la modificación del anticuerpo para permitir su
anclaje a la superficie de forma más eficiente. Entre los métodos más utilizados para la
modificación de las superficies destacan los tratamientos con gas ionizado, la química en
mojado, las monocapas de silano, la radiación ultravioleta, los polímeros impresos
molecularmente, los sustratos tridimensionales y las monocapas auto ensambladas, entre
otros (Goddard and Hotchkiss, 2007; Welch, Scoble, et al., 2017).
21
Introducción
1.4.1.1. Tratamientos con gases ionizados
Entre los tratamientos con gases ionizados podemos mencionar el plasma, la descarga corona
y el tratamiento de llama. Estos métodos permiten la funcionalización de sustratos ya
existentes, disminuyendo la hidrofobicidad de los mismos y reduciendo de esta manera la
desnaturalización de las proteínas unidas (Awaja et al., 2009). Estos métodos constituyen un
punto de partida para tratamientos químicos posteriores que permitirían la unión covalente de
proteínas.
El plasma es un estado de alta energía de la materia en el que un gas es parcialmente ionizado

en partículas cargadas, electrones y moléculas neutras. El tratamiento superficial por plasma
proporciona una modificación a escala nanométrica sin usar solventes o generar residuos
químicos y con menos degradación del material que algunos tratamientos químicos. El tipo de
funcionalización varía según el gas precursor del plasma (Ar, N2, O2, H2O, CO2, NH3) y los
parámetros de proceso (presión, potencia, tiempo y flujo de gas). Este tratamiento se ha
utilizado sobre muchos polímeros entre los que destacan el poliestireno, el polipropileno, el
fluoruro de polivinilideno (PVDF) y el polietileno tereftalato (PET) (Thissen, 2016). Los gases
reactivos empleados eliminan o modifican los grupos básicos de la superficie añadiendo
grupos funcionales que influyen en las características hidrofílicas y la reactividad bioquímica
(Bilek and McKenzie, 2010).
El método de descarga corona es un proceso simple, de bajo coste y continúo en el cual una
corriente inducida de aire ionizado bombardea la superficie polimérica. Introduce
superficialmente productos de oxidación, pero no es útil como técnica para introducir
funcionalidades específicas para la bioconjugación. Por su parte, el método de tratamiento de
llama, bombardea la superficie con aire ionizado generando un amplio espectro de productos
oxidados y, al igual que la descarga corona, no activa la superficie específicamente. La
diferencia es que en este método el oxígeno reactivo se genera quemando una mezcla de
gases rica en este elemento (Fabbri and Messori, 2017).
1.4.1.2. Monocapas auto ensambladas
La formación de monocapas auto ensambladas (Self-assembled monolayers, SAM) constituye

otro método de modificación química de la superficie que puede mejorar la adsorción de los
anticuerpos o producir grupos funcionales sobre esta, los cuales a su vez pueden ser utilizados
posteriormente para una inmovilización covalente de los anticuerpos. Debido a su disposición
ordenada bien definida, al buen transporte de electrones, a sus propiedades eléctricas
22
Introducción
controlables y a la disponibilidad de grupos funcionales, las SAMs han ganado una importancia
significativa para la inmovilización de biomoléculas (Kamra et al., 2016).
Las SAMs generalmente se forman con moléculas de cadenas hidrocarbonadas que contienen
grupos funcionales activos en sus extremos. Uno de estos grupos permitiría la unión de la
molécula a la superficie y el otro quedaría expuesto para la unión de las proteínas. Las propias
cadenas hidrocarbonadas una vez que se unan a la superficie promueven el auto ensamblaje, y
la unión entre las mismas permite la estabilización de las monocapas debido a interacciones
hidrofóbicas entre las cadenas (Hasan and Pandey, 2015).
Las monocapas auto ensambladas han sido empleadas para cubrir superficies de varios
materiales. Entre las opciones disponibles es posible el recubrimiento de superficies de óxido
con silanos, de superficies de óxido de aluminio con ácidos grasos o de superficies metálicas
con moléculas a base de azufre, como tioles o sulfuros (Welch, Scoble, et al., 2017).
El ácido 11-mercaptoundecanoico (11-MUA) ha sido utilizado en varios estudios para la

creación de monocapas auto ensambladas sobre superficies de oro, quedándose el grupo
COOH expuesto en la superficie. Posteriormente, los anticuerpos se unen a estas superficies
vía carbodiimida/N-hidroxisuccinimida quedando de esta manera unidos covalentemente a
través de un enlace tipo amida (Ahmad and Moore, 2012; Lebec et al., 2013).
1.4.1.3. Química en mojado
Un método clásico de uso actual incluye los medios químicos húmedos, donde se permite que
tengan lugar reacciones químicas entre un compuesto disuelto en una solución orgánica y la
superficie del polímero, generándose grupos funcionales reactivos en la superficie (Karaman et
al., 2016). La aminólisis y la hidrólisis alcalina o ácida representan casos típicos. Este
procedimiento aporta la ventaja de que el tratamiento es penetrante pudiendo activar
materiales porosos tridimensionales, mientras que el plasma y otras técnicas de modificación
superficial con fuentes de energía presentan ciertas limitaciones. Además, esta tecnología
proporciona superficies controladas y estables en cuanto a cantidad de grupos funcionales y
tipología requerida, manteniendo la transparencia en el caso de las placas de ELISA (Del Prado
et al., 2012).
Dentro de los posibles tratamientos químicos en mojado para la modificación superficial del
poliestireno podemos citar la clorosulfonación, que produce de manera muy selectiva grupos
clorosulfonilo en la superficie que son químicamente estables en condiciones ambientales
(temperatura, humedad y aireación) normales y que permiten la posterior reacción con aminas
23
Introducción
alifáticas (sulfonamidación) en condiciones muy suaves (bajas temperaturas y en medio

acuoso) y selectivas de manera cuantitativa (Fig. 7) (Del Prado et al., 2012).
Figura 7. Representación gráfica de la modificación del poliestireno. El poliestireno modificado con

grupos clorosulfonilo, reacciona con alcanos di sustituidos que contengan un grupo amino alifático
primario, para preparar derivados de poliestireno activados a través de enlaces sulfonamidas. R es un
grupo funcional seleccionado del grupo que comprende un amino (NH 2) o un carboxílico (COOH), X es la
cadena carbonada, que puede tener entre 0 y 12 carbonos.
Del Prado et al., (2012) han descrito la preparación de superficies de poliestireno

transparentes activadas con grupos clorosulfonilos y posteriormente aminadas con
etilendiamina. Esta superficie fue probada exitosamente en un ensayo tipo ELISA de detección
de IL6 humana, donde el reactivo utilizado para el enlace entre el anticuerpo y la superficie fue
el glutaraldehído, obteniéndose resultados satisfactorios en comparación con el ELISA
realizado sobre una superficie estándar.
Recientemente, ha sido publicado el tratamiento de 10 placas distintas mediante un método

de química en mojado empleando el complejo de cromo [Cr(OH)6]3- tamponado con
etilendiamina para mejorar la inmovilización de anticuerpos y el rendimiento del ELISA (Welch,
Lebot, et al., 2017). Mediante análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) y
usando como modelo un anticuerpo anti EGFR, estos autores demostraron la unión del doble
de anticuerpo en las placas tratadas al compararlas con las placas sin tratar, aumentando la
señal del ELISA tres veces, lo que indica una mejor orientación del anticuerpo. Posteriormente
Welch et al., (2016), optimizaron el proceso variando la sal metálica y las proporciones de la sal
del tampón. El complejo optimizado (hexahidrato de perclorato de cromo 1: 1 etilendiamina)
fue utilizado para mejorar los límites de detección de un ELISA de cuantificación del factor de
necrosis tumoral alfa bovino (TNFα), demostrando una mejora en un orden de magnitud con
respecto a las placas no tratadas.
24
Introducción
1.4.2. Inmovilización covalente de los anticuerpos
La unión covalente de los anticuerpos de captura a la superficie asegura una robusta

inmovilización de los mismos, mejorando de esta manera su densidad y evitando su pérdida
durante los pasos consecutivos del ensayo. La importancia de inmovilizar los anticuerpos a las
superficies de los ensayos para lograr una mayor sensibilidad de los mismos ha sido
demostrada en varias plataformas diagnósticas (Das et al., 2010; Dixit et al., 2010).
En el proceso de inmovilización covalente de un anticuerpo a una superficie ocurre una

reacción química entre los grupos reactivos de la superficie y los grupos reactivos libres de los
anticuerpos. Han sido empleadas distintas modificaciones del poliestireno que permiten el
enlace covalente de distintas moléculas a la superficie del plástico. Las estrategias de
inmovilización covalente de los anticuerpos a las superficies son caracterizadas atendiendo a la
reacción química implicada en el proceso. Entre estas pueden distinguirse aquellas que
involucran los grupos amino libres del anticuerpo o los grupos carboxilo, las que involucran los
grupos sulfihidrilos, las reacciones usando las glicosilaciones propias del anticuerpo, las
reacciones a través del sitio de unión a nucleótidos de los anticuerpos y más recientemente,
las reacciones realizadas a través de química clic (Goddard and Hotchkiss, 2007)
En la Tabla 4 se muestran algunos de los grupos reactivos químicos (cross-linking) utilizados,

así como el grupo funcional diana del anticuerpo implicado en la inmovilización (Vashist and
Luong, 2018a).
25
Introducción
Tabla 4. Reactivos usados en la inmovilización de los anticuerpos a las superficies

relacionado con el grupo funcional blanco.
GRUPO FUNCIONAL
REACTIVIDAD DIANA EN EL GRUPO QUÍMICO REACTIVO
ANTICUERPO
 NHS ester
 Imidoéster
Reacción amina -NH2  Epóxido
 Isotiocianato
 Aldehído
Reacción carboxilo –
-COOH  Carbodiimida (EDC)
amina
 Maleimida
 Piridildisulfida
Reacción sulfhidrilo -SH
 Tiosulfonato
 Haloacetilo (bromo o yodo)
Reacción aldehído
 Hidrazida
(Ej. azúcares -CHO
 Alcoxiamina
oxidados)
Reacción hidroxilo
-OH  Isocianato
(no acuoso)
Reacción azida -N3  Fosfina
Los entrecruzantes o grupos químicos reactivos son especies químicas que contienen grupos
altamente reactivos en uno o ambos extremos y, por tanto, son capaces de crear enlaces entre
grupos funcionales dados. Estos entrecruzantes facilitan la reacción de los grupos funcionales
deseados de un anticuerpo mediante la creación de intermediarios altamente reactivos que
posteriormente pueden unirse a los grupos funcionales de la superficie. La elección del
enlazador depende estrictamente de la reactividad química de los grupos funcionales
seleccionados en el anticuerpo y la superficie deseada. Estos entrecruzantes pueden
clasificarse en homo y hetero bifuncionales. Los entrecruzantes homo bifuncionales tienen los
mismos grupos químicamente reactivos en ambos extremos y reaccionan con las mismas
entidades en las moléculas diana, mientras que los entrecruzantes hetero bifuncionales tienen
dos centros químicamente reactivos diferentes en cada extremo (Dixit, 2011).
Existe una gran variedad de entrecruzantes comercialmente disponibles en diferentes

combinaciones. Entre los homo-bifuncionales podemos citar la amina -amina (glutaraldehído)
y el sulfhidrilo-sulfhidrilo, mientras que la amina-sulfhidrilo y la amina-carboxilo (carbodiimida)
se encuentran entre los hetero-bifuncionales. Además, están disponibles otros entrecruzantes
bifuncionales específicos tales como sulfhidrilo - hidroxilo, amina-carbohidrato y sulfhidril –
carbohidrato (Dixit, 2011).
26
Introducción
1.4.2.1. Uniones a la superficie utilizando los grupos NH2 y COOH de los anticuerpos
Los grupos amino y carboxilo pueden encontrarse de forma aleatoria en cualquier sitio de la
estructura de un anticuerpo y generalmente se encuentran expuestos en la superficie de la
molécula debido a su naturaleza polar. Los grupos amino vienen dados por el aminoácido
lisina, que posee una amina primaria, mientras que los grupos carboxilo los ofrecen el
aspartato y el glutamato. Debido a la prevalencia de estos grupos a través de toda la molécula
del anticuerpo, estos son los más utilizados para la inmovilización covalente de los anticuerpos
a diferentes superficies. Sin embargo, esta misma característica hace que los anticuerpos
inmovilizados tengan la probabilidad de no adoptar la orientación correcta y en algunas
ocasiones perder su funcionalidad. No obstante, permiten una mayor densidad del anticuerpo
en las superficies, así como una inmovilización permanente gracias a los enlaces covalentes
que se forman.
Muchos de los enlaces covalentes formados entre los anticuerpos y la superficie, se basan en
la generación de grupos amino, carboxilo y epoxi sobre la superficie mediante diferentes
métodos. Posteriormente, el anticuerpo se une a estos grupos a través de reacciones químicas
usando compuestos hetero u homo bifuncionales a través de sus grupos NH2 y COOH. Las
reacciones químicas más ampliamente utilizadas que involucran estos grupos funcionales del
anticuerpo utilizan como enlazador homo bifuncional el glutaraldehído (NH2-NH2) y como
enlazador hetero bifuncional la carbodiimida (NH2-COOH).
La unión hetero bifuncional usando 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida hidrocloruro

(EDC) puede ser utilizada para superficies que tienen expuestos grupos aminos libres
formándose un enlace covalente de tipo amida con los grupos carboxilo del anticuerpo
(Goddard and Hotchkiss, 2007; Dixit et al., 2011) o viceversa (Fig. 8). En estas reacciones ha
sido generalizado el uso de la carbodiimida en combinación con N-hidroxisuccinimida (NHS) ya
que esta favorece el proceso de bioconjugación debido a que estabiliza el intermediario que se
forma en la reacción y se une eficazmente a los grupos amino.
27
Introducción
Figura 8. Representación esquemática de la unión covalente de un anticuerpo a una superficie aminada

usando como enlazador EDC. El grupo carboxilo del anticuerpo reacciona con la carbodiimida del EDC
generando un intermediario derivado de la urea, un éster activo, que reacciona a su vez con los grupos
amino de la superficie. Imagen adaptada de Dixit (2011).
Por su parte, el glutaraldehído ha sido utilizado como un enlazador homo bifuncional pues
permite la unión del anticuerpo a la superficie a través de los grupos amino del anticuerpo y
los de la superficie. Este método ha sido exitosamente utilizado para la inmovilización de
diferentes anticuerpos y el uso de estas superficies en ensayos tipo ELISA (Gunda et al., 2014)
(Fig. 9).
Figura 9. Representación esquemática de la unión covalente de un anticuerpo usando glutaraldehído

como enlazador entre los grupos amino del anticuerpo y los de la superficie Imagen adaptada de Dixit
(2011).
Las superficies activadas con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES), las cuales tienen expuestos
grupos amino libres en la superficie, han sido ampliamente utilizadas para la inmovilización
covalente de los anticuerpos a las superficies. Este procedimiento implica la generación de
grupos hidroxilo en la superficie de las placas a través de un tratamiento con KOH seguido de
plasma de oxígeno. Estos grupos hidroxilo se unen a su vez con los grupos etoxi del APTES. lo
que da como resultado una superficie activada con APTES que posee grupos amino libres
28
Introducción
expuestos. Posteriormente, sobre estas superficies pueden ser utilizado el glutaraldehído o la

carbodiimida (Dixit et al., 2011; Gunda et al., 2014).
Dixit et al. (2011), funcionalizaron una superficie con APTES y luego utilizaron la carbodiimida/
N-hidroxisuccinimida para la unión covalente del anticuerpo dejando este anclado a la
superficie mediante una unión covalente a través de un enlace de tipo amida (Fig. 10). Este
procedimiento aumentó la sensibilidad del ensayo ELISA tomado como modelo, la detección
de la fetuína A humana, un biomarcador del carcinoma hepatocelular y de la ateroesclerosis,
unas 16 veces en comparación con la sensibilidad del kit comercial para esta proteína.
Figura 10. Inmovilización química de un anticuerpo a través de una unión covalente. La superficie de una
placa de ELISA es tratada con KOH para posteriormente unir APTES y dejar expuestos grupos amino
libres en la superficie. El anticuerpo tratado con 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) hidrocloruro de
carbodiimida (EDC) y sulfo N-hidroxisuccinimida (SHNS) se añade a la superficie formándose un enlace
amida entre el grupo carboxilo de los anticuerpos con los grupos amino de la superficie. Finalmente se
lleva a cabo un ELISA sándwich sobre las placas activadas (Dixit et al., 2011).
Los soportes sólidos con grupos epóxido en la superficie también son utilizados ampliamente
para la inmovilización de anticuerpos. Un epóxido es un éter cíclico que contiene un átomo de
oxígeno en el anillo y su estructura deformada lo hace altamente reactivo en comparación con
otras moléculas de éter. Este grupo es muy reactivo frente a las aminas secundarias de los
aminoácidos, en particular la histidina, y los sulfhidrilos de un anticuerpo. La fuerte reactividad
de un epóxido hacia los grupos amina permite la inmovilización de un anticuerpo a través de
regiones ricas en lisina o secuencias repetidas de histidina (HIS). Esta inmovilización no exige la
29
Introducción
presencia de un entrecruzante y permite utilizar anticuerpos completos o fragmentos de este

(Ehlers et al., 2007).
1.4.2.2. Uniones covalentes a través de los grupos SH creando enlaces tipo tiol
Los anticuerpos poseen grupos sulfhidrilos en forma de puentes disulfuro que permiten su
estabilidad estructural (Liu and May, 2012). La reducción de dichos puentes genera grupos
sulfhidrilo libres que pueden reaccionar con compuestos como las maleimidas (Billah et al.,
2010), disulfuros de piridilo (Iwasaki, Omichi and Iwata, 2008) o epóxidos, los cuales a su vez
pueden estar expuestos en la superficie del ensayo. Para la reducción química de estos grupos
han sido usados generalmente agentes reductores como son el tris (2- carboxietilo) fosfina
(TCEP) o el 2- mercaptoetilamina (2-MEA) (Trilling, Beekwilder and Zuilhof, 2013). De igual
manera, la fotorreducción mediante excitación con luz ultravioleta de λ= 260 nm es otra vía
que ha sido empleada para la reducción de los puentes disulfuro de los anticuerpos (Funari et
al., 2016). También ha sido descrita la incorporación de grupos tiol a los anticuerpos través de
los grupos amina usando el 2-iminotiolano, evitando de esta manera la pérdida de actividad
del anticuerpo (Gauvreau et al., 2004) (Fig. 11).
Figura 11. Representación esquemática de la unión covalente de los anticuerpos a diferentes superficies
a través de los grupos sulfhidrilo. a) Inmovilización de un anticuerpo a una superficie de poliestireno
activada con maleimida a través de la formación de un enlace tioéter. b) Unión de un anticuerpo con los
enlaces disulfuro reducidos, usando TCEP o 2-MEA, a una superficie de oro.
La reducción de los puentes disulfuro que suele ir dirigida a la región bisagra, puede hacer una
reducción no deseada de los demás puentes disulfuro del anticuerpo que conforman la
estructura terciaria de este, creando fragmentos de anticuerpos que no son capaces de
reconocer al antígeno o provocando un efecto de impedimento estérico en la zona de
30
Introducción
reconocimiento (Karyakin et al., 2000). Sin embargo, cabe destacar que algunos de estos
fragmentos pueden mantener su actividad en la superficie del sensor (Sharma and
Mutharasan, 2013).
Para controlar mejor este proceso se han construido fragmentos de anticuerpos añadiéndoles
grupos sulfhidrilo de forma específica mediante ingeniería genética (Hortigüela et al., 2015).
De este modo, estos autores fusionaron un péptido conteniendo el aminoácido cisteína a un
anticuerpo en el extremo distal de su unión al antígeno y usaron soportes con maleimida,
permitiendo así la unión covalente del anticuerpo a la superficie, además de su correcta
orientación (Fig. 11a) (Hortigüela and Wall, 2013).
La reducción de los puentes disulfuro ha sido ampliamente utilizada debido a la fuerte

interacción que se establece entre el oro y los grupos tiol libres del anticuerpo, por lo que ha
sido una estrategia de inmovilización útil para sustratos de oro y ampliamente utilizada
también en la obtención de nanopartículas (Fig. 11b) (Jazayeri et al., 2016).
1.4.2.3. Uniones covalentes a través de los grupos carbohidratos
Los grupos carbohidratos presentes en la región Fc, específicamente en el dominio CH2, de los
anticuerpos han sido utilizados como una vía para la inmovilización orientada de estos a las
superficies (Adak et al., 2014). El uso de peryodato de sodio sobre el grupo hidroxilo de los
carbohidratos genera grupos aldehídos que pueden reaccionar con una superficie aminada o
con hidracinas teniendo como resultado la unión de los anticuerpos de forma orientada en la
superficie (Duval, Van Beek and Zuilhof, 2015). Sin embargo, este método tiene la desventaja
de que aminoácidos como la metionina, el triptófano y la histidina presentes en los
anticuerpos, pueden ser oxidados durante el tratamiento con peryodato afectando la sitio-
especificidad del método y posiblemente el reconocimiento del antígeno. Además, los grupos
aldehídos formados en las glicosilaciones pueden reaccionar con los aminos libres y los grupos
tiol del anticuerpo, resultando en interacciones entre anticuerpos que provocan la agregación
y pérdida de actividad de estos (Bertolotti-Ciarlet et al., 2009; Ji et al., 2009).
Se han publicado numerosos trabajos sobre el uso del método de inmovilización con ácido
borónico. Esta reacción implica la modificación de los grupos dioles de los N-glicanos de los
anticuerpos mediante la reacción de estos con ácidos borónicos adheridos a las superficies.
Estos últimos reaccionan con 1,2 dioles para formar ésteres de boronato (Lim and Ahmed,
2015). Entre las ventajas de este método es destacable el hecho de dejar los sitios de unión
disponibles para la unión del antígeno (inmovilización orientada o aleatoria). Además, el
método consta de un solo paso sin modificación previa de los anticuerpos y es relativamente
31
Introducción
económico. Varios estudios comparativos han sugerido que la sensibilidad de detección de

antígeno más alta se ha logrado cuando los anticuerpos han sido inmovilizados con ácidos
borónicos (Duval, Van Beek and Zuilhof, 2015).
A pesar de sus ventajas, este método no ha sido ampliamente extendido. Probablemente esto
esté asociado a los diversos requerimientos de la técnica que pueden provocar que no
aumente la sensibilidad del ensayo. Entre estos se encuentra la preparación de las superficies
con ácido borónico, que requiere de varios pasos químicos, la búsqueda de un anticuerpo con
N-glicanos adecuados, así como las condiciones de unión del anticuerpo a la superficie que
permitan como resultado una inmovilización efectiva y orientada del anticuerpo,
asegurándose de que este no sea expulsado de la superficie por la competencia de dioles o las
condiciones de regeneración (Duval, Van Beek and Zuilhof, 2015).
1.4.2.4. Uniones de los anticuerpos a través del sitio de unión a nucleótidos
El sitio de unión a nucleótidos es una región conservada del dominio variable de todos los
isotipos de los anticuerpos, y ha sido utilizado para la inmovilización covalente y orientada de
estos a las superficies de ensayo. Esta región es rica en aminoácidos aromáticos específicos y
tiene afinidad con el ácido indol-3-butírico, con una Kd en el rango 1-8 µM, dependiendo del
isotipo del anticuerpo. Varios estudios han demostrado que la exposición a la luz ultravioleta
(λ=254 nm) permite la unión entre el anticuerpo y el ácido indol-3-butírico, el cual es fijado
previamente a la superficie. Esta inmovilización del anticuerpo no afecta el sitio de unión al
antígeno y resulta en una correcta orientación de este en la superficie, observándose por
consiguiente un aumento de la sensibilidad de 8 veces comparado con la adsorción física
(Alves, Kiziltepe and Bilgicer, 2012).
1.4.2.5. Uniones de los anticuerpos utilizando química clic
El término de reacción química clic (Click Chemistry, CC) introducido por Sharpless y
colaboradores (Kolb, Finn and Sharpless, 2001) define una nueva metodología sintética que
permite la preparación de una diversidad de estructuras complejas mediante la unión de
moléculas sencillas a través de un número selecto de reacciones muy eficientes. Una reacción
es considerada de tipo clic si reúne ciertos requisitos como son: i) simplicidad experimental; ii)
tolerancia frente a una amplia variedad de grupos funcionales y condiciones de reacción; iii)
selectividad y especificidad regional; iv) formación del producto con elevado rendimiento; v)
alta economía atómica; vi) insensibilidad al agua o al oxígeno; y vii) aislamiento sencillo del
producto final evitando purificaciones cromatográficas.
32
Introducción
Si bien existe un número considerable de reacciones químicas que reúnen todos o varios de
estos requisitos, se han destacado especialmente cuatro tipos de transformaciones químicas
que encajan a la perfección bajo el concepto de reacciones clic : 1) reacciones de cicloadición,
especialmente las 1,3-dipolares y las hetero Diels-Alder; 2) reacciones de sustitución
nucleófilica con apertura de anillos tensionados tales como epóxidos, aziridinas, sulfatos, iones
aziridinio e iones episulfonio; 3) reacciones de condensación de compuestos carbonílicos,
como la formación de éteres de oxima, hidrazonas y heterociclos aromáticos; y 4) reacciones
de adición a enlaces múltiples C-C, como por ejemplo: epoxidación, dihidroxilación,
aziridinación, y adiciones de haluros nitrosilo y sulfonilo.
En 2003, Wang et al., informaron que la reacción de cicloadición azida-alquino [3 + 2]

catalizada por cobre (I) (CuAAC), podía emplearse como una nueva clase de reacción clic para
las conjugaciones biológicas de forma rápida y confiable (Wang et al., 2003) (Fig. 12a). Debido
a que los grupos azida y alquino no reaccionan con los residuos de proteínas u otras
biomoléculas, esta reacción provocó un gran impacto y ha sido utilizada ampliamente como
una metodología de unión rápida y específica de moléculas de interés (Li and Zhang, 2016).
Usando la reacción entre un grupo alquino y un grupo azida, Finetti et al. (2016) inmovilizaron
un anticuerpo que se unía a través de un grupo azida a la superficie de una partícula de oro
activada con grupos alquino, catalizando dicha reacción con cobre. Usando esta reacción ha
sido inmovilizado sobre electrodos un anticuerpo anti E. coli (Svalova et al., 2020).
Dado que los metales exógenos utilizados para catalizar estas reacciones podrían causar
efectos citotóxicos de leves a graves en aplicaciones biomédicas, ha sido recomendado el uso
de reacciones químicas sin catalizador metálico (Dai et al., 2015). Estas nuevas reacciones sin
catalizadores metálicos han sido denominadas “bioortogonales” y constituyen una subclase de
reacción cuyos componentes son inertes en medios biológicos (Jewett and Bertozzi, 2010).
Entre las reacciones bioortogonales más utilizadas podemos citar la reacción de Diels-Alder de
demanda inversa de electrones IEDDA (del inglés, Inverse Electron-Demand Diels–Alder) (Fig.
12b) y la reacción de cicloadición entre una azida y un ciclooctino conocida como reacción
SPAAC azida-alquino (del inglés, Strain-promoted Alkyne-Azide Cycloaddition; Jewett and
Bertozzi, 2010) (Fig. 12c).
33
Introducción
Figura 12. Reacciones de conjugación de tipo química clic. a) Reacción de cicloadición azida-alquino
catalizada por cobre (CuAAC); b) reacción inversa de demanda de electrones Diels-Alder entre la
tetracina y un trans-alqueno; c) Reacción de cicloadición entre el dibenzociclooctino (DBCO) y un azida
no dependiente de cobre.
Las reacciones bioortogonales han sido utilizadas en varios campos de investigación como la
bioconjugación (Chio and Bane, 2020), la búsqueda de nuevos fármacos (Jiang et al., 2019; El
Azab et al., 2021), la radioquímica, el trabajo con polímeros (Arslan and Tasdelen, 2019) y la
biomedicina (Mushtaq, Yun and Jeon, 2019). Con este tipo de reacciones, la química clic, ha
dado lugar a un cambio de paradigma, que muestra que las reacciones químicas artificiales
pueden ocurrir tanto en la superficie como en el interior celular.
La química clic in vitro permite marcar de forma específica proteínas dianas celulares y realizar
estudio de fármacos en células vivas. Además, los lípidos y proteínas de la membrana celular
podrían marcarse selectivamente con química de clic in vitro y las células podrían adherirse
entre sí. Asimismo, la química clic in vivo permite la obtención de imágenes moleculares y la
administración de fármacos de forma eficiente y eficaz para el diagnóstico y la terapia. Por su
parte, la química clic ex vivo se puede utilizar para desarrollar herramientas moleculares para
34
Introducción
comprender el desarrollo de tejidos, el diagnóstico de enfermedades y el seguimiento

terapéutico (Kim and Koo, 2019).
La reacción de cicloadición bioortogonal basada en la tetracina ha sido usada para el

radiomarcaje de moléculas de anticuerpos (Rossin et al. 2010; Devaraj et al., 2008). En esta
reacción, la tetracina reacciona con un trans-cicloocteno (TCO) formando un enlace
dihidropiridacina sin la presencia de un catalizador, con una cinética de reacción ultra rápida (>
800 M-1s-1). García et al. (2018), acoplaron un anticuerpo con TCO para posteriormente hacer
un radiomarcaje con Tetracina-Tecnecio99m y usar estos anticuerpos radiomarcados en estudios
de imágenes in vivo en ratones.
En la inmovilización de anticuerpos a diferentes superficies han sido utilizadas las reacciones

bioortogonales, como la reacción de Diels-Alder. Sin embargo, los grupos funcionales son
introducidos en los anticuerpos a través de los grupos amino de las lisinas o a través de los
grupos tiol de las cisteínas, lo que hace que la inmovilización no sea orientada (Trilling,
Beekwilder and Zuilhof, 2013). Por otra parte, diferentes variantes de ciclooctinos han sido
usadas para la funcionalización y/o bioconjugación. Por ejemplo, Witte et al. (2012),
prepararon VHH de anti-GFP con grupos azida o ciclooctino en el carbono terminal y utilizaron
su pareja de reacción para su anclaje a la superficie.
1.4.3. Inmovilización de los anticuerpos a las superficies por afinidad o inmovilización sitio-
específica
La inmovilización por afinidad ocurre cuando un anticuerpo puede ser capturado

específicamente a través de una región deseada. Estas estrategias incluyen el uso de
biomoléculas afines como son la biotina y la estreptavidina, la afinidad de la proteína A, G y L
por el Fc de los anticuerpos, la afinidad de dominios de las proteínas por sus sustratos, etc.
Esta inmovilización tiene la ventaja de que puede introducir un alto grado de orientación del
anticuerpo, por lo que la región de reconocimiento del antígeno estaría siempre
correctamente posicionada.
La afinidad consiste en una fuerte interacción entre dos moléculas estabilizada por múltiples
enlaces. Si un tag tiene una fuerte afinidad hacia otra molécula y se une a esta con una
especificidad significativamente alta, se podría definir como un tag de afinidad. Los tags han
sido ampliamente utilizados para la inmovilización de anticuerpos (Arnau et al., 2006) ya que
pueden ser introducidos en las moléculas de estos ya sea química o genéticamente (Arnau et
al., 2006; Nogi et al., 2008). Se han desarrollado numerosos péptidos que pueden funcionar
como tags y que tienen alta afinidad por diversos materiales. Los tags comerciales más
35
Introducción
ampliamente utilizados son la biotina, el tándem de 6-10 histidinas, y la secuencia del péptido
FLAG (Cho et al., 2007; Jouybari et al., 2018).
1.4.3.1. Inmovilización de los anticuerpos a través de la unión avidina-biotina
La biotina es una vitamina soluble conocida como vitamina B7, que participa en la
gluconeogénesis. La alta afinidad de la biotina por la avidina (Kd ≈ 10-15 M) y la prácticamente
irreversible unión entre ambas (Holmberg et al., 2005), la convierte en uno de los tags más
utilizados en diversos ensayos biológicos. Los anticuerpos pueden ser biotinilados de forma
química fácilmente (usando N-hidroxisuccinimida biotina) y pueden unirse posteriormente a la
avidina o estreptavidina presente en la superficie de microtitulación. Este proceso de
biotinilación es al azar, y se unirá a los grupos aminos expuestos del anticuerpo que se
encuentran en toda su estructura. No obstante, otro grupo de investigadores (ver Cho et al.,
2007) han biotinilado los anticuerpos dirigiendo esta reacción, vía maleimida, a los grupos SH
de los puentes disulfuro. Estos autores obtuvieron una mejora de dos veces de la
inmovilización con respecto a la utilizada usando anticuerpos unidos a biotina vía grupos
amino.
Sin embargo, debido a la multivalencia de la avidina (es capaz de unirse a 4 moléculas de

biotina), cuando se utiliza para inmovilizar anticuerpos, se obtiene una alta densidad de los
mismos en la superficie lo que puede provocar un alto grado de impedimento estérico
(Kolenko et al., 2009). Se han obtenido moléculas de estreptavidina a las que se les ha
disminuido genéticamente su afinidad por la biotina con el objetivo de disminuir el estrés
estérico entre anticuerpos y mejorar la inmovilización de estos (Jouybari et al., 2018).
1.4.3.2. Inmovilización de anticuerpos a través de péptidos de unión específica a materiales
Recientemente, se han desarrollados péptidos que se unen de forma específica a

determinados sustratos (como proteínas y metales) que son introducidos químicamente o
mediante ingeniería genética en los anticuerpos o proteínas y pueden mejorar la orientación
de estos en las superficies de ensayo. Estos péptidos son específicos para una amplia gama de
materiales y ha sido posible su desarrollo gracias a su búsqueda mediante librerías de fagos
(Pande, Szewczyk and Grover, 2010). Entre los péptidos de unión a materiales podemos citar
los específicos del poliestireno [PS-tag, (Tang et al., 2013)] y poliestireno hidrófilo (Phi-PS)
[PS19-1 y PS19-6 (Kumada et al., 2010)], los del silicio [Si-tag (Ikeda et al., 2009)], los de
portaobjetos de vidrio o resina de sílice [R9 (Fuchs and Raines, 2009)], los de poli (metacrilato
de metilo) (PMMA) [c02, PM-OMP259 PMMA-tag (Kumada et al., 2012)], los de policarbonato
36
Introducción
[PCOMP6 (Kumada et al., 2012)], los de poli-L-láctido [c22 (Matsuno et al., 2008)], los de oro
[GBP (De Juan-Franco et al., 2013)], y el mejor conocido: el péptido de unión a níquel, el tag de
histidinas (Hochuli et al., 1988).
La fusión de un tándem de 6-10 histidinas en el extremo amino o carboxilo terminal de los

anticuerpos, permite la inmovilización orientada de estos en superficies que contengan Ni2+,
Co2+ o Cu2+ debido a la afinidad de los grupos de más de 6 histidinas con estos iones (Kd= 107
M-1). El ácido nitrilotriacético (NTA) forma complejos hexagonales con iones metálicos
divalentes, dejando dos sitios de unión disponibles para la quelación con un residuo de
histidina (Fig. 13). En un estudio comparativo de inmovilización de anticuerpos sobre
monocapas con maleimida o monocapas de NTA, fue utilizado un anticuerpo recombinante
(fragmento variable anti lisozima) que tenía fusionado una cisteína en su extremo amino
terminal y 6 histidinas en su extremo carboxilo terminal. A través de técnicas como la
espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), la resonancia de plasmón de superficie
(SPR) y la espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) se
demostró una unión del analito 10 veces superior en superficies de NTA comparadas con las de
maleimida (Baio et al., 2011). Sin embargo, debido a que la afinidad de unión del tag His6 no es
lo suficientemente alta, los anticuerpos inmovilizados podrían sufrir una disociación no
deseada, por lo que la estabilidad de estas superficies no es la idónea.
Figura 13. Inmovilización de una proteína mediada por histidina sobre superficies modificadas con NTA.
Las superficies tratadas con NTA son queladas con metales divalentes como el níquel. Posteriormente
las histidinas del tag reaccionan con el níquel hidratado a través del nitrógeno del anillo del imidazol
quedándose la proteína fijada a la superficie (Dixit, 2011).
37
Introducción
Otro péptido muy estudiado es el FLAG, con secuencia DYKDDDDK, que puede incorporarse
genéticamente en proteínas. Dichas proteínas con FLAG pueden capturarse adicionalmente
mediante un soporte que lleve anticuerpos anti-FLAG. Dicha inmovilización de proteínas a
través de FLAG se basa en la interacción antígeno-anticuerpo en lugar de la quelación, por lo
que se puede esperar una afinidad más fuerte y una mayor especificidad (Shen, Rusling and
Dixit, 2017).
1.4.3.3. Inmovilización de los anticuerpos a superficies recubiertas con Proteína A, Proteína

G o Proteína L
La obtención de soportes con anticuerpos orientados adecuadamente es posible cuando se

utiliza la proteína A, la proteína G o la proteína L. Todas estas proteínas son procedentes de
bacterias: la proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína G de Streptococcus sp. C40 y la
proteína L de cepas de Peptostreptococcus magnus. Las proteínas A y G contienen múltiples
dominios de unión a la fracción constante (Fc) de los anticuerpos de tipo IgG, presentando la
proteína A 5 sitios de unión mientras que la proteína G contiene 2 (Iijima et al., 2013). La unión
de estas proteínas a los anticuerpos es diferente y depende de las subclases de
inmunoglobulinas y las especies de origen de estas. La proteína G es capaz de unirse a un
rango más amplio de inmunoglobulinas, aunque también tiene sitios de unión a otras
proteínas como la albúmina, por lo que han sido generadas genéticamente moléculas de
proteína G que tienen truncados estos dominios. Además, se han producido proteínas de
fusión recombinantes A/G que son capaces de unirse a un rango mayor de inmunoglobulinas
(Seo, Lee and Poulter, 2013). Por su parte, la proteína L puede unirse a las inmunoglobulinas a
través de la cadena ligera kappa (Gao et al., 2006).
Todas estas proteínas han sido utilizadas de forma eficiente en biosensores, así como en
procesos de purificación de anticuerpos. En inmunoensayos se ha comprobado que permiten
un aumento significativo de la sensibilidad de los mismos comparados con la inmovilización al
azar de los anticuerpos, lo cual puede ser adjudicado a la correcta orientación de estos en las
superficies (Kausaite-Minkstimiene et al., 2010; Seo, Lee and Poulter, 2013).
El dominio de unión al Fc de los anticuerpos IgG de la proteína A se denomina dominio Z o

dominio ZZ y ha sido utilizado una variante pequeña obtenida de forma sintética para su unión
con el Fc (Nilsson et al., 1987). Miyao et al. (2015) construyeron superficies sólidas con uno o
dos dominios Z para la inmovilización de anticuerpos y encontraron que los dominios Z en
tándem (es decir, dominios ZZ) capturaban el anticuerpo de manera más eficiente que el
dominio Z único.
38
Introducción
Existen placas de ELISA comerciales recubiertas con proteína G que permiten el aumento de la
sensibilidad de la técnica a través de la orientación de los anticuerpos de captura. Estas
superficies permiten, además, la utilización de anticuerpos que no han sido purificados. Sin
embargo, estas placas son caras y su fabricación requiere mucho tiempo debido al complejo
proceso de purificación y fijación de la proteína G. Recientemente se han producido placas en
las que son fijadas células que expresan de forma estable el dominio de unión al Fc de la
proteína G (G-C2), ya sea una sola unidad o en grupos de 8. La evaluación de estas placas
mediante ELISA cuantitativo, comparándolas con las superficies estándar y las placas
comerciales de proteína G, ha demostrado que presentan una sensibilidad significativamente
mayor que la de las placas tradicionales basadas en poliestireno y que las comerciales basadas
en proteína G, lo que potencialmente las convierte en una nueva generación de placas
altamente sensibles para varios formatos de ELISA (Chen et al., 2018).
1.4.3.4. Inmovilización de los anticuerpos a través de la unión entre sustratos y enzimas
Los anticuerpos pueden ser modificados genéticamente o de forma química para ser unidos al
dominio activo de una enzima que esté involucrada en la catálisis de alguna reacción
enzimática. Estos conjugados podrían ser posteriormente capturados sobre las superficies
preparadas con el substrato de las enzimas o con un análogo. En este caso, el dominio de la
enzima que se une al substrato queda unido a la superficie donde este se encuentra, debido a
la formación de puentes de hidrógeno e interacciones electrostáticas, junto con la formación
de enlaces covalentes.
La pareja enzima-inhibidor, cutinasa y sus inhibidores de fosfonato, ha sido ampliamente

utilizada con este propósito. La cutinasa es una serina esterasa que puede unir
covalentemente su residuo de serina en el sitio activo con ligandos de fosfonato mediante una
reacción de esterificación. Esta enzima es relativamente pequeña (22 kDa) con su sitio activo
lejos de los extremos amino y carboxilo, lo que ofrece cierta flexibilidad para diseñar su fusión
a anticuerpos o proteínas de interés. Kwon et al. (2004) fusionaron fragmentos de anticuerpos
(por ejemplo, scFv y VHH) a la cutinasa y usaron soportes con fosfonatos para capturar las
proteínas de fusión. Los anticuerpos inmovilizados usando esta vía, exhibieron una alta
afinidad y especificidad por sus antígenos diana demostrado por estudios de fluorescencia y
resonancia de plasmones superficiales SPR (SPR, Surface Plasmon Resonance).
Otro ejemplo de esta estrategia es el uso de la enzima O6-alquilguanina transferasa humana

(hAGT), la cual se une a superficies activadas con bencilguanina. Esta enzima desplaza la
guanina de la molécula de bencilguanina y forma enlaces covalentes con el grupo benzilo de la
39
Introducción
misma. Los anticuerpos fusionados a esta enzima pueden ser capturados de forma covalente
sobre este tipo de superficie (Engin et al., 2010). Esta tecnología es comercializada por New
England Biolabs como SNAP-tag®.
El dominio de unión a quitina (CBD), que forma parte de la enzima quitinasa y cataliza la
hidrólisis del polímero quitina, puede ser incorporado genéticamente a anticuerpos
recombinantes, aunque también puede ser unido de forma química. Diversos anticuerpos han
sido desarrollados fusionados a CBD (Lindner et al., 2002)(Reulen et al., 2009) con el objetivo
de ser inmovilizados en distintas superficies para ser más adelante utilizados en
inmunoensayos. Los anticuerpos unidos a CBD pueden interaccionar con la quitina a través de
puentes de hidrógeno formados entre el hidrógeno del ácido aspártico D142 de CBD y el
oxígeno de la amida de la quitina, produciéndose también otras interacciones hidrofóbicas
como, por ejemplo, entre la tirosina Y214 del CBD y el grupo N-acetilglucosamina de la quitina.
Todas estas interacciones podrían jugar un papel crucial en la inmovilización del anticuerpo
(Dixit, 2011).
Recientemente las uniones mediadas por la sortasa han sido ampliamente utilizadas para el
marcaje de proteínas y anticuerpos de forma dirigida. La sortasa es una transpeptidasa que
reconoce el penta péptido LPXTG (donde X es un aminoácido cualquiera) uniéndose el S de la
cisteína C184 de la sortasa a la treonina del péptido, formando de esta manera un
intermediario estable: el LPXT-tioacilo-sortasa. Usando esta estrategia, diferentes drogas
altamente anti tumorales, anticuerpos y proteínas de interés han sido marcados para
posteriormente ser utilizados en estudios de imágenes in vivo, liberación de drogas en el
organismo y detección de la unión antígeno-anticuerpo (Beerli et al., 2015; Ismail and Lim,
2016).
1.5. Detección de ácidos nucleicos a través de reacciones inmunoenzimáticas

1.5.1. Ensayos inmunoenzimáticos para la cuantificación de productos de PCR
El método más simple para la detección de un producto de PCR es la electroforesis en gel de

agarosa. Sin embargo, desde el punto de vista diagnóstico, debido a su bajo límite de
detección, este método solo es útil para determinar si existe o no el producto de PCR. No
obstante, se han desarrollado diversos métodos y equipos de detección, entre ellos la PCR
cuantitativa en tiempo real y la droplet PCR.
A fines de la década de 1980 hubo un repentino auge de interés en el estudio de la

inmunodetección del ADN y fueron publicados varios métodos, entre ellos la inmunodetección
de ADN utilizando sondas de ARN biotinilado (Coutlée et al., 1989). A partir de entonces, se
40
Introducción
publicaron numerosos estudios sobre inmunodetección de ADN mediante técnicas de ensayo

ligado a enzimas, que posteriormente condujeron a la introducción del ensayo de detección de
una PCR mediante ELISA (PCR-ELISA). Este método combina PCR y ELISA en una sola técnica
analítica y su aplicación es muy similar a un ELISA, excepto que este método permite la
detección de ácidos nucleicos en lugar de proteínas (Di Pinto et al., 2012).
Los ensayos tipo ELISA han sido utilizados eficientemente para la cuantificación de productos
de PCR debido a que exhiben una alta especificidad y sensibilidad, permiten un amplio rango
dinámico, no son radioactivos y pueden ser automatizados (Kochanowski et al., 2003). Las
amplificaciones de PCR pueden ser provenientes de la amplificación de un ADN diana o de la
amplificación de un ARN de interés tras su retrotranscripción. Estos ensayos pueden ser
revelados mediante métodos colorimétricos, de fluorescencia o luminiscencia, siendo esta
última la que permite un rango dinámico más amplio.
Se han llevado a cabo diversos estudios sobre el uso de PCR-ELISA como método de detección
y diagnóstico, los cuales han demostrado ser exitosos. Así, esta técnica ha sido utilizada en la
clínica para la identificación de células cancerosas (Raji et al., 2011), detección de la presencia
de los distintos tipos de hepatitis A, B, C y E (Tahk et al., 2011; Seo et al., 2012), detección e
identificación de especies de dermatofitos (Beifuss et al., 2011), detección de infecciones
fúngicas invasivas en pacientes inmunodeprimidos (Hadrich et al., 2010), detección de
poliovirus, enterovirus y norovirus (Park et al., 2009), detección de leishmaniosis visceral en
niños (Medeiros et al., 2017) y la determinación de antígenos de grupos sanguíneos para la
enfermedad hemolítica en recién nacidos y pacientes politransfundidos (St-Louis, 2009).
Además, el uso de PCR-ELISA como sistema de alerta temprana ha sido extendido para la
detección de síntomas latentes de enfermedades o incluso estudios de expresión génica a
través de biomarcadores. Algunos de estos estudios incluyen el desarrollo de PCR-ELISA como
método de reemplazo para la detección y validación de estudios de expresión génica así como
la detección de mutaciones puntuales en diferentes enfermedades como, por ejemplo, la
talasemia (Gill et al., 2008; Palermo et al., 2012)
Existen diferentes formatos de PCR-ELISA dependiendo de la forma en que capturan y

cuantifican los productos de PCR. El método más utilizado es el que incluye cebadores o dTNPS
marcados con biotina, que son utilizados para la amplificación en la PCR. Posteriormente se
lleva a cabo una reacción de hibridación con estos productos de PCR y sondas marcadas (FITC,
digoxigenina). El producto de esta reacción es capturado en una placa de ELISA previamente
recubierta con avidina/ estreptavidina. El ELISA se revela con un anticuerpo anti digoxigenina-
41
Introducción
peroxidasa o anti FITC- peroxidasa, según corresponda (Medeiros et al., 2017). En otros casos,
la sonda está marcada con biotina y la PCR es realizada con dNTPs marcados con digoxigenina
(Fig. 14) (Seo et al., 2012).
Figura 14. Esquema del ensayo de detección de un producto de PCR mediante PCR-ELISA. La PCR inicial
se desarrolla usando dUTPS marcados con digoxigenina. La amplificación obtenida se une mediante
hibridación a una sonda complementaria y específica que, a su vez, está marcada con biotina.
Posteriormente, la inmunodetección se hace en placas de ELISA previamente recubiertas con
estreptavidina, y la detección se lleva a cabo con el anticuerpo anti digoxigenina HRP.
Atendiendo a las ventajas del método PCR-ELISA y a sus aplicaciones, tanto en la clínica como
en otros sectores, actualmente se están realizando estudios para la mejora de la técnica. Uno
de los intentos recientes consiste en desarrollar la capacidad de multiplexación de modo que
sea posible la detección de varias secuencias específicas simultáneamente y sin ninguna
reactividad cruzada. Este método disminuiría el coste y el tiempo de realización de la técnica
con respecto al análisis de un único analito. El desarrollo clave de este procedimiento es
diseñar sondas que sean altamente específicas para cada una de los genes de interés sin
reacciones cruzadas, como se ha comentado (Santos et al., 2008; Schützle et al., 2008; Avlami
et al., 2010; Tahk et al., 2011).
Por otro lado, Kobets et al. (2010) desarrollaron un método de PCR-ELISA mejorado que
eliminaba la necesidad del paso de hibridación del producto de PCR con sondas marcadas.
Centrándose en la detección y cuantificación de la Leishmania, estos investigadores utilizaron
cebadores marcados con digoxigenina y biotina para generar productos de PCR marcados. A
continuación, estos productos se unieron a una placa recubierta con estreptavidina y
42
Introducción
posteriormente fueron detectados usando un ELISA sándwich con el anticuerpo anti

digoxigenina. Este método no solo eliminó el paso de hibridación, en el cual era necesaria la
desnaturalización del producto de PCR antes de la hibridación y el diseño de una sonda
específica, sino que también eliminó una serie de pasos incluidos todos los procedimientos de
lavado entre cada uno de ellos. En general, este diseño redujo el coste de los reactivos, así
como el tiempo de incubación y lavado.
1.5.2. Ensayos inmunoenzimáticos para la detección de micro RNA
Los micro RNA (miRNA) son RNAs no codificantes conservados evolutivamente, de

aproximadamente 18-24 nucleótidos de longitud, que desempeñan un papel importante en el
control de la expresión génica humana mediante la regulación o silenciamiento génico
postranscripcional (Bartel, 2004). Diversos estudios han demostrado que los cambios en la
expresión de miRNA están implicados en una amplia variedad de enfermedades y trastornos
humanos como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, autoinmunes, neurodegenerativas,
hepáticas e inflamatorias (Wang, Chen and Sen, 2016; Correia et al., 2017). Los miRNA no sólo
circulan en la sangre periférica humana en una forma notablemente estable (Chen et al.,
2008), sino que también están ampliamente presentes en otros tejidos y líquidos corporales
como la orina, la saliva, la leche y el líquido cefalorraquídeo (Weber et al., 2010). Estas
características indican que los miRNA son biomarcadores potenciales que pueden ser
utilizados con fines de diagnóstico. Además, los miRNA están involucrados en el origen y el
desarrollo de diversas enfermedades y son específicos de la patología, por lo que la expresión
de un miRNA alterado ha sido empleada para la detección y el diagnóstico temprano, la
clasificación, el pronóstico y el diagnóstico predictivo de enfermedades.
Inicialmente la desregulación de los miRNA fue relacionada con tumores sólidos y neoplasias
hematológicas, y más recientemente varios estudios indican que los miRNA están implicados
en la tumorogénesis humana de forma general. Así, se ha visto que un subconjunto de miRNA
puede actuar como oncogenes o supresores de tumores. Por ejemplo, los grupos de miRNA-
17-92 están regulados positivamente en linfomas de células B difusos y en cáncer de pulmón y
de estómago (Fang et al., 2017). La sobreexpresión de miRNA-155 también se ha detectado en
neoplasias malignas de células B como son la leucemia de Burkitt, los linfomas de células B y la
leucemia linfocítica crónica (Faraoni et al., 2009). Por otro lado, la regulación a la baja de
distintos miRNA también puede contribuir a la transformación maligna al permitir la re-
expresión de oncogenes que contribuyen a fenotipos agresivos. Un ejemplo de ello es la
familia del miRNA-29, incluido los miRNA-29 a, b y c, los cuales se encuentran regulados a la
43
Introducción
baja en el cáncer de pulmón (Liu et al., 2018) y en la leucemia linfocítica crónica (Santanam et
al., 2010).
El mayor problema para la detección de miRNA en las muestras se debe a su pequeño tamaño
(aproximadamente 22 nucleótidos), a las pequeñas diferencias entre sus secuencias y a la baja
concentración en los fluidos del organismo (Dellett and Simpson, 2016). No obstante,
actualmente se utilizan varias técnicas para su detección como son la secuenciación de ARN,
los microarrays y la RT-PCR (Hunt et al., 2015).
La secuenciación de ARN se realiza mediante secuenciación masiva (NGS, del inglés Next
generation sequencing). Esta técnica permite descubrir nuevas moléculas de miRNA y es
también el principio más sensible para la identificación y cuantificación de miRNA. Sin
embargo, requiere mucho tiempo para el procesamiento, mucho volumen de muestra, un
software muy sofisticado para su análisis, una instrumentación y reactivos caros, lo que en
conjunto la convierte en una técnica de difícil aplicación (Dard-Dascot et al., 2018).
El microarray es una técnica multiplex utilizada para la detección de miRNA. Está basada en la
hibridación del miRNA diana con una sonda específica, y la cuantificación ocurre a través de la
fluorescencia aportada por la sonda (Wang and Xi, 2013). En principio, los microarrays pueden
proporcionar información muy precisa sobre la concentración absoluta de miRNA, pero en la
práctica hay un gran sesgo de cuantificación debido a correcciones de fondo poco fiables y a la
normalización, por lo que generalmente se considera una cuantificación relativa. La
sensibilidad de los microarrays es menor que la de la secuenciación y la medición también está
limitada por la sensibilidad del lector de fluorescencia (Wang and Xi, 2013; Hunt et al., 2015).
Debido a la instrumentación necesaria y a la sofisticación de las técnicas NGS y microarray,

estas no son consideradas adecuadas para su uso rutinario. En principio, su importancia radica
en su potencial para la detección de nuevos miRNA y en la búsqueda de expresión diferencial
de determinados miRNA relacionados con condiciones patológicas (Krepelkova et al., 2019). La
técnica con mayor potencial para fines diagnósticos es la RT-qPCR, para la que han sido
establecidas diversas adaptaciones técnicas teniendo en cuenta el tamaño de las moléculas de
miRNA (Zöllner, Hahn and Maghnouj, 2014).
La técnica RT-qPCR consiste en una retrotranscripción enzimática del miRNA maduro en una
secuencia de ADN complementaria, seguido de la amplificación de esta secuencia mediante
cebadores apropiados. El paso del proceso más propenso a errores es la reacción RT, por lo
que han sido desarrollados dos métodos para evitarlos. El primer método establecido para la
RT de un miRNA utiliza cebadores que forman lazos (stem-loop) específicos para producir
44
Introducción
ADNc a partir del miRNA específico. El cebador se hibrida con la región 3' del miRNA, mientras
que al mismo tiempo se prolonga desde el extremo 3' de la molécula al extremo 5’ formando
una molécula de ADNc que incluye el lazo del cebador. Después de la RT, el ADNc resultante es
amplificado por qPCR usando un cebador directo específico para la secuencia de miRNA y un
cebador inverso específico para el cebador del lazo (Fig. 15) (Schmittgen et al., 2008; Zöllner,
Hahn and Maghnouj, 2014). El segundo método extiende el miRNA en su extremo 3' terminal
con una cola de poli (A) utilizando la enzima poli (A) polimerasa y posteriormente el ARN
poliadenilado resultante se transcribe de forma inversa utilizando un cebador oligo (dT)
universal. Por lo tanto, todos los miRNA dentro de la muestra de ARN son transcritos.
Posteriormente, la amplificación del ADNc se lleva a cabo utilizando cebadores específicos
(Zöllner, Hahn and Maghnouj, 2014; Kappel and Keller, 2017).
Figura 15. Representación esquemática de la técnica RT-qPCR para un miRNA mediante el uso de un
cebador en forma de lazo (stem-loop). La estructura y el diseño del cebador de la RT en forma de lazo
específico se muestra cuando se une al miRNA diana y posteriormente se extiende durante la reacción
de RT (paso 1). En el paso 2, el lazo se abre durante la PCR. En este caso se representa el uso de una
sonda fluorescente marcada que permitirá la cuantificación del miRNA.
45
Hipótesis
HIPÓTESIS
Nuestra hipótesis de estudio se basa en que la sensibilidad de un ELISA depende del
anticuerpo de captura y de su inmovilización, si la superficie es modificada para que aumente
la densidad del anticuerpo o para que este quede orientado de forma correcta, podría
aumentar la sensibilidad del ELISA significativamente.
46
Objetivos
OBJETIVOS
El objetivo general de este proyecto se basa en el desarrollo de una metodología para la

obtención de un ELISA más sensible y multiplex que permita reducir el impacto de la baja
afinidad de un anticuerpo por su analito específico sobre la sensibilidad del método
inmunoenzimático y, además, sea capaz de detectar simultáneamente analitos de distinta
naturaleza.
Los objetivos específicos del estudio son:
1- Desarrollo de un método que permita aumentar la densidad de los anticuerpos

inmovilizados en una superficie de poliestireno de forma que esto favorezca el
aumento de la sensibilidad de un ELISA.
2- Crear un sistema que permita la correcta orientación de los anticuerpos de captura en
la superficie de un ensayo de ELISA de manera que mejore la sensibilidad de detección.
3- Detección de ácidos nucleicos mediante un ensayo inmunoenzimático.
4- Cuantificación mediante un ensayo multiplex de dos analitos de diferente naturaleza:
una proteína y un ácido nucleico.
47
II. AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD DE LA
TÉCNICA ELISA MEDIANTE QUÍMICA CLIC
Capítulo 2. Aumento de la sensibilidad de la técnica ELISA mediante química clic
CAPÍTULO 2
2.1. INTRODUCCIÓN
La sensibilidad de un ELISA depende de parámetros como la interacción entre el antígeno y el

anticuerpo, la temperatura, el pH y la eficacia de la unión del anticuerpo a la superficie de
ensayo. Entre estos factores, la inmovilización del anticuerpo en la placa de poliestireno juega
un papel crucial en la mejora del límite de detección (Welch, Scoble, et al., 2017). Ha sido
demostrado, a través de varias plataformas diagnósticas, que una mayor densidad de
anticuerpos en la superficie mejora la sensibilidad de la detección, por lo cual han sido
desarrolladas diferentes estrategias para inmovilizar adecuadamente las proteínas a las
superficies (Das et al., 2010; Dixit et al., 2010). Una proteína o un anticuerpo tienen la capacidad
de inmovilizarse en la placa de poliestireno simplemente por adsorción química, física o
interacción electrostática. Sin embargo, esta inmovilización pasiva generalmente da como
resultados que los anticuerpos queden orientados al azar, pierdan su conformación nativa y en
algunos casos su actividad. Además, los anticuerpos pueden experimentar desplazamiento sobre
las superficies debido a los sucesivos pasos de lavados requeridos del ELISA (Butler, 2000;
Kausaite-Minkstimiene et al., 2010).
La unión covalente de los anticuerpos de captura a la superficie asegura una robusta

inmovilización de los mismos, mejorando de esta manera su densidad y evitando su pérdida
durante los pasos consecutivos del ensayo. Muchos de los enlaces covalentes formados entre
los anticuerpos y la superficie, se basan en la generación de grupos amino, carboxilo y epoxi
sobre la superficie mediante diferentes métodos. Posteriormente, el anticuerpo se une a estos
grupos mediante reacciones químicas usando compuestos hetero u homo bifuncionales a través
de sus grupos NH2 y COOH (Dixit, 2011).
Aunque existen placas comerciales de ELISA que poseen grupos NH2 en la superficie
(ThermoFisher (CovaLink), Biomat, etc), actualmente muchos laboratorios desarrollan sus
propias superficies aminadas con las cuales obtienen mejores resultados. De este modo, Dixit et
al., (2011) prepararon placas de ELISA con grupos amino en superficie usando para ello APTES y
diversos investigadores siguen esta misma metodología con algunas variaciones (Wang et al
2019). Mediante una metodología muy distinta, Del Prado et al. (2012) prepararon superficies
de poliestireno aminadas mediante clorosulfonación-sulfonamidación y estas fueron evaluadas
mediante ELISA.
48
Inicialmente, antes del diseño de la estrategia a seguir para lograr el aumento de la sensibilidad
de un ELISA, en este capítulo mostraremos que la sensibilidad de esta técnica depende de la
afinidad del anticuerpo de captura por su antígeno, para lo cual compararemos dos anticuerpos
anti citoquinas, anti IL8h y anti IL6h, con el anticuerpo anti c-myc. Para hacer posible esta
comparativa se clonarán y se producirá de forma recombinante la proteína c-myc-GST-IL8h en
Escherichia coli y la proteína c-myc-IL6h en células de mamíferos.
Para lograr el objetivo principal de aumento de la sensibilidad de un ELISA, se utilizarán las

ventajas que ofrecen las reacciones de tipo química clic de ser rápidas, específicas y altamente
eficientes. De este modo, la reacción tetracina TCO, será utilizada para fijar el anticuerpo de
captura de forma covalente a la superficie de ensayo. Para ello, se prepararán superficies en las
cuales esté expuesto el grupo tetracina y los anticuerpos de captura serán modificados con TCO.
Para la preparación de las superficies se seguirán tres vías:
1) Se partirá de superficies aminadas mediante un proceso de clorosulfonación-

sulfonamidación, las cuales serán tratadas posteriormente con NHS-tetracina
2) Se partirá de superficies aminadas comerciales las cuales, después de aumentar el
número de grupos amino en superficie, serán tratadas con NHS-tetracina
3) Se obtendrá la proteína BSA unida a varios grupos tetracina que posteriormente será
utilizada para recubrir las superficies de ELISA a una alta concentración
La evaluación del aumento de sensibilidad de las diferentes superficies preparadas será

realizada a través del ELISA tipo sándwich para la detección de la proteína recombinante c-myc-
GST-IL8h y la proteína recombinante c-myc-IL6h. En ambos casos se utilizará como anticuerpo
de captura el anticuerpo anti c-myc, que estará marcado con TCO, y como anticuerpo de
revelado el anticuerpo anti IL8h- biotina y el anti IL6h-biotina, respectivamente. Además de la
detección de estas proteínas recombinantes como modelo de ELISA, se detectará el aumento de
sensibilidad, a través de un ELISA sándwich de detección de la proteína CEA, biomarcador
descrito para el cáncer colorrectal, usando para ello una pareja de anticuerpos comerciales. De
igual modo, el anticuerpo de captura será modificado con TCO.
49
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1. Obtención de proteínas recombinantes utilizadas en los ELISAs modelos para la

2.2.1.1. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-IL6h en células de
Atendiendo a la referencia para la secuencia de IL6 humana (IL6h) (Gb: NM_000600.5), se clonó
la región codificante de la proteína desde el nucleótido 64 al 702. La fusión de c-myc a la
citoquina IL6h por el extremo amino de la proteína fue diseñada sobre el vector de expresión
pCDNA3.1 quedando el gen de interés bajo el control del promotor de citomegalovirus (PCMV). La
secuencia de aminoácidos de c-myc utilizada fue EQKLISEEDL. La clonación en el vector pCDNA3.1
fue realizada con las enzimas de restricción XhoI/ NotI a partir del sintético de la fusión entre
ambos genes (IDT). La clonación fue comprobada por digestión del inserto y posteriormente
mediante secuenciación (Stabvida). El vector obtenido fue denominado pCDNA3.1-c-myc-IL6h.
Para la expresión de la proteína de fusión se empleó la línea celular de hámster CHO-K1 (ATCC,
CCL61) que fue transfectada con el plásmido pCDNA3.1-c-myc-IL6h. Las células fueron cultivadas
a 37 ºC y 5% CO2, en medio de cultivo Hams’F12 + 10% Suero Fetal Bovino (FBS) + 100 UI/ml
penicilina + 100 µg/ml estreptomicina. El sobrenadante del cultivo de las células adheridas fue
recogido a las 72 h y analizado mediante ELISA.
La proteína c-myc-IL6h fue detectada mediante dos tipos de ELISA, un ELISA comercial de
detección de IL6 humana (Immunotools GmbH, 31330069) y un ELISA de detección de la fusión
de c-myc con IL6h (Fig. 16). Para el ELISA de detección de IL6h, se recubrieron placas estándar de
ELISA (ThermoFisher, 442404) con el anticuerpo anti IL6 humana de recubrimiento
(Immunotools GmbH, 31670069) diluido en una solución tampón de NaHCO3 a pH 9 e incubado
durante 16 h a 4 ºC. Los pocillos fueron lavados 5 veces con 0,3ml de PBS-Tween-20 0,05% y
seguidamente fueron bloqueados con una solución de PBS-BSA 1%. Tras una incubación de 30
minutos a 37 ºC se añadieron diferentes diluciones del sobrenadante de células CHO-K1
expresando la proteína c-myc-IL6h. La concentración de la proteína en el sobrenadante fue
cuantificada utilizando una curva realizada con el patrón IL6 humano proporcionado por el kit
comercial. Después de 1 h de incubación a 37 ºC, los pocillos fueron lavados y el anticuerpo anti
IL6 humana-biotina fue añadido siguiendo las indicaciones del fabricante. Pasada 1 h de
incubación a 37 ºC la placa fue lavada, tras lo cual fue añadida la estreptavidina-HRP
(ThermoFisher, 21130), que fue incubada a temperatura ambiente protegida de la luz durante
30 minutos. Tras 5 lavados, se añadió el sustrato de la peroxidasa (TMB; 3,3’,5,5’-
50
tetrametilbenzidina) y la reacción fue detenida con una solución 1M de HCl. La lectura del ELISA
se realizó a 450nm usando el equipo de lectura FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
Figura 16. Esquema del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h. Se representa la
detección de la proteína de fusión c-myc-IL6h mediante un ELISA sándwich con el anticuerpo anti IL6h de
captura o con el anticuerpo anti c-myc. En ambos casos el anticuerpo de revelado es el anticuerpo anti
IL6h-biotina.
De forma similar, se comprobó la presencia en la proteína de fusión c-myc-IL6h del fragmento

del proto oncogen c-myc (Fig. 16). Para ello, las placas fueron recubiertas con el anticuerpo anti
c-myc 9E10 a 4 µg/ml en solución tampón de NaHCO3 a pH 9 y este fue incubado durante 16 h a
4º C. El resto del ELISA se realizó de forma idéntica a la descrita para la detección de IL6h.
Ambos ELISAs fueron comparados en cuanto a límite de detección (LOD) y límite de

cuantificación (LOQ) siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 2.2.1.1.1.
2.2.1.1.1. Análisis de los resultados obtenidos en ensayos tipo ELISA
Los resultados obtenidos de los ELISA fueron analizados mediante una curva de regresión
logística de 4 parámetros (4PL) usando el programa Graph-Pad Prism (GraphPad Software Inc.,
San Diego, CA, USA), obteniéndose de la curva la EC50, el valor de R2 y la pendiente de Hill.
La EC50 indica la concentración a la cual es obtenida la mitad de la señal del ensayo o la

concentración media efectiva. Por su parte, el valor de R2 es una medida estadística que indica
cuanto se ajustan los valores reales de las señales obtenidas a la curva de regresión trazada.
Finalmente, la pendiente de Hill es la pendiente o inclinación correspondiente a la curva. La
ecuación de la curva 4PL es la siguiente:
y= Valor mínimo + (Valor máximo-Valor mínimo) / (1+10^((LogEC50-X) *Pendiente de Hill))
Para el cálculo del límite de detección (LOD), que se corresponde con la mínima concentración
del analito que puede ser detectada mediante el ELISA, se tuvo en cuenta la media de la
51
absorbancia obtenida de al menos 3 controles negativos del ELISA más 3 veces la desviación
estándar de los mismos. En el caso del límite de cuantificación (LOQ), que representa la cantidad
mínima del analito que puede ser cuantificada, la desviación estándar fue multiplicada por 10. El
valor de absorbancia obtenido en cada caso, fue analizado mediante la curva 4PL obtenida de
los datos de la curva, obteniéndose los valores de concentración correspondientes al LOD y al
LOQ.
2.2.1.2. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en Escherichia coli.

Purificación en columna de afinidad y detección mediante ELISA
El fragmento sintético His6-c-myc- GST-IL8h (IDT) fue clonado en el vector de expresión pET-43a
(Novagen) usando las enzimas de restricción NdeI y SalI en fase con el TAG de histidinas del
vector. La proteína quimérica resultante estuvo constituida por 6 restos de histidina, el
fragmento terminal del proto oncogen c-myc (EQKLISEEDL), la proteína glutatión-S-transferasa y
la citoquina humana interleuquina-8 (IL8h) (Gb NM_00584.4). La secuencia del plásmido
resultante fue confirmada mediante digestiones de comprobación y secuenciación (Stabvida).
Para la expresión de la proteína, las células de E. coli BL21 (DE3) (fhuA2 [lon] ompT [dcm] hsdS
(rB-mB-) gal λ DE3 = λ sBamHIo ∆EcoRI-B int: (lacI::PlacUV5::T7 gene1) i21 ∆nin) transformadas
con el vector de expresión pET43a-HIS6-c-myc-GST-IL8h fueron incubadas a 37 ºC en 0,5L de
medio Luria Bertani (LB: 1% triptona, 0,5% extracto levadura, 1% NaCl) conteniendo 100 µg/ml
de ampicilina. Cuando la densidad óptica a 600nm (DO600nm) alcanzó un valor de 0,8, fue añadido
isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM, manteniendo el
cultivo durante 4 h a 37 ºC. Las células fueron separadas por centrifugación, lavadas con PBS
conteniendo 1 mM EDTA y lisadas con el sonicador Bandelin Sonoplus con un 70% de potencia
en el mismo tampón. La fracción soluble fue clarificada mediante centrifugación (14.000 g, 30
minutos, 4 ºC) y filtración usando un filtro de 0,22 µm. La proteína fue purificada mediante
cromatografía de afinidad usando una columna de níquel (HisTrap HP, GE Healthcare 17-5247-
01) en el AKTA Prime Plus siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones fueron
cuantificadas mediante un ensayo de Bradford (Bio-Rad) usando una curva de BSA como
estándar y analizadas mediante electroforesis para determinar el grado de pureza.
Para la detección de la proteína His6-c-myc-GST-IL8h se aplicaron dos modalidades de ELISA tipo

sándwich: uno formado por dos anticuerpos anti IL8 humana de Mabtech y otro, para detectar
la fusión de c-myc a la proteína IL8h, en el que se utilizó el anticuerpo anti c-myc combinado con
el anticuerpo anti IL8 humano (Fig. 17). Ambos ELISAs fueron realizados en placas estándar
(ThermoFisher, 442404) recubiertas con el anticuerpo anti IL8 humana, clon MT8H6, o con el
52
anticuerpo anti c-myc, clon 9E10, diluidos ambos a 2 µg/ml en una solución tampón de
Na2CO3/NaHCO3 a pH 9,6 e incubados durante 16 h a 4 ºC. Posteriormente, ambas placas fueron
lavadas 5 veces con 0,2 ml de la solución de lavado compuesta por PBS-Tween-20 0.05% y
bloqueadas con PBS-BSA 1% durante 30 minutos a 37 ºC. Fueron añadidas 100 µl de las
diluciones seriadas de la proteína His6-c-myc-GST-IL8h con un rango de concentraciones entre
0,4 a 200 ng/ml en las placas recubiertas con anti c-myc y en el rango de 4 a 1000 pg/ml en las
placas recubiertas con anti IL8h. Ambos ELISAs fueron revelados usando el anticuerpo anti IL8-
biotina, clon MT8F19, a 1 µg/ml. Luego de 5 lavados fueron añadidos 100 ng/ml de
estreptavidina-HRP e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la
luz. Finalmente se añadió el sustrato de la peroxidasa TMB y la reacción se detuvo usando HCl
1M. La lectura de los ELISA fue realizada a 450nm usando el equipo de lectura FLUOstar
OPTIMA.
Figura 17. Esquema del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h obtenida del
cultivo en E. coli. Se representa la detección de la proteína de fusión c-myc-GST-IL8h mediante un ELISA
sándwich con el anticuerpo anti IL8h de captura o con el anticuerpo anti c-myc. En ambos casos el
anticuerpo de revelado es el anticuerpo anti IL8h-biotina.
2.2.2. Modificación de anticuerpos y BSA para la incorporación de grupos funcionales

implicados en reacciones de tipo química clic
2.2.2.1. Incorporación del grupo funcional trans-cicloocteno en los anticuerpos anti c-myc y
anti CEA a través de la reacción N-hidoxisuccinimida con los grupos amino libres del
anticuerpo
Con el objetivo de incluir un grupo trans-cicloocteno (TCO) en moléculas de anticuerpos,

trabajamos con dos anticuerpos de captura: un anti c-myc purificado en Canvax Biotech a partir
del cultivo del hibridoma 9E10 y otro contra el antígeno carcinoembrionario (CEA) del hibridoma
3C1 (Hytest 4CA30). Para la incorporación del grupo TCO se utilizó el reactivo trans-cicloocteno
NHS éster (UV-Tracer Trans-Cyclooctene NHS ester, Click Chemistry Tools, A1031) en tampón
53
fosfato (0,15M NaCl, 0,1M NaPO4 pH 7,5) con distintas relaciones molares: 15, 10 y 5 moles del
reactivo por molécula de anticuerpo anti c-myc (Fig. 18). En el caso del anticuerpo anti CEA, el
grupo TCO fue incorporado en una relación molar de 5 moles del reactivo: 1 mol de anticuerpo.
La reacción fue incubada 1 h a temperatura ambiente y posteriormente dializada contra PBS pH
7,4 en una columna de diálisis de MWCO 7 kDa (Zeba, ThermoFisher, 89882).
Figura 18. Representación de la reacción química para la incorporación de un grupo trans-cicloocteno en

la molécula del anticuerpo.
La concentración molar del anticuerpo fue cuantificada mediante absorbancia a 280nm,

corrigiendo el efecto del trazador del compuesto mediante la ecuación:
Absorbancia 280nm corregida = Absorbancia 280nm – (Absorbancia 350nm x 0,4475)
y teniendo en cuenta que el coeficiente de extinción molar de un anticuerpo es Ɛ280nm = 204.000

M-1cm-1.
Por su parte, la concentración molar de TCO se cuantificó a 350 nm y fue calculada teniendo en
cuenta que el Ɛ350nm = 19.500 M-1cm-1. Finalmente se calculó la relación molar entre ambas
moléculas.
2.2.2.1.1. Detección de la actividad del anticuerpo modificado anti c-myc-TCO mediante ELISA
Las placas MaxiSorp fueron recubiertas con la proteína His6-c-myc-GST-IL8h diluida a 5 µg/ml en
NaHCO3 pH 9, e incubada 16 h a 4 ºC. Tras bloquear los pocillos con PBS-BSA 1%, fue añadido el
anticuerpo anti c-myc (9E10) en un rango de concentraciones de 0,39 a 50 ng/ml y el anticuerpo
anti c-myc unido a TCO con diferentes diluciones. El revelado se realizó con el anticuerpo anti
mouse HRP (Sigma-Aldrich A2554). En la Fig. 19 se muestra un esquema del ELISA realizado.
54
Figura 19. Esquema del ELISA de detección de actividad del anticuerpo anti c-myc-TCO. Cuantificación del
anticuerpo tomando como patrón el anticuerpo sin modificar.
2.2.2.1.2. Detección de la actividad del anticuerpo modificado anti CEA-TCO mediante ELISA
Las placas MaxiSorp (ThermoFisher 442404) fueron recubiertas con el antígeno

carcinoembrionario (CEA) (Hytest, 8CEA88) diluido a 5 µg/ml en NaHCO3 pH 9, e incubado 16 h a
4 ºC. Luego de bloquear los pocillos con PBS-BSA 1%, fue añadido el anticuerpo anti CEA (3C1)
en un rango de concentraciones de entre 15,62 y 500 ng/ml y el anticuerpo anti CEA (3C1) unido
a TCO con diferentes diluciones. El revelado se realizó con el anticuerpo anti mouse HRP (Sigma-
Aldrich, A2554) como se muestra en la Fig. 20.
Figura 20. Esquema del ELISA de detección de actividad del anticuerpo anti CEA-TCO. Cuantificación del
anticuerpo tomando como patrón el anticuerpo sin modificar.
2.2.2.2. Incorporación del grupo funcional tetracina en la albúmina de suero bovino
La proteína BSA fue modificada con el objetivo de incorporar varios grupos tetracina en la
molécula (Fig. 21). En la modificación se utilizó el reactivo Methyl Tetrazine–PEG4-NHS-ester
(Click Chemistry Tools, 1069) a una concentración molar 30 veces superior a la de la proteína,
para lo cual fueron utilizados 5 mg totales de BSA, correspondientes con 7,7x10-8 moles y
55
231x10-8 moles del reactivo. La reacción se llevó a cabo en tampón 50 mM NaPO 4, 150 mM NaCl
pH = 7 e incubada durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente la reacción se
detuvo añadiendo una solución 1M Tris HCl pH 8 para una concentración final de 100 mM en
tampón 50 mM NaPO4, 150 mM NaCl pH = 7. La mezcla de reacción fue dializada contra 0,5L de
PBS para eliminar el exceso del reactivo usando una membrana de diálisis de MWCO de 12 kDa.
La proteína fue cuantificada mediante Bradford usando una curva patrón de BSA, mientras que
la tetracina fue cuantificada mediante absorbancia a 520 nm. Finalmente se calculó el número
de grupos tetracina por molécula de BSA usando la relación molar entre ambas moléculas.
Figura 21. Representación de la incorporación de un grupo tetracina en la proteína BSA a través de la

reacción de los grupos aminos libres de ésta con N-hidroxisuccinimida formando un enlace tipo amida.
2.2.3. Preparación de superficies con alta densidad del grupo funcional tetracina
2.2.3.1. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno previamente aminadas
mediante química en mojado
Se utilizaron placas preparadas mediante la técnica de química en mojado, que incluye un

proceso de clorosulfonación seguido de una sulfonamidación (Proyecto 2012/000069, TECNALIA
Research & Innovation). La determinación de los grupos amino en superficie fue realizada a
través de un método colorimétrico usando el reactivo Orange II (Reinecke, Navarro and Briz
Iceta, 2010). Según la cuantificación aportada, los pocillos de las placas poseen una media de
grupos amino de 1,5 - 3 nmoles/cm2. Debido a que los pocillos son generalmente recubiertos
con un volumen de 100 µl, fue considerado un volumen de 150 µl para calcular la superficie a
tratar con tetracina. De modo que se considera como la superficie de recubrimiento al área del
círculo del fondo del pocillo más el área del rectángulo que rodea al círculo, la cual forma el
cilindro del pocillo:
Superficie de recubrimiento = Área del círculo + Área del rectángulo
Área del círculo = π r2 = 3,14 x (0,35 cm)2 = 0,384 cm2
Área del rectángulo = Largo del círculo x altura del líquido = (2 π r) x h
56
Conociendo que el volumen considerado es de 150 μL, tenemos que
Volumen del cilindro = π r2 h,
despejando la altura,
h = V / π r2 = (0,15 cm3) / (3,14) x (0,35 cm)2 = 0,4 cm
y sustituyendo en la ecuación del área del rectángulo,
Área del rectángulo = (2 x 3,14 x 0,35 cm) x 0,4 cm = 0,879 cm2
Por tanto,
Superficie de recubrimiento = Área del círculo + Área del rectángulo
= 0,384 cm2 + 0,879 cm2 = 1,263 cm2
Si en 1 cm2 teníamos 3 nmol de grupos amino, en 1,263 cm2 tendremos 3,8 nmol de grupos
amino.
Para el tratamiento con tetracina fue usado un exceso molar de 5 tetracina por grupos amino,
siendo por tanto necesarios 18,95 nmol del reactivo, que se corresponden con 12 µg tetracina/
pocillo teniendo en cuenta la masa molecular del reactivo de tetracina utilizado.
La tetracina se diluyó a 120 µg/ml en buffer 0,1M NaPO4, 0,15M NaCl pH 7,5, añadiendo 100 µl
de la mezcla por pocillo. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente y
agitación suave y posteriormente fueron lavadas 3 veces con 0,3 ml de PBS pH 7,4.
Las superficies fueron evaluadas mediante el ELISA de detección de la proteína recombinante c-

myc-GST-IL8h que se describe en el apartado 2.2.4.4.
2.2.3.2. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno aminadas usando poli-
lisina-tirosina
Se utilizaron placas aminadas de CovaLink (ThermoFisher, 62409-285) que, según cuantificación

de grupos amino, presentaban una media de 0,25 nmoles NH2/cm2 (datos no mostrados). Los
pocillos fueron tratados con una solución de glutaraldehído al 1% (v:v) (Merck, 8206030) y
fueron incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras un lavado con 0,2 ml de
agua se añadió una solución de 500 µg/ml de poli-lisina-tirosina (4 lisina: 1 tirosina) en PBS pH
7,4 (Sigma-Aldrich, P4659). Los pocillos se incubaron durante 16 h a temperatura ambiente con
agitación constante suave y posteriormente lavadas 3 veces con PBS. Las placas fueron tratadas
con el reactivo Methyl Tetrazine–PEG4-NHS-éster al igual que las placas aminadas mediante
química en mojado.
57

myc-GST-IL8h como se describe en el apartado 2.2.4.4.
2.2.3.3. Exposición del grupo tetracina en superficies estándar de ELISA mediante la proteína
BSA-Tetracina
La superficie de una placa estándar de ELISA fue recubierta con 20, 50 y 100 μg/ml de la
proteína BSA-Tetracina (1 BSA: 25 Tetracina) diluida en tampón 0,1M NaHCO3 a pH 9 e
incubadas durante 16 horas a 4 ºC. Tras 3 lavados con PBS-Tween-20 0,05%, las placas fueron
tratadas con un reactivo de bloqueo y almacenamiento para antígenos (Sigma-Aldrich, C9483) y
almacenadas a 4 ºC hasta su utilización.

myc-GST-IL8h descrito más adelante (apartado 2.2.4.4).
2.2.4. ELISAs desarrollados para la evaluación de las superficies activadas con tetracina
2.2.4.1. ELISA para la detección del anticuerpo anti CEA-TCO uniéndose a superficies tratadas
con tetracina
La reacción tetracina TCO sobre las superficies previamente recubiertas con BSA-tetracina a 20
µg/ml se comprobó usando el anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) (Fig. 22). El anticuerpo fue
utilizado en un rango de concentraciones de 0,78-1.000 ng/ml diluido en PBS pH 7,4
contendiendo BSA al 0,5%. Posteriormente, cada pocillo fue lavado 5 veces con 0,2 ml de PBS-
Tween-20 0,05% (v:v) y bloqueados posteriormente durante 30 minutos a 37 ºC con PBS-BSA
1%. El anticuerpo de revelado anti mouse HRP (Sigma-Aldrich, A2554) fue añadido e incubado 1
h a temperatura ambiente protegido de la luz. Tras 5 lavados se añadieron 100 µl del sustrato
TMB por pocillo. La reacción fue detenida con 1M de HCl y la medida se efectuó a 450 nm
usando el equipo de lectura FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
58
Figura 22. Esquema del ELISA para la detección de la reacción de tipo química clic entre un anticuerpo
marcado con TCO y una superficie recubierta con BSA- tetracina. Como control de las superficies
preparadas con BSA-tetracina, se utilizaron superficies recubiertas con BSA.
2.2.4.2. ELISA comparativo de detección de la proteína CEA en superficies estándar y en

En paralelo a lo anteriormente descrito, se realizaron los ELISAs de detección de CEA en placas

estándar (ThermoFisher, 442404) y en placas tratadas con BSA-tetracina como se resume en la
Fig. 23. En ambos casos, el anticuerpo anti CEA (3C1) fue utilizado a 5 μg/ml diluido en un
tampón 0,1M de Na2CO3/ NaHCO3 pH 9,6. Las placas tratadas fueron recubiertas con el
anticuerpo marcado anti CEA (3C1)-TCO, mientras que las placas estándar, lo fueron con el
anticuerpo anti CEA (3C1) sin modificar. Tras 1 h de incubación, ambas placas continuaron con el
mismo procedimiento. Estas fueron lavadas 5 veces con 0,2 ml por pocillo de PBS-Tween 20
0,05% y posteriormente fueron bloqueadas con una solución de PBS-BSA 1%. La proteína CEA
diluida en una solución de PBS pH 7,4 conteniendo 0,5% de BSA, fue añadida en el rango de
concentraciones de 0-200 ng/ml e incubada a temperatura ambiente durante 1 h. El anticuerpo
biotinilado anti CEA (3C6) a 0,5 μg/ml fue añadido como anticuerpo de detección luego de los
lavados e incubado durante 1 h a 37 ºC. Posteriormente, la estreptavidina-HRP (ThermoFisher,
21130) fue añadida a 100 ng/ml e incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente
protegida de la luz. Tras 5 lavados, se añadió el sustrato TMB a razón de 100 µl por pocillo. La
reacción fue detenida con 100 µl por pocillo de 1M de HCl. La absorbancia se determinó a 450
nm usando el lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
59
Figura 23. Esquema del ELISA desarrollado en superficies estándar recubriendo con el anticuerpo anti CEA
(3C1) sin modificar o en superficies previamente recubiertas con BSA-tetracina y posteriormente añadido
el anticuerpo anti CEA-TCO (3C1). Se representa la reacción entre la tetracina aportada por la proteína
BSA y el TCO procedente del anticuerpo. Ambos ELISA se revelan con el anticuerpo anti CEA (3C6) biotina.
Para el cálculo del LOD y el LOQ fue utilizado el procedimiento descrito en el apartado 2.2.1.1.1
utilizando para ello 10 pocillos de controles negativos de cada superficie. Los controles negativos
fueron realizados usando, en vez de la proteína CEA, el tampón de dilución utilizado en este
paso. Este ELISA fue realizado en paralelo 3 veces en días diferentes para determinar la variación
intra ensayo y establecer el LOD y el LOQ.
2.2.4.3. ELISA para la detección del anticuerpo anti c-myc-TCO uniéndose a superficies
Para la detección de la unión específica entre el anticuerpo anti c-myc-TCO (4 grupos TCO) con
las superficies de tetracina, se utilizaron superficies previamente recubiertas con 20 µg/ml de
BSA-tetracina (Fig. 24). Luego del bloqueo, fue añadido el anticuerpo anti c-myc-TCO o el
anticuerpo anti c-myc sin modificar en el rango de concentraciones desde 15,6 a 2.000 ng/ml.
Tras 1 h de incubación a 37 ºC, los pocillos fueron lavados 3 veces con el tampón de lavado PBS-
Tween-20 0,05%. El anticuerpo unido fue detectado usando el anticuerpo de revelado anti
mouse HRP (Sigma-Aldrich, A2554) que fue incubado durante 1 h a temperatura ambiente
protegido de la luz. Tras 5 lavados se añadieron 100 µl por pocillo del sustrato TMB. La reacción
fue detenida con 1M de HCl y la medida fue realizada a 450 nm usando el equipo de lectura
FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
60
Figura 24. Esquema del ELISA para la detección de la reacción de tipo química clic entre el anticuerpo anti
c-myc-TCO y una superficie recubierta con BSA- tetracina. Como control se utiliza el anticuerpo anti c-myc
sin modificar.
El tiempo de incubación óptimo de unión entre ambos grupos funcionales fue determinado
usando diferentes concentraciones del anticuerpo anti c-myc unido a TCO (100, 200, 500, 1.000,
2.000 y 5.000 ng/ml), y dos concentraciones del anticuerpo anti c-myc sin modificar (1.000 y
5.000 ng/ml) como controles negativos. Los tiempos ensayados fueron 30, 60, 120, 180, 240 y
300 minutos.
2.2.4.4. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en

superficies estándar y tratadas con tetracina
Se realizó en paralelo el ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST- IL8h en

superficies estándar de ELISA y en superficies tratadas con tetracina (Fig. 25). En ambos casos el
anticuerpo anti c-myc fue utilizado en el recubrimiento a 2 μg/ml en un tampón a 0,1M de
Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6. El anticuerpo sin modificar fue utilizado en las placas estándar, mientras
que en las tratadas con tetracina fue empleado el anticuerpo modificado anti c-myc-TCO.
Posteriormente, las placas fueron bloqueadas con una solución de PBS pH 7,4 conteniendo BSA
1% durante 30 minutos a 37 ºC. La proteína c-myc-GST-IL8h fue añadida en un rango de
concentraciones de 0,78-100 ng/ml e incubada a 37 ºC durante 1 h. Para eliminar absorciones
inespecíficas de la proteína se llevaron a cabo 5 lavados con 0,2ml de PBS-Tween-20 0,05%. El
anticuerpo anti IL8-biotina (clon MT8F19) a 1 µg/ml fue añadido e incubado durante 1 h a 37 ºC.
Tras 5 lavados se añadió la estreptavidina-HRP (ThermoFisher, 21130) a 100 ng/ml e incubado a
temperatura ambiente y protegida de la luz durante 30 minutos. Como sustrato se utilizó TMB y
la reacción fue detenida con una solución de HCl 1M. La absorbancia fue medida a 450 nm
usando el lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
61
Figura 25. Esquema del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h desarrollado en
superficies estándar de ELISA o en superficies tratadas con tetracina. El anticuerpo utilizado en placas
estándar no está modificado mientras que el anticuerpo utilizado en las placas tratadas con tetracina
tiene incorporado el grupo funcional TCO. El resto del ELISA se desarrolla de la misma forma en ambos
casos.
Para el cálculo del LOD y el LOQ fue utilizado el procedimiento descrito en el apartado 2.2.1.1.1
usando para ello 10 pocillos de controles negativos de cada superficie. Estos controles fueron
realizados usando el tampón de dilución en este paso el cual es PBS conteniendo 0,05% de BSA,
en vez de la proteína recombinante. Este ELISA se repitió 3 veces en días diferentes en placas
recubiertas con 20 µg/ml de BSA-tetracina para establecer el LOD y el LOQ atendiendo a la
variación intra ensayo.
2.2.4.5. ELISA comparativo de detección de la proteína c-myc-IL6h en superficies estándar y

Los ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h en superficies estándar

(ThermoFisher, 442404) y en superficies previamente aminadas mediante clorosulfonación-
sulfonamidación y posteriormente tratadas con tetracina, se realizaron en paralelo. En ambos
casos el anticuerpo anti c-myc fue utilizado en el recubrimiento a 2 μg/ml en un tampón a 0,1 M
de Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6. En las placas estándar se utilizó el anticuerpo sin modificar mientras
que las placas tratadas con tetracina fue utilizado el anticuerpo modificado anti c-myc-TCO (Fig.
26). Posteriormente, las placas fueron bloqueadas con una solución de PBS pH 7,4 conteniendo
BSA 1% durante 30 minutos a 37 ºC. La proteína c-myc-IL6h fue añadida en un rango de
concentraciones de 48-770 ng/ml e incubada a 37 ºC durante 1 h. Fueron realizados 5 lavados
con 0,2 ml de PBS-Tween 20 0,05% para eliminar absorciones inespecíficas de la proteína. El
anticuerpo anti IL6h biotina (Immunotools GmbH, 31330069) diluido 1/100 fue añadido e
62
incubado durante 1 h a 37 ºC. Luego de 5 lavados fue añadida la estreptavidina-HRP a 100 ng/ml
e incubada protegida de la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como sustrato fue
utilizado el TMB y la reacción fue detenida con una solución de 1 M de HCl. La absorbancia fue
medida a 450 nm usando el lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
Figura 26. Esquema del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h desarrollado en
superficies estándar de ELISA o en superficies aminadas tratadas con tetracina. El anticuerpo utilizado en
placas estándar no está modificado mientras que el anticuerpo utilizado en las placas tratadas con
tetracina tiene incorporado el grupo funcional TCO. El resto del ELISA se desarrolla de la misma forma en
ambos casos.
63
2.3. RESULTADOS
2.3.1. Obtención de proteínas recombinantes utilizadas en los ELISAs modelos para la

2.3.1.1. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-IL6h en células de
mamífero. Cuantificación y detección mediante ELISA
La clonación del inserto correspondiente a la proteína de fusión c-myc-IL6h fue comprobada

mediante secuenciación del plásmido obtenido, el cual fue denominado pCDNA3.1-c-myc-IL6h
(Fig. 27). Posteriormente, el plásmido fue utilizado para transfectar las células de la línea CHO-
K1.
Figura 27. Esquema de la clonación de la proteína recombinante c-myc-IL6 humana en el vector de

expresión de células de mamíferos pCDNA3.1.
La proteína recombinante c-myc-IL6h, expresada en el sobrenadante del cultivo de las células

transfectadas e incubadas durante 72 h, fue cuantificada mediante un ELISA tipo sándwich de
IL6 humana. Usando la citoquina IL6 humana proporcionada por el kit, fue realizada una curva
de regresión lineal, obteniéndose que la concentración de la proteína recombinante en el
sobrenadante del cultivo fue de 770,3 ± 6,5 ng/ml (Fig. 28).
64
Figura 28. ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6 humana. Curva sigmoidal obtenida
en el ELISA sándwich de detección de IL6h (azul) y curva del ELISA de detección de la fusión de c-myc con
IL6h en la proteína recombinante (rojo). Se representan el LOD y el LOQ obtenidos para cada ELISA.
Mediante el ELISA tipo sándwich usando anti c-myc 9E10 como anticuerpo de captura y el
anticuerpo anti IL6h biotinilado de detección, observamos que la proteína era reconocida por
ambos anticuerpos, detectándose de esta manera la fusión de la proteína IL6 humana con el tag
anti c-myc (Fig. 28). Como se observa en la figura la sensibilidad de ambos ELISAs es bastante
diferente. En el caso del ELISA usando como anticuerpo de captura anti IL6 humano, el LOD y el
LOQ están en el orden de pg/ml (30 y 43 pg/ml, respectivamente), mientras que cuando fue
utilizado como anticuerpo de captura, el anticuerpo anti c-myc, observamos una disminución de
la sensibilidad del ELISA en un orden de magnitud (hasta ng/ml), siendo el LOD y el LOQ, 96,5 y
117,7 ng/ml, respectivamente.
2.3.1.2. Clonación y expresión de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en E. coli.

Purificación en columna de afinidad y detección mediante ELISA.
El plásmido pET43a-c-myc-GST-IL8h fue secuenciado con el objetivo de detectar el inserto de

interés correspondiente a la proteína de fusión clonada, el mapa del plásmido se representa en
la Fig. 29.
65
Figura 29. Vector de expresión de la proteína recombinante His6- c-myc-GST-IL8h. La proteína IL8h está
fusionada en su extremo carboxilo terminal a GST (Glutation-S-transferasa), el proto oncogen c-myc y un
tándem de 6 histidinas.
Posteriormente, el plásmido obtenido fue usado para transformar las células de E. coli BL21
(DE3). A partir del cultivo de estas células se obtuvieron 10 mg/L de la proteína recombinante.
La electroforesis en gel de acrilamida muestra una banda de aproximadamente 38 kDa, que se
corresponde con la masa molecular esperada, observándose además un alto grado de pureza de
la proteína (Fig. 30).
38 kDa
Figura 30. Análisis de la proteína recombinante His6-c-myc-GST-IL8h obtenida en las células BL21 (DE3) de
E. coli. La imagen muestra un gel de acrilamida al 10% teñido con azul de Coomassie. Carriles: 1. Patrón de
peso molecular (Gene On); 2. 1 µg His6-c-myc-GST-IL8h. La flecha indica la proteína purificada.
La proteína recombinante His6-c-myc-GST-IL8h fue detectada mediante el ELISA sándwich de IL8

humana, así como el ELISA donde además de IL8 humana se detecta el tag c-myc en la proteína
quimérica. Como se observa, el rango de detección de la proteína varía considerablemente
entre ambos ELISAs, lo que puede ser debido a la sensibilidad del ensayo dado que el anticuerpo
anti c-myc tiene menos sensibilidad que el anti IL8 humano. Cuando en el ELISA fue utilizado el
anticuerpo anti IL8 humano como anticuerpo de captura, el LOD y el LOQ fueron de 0,03 y 0,037
66
ng/ml, respectivamente. Sin embargo, cuando el anticuerpo de captura utilizado es el anti c-

myc, el LOD es de 10,8 ng/ml y el LOQ es de 13,69 ng/ml (Fig. 31).
Estos resultados evidencian la importancia del anticuerpo de captura en los ELISAs tipo
sándwich, ya que la diferencia de sensibilidad entre ambos ELISA donde solo cambia el
anticuerpo de captura, es entre 360 y 370 veces. Este mismo perfil fue observado en el ELISA de
detección de c-myc-IL6h. En ambos casos cuando es utilizado el anticuerpo anti citoquina, la
sensibilidad es mucho mayor que cuando es utilizado el anticuerpo anti c-myc.
Figura 31. Análisis de la proteína recombinante His6-c-myc-GST-IL8h obtenida en E. coli mediante ELISA.
Curva sigmoidal 4PL del ELISA desarrollado usando anti IL8 humano (negra) o anti c-myc (gris) como
anticuerpos de captura. Las barras de error corresponden a tres triplicados para cada concentración de la
proteína recombinante. Se indica la EC50, el LOD y el LOQ en cada caso.
2.3.2. Modificación de anticuerpos y BSA para la incorporación de grupos funcionales

2.3.2.1. Incorporación del grupo funcional trans-cicloocteno en los anticuerpos anti c-myc y
anti CEA a través de la reacción N-hidoxisuccinimida con los grupos amino libres del
anticuerpo
Los anticuerpos utilizados en el recubrimiento de los ELISAs fueron modificados con el objetivo
de incorporar el grupo reactivo TCO, el cual posteriormente debe unirse a los grupos tetracina
que serán expuestos en las superficies de las placas de ensayo mediante una reacción bio-
ortogonal. La incorporación de los grupos TCO se realizó mediante la reacción de N-
hidroxisuccinimida éster con un grupo amino libre del anticuerpo formando un enlace tipo
amida. Este grupo amino puede estar ubicado en cualquier región del anticuerpo, por lo que la
modificación sería al azar y no estaría direccionada a ninguna región específica del anticuerpo.
67
Utilizando el anticuerpo anti c-myc (9E10) fueron ensayadas diferentes relaciones molares del
reactivo con respecto al anticuerpo: 15:1, 10:1 y 5:1. Atendiendo a los resultados de la
cuantificación de los distintos acoplamientos observamos que, a medida que aumenta la
relación molar del reactivo con respecto al anticuerpo, aumenta la cantidad de grupos TCO
incorporados en el mismo (Tabla 5).
Tabla 5. Cuantificación del anticuerpo anti c-myc-TCO mediante absorbancia a 280 y a 350nm para
determinar la relación molar final de grupos TCO por molécula de anticuerpo. Para la concentración
molar del anticuerpo se tiene en cuenta la Absorbancia 280nm corregida, que es igual a la
Absorbancia 280nm – (Absorbancia 350nm x 0,4475).
Relación Absorbancia Absorbancia Molaridad Molaridad Relación mg/ml del
inicial TCO: 280nm 350nm de TCO de anti c- final TCO: anticuerpo
Anticuerpo (µM) myc (µM) Anticuerpo
5:1 1,266 0,438 22,46 5,27 4,26 0,76
10:1 1,317 0,764 39,18 4,80 8,16 0,70
15:1 1,507 1,013 51,95 5,19 10,01 0,75
-1 -1 -1 -1
Ɛ280nm del anticuerpo= 204.000 M cm ; Ɛ350nm = 19.500 M cm ; MW anticuerpo= 150.000 g/mol
Posteriormente a la reacción del anticuerpo anti CEA (3C1) con el reactivo trans-cicloocteno NHS
éster a una relación 5:1, pudo constatarse por cuantificación a absorbancia 280 nm y 350nm,
que fueron incorporados 3,6 moléculas de TCO por molécula de anticuerpo.
Mediante un ELISA indirecto de reconocimiento del antígeno c-myc, se analizó si los anticuerpos
modificados mantenían su actividad y no afectaban el reconocimiento del antígeno por la
incorporación de los grupos TCO.
2.3.2.1.1. Detección de la actividad del anticuerpo c-myc-TCO mediante ELISA
Los anticuerpos anti c-myc-TCO (relación final 4 TCO: 1 anti c-myc, 8 TCO: 1 anti c-myc y 10 TCO
1: anti c-myc) fueron cuantificados mediante ELISA utilizando como patrón el anticuerpo sin
modificar. Se tomó como uno de los criterios de actividad del anticuerpo, la cuantificación de la
concentración. En caso de que el anticuerpo mediante ELISA tuviese una concentración menor
de la indicada por absorbancia a 280nm, esto indicaría que el anticuerpo habría perdido su
actividad ya que, aun estando presente en la muestra, no estaría reconociendo a su antígeno.
Para ello fue realizado el ELISA indirecto de detección del antígeno c-myc específico usando la
proteína recombinante c-myc-GST-IL8h y la absorbancia obtenida se interpoló en la curva patrón
de anti c-myc (9E10) para cada uno de los anticuerpos a cuantificar. Como se observa en la Tabla
6, los anticuerpos con 8 y 10 grupos TCO por molécula (relación de acoplamiento 10:1 y 15:1,
respectivamente) han perdido la actividad ya que sus concentraciones medidas por ELISA son
más bajas que la cuantificación medida por absorbancia a 280nm. Por otro lado, el anticuerpo
68
con 4 TCO incorporados conservó la actividad, ya que su concentración medida por ELISA (0,698
mg/ml) se corresponde con la concentración determinada por absorbancia a 280nm (0,76
mg/ml).
Tabla 6. Cuantificación de los anticuerpos anti c-myc, previamente modificados para la

incorporación de grupos TCO en diferentes relaciones molares, mediante ELISA indirecto de
reconocimiento de c-myc-GST-IL8h y usando como patrón el anticuerpo sin modificar.
TCO: anti c- Dilución en el Absorbancia Abs 450nm-Abs Log [Muestra] µg/ml
myc ELISA 450nm 450nm blanco µg/ml muestra
4:1 70000 2,155 2,005 0,9993 698,84
8:1 35000 2,339 2,189 1,0447 387,93
10:1 35000 0,989 0,839 0,6005 139,51
Usando este mismo esquema de ELISA obtuvimos una curva comparativa con cada anticuerpo
detectando que la actividad de los anticuerpos modificados con más de 4 grupos TCO había
disminuido. En la Fig. 32 se observa la pérdida de actividad de los anticuerpos 8 TCO: 1 anti c-
myc y 10 TCO 1: anti c-myc, mientras que el anticuerpo con 4 grupos TCO incorporados presenta
una curva muy similar a la del patrón.
Figura 32. ELISA para la cuantificación y detección de la actividad del anticuerpo anti c-myc unido al grupo
reactivo TCO usando como patrón el anticuerpo sin modificar. Curva sigmoidal 4PL comparativa del
anticuerpo anti c-myc (9E10) sin modificar (azul) y los anticuerpos anti c-myc-TCO relación 4 TCO: 1
anticuerpo (roja), 8:1 (verde) y 10:1 (magenta) obtenida en el ELISA de detección del antígeno c-myc. Para
cada concentración se representa la desviación estándar de 3 réplicas de cada una.
Atendiendo a estos resultados se seleccionó la relación molar 4:1 para la incorporación de TCO
en el anticuerpo anti CEA (3C1).
69
2.3.2.1.2. Detección de la actividad del anticuerpo anti CEA-TCO mediante ELISA
La detección de la actividad del anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) se llevó a cabo mediante ELISA
indirecto usando el antígeno CEA en el recubrimiento. Tomando como patrón el anticuerpo sin
modificar, fue cuantificado el anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) (Fig. 33). Atendiendo a los
resultados de la cuantificación del anticuerpo a 280nm, que fue de 0,6 mg/ml, y la cuantificación
según ELISA de 0,53 mg/ml, se comprobó que el anticuerpo con los grupos TCO incorporados no
perdió su actividad de reconocimiento del antígeno.
Figura 33. Curva sigmoidal 4PL del patrón del anticuerpo anti CEA (3C1) sin modificar tomada para el
cálculo de la concentración del anticuerpo anti CEA-TCO (3C1).
2.3.2.2. Incorporación del grupo funcional tetracina en la albúmina de suero bovino
La absorbancia a 520 nm de la proteína BSA- tetracina dializada de forma extensiva contra PBS
pH 7,4, fue interpolada en la curva del reactivo Methyl Tetrazine–PEG4-NHS-éster (Fig. 34)
obteniéndose de este modo la concentración molar de la tetracina presente en la proteína
modificada. La concentración molar de la proteína fue medida mediante Bradford usando una
curva de BSA y teniendo en cuenta la MW aproximada de BSA de 66.433 g/mol. De esta forma
se calculó la concentración molar de la proteína. Finalmente, la relación entre ambas
concentraciones molares indicó que había 25 grupos reactivos tetracina por molécula de BSA.
Figura 34. Curva de molaridad del reactivo Methyl Tetrazine–PEG4-NHS-éster contra absorbancia a
520nm.
70
2.3.3. Preparación de superficies con alta densidad del grupo funcional tetracina
2.3.3.1. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno previamente aminadas
mediante química en mojado
Las superficies de poliestireno fueron modificadas mediante una técnica de química en mojado,
específicamente a través de la clorosulfonación. Esta técnica fue seleccionada ya que produce
de manera selectiva grupos clorosulfonilo en la superficie, que son químicamente estables en
condiciones ambientales de temperatura, humedad y aire normales, además de que permite la
posterior reacción con aminas alifáticas (sulfonamidación) en condiciones muy suaves (bajas
temperaturas y medio acuosos) y selectivas, de manera cuantitativa (véase Fig. 7). Aunque se
han descrito diferentes metodologías de clorosulfonación, en este trabajo esta reacción fue
realizada a -10 ºC, realizándose posteriormente un aclarado con una solución de ácido sulfúrico
y agua helada, lo que permitió la obtención de superficies transparentes con una modificación
controlada (Del Prado et al., 2012). De este modo, se prepararon superficies con 1,5 y 3
nmoles/cm2 de grupos amino que fueron tratadas posteriormente con Methyl Tetrazine–PEG4-
NHS-ester para la obtención de grupos tetracina en la superficie de las placas.
Con el objetivo de determinar la concentración idónea de grupos amino en superficie, se realizó

el ELISA comparativo de detección de la proteína c-myc-GST-IL8h en placas con superficie
estándar y placas aminadas y posteriormente tratadas con tetracina. Posteriormente se realiza
un ajuste logarítmico de 4 parámetros y se calcula el LOD y LOQ para cada tipo de superficie.
Como se observa en la Figura 35, las curvas obtenidas para 1,5 y 3 nmoles/cm2 de grupos amino
son similares y ambas presentan diferencias muy significativas con respecto a la superficie
estándar, indicando que la sensibilidad de la detección de la proteína ha aumentado. Las placas
con superficies de 1,5 nmoles/cm2 de amino tratadas con tetracina aumentan la sensibilidad 5
veces, mientras que las de 3 nmoles/cm2 de grupos amino aumentan la sensibilidad
aproximadamente 11 veces con respecto a la superficie estándar, como se aprecia en la Tabla 7.
71
Figura 35. Curva sigmoidal 4PL obtenida del ELISA realizado para la detección de c-myc-GST-IL8h, de
forma paralela, en diferentes tipos de superficie; superficie estándar de ELISA (azul) y superficies
aminadas con diferentes concentraciones de grupos NH 2 (3nM verde) y 1.5nM (roja) y posteriormente
tratadas con tetracina. En las superficies tratadas con tetracina se utiliza el anticuerpo anti c-myc, que
lleva incorporados grupos TCO, mientras que en la superficie estándar se utiliza el anticuerpo anti c-myc
sin modificar. Para cada concentración de la proteína recombinante se representa la desviación estándar
de 3 réplicas de cada una.
Tabla 7. Comparación en la detección de c-myc-GST-IL8h desarrollada en una superficie

2
estándar o en superficies aminadas con 1,5 y 3 nmoles/cm de grupos amino.
2 2
Superficie 3 nmoles/cm NH2 + 1.5 nmoles/cm NH2
estándar Tetracina + Tetracina
LOD (ng/ml) 9,90 0,81 1,97
LOQ (ng/ml) 12,83 1,22 2,74
2
R 0,9997 0,9987 0,9948
2.3.3.2. Exposición del grupo tetracina en superficies de poliestireno aminadas usando poli-
lisina-tirosina
Como alternativa a las placas preparadas mediante química en mojado, se prepararon

superficies conteniendo un alto porcentaje de grupos amino en superficie partiendo de placas
disponibles comercialmente (CovaLink), que previamente presentaban una densidad baja de
estos grupos por cm2. Las placas fueron tratadas con glutaraldehído, molécula de naturaleza
bifuncional que posee dos grupos aldehídos en su estructura separadas por una cadena
carbonada. Uno de los grupos aldehído podría formar un enlace con el grupo amino de la
superficie mientras que el otro podría formar otro enlace con los grupos amino de la lisina del
compuesto poli-lisina-tirosina, creando de esta manera un cruzamiento entre la superficie de la
placa y la molécula poli-lisina-tirosina. Este último compuesto multiplicaría los grupos aminos
libres en superficie, ya que presenta 4 lisinas en cada molécula. Estos grupos quedarían
72
expuestos en la superficie a una distancia mayor que los grupos amino originales y podrían
reaccionar con el reactivo NHS-tetracina.
Estas superficies preparadas con tetracina a partir del uso del compuesto poli-lisina-tirosina,
fueron comparadas con las superficies estándar y con superficies preparadas con BSA-tetracina
mediante el ELISA de detección de la proteína c-myc-GST-IL8h. Se realizó un ajuste sigmoidal 4PL
con cada curva realizada en paralelo y se observaron las diferencias en la detección entre cada
superficie. Como se aprecia en la Fig. 36, la superficie estándar muestra señales de absorbancia
más bajas para la misma concentración de la proteína recombinante que las dos superficies
preparadas con tetracina. Sin embargo, las señales con las placas recubiertas previamente con
BSA tetracina presentaron mejores resultados. Usando estas curvas y 10 controles negativos en
cada superficie, se calcularon el LOD y el LOQ y se comprobó que las placas preparadas con BSA-
tetracina muestran una sensibilidad 8 veces mayor que las placas estándar, mientras que las
placas aminadas con glutaraldehído-poli-lisina-tirosina y posteriormente tratadas con tetracina
fueron 2,5 veces más sensibles (Tabla 8). De todo ello se puede deducir que las placas BSA-
tetracina son 3 veces más efectivas que las de poli-lisina-tetracina y el proceso de obtención es,
además, mucho más simple.
Figura 36. Curva sigmoidal 4PL obtenida del ELISA realizado para la detección de c-myc-GST-IL8h, de
forma paralela, en una superficie estándar de ELISA (azul), una superficie tamizada con poli-lisina y
posteriormente tratada con tetracina (verde) y una superficie recubierta con BSA-tetracina (roja). En las
superficies tratadas con tetracina se utiliza el anticuerpo anti c-myc-TCO, mientras que en la superficie
estándar se utiliza el anticuerpo anti c-myc sin modificar. Para cada concentración de la proteína
recombinante se representa la desviación estándar de 3 réplicas.
73
Tabla 8. Curva sigmoidal 4PL comparativa del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h

desarrollado sobre tres superficies de forma paralela: superficie estándar, superficie
previamente recubierta con 20 µg/ml de BSA-tetracina y superficie aminada mediante
glutaraldehído-poli-lisina-tirosina y posteriormente tratada con tetracina.
Superficie estándar BSA-Tetracina Poli-lisina-tetracina
LOD (ng/ml) 10,47 1,29 3,99
LOQ (ng/ml) 12,14 1,42 4,89
2
R 0,9983 0,9998 0,9991
2.3.3.3. Exposición del grupo tetracina en superficies estándar de ELISA usando la proteína
BSA-Tetracina
La proteína BSA-tetracina se utilizó en el recubrimiento de superficies de ELISA estándar a

concentraciones altas (20, 50 y 100 µg/ml) para permitir la exposición del grupo tetracina en las
superficies. Se determinó mediante el ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h la concentración
óptima de la proteína con la cual la sensibilidad del ELISA aumenta. Como se observa en la Fig.
37, la concentración de la proteína BSA-tetracina en el rango de 20 a 100 µg/ml no tiene un
efecto sobre la sensibilidad del ELISA. Si consideramos como hipótesis nula que no hay
diferencias significativas entre los LOD y LOQ calculados, usando el concepto estadístico de los
cuadrados medios obtenemos para el LOD y el LOQ unos valores de 0,015 y 0,006
respectivamente, indicando que no hay diferencias significativas en la detección de la proteína
con una probabilidad del 95% (Tabla 9).
Figura 37. Curva sigmoidal 4PL del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h
desarrollado en superficies recubiertas previamente con la proteína BSA-tetracina a diferentes
concentraciones y usando como anticuerpo de captura anti c-myc-TCO.
74
Tabla 9. Comparación en la detección de c-myc-GST-IL8h desarrollada en una

superficie estándar o recubierta previamente con la proteína modificada
BSA-Tetracina a diferentes concentraciones.
BSA-Tetracina LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml)
20 µg/ml 1,17 1,60
50 µg/ml 1,34 1,68
100 µg/ml 1,41 1,53
p 0,015 0,006
LOD: Límite de detección; LOQ: Límite de cuantificación; p: variación atendiendo al concepto de
cuadrados medios
2.3.4. ELISAs desarrollados para la evaluación de las superficies activadas con tetracina
2.3.4.1. ELISA para la detección del anticuerpo anti CEA-TCO uniéndose a superficies tratadas
con tetracina
La reacción química esperada en la superficie de la placa de ELISA sería una reacción de

cicloadición entre la tetracina y el TCO formándose un enlace covalente estable. Esta reacción es
muy rápida a temperatura ambiente y no requiere catalizadores (Cu (I)) para la formación del
producto. De esta manera se crea un enlace covalente que permite la unión del anticuerpo que
lleva el grupo TCO y la tetracina que se encuentra en la superficie de la placa, lo que evita la
pérdida del anticuerpo de captura en los sucesivos pasos de lavados que conllevan los ensayos
tipo ELISA, además de aumentar la densidad de anticuerpo en la superficie.
Para comprobar que la reacción entre la tetracina y el TCO estaba ocurriendo, se utilizó el
anticuerpo de revelado anti mouse para detectar al anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) unido a la
superficie previamente recubierta con BSA-tetracina. Como se observa en la Fig. 38, a medida
que aumenta la concentración del anticuerpo unido a TCO aumenta la señal de absorbancia en
las superficies con tetracina, mientras que en la superficie que fue recubierta solamente con BSA
no se detectó señal. Esto demostraría que el anticuerpo se está uniendo mediante la reacción de
cicloadición entre la tetracina y el TCO a la superficie de la placa, creándose un enlace covalente
entre ambos.
75
Figura 38. Ensayo de detección de la unión entre los grupos tetracina expuestos en la superficie de la
placa y los grupos TCO aportados por el anticuerpo. Curva sigmoidal 4PL comparativa entre el ELISA
realizado en placas previamente recubiertas con BSA-tetracina o con BSA.
La concentración óptima a utilizar del anticuerpo modificado anti CEA-TCO (3C1) sería aquella en
la que la señal de absorbancia sea saturante, de modo que este paso no se convierta en
limitante en el ELISA de cuantificación de la proteína CEA. En la Fig. 38 se observa que a partir de
1.000 ng/ml de anticuerpo se llega a la saturación de la señal.
2.3.4.2. ELISA comparativo de detección de la proteína CEA en superficies estándar y tratadas

con tetracina
El ELISA de detección de la proteína CEA fue desarrollado en superficies estándar o en

superficies previamente recubiertas con BSA-tetracina. En la Fig. 39 se muestra la curva
sigmoidal obtenida para ambos ELISAs desarrollados de forma paralela. En las placas en las que
se utiliza la reacción tetracina-TCO, se observan mayores señales para las mismas
concentraciones de la proteína CEA si se compara con las placas donde el anticuerpo de captura
se une solamente por adsorción a la superficie, de modo que la curva para la superficie a
ensayar se desplaza hacia la izquierda con respecto a la curva de la superficie control.
76
Figura 39. Curva sigmoidal 4PL comparativa del ELISA de detección de CEA desarrollado en superficies
estándar recubriendo con el anticuerpo anti CEA (3C1) sin modificar (azul) o en superficies previamente
recubiertas con BSA-tetracina y posteriormente añadido el anticuerpo anti CEA-TCO (3C1) (roja).
El mismo ELISA fue desarrollado 3 veces en paralelo para determinar la sensibilidad del ensayo
teniendo en cuenta la variación inter ensayo. En la tabla 10 se muestran los valores del LOD
obtenidos para cada tipo de superficie en las tres repeticiones, observándose que hay un
aumento de sensibilidad aproximado de 12 veces cuando se involucra la reacción tipo química
clic entre la tetracina aportada por el recubrimiento de la placa y el trans-cicloocteno aportado
por el anticuerpo anti c-myc-TCO con respecto a una superficie estándar.
Tabla 10. Tabla comparativa de los resultados obtenidos del ELISA de detección de CEA
desarrollado en paralelo en superficies previamente recubiertas con BSA-tetracina y usando
posteriormente el anticuerpo anti CEA-TCO, comparado con el ELISA desarrollado en
superficies estándar con el anticuerpo anti CEA.
Superficie estándar Superficie BSA- Relación de sensibilidad
tetracina
1-LOD 7,095 0,574 12,36
2-LOD 7,903 0,671 11,78
3-LOD 7,420 0,571 12,99
Media 7,473 0,605 12,38
SD inter ensayo 0,407 0,057 0,605
CV% inter 5,44 9,40 4,89
ensayo
LOD: Límite de detección, SD inter ensayo: Desviación estándar inter-ensayo, % CV inter ensayo: Porcentaje del
coeficiente de variación inter-ensayo
Posteriormente fueron analizados ambos grupos mediante un test t de Student, no emparejado,

obteniéndose una diferencia significativa amplia (p < 0,001) entre ambos tipos de superficies
(Fig. 40).
77
Figura 40. Resultados obtenidos del ELISA de detección de CEA. Gráfico de barras del LOD (ng/ml)
obtenido en cada superficie mostrando las diferencias significativas (p>0,0001) entre ambos grupos.
2.3.4.3. ELISA para la detección del anticuerpo anti c-myc-TCO uniéndose a superficies
En el ELISA de detección de la unión del anticuerpo anti c-myc (9E10)-TCO a la tetracina de la

superficie aportada por la proteína BSA-tetracina, se detecta que este se une de forma
específica a la superficie, ya que si se compara con el anticuerpo anti c-myc sin modificar no se
observa señal (Fig. 41). A medida que aumenta la concentración del anticuerpo, aumenta de
forma exponencial la señal de absorbancia en el ELISA siendo la EC50 de 180 ng/ml,
observándose una saturación a los 2.000 ng/ml del anticuerpo.
Figura 41. ELISA para la detección de la unión entre anti c-myc-TCO y la tetracina expuesta en la superficie
de una placa. Curva sigmoidal 4PL de concentración del anticuerpo contra señal de absorbancia.
Para determinar el tiempo óptimo de la reacción entre la tetracina y el grupo TCO, se realizó el
mismo ELISA, incubando la reacción entre el anticuerpo unido a TCO y la superficie recubierta
con BSA-tetracina, previo bloqueo con PBS-BSA 1%, a diferentes tiempos y usando diferentes
78
concentraciones del anticuerpo anti c-myc-TCO. En la Fig. 42 se observa que a partir de 2 horas
de incubación (120 minutos), aparece una meseta en la curva de cada concentración del
anticuerpo, indicando que incubaciones más prolongadas no inducen aumento de señalización
del ELISA de forma significativa. Además, se puede observar que a concentraciones muy bajas
del anticuerpo no se obtienen señales muy altas, lo que indica que en el ELISA de detección
específico de un analito utilizando el sistema de reacción tetracina- TCO, no se deben usar
concentraciones del anticuerpo inferiores a 1.000 ng/ml.
Figura 42. Optimización del tiempo de incubación de la reacción en la superficie de la placa entre el grupo
reactivo tetracina y el grupo TCO aportado por el anticuerpo. Para cada concentración del anticuerpo
(100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000 ng/ml) fueron utilizadas 4 réplicas en cada tiempo de reacción. El
gráfico muestra la desviación estándar entre las mediciones de cada concentración del anticuerpo. Se
utilizaron como controles negativos el anticuerpo anti c-myc sin modificar en la placa recubierta con BSA-
tetracina y en la placa recubierta con BSA, el anticuerpo anti c-myc-TCO a 5.000 ng/ml (no se representan
porque ambos controles presentan la misma señalización que el blanco del ELISA).
2.3.4.4. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en

Se obtuvieron dos tipos de superficies tratadas con tetracina:
a) Recubiertas previamente con 20 µg/ml de la proteína BSA- tetracina
b) Amidadas previamente mediante clorosulfonación-sulfonamidación y posteriormente

tratadas con NHS-tetracina.
En ambas superficies se esperaba una reacción entre el grupo tetracina de la superficie y el

grupo TCO aportado por el anticuerpo anti c-myc-TCO. Estas superficies fueron evaluadas para
determinar si aumentaba la sensibilidad atendiendo al LOD y el LOQ obtenido tras desarrollar
los ELISA en paralelo, en tres ensayos realizados en días diferentes, con una superficie estándar
donde fue utilizado el anticuerpo anti c-myc sin modificar. El ELISA desarrollado fue el de
detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8 humano.
79
Con los resultados obtenidos, fue calculado el LOD y el LOQ en cada uno de los ensayos, siendo
para las superficies estándar de 11,17 ± 0,62 ng/ml y 14,4 ± 0,82 ng/ml respectivamente,
mientras que para las superficies recubiertas con BSA-tetracina fue de 0,77 ± 0,05 ng/ml y 1,01 ±
0,14 ng/ml. Atendiendo a la sensibilidad del ensayo para cada superficie, se observó un
aumento de sensibilidad aproximado de 14 veces asociado a la disminución del LOD y del LOQ
(Tabla 11).
Tabla 11. Tabla comparativa de los resultados obtenidos del LOD y el LOQ del ELISA
de detección de c-myc-GST-IL8 humano. Los ELISA se desarrollaron en paralelo en
superficies previamente recubiertas con BSA-tetracina y usando posteriormente el
anticuerpo anti c-myc-TCO, comparado con el ELISA desarrollado en superficies
estándar con el anticuerpo anti c-myc.
Superficie Superficie Relación de
estándar BSA-tetracina sensibilidad
LOD (ng/ml) 11,52 0,70 16,36

1
LOQ (ng/ml) 14,63 0,91 16,13
LOD (ng/ml) 10,45 0,79 13,17

2
LOQ (ng/ml) 13,49 1,16 11,59
LOD (ng/ml) 11,52 0,80 14,39

3
LOQ (ng/ml) 15,07 0,95 15,79
Media 11,17 0,77 14,64
Límite de SD inter ensayo 0,62 0,05

detección (LOD)
CV% inter
5,54 7,01
ensayo
Media 14,40 1,01 14,50
Límite de
SD inter ensayo 0,82 0,14
cuantificación
(LOQ) CV% inter
5,66 13,56
ensayo
Ambas superficies fueron comparadas mediante un test t de Student, obteniéndose diferencias

muy significativas entre ambos grupos (Fig. 43).
80
Figura 43. Comparación entre el LOD y el LOQ (ng/ml) obtenidos en el ELISA de detección de c-myc-GST-
IL8h.
Tabla 12. Tabla comparativa mostrando el LOD y el LOQ calculados a partir de los
resultados obtenidos del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h, que se desarrollaron
en paralelo en superficies previamente aminadas y posteriormente tratadas con
tetracina usando el anticuerpo anti c-myc-TCO comparado con el ELISA desarrollado
en superficies estándar con el anticuerpo anti c-myc.
Superficie Superficie Relación de
estándar NH2-tetracina sensibilidad
LOD (ng/ml) 10,32 0,92 11,22

1 9,55
LOQ (ng/ml) 13,08 1,37
LOD (ng/ml) 10,35 0,92 11,25
2 11,65
LOQ (ng/ml) 13,86 1,19
LOD (ng/ml) 9,98 1,03 9,69
3 9,17
LOQ (ng/ml) 13,39 1,46
Media 10,22 0,96 10,72
Límite de
detección SD inter-ensayo 0,21 0,06
(LOD) CV% inter-ensayo 2,01 6,64
Media 13,44 1,34 10,12
Límite de
cuantificación SD inter-ensayo 0,39 0,14
(LOQ) CV% inter-ensayo 2,99 10,26
Las superficies previamente aminadas mediante clorosulfonación y luego tratadas con tetracina,
fueron evaluadas usando el ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h. El
LOD y el LOQ fueron calculados en cada uno de los ensayos, siendo para las superficies estándar
de 10,22 ± 0,21 ng/ml y 13,4 ± 0,39 ng/ml, respectivamente mientras que para las superficies
donde ocurre la reacción tetracina-TCO fueron de 0,96 ± 0,06 ng/ml y 1,34 ± 0,14 ng/ml.
81
Atendiendo a la sensibilidad del ensayo para cada superficie observamos un aumento de

sensibilidad aproximado de 10 veces asociado a la disminución del LOD y del LOQ (Tabla 12).
En la curva sigmoidal 4PL obtenida en uno de los ensayos realizados, se observa un

desplazamiento de la curva hacia la izquierda debido a un aumento de la señalización cuando
está involucrada la reacción tetracina-TCO en la superficie (Fig. 44a). En la Fig. 44b se observan
diferencias significativas obtenidas entre ambos grupos tanto para el valor del LOD como del
LOQ luego de un análisis mediante un test t de Student.
Figura 44. Análisis de los resultados del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h desarrollado en paralelo en
superficies previamente aminadas y posteriormente tratadas con tetracina usando el anticuerpo anti c-
myc-TCO en comparación con el desarrollado en superficies estándar con el anticuerpo anti c-myc. a.
Curva sigmoidal 4PL obtenida en el ELISA usando para cada concentración 3 réplicas. Se representa la
desviación estándar para cada concentración. b. Gráfico de barras del LOD y el LOQ (ng/ml) obtenido en
cada superficie tras tres repeticiones del ensayo, mostrando las diferencias significativas entre ambos
grupos (p< 0,0001).
2.3.4.5. ELISA comparativo de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h en

Las superficies aminadas mediante química en mojado y posteriormente tratadas con tetracina
fueron evaluadas para determinar si mejoran la sensibilidad del ELISA de detección de la
proteína recombinante c-myc-IL6h. Estas superficies también fueron evaluadas con el ELISA de
detección de la proteína c-myc-GST-IL8h, como fue descrito anteriormente. Para ello se
realizaron paralelamente ambos ELISAs empleando tanto la superficie estándar, como una
superficie modificada por tratamiento con tetracina como soporte del inmunoensayo.
En las superficies estándar fue usado el anticuerpo anti c-myc, mientras que en las superficies
tratadas con tetracina lo fue el anticuerpo anti c-myc-TCO, ello con el objetivo de obtener una
mayor estabilidad y sensibilidad a causa del enlace covalente formado entre la tetracina y el
82
TCO. Como se observa, el límite de detección mejora 9 veces en las placas tratadas con tetracina
con respecto a las MaxiSorp, siendo los valores del LOD y LOQ 9,51 ng/ml y 86,8 ng/ml,
respectivamente. El límite de cuantificación obtenido para las superficies de tetracina fue de
13,2 ng/ml, mientras que para la estándar fue de 110,4 ng/ml mostrando una diferencia de
sensibilidad de 8,4 veces (Fig. 45).
Estos resultados son consistentes y concuerdan con los obtenidos en la comparativa de estas
superficies usando el ELISA de c-myc-GST-IL8h, donde se obtiene un aumento de la sensibilidad
media entre ambas superficies similar (10x).
Figura 45. ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-IL6h realizado paralelamente en

superficies estándar MaxiSorp y en superficie aminada y posteriormente tratada con tetracina. Curva
sigmoidal 4PL mostrando el LOD y el LOQ obtenido en cada caso.
83
2.4. DISCUSIÓN
Existen diferencias significativas en la sensibilidad de detección de una proteína en dependencia

del anticuerpo de captura utilizado en el ELISA. Este hecho ha sido constatado en este trabajo
tanto en la comparación entre el anticuerpo anti IL8h y anti c-myc en la detección de la proteína
recombinante c-myc-GST-IL8h, como en la comparación entre el anticuerpo anti IL6h y anti c-
myc para detectar la proteína c-myc-IL6h. En la detección de la proteína c-myc-GST-IL8h usando
anti IL8h como anticuerpo de captura se obtuvo como LOD 0,03 ng/ml mientras que cuando se
utilizó anti c-myc la diferencia fue de 360 veces con un LOD = 10,8 ng/ml. En la detección de la
molécula c-myc-IL6h usando el anticuerpo anti IL6h como anticuerpo de captura, el LOD fue de
0,03 ng/ml, mientras que cuando se utilizó anti c-myc fue de 96,5 ng/ml. Estos resultados son
debidos probablemente a que la sensibilidad del ensayo queda comprometida al utilizar como
anticuerpo de captura anti c-myc el cual es un anticuerpo de baja afinidad comparado con los
anticuerpos anti IL8h o anti IL6h. Por tanto, el empleo en el recubrimiento de anticuerpos de
baja afinidad genera ELISAs con una menor sensibilidad para la detección de analitos.
Cuando se utiliza un anticuerpo para la detección o cuantificación de su antígeno, la sensibilidad

del ensayo depende en gran medida de la constante de disociación (Kd) del anticuerpo con su
antígeno: si la interacción antígeno anticuerpo es débil, el valor de la Kd es alto; mientras que, si
la afinidad es alta, el valor de la Kd es bajo. De acuerdo con la literatura, la constante de
disociación anticuerpo-antígeno oscila en un amplio rango de 10−5 a 10−12 M−1 (Heinrich et al.,
2010). La constante de disociación de los anticuerpos anti citoquinas se encuentra
aproximadamente en el rango picomolar, mientras que el anticuerpo monoclonal anti cmyc
(clon 9E10) tiene baja afinidad por su antígeno en al menos cinco órdenes de magnitud con una
Kd = 5,3 ± 0,3 × 10−7 M (Evan et al., 1985; Hilpert et al., 2001).
En un estudio sobre la predicción del LOD en la técnica ELISA, fue estimada la cantidad de
antígeno que puede unirse al anticuerpo de captura y posteriormente detectada en un ensayo
colorimétrico donde el sustrato es TMB (Zhang et al., 2013). Estos autores tuvieron en cuenta el
área de recubrimiento de una placa de ELISA, el radio hidrodinámico de una molécula de IgG y
finalmente el modelo de adsorción de Langmuir (Langmuir, 1918). El modelo de Langmuir ha
sido ampliamente usado para cuantificar la cantidad de moléculas adsorbidas a un sustrato
sólido en función de la concentración de la molécula en solución. El modelo de Langmuir plantea
la ecuación:
𝐾×𝐶
𝜃 = 𝜃𝑚á𝑥 ×
1+𝐾×𝐶
dónde: θ: número de sitios ocupados por el antígeno
84
θmáx= número máximo de sitios de unión en la superficie del sustrato

K: constante de unión antígeno- anticuerpo
C: concentración de la solución muestra.
Atendiendo a esto, se evidencia que el número de sitios que serán ocupados por el antígeno
dependen directamente de la constante de afinidad antígeno-anticuerpo. Si la constante de
unión aumentara en dos órdenes de magnitud, el límite de detección disminuiría
proporcionalmente (Zhang et al., 2013).
Diversas estrategias han sido utilizadas para la creación de grupos NH2 en la superficie de las
placas de poliestireno, para posteriormente unir el anticuerpo a estas a través de enlaces
covalentes. Con este fin han sido utilizados enlazadores como el glutaraldehído, que enlaza dos
grupos amino, y la carbodiimida, que enlaza un grupo amino con un carboxilo (Goddard and
Hotchkiss, 2007; Dixit et al., 2011). En este último caso, generalmente se combina el uso de la
carbodiimida con la N-hidroxisuccinimida (NHS) ya que esta estabiliza el intermediario que se
forma en la reacción y se une eficazmente a los grupos amino.
Las superficies activadas con 3-(aminopropil)-trietoxisilano (APTES), las cuales tienen expuestos
grupos amino libres, han sido ampliamente utilizadas para la inmovilización covalente de los
anticuerpos a estas (Dixit et al., 2011; Gunda et al., 2014). Dixit et al. (2011) activaron una
superficie con APTES y luego utilizaron la combinación carbodiimida/ NHS para la unión del
anticuerpo a la superficie mediante una unión covalente a través de un enlace de tipo amida
(véase Fig. 10). Este procedimiento aumentó la sensibilidad del ensayo ELISA para la detección
de la fetuína A humana, unas 16 veces en comparación con la sensibilidad del kit comercial.
Por otro lado, Wang et al. (2019), utilizaron superficies activadas con APTES para la
inmovilización de un antígeno de pequeño tamaño, el antígeno p24 del VIH. Debido a la
dificultad que supone el trabajo con moléculas pequeñas, estos investigadores utilizaron como
enlazador el glutaraldehído que, como se ha mencionado, presenta dos grupos aldehídos, cada
uno en un extremo de la molécula. Por un extremo aldehídico, el reactivo se une a la superficie
de la placa y por el otro, a grupos NH2 libres del antígeno. Con esta metodología, el límite de
detección con respecto a la superficie estándar mejoró 30 veces.
En ambos casos la superficie aminada utilizada ha sido lograda a través de APTES. Sin embargo,
Del Prado et al. (2012) obtuvieron superficies de poliestireno con una alta densidad de grupos
amino mediante un proceso de clorosulfonación seguido por una sulfonamidación. Esta
superficie fue probada exitosamente en un ensayo tipo ELISA de detección de IL6 humana,
donde el reactivo utilizado para el enlace entre el anticuerpo y la superficie fue el
85
glutaraldehído, obteniéndose resultados satisfactorios en comparación con el ELISA realizado

sobre una superficie estándar.
En nuestro caso hemos trabajado con superficies aminadas mediante clorosulfonación-

sulfonamidación, las cuales tenían una alta densidad de grupos amino en superficie. Nuestra
experiencia con superficies preparadas con APTES no fueron reproducibles y no aumentó el
límite de detección del ELISA de referencia (resultados no mostrados).
Sin embargo, en nuestro sistema no utilizamos como enlazadores ni glutaraldehído ni

carbodiimida para la unión del anticuerpo a la superficie, debido a que nuestro objetivo era que
el anticuerpo no fuese modificado en el momento del ELISA, como ocurre cuando se utilizan
estos dos reactivos. La unión previa del glutaraldehído o la carbodiimida con el anticuerpo no es
posible, ya que podrían formarse uniones entre las moléculas de anticuerpo provocando la
precipitación y la pérdida de actividad del mismo. La preparación previa del anticuerpo con el
grupo reactivo de interés nos permite controlar si este ha sufrido desnaturalización, lo cual no
puede ser evaluado en el momento del ensayo al usar glutaraldehído o carbodiimida. La
evaluación de la actividad del anticuerpo modificado nos permite además disminuir la
variabilidad inter ensayo aumentando de esta forma la reproducibilidad del mismo. De esta
forma, el anticuerpo modificado puede ser almacenado hasta su utilización, de modo que
estaría disponible cada vez que se fuera a repetir el ensayo, incluso sería posible su
comercialización una vez modificado.
Atendiendo a esto, en nuestro trabajo hemos diseñado un sistema basado en una reacción de
tipo química clic, donde por un lado tendríamos placas de ELISA con grupos tetracina en
superficie mientras que, por otro, tendríamos los anticuerpos unidos a TCO, de forma que
cuando estos dos interactúan, se crearía un enlace covalente entre ambos mediante una
reacción de alta eficiencia y especificidad.
Durante las últimas décadas, han sido desarrolladas varias reacciones bioortogonales, incluidas
la cicloadición [3 + 2] azida-alquino, la cicloadición 1,3-dipolar fotoclic y las reacciones de Diels-
Alder por demanda inversa de electrones (IEDDA), las cuales han sido utilizadas para
modificaciones de proteínas (Sletten and Bertozzi, 2009; Kang et al., 2017). Entre estas, destaca
la reacción IEDDA de la tetracina con el trans-cicloocteno, que presenta la cinética de reacción
más rápida (constante de velocidad de hasta 106 M−1 s− 1), es altamente específica, no necesita
catalizador y posee buena biocompatibilidad (Oliveira et al, 2017). Esta reacción ha sido aplicada
para la preparación de conjugados de anticuerpos, principalmente mediante modificaciones
usando la química del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) para su uso posterior en imágenes de
86
células, funcionalización de nanopartículas, y terapia dirigida de anticuerpos (Rahim et al., 2013;

Oliveira, Guo and Bernardes, 2017). Es por ello que en nuestro trabajo seleccionamos esta
reacción como base para un sistema que aumentara la sensibilidad de los ELISA.
Los anticuerpos de captura utilizados, el anticuerpo anti c-myc clon 9E10 y el anticuerpo anti
CEA clon 3C1, fueron unidos al grupo TCO por los grupos amino libres del anticuerpo a través de
N-hidroxisuccinimida. Se observó que a medida que aumentaba la cantidad del reactivo de
modificación para la incorporación del grupo TCO, aumentaba el número de grupos TCO por
anticuerpo, sin embargo, este perdía su actividad. La mejor condición fue cuando fue utilizada
una relación en la reacción de modificación de 5 moles de reactivo: 1 mol de anticuerpo,
obteniéndose finalmente 4 moléculas de TCO por anticuerpo. La modificación previa del
anticuerpo permite un mayor control del anticuerpo modificado y la disponibilidad de este para
repetidos ensayos.
Las superficies de las placas de ELISA fueron preparadas con tetracina usando para ello el
reactivo NHS-tetracina el cual se une a los grupos amino de la superficie. Empleamos dos
superficies aminadas, una superficie comercial Covalink la cual fue tratada con glutaraldehído y
posteriormente con poli-lisina para aumentar el número de grupos amino en superficie, y una
superficie aminada preparada mediante clorosulfonación- sulfonamidación.
La preparación de superficies aminadas mediante química en mojado, en este caso una

clorosulfonación seguida de una sulfonamidación, tiene varias ventajas en comparación con los
procedimientos descritos de preparación de sustratos a base de poliestireno (Reinecke et al.,
2010). En esta, inicialmente se crean grupos clorosulfonilos en las superficies mediante
clorosulfonación y, posteriormente, se añade un compuesto bifuncional en el que uno de los
grupos funcionales es una amina alifática primaria que sirve de anclaje a la superficie mediante
un enlace covalente de una sulfonamida. El segundo grupo funcional queda disponible en la
superficie modificada, en nuestro caso un grupo amino ya que se utiliza la etilendiamina. Este
método permite obtener superficies homogéneas con un número controlable de grupos
funcionales que es de entre uno y dos órdenes de magnitud mayor que el que se consigue
convencionalmente por tratamientos con plasma o ultravioleta. Las superficies obtenidas tienen
una calidad óptica excelente con un alto grado de transparencia y además se produce,
selectivamente y reproduciblemente solo el grupo funcional preseleccionado (Reinecke et al.,
2010).
Por otro lado, con el objetivo de exponer los grupos tetracina en superficie, fueron recubiertas
placas MaxiSorp con la proteína BSA conteniendo 20 moléculas de tetracina por cada molécula
87
de proteína. En la Tabla 13 se resume el LOD y el LOQ obtenidos en el ELISA de detección de la

proteína c-myc-GST-IL8h en las tres superficies preparadas en las cuales estaba expuesta la
tetracina utilizando como anticuerpo de recubrimiento anti c-myc-TCO, así como los resultados
obtenidos con la superficie estándar, donde fue utilizado el anticuerpo anti c-myc sin modificar
(los datos representan el cómputo de todas las veces que se utilizó este control).
Observamos que en todas las superficies preparadas con tetracina hay una mejora en la
sensibilidad del ELISA con respecto a la superficie estándar, siendo la superficie recubierta con
BSA-tetracina donde se obtuvieron los mejores resultados mientras que, la superficie que parte
de la placa Covalink generó los peores resultados. No obstante, la sensibilidad del ELISA tuvo un
aumento de un orden de magnitud, 13,7 y 11 veces, tanto en las superficies preparadas con
BSA-tetracina como en las superficies tratadas con tetracina luego de una aminación mediante
la técnica de química en mojado. En estas últimas fue corroborada la técnica mediante el
aumento de la sensibilidad del ELISA de detección de IL6-cmyc, donde el LOD mejoro 9 veces.
El proceso de preparación de las placas con BSA-tetracina es menos laborioso que las placas
preparadas con tetracina luego de una aminación mediante química en mojado. Además, la
proteína BSA-tetracina puede ser almacenada o incluso las superficies pueden estar
previamente recubiertas con la proteína, de forma que, al igual que el anticuerpo marcado con
TCO, la superficie estaría disponible cada vez que se fuera a utilizar y podría además ser
comercializada.
Tabla 13. Resumen del LOD y LOQ obtenido en el ELISA de detección de la proteína c-myc-GST-
IL8h en las diferentes superficies preparadas, comparadas con la superficie estándar
Superficies LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml)
MaxiSorp (Superficie estándar) 10,51 13,30
MaxiSorp + BSA-tetracina 0,77 1,01
Clorosulfonación/Sulfonamidación 0,96 1,34
- Tetracina
CovaLink/Glutarlaldehído/Poli-Lys- 3,99 4,89
Tetracina
Por otro lado, las superficies preparadas con BSA-tetracina mostraron un aumento de la
sensibilidad para la detección de CEA, donde el LOD fue mejorado 12 veces con respecto al ELISA
desarrollado de la forma convencional. Estos resultados demuestran que el sistema utilizando la
reacción tetracina –TCO en la superficie de las placas de ELISA para el anclaje del anticuerpo,
mejora la sensibilidad del ensayo de forma significativa y podría convertirse en un método
rutinario en los laboratorios de investigación debido a su escasa complejidad.
88
III. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
MEDIANTE TÉCNICAS
INMUNOENZIMÁTICAS
Capítulo 3. Detección de ácidos nucleicos mediante técnicas inmunoenzimáticas
CAPÍTULO 3
3.1. INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos han sido detectados mediante técnicas inmunoenzimáticas tras hibridación
por complementariedad con la molécula diana, o posterior a una amplificación por PCR.
Atendiendo a esta última, surgió la llamada técnica PCR-ELISA, donde los productos de PCR
provenientes de la amplificación de un ADN o un ARN retrotranscrito, son detectados mediante
un ensayo tipo ELISA y su detección está ligada a métodos colorimétricos, de fluorescencia o
luminiscencia, siendo esta última la que permite un rango dinámico más amplio. Los ensayos
tipo ELISA han sido utilizados eficientemente para la cuantificación de productos de PCR debido
a que exhiben una alta especificidad y sensibilidad, permiten un amplio rango dinámico, no son
radioactivos y pueden ser automatizados (Kochanowski et al., 2003).
La detección de ácidos nucleicos mediante hibridación se ha utilizado para la detección de oligos

de pequeño tamaño, como los miRNA. Lorenson et al. (2019) desarrollaron un método para la
detección de oligos al que denominaron “Ensayo de Hibridación de Oligonucleótidos Ligados a
Enzimas” (ELOHA). Este es un ensayo de competencia entre el oligo de detección, el cual está
marcado con la enzima de revelado (HRP), y el oligo diana. Ambos oligos son capturados
mediante hibridación con un oligo complementario de captura que se encuentra unido
covalentemente a la superficie de ensayo. Otro método de hibridación que no requiere PCR
previa y que está ligado a un ensayo inmunoenzimático, es el desarrollado por Kappel et al.,
(2015), que detecta el híbrido formado entre un ADN/ARN a través de un anticuerpo específico.
Numerosos estudian confirman que los miRNA participan en la carcinogénesis humana y alteran
la expresión de oncogenes y genes supresores de tumores alterando, además, funciones
celulares como la respuesta al estrés y la apoptosis (Hayes et al., 2014). El crecimiento tumoral y
la metástasis en varios tipos de cáncer pueden estar mediados por la regulación disfuncional de
determinados miRNA (Srivastava and Srivastava, 2012). De este modo ha sido demostrado que
la desregulación de la familia del miRNA-29, que incluye a miRNA-29a, b y c, está relacionado
con el cáncer de pulmón (Yanaihara et al., 2006), y de colón (Zhi et al., 2015; Li et al., 2016). Por
otro lado, un metaanálisis de las diferentes investigaciones clínicas del miRNA-205, revelaron
que este constituye un biomarcador de diagnóstico, pronóstico y recurrencia del cáncer de
pulmón (Li et al., 2017).
89
El objetivo de este capítulo es el estudio de la técnica que permite la detección simultánea de

dos moléculas de distinta naturaleza involucradas en el diagnóstico del cáncer, un ácido nucleico
y una proteína, mediante un ensayo inmunoenzimático. Inicialmente se desarrollará un método
para la detección del miRNA mediante ELISA y posteriormente, será combinado con la detección
de una proteína en un mismo pocillo. Para la detección del miRNA mediante un inmunoensayo
se seguirán dos estrategias:
1) Detección del miRNA mediante un ensayo tipo sándwich. El miRNA es reconocido de

forma específica por hibridación a través de dos oligos, uno fijado a la placa y el otro
marcado con un hapteno para su posterior reconocimiento con un anticuerpo anti
hapteno.
2) ELISA del producto de una PCR del miRNA realizada con dos cebadores marcados (uno
con FITC y el otro con biotina). Debito al pequeño tamaño de los miRNA, la RT-PCR se
realizará mediante el uso de un cebador tipo stem-loop, que permite el incremento del
tamaño del miRNA y su detección específica.
Una vez establecido el método de detección del miRNA, se desarrollará un ELISA de dos spots en
un mismo pocillo, uno para la detección de una proteína y el otro para la detección del miRNA.
Además, se establecerán las bases para la detección de varios miRNA en un mismo ensayo.
90
3.2.1. Unión de BSA con oligos a través de una reacción de tipo química clic
3.2.1.1. Incorporación del grupo reactivo DBCO en la proteína albúmina de suero bovino
La proteína albúmina de suero bovino (BSA) fue modificada con el objetivo de incorporar varios
grupos dibenzo-ciclooctino (DBCO) en la molécula. En la modificación fueron utilizados 5 mg
totales de BSA, lo que se corresponde con 7,7x10-8 moles. El reactivo de acoplamiento,
Dibenzylcyclooctyne-NHS ester (Click Chemistry Tools, A134), fue añadido con una relación
molar de 30 veces, requiriéndose 231x10-8 moles de este. La reacción se llevó a cabo en tampón
fosfato de sodio 50 mM conteniendo 150 mM NaCl, a pH 7, e incubada durante 2 h a
temperatura ambiente. Posteriormente, la reacción se detuvo añadiendo una solución de Tris-
HCl 1 M, pH 8 para una concentración final de 100 mM. Para eliminar el exceso del reactivo, la
mezcla de reacción se dializó contra 0,5 L de PBS usando una membrana de diálisis de MWCO de
12 kDa. La proteína fue cuantificada mediante Bradford usando una curva patrón de BSA,
mientras que el grupo DBCO fue cuantificado mediante absorbancia a 350 nm. Finalmente se
calculó el número de grupos DBCO por molécula de BSA usando la relación molar entre ambas
moléculas.
3.2.1.2. Unión de diferentes oligos con la proteína BSA-DBCO
La proteína BSA-DBCO (1:20) fue utilizada para obtener moléculas de BSA unidas a diferentes
oligos, que fueron sintetizados con una molécula de azida en su extremo 3’ (Fig. 46). Los oligos
utilizados fueron pmir-205-5fw (3’ Azido-GGAAGTAAGG 5’) y pmir-29b-1fw (3’ Azido-
ATCGTGGTAAA 5’). En la reacción de acoplamiento, se utilizó 1 mg de BSA-DBCO para cada oligo
en una relación molar de 2 moles de oligo por cada molécula de BSA-DBCO. Por tanto, fueron
necesarios 3x10-8 moles de cada oligo. La mezcla fue incubada durante 4 h a temperatura
ambiente y agitación suave. Posteriormente cada mezcla fue dializada contra PBS pH 7,4 en
Amicon de 10 kDa de MWCO para eliminar las moléculas no unidas a BSA.
91
Figura 46. Reacción entre un grupo dibenzo-ciclooctino con un grupo azida en condiciones fisiológicas. En
nuestras reacciones el grupo DBCO está unido a la proteína BSA, mientras que el grupo azida está unido
en el extremo 3’ terminal a los diferentes oligos.
El proceso de acoplamiento fue seguido a través de la cuantificación de las moléculas mediante

espectrofotometría a 260 nm y 280 nm. Para detectar el cambio de tamaño de las moléculas
acopladas fue realizada una electroforesis en acrilamida al 10% que fue teñida con azul de
Coomassie.
3.2.2. Detección de un oligo mediante la técnica ELISA

3.2.2.1. Prueba de concepto de la detección a través de una reacción inmunoenzimática de la
hibridación in situ de dos oligos complementarios
Esta prueba de concepto se efectuó con dos parejas diferentes de oligos, la pmir-205-5fw con
pmir-205-10fw-FITC y la pareja pmir-29b-1fw con pmir-29b-8fw-TAMRA a través de ensayos
inmunoenzimáticos.
Para la detección de la unión de pmir-205-5fw con pmir205-10fw-FITC, se realizó un spot de 0,2

µL a unaconcentración de 20 μg/ml en la superficie de una placa negra de fondo óptico (Greiner
Bio-One, 655097) con la proteína BSA-pmir-205-5fw, diluida en tampón 0,1M de NaHCO3 pH 9, e
incubada durante 1 h a temperatura ambiente (Fig. 47). Posteriormente, la placa fue lavada
usando PBS-Tween-20 0,05% y la superficie fue bloqueada durante 30 minutos usando PBS-BSA
1%. Posteriormente se añadió el oligo marcado con FITC-pmir-205-10fw-FITC (5’
TAGCACCATTTAGCCTTTCT-FITC 3’) en el rango de concentraciones de 0,5 a 10.000 attomoles/µl
diluido en PBS más 100 mM LiCl y la reacción fue incubada durante 1 h a 37 ºC. Tras 3 lavados
consecutivos, fue añadido el anticuerpo anti FITC clon 4-4-20 a 0,5 µg/ml e incubado 1 h a 37 ºC.
El revelado se llevó a cabo usando el anticuerpo anti mouse HRP (Sigma-Aldrich, A2554),
incubado durante 1 h a temperatura ambiente y protegido de la luz. Tras 5 lavados se añadieron
50 µl por pocillo del sustrato de quimioluminiscencia de la peroxidasa (ThermoFisher, 37075). La
lectura fue realizada usando el equipo Q-View (Quansys Biosciences).
92
Figura 47. Representación esquemática de la unión mediante complementariedad entre dos oligos en un
ensayo tipo ELISA. El oligo de captura está unido a BSA, que se une a la superficie mediante adsorción
pasiva. Izquierda: Unión entre los oligos pmir-205-5fw y pmir-205-10fw-FITC y detección con el
anticuerpo anti FITC. Derecha: Unión entre los oligos pmir-29b-1fw y pmir-29b-8fw-TAMRA y detección
con el anticuerpo anti TAMRA.
La detección de la unión de pmir-29b-1fw con pmir-29b-8fw se efectuó de manera similar a la

anterior, usando las especificaciones para esta pareja (Fig. 47). El recubrimiento fue realizado
con un spot de 0,2 µL a 20 μg/ml de la proteína BSA-pmir-29b-1fw. El oligo muestra pmir-29b-
8fw (5’ TAGCACCATTTAGCCTTTCT-TAMRA 3’) fue añadido en el rango de concentraciones de 0,5
a 10.000 attomoles/µl. Posteriormente se utilizó el anticuerpo anti TAMRA clon 5G5 (Abcam,
ab171120) a 250 ng/ml. Los pasos restantes fueron idénticos al ensayo anterior.
3.2.2.2. Optimización del tampón utilizado en el paso de hibridación de los oligos por
complementariedad
Para determinar el tampón óptimo de unión por complementariedad de ambos oligos, se utilizó
el ensayo de unión entre pmir-205-5fw con pmir-205-10fw-FITC (Fig. 47). Fueron ensayados tres
tampones diferentes en los que la concentración del oligo pmir-205-10fw fue de 200 attomol/µl:
a) PBS; b) PBS + 50 mM LiCl y c) PBS + 100 mM LiCl.
El resto de los pasos del ensayo se realizaron tal y como ha sido descrito previamente. El ensayo
fue analizado usando un test de ANOVA.
93
3.2.2.3. Ensayo 2 PLEX de detección de la hibridación entre dos oligos. Bases para el
multiplexado
Se llevó a cabo una prueba de multiplexado usando las mismas parejas de oligos que las
descritas en el apartado 3.2.2.1. En el recubrimiento se efectuó, en el mismo pocillo, un spot de
0,2 µl de BSA-pmir-205-5fw y un spot de BSA-pmir-29b-1fw, ambos a una concentración de 20
µg/ml (Fig. 47). El ensayo fue realizado según lo descrito en el apartado 3.2.2.1, mezclando en
cada paso los reactivos de cada una de las parejas y teniendo en cuenta la concentración final
deseada en cada caso.
Paralelamente, fue realizado el ensayo de cada pareja de oligos por separado, en 1PLEX, para
comparar la intensidad de píxeles obtenidas para 1PLEX y 2PLEX.
3.2.2.4. Detección del miRNA-205 a través de una técnica de hibridación in situ ligado a un
ensayo inmunoenzimático
La superficie de una placa negra de fondo óptico (Greiner Bio-One, 655097) fue recubierta con
un spot de 0,2 µl de la proteína BSA-pmir-205-5fw a 20 µg/ml e incubada durante 1 h a
temperatura ambiente. Tras 3 lavados con PBS-Tween-20 0,05%, los pocillos fueron bloqueados
con una solución de PBS-BSA 1% e incubados durante 30 minutos a 37 ºC. La muestra miRNA
205 fue añadida en el rango de concentraciones de 0,04 hasta 50 ng/ml diluida en PBS
conteniendo 100 mM de LiCl e incubada durante 1 h a 37 ºC. Después de 3 repeticiones de
lavados, se añadió el oligo marcado con biotina pmir-205-2rev Biotina a 1 pmol/µL diluido en
PBS-100 mM LiCl e incubado 1 h a 37 ºC. De nuevo, tras 3 lavados con PBS-Tween-20 0,05% se
procedió al revelado con estreptavidina-HRP (ThermoFisher, 21310). Posteriormente, los pocillos
fueron lavados 5 veces y se añadieron 50 µL del sustrato de quimioluminiscencia (ThermoFisher,
37075). La intensidad de la luz fue medida utilizando el equipo Q-View (Quansys Biosciences)
(Fig. 48).
94
Figura 48. Representación esquemática de un ensayo tipo sándwich para la detección del miRNA pmir-205
haciendo uso de dos oligos complementarios, uno de captura y uno de detección marcado con biotina en
su extremo amino terminal.
3.2.3. Detección de un miRNA a través de una PCR ligada a la técnica ELISA

3.2.3.1. Amplificación del miRNA-29b mediante PCR con cebadores marcados
Para la retrotranscripción se utilizaron 12 fg del miRNA-29b, correspondientes a 106 moléculas

(MW miRNA-29b = 7.292 g/mol), el pStem-loop-mir-29b (5’
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGGCCAACAACACTG 3’) y la retrotranscriptasa
(Revertaid H Minus reverse transcriptase, ThermoFisher, EPO452) siguiendo el protocolo descrito
para la enzima. Con el miRNA-29b retrotranscrito se efectuó una PCR a tiempo final usando los
cebadores marcados pmir-29b-4fw-FITC (5’ FITC-GGGTAGCACCATTTGAAATC 3’) y pmir-29b-
5rev-Biotina (5’ Biotina-GAATACCTCGGA CCCTGCACC 3’). El programa de PCR utilizado consta de
un paso de desnaturalización de 5 minutos a 94 ºC; 25 ciclos que incluyen una desnaturalización
de 30 segundos a 94 ºC, un anillamiento a 50 ºC de 30 segundos y una extensión de 3 segundos
a 72 ºC; y un paso de elongación final de 3 minutos a 72 ºC. Considerando que la
retrotranscripción tuviese un 100% de eficiencia, tendríamos 106 moléculas del miRNA-29b en
20 µL totales de la reacción. Usando diferentes cantidades de molde del miRNA-29b proveniente
de la retrotranscripción, se confeccionó una curva que incluyó el rango de 976 a 62.500
moléculas, haciendo para ello diluciones seriadas dobles de la muestra de ADN complementario.
95
3.2.3.2. Eliminación del exceso del cebador marcado con hapteno usando partículas
magnéticas de estreptavidina
3.2.3.2.1. Preparación de las partículas magnéticas de estreptavidina
Se prepararon partículas de 200 nm con estreptavidina que tuviesen un enlace disulfuro entre la
estreptavidina y la partícula magnética (Fig. 49). Para ello fueron utilizadas las partículas
magnéticas FluidMag-Amine (Chemicell) y el reactivo de biotinilación EZ-LinkSulfo-NHS-SS-Biotin
(ThermoFisher, 21328). En primer lugar, las partículas fueron lavadas y equilibradas con el
tampón de acoplamiento 100 mM fosfato de sodio, 150 mM NaCl pH 7,2. y fueron realizados
tres acoplamientos para 1 mg totales de partículas resuspendidas en 200 µl del tampón,
variando la cantidad del reactivo de biotinilación. Para fijar la cantidad del reactivo por reacción
se tuvo en cuenta la cantidad de proteína (estreptavidina) con la que serían marcadas las
partículas. Para 1 mg de partículas queríamos 250 µg de estreptavidina, lo que se corresponde
con 4.5x10-9 mol de estreptavidina (MW estreptavidina= 55.000 g/mol). Se consideraron tres
relaciones molares del reactivo con respecto a la estreptavidina: 1:1, 1:10 y 1:100. Teniendo en
cuenta la MW del reactivo, fueron necesarios 2,7; 27 y 270 µg del reactivo para 1 mg de
partículas en cada reacción. Las reacciones fueron incubadas durante 1 h a temperatura
ambiente y agitación suave.
Una vez lavadas las partículas 5 veces con 0,5 mL de tampón de acoplamiento, se comprobó la
biotinilación de las partículas usando 2 µg totales de partículas con 100 µl de 100 ng/ml de
estreptavidina HRP. Tras el lavado extensivo de las partículas con el mismo tampón, fue añadido
a la reacción el sustrato de la peroxidasa TMB. La reacción fue detenida con 100 µl por reacción
de 1M de HCl. La absorbancia se determinó a 450nm usando el lector de placas FLUOstar
OPTIMA (BMG Labtech).
Figura 49. Esquema de unión de las partículas FluidMag aminadas a la estreptavidina. Primeramente, las
partículas fueron biotiniladas a través de la N-hidroxisuccinimida, dejando este reactivo un enlace
disulfuro entre la partícula y la biotina y, posteriormente, fue añadida la estreptavidina la cual se une a la
biotina con una alta avidez.
96
Para la unión de la estreptavidina se utilizó 1 mg de partículas marcadas con 270 µg del reactivo
de biotinilación, todo ello para acoplar 250 µg de estreptavidina (GenScript, Z02043). Tras
incubar la mezcla de reacción durante 1 h a temperatura ambiente y agitación, las partículas
fueron lavadas 3 veces con el tampón de acoplamiento para eliminar el exceso de estreptavidina
no unida.
3.2.3.2.2. Eliminación del cebador marcado con el hapteno
Seañadieron 20 µg de partículas magnéticas FluidMag-S-S-Biotina-Estreptavidina por cada 20 µl

de reacción de PCR del miRNA marcado con biotina y un hapteno (Apartado 3.2.3.1). El volumen
fue ajustado a 150 µL usando el tampón de reacción 100 mM Na3PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2. Tras
incubar la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, las partículas fueron lavadas
con 200 µL del mismo buffer. La unión PCR-biotina-Estreptavidina fue separada de las partículas
utilizando 100 µL del tampón de reacción conteniendo 30 mM de DTT e incubando durante 10
minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron diluidas 5 veces y cuantificadas mediante
ELISA.
4.2.3.3. ELISA de cuantificación del miRNA amplificado por PCR
La superficie de una placa negra de fondo óptico (Greiner Bio-One, 655097) fue recubierta con
un spot por pocillo de 0,2 µl a 20 µg/ml del anticuerpo anti FITC diluido en tampón 0,1M de
Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6, e incubada durante 1 h a temperatura ambiente (Fig. 50). Después de
tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% los pocillos fueron bloqueados durante 30 minutos a 37
ºC con PBS-BSA 1%. Las muestras de PCR marcada provenientes de la elución de las partículas
FluidMag-S-S-Biotina-Estreptavidina (Apartado 4.2.3.2.2) fueron añadidas e incubadas durante 1
h a 37 ºC. Luego de 3 lavados fue añadido el anticuerpo anti estreptavidina- biotina (Abcam,
ab7241) a 100 ng/ml Pasada 1 h de incubación a 37 ºC la placa fue lavada y se añadió la
estreptavidina-HRP, que fue incubada a temperatura ambiente protegida de la luz durante 30
minutos. Posteriormente, los pocillos son lavados 5 veces y se añadieron 50 µl del sustrato de
quimioluminiscencia (ThermoFisher, 37075). La intensidad de la luz fue medida utilizando el
equipo Q-View.
97
Figura 50. Esquema del ensayo PCR-ELISA para la de detección del miRNA-29b realizado mediante spots
en placas de ELISA. El miRNA amplificado por PCR fue detectado usando un sándwich entre el anticuerpo
anti FITC y el anticuerpo anti estreptavidina.
3.2.4. ELISA de 2 plex para detectar moléculas de distinta naturaleza en el mismo ensayo
3.2.4.1. ELISA de detección de CEA y miRNA-29b
El ELISA de dos plex para la detección simultánea de CEA y miRNA-29b, fue realizado en pocillos
de placas negras con fondo transparente, cada pocillo conteniendo un spot con el anticuerpo
anti-CEA y otro spot con el anti-FITC. El ELISA de detección de la PCR del miRNA-29b fue
realizado tal y como se describe en el Apartado 3.2.3.3. Para el ELISA de CEA el spot de 0,2 µl se
realizó con el anticuerpo anti CEA clon 3C1 a 20 μg/ml diluido en tampón a 0,1M de
Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6. Después de 1 h de incubación, las placas se lavaron 3 veces con 0,2 ml
por pocillo de PBS-Tween-20 0,05% y bloqueadas posteriormente con una solución de PBS-BSA
1%. La proteína CEA diluida en una solución de PBS pH 7,4 conteniendo 0,5% de BSA, fue
añadida en el rango de concentraciones de 3,12-200 ng/ml e incubada a 37 ºC durante 1 h. El
anticuerpo biotinilado anti CEA clon 3C6 a 0,5 μg/ml fue añadido como anticuerpo de detección
después de los lavados e incubado durante 1 h a 37 ºC. La estreptavidina-HRP (ThermoFisher,
21130) fue añadida a 100 ng/ml e incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente y
protegida de la luz. Los pocillos fueron lavados 5 veces y, posteriormente, se añadieron 50 µL del
sustrato de quimioluminiscencia (ThermoFisher, 37075).
La intensidad de píxeles de la luz, como medida de la concentración de las moléculas, fue

determinada utilizando el equipo Q-View (Quansys Biosciences).
98
3.3. RESULTADOS
3.3.1. Unión de BSA con oligos a través de una reacción de tipo química clic
3.3.1.1. Incorporación del grupo reactivo DBCO en la proteína BSA
La concentración de la proteína BSA-DBCO mediante Bradford y usando una curva de BSA, fue
de 7 mg/ml lo que se corresponde con 0,1x10-3 M considerando que la MW de BSA es 66.433
g/mol. La absorbancia a 350 nm fue de 24,31 y teniendo en cuenta que el coeficiente de
extinción molar del reactivo es 12.000 M-1cm-1, la concentración molar de este fue de 2x10-3 M.
Por tanto, la relación molar entre ambas concentraciones indicó la existencia de 20 grupos
reactivos DBCO por molécula de BSA. Esta proteína modificada fue utilizada para la unión de
oligos que llevan el grupo reactivo azido.
3.3.1.2. Unión de diferentes oligonucleótidos con la proteína BSA-DBCO
La unión de BSA-DBCO con los oligonucleótidos pmir-205-5fw y pmir-29b-1fw fue cuantificada

en espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 y 280 nm: a 260 nm fueron cuantificados los
oligonucleótidos mientras que, a 280 nm, la proteína BSA. Sin embargo, al estar tan cerca ambas
longitudes de ondas, hay una superposición del valor de absorbancia de ambas moléculas en
ambas lecturas, por lo que es necesario tener en cuenta la relación entre las absorbancias para
determinar qué tipo de molécula prevalece sobre la otra. En la Tabla 14 se muestran los valores
de absorbancia a 260 nm y 280 nm obtenidos para cada muestra, así como la relación de
absorbancia 260 nm/ 280 nm para cada caso. La relación 260 nm/280 nm para la proteína BSA-
DBCO fue de 0,9 mientras que, en el caso de los oligos, este valor fue cercano a 2. Después del
acoplamiento de BSA-DBCO con cada oligo, observamos que la relación aumenta con respecto a
la de la proteína sin el oligo, por lo que se puede inferir que estos están unidos a la molécula de
BSA.
Tabla 14. Cuantificación de BSA-DBCO, de los oligos pmir-205-5fw y pmir-29b-1fw y BSA unido
a cada uno de los oligos mediante absorbancia a 260nm y 280nm.
MUESTRA 260 nm 280 nm 260 nm/ 280nm
BSA-DBCO 18,96 20,30 0,931
pmir-205-5fw-Azido 12,75 6,72 1,897
pmir-29b-1fw-Azido 10,95 5,76 1,901
BSA-pmir-205-5fw-Azido 12,24 9,79 1,250
BSA-pmir-29b-1fw-Azido 24,46 20,76 1,178
En la electroforesis es evidente el cambio de peso molecular de la proteína BSA según esté

acoplada o no acoplada a los diferentes oligos (Fig. 51). En los acoplamientos BSA-oligos no se
observa una banda única de la Proteína-Oligo, sino una mancha en un rango de pesos
99
moleculares más altos que la proteína BSA, lo que sugiere que la proteína está unida a los oligos
pero no hay homogeneidad en el producto obtenido, presumiblemente debido a la existencia de
diferentes grados de acoplamiento.
Figura 51. Análisis de la proteína BSA unida a diferentes oligos. Carril 1: 2 µg BSA; Carril 2: 3 µg BSA-pmir-
205-5fw; Carril 3: 3 µg BSA-pmir-29b-1fw; Carril 4: Patrón de peso molecular (ThermoFisher, 26619).
3.3.2. Detección de la hibridación entre dos oligos mediante la técnica ELISA

3.3.2.1. Prueba de concepto para la detección de la hibridación entre dos oligos usando la
técnica ELISA
La complementariedad entre dos oligos fue detectada a través de una reacción

inmunoenzimática utilizando para ello oligonucleótidos marcados con haptenos. Los haptenos
utilizados fueron isotiocianato de fluoresceína (FITC), que fue detectado con el anticuerpo anti
FITC 4-4-20, y tetrametil-rodamina (TAMRA), que fue detectado con el anticuerpo anti TAMRA.
El ensayo de detección de la hibridación entre dos oligos in situ fue realizado con dos parejas de
oligos diferentes: la pareja pmir-205-5fw y pmir-205-10fw-FITC, que tenían 10 nucleótidos
complementarios y la pareja pmir-29b-1fw y pmir-29b-8fw-TAMRA, con 11 nucleótidos
complementarios. En el caso de la primera pareja, la detección fue realizada usando el
anticuerpo anti FITC mientras que la otra fue realizada con el anticuerpo anti TAMRA. Como se
observa en la curva sigmoidal 4PL obtenida para ambos casos, la detección de la hibridación es
posible a través de una reacción inmunoenzimática (Fig. 52), siendo la unión de los oligos pmir-
29b-1fw y pmir-29b-8fw-TAMRA ligeramente más sensible que la de pmir-205-5fw y pmir-205-
10fw-FITC.
100
Figura 52. Detección de la unión entre oligos a través de un ensayo inmunoenzimático. Curva sigmoidal
4PL de la unión entre el oligo pmir-205-5fw y el oligo pmir-205-10fw (azul) y entre el oligo pmir-29b-1fw y
el oligo pmir-29b-8fw (gris). La detección fue realizada con el anticuerpo anti FITC y anti TAMRA,
respectivamente. Todas las concentraciones del oligo detectado fueron realizadas por triplicado y
muestran su desviación estándar en la curva.
En la Tabla 15 quedan recogidos los valores de EC50 y R2 obtenidos para cada curva sigmoidal y
el resultado del cálculo del límite de detección para ambos casos. Como se observa, los valores
de absorbancia se ajustan a una curva sigmoidal, ya que el R2 en ambos casos está muy cercano
a 1. Atendiendo a la EC50 y al LOD, se demuestra que la detección de pmir-29b-8fw es más
sensible que la detección de pmir-205-10fw, aunque en ambos casos está en el orden de
attomol/µl. La diferencia de sensibilidad puede ser atribuida a que el oligo pmir-29b-8fw
compartía un nucleótido complementario más con su oligo de captura que el pmir-205-10fw.
Tabla 15. Análisis de los resultados obtenidos de la detección de oligos mediante ELISA.
pmir-205-10fw-FITC pmir-29b-8fw-TAMRA
EC50 1.980,0 440,3
2
R 0,9974 0,9994
LOD (attomol/µl) 2,72 1,04
3.3.2.2. Optimización del tampón utilizado en el paso de hibridación de los oligonucleótidos

por complementariedad
Se comparó la complementación entre el oligo pmir-205-5fw y pmir-205-10fw con diferentes

concentraciones de LiCl en PBS como tampón de dilución del oligo marcado. Como se observa
en la Fig. 53, es necesaria la presencia del LiCl en el paso de complementación entre los oligos,
ya que hay diferencias significativas entre la reacción realizada en PBS y en la que se incluye 100
mM LiCl (p<0,0001) o 50 mM LiCl (p= 0,0003). En relación con la comparación entre las
concentraciones 100 mM y 50 mM de LiCl, observamos que las diferencias entre ambos son
menores (p= 0,0258). El tampón PBS suplementado con 100 mM de LiCl, como tampón para el
101
paso de unión por complementariedad de ambos oligos, fue seleccionado por permitir una
mayor intensidad de los pixeles a leer.
Figura 53. Comparación de las señales obtenidas en el ensayo tipo ELISA basado en la complementariedad
entre dos oligos usando diferentes concentraciones de LiCl. El oligo pmir-205-10fw-FITC fue utilizado a
200 attomol/ µL. Cada muestra fue realizada por triplicado, representándose la desviación estándar de
cada muestra.
3.3.2.3. Ensayo 2 PLEX de detección de la hibridación entre dos oligos. Bases para el
multiplexado
El ensayo realizado en 2 PLEX tenía como objetivo determinar posibles reacciones cruzadas
entre ambos oligos que provocaran la disminución de la intensidad de píxeles comparada con la
obtenida cuando la muestra se lleva a cabo en 1PLEX, además de detectar la posible reacción
cruzada de los anticuerpos anti FITC y anti TAMRA utilizados en la reacción. Para ello, el ensayo
realizado de forma paralela para cada una de las parejas en pocillos independientes (1PLEX) se
comparó con el simultáneo de ambos oligos en el mismo pocillo, estando presentes ambos en la
misma reacción (2 PLEX). Las curvas obtenidas del logaritmo de la concentración del oligo
marcado contra la respuesta (intensidad de píxeles) para 1 PLEX y 2 PLEX se compararon
utilizando un test t de student en parejas (Fig. 54). Como se observa, no hubo una diferencia
significativa entre la curva realizada para 1 PLEX y la realizada en el pocillo 2 PLEX para cada una
de las parejas de oligos. La EC50 de pmir-205-5fw y pmir-205-10fw en 1 y 2 PLEX fue de 1.980 y
2.117 attomol/µL, respectivamente, mientras que el valor de p fue de 0,1342. En el caso de
pmir-29b-1fw y pmir-29b-8fw, la EC50 fue de 440 y 537 attomol/µL y el valor de p fue de 0,0583,
demostrando que no hay diferencias significativas entre los resultados obtenidos en el ensayo
desarrollado en 1 PLEX y en 2PLEX.
102
Figura 54. Curva sigmoidal 4PL comparativa obtenida en un ensayo de detección de la hibridación entre
dos oligos a través de una reacción inmunoenzimática realizada en un ensayo de 1 o 2 PLEX. Izquierda:
Curva de detección de la hibridación de pmir-205-5fw y pmir-205-10fw. Derecha: Curva de detección de la
hibridación entre pmir-29b-1fw y pmir-29b-8fw.
3.3.2.4. Detección del miRNA-205 a través de una técnica de hibridación in situ ligado a un
ensayo inmunoenzimático
El ensayo para la detección de un miRNA en un spot en pocillos de placa de ELISA, fue utilizado
para la detección del miRNA-205. Para ello se realizó la hibridación del miRNA por su extremo 5’
con un oligo fijado en la superficie, y por el extremo 3’ con un oligo marcado con biotina. Se
ensayaron varios rangos de concentraciones (resultados no mostrados) y en ninguno de ellos se
obtuvieron resultados positivos. En la Fig. 55 se muestra un rango de concentraciones bastante
alto, del orden de ng/ml del miRNA-205 con el cual, a pesar del aumento de concentración, no
se observa un incremento exponencial de la señalización.
Figura 55. Ensayo de detección del miRNA-205 en spot realizado en placas de ELISA. Curva sigmoidal 4PL
del logaritmo de la concentración del miRNA-205 contra la intensidad de píxeles.
103
3.3.3. Detección de miRNA a través de una PCR ligada a la técnica ELISA

3.3.3.1. Amplificación del miRNA-29b mediante PCR con cebadores marcados
Los micro RNAs en general presentan una longitud de entre 18-25 nucleótidos, por lo que su
amplificación mediante PCR es limitada. Ha sido descrito el empleo de un oligonucléotido stem-
loop en la retrotranscripción como una mejora en la amplificación en cuanto a especificidad y
eficiencia (Schmittgen et al., 2008; Zöllner et al., 2014). En nuestro trabajo se diseñó un stem-
loop específico para el miRNA-29b que permitiera aumentar el tamaño del mismo en el paso de
la retrotranscripción (Fig. 56). Se utilizó el stem-loop-mir-29b con una longitud de 51 bases, de
las cuales 7 eran complementarias al miRNA-29b, y 14 bases complementarias sobre sí mismas
formando un lazo.
Figura 56. Representación de la secuencia de nucleótidos del miRNA-29b (rojo) unido al p-stemp-loop-
mir-29b (azul). En el proceso de retrotranscripción se obtiene el cDNA del miRNA-29b (verde) y
posteriormente se amplifica la secuencia mediante PCR.
3.3.3.2. Eliminación del exceso de oligos usando partículas magnéticas de estreptavidina.

3.3.3.2.1. Preparación de las partículas magnéticas de estreptavidina.
Las partículas FluidMag-amina fueron unidas a estreptavidina usando un reactivo de

biotinilación intermedio que permitiera la presencia de un enlace disulfuro entre la partícula y la
estreptavidina. La presencia de este enlace fue introducida para permitir la separación de la
estreptavidina de las partículas cuando fuese necesario (Fig. 49). La biotinilación realizada con
104
diferentes relaciones molares del reactivo de biotinilación con respecto a la estreptavidina, se

determinó mediante un ensayo en solución usando 20 µg de las partículas de cada
acoplamiento. El análisis mediante ANOVA de los diferentes acoplamientos muestra una
diferencia muy significativa en el marcaje (p< 0,0001) al emplear una relación molar de reactivo
de biotinilación: estreptavidina (1:1) con respecto a los acoplamientos con una relación molar
10: 1 y 100:1 (Fig. 57). La relación 1:1 fue descartada, ya que el marcaje es muy bajo. Las
diferencias en el marcaje al usar mayor cantidad de estreptavidina son menores, aunque
también significativas siendo la relación molar 1:100 la que ofreció los mejores resultados. Para
el proceso de unión con la estreptavidina se emplearon partículas cuyo proceso de
acoplamiento con la biotina tuvo un criterio de relación molar de 1:100.
Figura 57. Gráfico de barras comparativo de la absorbancia obtenida a partir de la unión de 20 µg de

partículas marcadas FluidMag-SS-biotina con estreptavidina peroxidasa. El gráfico muestra la comparación
entre los diferentes acoplamientos de las partículas variando la relación molar entre el reactivo de
biotinilación y la estreptavidina.
3.3.3.3. ELISA de cuantificación del miRNA-29b amplificado por PCR.
El miRNA-29b fue amplificado mediante una PCR usando oligos marcados con FITC y biotina.
Para eliminar el exceso de oligos, el producto de PCR fue purificado con partículas magnéticas
previamente recubiertas con estreptavidina. Al añadir el producto de PCR, este quedó
inicialmente unido a las partículas a través de la estreptavidina. Posteriormente, en el primer
lavado de las partículas, se eliminó el exceso del cebador marcado con FITC el cual podría
bloquear la señal del ELISA (datos no mostrados). Estas partículas, fueron tratadas con un
105
agente reductor para romper el enlace disulfuro entre la partícula y la biotina (Fig. 49), y de esta
manera fue separado el complejo biotina-estreptavidina-PCR de la partícula magnética.
Terminado el proceso de aislamiento de la PCR, las moléculas amplificadas se quedan unidas a

una molécula de estreptavidina, por lo que se diseñó un ELISA basado en la captura a través de
FITC y la detección a través de la estreptavidina con un anticuerpo específico. Los resultados del
ELISA mostraron una señal dosis-respuesta logarítmica, demostrando que la PCR iba marcada
con FITC y que el proceso de aislamiento usando las partículas magnéticas de estreptavidina fue
efectivo, ya que no hubo un bloqueo de la señal de luminiscencia del ELISA. Estos resultados, a
su vez, mostraron que la PCR estaba unida a estreptavidina. El ensayo se repitió 5 veces
obteniéndose un LOD de 1.307± 183 moléculas, con un porcentaje del CV inter ensayo de
13,97% (Fig. 58).
Figura 58. Curva sigmoidal 4PL del ELISA de detección de la PCR del miRNA-29b unida a FITC y
estreptavidina. Se representa el LOD obtenido tras repetirse el ensayo 5 veces.
3.3.4. ELISA de 2 plex para detectar moléculas de distinta naturaleza en el mismo ensayo.
3.3.4.1. ELISA de detección de CEA y miRNA-29b.
Como prototipo de la detección en un mismo ensayo de dos moléculas de diferente naturaleza,

se desarrolló un ELISA 2 plex para la detección de miRNA-29b amplificado por PCR y de la
proteína CEA. El ensayo fue implementado para la lectura de una señal quimioluminiscente de
spots realizados en un pocillo de placa de ELISA. En la Fig. 59a se muestra el esquema que
representa los pasos de ambos ELISAs realizados de forma simultánea en un mismo pocillo. La
lectura de la señal se realiza mediante la medida de la intensidad de píxeles en cada spot a
través de una foto tomada con el equipo Quansys (Fig. 59b). A medida que disminuye la
concentración de CEA o el número de moléculas amplificadas del miRNA-29b, disminuye la
intensidad de la luz. Los resultados obtenidos se analizaron mediante una curva sigmoidal 4PL
106
(Fig. 59c y 59d) y, posteriormente, se calculó el LOD para cada ELISA, siendo este de 1.358
moléculas en el caso del miRNA y de 2,54 ng/ml en el caso de la proteína CEA.
Figura 59. ELISA 2 plex para la detección de miRNA-29b y CEA en un mismo pocillo de placa de ELISA. a.
Esquema de los pasos de ambos ELISAs realizados de forma simultánea. b. Foto invertida de los resultados
del ensayo tomada por el equipo Quansys. Al lado de cada spot se muestra el número de moléculas
estimado en el caso de miRNA-29b y la concentración final de CEA en el pocillo. c. Curva sigmoidal 4PL
obtenida del número de moléculas estimado de pmiRNA-29b contra la intensidad de píxeles obtenida en
el ELISA d. Curva sigmoidal 4PL obtenida de la concentración de CEA en ng/ml contra la intensidad de
píxeles obtenida en el ELISA.
107
3.4. DISCUSIÓN
Desde su descubrimiento en 1993, los miARN han mostrado un gran potencial diagnóstico al
estar asociados con diversas enfermedades (Lee et al., 1993; Wang et al, 2016; Correia et al.,
2017). Desde entonces, el número de publicaciones sobre el potencial diagnóstico de los
miRNAs ha crecido casi exponencialmente, lo que ha impulsado al desarrollo de nuevas
herramientas de diagnóstico basadas en miRNA (Bonneau et al., 2019).
Muchos miRNA han sido reportados como biomarcadores de enfermedad para diferentes
patologías, pero solo una pequeña fracción ha sido trasladada a su uso en la clínica (Bonneau et
al., 2019). La variabilidad de los ensayos de PCR cuantitativa inter laboratorios y la consiguiente
errónea interpretación de estos, han limitado el avance para el diagnóstico (Stejskal et al.,
2019). La detección y cuantificación de los miRNAs continúa siendo un reto científico.
El primer ensayo basado en técnicas inmunoenzimáticas para detección de miRNAs fue

desarrollado por Kappel et al. (2015). En este, el miRNA se hibrida con un DNA complementario
biotinilado y el complejo de ambos es capturado por partículas recubiertas con estreptavidina.
El revelado del ensayo se realiza usando un anticuerpo que reconoce de forma específica el
híbrido DNA/miRNA (Kappel et al., 2015). La técnica fue comparada con la RT qPCR para la
detección de los miRNA hsa-miR23a-3p y el hsa-miR-93-5p, obteniéndose menos variabilidad en
los resultados mediante el ensayo inmunoenzimático que con RT-qPCR (Stejskal et al., 2019).
A diferencia de estos autores, en este trabajo hemos desarrollado una metodología basada en la
hibridación por complementariedad para la detección de miRNAs que no implica el uso de
anticuerpos contra híbridos DNA/miRNA, sino que la captura se basa en la complementariedad
de nucleótidos con el analito, y la detección hace uso de anticuerpos contra haptenos. Como
prueba de concepto se empleó la hibridación entre dos moléculas en una superficie sólida
usando para ello como molécula diana, una secuencia de ADN de simple cadena marcada con un
hapteno (FITC o TAMRA). Esta secuencia hibrida in situ con su secuencia complementaria, la cual
ha sido fijada a la placa vía adsorción del complejo BSA-secuencia complementaria, preparada
previamente mediante química clic. La detección de la hibridación entre las dos moléculas fue
realizada a través de un anticuerpo específico anti hapteno. Como resultado se obtuvo un
ensayo que permite cuantificar ácidos nucleicos de simple cadena con una sensibilidad en el
orden de los attomoles/µl, que es la misma que la obtenida por Kappel et al., (2015).
El ensayo fue también evaluado en formato dos plex para la detección de dos analitos haciendo
uso de dos canales de lectura. Los resultados obtenidos mostraron una alta especificidad, no
observándose reacciones cruzadas entre ambas secuencias y la sensibilidad no se vio afectada.
108
Atendiendo a la EC50 y al LOD, se comprueba que la detección de pmir-29b-8fw es más sensible

que la de pmir-205-10fw, aunque en ambos casos está en el orden de los attomol/µl. La
diferencia de sensibilidad puede ser atribuida a las diferencias de afinidad entre los anticuerpos
anti FITC y anti TAMRA o a que el oligo pmir-29b-8fw compartía un nucleótido complementario
más con su oligo de captura que el pmir-205-10fw. No obstante, la constante de afinidad de anti
FITC 4-4-20 es de las más altas descritas entre un anticuerpo y su antígeno (1.2x10 10 M-1) (Bates
et al, 1985; Whitlow et al., 1995) y el anticuerpo anti TAMRA clon 5G5 usado en este trabajo no
tiene publicada una constante de afinidad. El desarrollo de un ensayo dos plex con dos canales
de salida para cuantificar dos moléculas de ácido nucleico distintas es de gran interés y sería la
base de la implementación de un sistema multiplex basado en hibridación en placa y ELISA.
Asimismo, el ensayo descrito podría ser adaptado, atendiendo a los valores de sensibilidad
obtenidos, a un ensayo de competencia para la detección de ácidos nucleicos de simple cadena.
En este ensayo la molécula diana sería complementaria a la secuencia de captura y competiría
con una secuencia de simple cadena sintética marcada con un hapteno. El diseño de un ensayo
basado en la competencia con una molécula marcada evitaría el marcaje del analito de interés,
siendo la reducción de la señal proporcional al aumento de la concentración del analito.
El empleo de un sistema sándwich de hibridación no exigiría tampoco del marcaje por PCR del
analito. Este incluiría dos pasos de hibridación in situ: una primera hibridación con el oligo de
captura, y la segunda con el oligo de detección. En este trabajo fue evaluado un sistema
sándwich de hibridación para la detección del miRNA-205, usando como oligo de captura el
pmir-205-5fw y como oligo de detección el pmir-205-2rev-biotina. Los resultados obtenidos no
permitieron la cuantificación de la molécula diana en el rango de los ng/ml. Esto pudo ser
debido a las condiciones de hibridación, al tamaño de las secuencias y/o a impedimento
estérico.
Rautio et al., (2003) desarrollaron un sistema sándwich de hibridación utilizando partículas

magnéticas en lugar de placas como soporte, logrando desarrollar un ensayo de cuantificación
de RNA ribosomal con una sensibilidad en el orden de los fmoles, 1.000 veces inferior a la
observada en el sistema no sándwich que hemos desarrollado y que implica un único paso de
hibridación.
Se han llevado a cabo numerosas investigaciones para la detección de moléculas de ácidos

nucleicos diana con la técnica denominada PCR-ELISA, usando para ello el kit comercial PCR-
ELISA-DIG (Roche Diagnostics Ltd) (Kurupati et al., 2005; Pumannova et al., 2006). Este sistema
amplifica la secuencia deseada con una mezcla de dNTPs que incluye dUTPs marcados con
109
digoxigenina. Tras la desnaturalización del producto de PCR se efectúa la hibridación de este con
una sonda complementaria biotinilada. La superficie donde se desarrolla el ELISA, previamente
recubierta con estreptavidina, captura la sonda biotinilada y la muestra es detectada a través de
un anticuerpo anti digoxigenina (Kurupati et al., 2005). Dado que en este método no se emplean
cebadores marcados para la captura, no es necesario un paso de purificación el producto de PCR
para la eliminación de estos.
En el sistema PCR-ELISA desarrollado en este trabajo, los cebadores utilizados en la PCR están
marcados, uno con biotina y el otro con FITC, y la captura de la muestra no es por hibridación
sino mediante un anticuerpo que captura FITC. Por lo tanto, es necesario eliminar el cebador
marcado con FITC ya que, de lo contrario, el exceso de este bloquearía el anticuerpo de captura
y comprometería la sensibilidad del ELISA. Las partículas marcadas con estreptavidina obtenidas
permitieron la separación eficiente de la diana amplificada marcada.
La sensibilidad del ELISA desarrollado permite la detección de 103 moléculas del miRNA-29b,
para un LOD de 15,7 attogramos. El LOD fue menor que el descrito por Kurupati et al., (2005),
que detectaron la bacteria Pseudomonas aeruginosa de cultivos de sangre con una especificidad
y sensibilidad del 100%, teniendo un LOD de 10 fg para una secuencia diana de 249 pares de
bases (~3.700 moléculas). La diferencia de sensibilidad entre ambos ensayos puede ser debida a
múltiples factores: el tamaño de la molécula diana, la eficiencia de la amplificación, la proteína
de captura del producto de PCR o, el sustrato utilizado, entre otros. En nuestro caso la eficiencia
de amplificación del miRNA-29b usando los cebadores indicados fue de un 95% (resultados no
mostrados).
Dada la sensibilidad de nuestro ensayo, se considera que el método puede ser utilizado para la
detección de cualquier miRNA de forma específica. Consideramos que este sistema pudiera
hacerse multiplex para la detección de varios miRNAs de una misma muestra tan solo
cambiando el cebador que lleva el hapteno, el cual es específico para el miRNA. El cebador
biotinilado, en nuestro caso, puede ser común debido a que se une a la secuencia adicional del
stem-loop que no es necesario variar entre diferentes miRNA y favorece la detección con
estreptavidina-HRP.
En un estudio comparativo entre la detección de un ácido nucleico mediante PCR a tiempo real
o mediante PCR-ELISA, para la detección de una secuencia de 159 pares de bases de
citomegalovirus (CMV), los autores demostraron que ambos métodos tienen la misma
especificidad y poseen la sensibilidad necesaria para detectar el ADN de CMV. Sin embargo, la
110
PCR cuantitativa tiene mayor reproducibilidad y un rango dinámico de detección del ADN más
amplio (Pumannova et al., 2006).
Las técnicas basadas en inmunonensayos para la detección de ácidos nucleicos constituyen un

método alternativo a la PCR a tiempo real. Aunque la sensibilidad de la técnica es relativamente
menor que la qPCR para cuantificar ácidos nucleicos, tiene como ventaja la capacidad de poder
añadir la cuantificación de proteínas en el mismo ensayo. Además, la instrumentación requerida
es mucho menos costosa que la necesaria para qPCR.
La proteína CEA fue la seleccionada para el diseño de un prototipo de ensayo inmunoenzimático

de detección de dos moléculas de distinta naturaleza. En el capítulo 2 se incluyó un ELISA de
detección de CEA en el que para el revelado se utilizó un sustrato colorimétrico, mientras que en
los ensayos incluidos en este capítulo hemos usado un sustrato luminiscente. En ambos casos se
utilizó la misma pareja de anticuerpos, y el ELISA se desarrolló en superficies de poliestireno
estándar. Los resultados muestran una diferencia de sensibilidad entre ambos ELISA de 3 veces,
siendo el LOD medio para el ensayo colorimétrico de 7,47 ng/ml y para el luminiscente de 2,54
ng/ml. Estas diferencias son debidas probablemente al sustrato.
Por otra parte, los resultados descritos concuerdan con los obtenidos en un estudio comparativo
entre un ELISA colorimétrico y uno quimioluminiscente para la detección de IL23h, donde los
autores encuentran una diferencia de 5 veces, siendo el ensayo luminiscente el de mayor
sensibilidad (Samineni et al., 2006). Otros autores coinciden en que la sensibilidad es mayor en
ensayos luminiscentes comparados con ensayos colorimétricos al detectar interferón alfa-2b
(Obenauer-Kutner et al., 1997), IL-12, IL-4h e IL-4 de ratón (Lewkowich et al., 2001) y factor de
necrosis tumoral (Petrovas et al, 1999). Sin embargo, en otro estudio realizado para la detección
de IL8h y TNFα humano, los autores compararon el sustrato TMB con diferentes sustratos
luminiscentes, incluido el de este trabajo, y no encontraron diferencias significativas en la
sensibilidad de los ELISAs (Siddiqui and Remick, 2003).
Incluso al emplear revelado colorimétrico, cuando en lugar de utilizar superficies estándar

fueron empleadas superficies tratadas con tetracina, los resultados mostraron un aumento de la
sensibilidad de detección del antígeno CEA de 12 veces con respecto a las superficies estándar,
con un LOD de 0,605 ng/ml. Aunque no fue evaluado, es presumible que el LOD disminuya si se
combinaran las superficies tratadas con tetracina con la utilización del sustrato quimio
luminiscente.
La detección de varias proteínas a partir de una misma muestra tiene numerosas ventajas entre
las que cabe destacar la disminución del tiempo de ensayo y el coste, el poco volumen de
111
muestra utilizado y la amplia información obtenida sobre el proceso patológico (Adamcova and
Šimko, 2018). Por dicha razón se han desarrollado numerosos sistemas de detección multiplex,
los cuales detectan de forma simultánea varias proteínas relacionadas con una determinada
patología de una misma muestra (por ejemplo, Quansys, Luminex, etc).
Actualmente se conoce que la detección de varios biomarcadores relacionados con

determinados cánceres permite un pronóstico y diagnóstico en estadios más temprano de la
enfermedad, lo que implica un mayor valor diagnóstico. Estos biomarcadores incluyen listados
de moléculas de distinta naturaleza. Por ejemplo, en el diagnóstico del cáncer colorrectal se ha
definido la proteína CEA como biomarcador, con una especificidad entre 70-95%, así como
distintos miRNA como el miRNA-29 (85-93% de especificidad) y el miR139-3p (98% de
especificidad) (Moody et al., 2017).
En este trabajo hemos implementado un método multiplex de detección de la proteína CEA y el

miRNA-29b, ambos relacionados con el cáncer colorrectal. Se emplearon superficies estándar y
revelado quimiluminiscente para la detección simultánea de ambas moléculas, siendo el LOD de
cada ensayo similar a los de los ensayos independientes de CEA y mir-29b.
En este ensayo podrían haber sido incluidos otros miRNA solo cambiando el marcaje del
oligonucléotido. Para dicho marcaje, en este caso fue utilizado FITC, pero también podría haber
sido utilizado TAMRA, NP, digoxigenina u otros TAGs contra los que existan anticuerpos.
Además, se podrían incorporar otras proteínas relacionadas para la que se conozca una pareja
de anticuerpos específicos de alta afinidad.
112
IV. AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD DE LA
TÉCNICA ELISA MEDIANTE UNA
TECNOLOGÍA BASADA EN LA QUITINA Y
EL DOMINIO DE UNIÓN A QUITINA
Capítulo 4. Aumento de la sensibilidad de la técnica ELISA mediante una tecnología basada en la quitina y ChBD
CAPÍTULO 4
4.1. INTRODUCCIÓN
Con objeto de mejorar la sensibilidad de la técnica de ELISA, se han desarrollado diversos

métodos que se basan en la disminución de los efectos adversos de la inmovilización de los
anticuerpos mediante adsorción pasiva a las superficies. Estos métodos, como ha sido descrito
anteriormente, incluyen estrategias de modificación de las superficies de ensayo, modificación
de los anticuerpos y la aplicación de ambas estrategias (Welch, Scoble, et al., 2017).
La unión de los anticuerpos a la superficie de forma covalente o mediante enlaces que

permitan una alta estabilidad, mejora la sensibilidad del ensayo ELISA dado que esta técnica
involucra repetidos lavados que pueden desplazar las moléculas ya unidas. Además, la
orientación adecuada de los anticuerpos en la superficie, es uno de los objetivos principales de
la inmovilización ya que permite que éstos tengan expuestos sus sitios de unión al antígeno
mejorando así su efectividad.
Las estrategias de inmovilización por afinidad, que son aquellas donde el anticuerpo es
capturado específicamente por una región deseada, tienen la ventaja de que pueden
introducir un alto grado de orientación del anticuerpo, por lo que la región de reconocimiento
del antígeno estaría siempre correctamente posicionada. Entre estas estrategias se encuentran
aquellas donde el anticuerpo está unido al dominio activo de una enzima, lo que
posteriormente se combina con el uso de superficies preparadas con el substrato de la enzima
o con un análogo. En este caso, el dominio de la enzima que se une al substrato queda unido a
la superficie donde éste se encuentra, lo que se debe a la formación de puentes de hidrógeno
e interacciones hidrofóbicas y electrostáticas.
Entre los ejemplos de enzimas utilizados para la inmovilización de proteínas o anticuerpos a

diferentes soportes, podemos citar la cutinasa, la cual se une a soportes de fosfonato (Kwon et
al., 2004), la O6-alquilguanina transferasa, que se une a superficies activadas con
bencilguanina (Engin et al., 2010) y la quitinasa, de la que se utiliza solamente el dominio de
unión a quitina, método que se combina con el uso de superficies de quitina (Lindner et al.,
2002; Reulen et al., 2009).
La forma madura de la quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12 está compuesta por un

dominio catalítico (CD) en el extremo amino terminal, dos dominios fibronectina tipo III (FnIII)
y un dominio de unión a quitina (ChBD) (Wang et al., 2018). En un estudio de unión a
113
diferentes sustratos de la quitinasa, se demostró que tanto la enzima madura como el dominio
aislado ChBD, se unen específicamente a la quitina o a su forma regenerada (por ejemplo,
quitosano acetilado) pero no a otros polisacáridos como la celulosa, el quitosano o el almidón.
Al parecer, este dominio se une a una región de la quitina insoluble pero no a derivados
solubles de esta, siendo una unión estable en un amplio rango de pH y de alta afinidad. Sin
embargo, cuando se elimina ChBD de la quitinasa madura, ésta no es capaz de unirse a quitina
(Hashimoto et al., 2000).
La quitina, componente principal de las conchas de los crustáceos, es un homopolímero lineal

insoluble de N-acetil-glucosamina unida mediante enlaces β-1,4. Este biopolímero y la
celulosa, son los más abundantes en la naturaleza. El quitosano es un derivado de la quitina
que se forma por desacetilación de esta con álcali, resultando en su solubilización. El quitosano
está disponible comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares (por ejemplo,
10-1.000 kDa) y diferentes grados de desacetilación. La quitina se puede regenerar por
acetilación del quitosano en una solución ácida usando un agente de acetilación como el
anhídrido acético (Brooker et al., 2012).
El objetivo de este capítulo es conseguir el aumento de la sensibilidad de los ELISA a través de

la preparación de superficies de quitina y la utilización de anticuerpos de captura, obtenidos
de forma recombinante o química, unidos a ChBD. Atendiendo a este objetivo general, se
llevará a cabo la preparación de placas de poliestireno de formato de 96 pocillos recubiertas
con quitina. Para ello, debido a que la quitina es altamente insoluble, se partirá de quitosano
comercial y se realizará un proceso de acetilación in situ, suficiente para el reconocimiento
específico de ChBD.
El anticuerpo de captura utilizado, anti c-myc 9E10, se fusionará a ChBD siguiendo dos vías
diferentes: 1) mediante la obtención del anticuerpo recombinante por clonación del
anticuerpo fusionado a CHBD en un vector de expresión de células de mamíferos, y 2)
mediante reacciones de tipo química clic entre el anticuerpo acoplado a un grupo trans-
cicloocteno y ChBD acoplada a tetracina. Para este último caso, el anticuerpo será obtenido del
cultivo de hibridoma, mientras que ChBD será clonada en un vector de expresión de E. coli y
posteriormente purificado tras su sobreexpresión en estas células.
La obtención del anticuerpo recombinante fusionado a ChBD asegura la ubicación de este en la

molécula del anticuerpo, lo que permitirá su orientación en las superficies, mientras que en el
anticuerpo unido a ChBD de forma química puede situarse en cualquier sitio de la molécula del
anticuerpo. A pesar de que esta vía es menos específica, su desarrollo es esencial ya que en
114
muchos casos no es posible la clonación del anticuerpo debido a que no es conocida su

secuencia y el proceso de clonación es altamente especializado. Por otra parte, una vez
obtenido el anticuerpo deseado, los reactivos necesarios para la unión entre las dos moléculas
están disponibles comercialmente.
El aumento de sensibilidad de los ELISA será evaluado a través de la determinación de la

proteína recombinante c-myc-GST-IL8 humana como modelo de cuantificación por ELISA.
115
4.2.1. Obtención de proteínas recombinantes

4.2.1.1. Obtención de la proteína recombinante Cys-His6-ChBD
El fragmento sintético Cys-His6-ChBD, que consta de 6 histidinas y una cisteína en el extremo

amino unidos a la secuencia del dominio de unión a quitina de la quitinasa A1 de Bacillus
circulans WL-12 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKALQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ;
(Terpe, 2003), fue clonado dentro del vector pET-43a (Novagen) con las enzimas de restricción
NdeI/SalI. El vector obtenido, pET-43a-Cys-His6-ChBD, fue confirmado por digestión de
comprobación usando enzimas de restricción y posteriormente mediante secuenciación (STAB
VIDA).
La expresión y purificación de la proteína fue realizada según Hashimoto et al., 2000. Las
células BL21 (DE3) de E. coli una vez transformadas con el vector pET-43a-Cys-His6-ChBD,
fueron incubadas a 37 ºC en 0,5L de medio LB conteniendo 50 µg/ml ampicilina. Cuando fue
alcanzada una densidad óptica a 600nm (DO600nm) de 0,6 el cultivo fue inducido añadiendo
isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5mM. La inducción fue
incubada durante 16 h a 30 ºC y agitación constante de 160 rpm. Posteriormente, el cultivo fue
centrifugado a 5.000 g durante 10 minutos y el pellet celular se resuspendió en una solución
de Tris-HCl 100mM (pH 8) conteniendo 10mM de PMSF y 1mM de EDTA. Tras un paso de
lavado las células fueron resuspendidas en la misma solución y sonicadas utilizando el
sonicador Bandelin Sonoplus (BANDELIN electronic GmbH & Co. KG) con un 70% de potencia.
La fracción soluble de la proteína fue clarificada mediante centrifugación (14.000 g, 30
minutos, 4 ºC) y posteriormente precipitada con un 60% de saturación de sulfato de amonio a
4 ºC durante 16 h y agitación magnética. El precipitado de la proteína fue disuelto en 5mM
fosfato de sodio pH 6 conteniendo 10mM de Imidazol y, posteriormente, dializado usando
membrana de diálisis de 10 kDa contra 1L del mismo tampón. Finalmente, la proteína Cys-
His6-ChBD fue purificada mediante cromatografía con columna de Ni por afinidad (HisTrap HP,
GE Healthcare 17-5247-01) siguiendo las instrucciones del fabricante en AKTA Prime Plus. La
proteína fue cuantificada mediante Bradford usando una curva de BSA y analizada mediante
electroforesis en gel de acrilamida al 14% para determinar el grado de pureza.
Para la detección de la actividad del dominio de unión a quitina, se llevó a cabo un ELISA en
placas cuya superficie fue previamente recubierta con quitosano acetilado (Apartado 4.2.3). La
proteína Cys-His6-ChBD purificada fue añadida a la placa en el rango de concentraciones de
15,62-1000 pg/ml e incubada 1 h a 37 ºC. Una vez lavados los pocillos 3 veces con 0,2ml de
116
PBS-Tween-20 0,05%, se añadió 0,1ml del anticuerpo anti histidina-biotina (GenScript, A00613)
a 50 ng/ml (Fig. 60). Luego de 3 lavados fueron añadidos 100 ng/ml de estreptavidina-HRP e
incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Finalmente se
añadió el sustrato de la peroxidasa TMB y la reacción fue detenida usando HCl 1M. La lectura
del ELISA fue realizada a 450nm usando el equipo de lectura FLUOstar OPTIMA.
Figura 60. Esquema del ELISA de detección de actividad de ChBD en placas de quitosano acetilado. El
anticuerpo de detección es específico para el tag histidina que lleva la proteína Cys-His6-ChBD, por lo
que como control negativo se utilizó la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h, que presenta una cola
de 6 histidinas en el amino terminal.
4.2.1.2. Obtención del anticuerpo anti c-myc-CHBD en células de mamífero
Para la obtención del anticuerpo anti-c-myc fue aislado el ARN del hibridoma 9E10 a partir de
106 células usando el reactivo PRImeZOL (Canvax Biotech, AN1100) y atendiendo al protocolo
descrito por el fabricante. Posteriormente, fue realizada una retrotranscripción del ARN en
ADNc y éste fue usado como molde para la amplificación de la secuencia del anticuerpo
usando una polimerasa de alta fidelidad (Canvax Biotech, P0032).
La retrotranscripción del fragmento Vk-Ck del anticuerpo fue desarrollada usando el oligo pCK-
2rev (5´ TATGCGGCCGCCTTTGTCTCTAACACTCATTCCTG 3´). La amplificación por PCR fue
realizada usando los oligos pVK-1fw (5´GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’)
y pCK-2rev. Por otro lado, el ADNc del fragmento VH del anticuerpo se obtuvo utilizando el
oligo pVH9E10-6rev (5´TTTTAGATCTAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC 3’) en la retrotranscripción,
mientras que la PCR se llevó a cabo usando los oligos pVH9E10-4fw
(5´TTTAAGCTTCGCCACCATGAACTTCGGGCTCAG 3´) y pVH9E10-6rev.
Los productos de la PCR obtenidos en ambos casos fueron clonados en el vector pSPARK®
(Canvax Biotech, C0001) y secuenciados en el servicio de secuenciación de la empresa STAB
VIDA. Las secuencias funcionales obtenidas del fragmento Vk-Ck del anticuerpo fueron sub
117
clonadas en el vector de expresión pcDNA3.4 usando las enzimas de restricción EcoRV/ NotI,
mientras que para el fragmento VH fueron utilizadas las enzimas HindIII/ BglII. Finalmente, el
fragmento VH del anticuerpo fue fusionado en fase al fragmento Fc de la IgG1 murina. Los
vectores recombinantes fueron comprobados por digestión y secuenciación.
El dominio de unión a quitina (ChBD) de la quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12 fue

amplificado con las enzimas de restricción 5´NheI/ 3´NotI flanqueantes a la secuencia. Fue
realizada una ligación triple entre el fragmento de ChBD digerido NheI/ NotI, el fragmento de
PCR correspondiente al VH amplificado con los oligos pVH9E10-4fw y pIgG1m-25rev
(5´GATAGCTAGCTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG 3´) y digerido con las enzimas HindIII/ NheI y el
vector pcDNA3.4 abierto con las enzimas HindIII/ NotI.
Los vectores obtenidos para la expresión de las cadenas VH y VK del anticuerpo anti c-myc-
ChBD fueron co-transfectados en células CHO-S usando el kit de expresión “ExpiCHO
Expression system kit” (Thermo Scientific, A29133). El anticuerpo fue expresado durante 10
días a 32 ºC y 5% CO2 con agitación constante atendiendo a las instrucciones del fabricante.
Las células fueron separadas por centrifugación y el sobrenadante conteniendo el anticuerpo
se cuantificó mediante ELISA sándwich de detección de IgG murina y purificado mediante
afinidad con columna de proteína G (HiTrap Protein G HP, GE Healthcare 29-0485-81). El
anticuerpo fue cuantificado por absorbancia a 280nm y el grado de pureza del anticuerpo se
analizó mediante electroforesis.
La detección de la actividad del anticuerpo fue efectuada posteriormente mediante un ELISA

indirecto (Fig. 61). Una placa estándar de ELISA, Maxisorp (Thermo Scientific, 442404), fue
recubierta con 2 µg/ml de la proteína c-myc-GST-IL8 humana e incubada a 4 ºC durante 16 h.
La placa fue lavada 3 veces usando 0,2 ml por pocillo de PBS-Tween-20 0,05% y bloqueada con
PBS-BSA 1% durante 30 minutos a 37 ºC. Posteriormente se añadió el anticuerpo anti c-myc
obtenido del hibridoma 9E10 o el anticuerpo anti c-myc-ChBD, obtenido de forma
recombinante a partir del cultivo de células CHO, ambos con diluciones seriadas en base dos,
desde 100 a 0,078 ng/ml. Después de tres lavados, el ELISA fue revelado usando el anticuerpo
anti mouse HRP (Sigma-Aldrich, A2554). Finalmente fue añadido el sustrato TMB y la reacción
fue parada con 1M HCl. La absorbancia se determinó a 450 nm usando el lector de placas
FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).
118
Figura 61. ELISA de detección de actividad del anticuerpo recombinante anti c-myc-ChBD. Para la curva
patrón se utiliza el anticuerpo anti c-myc obtenido del hibridoma.
Para la detección de la actividad del dominio de unión a quitina del anticuerpo anti c-myc-
ChBD, se utilizaron partículas magnéticas de quitina (Chitin magnetic beads; BioLabs E8036S),
siguiendo las indicaciones del fabricante. Brevemente, 1 µg/ml del anticuerpo en tampón de
unión (500 mM NaCl, 20 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X100 pH 8) fue incubado con
50 µl de partículas durante 1 h a 4 ºC. Una vez lavados 3 veces con el mismo tampón, fue
añadido 1 µg/ml del anticuerpo anti-mouse FITC y se incubó durante 30 minutos a 4 ºC. Las
partículas fueron posteriormente analizadas mediante citometría de flujo (Guava EasyCyte
mini, Guava Technologies).
4.2.2. Unión del anticuerpo anti c-myc con el dominio de unión a quitina químicamente
4.2.2.1. Modificación química del anticuerpo anti c-myc y de la proteína de unión a quitina
El grupo reactivo TCO se incorporó al anticuerpo anti c-myc según lo descrito en el apartado
2.2.2.1 y, posteriormente, se determinó su actividad. El grupo reactivo tetracina fue
incorporado en la proteína Cys-His6-ChBD a través del grupo SH del aminoácido cisteína
adicionado a la proteína. Primeramente, la proteína fue tratada con 1 mM de DTT durante 30
minutos a temperatura ambiente con el objetivo de reducir el grupo SH y más adelante
dializada en un dispositivo de diálisis (Amicon) de masa molecular de corte de 10 kDa
(Millipore, UFC801024) contra 100 mM fosfato de sodio, 150 mM NaCl, EDTA 5 mM pH 7,5. La
proteína fue cuantificada mediante Bradford usando una curva de BSA. Posteriormente, 1 mg
de la proteína reducida (MW teórica= 12.216 daltons), que equivale a 8,18 x 10-8 mol, fue
modificado usando un exceso molar del reactivo Tetrazine-PEG4-Maleimide (Click Chemistry
Tools, A139) de 10. El reactivo fue incubado con la proteína durante 1 h a temperatura
119
ambiente y luego la mezcla fue dializada contra 1L de PBS pH 7,4 usando membrana de 12 kDa
de corte. La proteína tetracina-Cys-His6-ChBD fue cuantificada por Bradford.
La proteína Cys-His6-ChBD-Tetracina fue mezclada con el anticuerpo anti c-myc-TCO (4 TCO: 1

anti c-myc), obtenido en el apartado 2.2.2.1., y fue incubada durante 4h a temperatura
ambiente. Para ello, se tiene en cuenta una relación molar de 10 tetracina-Cys-His6-ChBD: 1
anti c-myc-TCO. Posteriormente la mezcla fue dializada en un dispositivo de diálisis (Amicon)
de masa molecular de corte de 100 kDa (Millipore, UFC610024) con el objetivo de eliminar el
exceso de proteína Cys-His6-ChBD-Tetracina contra PBS pH 7.4. El anticuerpo se purificó en
AKTA usando columna de proteína G (HiTrap Protein G HP, GE Healthcare 29-0485-81),
cuantificado por absorbancia a 280nm y analizado el grado de pureza del anticuerpo mediante
electroforesis. La actividad del anticuerpo fue determinada usando el ELISA descrito en el
apartado 4.2.1.2.
4.2.2.2. Detección de la unión química entre ChBD y el anticuerpo anti c-myc
La unión química entre el anticuerpo anti c-myc y ChBD, a través de la reacción entre la
tetracina y el TCO, fue detectada mediante un ELISA realizado en placas preparadas con
quitosano acetilado. Para ello fue añadido el anticuerpo en el rango de concentraciones desde
3,12-100 ng/ml e incubado a 37 ºC durante 2 h. El anticuerpo sin unirse a la proteína ChBD fue
utilizado como control negativo. Luego de tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% se añadió el
anticuerpo de revelado anti mouse IgG HRP (Fig. 62).
Figura 62. Esquema del ensayo de detección de actividad de la proteína recombinante ChBD unida de
forma química al anticuerpo anti c-myc en placas preparadas de quitosano acetilado.
4.2.3. Preparación de superficies de quitosano acetilado
Se utilizó el procedimiento descrito por Bernard et al. (2004) incluyendo pequeñas

modificaciones. En nuestro caso, fueron utilizados dos tipos de quitosano con distintos grados
120
de desacetilación, 60% (Chitosan, Sigma-Aldrich, 740063) y 80% (Chitosan Crab Shells, Sigma-
Aldrich, 48165), de cada uno de los cuales fueron disueltos 30 mg del quitosano deacetilado en
5 ml de 0,1M de cetato de sodio pH 3. Cada solución fue diluida 20 veces en acetato de sodio
0,1M, pH 5, y se añadieron 50 μl por pocillo en placas de poliestireno de 96 pocillos.
Posteriormente fueron añadidos 8 μL de ácido acético anhidrido (Sigma-Aldrich, 320102) (Fig.
63). La placa fue incubada toda la noche en cámara de extracción de gases para permitir el
secado de la misma. Finalmente, la placa fue lavada con PBS 10X pH 7,4 y bloqueada con 0,3
ml de PBS 10x pH 7,4 + 1 μg/mL de BSA.
Figura 63. Representación de la reacción de acetilación del quitosano mediante una reacción in situ con
ácido acético anhidrido.
Las placas preparadas con los distintos tipos de quitosano deacetilado fueron evaluadas para
detectar el quitosano adherido a la superficie y ser comparadas entre sí usando un ensayo tipo
ELISA. A ambas placas les fue añadido el anticuerpo anti c-myc-ChBD obtenido en células de
mamíferos con diluciones seriadas en base dos, desde 50 a 0,039 ng/mL, y este fue incubado
durante 2 h a 37 ºC. Después de tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% se llevó a cabo el
revelado empleado el anticuerpo anti mouse HRP (Fig. 62).
4.2.4. ELISAs para la validación del aumento de sensibilidad de las superficies de quitosano
acetilado con respecto a las superficies estándar
4.2.4.1. Optimización de la unión de la proteína de unión a quitina a la superficie de
quitosano acetilado
Para la optimización de la unión de ChBD a la superficie de quitosano acetilado, se determinó

la concentración óptima del anticuerpo de recubrimiento anti c-myc-ChBD obtenido en células
de mamíferos, así como el tiempo de incubación (1, 2, 4, 6 y 16 h) de la reacción ChBD-quitina,
y el buffer de unión (PBS pH 7,4 o NaHCO3 pH 9). Para ello, en una placa con superficie de
quitina fue añadido el anticuerpo anti c-myc-ChBD con diluciones seriadas desde 1 a 0,312
µg/ml e incubado durante 2 h a 37 ºC. El anticuerpo anti c-myc 9E10 obtenido de hibridoma se
utilizó como control de especificidad de la reacción. El ELISA fue revelado con anti mouse HRP
(Fig. 62).
121
4.2.4.2. Comparación del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h realizado en placas con

superficies preparadas con quitosano acetilado o superficies estándar
El ELISA en placas MaxiSorp y en placas preparadas con quitosano acetilado fue llevado en
paralelo (Fig. 64). Para ello, se recubrió con el anticuerpo anti c-myc en placas MaxiSorp y con
anti c-myc ChBD en placas de quitosano acetilado. Posteriormente las placas fueron
bloqueadas con una solución de PBS pH 7,4 conteniendo BSA 1% (peso: volumen) durante 30
minutos a 37 ºC. La proteína c-myc-GST-IL8h fue añadida en un rango de concentraciones de
100-0,39 ng/ml e incubada a 37 ºC durante 1 h. Fueron realizados 3 lavados con 0,2ml de PBS-
Tween-20 0,05% para eliminar absorciones inespecíficas de la proteína. El anticuerpo anti IL8
biotina (clon MT8F19) fue añadido (1 µg/ml) e incubado durante 1 h a 37 ºC. Tras 5 lavados se
añadió la estreptavidina-HRP (Thermo Scientific, 21130) a 100 ng/ml e incubada a temperatura
ambiente y protegida de la luz durante 30 minutos. Fue utilizado como sustrato el TMB y la
reacción fue detenida con una solución de 1M de HCl. Se determinó la absorbancia a 450nm
usando el lector de placas FLUOstar OPTIMA.
Figura 64. Esquema del ELISA de detección de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h en superficie
estándar y en superficie tratada con quitosano acetilado. El anticuerpo de captura utilizado en la
superficie estándar es anti c-myc proveniente del hibridoma 9E10, mientras que en las superficies de
quitosano, se utiliza el anticuerpo recombinante producido en células de mamíferos anti c-myc-ChBD
(clon 9E10).
Usando estos ELISAs en paralelo se evaluó el anticuerpo anti c-myc-ChBD obtenido mediante
clonación y expresión en células de mamíferos y el anticuerpo obtenido mediante unión
química.
122
4.2.4.3. Influencia del tipo de muestras sobre el ELISA
Para determinar la influencia de la procedencia de la muestra, se añadió la proteína c-myc-

GST-IL8h a dos concentraciones, 100 ng/ml y 10 ng/ml en suero humano, plasma humano o
medio de cultivo de células superiores (Medio RPMI 1640). La concentración de las muestras
fue determinada en el ELISA en placas de quitosano acetilado usando para ello la curva patrón
de la proteína diluida en PBS-BSA 0,5%.
El porcentaje de recuperación fue calculado teniendo en cuenta que el 100% de recuperación

o la concentración esperada era la obtenida cuando la muestra fue disuelta en PBS-BSA 0,5% y
cuantificada mediante el ELISA. La ecuación utilizada fue:
% de recuperación = (Concentración observada de la muestra con la proteína añadida - Media

de la concentración de la muestra sin añadir la proteína) / Concentración de la proteína
obtenida en PBS-BSA 0,5%
123
4.3. RESULTADOS
4.3.1. Obtención de proteínas recombinantes

4.3.1.1. Obtención de la proteína recombinante His6-Cys-ChBD
El dominio de unión a quitina de la quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12 (ChBD) fue clonado
añadiendo un aminoácido cisteína en el extremo amino. Esta metodología se llevó a cabo con
el objetivo de unir de forma dirigida el grupo reactivo tetracina a la proteína a través de una
reacción de la maleimida con el grupo sulfhidrilo de la cisteína. La proteína recombinante Cys-
His6-ChBD clonada en el vector de expresión pET-43a se representa en la Fig. 65. La secuencia
de nucleótidos correspondientes al inserto fue comprobada mediante secuenciación siendo
esta la esperada (Stabvida).
Figura 65. Vector de expresión pET-43a conteniendo la secuencia de la proteína recombinante ChBD
conteniendo 6 histidinas y una cisteína en el carboxilo terminal.
El vector pET-43a-Cys-His6-ChBD resultante fue utilizado para la transformación de las células

BL21 (DE3) y, posteriormente, fue purificada la proteína mediante afinidad en columna de
níquel. A partir de la sobre expresión de estas células se obtuvieron 5 mg por litro de cultivo de
la proteína recombinante. A continuación, fue analizado el grado de pureza de la proteína
purificada mediante electroforesis en un gel de acrilamida, detectándose una única banda con
un peso molecular aproximado al teórico de 13 kDa (Fig. 66 Izq.).
La actividad del dominio de unión a quitina fue detectada en placas de quitosano acetilado
mediante un ELISA. Como se observa en la Fig. 66, el ensayo está en el orden de los pg/ml,
siendo el LOD de 68,11 pg/ml, indicando la alta afinidad de ChBD por el quitosano acetilado.
124
Figura 66. Análisis de la proteína recombinante Cys-His6-ChBD purificada de cultivo de E. coli. Izquierda:
Electroforesis en gel de acrilamida (14%) y tinción con azul de Coomassie. Carril 1: 5 µg de Cys-His6-
ChBD; Carril 2: patrón de peso molecular (Thermo Fisher Scientific, 26619). Derecha: Curva sigmoidal 4PL
de la detección de actividad de la proteína ChBD en placas de quitosano acetilado y detección con el
anticuerpo anti histidina.
4.3.1.2. Obtención del anticuerpo anti c-myc-ChBD en células ExpiCHO
Los fragmentos VH y Vk del anticuerpo anti c-myc (Clon 9E10) fueron clonados en el vector
pCDNA3.1 con promotor de citomegalovirus. La región constante de la cadena ligera, Ck murina,
fue clonada en fase detrás del Vk. De la misma manera, detrás del fragmento variable de la
cadena pesada (VH), fue clonada la fracción constante de la cadena pesada de una IgG1
murina y posteriormente se añadió el dominio de unión a quitina (ChBD) (Fig. 67). Las
clonaciones fueron comprobadas por digestión con enzimas de restricción y secuenciadas
posteriormente.
Figura 67. Esquema de los vectores para la expresión del anticuerpo recombinante anti c-myc-ChBD en
células de mamíferos (cadenas ligera y pesada). PCMV: Promotor de citomegalovirus; PSVk: Péptido
señal de la cadena ligera; Vk anti c-myc: Región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti c-myc;
CK mm: Cadena constante kappa murina (mm: Mus musculus); PSVH: Péptido señal de la cadena
pesada; VH anti c-myc: región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti c-myc; Fc IgG mm:
Fracción constante de la cadena pesada murina; ChBD: Dominio de unión a la quitinasa A1 de Bacillus
circulans WL-12.
125
El anticuerpo anti c-myc-ChBD fue obtenido a partir de la expresión en células ExpiCHO usando
un protocolo estándar. Atendiendo al ELISA de cuantificación del sobrenadante de las células
expresando el anticuerpo, se detectaron 40 μg por ml de cultivo del anticuerpo obteniéndose
tras la purificación, 8 mg totales del anticuerpo a partir de 60 ml de cultivo. Según la
electroforesis en gel de acrilamida, el anticuerpo presenta un alto grado de pureza (Fig. 68).
Figura 68. Análisis del anticuerpo anti c-myc-ChBD expresado en células de mamífero. Electroforesis en
gel de acrilamida al 10% y tinción con azul de Coomassie. Carril 1: 2 µg de anti c-myc-ChBD en tampón
de carga conteniendo β Mercaptoetanol; Carril 2: Patrón de peso molecular en kDa (Thermo Fisher
Scientific, 26619).
Posteriormente, el anticuerpo purificado a partir de este sobrenadante fue analizado mediante

ELISA para comparar su actividad con respecto al anticuerpo anti c-myc obtenido a partir del
clon del hibridoma 9E10, y también para detectar actividad del dominio de unión a quitina
mediante citometría sobre partículas de quitina. Como se observa, ambos anticuerpos poseen
la misma actividad, lo que demuestra que la fusión al dominio ChBD no afecta la actividad de
reconocimiento del anticuerpo por su antígeno. Asimismo, las curvas no presentan diferencias
significativas entre sí, siendo el valor de p= 0,3658 (Fig. 69).
126
Figura 69. Curva sigmoidal 4PL resultante del análisis del ELISA de detección de la actividad específica
del anticuerpo recombinante anti c-myc-ChBD obtenido en células de mamíferos comparado con el
anticuerpo anti c-myc obtenido del hibridoma 9E10.
Atendiendo a la citometría de flujo sobre las partículas de quitina comerciales (Fig. 70), se
observa que el dominio de unión a quitina de la quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12
fusionada al anticuerpo anti c-myc mediante clonación, es activo y capaz de reconocer de
forma específica la quitina, detectándose un 50% de unión.
Figura 70. Citometría de partículas magnéticas recubiertas con quitina usando el anticuerpo anti c-myc-
ChBD. Como control negativo de la citometría fue utilizado el anticuerpo anti c-myc, representado por la
línea gris, mientras que el anticuerpo anti c-myc-ChBD está representado en rojo.
4.3.2. Unión del anticuerpo anti c-myc con el dominio de unión a quitina químicamente
4.3.2.1. Modificación química del anticuerpo anti c-myc y de la proteína de unión a quitina
Se incorporaron cuatro grupos trans-cicloocteno en el anticuerpo anti c-myc como fue descrito
en el apartado 2.2.2.1. La actividad del anticuerpo con TCO (2.2.2.1.1) fue comparada con la
del anticuerpo sin modificar, observándose que no hubo pérdida de la misma, ya que el
anticuerpo continúa reconociendo su antígeno específico. Por otro lado, se incorporó un grupo
127
tetracina, a través de la reacción de la maleimida, con la cisteína incorporada en un extremo

de la proteína Cys-His6-ChBD. Ambas proteínas, anti c-myc-TCO y tetracina-Cys-His6-ChBD.
Tras ser dializadas, se mezclaron para permitir el acoplamiento entre las dos moléculas y, de
esta manera, obtener un anticuerpo anti c-myc fusionado a ChBD de forma química sin
necesidad de la obtención del anticuerpo de forma recombinante (Fig. 71).
Figura 71. Representación esquemática de la unión mediante química clic entre la tetracina y el TCO
incorporados en ChBD y el anticuerpo anti c-myc respectivamente, en condiciones fisiológicas.
4.3.2.2. Detección de la unión química entre ChBD y el anticuerpo anti c-myc
La unión química de ChBD al anticuerpo anti c-myc mediante una reacción de tipo química clic,
fue comprobada a través de un ELISA realizado en placas de quitosano acetilado. En este
ensayo se comprueba la unión entre ambas moléculas además de la actividad de la proteína
Cys-His6-ChBD obtenida de forma recombinante en E. coli. Como control negativo del ELISA se
utilizó el anticuerpo sin modificar, el cual no presentó reacción en el rango de concentraciones
utilizado. Como se observa en la Fig. 72, a medida que aumenta la concentración del
anticuerpo, aumenta la señalización del ELISA, indicando que la proteína ChBD es activa ya que
se está uniendo de forma específica al quitosano acetilado de la superficie. Además, queda
demostrada la unión entre ambas moléculas, ya que en el ensayo tipo sándwich se captura la
proteína mediante la actividad de unión de ChBD a la superficie y la detección se hace de la
región constante del anticuerpo, por lo que para que haya señalización tienen que ocurrir
ambos eventos.
128
Figura 72. Curva sigmoidal 4PL del ensayo de detección de actividad del dominio de unión a quitina
unido mediante química clic, realizado en placas de quitosano acetilado.
4.3.3. Preparación de superficies de quitosano acetilado
Se prepararon dos superficies distintas de quitina (quitosano acetilado) a partir de dos tipos de
quitosano comercial que se diferenciaban en el grado de desacetilación, uno con un 60% y el
otro con un 80%. Ambas superficies fueron tratadas mediante un proceso de acetilación in
situ. Se esperaba que el porcentaje de desacetilación más bajo produjera mejores resultados,
ya que ChBD se une específicamente a los derivados de la quitina insolubles. Sin embargo, las
señales fueron mayores en las superficies preparadas a partir del quitosano con un 80% de
desacetilación (Fig. 73). Estos resultados pueden ser debidos al hecho de que la solución previa
preparada del quitosano con un 80% de desacetilación es mucho menos viscosa que la
preparada a partir del quitosano con un 60% de desacetilación.
Figura 73. Análisis de las superficies de quitosano acetilado preparadas a partir de dos quitosanos con
diferentes grados de desacetilación. Curva sigmoidal 4PL obtenida usando diferentes concentraciones
del anticuerpo anti c-myc-ChBD recombinante sobre cada superficie. Se representa la EC50 obtenida en
cada curva.
129
Además, una vez analizado el coeficiente de variación obtenido de los resultados de la

absorbancia resultante de 10 controles negativos de cada superficie, se encontraron mejores
resultados en las superficies preparadas con un 80% de desacetilación (Tabla 16), por lo que se
seleccionó este tipo de superficie en ensayos posteriores.
Tabla 16. Análisis del control negativo sin anticuerpo (blanco) en el ELISA de
detección de actividad de ChBD en la proteína de fusión anti c-myc-ChBD
Quitosano 60% de Quitosano 80% de
desacetilación desacetilación
Media blanco 0,208 0,170
CV% del blanco 18,66 4,70
4.3.4. ELISAs para la validación del aumento de sensibilidad de las superficies de quitosano
acetilado con respecto a las superficies estándar
4.3.4.1. Optimización de la unión de la proteína de unión a quitina a la superficie de
quitosano acetilado
El ELISA de unión del anticuerpo recombinante anti c-myc-ChBD comparado con el anticuerpo
proveniente del hibridoma 9E10 anti c-myc, se llevó a cabo en una superficie previamente
preparada de quitosano acetilado (Fig. 74a). Como se observa, la unión a estas superficies es
específica para el anticuerpo que lleva el dominio de unión a quitina (ChBD) y no se observa
unión cuando se utiliza el anticuerpo anti c-myc. Este ELISA fue repetido 5 veces en días
diferentes y se comprobó que, para un intervalo de confianza del 95%, la EC50 estaba en el
rango entre 47,54 y 67,22 ng/ml. Debido a que este anticuerpo es el de captura del antígeno
en un ELISA tipo sándwich, se consideró que la concentración del mismo debería de ser
saturante por lo que fue calculada la EC95, que estuvo en el rango entre 155,41 y 219,75
ng/ml.
El tampón de reacción y el tiempo de incubación fueron variables medidas con el objetivo de

optimizar las condiciones de unión entre el quitosano acetilado y el anticuerpo recombinante
anti c-myc-ChBD. El tampón con mejores resultados fue el NaHCO3, dado que la EC50 fue de
14,7 ng/ml, mientras que la obtenida con PBS fue más alta, de 55,5 ng/ml (Fig. 74b). Los
resultados del valor de p mediante el test t de Student para las comparaciones entre las
distintas curvas obtenidas con respecto a los tiempos de incubación (1, 2, 4 y 6h), demuestran
que no hubo diferencias significativas para un intervalo del 95% de confianza, por lo que fue
seleccionada 1 h de incubación como el tiempo óptimo de unión (Fig 74c).
130
a b
Figura 74. Análisis de las condiciones óptimas de unión de ChBD sobre las superficies de quitosano
acetilado. a. Comparación de la unión del anticuerpo recombinante anti c-myc-ChBD y el anticuerpo anti
c-myc sobre superficies de quitosano acetilado. b. Curvas de unión del anticuerpo recombinante anti c-
myc-ChBD usando diferentes tampones. c. Curvas de unión de anti c-myc-ChBD a 37 ºC a las superficies
de quitosano acetilado usando diferentes tiempos de incubación. Todas las curvas muestran las barras
de error de 3 réplicas para cada concentración del anticuerpo.
4.3.4.2. Comparación del ELISA de detección de c-myc-GST-IL8h realizado en placas con

superficies preparadas con quitosano acetilado o superficies estándar
El ELISA desarrollado en superficies recubiertas con quitosano acetilado y usando anti c-myc-
ChBD recombinante como anticuerpo de captura, fue comparado con el ELISA desarrollado en
superficies estándar con el anticuerpo anti c-myc proveniente de hibridoma, para la detección
de la proteína c-myc-GST-IL8h (Fig. 64). La curva sigmoidal referente a la superficie de
quitosano acetilado, se desplaza hacia la izquierda con respecto a la de la superficie estándar,
indicando que concentraciones más bajas del analito pueden ser detectadas y cuantificadas
(Fig. 75).
131
Figura 75. ELISA comparativo de detección de la proteína c-myc-GST-IL8h en superficies estándar y

superficies tratadas con quitosano acetilado. Izquierda: Curva sigmoidal 4PL del ELISA desarrollado
sobre las dos superficies. El rango de concentración usado fue de 0,39-200 ng/ml. Los resultados
corresponden a 3 réplicas de cada concentración. El control negativo incluía 10 réplicas. Derecha:
Diagrama de barras del LOD y el LOQ obtenido de 5 repeticiones del ELISA en cada superficie.
En las superficies estándar la cantidad mínima detectada de la proteína c-myc-GST-IL8h fue de

10,4 ng/mL, mientras que en las superficies de quitosano acetilado fue de 1,74 ng/ml,
significando esto un incremento de 6 veces el límite de detección (Tabla 17). Además, las
cantidades mínimas que pueden ser cuantificadas fueron 12,5 y 2,4 ng/ml respectivamente, lo
que supone una mejora de 5,2 veces del límite de cuantificación. Por otra parte, el análisis
estadístico de los resultados nos muestra diferencias tanto en el LOD como en el LOQ entre
ambas placas (p < 0,0001) (Fig. 75).
Tabla 17. Comparación de los resultados obtenidos del LOD y el LOQ del ELISA de
detección de la proteína c-myc-GST-IL8h en superficies estándar y superficies tratadas
con quitosano acetilado.
Superficies estándar Superficies de quitosano acetilado
LOD (ng/mL) 10,38 ± 1,58 1,74 ± 0,23
LOQ (ng/mL) 12,50 ± 1,41 2,40 ± 0,34
CV% Intra-ensayo 0,27- 6,05 0,17- 4,90
CV% Inter-ensayo 0,77- 8,35 1,37- 6,59
El anticuerpo anti c-myc-ChBD obtenido por la unión de ambas proteínas mediante reacción
química, fue utilizado para determinar si, al igual que el anticuerpo obtenido de forma
recombinante, aumentaba la sensibilidad del ELISA de detección de la proteína c-myc-GST-
IL8h. De la misma manera fue comparado el ELISA realizado en superficies estándar o en placas
recubiertas con quitosano acetilado. En la Fig. 76 se observa que las señales son mayores en el
ELISA realizado en superficies de quitosano acetilado en comparación con la estándar.
132
Atendiendo al LOD calculado, 9,56 ng/ml para la superficie estándar y 2,45 ng/ml para la
superficie de quitosano, se demuestra que hay un aumento de sensibilidad de 4 veces.
Figura 76. Curva sigmoidal 4PL obtenida del ELISA comparativo de detección de la proteína c-myc-GST-
IL8h en superficies estándar y tratadas con quitosano acetilado.
4.3.4.3. Influencia del tipo de muestras sobre el ELISA
Durante el desarrollo de un ELISA es necesario un ensayo de Proteína añadida/Recuperación

(Spike/Recovery) para determinar si los valores de una muestra cuantificada mediante el ELISA
son precisos y confiables y que no haya habido interferencias a casusa del medio natural de la
muestra. En este ensayo, una cantidad conocida de la proteína recombinante c-myc-GST-IL8h
es añadida a diferentes medios y cuantificada en las superficies preparadas con quitosano
acetilado. Los resultados de la concentración medida mediante el ELISA no deberían de diferir
significativamente del valor esperado de concentración. Si hubiese diferencias, estas podrían
estar causadas por algún factor de la muestra que inhibe la detección de la proteína en este
sistema.
La proteína fue añadida a muestras de plasma humano, de suero humano, de medio celular
(RPMI suplementado con 10% de FBS) y de PBS-BSA 0,5% a una concentración final de 10 y 100
ng/ml. Posteriormente, la proteína fue cuantificada mediante ELISA usando una curva
estándar. La concentración de la proteína preparada en PBS-BSA 0,5% fue considerada como el
100% de recuperación debido a que este es el tampón usado normalmente para desarrollar la
curva estándar (Fig. 77 a y b). El rango de recuperación aceptado fue del 80-120% (R&D
Systems).
133
a b
Figura 77. Detección de la proteína c-myc-GST-IL8h en superficies tratadas con quitosano acetilado
añadida a muestras biológicas humanas y medio de cultivo. a. Gráfico de barras de la concentración
resultante de la proteína cuando fue añadida a una concentración final de 10 ng/ml. b. Gráfico de barras
de la concentración resultante de la proteína cuando fue añadida a una concentración final de 100
ng/ml.
Como se observa en la Tabla 18 los porcentajes de recuperación se ajustan en todos los casos
al rango de recuperación aceptado, excepto el porcentaje del 73% correspondiente a la
concentración de 10 ng/ml de la proteína en suero humano. Estos resultados indican que las
superficies preparadas con quitosano pueden ser utilizadas para la detección de proteínas en
muestras de pacientes, así como en medios celulares con un alto porcentaje de suero fetal
bovino.
Tabla 18. Resultados de recuperación (en %) obtenido de cada muestra añadida en

diferentes medios comparado con el control.
Concentración de Resultados
Muestra proteína añadida cuantificación por % de recuperación
(ng/ml) ELISA (ng/ml)
10 9,54 92,54
Plasma humano
100 112,11 109,73
10 7,59 73,69
Suero humano
100 108,00 105,70
Medio RPMI + 10% 10 11,66 113,15

FBS 100 95,53 93,50
134
4.4. DISCUSIÓN
La correcta orientación de los anticuerpos en las superficies donde se desarrollan los

inmunoensayos reviste una gran importancia, ya que se ha demostrado que aumenta
considerablemente la sensibilidad de detección. Por esta razón, se han realizado numerosas
investigaciones de inmovilización orientada de anticuerpos a superficies basándose en la
afinidad entre distintas moléculas (Welch et al., 2017).
El quitosano es un compuesto de bajo coste ampliamente utilizado en diferentes aplicaciones

entre las que se incluye la preparación de superficies (Wei, Cruz and Gorski, 2002). Para la
regeneración de la quitina a partir de la acetilación del quitosano han sido realizados varios
estudios. Bernard et al. (2004) prepararon superficies, a través de una acetilación in situ del
quitosano, que permitieron detectar un análogo de la hormona glicoproteica heterodimérica
humana fusionada con ChBD directamente de los medios de cultivo de células de mamíferos,
detectando hasta una cantidad mínima de 100 picogramos totales de la proteína de fusión.
Según estos investigadores, la detección de la proteína estuvo en el mismo rango que cuando
se detectó la proteína usando placas de microtitulación recubiertas con anticuerpos de captura
de alta afinidad (es decir, Kd > 5x10-9M) y considerablemente mejor que cuando las placas de
microtitulación habían sido recubiertas con anticuerpos de menor afinidad (Kd < 10-8M). En
nuestro caso, usando las placas recubiertas con quitosano acetilado, fuimos capaces de
detectar hasta 6,8 picogramos totales de la proteína Cys-His6-ChBD. La sensibilidad, en nuestro
caso, fue 15 veces mayor. Sin embargo, este resultado puede ser debido a que nuestro
dominio de unión a quitina no estaba fusionado a ninguna proteína, lo que puede mejorar su
afinidad por la quitina, además de que el peso molecular es más bajo que la proteína de fusión
que usaron estos investigadores. Asimismo, la preparación de las superficies optimizadas con
un quitosano acetilado que tiene mejores rendimientos, el de caparazón de cangrejo, y el
anticuerpo de revelado utilizado, que es de alta afinidad y está biotinilado, probablemente
permitieron que el LOD fuese menor y que, por consiguiente, el ensayo fuera más sensible.
La unión entre ChBD y quitina es altamente estable en un amplio rango de pH. Incluso en
dodecilsulfato de sodio, esta interacción solo se disocia parcialmente a pH bajo o en urea 8 M
a 37 °C (Bernard et al., 2004). Estos datos sugieren que la unión ChBD-quitina es útil y
adecuada para el desarrollo de ELISAs en esas superficies preparadas.
En nuestro ensayo utilizamos superficies acetiladas no solo para detectar proteínas marcadas
con ChBD, sino también para mejorar la detección de cualquier molécula mediante
inmunoensayo. Los anticuerpos fusionados a ChBD nos permiten realizar cualquier tipo de
135
ELISA: sándwich, competitivo o directo. En contraste con esto, el método descrito por Bernard
et al., (2004) está restringido a analitos marcados con ChBD. Por otro lado, estos autores
utilizaron lecturas radioactivas mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados
radioactivamente, mientras que en este trabajo ha sido combinado el uso de las superficies de
quitosano acetilado con ensayos enzimáticos colorimétricos.
Posteriormente, hemos mostrado que la unión del anticuerpo anti c-myc fusionado a ChBD, ya
sea obtenido de forma recombinante o mediante química clic, se une de forma específica a
superficies de quitosano acetilado. Cuando fue usado como tampón de reacción entre ChBD y
su sustrato, uno de pH neutro o alcalino, se obtuvieron mejores resultados a pH más alto. Este
resultado concuerda con los reportados por Hashimoto et al. (2000), que demostraron que
ChBD de la quitinasa A1 muestra actividad de unión a la quitina en un amplio rango de pH,
siendo la mejor condición a pH 9.
La inmovilización de los anticuerpos biotinilados a superficies recubiertas de estreptavidina

como método de inmovilización de anticuerpos basado en la afinidad entre moléculas, no
permite la orientación correcta de los anticuerpos debido a que el proceso de biotinilación es
aleatorio donde generalmente la biotina se une al anticuerpo vía grupos NH2 libres. La biotina
puede unirse al grupo amino de cualquier lisina y también a un amino terminal: En
consecuencia, es posible que el anticuerpo no esté correctamente orientado en la superficie.
Sin embargo, la limitación más importante de este procedimiento es que generalmente se
usan anticuerpos biotinilados como anticuerpos secundarios; es decir, anticuerpos que se usan
para detectar el analito unido a un primer anticuerpo de recubrimiento. Cho et al. (2007)
conjugaron anticuerpos a biotina vía reacción de la maleimida con los grupos disulfuro de la
bisagra y detectó solo una mejora del doble en la detección del antígeno en relación con el
sistema que usa la biotinilación aleatoria de anticuerpos.
Otra de las técnicas de inmovilización de anticuerpos sitio-específica, utiliza la afinidad de la

región constante de los anticuerpos por la Proteína A (una proteína de membrana de
Streptococcus sp) y la Proteína G (una proteína de membrana de Staphylococcus aureus)
(Nilsson et al., 1987; Chen et al., 2018). La inmovilización de anticuerpos utilizando microplacas
recubiertas con proteína G es una técnica que, a pesar de haber sido comercializada, aún
continúa en investigación para mejorar su sensibilidad. Chen et al. (2018) prepararon placas de
ELISA recubiertas de células de mamífero que expresaban el dominio de unión al Fc de los
anticuerpos de forma repetida en superficie, obteniendo un aumento de la sensibilidad hasta
de 6,8 veces con respecto a las placas comerciales. Este método, a pesar de que permite una
orientación adecuada de los anticuerpos y no es necesaria su modificación, tiene la desventaja
136
de que debe evitarse el uso de las IgG como anticuerpos secundarios, ya que cualquier
proteína G libre reaccionará con dicha IgG secundaria. Este hecho es muy importante ya que la
mayoría de los anticuerpos comerciales que se utilizan hoy en día en los ELISA son de isotipo
IgG.
El ELISA realizado en nuestro sistema fue 6 veces más sensible que el realizado en superficies
estándar cuando se utilizó como anticuerpo de captura un anticuerpo fusionado a ChBD de
forma recombinante, y 4 veces más sensible cuando se utilizó el anticuerpo unido a ChBD
químicamente. Estas diferencias pueden ser debidas a que el anticuerpo obtenido de forma
recombinante tiene ChBD fusionado al Fc de la cadena pesada, mientras que el anticuerpo que
se une químicamente a ChBD lo hace vía grupos NH2 libres del anticuerpo. Por tanto, el primer
anticuerpo probablemente quedaría orientado en la superficie con sus sitios de unión al
antígeno expuestos, mientras que, en el otro caso, el anticuerpo puede no estar orientado de
forma correcta y la mejora de la sensibilidad sea debida solamente al aumento de la densidad
del anticuerpo en la superficie y al no desplazamiento de este en los pasos de lavado. La
literatura citada en este trabajo muestra que la unión a superficies de poliestireno de forma
pasiva tiende a distorsionar algunos anticuerpos de captura lo suficiente como para perder su
capacidad de detección de su antígeno (Butler, 2000). El método descrito aquí evita esa
tendencia porque la unión a la superficie es por afinidad y no por interacciones hidrofóbicas y
electrostáticas, por lo que la sensibilidad aumenta en cualquiera de los dos casos.
En este trabajo mostramos que un anticuerpo recombinante fusionado a ChBD por la región Fc
sería un método excelente para lograr una orientación adecuada de anticuerpos en placas de
ELISA, de forma similar a cuando estos son capturados con Proteína A o G. Este sistema,
basado en la superficie de quitosano acetilado, tiene la ventaja adicional de que para la
detección podrían usarse todos los isotipos de anticuerpos y/o cualquier anticuerpo
biotinilado.
En resumen, los datos mostrados aquí sugieren que las superficies de quitosano acetilado
mejoran la detección de biomarcadores incluso utilizando anticuerpos de baja afinidad. Este
método tiene también la ventaja de que puede ser desarrollado para cualquier biomarcador y
que, además, puede utilizar cualquier isotipo de anticuerpo en la detección. Por ello, este
sistema podría utilizarse para cuantificar una muestra biológica que tenga una concentración
por debajo del límite de detección del ELISA tradicional. Dado el aumento de la sensibilidad, la
estabilidad en el tiempo y el bajo costo de su preparación, las superficies de quitosano
acetilado pueden ser una excelente alternativa a las superficies estándar.
137
Conclusiones
CONCLUSIONES
1.- El uso de un sistema de inmovilización de anticuerpos, donde estos quedan fijados a la

superficie a través de un enlace covalente entre la tetracina y el TCO, mejora
significativamente la sensibilidad del ensayo ELISA.
2.- Las superficies previamente recubiertas con la proteína BSA marcada con 20 grupos
tetracina por molécula, mejoraron la sensibilidad de los ELISA obteniéndose mejores
resultados que con las superficies preparadas con tetracina, una vez aminadas por distintos
métodos.
3.- El sistema basado en la afinidad entre la quitina y el ChBD, donde las superficies fueron
preparadas con quitosano acetilado y el anticuerpo de captura se unió a ChBD, favoreció el
aumento de la sensibilidad del ELISA probablemente debido a la correcta orientación de los
anticuerpos en la superficie del ensayo.
4.- La detección inmunoenzimática de un miRNA amplificado por PCR usando un cebador de

tipo stem-loop, produjo resultados que indicaban una alta especificidad y sensibilidad del
ensayo atendiendo a su límite de detección.
5.- Es posible la detección de dos moléculas de distinta naturaleza, una proteína y un ácido
nucleico, de forma simultánea en un único ensayo inmunoenzimático realizado sobre un
soporte sólido.
138
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155
biosensors
Article
Covalent Immobilization of Antibodies through Tetrazine-TCO
Reaction to Improve Sensitivity of ELISA Technique
Tania García-Maceira 1, *, Fé I. García-Maceira 1 , José A. González-Reyes 2 , Luis A. Torres-Sánchez 1 ,
Ana Belén Aragón-Gómez 1 , María Eugenia García-Rubiño 3 and Elier Paz-Rojas 1
1 Canvax Biotech, Parque Científico y Tecnológico Rabanales 21, c/Astrónoma Cecilia Payne s/n, Edificio
Orión, 14014 Córdoba, Spain; fi.garciamaceira@gmail.com (F.I.G.-M.); titoanafe@gmail.com (L.A.T.-S.);
nelebana83@hotmail.com (A.B.A.-G.); pazrojaselier@gmail.com (E.P.-R.)
2 Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, Campus de Excelencia Internacional
Agroalimentario (ceiA3), University of Córdoba, 14014 Córdoba, Spain; bc1gorej@uco.es
3 Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Granada, 18071 Granada, Spain;
rubino@ugr.es
* Correspondence: tagama0802@gmail.com
Abstract: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is routinely used to detect biomolecules

related to several diseases facilitating diagnosis and monitoring of these, as well as the possibility
of decreasing their mortality rate. Several methods have been carried out to improve the ELISA
sensitivity through antibodies immobilization on the microtiter plates. Here, we have developed
a strategy of antibodies immobilization to improve the ELISA sensitivity increasing the antibody
density surface through the tetrazine (Tz)-trans-cyclooctene (TCO) reaction. For this, we prepared
surfaces with tetrazine groups while the captured antibody was conjugated with TCO. The tetrazine

surfaces were prepared in two different ways: (1) from aminated plates and (2) from Tz-BSA-coated
plates. The surfaces were evaluated using two sandwich ELISA models, one of them using the
Citation: García-Maceira, T.;
García-Maceira, F.I.; González-Reyes,
low-affinity antibody anti-c-myc as a capture antibody to detect the c-myc-GST-IL8h recombinant
J.A.; Torres-Sánchez, L.A.; protein, and the other one to detect the carcinoembryonic human protein (CEA). The sensitivity
Aragón-Gómez, A.B.; García-Rubiño, increased in both surfaces treated with tetrazine in comparison with the standard unmodified surface.
M.E.; Paz-Rojas, E. Covalent The c-myc-GST-IL8h detection was around 10-fold more sensible on both tetrazine surfaces, while
Immobilization of Antibodies CEA ELISA detection increased 12-fold on surfaces coated with Tz-BSA. In conclusion, we show
through Tetrazine-TCO Reaction to that it is possible to improve the ELISA sensitivity using this immobilization system, where capture
Improve Sensitivity of ELISA antibodies bond covalently to surfaces.
Technique. Biosensors 2021, 11, 524.
https://doi.org/10.3390/bios11120524
Keywords: ELISA; antibodies immobilization; tetrazine; TCO; CEA
Received: 28 November 2021

Accepted: 17 December 2021
Published: 20 December 2021
1. Introduction
Publisher’s Note: MDPI stays neutral
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is one of the most used techniques
with regard to jurisdictional claims in
for the detection of molecules, generally proteins, in different fields such as food technology,
published maps and institutional affil- clinical diagnosis, scientific research, and industry. The sensitivity of an ELISA depends on
iations. different factors such as the interaction antigen-antibody, the temperature, the pH, and the
effectiveness of the antibody binding to the test surface. Microtiter commercial plates use
hydrophobic polymers such as polystyrene. The increase in hydrophilicity can enhance
antibody binding (density) and decreases the amount of denatured protein. Therefore, the
Copyright: © 2021 by the authors.
immobilization of the antibody on the polystyrene surface plays a crucial role in improving
Licensee MDPI, Basel, Switzerland.
the detection limit [1].
This article is an open access article
It has been shown that a higher density of antibodies on the surface increases the
distributed under the terms and detection sensitivity of analytes in ELISA, and, accordingly, different strategies have been
conditions of the Creative Commons developed to adequately immobilize proteins to surfaces [2–4]. These strategies are based
Attribution (CC BY) license (https:// on the generation of amino, carboxyl, or epoxy groups on the surface by different methods
creativecommons.org/licenses/by/ and the subsequent covalent bond of the antibody to these groups through chemical
4.0/). reactions using NH2 , SH, and COOH free groups of the antibodies [5].
Biosensors 2021, 11, 524. https://doi.org/10.3390/bios11120524 https://www.mdpi.com/journal/biosensors

Biosensors 2021, 11, 524 2 of 13
With the aim of increasing the sensitivity of the ELISA, Dixit et al. [6] used a method-
ology based on the use of aminopropyltriethoxysilane (APTES) to generate NH2 groups
on the assay surface [4,5]. Subsequently, other groups followed this method with some
variations (see, for example, the work of [7]). Using this approach, a 50-fold increase in sen-
sitivity has been achieved compared to standard surfaces [8]. The capture of the antibody
to the surface is carried out using EDC (carbodiimide) and NHS (N-hydroxysuccinimide)
chemistry on the aminated 96-well plate, forming an amide-type covalent bond [5,9].
Additionally, other methods have been applied to produce functional groups on the
surface, such as plasma treatment [10], corona discharge [11], ultraviolet treatment, and
wet chemistry techniques [12]. The wet chemical modification allows chemical reactions
to take place between a compound dissolved in an organic solution and the surface of
the polymer, generating reactive functional groups on the surface [13]. This procedure
shows the advantage that the treatment is penetrating and provides controlled and stable
surfaces in terms of the number of functional groups and required typology, maintaining
transparency in the case of ELISA plates [14]. Using chlorosulfonation-sulfonamidation
reactions, aminated surfaces have been prepared as well, controlling the density of NH2
groups on the surface, which were used for the development of ELISAs [14].
Among the “click chemistry reactions”, which are frequently used in biomedicine,
there is the “Inverse Electron Demand Diels–Alder” (IEDDA) reaction between 1,2,4,5-
tetrazines (Tz) and trans-cyclooctenes (TCO), forming a dihydropyridazine bond in the
absence of a catalyst [15]. Today, this one is among the fastest known click reactions, with
second-order rate constants of up to 3.3 × 106 M−1 s−1 [16]. The Tz-TCO reaction has been
widely used in in vivo imaging studies, where the antibodies are labeled with TCO and
later with tetrazine-technetium-99m [17,18], as well as for the immobilization of antibodies
to surfaces [19].
In an attempt to increase the sensitivity of the ELISA technique, we used the click
chemistry reaction between Tz-TCO, in which the capture antibody was modified with
TCO, and the surface had exposed tetrazine groups. The addition of tetrazine to the
plate was carried out in two different ways: (a) starting from aminated plates by wet
chemistry and (b) coating the plate with the Tz-BSA protein by adsorption. To evaluate the
sensitivity on both surfaces, we used a sandwich-type ELISA to detect the recombinant
protein IL8h and the colorectal cancer biomarker CEA and compared the results obtained
in the conventional ELISA with those achieved in the treated plates. The results show a
significant increase in the sensitivity of the model ELISA for the detection of IL8h with
respect to the conventional ELISA on both surfaces, as well as on the plates prepared with
Tz-BSA in the case of the detection of CEA.
2. Materials and Methods

2.1. TCO Functionalization of Anti-c-myc and Anti-CEA
For both anti-CEA 3C1 (Hytest 4CA30) and anti-c-myc 9E10, TCO functionalization of
antibodies was performed with UV-Tracer Trans-Cyclooctene NHS ester (Click Chemistry
Tools, A1031) in phosphate buffer (0.15 M NaCl, 0.1 M NaPO4 , pH = 7.5). Different
molar relations between trans-cyclooctene and the antibody anti-c-myc were used to
provide different degrees of labeling per antibody. Thus, 5, 10, and 15 equivalents of TCO
per 1 equivalent of mAb were added. The antibody anti-CEA 3C1 was modified with
5 equivalents of TCO per 1 equivalent of antibody. Reactions were performed for 60 min
at room temperature (RT) with stirring. TCO-modified antibodies were purified on Zeba
desalting columns (40 kDa MW cut-off, 0.5 mL) (Pierce ZebaTM desalting columns, Thermo
Scientific, Waltham, MA, USA).
The degree of labeling (DOL) was calculated based on the molar concentration re-
lation between antibodies and reactive. Absorbance at 280 nm (A280 ) was used to de-
termine the antibody concentration in the samples. Since UV tracer also absorbs at
280 nm, a correction factor was applied to adjust the A280 contributed by the tracer
(A280 corrected = A280 − A350nm × 0.4475). Then we checked the absorbance of TCO- mod-
Biosensors 2021, 11, 524 3 of 13
ified antibodies at 280 nm and 350 nm, where antibodies molar extinction coefficient
at 280 nm (ε) is equal ε280nm = 204.000 M−1 cm−1 and UV tracer at 350 nm is equal
at ε350nm = 19.500 M−1 cm−1 .
The affinity of the anti-c-myc-TCO antibodies conjugated toward their targets was
assessed by ELISA and compared with the non-modified antibody. A microplate coated
with 2 µg/mL c-myc-GST-human IL8 antigen was blocked with PBS containing 1% (w/v)
BSA. Then, serially dilutions of the TCO-modified anti-c-myc antibodies were added and
incubated at 37 ◦ C for 1 h. Antibodies concentrations ranged from 0.39 to 50 ng/mL.
Anti-mouse HRP (Sigma, A2554, Madrid, Spain) was used as a revealing antibody. Then
ELISA colorimetric reaction employed TMB (3,30 ,5,50 -tetramethylbenzidine), and it was
stopped with 1 M HCl. The measure was performed at 450 nm. Similarly, the anti-CEA-
TCO antibody affinity was measured by ELISA on a microplate coated with 5 µg/mL
carcinoembryonic antigen (CEA) (Hytest, 8CEA88). TCO-modified anti-CEA 3C1 and
unmodified antibody affinity were compared at concentrations ranging from 15.62 to
500 ng/mL.
2.2. Tetrazine Functionalization of BSA

Tetrazine functionalization of BSA was realized with methyl tetrazine–PEG4-NHS-
ester (Click Chemistry Tools, 1069) using 30 equivalents of tetrazine per 1 equivalent of BSA
in phosphate buffer (50 mM NaPO4 , 150 mM NaCl, pH = 7). The reaction was developed
under stirring in the dark at RT for 2 h and stopped with 1 M Tris-HCl buffer pH = 8. The
reaction was dialyzed with 1 L PBS pH 7.4 using a dialysis tubing membrane of 12 kDa
molecular weight cut-off. Tz-BSA concentration was determined by Bradford assay (Bio-
Rad) at 495 nm and using bovine serum albumin (BSA) as standard DOL was calculated
based on molar concentration relation between BSA and the reactive, considering that MW
BSA = 66.433 g/mol and concentration of tetrazine was interpolated at the curve of reactive
performed at A520 .
2.3. Preparation of Microtiter Plates with Tetrazine

Aminated coated plates were prepared using a wet chemical technique by TECNALIA
Laboratories (Project 2012/000069, TECNALIA Research & Innovation). The densities of
NH2 groups were 1.5 and 3 nmol/cm2 . Microtiters well were treated with 5 equivalents of
methyl tetrazine–PEG4-NHS-ester per NH2 group in 100 µL of phosphate buffer (50 mM
NaPO4 , 150 mM, NaCl, pH = 7). Plates were stirred in the dark for 2 h at RT following by
3 washing steps with 0.3 mL of PBS pH = 7.4.
Standard microplates of polystyrene (MaxiSorp, Thermo 442404, Waltham, MA, USA)
were coated with 20, 50, or 100 µg/mL of Tz-BSA in buffer 0.1 M NaHCO3 pH = 9 and
incubated for 16 h at 4 ◦ C. After 5 washing steps with 0.3 mL of PBS-Tween-20 0.05%, plates
were treated with coating stabilizer and blocking buffer (Sigma-Aldrich, C9483) and stored
at 4 ◦ C.
2.4. ELISA to Evaluate Binding of TCO-Modified Antibodies to Tetrazine Surfaces

Standard microplates coated with 20 µg/mL of Tz-BSA or aminated surface treated
with tetrazine were added serially dilutions of the TCO-modified anti-c-myc antibody
or the unmodified antibody and incubated at 37 ◦ C for 1 h. Antibodies concentration
ranged from 15.6 to 2000 ng/mL. After microplate washing, anti-mouse HRP and TMB
were sequentially added. The enzyme reaction was stopped with 1 M HCl, and color
development was measured at 450 nm on a microtiter reader.
2.5. ELISA Assays for the Detection of Bi-Specific Model c-myc-GST-IL8h Protein Using Treated
Tetrazine Surfaces
The sandwich ELISA was used for the detection of human c-myc-GST-IL8h as well
as to evaluate the tetrazine surfaces and to compare the limits of detection obtained in
this surface with the results achieved from standard surfaces. We compared 1.5 nm/cm2
Biosensors 2021, 11, 524 4 of 13
and 3 nm/cm2 of NH2 group in tetrazine surface prepared from wet chemical and the
concentration of the coating with Tz-BSA, 20, 50, or 100 µg/mL on standard plates.
The ELISA was performed as described by García-Maceira et al. [20] with modifi-
cations. Briefly, standard plates coated with Tz-BSA or aminated plates Tz treated were
added 2 µg/mL anti-c-myc-TCO in 0.1 M Na2 CO3 /NaHCO3 pH = 9.6. Simultaneously
standard plates were coated with unmodified anti-c-myc antibody and blocked with PBS
pH = 7 containing 1% (w/v) BSA. The following ELISA steps were executed as described
below. All plates were added to the model protein c-myc-GST-IL8h in serial dilutions
from 0.78 to 100 ng/mL. ELISAs were then developed using an anti-human IL-8 biotin
clone MT8F19 antibody at 1 µg/mL. After 1 h of incubation at 37 ◦ C and 5 washing steps,
streptavidin-HRP (Thermo Fisher, 21130, Waltham, MA, USA) diluted at 100 ng/mL was
added. ELISA readout was as described previously.
2.6. Comparative ELISA Assays for the Detection of Carcinoembryonic Human Protein Using
Treated Tetrazine Surfaces
The standard and Tz-BSA-coated surfaces were compared using the CEA sandwich
ELISA. MaxiSorp plates were coated with 5 µg/mL unmodified anti-CEA 3C1 antibody
in 0.1 M Na2 CO3 /NaHCO3 pH = 9.6 and blocked with PBS pH = 7 containing 1% BSA.
Simultaneously, anti-CEA-TCO was added to 20 µg/mL of Tz-BSA pre-coated plates.
The next steps were the same for both ELISA. A range of concentrations of CEA pro-
tein (0–200 ng/mL) was added per duplicate in wells and incubated for 1 h at RT. After
3 washing steps, detection was achieved with 100 µL of 0.5 µg/mL of biotin anti-CEA 3C6.
After 5 washing steps, 100 µL per well of streptavidin-HRP was diluted at 100 ng/mL,
and TMB was sequentially added. The enzyme reaction was stopped with 1 M HCl, and
color development was measured at 450 nm on a microplate reader.
2.7. Assay Performance Analysis

The results of ELISAs were analyzed using the GraphPad Prism program (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA, USA), and the four-parameter logistic standard curve showed
the EC50 and R2 of each one. The detection limit was calculated using the absorbance
arithmetic media of all repetitions of the blank plus 3 standard deviations. Similarly, was
calculated the limit of quantification using 10 standard deviations as criteria. Finally, the
LOD and LOQ concentrations were obtained by plotting the absorbance of each other on
the standard curve.
3. Results
Coating ELISA antibodies were modified to include TCO functional groups through
their NH2 groups. This modification was not directional, and TCO groups would be
attached at any NH2 sites of the molecule. Modifications of anti-c-myc 9E10 with 5, 10,
and 15 equivalents of TCO per antibody molecule resulted in anti-c-myc-TCO conjugates
with 4, 8, and 10 TCOs/antibody, respectively. On the other hand, anti-CEA 3C1 antibody
modified with five equivalents of TCO resulted in anti-CEA-TCO conjugates with four
TCOs/molecule.
The affinity of anti-c-myc-TCO-conjugated antibodies was compared with anti-c-myc
unmodified through an indirect ELISA coated with c-myc-GST-IL8h protein and revealed
with anti-mouse IgG-HRP. As observed in Figure 1, this modification did not disturb the
affinity toward c-myc when the antibody contains four TCO groups per molecule as the
curve was like that one obtained with the unmodified antibody, being EC50 values also
similar. In contrast, with 8 and 10 TCO groups per antibody, the specific antigen anti-c-myc
detection activity was significantly reduced. Consequently, we selected the conjugation
process with five equivalents.
Biosensors 2021, 11, x FOR PEER REVIEW 5 of 13
Biosensors 2021, 11, 524

similar. In contrast, with 8 and 10 TCO groups per antibody, the specific antigen anti‐c‐
5 of 13
myc detection activity was significantly reduced. Consequently, we selected the conjuga‐
tion process with five equivalents.
Figure 1.
1. Comparative
Comparative ELISAELISA of
of anti‐c‐myc‐TCO‐conjugated
anti-c-myc-TCO-conjugated antibodies and anti‐c‐myc
anti-c-myc unmodified
to its antigen affinity c-myc.
c‐myc. A 4PL sigmoidal curve to each anti-c-myc
anti‐c‐myc antibody is displayed.
displayed. The
EC50 representsthe
EC50 represents theanalyte
analyteconcentration
concentration capable
capable of generating
of generating halfhalf of maximum
of the the maximum
signalsignal ob‐
obtained
tained in the
in the test in test in the range
the linear linear of
range
the of the curve.
curve. The bars
The error errorcorrespond
bars correspond to three
to three replicates
replicates of
of each
each antibody concentration.
antibody concentration.
Similarly, using an indirect ELISA, we confirmed that anti-CEA-TCO

anti‐CEA‐TCO conserved the
same activity that the unmodified antibody.
antibody.
3.1. Evaluation
3.1. Evaluation of
of Tetrazine‐Coated
Tetrazine-Coated Microtiter
Microtiter Plates
Plates
The Tz-BSA protein was assessed at
The Tz‐BSA protein was assessed at 520 520 nm to
nmquantify the number
to quantify of tetrazine
the number groups
of tetrazine
incorporated into a BSA molecule. The protein concentration was measured
groups incorporated into a BSA molecule. The protein concentration was measured − by Bradford
by
using a standard curve of unmodified BSA. Considering an MW ofanBSA 1
Bradford using a standard curve of unmodified BSA. Considering MWasof66.433
BSA asgmol
66.433,
we calculated
gmol the molar
−1, we calculated the concentration of Tz-BSA,
molar concentration and the
of Tz‐BSA, andabsorbance at 520atnm
the absorbance 520was
nm
interpolated at a linear regression curve of methyl tetrazine–PEG4-NHS-ester. Finally, we
was interpolated at a linear regression curve of methyl tetrazine–PEG4‐NHS‐ester. Fi‐
obtained a ratio of 25 tetrazines per molecule of BSA.
nally, we obtained a ratio of 25 tetrazines per molecule of BSA.
The evaluation of the binding to tetrazine-coated surfaces was performed with the
The evaluation of the binding to tetrazine‐coated surfaces was performed with the
anti-c-myc-TCO (1:4) antibody. As we show here, the anti-c-myc-TCO antibody bound
anti‐c‐myc‐TCO (1:4) antibody. As we show here, the anti‐c‐myc‐TCO antibody bound
specifically to the tetrazine surfaces, either pre-coated with Tz-BSA or aminated plates
specifically to the tetrazine surfaces, either pre‐coated with Tz‐BSA or aminated plates
treated with tetrazine, and binding of the anti-c-myc antibody lacking TCO conjugation
treated with tetrazine, and binding of the anti‐c‐myc antibody lacking TCO conjugation
was not observed (Figure 2). There were no differences between both different tetrazine
was not observed (Figure 2). There were no differences between both different tetrazine
prepared surfaces.
prepared surfaces.
Biosensors 2021,
Biosensors 11,11,
2021, x FOR PEER
x FOR REVIEW
PEER REVIEW 6 6of of1313
Biosensors 2021, 11, 524 6 of 13
Figure 2. Evaluation of tetrazine surfaces using anti-c-myc-TCO (4:1). The 4PL sigmoidal curves
Figure
Figure2. 2.
Evaluation
Evaluationofof
tetrazine surfaces
tetrazine using
surfaces usinganti‐c‐myc‐TCO
anti‐c‐myc‐TCO (4:1). The
(4:1). 4PL
The 4PLsigmoidal
sigmoidalcurves ofof
curves
of antibodies
antibodies concentration
concentration against
against absorbance
absorbance atat
450 at
nm.450 nm.
The The negative
negative control control
was was performed
performed onon
Tz‐
antibodies concentration against absorbance 450 nm. The negative control was performed Tz‐
on Tz-BSA-coated
BSA‐coated surface. surface.
The error The correspond
bars error bars correspond
toto
three to three
replicates replicates
ofof
each of each concentration
concentration ofof
antibody.
BSA‐coated surface. The error bars correspond three replicates each concentration antibody.
of antibody.
TheTheincubation
incubationtime timeofofthetheclick
clickchemistry
chemistryreaction
reactionbetween
betweentetrazine
tetrazinesurface
surfaceandand
TCO The incubation
from the time of the
anti‐c‐myc‐TCO click chemistry
conjugated antibodyreaction
was between tetrazine
measured at 60, surface
120, 180, and
240,
TCO from the anti‐c‐myc‐TCO conjugated antibody was measured at 60, 120, 180, 240,
TCO
and 300 from
min the
with anti-c-myc-TCO of conjugated antibody was measured atand
60, 5000
120, ng/mL.
180, 240,
and
and 300
300 min
min withconcentrations
with concentrations of
concentrations
antibody
of antibodyofof
antibody
100,
of 100,
100,
200,
200,
200,
500,
500,
1000,
500, 1000,
1000,
2000,
2000,
2000, and 5000
and 5000 ng/mL.
ng/mL.
This
Thisreaction
reaction was
was performed
performed ononTz‐BSA
Tz‐BSA pre‐coated
pre‐coated surface.
surface.AsAsobserved
observed ininFigure
Figure3,3,the
the
This reaction was performed on Tz-BSA pre-coated surface. As observed in Figure 3, the
absorbance
absorbance did didnot
notincrease
increase further
further after 2
after 2h incubation,
h incubation, remaining
remaining unchanged
unchanged inde‐
inde‐
absorbance did not increase further after 2 h incubation, remaining unchanged indepen-
pendently
pendently ofofthe
theantibody
antibodyconcentration.
concentration. Nevertheless,
Nevertheless,there
therewas
wasaaasignal
signalincrease
increasewhen
when
dently of the antibody concentration. Nevertheless, there was signal increase when
antibody concentration
antibody concentration
concentration waswas raised.
was raised. The
raised. The optimal results
optimal results were
results were obtained
were obtained when
obtained when using
when using more
using more
more
antibody The optimal
than
than1000
1000ng/mL
ng/mL (see Figure
(see Figure3).3).
than 1000 ng/mL (see Figure 3).
Figure
Figure3.3.Incubation
3. Incubationtime
timeoptimization
optimization ofofthethetetrazine‐TCO
tetrazine-TCO
tetrazine‐TCO reactions
reactionsononthe
thesurface
the surface
surfaceofof
microtiter
of microtiter
microtiter
plates prepared
plates prepared
plates with
prepared with tetrazine
with tetrazineusing
tetrazine usingthe anti‐c‐myc‐TCO
using the anti-c-myc-TCO (1:4) antibody.
anti‐c‐myc‐TCO (1:4) antibody. Four
antibody. Four replicates
Four replicates were
replicates were
were carried
carried
carried
out for
out foreach
foreach antibody
eachantibody concentration
antibodyconcentration
concentration andand incubation
incubation time.
time.Unmodified
Unmodified anti‐c‐myc
anti‐c‐myc antibody
antibody onon
Tz‐
Tz‐
out and incubation time. Unmodified anti-c-myc antibody on Tz-BSA
BSA
BSA pre‐coated
pre‐coated wells. Anti‐c‐myc‐TCO
wells. Anti‐c‐myc‐TCO antibodies
antibodies ononpre‐coated
pre‐coated BSA
BSAwells
wells were
wereused
usedasasnegative
negative
pre-coated wells. Anti-c-myc-TCO antibodies on pre-coated BSA wells were used as negative controls.
controls.
controls.InInthese cases,
these signals
cases, were
signals weretoo low toto beberepresented inin
the graph.
In these cases, signals were too low totoo
be low
represented represented
in the graph.the graph.
3.2.
3.2.ELISA
ELISAAssays
Assaysforfor
forthe
theDetection
the Detectionofof
Detection ofc‐myc‐GST‐IL8h
c‐myc‐GST‐IL8hProtein
c-myc-GST-IL8h ProteinUsing
Protein UsingTreated
Using TreatedTetrazine
Treated Tetrazine
Tetrazine Surfaces
Surfaces
Surfaces
The recombinant protein c-myc-GST-IL8h was cloned and expressed by Canvax
The
BiotechTherecombinant
S.L. protein
proteinc‐myc‐GST‐IL8h
García-Maceira
recombinant etc‐myc‐GST‐IL8h
al. [20] confirmedwaswascloned
that
cloned and
this
and expressed
protein canbybe
expressed byCanvax
CanvaxBio‐
detected by
Bio‐
tech
ELISAS.L.
tech S.L. García‐Maceira
with et
different capture
García‐Maceira al. [20] confirmed
et al.antibodies,
[20] confirmed that this
as anti-human protein can be detected
IL8 or anti-c-myc
that this protein can be detected by
9E10 by ELISA
antibody,
ELISA
with
withdifferent
using the same
different capture
revealed
capture antibodies, asasanti‐human
biotin anti-IL8h
antibodies, antibody,
anti‐human IL8 soor
IL8 oranti‐c‐myc
that it can be 9E10
anti‐c‐myc used
9E10asantibody,
a chimeric
antibody, using
pro-
using
the
thesame
tein andrevealed
same would bebiotin
revealed biotinanti‐IL8h
detected by theantibody,
anti‐IL8h c-myc tagso
antibody, orsothat
thatitprotein
IL8h itcan
canbebe used
[20]. asasa achimeric
Significative
used protein
differences
chimeric protein
and
in
and would
the bebedetected
detection
would of theby
detected bythe
thec‐myc
recombinant c‐myctag tagororIL8h
protein with
IL8h protein
different
protein [20]. Significative
coating
[20]. differences
antibodies
Significative inin
were also
differences
the detection
found [20], of the recombinant
indicating that a protein
low-affinity with different
antibody coating
reduces antibodies
the
the detection of the recombinant protein with different coating antibodies were also foundassay were also
sensitivity. found
Accord-
Biosensors 2021, 11, 524 7 of 13
[20], indicating that a low‐affinity antibody reduces the assay sensitivity. Accordingly, we
designed a strategy to improve an ELISA developed with an antibody that can decrease
ingly, we designed a strategy to improve an ELISA developed with an antibody that can
this effect.
decrease this effect.
Tetrazine surfaces were prepared in two different ways. Polystyrene plates were
Tetrazine surfaces were prepared in two different ways. Polystyrene plates were
treated by wet chemical to the prepared aminated surfaces, followed by a reaction with
treated by wet chemical to the prepared aminated surfaces, followed by a reaction with
NHS‐tetrazine reagent obtaining tetrazine surfaces. The aminated surfaces used contained
NHS-tetrazine reagent obtaining tetrazine surfaces. The aminated surfaces used contained
1.5 and 3 nmol/cm2 2of NH2 groups per well. The second method consisted of Tz‐BSA pre‐
1.5 and 3 nmol/cm of NH2 groups per well. The second method consisted of Tz-BSA
coated standard surface.
pre-coated standard surface.
The detection sandwich ELISA of c‐myc‐GST‐IL8h was performed to determine the
The detection sandwich ELISA of c-myc-GST-IL8h was performed to determine the
best concentration of NH2 groups on surfaces prepared by the wet chemical technique.
best concentration of NH2 groups on surfaces prepared by the wet chemical technique.
These surfaces were the starting point to prepare tetrazine surfaces. We compared 1.5 and
These surfaces were the starting point to prepare tetrazine surfaces. We compared 1.5 and
3 nmol/cm22 of
3 nmol/cm of NH
NH22groups
groups perper well
well using
using aa standard
standard plate as control
plate as control (Figure
(Figure 4).
4). LOD
LOD and
and
LOQ were calculated from 4PL fitted curves, and significant differences
LOQ were calculated from 4PL fitted curves, and significant differences between the ELISA between the
ELISA performed on tetrazine surface with respect to standard were found.
performed on tetrazine surface with respect to standard were found. Thus, the sensitivity Thus, the sen‐
sitivity
on on tetrazine
tetrazine surface prepared
surface prepared from aminated
from aminated wells withwells
1.5 with 1.5 nmol/cm
nmol/cm
2 was 5‐fold
2 was 5-fold higher
higher
than onthan on standard
standard surfaces, surfaces, while tetrazine
while tetrazine surfacessurfaces
prepared prepared
from 3 from 3 nmol/cm
nmol/cm 2 of NH2 of
2
NH2 were
were 11-fold11‐fold
moremore sensitive
sensitive than than the standard
the standard control
control (Table
(Table 1). Although
1). Although there there
werewere
no
no visual
visual differences
differences between
between both
both tetrazine
tetrazine surface
surface curves,
curves, LODLODandandLOQLOQvalues
valuesshowed
showed
that the ELISA developed on tetrazine surface prepared from
that the ELISA developed on tetrazine surface prepared from 3 nmol/cm of NH2 was 3 nmol/cm 22 of NH2 was
more sensitive
more sensitive than
than the
theone
onedeveloped
developedon onaasurface
surfaceprepared
preparedfromfrom1.51.5nmol/cm
nmol/cm22 ofof NH
NH22..
These differences
These differencescancanbebe attributed
attributedto to the
the standard
standard deviation
deviation in in tetrazine
tetrazine surface
surface prepared
prepared
from 1.5
from 1.5 nmol/cm
nmol/cm22 ofof NH
NH22since
sinceititwas
washigher
higherthan
thanthe
theone
oneprepared
preparedfromfrom 33 nmol/cm
nmol/cm2.2 .
Figure 4.4.Comparative
Figure ComparativeELISA
ELISAofofc-myc-GST-IL8h
c‐myc‐GST‐IL8h detection in standard
detection andand
in standard tetrazine-coated surfaces.
tetrazine‐coated sur‐
4PL sigmoidal
faces. curvescurves
4PL sigmoidal on twoon
tetrazine surfaces
two tetrazine prepared
surfaces from aminated
prepared platesplates
from aminated with different NH2
with different
NH2 groups
groups density
density and standard
and standard surface
surface were
were usedused as control.
as control. OnOn the
the tetrazinesurface,
tetrazine surface,the
thecapture
capture
antibody was anti‐c‐myc‐TCO, while on the standard surface, we used an anti
antibody was anti-c-myc-TCO, while on the standard surface, we used an anti c-myc unmodifiedc‐myc unmodified
antibody. The
antibody. The results
results correspond
correspond to to three
three replicates
replicatesfor
foreach
eachconcentration.
concentration. The
The negative
negative control
control
included 10 replicates.
included 10 replicates.
Table1.1.Comparison
Table ComparisonofofLOD
LOD and
and LOQ
LOQ values
values obtained
obtained for tetrazine
for tetrazine surfaces
surfaces prepared
prepared from from ami‐
aminated
nated plates with different concentrations of amine groups per well, with respect to the standard
plates with different concentrations of amine groups per well, with respect to the standard plates.
plates.
Tz Surface Prepared from Aminated Plates with
Standard SurfaceTz Surface Prepared from Aminated Plates with
Standard Surface 3 nmoles 2 2
3 nmoles NHNH 2 /cm
2/cm 2 1.5nmoles
1.5 nmoles NH
NH22/cm
/cm2
LOD(ng/mL)
LOD (ng/mL) 10.9010.90 0.810.81 1.97
1.97
LOQ
LOQ(ng/mL)
(ng/mL) 13.8313.83 1.221.22 2.74
2.74
RR2 2 0.9997
0.9997 0.9987
0.9987 0.9948
0.9948
Biosensors2021,
Biosensors 2021,11,
11,524
x FOR PEER REVIEW 88 of
of 13
13
On the other hand, we coated standard ELISA (MaxiSorp) surfaces with different
On the other hand, we coated standard ELISA (MaxiSorp) surfaces with different
concentrations of Tz‐BSA (25 tetrazine: 1BSA) protein (20, 50, and 100 μg/mL) to develop
concentrations of Tz-BSA (25 tetrazine: 1BSA) protein (20, 50, and 100 µg/mL) to develop
the ELISA for c‐myc‐GST‐IL8h detection. The capture antibody used was anti‐c‐myc‐TCO
the ELISA for c-myc-GST-IL8h detection. The capture antibody used was anti-c-myc-TCO
(1:4), and the revealing antibody was anti‐human IL8 biotin. As depicted in Figure 5, no
(1:4), and the revealing antibody was anti-human IL8 biotin. As depicted in Figure 5, no
differences in the ELISAs sensitivity were detected, as LOD and LOQ results were similar.
differences in the ELISAs sensitivity were detected, as LOD and LOQ results were similar.
Considering these results and using the statistical concept of medium square, we calcu‐
Considering these results and using the statistical concept of medium square, we calculated
lated p‐value for LOD = 0.015 ng/mL and for LOQ = 0.006 ng/mL with a 95% probability.
p-value for LOD = 0.015 ng/mL and for LOQ = 0.006 ng/mL with a 95% probability. These
These results revealed that there were no significant differences between the three con‐
results revealed that there were no significant differences between the three concentrations
centrations
of Tz-BSA toofcoat
Tz‐BSA
and, to coat and,
therefore, wetherefore,
selected awe
20selected
µg/mL aconcentration
20 μg/mL concentration of the
of Tz-BSA for Tz‐
BSA for the
next assays. next assays.
Figure 5.5. ELISA

Figure ELISAofofc-myc-GST-IL8h
c‐myc‐GST‐IL8hdetection
detectioninin standard
standard surfaces
surfaces pre‐coated
pre-coated with
with different
different con‐
concen-
centrations
trations of Tz‐BSA.
of Tz-BSA. The The
4PL4PL sigmoidal
sigmoidal curves
curves to each
to each coated
coated Tz‐BSA
Tz-BSA surface
surface are represented.
are represented.
The
The sandwich
sandwich ELISA
ELISA forfor c-myc-GST-IL8h
c‐myc‐GST‐IL8h detection
detection was
was repeated
repeated three
three times
times to com-
com‐
pare
parethe
the LOD
LOD and and LOQ
LOQ inin tetrazine
tetrazine and
and standard
standardsurfaces.
surfaces. In
In Table
Table2, 2,we
weshow
showthethe results
results
of
of each assay as as well
wellasasthe
thestandard
standarddeviation
deviationand
and coefficient
coefficient of of variation
variation inter-assay.
inter‐assay. In
In
thethe standard
standard surface,
surface, thethe medium
medium LOD LODwaswas 11.17
11.17 ± 0.62
± 0.62 ng/mL ng/mL
and theandLOQthe was
LOQ14.4was±
0.82 ±
14.4 0.82 ng/mL,
ng/mL, while inwhile in the tetrazine
the tetrazine surfacesurface
preparedprepared from pre-aminated
from pre‐aminated plates,plates, these
these values
values were 0.96 ± 0.06 ng/mL and 1.34 ± 0.14 ng/mL, respectively. On
were 0.96 ± 0.06 ng/mL and 1.34 ± 0.14 ng/mL, respectively. On another tetrazine surface another tetrazine
surface
prepared prepared by coating
by coating the standard
the standard surfacesurface with Tz-BSA,
with Tz‐BSA, LOD and LODLOQ andvalues
LOQ values were±
were 0.77
0.77 ± 0.05 ng/mL and 1.01 ± 0.14 ng/mL, respectively. Concerning
0.05 ng/mL and 1.01 ± 0.14 ng/mL, respectively. Concerning the assays sensitivity, wethe assays sensitivity,
we found
found an an improvement
improvement in both
in both tetrazine
tetrazine surfaces
surfaces with
with respect
respect to to
thethe standard.
standard. Thus,
Thus, in
in tetrazine surfaces prepared from pre-aminated plates, the assay
tetrazine surfaces prepared from pre‐aminated plates, the assay was approximately 11‐ was approximately
11-fold
fold moremore sensitive,
sensitive, whileininpre‐coated
while pre-coatedTz‐BSA
Tz-BSAsurfaces,
surfaces,itit was
was 14‐fold
14-fold compared
compared to to the
the
standard surface. The significant differences between groups shown
standard surface. The significant differences between groups shown in Figure 6 confirmin Figure 6 confirm
that
that both
both tetrazine
tetrazine surfaces
surfaces improve
improve the the detection
detection sensitivity
sensitivity of ELISA of
of ELISA of c‐myc‐GST‐IL8h.
c-myc-GST-IL8h.
Table 2. LOD and LOQ values of ELISA detection of c‐myc‐GST‐IL8h protein. The results of three
Biosensors 2021, 11, 524 different independent assays for each surface are shown. 9 of 13
Surfaces LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL)

Replicate 1 11.52 14.63
Table 2. LOD and LOQ values of ELISA detection of c-myc-GST-IL8h protein. The results of three
Replicate 2
different independent assays for each surface are shown.
10.45 13.49
Replicate 3 11.52 15.07
Standard Surface
Surfaces LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL)
Arithmetic media 11.17 14.40
Replicate 1
Standard deviation 11.520.62 14.630.82
%CV inter‐assay
Replicate 2 10.455.54 13.495.66
Replicate
Replicate 3 1 11.520.70 15.070.91
Standard Surface
Replicate
Arithmetic 2
media 11.170.79 14.401.16
Tz‐BSA‐Coated Replicate
Standard deviation3 0.62 0.80 0.820.95
Surface Arithmetic
%CV media
inter-assay 5.540.77 5.661.01
Standard
Replicatedeviation
1 0.700.05 0.910.14
%CV inter‐assay 7.01 13.56
Replicate 2 0.79 1.16
Tz-BSA-Coated Replicate 3 0.80 0.95
Surface Replicate 2 0.92 1.19
Tetrazine Surface Pre‐ Arithmetic media 0.77 1.01
pared from Standard deviation 0.05 0.14
Arithmetic media 0.96 1.34
Aminated Plates %CV inter-assay 7.01 13.56
Standard deviation 0.06 0.14
Replicate
%CV 1
inter‐assay 0.926.64 1.37
10.26
Tetrazine Surface
Significant differences were found
Replicate 3 when comparing
1.03 both tetrazine prepared
1.46 surfaces
Prepared from
(Figure 6). Since
Aminated Platesthe preparation of Tz‐BSA‐coated
Arithmetic media surface
0.96 is a simple process
1.34 compared
with tetrazine surfaces prepared from aminated plates,
Standard deviation 0.06
we selected this surface
0.14
in another
ELISA comparative assay that includes an important antigen with clinical interest.
%CV inter-assay 6.64 10.26
Figure 6. Bar graphs of sandwich ELISA for c-myc-GST-IL8h protein detection representing the
Figure 6. Bar
arithmetic graphs
media of sandwich
of LOD ELISA for
and LOQ (ng/mL) c‐myc‐GST‐IL8h
calculated proteinsurface,
for Tz-BSA-coated detection representing
tetrazine surface the
arithmetic media
prepared from of LOD and
pre-aminates LOQand
plates, (ng/mL) calculated
standard surface.for Tz‐BSA‐coated surface, tetrazine surface
prepared from pre‐aminates plates, and standard surface.
Significant differences were found when comparing both tetrazine prepared surfaces
(Figure 6). Since the preparation of Tz-BSA-coated surface is a simple process compared
Biosensors 2021, 11, 524 10 of 13
with tetrazine surfaces prepared from aminated plates, we selected this surface in another
3.3. ELISA Assays for the Detection of CEA Using Tetrazine‐Treated Surfaces
ELISA comparative assay that includes an important antigen with clinical interest.
We developed another sandwich ELISA using Tz‐BSA pre‐coated surfaces to explore
3.3. ELISA
possible Assaysimprovement
sensitivity for the DetectionofofELISA
CEA Using Tetrazine-Treated
through Surfaces reaction compared
the tetrazine‐TCO
with the Westandard surface,
developed in which
another sandwich theELISA
antibody
usingbinds
Tz-BSAto the surfacesurfaces
pre-coated by passive adsorp‐
to explore
tion.possible
When comparing the signals observed
sensitivity improvement in the Tz‐BSA
of ELISA through surface and
the tetrazine-TCO those compared
reaction obtained in
with the standard
the standard one, wesurface,
detectedin which
a higherthe signal
antibodyin binds
TZ‐BSA to the surface
with by passive
the same adsorption. of
concentrations
CEAWhen comparing
and with a clearthe signals observed
displacement in curve
of the the Tz-BSA
to thesurface and thosewith
left compared obtained in the
the standard
standard one, we detected a higher signal in TZ-BSA with the
curve (Figure 7A). This ELISA comparison was developed three times, and the LOD same concentrations of in
CEA and with a clear displacement of the curve to the left compared with the standard
the standard surface was 7.47 ± 0.41 ng/mL, while in Tz‐BSA‐coated surface, it was 0.60 ±
curve (Figure 7A). This ELISA comparison was developed three times, and the LOD in
0.06 ng/mL. There was an increased sensitivity in CEA detection ELISA of 12.4‐fold com‐
the standard surface was 7.47 ± 0.41 ng/mL, while in Tz-BSA-coated surface, it was
pared with
0.60 theng/mL.
± 0.06 traditional
Theretechnique. A Student
was an increased t‐testinshowed
sensitivity extremely
CEA detection ELISAsignificant
of 12.4-folddif‐
ferences between both surfaces (p < 0.0001; see Figure 7B), which allows
compared with the traditional technique. A Student t-test showed extremely significant us to conclude
that differences
Tz‐BSA‐coated
between both surfaces (p < 0.0001; see Figure 7B), which allows us to greatly
plates combined with modified‐TCO capture antibody concludeim‐
prove the
that ELISA sensitivity.
Tz-BSA-coated plates combined with modified-TCO capture antibody greatly improve
the ELISA sensitivity.
Figure 7. ELISA for CEA protein detection developed on Tz-BSA-coated and standard surfaces.
Figure
(A)7.4PL
ELISA for CEA
sigmoidal protein
curves. detection
(B) Bar graphsdeveloped onmean
representing Tz‐BSA‐coated and(instandard
values of LOD ng/mL) surfaces.
calculated(A)
4PL sigmoidal
for Tz-BSA-coated and standard surfaces showing significant differences between both conditionsfor
curves. (B) Bar graphs representing mean values of LOD (in ng/mL) calculated
Tz‐BSA‐coated
(p < 0.0001).
and standard surfaces showing significant differences between both conditions (p <
0.0001).
4. Discussion
4. Discussion
There are significant differences in protein detection sensitivity by ELISA depending
on the capture
There antibody.differences
are significant This fact wasinreported
proteinby García-Maceira
detection et al. [20],
sensitivity who developed
by ELISA depending
an ELISA with different capture antibodies to detect a chimeric recombinant
on the capture antibody. This fact was reported by García‐Maceira et al. [20], who protein c-myc-
devel‐
GST-IL8h, showing differences in the dynamic range of concentrations and the sensitivity
oped an ELISA with different capture antibodies to detect a chimeric recombinant protein
for the analyte detection [20].
c‐myc‐GST‐IL8h, showing differences in the dynamic range of concentrations and the sen‐
Considering the model of Langmuir [21], the detection limit of an ELISA depends on
sitivity
the for the analyte
binding affinity detection [20].antibody with the target protein. If antibody-antigen
of the capture
Considering
binding the values
constant model increase
of Langmuir [21], the
two orders of detection
magnitude, limit
theof an ELISA
detection depends
limit values on
the binding
decrease affinity of the capture
proportionally antibody with
[22]. In agreement with the
mosttarget
of theprotein.
reports,Ifbinding
antibody‐antigen
constant
binding constant
values may varyvalues
in a increase two from
wide range: orders −5 magnitude,
10of to 10−12 M−1the detection
[23]. limitare
Since there values
manyde‐
antibodies
crease with low[22].
proportionally affinity, several strategies
In agreement with mosthaveofbeen
the recently
reports, developed to minimize
binding constant values
maytheir
varyeffect on ELISA
in a wide range:sensitivity.
from 10−5 to 10−12M−1 [23]. Since there are many antibodies with
Different
low affinity, crosslinkers
several strategieshave
havebeen
beenemployed
recently to immobilize
developed proteins covalently
to minimize onon
their effect
aminated polystyrene
ELISA sensitivity. surfaces, such as glutaraldehyde, with each extreme able to bind
to an NH2 group, or carbodiimide, which links an amino group with a carboxyl [8,24].
Different crosslinkers have been employed to immobilize proteins covalently on ami‐
nated polystyrene surfaces, such as glutaraldehyde, with each extreme able to bind to an
NH2 group, or carbodiimide, which links an amino group with a carboxyl [8,24]. Surfaces
activated with APTES, with NH2 free groups on the surface, have been used for the cova‐
lent immobilization of antibodies [5,7,24]. Dixit et al. [5] used a combination of the cross‐
Biosensors 2021, 11, 524 11 of 13
Surfaces activated with APTES, with NH2 free groups on the surface, have been used for
the covalent immobilization of antibodies [5,7,24]. Dixit et al. [5] used a combination of the
cross-linker carbodiimide/NHS to improve an ELISA of fetuin-A detection, improving the
sensitivity 16-fold compared to commercial kits. On the other hand, Wang et al. [7] used
glutaraldehyde as a crosslinking to immobilize HIV-p24 antigen on surfaces activated with
APTES, improving by 30-fold the LOD compared with the standard surface in an ELISA of
HIV-p24 detection [7].
In this work, we did not use crosslinkers such as glutaraldehyde or carbodiimide
because when used in situ, they could form bonds between the antibody molecules causing
its precipitation and loss of activity. The activity evaluation of the modified antibody before
being used offers several advantages: (a) to decrease the inter-assay variability and thus
increasing its reproducibility; (b) to store the modified antibody until used, being then
available each time the ELISA is repeated, and (c) it could even be marketed once it had
been modified. In this work, we prepared capture antibodies pre-modified with TCO and
plates prepared with tetrazine on the surface, and both were pre-evaluated and stored
before their use so that when they are mixed, a covalent bond is formed between tetrazine
and TCO groups with high specificity and selectivity.
Several bioorthogonal reactions, including the azide-alkyne [3+2] cycloaddition, the
photoinducible 1,3-dipolar cycloaddition, and the inverse electron demand Diels–Alder
(IEDDA) reaction, have been developed and used for several applications, including
protein modifications [25,26]. Among these, the IEDDA reaction stands out from other
bioorthogonal reactions due to its unmatchable kinetics (rate constant of up to 106 M−1 s−1 )
and its high specificity and biocompatibility [25]. Specifically, this reaction has been used to
conjugate antibodies, which were later conjugated with tetrazine or TCO and then applied
to cell imaging, nanoparticle functionalization, and targeted antibody therapy [27,28].
Attending to its characteristics and applications, we selected this reaction as the basis of
system development to increase ELISA sensitivity.
The capture antibodies used in this work were modified with TCO through their free
NH2 groups using NHS reagent. We observed that when the modification compound
increased with respect to the antibodies, the TCO groups incorporated into the antibody
molecules increased too. However, decreased antibodies activity was also detected, demon-
strating the importance of the evaluation of the modified antibodies.
On the other hand, the microtiter ELISA plates were prepared with tetrazine in two
different ways: from aminated plates after wet chemical treatment of chlorosulfonation-
sulfonamidation and from MaxiSorp plates coated with the BSA protein modified with
20 tetrazines per protein molecule. Aminated surface prepared using wet chemical tech-
nique has some advantages compared with other methods described of polystyrene prepa-
ration surface with reactive groups [29]. Thus, in this method, polystyrene surface is
activated with chlorosulfonyl groups, and then a bifunctional aliphatic amine compound
is added, allowing an amine group linkage to the surface, while the second functional
group remains available for further reactions. This method also allows to acquire a control-
lable number of amine groups on polystyrene surfaces and additionally provides a higher
amount of amine groups than that obtained using commercial plasma, functionalized
polystyrene substrates, or ultraviolet treatment [13].
Attending the results obtained for LOD and LOQ calculated for c-myc-GST-IL8h de-
tection in the different surfaces (see Table 2), we found an improvement of the sensitivity in
both tetrazine surfaces when an anti-c-myc-TCO was used as a capture antibody compared
with the standard surface. Thus, ELISA sensitivity increased in one order of magnitude.
In this sense, when using Tz-BSA surfaces, the LOD was 13.7-fold improved compared
to the standard plates, while in tetrazine surfaces followed by wet chemical treatment,
this improvement was 11-fold. On the other hand, the surfaces prepared with Tz-BSA
showed increased sensitivity for the detection of CEA, an effect due to a 12-fold LOD
improvement when compared with ELISAs developed by traditional techniques. These
results demonstrate that the system using Tz-TCO reaction on the surface of ELISA plates
Biosensors 2021, 11, 524 12 of 13
for antibody anchoring significantly improves the sensitivity of the assay and could become
a routine method in research laboratories due to its reduced complexity.
The Tz-BSA-coated surface preparation is less laborious than the tetrazine prepared
plates after wet chemical amination. In addition, the Tz-BSA protein can be stored, and the
surfaces can even be previously coated with the protein by using a stabilizer reagent so
that, like the TCO-labeled antibody, the surface would be readily available when needed,
and eventually, it could also be marketed.
5. Conclusions
In this work, we describe a method based on Tz-TCO reaction to immobilize antibodies
to microtiter surfaces that additionally may improve the ELISA assay sensitivity, using for
this purpose the comparison of sandwiches ELISA with their corresponding traditional
methods. The Tz-BSA-coated surface also provides a simple procedure to obtain surfaces
with a high quantity of tetrazine that increases ELISA sensitivity.
Author Contributions: Conceptualization, E.P.-R.; methodology, E.P.-R. and T.G.-M.; formal analysis,
T.G.-M., F.I.G.-M. and L.A.T.-S.; investigation, T.G.-M., F.I.G.-M., J.A.G.-R., A.B.A.-G., M.E.G.-R. and
L.A.T.-S., data curation, T.G.-M.; writing original draft preparation, T.G.-M.; manuscript writing and
editing, F.I.G.-M., M.E.G.-R. and J.A.G.-R.; project administration, E.P.-R. All authors have read and
agreed to the published version of the manuscript.
Funding: This research was funded by Compra Pública Precomercial, Reference 2012/000069, Min-
isterio de Economía y Competitividad, España. ONCOVER project: Volatile compound detection
system for early cancer diagnosis.
Acknowledgments: Aminated plates from wet chemicals were supplied by Nerea Briz Iceta, Tecnalia,
Mikeletegi Pasealekua, 2 Parque Tecnológico, E-20009 San Sebastián, Spain.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.
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García-Maceira et al. BMC Biotechnology (2020) 20:41
https://doi.org/10.1186/s12896-020-00640-z
METHODOLOGY ARTICLE Open Access
Highly enhanced ELISA sensitivity using

acetylated chitosan surfaces
Tania García-Maceira1*, Fé I. García-Maceira1, José A. González-Reyes2 and Elier Paz-Rojas1
Abstract
Background: The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is the most widely used and reliable clinical routine
method for the detection of important protein markers in healthcare. Improving ELISAs is crucial for detecting
biomolecules relates to health disorders and facilitating diagnosis at the early diseases stages. Several methods have
been developed to improve the ELISA sensitivity through immobilization of antibodies on the microtiter plates. We
have developed a highly sensitive ELISA strategy based on the preparation of acetylated chitosan surfaces in order
to improve the antibodies orientation.
Results: Chitin surfaces were obtained by mixing small quantities of chitosan and acetic anhydride in each well of
a microtiter plate. Anti-c-myc 9E10 low affinity antibody fused to ChBD was cloned and expressed in CHO cells
obtaining the anti-c-myc-ChBD antibody. We found that anti c-myc-ChBD binds specifically to the chitin surfaces in
comparison with anti-c-myc 9E10, which did not. Chitin surface was used to develop a sandwich ELISA to detect
the chimeric human protein c-myc-GST-IL8 cloned and expressed in Escherichia coli. The ELISA assays developed on
chitin surfaces were 6-fold more sensitive than those performed on standard surface with significant differences (p<
0,0001).
Conclusions: As shown here, acetylated chitosan surfaces improve the antibody orientation on the substrate and
constitute a suitable method to replace the standard surfaces given the stability over time and the low cost of its
preparation.
Keywords: Chitosan surface, Chitin binding domain, Antibody orientation, ELISA
Background monitoring of disorders. However, the effectiveness of

The ELISA is a powerful and widely used technique the detection is frequently limited by the sensitivity and
which has been used for decades to detect different quantification capacity of the assay. Due to its high
molecules, especially protein analytes, in diagnostic and specificity and sensitivity, ELISA technique is probably
research context. This highly versatile technique allows the most used technique for these purposes, although
the detection of biomolecules with high specificity and for many biomarkers this technique has shortcomings
sensitivity, associating the readout with a subsequent based on criteria like kinetic properties and/or antibody
enzymatic reaction producing colorimetric, fluorescence availability [3, 4]. To cope with this issue, several
or luminescence signals [1, 2]. methods have been developed to increase the sensitivity
Disease biomarkers detection on clinical samples have of the ELISA technique. In this sense, several surfaces
great importance for diagnosis as well as for the have been designed in order to improve antibodies
orientation and density [4, 5], while other methods have
* Correspondence: t.garcia@canvaxbiotech.com been established to improve the detection process by
1
Canvax Biotech; Parque Científico y Tecnológico Rabanales 21, c/Astrónoma amplifying the ELISA signals [6].
Cecilia Payne s/n, Edificio Canvax, 14014 Córdoba, Spain
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García-Maceira et al. BMC Biotechnology (2020) 20:41 Page 2 of 12
In a standard sandwich ELISA assay, the analyte detec- groups are exclusively located in the hinge region play-
tion is based on the use of two specific antibodies: a ing an essential role on the protein tertiary structure.
primary or capture antibody, which is adsorbed to a Other methods have used the affinity of Protein A and
polystyrene surface with high protein binding capacity, G for the Fc (fragment crystallizable region) region of
and a secondary antibody which generally is biotinylated. the antibodies, and several surfaces have been developed
The catalyzing enzyme can be horseradish peroxidase that facilitate the adequate orientation of the antibodies
(HRP) which normally is linked to streptavidin. The high and thereby improving the sensitivity of the ELISA [19].
affinity streptavidin-biotin binding facilitates the signal Due to its multiple biomedical applications, chitin
amplification [7]. (poly N-acetyl glucosamine), one of the most abundant
To improve analyte detection, several methods have polysaccharides in nature, is broadly used in the
been developed. Among them, the use of silver nanopar- pharmaceutical industry. The chitin binding domain
ticles, streptavidin-coated microparticles, or the signal (ChBD) of Bacillus circulans WL-12 chitinase, specific-
amplification with the tyramide system, can be men- ally binds to the insoluble or regenerated form of chitin
tioned [8–10]. but not to other polysaccharides such as cellulose, chito-
The adsorption of capture antibodies to standard san or starch. This fact results in higher stability and
polystyrene surfaces takes place due to hydrophobic and affinity of this union in a wide pH range [20].
electrostatic interactions [11]. In this process of To improve the orientation and density of antibodies,
immobilization, the antibodies can acquire a random and thus the sensitivity of the ELISA, we have used
orientation hindering the interaction with its antigen. In chitin-coated polystyrene surfaces. Chitin was regener-
addition, in the contact surface some steric impediment ated by acetylation from different chitosan sources “in
can occur and even the antibodies can be denatured situ”. These surfaces prepared with acetylated chitosan
with the consequent loosening of ability to detect the were used in the determination of human IL-8 as a
antigen. Furthermore, during the development of an model of quantification by ELISA. The results show an
ELISA the antibody can be displaced by other proteins, improved detection limit with the consequent improve-
for example, during surface washing steps [12, 13]. All ment of the ELISA sensitivity, possibly due to an
these effects can result in lower sensitivity of a large increase immobilization and better orientation of anti-
number of ELISAs with the subsequent reduced repro- bodies fused to the chitin binding domain.
ducibility. In order to decrease these adverse effects on
antibodies immobilization, and thereby improving the Results
sensitivity of the ELISA technique, some procedures Firstly, we obtained a plasmid for the expression of c-
have been developed. These methods include, for myc-GST-IL8h fusion protein. After checking by se-
example, surface modification to make them more quencing, it was used to transform E. coli BL21 (DE3)
hydrophilic or more suitable for the covalent binding of strain. The E. coli BL21 (DE3) cultures yielded 10 mg/L
the antibodies, and the use of high-affinity intermediate of His6-c-myc-GST-IL8h recombinant protein. The elec-
molecules [14]. trophoresis gel showed a band of approximately 38 kDa,
The production of monolayer surfaces is one of the which correlated well with the expected molecular mass.
methods that best permit the adsorption of antibodies. Also, a high degree of purity of this protein was notice-
In addition, the monolayers facilitate the appearance of able (Fig. 1a).
functional groups which subsequently allow the covalent The recombinant protein His6-c-myc-GST-IL8h was
binding of the antibodies to the surface. The monolayers detected in the sandwich ELISA using anti-human IL-8,
are formed using hydrocarbon molecules containing as well as with an anti-c-myc-ChBD as capture antibody
functional groups at one or both ends and, additionally, (see Fig. 1b). Both ELISAs were developed in parallel on
can be auto assembled [15]. The monolayers formed standard unmodified surfaces. Figure 1b shows the
from mercaptoundecanoic acid [16] are representative differences observed in the dynamic range of concentra-
examples of these structures. tions. When using standard surfaces coated with the
On the other hand, the covalent coupling of the anti- human anti-IL-8 antibody, ELISA LOD and LOQ were
body to the surface would enhance its immobilization 0.03 and 0.037 ng/mL, respectively. However, when coat-
thus improving its concentration and orientation. For ing with the anti-c-myc antibody 9E10, these values were
this purpose, −NH2, −COOH and -SH groups of the 10.8 and 13.69 ng/mL, respectively. Thus, when changing
antibodies have been used. However, −NH2 and -COOH only the capture antibody, the difference between both
groups are ubiquitous throughout the antibody structure ELISAs was between 360 and 370 times more sensitive.
and their use should hinder the correct antibody orienta- Using a standard protocol, the anti-c-myc-ChBD anti-
tion [17]. Antibody immobilization through -SH2 groups body was expressed with the ExpiCHO system. This
could result in loss of functionality [18] since these antibody had an expression of 40 μg/mL, and the affinity
Fig. 1 Analysis of His6-c-myc-GST-IL8h recombinant protein obtained in E. coli. In panel a we show 10% acrylamide gel electrophoresis and
Coomassie blue staining. Lanes: 1. Molecular weight pattern (Gene On); 2. His6-c-myc-GST-human IL8 (1 μg). The arrow indicates the analyzed
protein with the expected MW. In panel b we show the 4PL sigmoidal curve of the ELISA developed using anti-human IL8 or anti-c-myc 9E10 as
capture antibody and both revealed using anti- human IL8 biotin. The error bars correspond to three replicates of each concentration of His6-c-
myc GST IL8h protein. EC50 represents the analyte concentration capable of generating half of the maximum signal obtained in the test in the
linear range of the curve. LOD is the minimum amount of analyte detected and LOQ represents the minimum amount of analyte that can be
quantified by the test
purification with Protein G column using the AKTA 4.70). This result is probably due to the fact that 80%
system, allowed the isolation of the pure antibody deacetylated chitosan surfaces are less viscous than those
(Fig. 2a). It specifically recognized its antigen with the prepared using solutions of chitosan with 60% of deacety-
same sensitivity than the unmodified anti-c-myc 9E10 lation. Therefore, the 80% deacetylated chitosan was
antibody, as confirmed by a direct ELISA (Fig. 2b). Flow selected for the preparation of chitin plates.
cytometry on chitin particles showed that the chitin As we show here, the binding to surfaces coated with
binding domain of chitinase A1 from Bacillus circulans insoluble chitins specific and is recognized only by an
WL-12 fused to the anti-c-myc antibody, was active and antibody fused to the ChBD. Accordingly, the anti-c-
capable of binding to chitin in a specific manner. Its myc-ChBD antibody bound specifically to the chitin
union to 50% of the particles was detected (Fig. 2c). surface, and no binding of the same antibody lacking the
Chitin plates with two types of commercial chitosan ChBD domain was detected (Fig. 3b). This ELISA was
were prepared, one with 60% deacetylation and the other repeated 5 times on different days, and it was deter-
with 80%. Both plates were treated by an “in situ” acetyl- mined that in the 95% confidence interval, the EC50
ation process. It should be expected that lower percentage ranged from 47.54 to 67.22 ng/mL. As this is the capture
of deacetylation would produce better results. However, antibody, its concentration should be saturating in the
the signal was higher in those plates prepared from chito- sandwich ELISA, and then the EC95 is calculated to use
san with 80% deacetylation (Fig. 3a). Besides, when the a higher concentration. The EC95 range was 155.41 to
absorbance and the coefficient of variation of 10 negative 219.75 ng/mL.
control wells were analyzed, these parameters were much To optimize the binding reaction conditions of ChBD
higher in acetylated chitosan prepared from a chitosan protein with the chitin surface, we performed several
with 60% deacetylation (Mean blank = 0.208; %CV Blank = tests to improve the experimental conditions (reaction
18.66) than in the surfaces prepared from chitosan with buffer and incubation time of the ChBD-chitin binding).
80% deacetylation (Mean blank = 0.170; %CV Blank = The test buffer selected was NaHCO3 since the EC50
Fig. 2 Analysis of the anti c-myc-ChBD antibody expressed in mammalian cells. Panel a shows 10% acrylamide gel electrophoresis and
Coomassie blue staining. Lanes: 1. anti c-myc- ChBD with β Mercaptoethanol (2 μg); 2. Molecular weight pattern. Panel b shows the ELISA
detection of anti-c-myc-ChBD antibody activity compared to the antibody purified from hybridoma 9E10. In panel c cytometry of chitin-coated
magnetic particles using the specific anti-c-myc-ChBD antibody is depicted. The negative cytometry control for which we used the anti-c-myc
antibody is represented in black; particles tagged with the recombinant anti-c-myc-ChBD antibody are represented in red
was 14.7 ng/mL, lower than that obtained with PBS, analyte concentrations that cannot be measured using
which was 55.5 ng/mL (Fig. 3c). After one-hour incuba- standard plates (Fig. 4a).
tion, no signal variation was detected. Thus, one hour In the standard plates, the minimum detected amount
was selected as the incubation time for binding of anti- of human His6-c-myc-GST-IL8h protein was 10.4 ng/
c-myc-ChBD antibody to the chitin surface (Fig. 3d). mL, while in the chitin surfaces it was 1.74 ng/ml, with
ELISAs performed on chitosan plates using anti-c- 6-fold increase of the detection limit (Table 1). Also, the
myc-ChBD as capture antibody and ELISAs developed lowest quantified amounts were 12.5 and 2.4 ng/mL re-
on standard plates using an anti-c-myc antibody were spectively, a 5.2 fold improvement of the detection limit.
compared (see Fig. 4). The results show that the The statistical analysis yielded significant differences in
ELISA performed on chitin surface has a shift of the both the LOD and the LOQ between ELISAs (p < 0.0001
sigmoid curve to the left, indicating that lower con- in both cases; see also Fig. 4b).
centrations of the analyte, were detected and quanti- LOD: Limit of detection; LOQ: Limit of quantification;
fied. In fact, on the modified surface we detected CV: Coefficient of variation.
Fig. 3 ELISA conditions establishment in acetylated chitosan surfaces. Panel a: Comparison of acetylated chitosan surfaces: anti-c-myc-ChBD
antibody binding ELISA on surfaces prepared with chitosan at different degrees of deacetylation. Panel b: anti-c-myc-ChBD binding curve to
chitin modified surfaces as a negative control anti c-myc 9E10. Panel c: Binding curves of anti-c-myc-ChBD to chitin surface in different buffers.
Panel d: anti-c-myc-ChBD binding curve to chitin at 37 °C and using different incubation times. All charts show error bars of 3 replicas for
each concentration
During ELISA assay development a Spike/Recovery as- is commonly used to elaborate standard curves (see Fig. 5
sessment is commonly performed to determine whether a-b). The recovery acceptance ranges were 80–120%
the value obtained from a sample is accurate and reliable (R&D Systems). As observed, excepting the 73% recov-
or if there is some factor in the natural sample matrix ery, the other percentages fit with the expected values
interfering with the measurement. In this assay, a known (Table 2). These results indicate that chitin-prepared
amount of recombinant protein, in this case His6-c- plates can be used for the detection of proteins in sam-
myc-GST-IL8h, is “spiked” into a sample and measured ples from patients as well as from cell cultures.
in the ELISA. The resulting concentration should not
differ significantly from the expected value of the spiked Discusion
concentration. If there are differences, some factor in ELISA developed with different capture antibody, in
the sample may be inhibiting the detection of the pro- this work, anti human-IL8 or anti c-myc 9E10 anti-
tein in this system. body to detect recombinant protein His6-c-myc-GST-
His6-c-myc-GST-IL8h protein was added to human IL8h, show differences in the dynamic range of
serum and plasma samples, to RPMI medium plus 10% concentrations. These results were due probably to
FBS and to PBS: BSA 0.5% at 10 and 100 ng/mL final the sensitivity of the assay, since coating with the
concentration. The protein was then measured on each anti-c-myc antibody is less sensitive than coating with
sample and the concentrations were calculated using a the anti-human IL8 antibody. This reveals that coat-
standard curve. The protein concentrations in PBS: BSA ing with low affinity antibodies, ELISA displays a
0.5% was taken as 100% of recovery because this buffer lower sensitivity for analyte detection.
Fig. 4 Comparative ELISA of human c-myc-GST-IL8 in standard and chitin-treated plates. Panel a: 4PL sigmoidal curves on two different surfaces
developed ELISAs. Concentration range used was 0.39–200 ng/mL. The results correspond to three replicates for each concentration. The negative
control included 10 replicas. Panel b: bar diagram of LOD and the resulting LOQ of five ELISAs on each surface. The value of p was determined
using the GraphPad Prism software
When an antibody is used for detection or quantifica- polysaccharides such as chitosan, cellulose or starch
tion of its antigen, the assay sensitivity greatly depends [20]. Once chitosan is acetylated, ChBD specifically
on the dissociation constant (Kd) of the antibody with binds to it.
its antigen: if the antigen-antibody interaction is weak, Here we show that the binding of the antibody fused
Kd value is high, while if the affinity is high, Kd value is to ChBD to acetylated chitin surfaces is specific. Using
low. In agreement with most of the reports, the neutral or alkaline pH reaction buffer, we obtained
antibody-antigen binding constant may vary in a wide better results at higher pH. This result agrees with those
range from 10− 5 to 10− 12 M− 1 [21]. The anti-cytokines reported by Hashimoto et al. [20] since they demon-
binding constant is about picomolar range while anti c- strated that ChBD from chitinase A1 shows binding
myc antibody monoclonal (clone 9E10) has low affinity activity over a broad range of pHs with the highest
in at least two order of magnitude to its antigen, Kd = binding at pH 9.
5.3 ± 0.3 × 10− 7 M [22, 23]. If the binding constant Bernard et al. [26] used surfaces coated with acetylated
increases by two orders of magnitude, the detection limit chitosan to detect a ChBD-tagged heterodimeric human
can reach 1 pg/mL [24]. glycoprotein hormone analog directly from mammalian
Chitin is an insoluble linear β-1,4-linked homopolymer cell culture media. They reported that the binding to the
of N-acetyl-glucosamine. Its solubilization with alkali surface was stable in sodium dodecyl sulfate and only
results in chitosan, which forms films whose amino partially reversed at low pH or in 8 M urea at 37 °C.
groups, can be readily acetylated with acetic anhydride These facts indicate that ChBD- chitin binding is useful
treatment [25]. This acetylation is necessary since ChBD and suitable for ELISA development in those prepared
only recognizes insoluble chitin but no other surfaces because of the high ChBD and chitin binding
stability. However, these authors did not develop an
Table 1 Comparison of the obtained results for standard and ELISA to bind an antibody to acetylated chitosan
acetylated chitosan surfaces surface.
High binding surfaces Chitosan acetylated surfaces In our assay we used acetylated surfaces not only to
LOD (ng/ml) 10.38 ± 1.58 1.74 ± 0.23 detect ChBD-tagged protein but also to improve the de-
LOQ (ng/ml) 12.50 ± 1.41 2.40 ± 0.34 tection of any molecule by immunoassay. Antibodies
%CV Intra-assay 0.27–6.05 0.17–4.90
fused to ChBD enabled us to perform any type of ELIS
A: sandwich, competitive or indirect. In contrast to this,
%CV Inter-assay 0.77–8.35 1.37–6.59
the method described by Bernard et al. [26] is restricted
Fig. 5 Detection of His6-c-myc-GST-IL8h protein in plates prepared with chitin and using different concentrations of a biological sample. Panel a:
Bar graph of the resulting ELISA concentration when the protein to be analyzed was added at final concentrations of 10 ng/mL b: Bar graph of
the resulting ELISA concentration when the protein to be analyzed was added at final concentrations of 100 ng/mL
to analytes tagged with the ChBD. In other hand, they random process. The biotin can attach to the amino
used radioactive readout by using radiolabeled monoclo- group of any lysine and also to an amino terminal.
nal antibodies. We reported in our work the coupling of Consequently, the antibody may not be properly
acetylated chitosan surface to a colorimetric enzymatic oriented on the surface. But by far the most important
assay. limitation of this procedure is that generally biotinylated
In biomolecular assays and sensor development, the antibodies are used as secondary antibodies, that is, anti-
detection limit is of capital importance and, conse- bodies that are used to detect the analyte bound to a
quently, numerous investigations to bring the detection first coating antibody. Cho et al. [31] conjugated anti-
limit of bioanalytical techniques to the lowest possible bodies to biotin at the hinge disulfides and found only
levels have been carried out. In ELISA assays the orien- two-fold improvement in the antigen detection relative
tation of immobilized antibodies to improve immunoas- to the system using random biotinylation of antibodies.
says has been extensively investigated [14]. Antibodies immobilization using coating microplates
To promote site directed antibody binding, affinity with G protein is a commercial technique and there have
immobilization techniques are good strategies [27]. been attempts to improve its outcomes [19]. Neverthe-
Among others, these techniques use the affinity of anti- less, it has the disadvantage that the use of IgG as
bodies for Protein A (a surface protein of Streptococcus) secondary antibodies must be avoided as any free G pro-
and Protein G (a surface protein of Staphylococcus aur- tein will react with such secondary IgG. This fact is very
eus) [18, 28], specific peptides and aptamers that bind to important as most commercial antibodies used today in
antibodies Fc region [11, 29] and the biotin-streptavidin ELISA are IgG isotype.
interaction [30]. As we demonstrated, a recombinant antibody fused to
The interaction between streptavidin-coated surfaces ChBD by the Fc region would be an excellent method to
and biotinylated antibodies do not support the correct achieve adequate orientation of antibodies in ELISA mi-
orientation of the antibodies because biotinylation is a croplates similar to trapping antibodies with Protein A
Table 2 ELISA analyte recovery in different media compared to the control
Sample Spiked level (ng/ml) ELISA results (ng/ml) %Recovery
Human Plasma 10 9.54 92.54
100 112.11 109.73
Human Serum 10 7.59 73.69
100 108.00 105.70
RPMI medium (10% FBS Supplemented) 10 11.66 113.15
100 95.53 93.50
or G. This system based on acetylated chitosan surface- growth reached optical density of 0.8 at 600 nm
ChBD antibody has the additional advantage that all (OD600 nm), 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyrano-
antibody isotypes and any biotinylated antibody can be side (IPTG) was added to the culture to induce ex-
used for detection. pression of the protein. The culture was incubated for
The employment of chitosan acetylated surfaces and a further 4 h at 37 °C. Then cells were collected by
antibodies fused to CHBD greatly increase the ELISA centrifugation (5000 x g for 5 min), washed with PBS
sensitivity through the enhancement of the detection supplemented with 1 mM EDTA and resuspended in
limit. Probably, the improvement is achieved by the the same buffer. The cells were disrupted by sonic-
adequate orientation of antibodies in the microplates ation with a Bandelin Sonoplus disruptor set at 70%
well used in our system. The literature cited in this of power. The soluble fraction was clarified by centri-
manuscript shows that the binding to polystyrene sur- fugation (4 °C, 14000 x g, 30 min) and was filtered
faces tends to distort some trapping antibodies through 0.22 μm filter. Then it was loaded on a 1 mL
enough to destroy their value as a capture antibodies HisTrap HP column (GE Healthcare 17–5247-01)
[12, 13]. The method described in this paper avoids connected to an AKTA Prime plus (GE Healthcare).
that tendency because the binding to surface is After washing with 20 mM sodium phosphate pH 7.4,
through affinity and not by hydrophobic and electro- proteins were eluted by applying the same buffer plus
static interactions. 500 mM imidazole. Protein concentration was deter-
mined by the Bradford assay (Bio-Rad) using bovine
Conclusions serum albumin (BSA) as standard. Sodium dodecyl
In summary, the data showed in this work support sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis with
that acetylated chitosan surfaces improve biomarkers 12% polyacrylamide was carried out.
detection even using low affinity antibodies. ELISA
developed on chitin surface was 6-fold more sensitive Comparative ELISA assays for the detection of bi-specific
than those performed on standard surfaces. This model c-myc-GST-human IL-8 protein using two coating
method has the advantage that can be developed for antibodies with different affinity
any biomarker and any antibody isotype can be used Maxisorp plates (Thermo 442,404) were coated with
as a detection reagent. The method should be used to the antibodies anti-human IL-8 clone MT8H6 or anti-
quantify a biological sample that has a concentration c-myc purified from 9E10 hybridoma diluted to 2 μg/
below the detection limit of traditional ELISA. Given mL each other in Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6 and incu-
the increase in sensibility, stability in time and the bated overnight at 4 °C. After blocking with PBS pH 7
low cost of its preparation, acetylated chitosan containing 1% (w/v) BSA, the model protein GST-c-
surfaces may be an excellent alternative to standard myc-human IL-8 was added in serially dilutions from
surfaces. 4 to 1000 pg/mL in the anti-human IL-8 plates and
from 0.4 to 200 ng/mL on anti-cmyc coated plates.
Methods The next steps were as those described for ELISA as
Construction of the pET43a-His6-c-myc-GST- human IL-8 follow. Both ELISAs were developed using an anti-
expression plasmid human IL-8 biotin clone MT8F19 antibody at 1 μg/
The synthetic fragment His6-c-myc-GST-human-IL-8 mL. After 5 washing steps 100 μl per well of
was cloned into the pET43a vector (Novagen) with the streptavidin-HRP diluted at 100 ng/mL and TMB (3,
restriction enzymes NdeI and SalI. The chimeric protein 3′,5,5′- tetramethylbenzidine) were sequentially added
was constituted by a six histidine tag, one additional tag to them. Enzyme reaction was stopped with 1 M HCl
derived from a terminal fragment of the proto oncogene and color development was measured at 450 nm on a
c-myc (EQKLISEEDL), the glutation-S-transferase microplate reader (FLUOstar OPTIMA, BMG
protein (GST) and the human cytokine interleukin-8 Labtech).
(Gb: NM_00584.4). The sequence of the recombinant
plasmid was confirmed by restriction digestion and Chimeric antibody anti c-myc-ChBD
DNA sequencing. Cloning of anti-cmyc 9E10 antibody from hybridoma cells
and fusion with ChBD
Induction, expression and purification of protein His6-c- RNA was isolated from 106 cells 9E10 hybridoma using
myc-GST- human IL-8 the PRImeZOL™ Reagent (Canvax AN1100) following
E. coli BL21 (DE3) cells carrying the recombinant the manufacture’s protocol, reverse-transcribed (RT)
plasmid pET43a-His6-c-myc-GST-human IL-8 were into cDNA and VH and VL genes was amplified by PCR
grown in 0.5 L Luria Bertani (LB) medium containing with the high-fidelity DNA polymerase (Canvax P0032).
100 μg/mL of ampicillin at 37 °C. When the bacterial Retro transcription of the fragment VK-CK was
performed with the primer pCK-2rev at 4 °C for 1 h. After 3 washing steps with the same
(5’TATGCGGCCGCCTTTGTCTCTAACACT- buffer, 1 μg/mL of anti-mouse FITC was added and
CATTCCTG 3′). The primers pVK-1fw (5’GGGGA- incubated at 4 °C for 30 min. Beads were analyzed on
TATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT a flow cytometer (Guava EasyCyte mini, Guava
3′) and pCK-2rev were used for the amplification. On Technologies).
the other hand, VH fragment cDNA was obtained using
the antisense primer pVH9E10-6rev (5’TTTTAGATC- ELISA to detect anti c-myc-ChBD antibody activity
TAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC 3′) and the compared with the antibody 9E10 from hybridoma
elongation was developed with pVH9E10-4fw A microplate coated with 2 μg/mL c-myc-GST-human
(5’TTTAAGCTTCGCCACCATGAACTTCGGGCTCAG IL-8 antigen was blocked with PBS containing 1% (w/v)
3′) and pVH9E10-6rev. PCR products were cloned into BSA. Then serially dilution of the anti-c-myc-ChBD
pSPARK® vector (Canvax C0001). The pSPARK® vector antibody from CHO-S or anti c-myc 9E10 antibody
used for this purpose encoded the LacZ α-peptide when from hybridoma were added and incubated at 37 °C for
no insert was present. This allowed a blue/white selection 1 h. Both antibodies concentrations were ranging from
on IPTG and X-gal containing LB-agar plates. The 100 to 0.078 ng/mL. After microplates washing, anti-
funtional obtained sequences were then subcloned into mouse HRP (Sigma A2554) and TMB were sequentially
mammalian expression vector pCDNA3.4 driven by cyto- added to them. Enzyme reaction was stopped with 1 M
megalovirus promoter. The VH fragment cloned was HCl and color development was measured at 450 nm
fused to the murine FC IgG. on a microtiter reader.
ChBD (chitin binding domain) of chitinase A1 from
Bacillus circulans WL-12 was synthetized with the flank re- Preparation of microtiter plates with acetylated chitosan
striction enzymes 5′NheI/ 3′NotI. The fragment was ligated The procedure described by Bernard et al., 2004 with
simultaneously with the PCR fragment performed with the modifications was used. Deacetylated chitosan (30 mg)
primers pVH9E10-4fw and pIgG1m-25rev (5’GATAGC- were dissolved in 5 mL of 0.1 M Sodium acetate pH 3.
TAGCTTTACCAGGAGAGTGGGAGAG 3′) on the pcD Two deacetylated chitosans with different grades of
NA3.4 vector coding the VH fragment digested by the deacetylation were used: chitosan from white mush-
restriction enzymes HindIII/ NheI. Both fragments were room (60% deacetylation, Sigma 740,063) and chitosan
ligated at once into the expression vector opened with the from crab shells (80% deacetylation, Sigma 48,165).
restriction enzymes HindIII/ NotI. Each solution was diluted 20-fold in sodium acetate
pH 5, and the polystyrene plates filled with 50 μL per
Expression and purification of anti c-myc- ChBD antibody in well. Afterward, 8 μL per well of acetic anhydride
mammalian cells (Sigma 320,102) were added. The plate was placed in
Both VH-IgG1 and VL-CK chain of the anti c-myc- a fume hood and allowed to dry overnight. Eventually,
ChBD expression vectors were co-transfected in CHO-S the plate was washed using PBS 10X pH 7.4 and
(Chinese hamster ovary) cells using the ExpiCHO Ex- blocked with 0.3 mL PBS (10x) pH 7.4: BSA (1 μg/
pression system kit (Thermo A29133). The antibody was mL).
expressed at 32 °C and 5% CO2 for 10 days attending to
the manufacturer’s instructions. Cells were isolated by Comparison of microplates coated with two different
centrifugation and the supernatant was measured by deacetylated chitosans by binding of the chimeric anti-c-
mouse IgG sandwich ELISA and purified by affinity myc-ChBD antibody
chromatography with protein G column (HiTrap Protein Two different chitosan acetylated microplates prepared
G, GE Healthcare 29–0485-81). Pure antibody concen- using white mushroom and crab shells chitosan. Anti-
tration was measured by absorbance at 280 nm and cmyc-ChBD antibody in serial dilutions ranging from
purity grade was analyzed by SDS-PAGE. 0.039 to 50 ng/mL were added. Microplates were
incubated at 37 °C for 2 h. After washing, anti-mouse
Flow cytometry to detect chitin binding domain activity HRP (Sigma A2554) and TMB were sequentially added
using chitin magnetic beads to them. Enzyme reaction was stopped with 1 M HCl
For the activity detection of the chitin binding and color development was measured at 450 nm on a
domain fused to the heavy chain of anti c-myc anti- microtiter reader.
body, chitin magnetic beads were used (BioLabs
E8036S), following the manufacture’s guidelines. The Optimization of protein c-myc-GST-human IL-8 detection
antibodies were diluted in binding buffer at 1 μg/mL in acetylated chitosan microplates
(500 mM NaCl, 20 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 0.05% Anti c-myc-ChBD antibody concentration, incubation
Triton-X100, pH 8) and incubated with 50 μl of beads time (1, 2, 4, 8 and 16 h) and the binding buffer for the
binding reaction chitin- chitin binding domain were 100 ng/mL and 10 ng/mL in human serum, human
established. Concentrations ranging 0.312 to 1 μg/mL of plasma, PBS: BSA 0.5% and cell culture medium (RPMI
anti c-myc-ChBD antibody and PBS pH 7.4 or NaHCO3 1640 medium). The sample concentrations were deter-
pH 9 buffers were used. ELISA assays were carried out mined in chitosan acetylated microplates plotting in
on chitosan acetylated surfaces. Anti c-myc antibody control curve performed in PBS-BSA 0.5%.
from 9E10 hybridoma was used as negative control of The recovery percentages were calculated using the
the chitin specific binding. ELISA was revealed with an concentrations measured in PBS: BSA as 100% of recov-
anti-mouse HRP (Sigma A2554). ery or expected concentration. We used the equation:
% recovery = (Sample concentration observed- medium
Comparative ELISA between standard polystyrene and concentration unspiked)/ Concentration obtained in
chitosan acetylated surfaces PBS: BSA 0.5%.
ELISA assays were performed simultaneously in stand-
ard polystyrene (Maxisorp, Thermo 442,404) and in chi-
tosan acetylated microplates (Fig. 6). Standard Assay performance analysis
microplates were coated with the anti-c-myc antibody All datasets obtained from the developed ELISA pro-
while chitosan acetylated plates were coated with the cedures were subjected to four-parameter logistic
anti-c-myc-ChBD antibody. Afterwards, a concentration function- based standard curve analysis in the Graph-
range of the chimeric protein His6-c-myc-GST- human Pad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA,
IL-8 from 100 to 0.39 ng/mL, was prepared. 100 μL of USA): EC50, R2, to determine limit of detection
samples per well were added and incubated at 37 °C for (LOD) and limit of quantitation (LOQ). The EC50
1 h. After washing steps, the biotinylated antibody anti indicates the concentration at which half of the test
IL-8 (clone MT8F19) and streptavidin- conjugated signal is obtained or the half maximal effective
horseradish peroxidase were used. TMB was added for concentration, and R-squared, is a statistical measure
color development and plates were measured at 450 nm of how close the data are to the fitted curve. Both
on a microtiter reader. Both ELISAs were performed parameters were determined from the report data
simultaneously under the same conditions, on 5 different generated by the software.
days, using three replicates of each concentration and 10 Absorbance corresponding to the detection limit was
replicates of the target. the result of the average absorbance of the blank from
all the repeats plus 3 standard deviations of the blank
Influence of serum, plasma and cell culture medium using while for quantification limit was the same but 10 stand-
acetylated chitosan microplates ard deviations. Then, by plotting the absorbance on the
The c-myc-GST-human IL-8 spiked samples were pre- standard curve, the values of the LOD and LOQ concen-
pared by mixing two different concentrations of protein, tration are obtained.
Fig. 6 Schematic illustration of a comparative ELISA developed in standard or chitosan acetylated microplates
Abbreviations immunoassay for botulinum neurotoxin detection using high-affinity

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay; ChBD: Chitin binding recombinant antibodies. Anal Chim Acta.
domain; Fc: fragment crystallizable; LOD: Limit of detection; LOQ: Limit 2006;570(2):137–43.
of quantification; Kd: Dissociation constant; CV: Coefficient of variation; 9. Yu R, Ma W, Liu X, Jin H, Han H, Wang H, Tian H, Long Y. Metal-linked
GST: Glutation-S-transferase; IL8: Interleukin-8; BSA: Bovine serum albumin immunosorbent assay [MeLISA]: the enzyme free alternative to ELISA for
biomarker detection in serum. Theranostics.
Acknowledgements 2016;6(10):1732–9.
Not applicable. 10. Zhang Y, Yang J, Nie J, Yang J, Gao D, Zhang L, Li J. Enhanced ELISA
using a handheld pH meter and enzyme-coated microparticles for the
Authors’ contributions portable, sensitive detection of proteins. Chem Commun.
All authors participated in the design of the study and the interpretation of 2016;52:3474.
the results; TGM executed the experiments with the help of FIGM; TGM, 11. Jung Y, Jeong JY, Chung BH. Recent advances in immobilization methods
FIGM and JAGR wrote the first draft of the manuscript, generated the figures of antibodies on solid supports. Analyst. 2008;133(6):697–701.
and contributed to editing the manuscript; the study was conceived and 12. Butler JE. Solid support in enzyme-linked immunosorbent assay and other
directed by EPR and TGM. All authors read and approved the manuscript on solid-phase immunoassays. Methods. 2000;22(1):4–23.
its current form. 13. Butler JE, Ni L, Brown WR, Joshi KS, Chang J, Rosenberg B, Voss EW.
The immunochemistry of sandwich ELISAs—VI. Greater than 90% of
Funding monoclonal and 75% of polyclonal anti-fluorescyl capture antibodies
This work was partially supported by the project number 360229 (Reference: [CAbs] are denatured by passive adsorption. Mol Immunol. 1993;30:
76359) from “Junta de Andalucía”. The funders had no role in study design, 1165.
data collection, and interpretation, preparation of the manuscript or 14. Welch NG, Scoble JA, Muir BW, Pigram PJ. Orientation and characterization
decision-making in relation to submission for publication. of immobilized antibodies for improved immunoassays. Biointerphases.
2017;12:02D301.
Availability of data and materials 15. Hasan A, Pandey LM. Polymers, surface-modified polymers, and self
The datasets used and analyzed during the current study are available from assembled monolayers as surface-modifying agents for biomaterials. Polym-
the corresponding author on reasonable request. Plast Technol Eng. 2015;54(13):1358–78.
16. Lebec V, Boujday S, Poleunis C, Pradier CM, Delcorte A. Time-of-flight
Ethics approval and consent to participate secondary ion mass spectrometry investigation of the orientation of
Not applicable. adsorbed antibodies on SAMs correlated to biorecognition tests. J Phys
Chem C. 2014;118(4):2085–92.
Consent for publication 17. Goddard JM, Hotchkiss JH. Polymer surface modification for the attachment
Not applicable. of bioactive compounds. Prog Polym Sci. 2007;32(7):698–725.
18. Karyakin AA, Presnova GV, Rubtsova MY, Egorov AM. Oriented
Competing interests immobilization of antibodies onto the gold surfaces via their native Thiol
The authors declare that they have no competing interests. groups. Anal Chem. 2000;72(16):3805–11.
19. Chen YJ, Chen M, Hsieh YC, Su YC, Wang C, Chen C, Kao AP, Wang KH,
Author details Cheng JJ, Chuang KH. Development of a highly sensitive enzyme-linked
1
Canvax Biotech; Parque Científico y Tecnológico Rabanales 21, c/Astrónoma immunosorbent assay (ELISA) through use of poly-protein G-expressing
Cecilia Payne s/n, Edificio Canvax, 14014 Córdoba, Spain. 2Departamento de cell-based microplates. Sci Rep. 2018;8:17868.
Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidad de Córdoba, Campus 20. Hashimoto M, Ikegami T, Seino S, Ohuchi N, Fukada H, Sugiyama J,
de Excelencia Internacional Agroalimentario, ceiA3, 14014 Córdoba, Spain. Shirakawa M, Watanabe T. Expression and characterization of the chitin-
binding domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12. J Bacteriol.
Received: 25 April 2020 Accepted: 10 August 2020 2000;182(11):305–3054.
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Publisher’s Note
Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in
published maps and institutional affiliations.

Universidad de Córdoba: Tesis Doctoral

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

Programa de Doctorado en Biomedicina

Sistemas de detección ultrasensible de moléculas

Ultrasensitivity detection system of different nature

Memoria presentada por

Tania García Maceira

Dr. José Antonio González Reyes Dra: Fé Isabel García Maceira

AUTOR: Tania García Maceira

© Edita: UCOPress. 2022

Que Dª Tania García Maceira, Licenciada en Microbiología, ha realizado bajo su dirección el

Y para que conste, firmo la presente en Córdoba, a 20 de febrero de 2022.

DOCTORANDO/A: TANIA GARCÍA MACEIRA

INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS

Los inmunoensayos para la detección de biomarcadores continúan siendo hoy en día

La Memoria de tesis está bien estructurada, presentándose en distintos capítulos los

El trabajo realizado ha exigido de la ejecución de un amplio abanico de técnicas que

Durante el desarrollo de la presente tesis doctoral, la doctoranda Tania García Maceira

Córdoba, 8 de febrero de 2022-02-06

Firma de los directores

Mi más profundo agradecimiento a mi directora de tesis, la Dra Fé Isabel García Maceira, y al

Muchas gracias a todos.

En esta memoria se empleó el anglicismo anti mouse, usado ampliamente en Inmunología.

II. AUMENTO DE LA SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA ELISA MEDIANTE QUÍMICA CLIC 48

mamíferos. Cuantificación y detección mediante ELISA

III. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS 89

IV. AUMENTO DE LASENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA ELISA MEDIANTE UNA TECNOLOGÍA 113

4.2. MATERIALES Y MÉTODOS 116

En este trabajo hemos desarrollado dos estrategias de inmovilización de anticuerpos a un

En la segunda estrategia fueron preparadas superficies de poliestireno con quitosano acetilado

Asimismo, se diseñó un método de detección de dos moléculas de distinta naturaleza en un

1.1. Sistemas de detección de moléculas para el diagnóstico temprano del cáncer

Los biomarcadores tienen muchas aplicaciones potenciales en oncología, incluida la evaluación

Tabla 1. Potencial uso de los biomarcadores de cáncer

Los biomarcadores son fundamentales en el desarrollo de medicamentos personalizados y han

Los inmunoensayos son métodos bioanalíticos altamente selectivos que detectan y

Gracias a los avances de la bioingeniería, la microfluídica y los biosensores han surgido

amino-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona) entre los quimioluminiscentes y la fluoresceína, la

Debido a la extensa utilización de los ELISA, muchas investigaciones se han centrado en la

Figura 1. Esquemas de los diferentes tipos de ELISA en base a su diseño.

En el ELISA indirecto, al igual que en el directo, el analito se fija a la superficie de la placa y

Actualmente los biomarcadores conocidos para la detección de enfermedades inflamatorias y

Tabla 2. Biomarcadores analizados mediante inmunoensayos automatizados para la detección del

Los ELISAs de competencia implican la cuantificación de una sustancia que es capaz de

A diferencia de los ELISA, la tecnología basada en perlas AlphaLISA es un ensayo homogéneo.

Figura 2. Detección de un analito mediante la tecnología AlphaLisa de PerkinElmer. La partícula aceptora

1.2.3. Ensayos multiplex

Figura 4. Representación de la tecnología Luminex® xMAP. Las partículas de poliestireno o

A pesar de la capacidades de multiplexación teórica de las plataformas, los paneles disponibles

Tabla 3. Ejemplos de ensayos multiplex disponibles comercialmente para una variedad de

Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son el componente crítico de un

1.3.1. Estructura de los anticuerpos

Estructuralmente, los anticuerpos contienen cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas

En las inmunoglobulinas aparece, además de las cuatro cadenas polipeptídicas básicas, un

1.4. Estrategias de inmovilización de un anticuerpo a una superficie

El método más simple de inmovilización de un anticuerpo a una superficie sólida como el

La orientación correcta del anticuerpo en una superficie, lo que asegura su completa

Figura 6. Dimensiones de un anticuerpo y posibles orientaciones en una superficie tras una

La eficiencia de unión al antígeno de un anticuerpo que ha sido inmovilizado mediante

Las estrategias de inmovilización de un anticuerpo a una superficie pueden condicionar la

Con el objetivo de disminuir los efectos adversos de la inmovilización pasiva de los

1.4.1. Modificación de las superficies

En el desarrollo de los inmunoensayos intervienen dos elementos fundamentales. En primer

Tradicionalmente, los inmunoensayos son realizados en placas de poliestireno debido a que