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Prácticas de Laboratorio [ Miguel Galán Rubio 1º Enología]
ÍNDICE
PRÁCTICA 1: TITULACIÓN POTENCIOMETRICA DE AMINOÁCIDOS...............................................3

Introducción.............................................................................................................................3
Materiales y reactivos..............................................................................................................4
Método....................................................................................................................................4
Resultados y discusión.............................................................................................................5
Medidas de pH del aminoácido Glicina................................................................................5
Gráfica de la valoración de la glicina....................................................................................6
Medidas de pH del aminoácido ácido glutamínico...............................................................7
Gráfica de valoración del ácido glutamínico.........................................................................8
Conclusiones............................................................................................................................9
Cuestiones................................................................................................................................9
PRÁCTICA 2: PRECIPITACIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR EL
MÉTODO DE LOWRY..................................................................................................................15
Introducción...........................................................................................................................15
Materiales y reactivos............................................................................................................15
Método..................................................................................................................................16
Resultados y discusión...........................................................................................................17
Tabla para la preparación de las diluciones de la recta patrón..........................................17
Resultados de absorbancia obtenidos de los patrones y muestras....................................17
Discusión............................................................................................................................18
Recta de calibrado..............................................................................................................18
Cálculos..................................................................................................................................19
PRACTICA 3: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN POR LA AMILASA SALIVAR......................20
Introducción...........................................................................................................................20
Método..................................................................................................................................21
Resultados..............................................................................................................................22
Medición de pH con papel indicador universal..................................................................22
Prueba de Fehling...............................................................................................................23
Prueba del lugol.................................................................................................................23
Conclusiones..........................................................................................................................23
Página | 1
Cuestiones..............................................................................................................................24
PRÁCTICA 5: EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL ÁCIDO
DESOXIRRIBONUCLEICO.............................................................................................................26
Introducción...........................................................................................................................26
Método..................................................................................................................................27
Gráfica recta patrón e interpolación de resultados................................................................28
Resultados..............................................................................................................................28
Cuestiones..............................................................................................................................29
PRÁCTICA 6: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).................................................30
Introducción...........................................................................................................................30
Método..................................................................................................................................31
Resultados..............................................................................................................................32
Conclusiones..........................................................................................................................33
Página | 2
PRÁCTICA 1: TITULACIÓN POTENCIOMETRICA DE

AMINOÁCIDOS
Martes, 11 de Febrero de 2014
Introducción
Los aminoácidos son sustancias que poseen un grupo amino básico y un grupo acido
en su estructura, ambos unidos a un carbono específico llamado “carbono-α”. Por
esto, se dice que todos los aminoácidos poseen características ácido-base.
Cada aminoácido se diferencia de los otros en su grupo radical o “R”. Esta cadena,
unida también al carbono-α, puede ser muy variada y otorga una gran diversidad a los
aminoácidos, pero generalmente no interviene químicamente en ningún proceso
químico.
Las características ácido-base de los aminoácidos les conceden una capacidad de

controlar la varianza de pH. Esto se llama tamponamiento o simplemente tampón.
Dependiendo de las características de pH del medio en el que se encuentre, el

aminoácido se encuentra cargado positivamente o negativamente. El punto en el cual
las cargas internas del aminoácido son nulas, se llama punto isoeléctrico. En este
punto, el aminoácido no se encuentra ni en forma catiónica ni en forma aniónica, si no
que se encuentra en forma de ión neutro o “ión zwitterion”. En esta zona isoeléctrica,
se pierde la capacidad tamponadora como se observará posteriormente.
Los objetivos de esta práctica son la observación del cambio de pH y el

comportamiento del aminoácido ante este. Para ello se deberá realizar una tabla para
que se vea claramente las zonas de tamponamiento y el punto isoeléctrico de ambos
aminoácidos.
Página | 3
Materiales y reactivos
Materiales:
 pHmetro
 Vaso de precipitados
 Agitador magnético
 Probeta
 Bureta
Reactivos:
 Disolución de aminoácido 0.1 M de Glicina y ácido glutámico

 KOH 0.l M
 HCl 0.1M
Método
1) Se preparó todo el equipo que se usó posteriormente en la práctica: pH-metro,

bureta…
2) Se añadieron 20 mL del primer aminoácido a valorar (en nuestro caso, primero

la Glicina), en un vaso de precipitados con ayuda de una probeta
3) Se enrasó la bureta con la disolución de hidróxido potásico 0,1M
4) Se colocó el vaso de precipitados con aminoácido en la plataforma del pH-

metro, se introdujo el imán y se activó una agitación suave.
5) Se colocó la bureta en el interior de vaso teniendo cuidado de que la bureta no

tocase nunca la disolución ni el imán agitador
6) Se valoró el aminoácido, apuntando los valores de pH que se observaban a

cada uno o dos mililitros de hidróxido potásico añadido
7) Se tomó datos hasta que el pH del aminoácido sea de 12
8) Se realizó una tabla con todos los valores obtenidos

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9) Se repitió el mismo procedimiento para la valoración del segundo aminoácido,

que en nuestro caso fue el ácido glutamínico, pero se debía acidificar
inicialmente el pH con HCl hasta un 1-2 aproximadamente.
Resultados y discusión
Para la resolución de esta práctica, se mostrarán los datos obtenidos del pH en

aumento de la disolución de ambos aminoácidos y una representación de la gráfica
formada.
Medidas de pH del aminoácido Glicina
1. pH= 1,32 (inicial)

2. pH= 1,38 (1 mL gastado)
6. pH= 1,65 (2 ml gastados)
14. pH= 2,64 (2 mL gastados)
18. pH= 3,63 (1 ml gastado)
20. pH= 6,36 (1 ml gastado) Punto isoeléctrico
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30. pH= 10,21 (2 mL gastado)
31. pH= 10,39 (2 mL gastado)
32. pH= 10,60 (2 mL gastado)
33. pH= 10,72 (1 mL gastado)
34. pH= 11,06 (2 mL gastado)
35. pH= 11,43 (2 mL gastado)
36. pH= 11,67 (2 mL gastado)
37. pH= 11,75 (2 mL gastado)
38. pH= 11,88 (2 mL gastado)
39. pH= 11,93 (1 mL gastado)
40. pH= 11,97 (1 mL gastado)
Gráfica de la valoración de la glicina
60
50
40
mL gastados
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12
pH
Medidas de pH del aminoácido ácido glutamínico
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1. pH= 1,71 (acidificado inicialmente)

33. pH= 5,64 (1 mL gastado) Punto isoeléctrico
41. pH= 10,02 (1 mL gastado)
Página | 7
42. pH= 10,17 (1 mL gastado)

43. pH= 10,31 (1 mL gastado)
44. pH= 10,50 (1 mL gastado)
45. pH= 10,72 (1 mL gastado)
46. pH= 10,98 (1 mL gastado)
47. pH= 11,24 (1 mL gastado)
48. pH= 11,45 (1 mL gastado)
49. pH= 11,58 (1 mL gastado)
50. pH= 11,70 (1 mL gastado)
51. pH= 11,76 (1 mL gastado)
52. pH= 11,81 (1 mL gastado)
53. pH= 11,89 (1 mL gastado)
54. pH= 12,07 (1 mL gastado)
Gráfica de valoración del ácido glutamínico
50
40
30
mL gastados
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12
pH
Conclusiones
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Con esta práctica, hemos observado el comportamiento de los dos aminoácidos

cuando aumenta el pH de su disolución. Al realizar la tabla con los datos hemos
observado las zonas tampón y la zona en la que el pH aumenta considerablemente
(punto isoeléctrico).
Cuestiones
Suponiendo que tienes 2 milimoles del aminoácido glicina en disolución a pH 1,23
a) Calcula los milimoles que están en forma de Gly+ y los que estarán en forma
de Glyzw (pKa de la Gly = 2.3) utilizando la fórmula de Henderson-Hasselbach.
pH= pKa + log [ Gly ]

zwitterion
1=2.3 + Log X/Y -1.3= Log X/2-X
[ Gly ]+
x = 0.0954 [ Gly ] y = 1.9045 [ Gly ]

zwitterion +
X/2 - x = 0.0501
[ Gly+ ] + [ Gly zwitterion ] =2

[ Gly zwitterion ] = X X+Y=2
[ Gly+ ] = Y Y=2- X
b) Comienzas a añadir hidróxido potásico 0.1 M. Cuando el pH sea de 2, calcula

los milimoles que tendrás en forma de Gly+ y los que tendrás en forma de
Glyzw
Página | 9

zwitterion
2=2.3 + Log X/Y -0.3= - Log X/2X
[ Gly+ ]
X = 0.668 [ Gly ] Y = 1.332 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 0.501
[ Gly zwitterion ] = x x + y = 2
[ Gly+ ] = y y = 2- x
[ Gly+ ] + [ Gly zwitterion ] =2
c) Repite los cálculos anteriores subiendo el pH de unidad en unidad hasta que

llegues a pH 4.

zwitterion
[ Gly+ ]
[ Gly+ ] + [ Gly zwitterion ] = 2

[ Gly zwitterion ] = X X + Y = 2
[ Gly+ ] = Y Y=2-X
Para pH 3 3=2.3 + Log X/2- X 0,7 = Log X/2-X
X = 1,67 [ Gly ] Y = 0,33 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = -0,155
Para pH 4 4=2.3 + Log X/2- X 1,7 = Log X/2-X
X = 1,96 [ Gly ] Y = 0,04 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 0,23
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d) Representa gráficamente esos puntos, en donde las abscisa serán milimoles

de forma zwitterion y ordenadas el pH. Dibuja el eje de abscisas con una
escala de 0 a 5 (mmoles) y la de ordenadas de 0 a 13 (pH).
e) Ahora calcula los milimoles que estarán en forma de Gly - y los que estarán en
forma de Glyzw a un pH de 12 (pKb de la Gly = 9.6).
pH = pKb + Log [ Gly− ]

[ Gly zwitterion ]
12 = 9.6 + Log X/Y 2.4 = Log X/2-X 251.188 = X/2-X
[ Gly− ] y = 0.0079 [ Gly

zwitterion ]
x = 1.992
[ Gly− ] = X X+Y=2
[ Gly zwitterion ] = Y Y=2-X
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f) Repite los cálculos anteriores bajando el pH de unidad en unidad hasta un pH

de 8.
Ph = pKb + log [ Gly− ]

[ Gly zwitterion ]
[ Gly− ] = X X+Y=2
[ Gly zwitterion ]=Y Y=2–X
Para pH 11 11= 9,6 + Log X/2- X 1,4 = Log X/2-X
X = 0,077 [ Gly ] Y = 1,431 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 25,119
Para pH 10 10 = 9,6 + Log X/2- X 0,4 = Log X/2-X
X = 0,077 [ Gly ] Y = 1,431 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 2,511
Para pH 9 9 = 9,6 + Log X/2- X -0,6 = Log X/2-X
X = 1,599 [ Gly ] Y = 0,401 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 0,251
Para pH 8 8 = 9,6 + Log X/2- X -1,6 = Log X/2-X
X = 1,951 [ Gly ] Y = 0,0049 [ Gly ]

zwitterion +
X/2-X = 0,025
Página | 12
g) Representa esos puntos en la gráfica anterior, en el cual el eje de abscisas

será 2 + milimoles de la forma Gly-. Une todos los puntos de tu gráfica
mediante líneas.
h) ¿Cuál es el valor del pH al cual se ha valorado la mitad de la Gly + inicial, es

decir, se ha consumido 1 mmol de hidróxido potásico?
pH= pKa + log[ Gly ]

zwitterion
[ Gly+ ]
[ Gly zwitterion ] = 1
[ Gly+ ] = 1
pH = pKa = 2.3
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i) ¿Cuál es el valor del pH al cual se ha valorado toda la Gly + y la mitad de la

forma Glyzw, es decir, que se hayan consumido 3 mmoles de hidróxido
potásico?
Ph = pKb + log [ Gly− ]

[ Gly zwitterion ]
[ Gly− ] =1
[ Gly zwitterion ] =1
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PRÁCTICA 2: PRECIPITACIÓN Y DETERMINACIÓN

CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE
LOWRY
Martes, 18 de Febrero de 2014
Introducción
En esta práctica, el objetivo será realizar la precipitación y cuantificación de proteínas

de una muestra, la cual es muy importante en numerosas industrias de alimentación.
Nuestra muestra es una clara de huevo.
Para su cuantificación, usaremos el espectrofotómetro a 650 nm de longitud de onda,

previamente ajustado con una curva patrón de concentraciones conocidas sobre la
que se interpolará.
Si el medio posee una alta fuerza iónica, las proteínas precipitaran, pudiéndose extraer
mediante una previa centrifugación y extracción del sobrenadante. Para aumentar el
poder iónico, se usa sulfato amónico. Esto hará que las proteínas de la clara del huevo
precipiten según su solubilidad a diferentes concentraciones de sulfato amónico.
Para la lectura, se usa un reactivo específico para nuestra metodología. Usaremos el

método Lowry de alta sensibilidad usando para ello el reactivo Folin-Ciocalteau, el cual
formará un complejo coloreado según la concentración proteica, y siendo posible la
lectura en el espectrofotómetro.
Materiales:
 Tubos largos
 Agitador Vortex
 Centrifugadora
 Pipetas y pipeteadores
 Espectrofotómetro
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Reactivos:
 Solución A: NaOH, Na2CO3, tartrato Na-K y agua

 Solución B: CuSO4 pentahidratado y agua
 Solución alcalina de uso: mezcla de A y B
 Reactivo de Folin-Ciocalteau
 Proteína estándar
 Sulfato amónico
 NaCl 0,9%
 Muestra: clara de huevo
Método
1) Se partió de una suspensión de clara de huevo con 0,5g de clara de huevo en 5

mL de agua
2) En una cubeta con hielos, se añadió 1,5 g de sulfato amónico
3) Se agitó durante 3 minutos sin hacer espuma
4) Se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos aproximadamente.
5) Se desechó el sobrenadante
6) Se resuspendió el precipitado en 6 mL de NaCl 0,9%
7) Se prepararon dos soluciones diluidas a ½ y a ¼
8) Se realizó la recta patrón en 6 tubos numerados (del 0 al 5), usando para ello
las siguientes cantidades con un volumen total de 0,5 mL: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y
0.5 mg de proteína
9) Se añadió 0,5 mL de las muestras problema preparadas anteriormente a tubos

de ensayo numerados (6 y 7)
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10) Se añadió a cada tubo 0,5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteau diluido, el cual

seguidamente se agitó en un agitador vortex y se dejo reposar en oscuridad
durante 30 minutos
11) Tras el reposo, se midió la absorbancia a 650 nm en el espectrofotómetro,

realizando primeramente la curva patrón
12) Se colocó el blanco como referencia y se interpoló para obtener la

concentración de los tubos 6 y 7 (muestras problema)
13) Con esto realizaremos los cálculos para obtener los mg de proteína en 100 g de
clara de huevo.
Resultados y discusión
Tabla para la preparación de las diluciones de la recta patrón
Tubo Mg proteína Tabla volumen mL proteína mL agua

total total (mL) estándar
0 0 0,5 0 0,5
1 0,1 0,5 0,1 0,4
2 0,2 0,5 0,2 0,3
3 0,3 0,5 0,3 0,2
4 0,4 0,5 0,4 0,1
5 0,5 0,5 0,5 0
Resultados de absorbancia obtenidos de los patrones y muestras
Tubo Resultado (A) a 650 nm

Blanco 0
1 0,158
2 0,285
3 0,787
4 0,830
5 0,907
6 (muestra) 0,389
7 (muestra) 0,114
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Discusión: La recta patrón está desviada, observándose por el coeficiente de

correlación (R2) indicado en la gráfica por lo que los resultados pueden estar errados
levemente.
Según los resultados de las muestras, se puede observar que efectivamente, la

muestra 6, la cual habíamos diluido solo hasta la mitad, se encuentra más concentrada
que la muestra 7 que la realizamos al 1/4.
Con estos datos podemos calcular mediante operaciones los mg de proteína en

nuestra muestra y por tanto, calcular los que aparecerían en 100 gramos.
Recta de calibrado
Usando los datos aportados anteriormente se realiza una recta de calibrado, en la que
posteriormente se extrapolarán los datos de las muestras para obtener los resultados
1
f(x) = 2.01514285714286 x − 0.00928571428571395
0.9 R² = 0.922998560992497
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Usando la ecuación de la recta, calculamos los miligramos de proteína en nuestras

muestras sustituyendo en la Y (absorbancia), los datos obtenidos en el
espectrofotómetro:
Y= 2,0151X – 0,0093
Muestra 6 0,389=2,0151X - 0,0093 X= 0,1977 mg proteína/34,3g muestra
Muestra 7 0,114= 2,0151X – 0,0093 X= 0,0612 mg proteína/34,3g muestra
Página | 18
Cálculos
Tubo 6 (1/2): 0,389 0,1977 mg proteína/34,3g muestra
Tubo 7 (1/4): 0,114 0,0612 mg proteína/34,3g muestra
Multiplicamos por el factor de dilución:
Tubo 6 (1/2): 0,1977 * 2 = 0,3954 mg proteína/34,3g muestra
Tubo 7 (1/4): 0,0612 * 4 = 0,2448 mg proteína/34,3g muestra
Media: (0,3954+0,0612)/2= 0,3221 mg proteína/34,3g muestra
Para calcular en 100 g de clara de huevo, usamos una proporción, dando 0,9391 mg
proteína/100 g muestra.
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PRACTICA 3: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN POR

LA AMILASA SALIVAR
Fecha: Martes, 25 de Febrero de 2014
Introducción
La amilasa salivar es una enzima que cataliza las reacciones de hidrólisis que se
producen en la ruptura de los enlaces del almidón, y transformando este en maltosa
para su posterior uso energético. La estructura proteica de esta enzima se ve alterada
por factores físico-químicos como el pH y la temperatura.
En esta práctica, los objetivos serán la observación de el efecto del pH sobre la

actividad de la enzima amilasa mediante las pruebas del lugol y de Fehling, además de
observar la influencia de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática,
usando diferentes temperaturas (0, 37 y 100ºC) y usando de nuevo la prueba del lugol.
Materiales:
 Parafilm
 Embudo
 Tubos de ensayo
 Papel indicador universal
 Baño maría
 Baño de hielo
Reactivos:
 Saliva (muestra de amilasa)

 I2/KI
 Reactivo Fehling A
 Reactivo Fehling B
 HCl 0,4%
Página | 20
Método
1. Se obtuvo una muestra de saliva masticando algo de parafina y se añade

ayudándonos de un embudo a un tubo de ensayo hasta que tuvimos 2 mL
aproximadamente
2. Enrasamos hasta 20 mL con agua destilada
3. Se prepararon 5 tubos de ensayo numerados en los que se añadió las siguientes

cantidades de reactivos:
Tubo 0 1 2 3 4 5
HCl 0,4 % 0 2 0 0 0 0
(mL)
NaOH 0 0 2 0 0 0
0,1N (mL)
Agua (mL) 0 0 0 2 0 2
CaCO3 1% 0 0 0 0 2 0
(mL)
Almidón 0 2 2 2 2 2
1% (mL)
Saliva 2 2 2 2 2 0
diluida
(1:10)
(mL)
4. Se calentó el tubo 0 (blanco) a 100ºC durante 5 minutos
5. Se añadió el contenido del tubo 0 al tubo 5
6. Se agitaron todos los tubos
7. Se midió el pH de cada uno con un papel indicador (ver resultados)
8. Se colocaron los tubos a 37ºC durante 15 minutos
9. Se llevó el pH de los tubos 1 y 2 hasta un pH neutro
10. Se realizó la prueba del i2/KI, en la cual se añadió a 0,5 mL de cada tubo 2 gotas
de I2/KI y se observó la presencia o ausencia de almidón ( ver resultados)
Página | 21
11. Posteriormente, se realizó la prueba de Felhing, la cual consistió en añadir a 1

mL de cada tubo 1 mL de Felhing A y otro de Felhing B, los cuales seguidamente
se agitaron y se calentaron a baño maría durante 10 minutos. Se observó y
anoto la presencio o ausencia de maltosa mediante un precipitado rojo ladrillo
(ver resultados)
12. Se colocó 2 mL de disolución de almidón 1% en un tubo rotulado y se colocó a

37ºC en un baño maría
13. Se hizo lo mismo con 2 mL de saliva diluida al 1:10
14. Se esperó de 2 a 3 minutos
15. Se prepararon 5 tubos limpios y numerados con 0,5 mL de HCl 0,4% y dos gotas
de I2/KI
16. Se añadieron 2mL de de solución enzimática sobre los 2 mL de almidón en el

baño maría y se comenzó a contar el tiempo que transcurre
17. Se realizó la prueba del I2/KI a intervalos de 1 minuto extrayendo 0,5 mL de la

mezcla de reacción y añadiéndola a los tubos con HCl y I2/KI
18. Se observa y anota la evolución de la hidrolisis del almidón
19. Se realizó la misma prueba pero esta vez con hielo
20. Se realizó la misma prueba pero en baño maría a 100ºC
21. Se compararon las velocidades de la reacción enzimática entre los tres casos
Resultados
Medición de pH con papel indicador universal
Tubo Color papel pH

1 Rojo Ácido
2 Azul Básico
3 Verde Neutro
4 Verde Ligeramente básico
Página | 22
5 Verde Neutro
Prueba de Fehling
Tubo Descripción Conclusión

1 Sin apenas precipitado Negativo
3 Con notable cantidad de precipitado Positivo
4 Con notable cantidad de precipitado Positivo
Prueba del lugol
Tubo Descripción Conclusión

1 Coloración azul Negativo
3 Coloración amarilla Positivo
4 Coloración amarilla Positivo
Conclusiones
 Los tubos positivos, que corresponden a nuestros tubos 3 y 4, poseen un pH

correcto para realizar la hidrolisis completa del almidón y, sobretodo el tubo 3
que posee un pH neutro.
 En los tubos 1, 2 y 5, no se da el pH correcto, ya que el tubo 1 es demasiado

ácido, el tubo 2 es demasiado básico y en el tubo 5 queda desnaturalizada la
estructura proteica de la enzima debido a la adición del tubo 0 a este, el cual
fue calentado a altas temperaturas.
 Si se realiza la prueba a 0ºC en una cubeta con hielo, la hidrolisis se realiza al

final, ya que se ralentiza por el frio.
 Si la prueba se realiza a 37ºC, simulando la temperatura corporal, la enzima

tiene su actividad óptima, y se produce la hidrolisis progresiva del almidón
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 Si la prueba se realiza a 100ºC, se desnaturaliza la enzima y no se produce la

hidrolisis del almidón.
 Por tanto, la enzima actúa mas eficientemente en medios neutros o

ligeramente básicos
Cuestiones
1) Las enzimas se inactivan de muchas formas. Indica las cuatro formas en que has
inactivado la amilasa salival
 Desnaturalización por pH ácido

 Desnaturalización por pH básico
 Desnaturalización por temperatura elevada
 Inactivación por baja temperatura
2) Indica otras cuatro formas distintas que podrías haber empleado para inactivar
esa enzima.
 Adición de agentes químicos desnaturalizantes como urea o alcoholes.

 Uso de inhibidores enzimáticos
 Uso de solventes no polares
 Aplicando ondas ultrasónicas
3) La detección de la actividad de la enzima amilasa la hiciste en la práctica con

dos métodos: determinando la desaparición de sustrato de la enzima y
determinando la aparición del producto de la reacción enzimática. Explica cuales
eran esos dos métodos.
El método por el cual determinamos la desaparición de substrato de la enzima se

denomina método Fehling, en el cual añadimos dos reactivos preparados para la
determinación de azucares reductores en nuestro caso la maltosa. Si un azúcar reduce
el reactivo de Fehling a un precipitado rojo, se dice que es un azúcar reductor.
Página | 24
El otro método por el cual determinamos la aparición de un producto de la reacción

enzimática se llama prueba del lugol. Este método se usa para identificar
polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de reactivo de lugol (disolución
de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico.
Página | 25
PRÁCTICA 5: EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN

CUANTITATIVA DEL ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO
Martes, 25 de Marzo de 2014
Introducción
En esta práctica, se busca extraer el ADN mediante el método indicado y con el mayor
rendimiento posible. Para ello, mantendremos nuestra muestra de hígado de pollo en
ácido perclórico a 90ºC en un baño maría durante 20 minutos.
Se usará el espectrofotómetro a 260 nm, usando para ello una recta patrón preparada
anteriormente con concentraciones de ADN conocidas, y se medirán las absorbancias,
con las cuales seremos capaces de cuantificar las muestras y conocer la concentración
de ADN obtenido en ellas.
Para que la calidad de nuestra muestra de ADN sea buena, el cociente entre las
absorbancias a 260 y 280 nm debería ser mayor que 1.8.
Materiales:
 Baño de hielo
 Baño maría
 Espectrofotómetro en región UV
 Mortero
 Tubo de ensayo
Reactivos:
 Muestra de hígado de pollo

 Solución patrón de ADN estándar
 Acido perclórico 0.5N
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Método
1) Pesar aproximadamente 0,5 g de hígado de pollo y se anota la cantidad exacta

de la pesada (0,51 g)
2) Se homogeiniza el tejido a 1:10 diluyéndolo con agua tomada con pipeta y se

machaca con el mortero para homogeneizar.
3) Se añade 1 mL del homogeneizado con pipeta a un tubo de ensayo y se le

añadió 1 mL de ácido perclórico 0.5N (HClO4)
4) Se mezcló correctamente y se dejó reposar en frio durante 10 minutos
5) Se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos
6) Se eliminó el sobrenadante
7) Se diluyó el precipitado en 2 mL de ácido perclórico
8) Se mantuvo en un baño maría a 90ºC durante 20 minutos y se agitó de vez en

cuando para mantener la suspensión
9) Se preparó la recta patrón siguiendo las siguientes cantidades:
Tubo µg de ADN total Volumen total (mL) µL solución stock mL de agua

de ADN
0 0 1 0 1
1 25 1 125 875
2 50 1 250 750
3 75 1 375 625
4 100 1 500 500
10) Se volvió a centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos
11) Se tomó el sobrenadante y se desechó el precipitado
12) Se preparó en dos tubos de ensayo la muestra diluida en ácido perclórico 10

veces y 20 veces.
13) Se tomaron 1 mL de cada muestra en dos tubos
Página | 27
14) Se midió la absorbancia a 260 nm en el espectrofotómetro usando de

referencia el agua ultrapura
15) Se realizó la gráfica de la absorbancia frente a la concentración de ADN y se

interpoló las absorbancias de nuestras muestras para obtener la concentración
16) Se calculó el contenido de ADN por cada gramo de hígado de pollo.
Gráfica recta patrón e interpolación de resultados
1.8
1.6
f(x) = 0.0031392 x + 0.0170000000000001
1.4 R² = 0.990677790968706
1.2
Absorbancias
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración ADN (µg)
Resultados
Tubo Absorbancia
0 0
1 0,405
2 0,884
3 1,111
4 1,609
Muestra 1 (1:10) 0,976
Muestra 2 (1:20) 0,455
Página | 28
Tras interpolar el valor de las absorbancias de las muestras en nuestra recta patrón las
concentraciones quedan:
Muestra 1 (1:10) y=0,0031x + 0,017 0,976= 0,0031x + 0,017 x= 309,355 µg ADN
Muestra 2 (1:20) y=0,0031x + 0,017 0,455= 0,0031x + 0,017 x= 141,290 µg ADN
Por lo tanto, la concentración de ADN por cada gramo de tejido será:

Muestra 1 (1:10) = 309,355 x 10 = 3093,55
Muestra 2 (1:20) = 141,290 x 20 = 2825,80
(3093,55 + 2825,80)/2 = 2959,68 µg ADN en 0.510 g de tejido
0.510 g tejido 2925 ,68 µg ADN

= X = 5803,28 µg ADN
1 g tejido X µg ADN
Cuestiones
1) ¿Qué propiedad de los ácidos nucleídos usamos para su extracción?
La desnaturalización de las histonas encontradas en las cadenas de ADN
2) ¿Qué propiedad de los ácidos nucleídos usamos para su detección y

cuantificación?
Su capacidad de absorción en la región ultravioleta (260 nm)
Página | 29
PRÁCTICA 6: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)
Fecha: Martes, 1 de Abril de 2014
Introducción
En esta práctica realizamos una PCR (Polymerase Chain Reaction), la cual consiste en
una amplificación selectiva de una secuencia predeterminada de ADN, usando para
ello una enzima selectiva llamada ADN polimerasa.
El fragmento que replicaremos quedará limitado por los marcadores moleculares, en el

cual el fragmento no podrá superar los 10 Kb.
Para realizar la PCR, añadiremos a la muestra de ADN: dNTP´s, 2 primers A1 y A2, Taq
polimerasa y el resto de agua ultrapura.
La mezcla se coloca en un termociclador, en el cual se configuran los ciclos de

temperatura y su duración para que se realicen automáticamente.
En este proceso aparecen 3 fases: la desnaturalización del ADN bicatenario a 95ºC, la

hibridación de los oligos entre 50 y 55ºC y la extensión de los oligos por la Taq
polimerasa a 72ºC.
La molécula de ADN se amplifica hasta un millón de veces con 20 o 30 ciclos.
Se realiza una pre-desnaturalización del DNA a amplificar antes del primer ciclo y la
duración de la etapa de extensión del oligonucleótido del último ciclo se prolonga. Es
muy importante la elección adecuada de los oligonucleótidos para la especificidad de
la amplificación. Su longitud, generalmente próxima a 20 nucleótidos, permitirá una
hibridación rápida con una secuencia única.
Materiales:
 Termociclador
 Tubos eppendorf
 Agitador Vortex
 Baño maría y cubeta de hielo
 Centrifugadora
Página | 30
Reactivos:
 dNTP´s
 Oligonucleótidos A1 y A2
 Taq polimerasa
 Muestra de ADN extraída
 Agua ultrapura
Método
1) Se resuspendió, ayudándonos de un asa de siembra, un poco de la cepa de

Staphylococus aureus sembrada anteriormente en 500 µL de agua ultrapura en
un tubo eppendorf
2) Se agitó con el Vortex
3) Se hizo hervir en un baño maría a 100ºC durante 8 minutos
4) Se deja enfriar, ayudándonos con una cubeta de hielos
5) Se centrifugó a 12000 rpm durante 2 o 3 minutos
6) Se pasó el sobrenadante a un eppendorf nuevo rotulado
7) Se guardo en la nevera hasta su uso
8) Se tomo un nuevo eppendorf rotulado como “Mix” o “Pool”
9) En este tubo, se añadió los µL de cada elemento que formara parte de las
muestras y de los controles positivo y negativo. Para ello lo desarrollamos de la
siguiente forma:
Muestra 1 Muestra 2 Control + Control - Mix o Pool

Buffer 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL 25 µL
MgCl 1,5 µL 1,5 µL 1,5 µL 1,5 µL 7,5 µL
A1 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 5 µL
A2 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 5 µL
dNTP´s 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL 5 µL
Taq 0,3 µL 0,3 µL 0,3 µL 0,3 µL 1,5 µL
ADN 10 µL 10 µL 10 µL 0 µL 0 µL
Agua 30,2 µL 30,2 µL 30,2 µL 40,2 µL 0 µL
Volumen final 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 12,25 µL
Página | 31
10) Se prepararon los microtubillos rotulados que usaremos posteriormente para la

realización de la PCR. Para ello usamos dos de las muestras de ADN, y una
muestra de ADN que conocemos que su resultado es positivo (control +) y otro
microtubillo en el cual echaremos todos los elementos que le añadimos a las
muestras pero en lugar de ADN se le añade la misma cantidad de agua
ultrapura (control -)
Resultados
Esta imagen nos muestra cuatro casos diferentes encontrados en esta práctica:
Caso 1) En el primer caso empezando por la izquierda, observamos que la muestra 1

(P1) dio positiva respecto al control, observándose pues una banda al igual que en el
control positivo. Sin embargo, se observa que la segunda muestra (P2) dio negativo al
no aparecer dicha banda en su carril, coincidiendo con el control negativo. Este caso es
el que se consideró correcto.
Caso 2) En este segundo caso, observamos que aparece lo mismo que en el caso 1 pero
aparece una banda en el control negativo. Esto nos hace ver que esta analítica no es
válida, ya que el control negativo no debería haber aparecido replicación del gen.
Puede haber estado provocado por una contaminación del control negativo o un error
técnico y/o humano.
Página | 32
Caso 3) En el tercer caso, vemos que ambas muestras aparecen con el gen replicado y
con su respectiva banda, pero no aparece banda en el control positivo. Esto hace que
este análisis no sea válido, ya que el control positivo es una muestra de la cual
tenemos conocimiento que se va a producir replicación del gen y por tanto una banda.
Esto puede haber sido provocado por varios factores siendo el más probable el error
humano al confundir las muestras de control positivo con la segunda muestra que
debería dar negativo.
Caso 4) En este último caso, se observa que únicamente ha aparecido una banda en el
control positivo, y puede llevar a error ya que la muestra 1 debería ser positiva.
Aunque los controles hayan funcionado, el gen de la muestra 1 no se ha replicado, y
puede ser debido a una mala configuración de las rampas de temperatura del
termociclador.
Hay que remarcar que la secuencia de bandas que aparece entre el caso 1 y 2 y entre
el caso 3 y 4 es un marcador de pesos moleculares, marcado en la imagen como MM.
Conclusiones
 En esta práctica observamos como conocer si una muestra posee un gen

específico respecto a otro que no lo posee mediante la técnica de la reacción
en cadena de la polimerasa.
 Vimos los problemas que podían aparecer en la realización de este método de

replicación del ADN siendo sobretodo errores de contaminación o técnica.
 En esta práctica no se realizó la inyección de las muestras en los pocillos, pero

se indicó el método para realizar geles de agarosa.
 Se observó que la PCR es una técnica altamente fiable para detección de genes
específicos y su diversidad de utilidades.
 Se nos mostró la importancia de rotular los microtubillos para evitar problemas

posteriores
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Prácticas de Laboratorio [ Miguel Galán Rubio 1º Enología]

PRÁCTICA 1: TITULACIÓN POTENCIOMETRICA DE AMINOÁCIDOS...............................................3

PRÁCTICA 1: TITULACIÓN POTENCIOMETRICA DE

Las características ácido-base de los aminoácidos les conceden una capacidad de

Dependiendo de las características de pH del medio en el que se encuentre, el

Los objetivos de esta práctica son la observación del cambio de pH y el

 Disolución de aminoácido 0.1 M de Glicina y ácido glutámico

1) Se preparó todo el equipo que se usó posteriormente en la práctica: pH-metro,

2) Se añadieron 20 mL del primer aminoácido a valorar (en nuestro caso, primero

3) Se enrasó la bureta con la disolución de hidróxido potásico 0,1M

4) Se colocó el vaso de precipitados con aminoácido en la plataforma del pH-

5) Se colocó la bureta en el interior de vaso teniendo cuidado de que la bureta no

6) Se valoró el aminoácido, apuntando los valores de pH que se observaban a

7) Se tomó datos hasta que el pH del aminoácido sea de 12

8) Se realizó una tabla con todos los valores obtenidos

9) Se repitió el mismo procedimiento para la valoración del segundo aminoácido,

Para la resolución de esta práctica, se mostrarán los datos obtenidos del pH en

Medidas de pH del aminoácido Glicina

1. pH= 1,32 (inicial)

27. pH= 9,49 (1 mL gastado)

Gráfica de la valoración de la glicina

Medidas de pH del aminoácido ácido glutamínico

1. pH= 1,71 (acidificado inicialmente)

42. pH= 10,17 (1 mL gastado)

Gráfica de valoración del ácido glutamínico

Con esta práctica, hemos observado el comportamiento de los dos aminoácidos

Suponiendo que tienes 2 milimoles del aminoácido glicina en disolución a pH 1,23

pH= pKa + log [ Gly ]

x = 0.0954 [ Gly ] y = 1.9045 [ Gly ]

[ Gly+ ] + [ Gly zwitterion ] =2

b) Comienzas a añadir hidróxido potásico 0.1 M. Cuando el pH sea de 2, calcula

pH= pKa + log [ Gly ]

X = 0.668 [ Gly ] Y = 1.332 [ Gly ]

c) Repite los cálculos anteriores subiendo el pH de unidad en unidad hasta que

pH= pKa + log [ Gly ]

[ Gly+ ] + [ Gly zwitterion ] = 2

Para pH 3 3=2.3 + Log X/2- X 0,7 = Log X/2-X

X = 1,67 [ Gly ] Y = 0,33 [ Gly ]

Para pH 4 4=2.3 + Log X/2- X 1,7 = Log X/2-X

X = 1,96 [ Gly ] Y = 0,04 [ Gly ]

d) Representa gráficamente esos puntos, en donde las abscisa serán milimoles

pH = pKb + Log [ Gly− ]

12 = 9.6 + Log X/Y 2.4 = Log X/2-X 251.188 = X/2-X

[ Gly− ] y = 0.0079 [ Gly

f) Repite los cálculos anteriores bajando el pH de unidad en unidad hasta un pH

Ph = pKb + log [ Gly− ]

Para pH 11 11= 9,6 + Log X/2- X 1,4 = Log X/2-X

X = 0,077 [ Gly ] Y = 1,431 [ Gly ]

Para pH 10 10 = 9,6 + Log X/2- X 0,4 = Log X/2-X

X = 0,077 [ Gly ] Y = 1,431 [ Gly ]

Para pH 9 9 = 9,6 + Log X/2- X -0,6 = Log X/2-X

X = 1,599 [ Gly ] Y = 0,401 [ Gly ]

Para pH 8 8 = 9,6 + Log X/2- X -1,6 = Log X/2-X

X = 1,951 [ Gly ] Y = 0,0049 [ Gly ]

g) Representa esos puntos en la gráfica anterior, en el cual el eje de abscisas

h) ¿Cuál es el valor del pH al cual se ha valorado la mitad de la Gly + inicial, es

pH= pKa + log[ Gly ]

i) ¿Cuál es el valor del pH al cual se ha valorado toda la Gly + y la mitad de la

Ph = pKb + log [ Gly− ]

PRÁCTICA 2: PRECIPITACIÓN Y DETERMINACIÓN

En esta práctica, el objetivo será realizar la precipitación y cuantificación de proteínas

Para su cuantificación, usaremos el espectrofotómetro a 650 nm de longitud de onda,