Cuellar Martinez

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOLOGÍA
CÓDIGO DE BARRAS GENÉTICO DE ALGUNAS ORQUÍDEAS

VERACRUZANAS BAJO RIESGO DE EXTINCIÓN.
TESIS
TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL
QUE PRESENTA:
MANUEL ADRIÁN CUÉLLAR MARTÍNEZ
DIRECTORA:
VICTORIA SOSA ORTEGA
XALAPA, VER. 2011

AGRADECIMIENTOS
 Al Instituto de Ecología, A. C. por otorgarme las facilidades para la realización de

este trabajo de investigación y permitirme trabajar en sus instalaciones.
 A la Dra. Victoria Sosa por concederme la oportunidad de desarrollar este

proyecto, por todos los consejos, apoyo y dedicación como mi directora de tesis.
 A Arith Fabiana Pérez Orozco, técnico del laboratorio de biología molecular del
Instituto de Ecología, A. C. por su asesoramiento en mi trabajo en el laboratorio.
 A Etelvina Gándara Zamorano y Diego Francisco Angulo Pérez por ayudarme a

usar el software para realizar algunos análisis.
 A los miembros del comité tutorial: al Dr. José Armando Lozada García, a la Dra.
Verónica Guillermina Domínguez Martínez por las revisiones y correcciones que
me hicieron para mejorar mi trabajo
 A Milton Hugo Díaz Toribio, Wendy Bertha Colorado Durán y Jorge Antonio
Gómez Díaz por acompañarme a realizar colectas en campo.
 A Miguel Castañeda Zarate, Jonas Morales Linares y don Orencio Jarvio Pérez
por donar tejido de ejemplares de sus colecciones y colectas para la realización
de este trabajo.
 Al personal del Instituto de Ecología y del Jardín Botánico Francisco Javier

Clavijero: Carlos Iglesias, Gloria Martínez, Víctor Luna y al Dr. Andrew P.
Vovides.
 A mis padres Gloria Martínez Cuevas y Manuel Gregorio Cuéllar Rojas y a mis
hermanos Mayra y Fernando por su cariño incondicional y su apoyo en todo
momento que lo he necesitado.
 A todos mis amigos de la Facultad de Biología por brindarme su amistad y

confianza, y por todos los momentos increíbles que hemos vivido.
DEDICATORIA
A mis padres:
Manuel Gregorio Cuellar Rojas y Gloria Martínez Cuevas
Y hermanos:
Mayra Lídice y Fernando Iván
Por todo su cariño, por los consejos y la confianza que han depositado en mí, por estar
conmigo en los mejores momentos de mi vida, por los valores y enseñanzas que me han
inculcado y que han forjado la persona que soy y les agradezco el apoyo incondicional
especialmente durante mis estudios universitarios.
A toda mi familia:
A mis abuelos: el señor Anastasio Martínez y la señora Lourdes Cuevas; a todos mis
tíos, tías y a toda la banda de primos, gracias a cada uno de ustedes por el apoyo y el
cariño que me han demostrado.
De manera especial a la memoria de mi abuela Pilar Rojas, que me cuida y me guía

desde algún lugar del cielo y siempre la llevare en mi corazón
A mis amigos que son mi segunda familia:
Los Gómez Brothers: Jorge y Andrés, a Wendy Colorado, Karina Rodríguez, Rosario
Zayas, Odalis y Swany Morteo, Eduardo Landa, Rodrigo Triana e Israel Hernández por
todos las locuras y momentos divertidos que hemos disfrutado a lo largo de todo este
tiempo y por apoyarme y estar conmigo en los momentos que lo he necesitado.
ÍNDICE
RESUMEN .................................................................................................................................................. 6
1.INTRODUCCION .................................................................................................................................... 7
2.GENERALIDADES ................................................................................................................................. 8
2.1 ORCHIDACEAE .......................................................................................................................................... 8

2.2. CÓDIGO DE BARRAS GENÉTICO ............................................................................................................ 11
2.3 MÉTODOS MOLECULARES ...................................................................................................................... 15
3.OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 19
3.1 OBJETIVO GENERAL: .............................................................................................................................. 19

3.2 OBJETIVOS PARTICULARES: ................................................................................................................... 19
4.ANTECEDENTES DE LOS CÓDIGOS DE BARRAS GENÉTICOS................................................ 20
5.MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................... 25
5.1 MUESTREO DE MATERIAL BIOLÓGICO .................................................................................................... 25

5.2 EXTRACCIÓN DE ADN Y SECUENCIACIÓN ............................................................................................ 27
5.3 VISUALIZACIÓN Y ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS................................................................................. 27
5.4 ANÁLISIS ................................................................................................................................................ 28
6.RESULTADOS ..................................................................................................................................... 28
7.DISCUSIÓN .......................................................................................................................................... 39
8.CONCLUSION ...................................................................................................................................... 43
9.LITERATURA CITADA ........................................................................................................................ 44
10.ANEXOS ............................................................................................................................................. 52
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Lista de orquídeas veracruzanas incluidas en alguna categoría de riesgo en la

NOM-059 SEMARNAT-2001. ................................................................................................................. 10
Tabla 2. Esquema sintético de trabajos comparativos de varios locus propuestos como
códigos de barras genéticos en plantas. .......................................................................................... 24
Tabla 3. Lista de orchidaceae incluidas en la aplicación de código de barras genéticos y el
código que se le asignó en los análisis. ............................................................................................ 26
Tabla 4. Secuencias de la región del gen de cloroplasto matK con mayor similitud a las
secuencias de orchidaceae en la comparación a través de BLAST. ............................................ 29
Tabla 5. Secuencias de la región del gen de cloroplasto rbcL con mayor similitud a las
secuencias de orchidaceae en la comparación a través de BLAST. ............................................ 30
Tabla 6. Secuencias concatenadas matK + rbcL con mayor similitud a las secuencias de
orchidaceae en la comparación a través de BLAST. ....................................................................... 31
Tabla 7. Matriz de distancia para el fragmento del gen rbcL. ........................................................ 36
Tabla 8. Matriz de distancia para el fragmento del gen matK. ....................................................... 37
Tabla 9. Matriz de distancia para matK+rbcL.. ................................................................................. 38
INDICE DE FIGURAS
figura 1. Ábol Neighbor-Joining del fragmento del gen rbcL, construido usando el modelo
kimura-2 parámetros.. ........................................................................................................................... 32
figura 2. Árbol Neighbor-Joining del fragmento del gen matK, construido usando el
modelo kimura-2 parámetros........................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
figura 3. Árbol Neighbor-Joining de matK+rbcL, construido usando el modelo kimura-2
parámetros.. ............................................................................................................................................ 34
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Especímenes analizados.. ................................................................................................... 52
Anexo 2. Imágenes de las especies de orquídeas analizadas. ...................................................... 53

Anexo 3. Imágenes de las matrices de secuencias en se-al secuence alignment editor, v2.
0a11. la imagen 3a correspondiente a la matriz de secuencias del fragmento del gen rbcl y
la 3b a la matriz de secuencias del fragmento matk. ...................................................................... 57
Anexo 4. Protocolo de extracción de ADN con CTAB de Doyle y Doyle (1987). ........................ 58
Anexo 5. Protocolo de purificación de muestras de PCR Qiaquick ............................................ 59
Anexo 6. Protocolo de purificación de secuencias ......................................................................... 60
Anexo 7. Secuencias de las 20 especies de orquídeas del gen de cloroplasto matK. ............. 61
Anexo 8. Secuencias de las 20 especies de orquídeas del gen de cloroplasto rbcL. ............... 66
RESUMEN
Uno de los grupos de plantas más diversos en México es el caso de las Orchidaceae,
en el cual se han reportado 1200 especies. Veracruz es uno de los estados con mayor
número de taxones de esta familia de plantas en el que se han registrado 351 especies.
Por otro lado, los códigos de barras genéticos consisten en secuencias cortas y
estandarizadas de ADN que permiten la identificación de especies conocidas y el
descubrimiento de especies nuevas, además es particularmente útil para reconocer
aquellas consideradas como amenazadas o en peligro de extinción. Las Orchidaceae
son uno de los grupos con mayor número de especies protegidas, principalmente por la
extracción indiscriminada de individuos de especies cotizadas ornamentalmente, las
cuales son recolectadas en sus hábitats y también se ven amenazadas por la
destrucción de los ecosistemas donde habitan. Los códigos de barras son entonces una
herramienta molecular que podrá contribuir a su identificación lo que facilitará a las
autoridades gubernamentales relacionadas con el tráfico y manejo de especies a
reconocerlas, aún si carecen de estructuras reproductivas. En el presente estudio se
obtuvieron las secuencias de las regiones de ADN de cloroplasto matK y rbcL
propuestos por la CBOL Plant Working Group en el 2009 como los códigos de barras
estándares en plantas para un total de 20 especies de orquídeas protegidas de
Veracruz. Los resultados arrojan que matK es la mejor región como código de barras
genético ya que en el análisis logró identificar al 100% de las muestras, estos mismos
resultados se obtuvieron empleando un código de barras con dos locus matK + rbcL.
Por otro lado rbcL de manera individual, es un gen que se conoce por el poco poder
discriminatorio para identificar individuos a nivel de especie y en este caso, solo pudo
identificar al 80% de las muestras. Los códigos de barras estándares en vegetales
propuestos por CBOL fueron exitosos para Orchidaceae, sin embargo sería
conveniente buscar nuevas opciones que pudieran sustituir el desempeño de rbcL y así
identificar más fácilmente a las especies.
6
1. INTRODUCCION
La familia Orchidaceae incluye a varias especies protegidas tanto a nivel
nacional como internacional; en el caso particular de México, la familia de las
orquídeas ocupa el segundo sitio entre las familias de plantas con mayor número de
especies protegidas (Flores-Palacios y Valencia-Díaz 2007) contando con 181
especies y superado solo por la familia Cactaceae que posee 285 especies protegidas
(Solís-Montero et al. 2005). Aproximadamente el 91% de orquídeas mexicanas
protegidas son especies epifitas (SEMARNAT 2002).
Las epifitas representan aproximadamente el 10% del total de la flora vascular

mundial con una riqueza y abundancia marcada en las regiones tropicales (Neto et al.
2009), así mismo tienen una gran importancia en el mercado hortícola internacional y
entre éstas se encuentran numerosas especies de Orchidaceae. Por esta razón
muchas especies están siendo erradicadas o llevadas a la extinción por diversos
factores como lo es la deforestación de los bosques y consecuentemente la
fragmentación de los hábitats naturales en las que se desarrollan y sin dejar a un lado
la colecta ilegal (Flores-Palacios y Valencia-Díaz 2007).
Controlar el comercio ilegal está afectado por la dificultad de identificación de

orquídeas, principalmente cuando están estériles, lo que las hace un modelo idóneo
para aplicar herramientas moleculares de identificación (Lahaye et al. 2008). Por esta
razón el objetivo de esta tesis es la de producir secuencias de ADN de cloroplasto
como códigos de barras genéticos para lograr la identificación de especies en peligro
de extinción de Orchidaceae particularmente de Veracruz; esto coadyuvará a proveer
un medio eficiente para identificarlas aún en estado vegetativo y podrá ser utilizado por
autoridades sanitarias y por cualquier investigador interesado en identificar tráfico
ilegal de orquídeas (Pillon y Chase 2006).
7
2. GENERALIDADES
2.1 Orchidaceae
Alrededor de 1200 especies de orquídeas se han reportado para México, razón

por la cual Orchidaceae ocupa el tercer lugar en riqueza de especies de entre las
familias de plantas mexicanas (Hágsater et al. 2005). Esta gran diversidad es resultado
de la amplia variedad de condiciones fisiográficas y climáticas existentes en el país así
bien, como por su distribución geográfica y su historia geológica, un factor importante
es que México es considerado un centro de evolución de floras (Rzendowki 2006).
Veracruz es uno de los estados con mayor diversidad biológica del país,
pues se calcula que más de 8 000 especies de plantas habitan la entidad (Krömer et al.
2010). Del número total de especies registradas, 351 corresponden a la familia
Orchidaceae, lo que la convierte en una de las más ricas en el estado (García-Cruz y
Sosa, 1998). Los hábitats más ricos no solo en orquídeas sino también para varios
grupos de epífitas son los bosques de neblina que ocupan únicamente 1% del territorio
nacional y albergan a casi la mitad de las especies de Orchidaceae reportadas para el
país y esta riqueza está asociada a los microambientes que prevalecen en el bosque de
neblina (Solís-Montero et al. 2005; Flores-Palacios y García-Franco 2008), en el caso
de Veracruz este tipo de ecosistema se sitúa en el centro del estado por lo que podría
ser el sitio con mayor riqueza de epifitas (Flores-Palacios y García-Franco 2008).
Las orquídeas son una de las familias más amenazadas en el país, con 181
especies dentro de la lista nacional de especies protegidas (Flores-Palacios y Valencia-
Díaz 2007). El aislamiento de hábitats debido a la fragmentación es uno de los factores
más importantes que ponen en riesgo a la biodiversidad existente (Flores-Palacios y
García-Franco 2008) y Veracruz es uno de los estados del país más deteriorados, por
lo que es urgente proteger lo que aún esta conservado y restaurar los ecosistemas que
están en peligro de desaparecer (Krömer et al. 2010). La protección legal y la
regulación de la biodiversidad pretenden detener la explotación incontrolada
8
restringiendo la extracción de especies protegidas, sin embargo el comercio ilegal de
plantas es frecuente a nivel mundial para su uso en el ámbito medicinal y en la
horticultura ornamental (Flores-Palacios y Valencia-Díaz 2007). Actualmente existe una
Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2001 desarrollada por la Secretaria del
Medio ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT), esta norma identifica a las
especies tanto animales como vegetales que están en riesgo en la República Mexicana
y en base a ciertos criterios, las clasifica en alguna de las categorías que la conforman
(Solórzano 2009). En la tabla 1. Se enlista a las 35 especies de orquídeas reportadas
para el estado de Veracruz que están incluidas en alguna categoría de protección
(SEMARNAT 2002). El comercio ilegal de especies ornamentales ha sido reconocido
como una amenaza muy importante para la biodiversidad, a pesar de la protección
legal el tráfico de muchas epifitas silvestres es común en los mercados y calles siendo
esto un indicador de que las medidas de protección son insuficientes y es urgente
comprender la magnitud de este problema (Flores-Palacios y Valencia-Díaz 2007).
La identificación correcta de algunas especies biológicas no ha sido posible con

base solamente en la morfología, por lo que se ha optado en el uso de secuencias de
ADN como código de barras para realizar esta tarea de una manera rápida y fácil y
empleando pequeñas porciones de tejido, semillas y material estéril, siendo una
herramienta interesante que puede contribuir a detener el tráfico ilegal de orquídeas
permitiendo identificarlas aún en estado vegetativo (Cräutlein et al. 2011).
9
Tabla 1. Lista de orquídeas veracruzanas incluidas en alguna categoría de riesgo en la NOM-059
SEMARNAT-2001.
Categoría de riesgo en la
Especies
NOM-059-SEMARNAT-2001
Acianthera violacea (A. Rich. & Galeotti) Pridgeon & M. W.
Sujeta a protección especial
Chase
Acineta barkeri (Bateman) Lindl.
Amenazada
Anathallis abbreviata (Schltr.) Pridgeon & M. W. Chase
Aspidogyne stictophylla (Schltr.) Garay
Barbosella prorepens (Rchb. f.) Schltr.
Amenazada
Chysis bractescens Lindl.
Amenazada
Corallorrhiza macrantha Schltr.
Cryptarrhena lunata R. Br.
Cycnoches ventricosum Bateman
Amenazada
Cypripedium irapeanum Lex.
Amenazada
Dryadella guatemalensis (Schltr.) Luer
Epidendrum coronatum Ruiz & Pav.
Epidendrum dressleri Hágsater
Euchile citrina (La Llave & Lex.) Withner. Sujeta a protección especial
Euchile mariae (Ames) Withner Amenazada

Lacaena bicolor Lindl.
Maxillaria tonsoniae Soto Arenas
Mormodes maculata (Klotzsch) L. O. Williams var. unicolor
Amenazada
(Hook.) L. O. Williams
Oestlundia distantiflora (A. Rich. & Galeotti) W. E. Higgins
Oncidium incurvum Barker ex Lindl.
Amenazada
Papperitzia leiboldii (Rchb. f.) Rchb. f.
Prosthechea vitellina (Lindl.) W. E. Higgins
Rhynchostele beloglossa (Rchb. f.) Dressler & N. H.
Williams
10
Tabla 1. Continuación. Lista de orquídeas veracruzanas incluidas en alguna categoría de riesgo en la
NOM-059 SEMARNAT-2001.
Rhynchostele cordata (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar

Amenazada
Rhynchostele ehrenbergii (Link, Klotzsch & Otto) Soto-
Amenazada
Arenas & Salazar
Rhynchostele rossii (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar
Amenazada
Sarcoglottis cerina (Lindl.) P. N. Don
Specklinia digitale (Luer) Pridgeon & M.W.Chase
Amenazada
Specklinia glandulosa (Ames) Pridgeon & M.W.Chase
Spiranthes torta (Thumb.) Garay & H. R. Sweet
Stanhopea oculata (Lodd.) Lindl.
Amenazada
Stanhopea tigrina Bateman
Amenazada
Teuscheria pickiana (Schltr.) Garay
Trichocentrum stramineum (Bateman ex Lindl.) M. W.
Amenazada
Chase & N. H. Williams
Vanilla planifolia Jacks.
2.2. Código de barras genético
Más de dos siglos fueron necesarios para que los taxónomos describieran 1.7
millones de especies diferentes de plantas, animales, hongos, algas y microorganismos,
aunque es conocido que esta cifra pudiera ser una subestimación de la diversidad
biológica real de la tierra (Savolainen et al. 2005; Blaxter 2003). La acumulación de
bases de datos de secuencias de ADN tienen un gran potencial para la identificación y
clasificación de organismos, así como un código de barras identifica los productos de
un supermercado (Hebert et al. 2003; Blaxter 2003); como también es ventajoso para
programas de investigación ecológica y de biodiversidad (Savolainen et al. 2005); cabe
mencionar que la idea de emplear secuencias de ADN para la identificación rápida de
11
especímenes no es nueva (Lanteri 2007). Actualmente los proyectos de códigos de
barras genéticos están logrando resultados muy positivos (Gregory 2005).
El código de barras genético consiste en la caracterización de regiones cortas y

estandarizadas del genoma en todos los organismos con el fin de reconocer e
identificar especies biológicas (Hebert et al. 2003). El objetivo de los códigos de barras
genéticos como método molecular, es facilitar la identificación de organismos de
manera precisa y en corto tiempo y con esto, conocer especies pertenecientes a
taxones difícilmente diagnosticables sobre la base de la morfología así mismo busca
asignar individuos no identificados a especies (Newmaster et al. 2006; Lanteri 2007).
Una aplicación importante de los códigos de barras genéticos es identificar

especies que son ilegalmente extraídas de su hábitat, ya sea el tráfico de plantas de
ornato o tala clandestina de madera. En el caso de especies protegidas se puede
identificar el material bajo investigación al nivel de especie, o en algunos casos, hasta
individuos (Gernandt 2009). Pueden también ayudar a asignar especímenes
desconocidos a especies conocidas en los casos en que la morfología no es suficiente
(en especímenes inmaduros, parciales o dañados) o es dudosa (como en las especies
con dimorfismo sexual), o asociar los distintos estados de desarrollo ontogénico de la
misma especie (Lanteri 2009). Adicionalmente los códigos de barras genéticos ayudan
a descubrir especies cripticas (Monaghan et al. 2005; Hebert et al. 2004; Moritz y
Cicero, 2004; Schindel y Miller; 2005), o como un complemento en el proceso de
delimitar especies (Schindel y Miller; 2005) y ser una herramienta para ayudar al
taxónomo en su tarea de realizar identificaciones (Savolainen et al. 2005), de igual
manera ha sido eficiente en el monitoreo de parásitos vectores de enfermedades
(Besansky et al. 2003), de insectos invasores que podrían dar lugar a plagas
(Armstrong y Ball 2005) y ha sido exitoso en la elaboración de inventarios
entomológicos (Monaghan et al. 2005).
12
Los atributos deseables de un código de barras de DNA incluyen los siguientes
aspectos (Gernandt 2009; ver http://www.rbgkew.org.uk/barcoding/rationale.html):
1. Suficiente variación para permitir la identificación de las especies pero con un

nivel bajo de variación intraespecífica.
2. Amplificación y secuenciación universal con primers estandarizados.
3. Técnicamente simple de secuenciar (e.g., sin problemas de copias múltiples
parálogas).
4. Suficientemente corto para secuenciar en una reacción con la tecnología actual.
5. Fácilmente alineable (i.e., teniendo más polimorfismos debidos a substituciones
que a inserciones/deleciones).
6. Fácilmente recuperable de ejemplares de herbario y otras muestras degradadas
o fragmentarias (e.g., material forense).
La identificación de especies a través de los códigos de barras genéticos es lograda

por medio de la obtención de una secuencia corta de ADN de una parte estándar del
genoma (como lo es una región especifica de un gen) del espécimen bajo investigación,
la secuencia de código de barras de cada especie desconocida es comparada
posteriormente dentro de una biblioteca de secuencias de códigos de barras derivadas
de individuos de identidad conocida y finalmente el espécimen es identificado si su
secuencia coincide estrechamente con alguna otra de la biblioteca de códigos de barras
(Hajibabaei et al. 2007).
A pesar de los beneficios potenciales de los códigos de barras genéticos tanto a

profesionales como a usuarios de la taxonomía, se ha creado polémica en algunos
círculos científicos (Dasmahapatra y Mallet 2006), algunos de ellos caracterizan a los
códigos de barras genéticos como “anti-taxonomía”, argumentando que señalara la
muerte de un sistema creado hace 250 años. Aunque se cree que esta oposición se
debe a conceptos erróneos sobre el código de barras genético (Hebert y Gregory 2005).
13
El sistema de identificación por códigos de barras genéticos está basado en lo
que en esencia es un carácter único complejo (la secuencia parcial de un gen) por lo
que sus resultados son vistos como poco confiables y propensos a errores de
identificación (Dasmahapatra y Mallet 2006).
La región de ADN que se ha utilizado en el código de barras de animales es el

gen mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad 1, también llamado CO1 o cox1
(Hebert et al. 2003; Chase et al. 2007; Hajibabaei et al. 2007), sin embargo en plantas
la tasa de cambio ha sido más lenta (Kress et al. 2005; Newmaster et al. 2006;
Whitlock et al. 2010). En plantas, la falta de consenso en la elección de un código de
barras genético adecuado impidió la elección del o los marcadores adecuados
(Hollingsworth et al. 2009; Kress et al. 2005). Los bajos niveles de sustitución del ADN
mitocondrial en plantas han hecho que no sean buenos candidatos para discriminar
individuos a nivel de especie, asimismo las cuestiones técnicas con el uso de regiones
nucleares provocó que se haya centrado la atención en genomas de cloroplastos como
una mejor opción de trabajo en la actualidad (Newmaster et al. 2008), ya que el ADN de
cloroplasto es de tamaño pequeño, posee un alto número de copias y tiene una
estructura simple además, comparado con los genomas mitocondriales y nucleares, el
contenido y la estructura de los genes de cloroplasto son más conservados lo que
facilita el diseño de primers específicos y al ser de herencia materna, no tiene
recombinación genética; de esta manera sus secuencias son útiles para estimar
relaciones filogenéticas en plantas (Wu et al. 2010; Avise 2009). Dado que el objetivo
de los códigos de barras genéticos es facilitar la identificación de muestras, incluyendo
fragmentos aislados de tejido, entonces los loci seleccionados deben de identificar
fácilmente en todos los grupos de las plantas (Kress y Erickson, 2008).
Se han propuesto un gran número de regiones del genoma de cloroplasto como

posibles candidatos para obtener códigos de barras en plantas, pero ninguno ha sido
aceptado ampliamente por la comunidad científica (Pennisi 2007; Kress y Erickson
2008), pero después de una evaluación, se alcanzó un consenso en el 2009 por el
14
conjunto multinacional de investigadores de códigos de barras genético para plantas
(CBOL Plant Working Group 2009) quienes seleccionaron a dos loci como código de
barras genéticos, eligiendo fragmentos fácilmente amplificables por PCR para los genes
maturasa K (matK) y la subunidad larga de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa
oxigenasa (rbcL). Ambas regiones junto a trnH-psbA recientemente han sido usadas en
análisis filogenéticos moleculares, teniendo gran éxito en la sistemática molecular
vegetal (CBOL Plant Working Group, 2009; Asahina et al. 2010). De acuerdo con el
CBOL, este código de barras genético en plantas puede ser complementado con un
grupo de tres regiones no codificantes, también del genoma de cloroplasto ( atpF-atpH,
psbK-psbL y trnH-psbA) los cuales ya habían sido considerados ya sea por separado o
en conjunto en varios estudios de códigos de barras genéticos. (CBOL Plant Working
Group 2009).
2.3 Métodos moleculares
Las células vegetales contienen tres genomas distintos: el genoma de

cloroplasto, el genoma mitocondrial y en el nuclear; el genoma de la mitocondria y del
cloroplasto son de herencia uniparental, generalmente materna en los angiospermas
mientras que el genoma nuclear es biparental (Avise 2009; Judd et al. 2002). Los tres
genomas difieren entre sí en su tamaño. El genoma del núcleo es el más grande y
puede contener millones de kilobases; mientras que el genoma mitocondrial incluye
varios cientos de kilobases de ADN (200-2500 kb), es pequeño en relación al genoma
nuclear (Judd et al. 2002). El genoma del cloroplasto es el más pequeño de los tres,
varía moderadamente de tamaño entre las especies y va de los 120 a 217 kb (Avise
2009). Al igual que las eubacterias de las que se derivan, la mitocondria y el cloroplasto
tienen un genoma circular. El genoma mitocondrial se rearregla con frecuencia, así
como se rearregla en muchas formas que pueden ocurrir en la misma célula. Esto
significa que el rearreglo del genoma se produce tan a menudo en las plantas que no
15
caracteriza o diferencia especies o grupos de especies y por lo tanto, no es
especialmente útil para inferir relaciones filogenéticas (Judd et al. 2002).
El cloroplasto es estable dentro de las células como dentro de las especies. Se

caracteriza por la presencia de dos regiones que codifican los mismos genes, pero en
direcciones opuestas conocidos como secuencias invertidas (IR) de 20 a 30 kb
separadas por una región corta (SSC) y una región larga (LSC) de copia sencilla (Wu et
al. 2010; Judd et al. 2002).
El ADN de cloroplasto es circular y de doble hebra y dentro del citoplasma de la

célula se pueden encontrar muchas copias del mismo (Avise 2009). Este ADN está
organizado en unidades discretas llamadas nucleoides, localizadas en el estroma del
cloroplasto y asociados con las membranas de los tilacoides (Huertas de Ordóñez 2003).
La molécula contiene cerca de 120 genes que codifican ARN de transferencia y ARN
ribosomal, más numerosos polipeptidos que participan en síntesis de proteínas y en la
fotosíntesis (Avise 2009).
El gen matK (maturasa K) o conocido también como orfK se ha surgido

recientemente como un gen valioso debido a su alta señal filogenética comparada con
otros genes usados en este campo (Barthet y Hilu 2007). Este gen universalmente
presente en las plantas terrestres (Wicke y Quandt, 2009), es de aproximadamente
1,500 pb y está localizado en el intron de grupo II entre los exones de trnK 5ý 3én la
copia grande del genoma del cloroplasto (Barthet y Hilu, 2007) Las maturasas son
enzimas que catalizan la remoción de intrones no catalíticos de RNAs prematuros como
los transcritos de ARN para los genes trnK, trnA, trnI, rps12, rpl2 y atpF además de ser
requeridos para la función normal de la fotosíntesis y para la postranscripción como
factor de empalme en los cloroplastos. (Barthet y Hilu 2007; Hao et al. 2010).
16
Los altos niveles de sustitución de nucleótidos en la primera, segunda y tercera
posición del codón provoca que matK evolucione más rápidamente en comparación a
otros genes de plastidos como rbcL (Wicke y Quandt 2009) lo que proporciona un buen
número de sitios informativos variables con buena señal filogenética resultando útil en
la determinación de historias evolutivas y relaciones filogenéticas en varios niveles
taxonómicos (Hao et al. 2010; Carrión 2009).
El gen rbcL codifica la subunidad larga de la enzima fotosintética ribulosa-1,5-

bifostato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO), que es el mejor aceptor de carbono en
todos los eucariontes fotosintéticos y cianobacterias. A nivel de familia y rangos
taxonómicos más altos, rbcL es el gen más utilizado para construir filogenias y es uno
de los segmentos más frecuentemente secuenciados del ADN de cloroplasto (Penjor et
al. 2010). Este gen fue elegido porque es universal entre las plantas, es bastante largo
(1428 pb), no presenta problemas de alineación y amplificación, es parte del cloroplasto
y está presente en muchas copias de la célula. (Newmaster et al. 2006; Judd et al.
2002).
El primer paso para obtener una secuencia de ADN consiste en la extracción de

ADN y purificación de ADN mientras que el segundo paso reside en amplificar
fragmentos de ADN por medio de PCR (Posik et al. 2007). Posteriormente, se revisan
los fragmentos de ADN obtenidos por medio de la aplicación de un campo eléctrico en
geles de agarosa, método conocido como electroforesis (Asuar 2007; Gutiérrez y
Valdez 2008). La agarosa forma una especie de red con agujeros de tamaño diferente,
por la cual pasan los fragmentos de ADN provocado por una corriente eléctrica hacia el
polo positivo ya que el ADN tiene carga negativa por la presencia de grupos fosfato, de
esta manera tiende a moverse hacia el polo positivo, formando un patrón de bandas
característico en estos geles. (Asuar 2007; Gutiérrez y Valdez 2008). En esta técnica,
las moléculas de tamaño menor se mueven a través del gel con mayor rapidez y los
más grandes se irán retrasando, lo que permite la separación de una mezcla de ácidos
nucleicos en función de su tamaño (Posik et al. 2007; Asuar 2007). Las bandas nos
17
indican el éxito en la obtención del producto y se procede a su secuenciación.
Posteriormente un programa informático ordena estas cadenas, lo cual permite saber la
posición de cada nucleótido en el fragmento del gen por estudiar (Gutiérrez y Valdez
2008).
Para determinar los polimorfismos en las secuencias utilizadas como códigos de

barras genéticos se calculan las distancias, es decir se mide el grado de disimilitud
entre dos taxa o dos genes, la distancia se refiere al número de posiciones en que las
comparaciones por pares difieren, esto se puede expresar en porcentaje o un número
entero (Forey et al. 1993). Estos análisis de distancia se pueden representan
gráficamente en un árbol Neighbor-Joining (NJ), este método utiliza un algoritmo en el
cual se construye un árbol basado en el principio de examinar las posibles topologías o
patrones de ramificación que puedan estar cerca del árbol real y escoger el que
represente la distancia más corta (Saitou y Nei 1987), de igual forma se puede hacer
una evaluación de distancias genéticas dentro y entre las especies (Hajibabaei et al.
2007), calcular divergencias entre la secuencia problema y las conocidas y conocer los
valores de éxito en la identificación de especies (Ebihara et al. 2010).
18
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general:
 Obtener secuencias de ADN como códigos de barras genéticos para veinte

especies de orquídeas veracruzanas que se encuentren en alguna categoría de
riesgo en la NOM-059-SEMARNAT-2001.
3.2 Objetivos particulares:
 Secuenciar las regiones de ADN de cloroplasto rbcL y matK propuestas por

CBOL Plant Working Group como los códigos de barras genéticos en plantas.
 Calcular el grado de disimilitud entre cada secuencia y representándolos

esquemáticamente en un árbol Neighbor-Joining y en una matriz de distancia.
 Incrementar la base de datos de MEXBOL con códigos de barras genéticos de

orquídeas, de esta forma estarán disponibles para que puedan ser usadas por
autoridades relacionadas con la regulación del tráfico ilegal de especies.
19
4. ANTECEDENTES DE LOS CÓDIGOS DE BARRAS GENÉTICOS
Kress et al. (2005), probaron el funcionamiento de las regiones de los locus trnK-rps16,
trnH-psbA, rpl36-rps8, atpB-rbcL, ycf6-psbM, trnV-atpE, trnC-ycf6, psbM-trnD y trnL-F;
mientras que ITS y rbcL fueron usados como base para las comparaciones de las
regiones analizadas, en su análisis trabajaron con 99 especies de 80 géneros y 53
familias. trnH-psbA resultó la mejor región de ADN para utilizarse como código de
barras genético ya que tiene una buena longitud, una alta variación intraespecífica, se
pueden utilizar primers universales por su facilidad de amplificación y su alta
discriminación y esto hace que tenga un gran potencial para la discriminación a nivel de
especie. Aunque es probable que se requiera de más de un locus para la discriminación
a nivel de especie en todas las especies de plantas con flores por lo que ITS y trnH-
psbA son un buen punto de partida para realizar análisis a gran escala como código de
barras genéticos (Tabla 2).
Kress y Erickson (2007), evaluaron un sistema global de código de barras genético

para plantas terrestres mediante la comparación de la aplicación universal y grado de
divergencia en la secuencia de nueve loci candidatos a código de barraras, incluyendo
regiones codificantes (rbcL, matK, rpoC1, rpoB2, accD, ycf5 y ndhJ) y no codificantes
(trnH-psbA e ITS1) de manera individual así como en pares a través de un grupo de 48
géneros diversos; mencionan que trnH-psbA es el candidato individual más viable a ser
utilizado como código de barras en plantas pero enfatizaron que un solo locus no puede
discriminar entre especies en más del 79% de los géneros, mientras que la
discriminación aumentó cuando el espaciador trnH-psbA fue emparejado con uno de los
tres locus codificantes (rbcL ó rpoC1 ó rpoB2) y teniendo un 100 % de éxito en la
amplificación en PCR. Este estudio apoyó la observación de que la combinación de una
región no codificante como el espaciador trnH-psbA junto con una porción del gen
codificante rbcL pueden identificar y discriminar correctamente entre especies
relacionadas, ya que rbcL a diferencia de rpoC1 y rpoB2, tiene una fácil y exitosa
amplificación (92.7%) además de su probada habilidad de identificar taxa a nivel de
20
género y familia convirtiéndolo en la opción más apropiada para ser un código de barras
de dos locus para las plantas terrestres que proporciona la universalidad necesaria y la
discriminación de especies (Tabla 2).
Lahaye et al. (2008), realizaron un análisis de ocho regiones potenciales como códigos
de barras genéticos (accD, ndhJ, matK, trnH-psbA, rbcL, rpoB, rpoC1 y ycf5) para más
de 1,600 muestras de angiospermas y para más de 1000 especies de orquídeas. trnH-
psbA es la región de ADN que muestra una mayor variación interespecífica seguida de
matK siendo estas dos regiones los mejor candidatos a ser códigos de barras
genéticos, sin embargo, siendo que el exón 5’ de matK es fácil de amplificar y de
alinear, este gen es propuesto como un código de barras genético universal en plantas.
La región de trnH-psbA funcionó casi igual a matK pero tiene un patrón de evolución
molecular complejo por lo que es propuesto como un complemento alternativo a matK
(Tabla 2).
Newmaster et al. (2008), realizaron un estudio para determinar la eficacia de seis

regiones codificantes (UPA, rbcL, matK, rpoB, rpoC1 y accD) y una no codificante (trnH-
psbA) de ADN de cloroplasto para obtener código de barras en el género Compsoneura
usando tanto una sola región como varios genes. Teniendo como resultados que cinco
regiones fueron predominantemente invariantes entre especies (UPA, rpoB, rpoC1,
accD y rbcL) y dos regiones (matK y trnH-psbA) tuvieron variación significativa y
demostraron ser candidatos para ser el cogido de barras genético de la nuez moscada.
También se demostró que dos genes, una región moderadamente variante (matK) y
una región más variable (trnH-psbA) ofrece una resolución entre todas las especies de
Compsoneura (Tabla 2).
Carrión, J. M. D. C. (2009), realizó un proyecto para determinar un código de barras

para 22 especies de orquídeas ecuatorianas analizando las regiones matK, ITS y trnL-
F. Examinaron las tres regiones para las 22 especies y obtuvieron 14 secuencias para
ITS, 13 para matK y 16 para trnL-F. No se obtuvieron las tres regiones para cada
individuo teniendo una limitante para la identificación rápida de estas. matK presenta
21
altos niveles de variación para la discriminación a nivel de especie en plantas. Por lo
tanto este trabajo concluye que matK es la región más apta para considerarla como
código de barras genético por su alta variabilidad (Tabla 2).
Hollingsworth et al. (2009), evaluaron siete regiones de cloroplasto (rpoC1, rpoB, rbcL,
matK, trnH-psbA, atpF-atpH, psbK-psbI) como candidatos para código de barras en tres
grupos de plantas: Inga (angiosperma, Fabaceae), Araucaria (gimnosperma,
Araucariaceae) y Asterella (hepática). Un locus tuvo la mayor potencialidad para
discriminar a nivel de especie con un 90% de éxito y fue para rbcL en hepáticas y fue el
locus con más éxito con una estimación superior al 42% de especies discriminadas.
Con un código de barras multilocus, el mayor éxito para la discriminación de especies
en Araucaria fue rpoC1 + rpoB + matK con 32%, mientras que en Inga fue 69% con los
locus rpoC1 + matK + rbcL. En cuanto al porcentaje de especies totales discriminadas,
las combinaciones rbcL + trnH-psbA + matK y también rpoC1 + rbcL + matK mostraron
cerca del 60% de las especies potencialmente discriminadas. Por lo que proponen que
un código de barras genético multilocus es la solución más apropiada, sugiriendo que
una combinación de rbcL, rpoC1, matK y trnH-psbA como los candidatos a ser código
de barras genético en plantas (Tabla 2).
CBOL Plant Working Group (2009), comparó el desempeño de siete importantes

candidatos de regiones de ADN de plastidos (atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1,
psbK-psbl y trnH-psbA). rbcL es un gen con alta universalidad pero no destaca por su
poder discriminatorio mientras que matK tiene alto nivel de discriminación entre las
angiospermas pero no tiene primers universales reconocidos por todos los grupos de
plantas, con esta región lograron un 90% de éxito en la amplificación y secuenciación
usando un par de primers y en gimnospermas (83%) y en criptógamas (10%) fue
limitado aun cuando varios conjuntos de primers se usaron. Las secuencias de trnH-
psbA resultaron de baja calidad debido a la presencia de largas repeticiones de
mononucleótidos que generen errores de lectura en los secuenciadores, finalmente
recomiendan que la combinación de dos locus: rbcL y matK como código de barras
genético en plantas debido a que rbcL tiene secuencias de calidad, son fácilmente
22
recuperables a través de linajes filogenéticamente divergentes y se desempeña bien en
pruebas de discriminación en combinación con otros loci. Estos dos locis tuvieron un
72% de éxito en la discriminación de especies (Tabla 2).
Asahina et al. (2010), emplearon la técnica de códigos de barras genéticos para la

identificación de cinco especies de orquídeas pertenecientes al género Dendrobium,
estas especies han sido empleadas con fines medicinales pero la dificultad de su
identificación por métodos tradicionales ha impedido la amplitud de su uso en la
actualidad. Se emplearon secuencias de los genes rbcL y matK como códigos de
barras. Los resultados revelaron que los datos originados de matK han distinguido con
éxito a cada especie (Tabla 2).
Nicolalde et al. (2010), examinaron el desempeño de cuatro regiones codificantes del

cloroplasto (matK, rbcL, rpoC1 y rpoB), tres regiones espaciadoras no codificantes
(atpF-atpH, psbK-psbI y trnH-psbA) y la región nuclear ITS como códigos de barras
genéticos para tres géneros de cícadas (Ceratozamia, Dioon y Zamia). En el caso de
Ceratozamia fueron necesarias cuatro regiones de cloroplasto y una región nuclear
para lograr la identificación de más del 70% de especies, en contraste, la combinación
de atpF-atpH + psbK-psbI y la combinación de atpF-atpH + psbK-psbI + rpoC1 + ITS
fueron necesarios para llegar al 79% y 75% de identificación de especies en Dioon y
Zamia, respectivamente. En este estudio rbcL mostro gran éxito en la amplificación pero
mostró una baja variación nucleotídica dentro de los géneros, matK se excluyó debido a
que no amplificó para las especies seleccionadas, por lo que el código de barras
estándar propuesto por CBOL Plant Working Group es inadecuado en cícadas, psbK-
psbI fue exitoso en la amplificación y tuvo buenos niveles de variación, sin embargo no
funcionó en todos los grupos analizados aun así esta región es sugerida que sea
incluida en la búsqueda de un sistema de código de barras genético en el caso de
cícadas. Ninguna de las combinaciones resulto ser óptima como potenciales códigos de
barras para cícadas (Tabla 2).
23
Tabla 2. Esquema sintético de trabajos comparativos de varios locus propuestos como códigos de barras
genéticos en plantas.
Estudio Regiones comparadas Regiones recomendadas

Kress et al. 2005 atpB-rbcL, ITS, psbM-trnD, trnC-ycf6, ITS + trnH-psbA
trnH-psbA, trnL-F, trnk-rps16, trnV-atpE,
rpl36-rps8, ycf6-psbM
Kress y Erickson accD, ITS1, ndhJ, matk, trnH-psbA, rbcL, rbcL + trnH-psbA
2007 rpoB, rpoC1, ycf5
Sass et al. 2007 accD, ITS, ndhJ, matk, trnH-psbA, rpoB, ITS
rpoC1, ycf5
Chase et al. 2007 rbcL, trnH-psbA, rpoC1, matK, ITS, rpoB matK + rpoC1 + trnH-psbA ó matK +
rpoC1 + rpoB
Newmaster et al. UPA, rbcL, matK, rpoB, rpoC1, trnH-psbA, matK + trnH-psbA
2008 accD
Lahaye et al. 2008 accD, ndhJ, matK, trnH-psbA, rbcL, rpoB, matK (o matK, trnH-psbA)
rpoC1 y ycf5
Fazekas et al. 2008 cox1, 23S rDNA, rpoB, rpoC1, rbcL, Seleccionar 3 o 4 regiones de: rbcL,
matK, trnH-psbA, atpF-atpH, psbK-psbI rpoB, matK, trnH-psbA, atpF-atpH
Carrión 2009 matK, ITS y trnL-F matK
Hollingsworth et al. rpoC1, rpoB, rbcL, matK, trnH-psbA, atpF- rbcL+poC1+matK+trnH-psbA
2009 atpH, psbK-psbI
CBOL Plant atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, rbcL+matK
Working Group psbK-psbl y trnH-psbA)
2009
Asahina et al. 2010 rbcL, matK matK
Nicolalde et al. matK, rbcL, rpoC1, rpoB, atpF-atpH, Ninguna región fue adecuada para
2010 psbK-psbI y trnH-psbA, ITS cícadas
24
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Muestreo de material biológico
Se recolectó material de 20 especies de Orchidaceae distribuidas en Veracruz

(Anexo 2). Por medio de la consulta a la base de datos de Flora de Veracruz se
detectaron las localidades donde se han registrado previamente las especies incluidas
en la Norma Mexicana (NOM059-SEMARNAT-2001). Algunos ejemplares fueron
colectados en campo directamente por este proyecto, otras muestras se tomaron de
especímenes ya identificados de la colección de orquídeas del jardín botánico
Francisco Javier Clavijero del Instituto de Ecología A.C. Se incluyó a Anathallis
abbreviata (Schltr.) Pridgeon & M. W. Chase reportada recientemente como nuevo
registro para Veracruz (Castañeda-Zárate et al. en prensa). Se obtuvieron ejemplares
de herbario como muestras de respaldo que fueron resguardados en el herbario XAL
(Anexo 1). Las especies utilizadas en este estudio se incluyen en la tabla 3.
25
Tabla 3. Lista de Orchidaceae incluidas en la aplicación de código de barras genéticos y el
código que se le asignó en los análisis.
Especie Código
Rhynchostele cordata (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar 1M
Rhynchostele rossii (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar 2M
Rhynchostele beloglossa (Rchb. f.) Dressler & N. H. Williams 3M
Oncidium incurvum Barker ex Lindl. 4M
Stanhopea tigrina Bateman 5M
Stanhopea oculata (Lodd.) Lindl. 6M
Cypripedium irapeanum Lex. 7M
Trichocentrum stramineum (Bateman ex Lindl.) M. W. Chase & 8M

N. H. Williams
Aspidogyne stictophylla (Schltr.) Garay 9M
Acineta barkeri (Bateman) Lindl. 10M
Anathallis abbreviata (Schltr.) Pridgeon & M. W. Chase 11M
Vanilla planifolia Jacks. 12M
Barbosella prorepens (Rchb. f.) Schltr. 13M
Chysis bractescens Lindl. 14M
Cycnoches ventricosum Bateman 15M
Mormodes maculata (Klotzsch) L. O. Williams var. unicolor 16M

(Hook.) L. O. Williams.
Prosthechea vitellina (Lindl.) W. E. Higgins. 17M
Lacaena bicolor Lindl. 18M
Euchile citrina (La Llave & Lex) Withner. 19M
Euchile mariae (Ames) Withner. 20M
26
5.2 Extracción de ADN y secuenciación
El ADN total fue aislado a partir segmentos de hoja de aproximadamente 1 cm 2

de tejido fresco o conservado en silica gel usando el método de extracción de ADN con
CTAB (Doyle y Doyle, 1987., ver anexo 4). Los locus utilizados en este trabajo fueron
los propuestos por CBOL Plant Working Group (2009), La región de rbcL fue
amplificada y secuenciada empleando los primer rbcLa_f (Erickson et al. 2008; CBOL
Plant Working Group 2009) y rbcLajf-634R (Fazekas et al. 2008; CBOL Plant Working
Group 2009); en el caso de matK se usaron los primers Xf y 5r (Ford et al.2009; CBOL
Plant Working Group 2009). El volumen total de la reacción de PCR fue de 25.0 µL. las
condiciones de PCR variaron para cada primer empleado, en matK fue 1 min a 94°C, 40
ciclos de 30 seg a 94°C, 40 seg a 72°C y 5 min a 72°C, para rbcL 1 min a 94°C, 40
ciclos de 30 seg a 94°C, 40 seg a 50°C, 72°C a 40 seg y 5 min a 72°C. Los productos
de la amplificación fueron visualizados por medio de una electroforesis en gel de
agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio, los productos de la PCR fueron
purificados usando QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, California, USA., ver anexo
5). Posteriormente fueron limpiados (Anexo 6) y se realizo la secuenciación automática
usando Taq BigDay Terminator cycle Sequencing Kit v.3.1 8 (Perkin Elmer Applied
Biosystems, Foster City, California, U.S.A.), las condiciones de la secuenciación fueron
las mismas para rbcL y matK.
5.3 Visualización y alineamiento de secuencias
Los cromatogramas fueron editados y ensamblados usando el software

Sequencher 4.2 (Genes Codes, Ann, Arbor, Michigan) y alineados manualmente en Se-
Al v. 2.0a11 (Rambaut 2002) en donde también se conjuntaron las matrices de datos
(Anexo 3). Posteriormente fueron grabadas en formato FASTA (anexo 7 y anexo 8)
para la realización de análisis.
27
Se utilizo la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) de GenBank para realizar una comparación de las
regiones matK, rbcL y matK+ rbcL para determinar las posibles especies a las que
pertenecen las secuencias problemas que se obtuvieron.
5.4 Análisis
Para determinar si las secuencias de rbcL y de matK son útiles para identificar
las especies estudiadas se llevaron a cabo los siguientes análisis:
1. Se efectúo un análisis de distancia por medio de un árbol Neighbor-Joining (NJ)

para rbcL, matK y la región 2-locus matK + rbcL usando el modelo de Kimura-2
parámetros y se procedió a calcular el número de sustituciones de bases por sitio
entre las 20 secuencias para matK, rbcL y matK + rbcL. Ambos análisis se
realizaron en el software MEGA5 (Tamura et al. 2011).
2. Se construyó una matriz de distancia con los mismos parámetros del NJ para
determinar el polimorfismo de bases útil para identificar a las especies de
Orchidaceae estudiadas.
6. RESULTADOS
Los productos obtenidos de PCR fueron de buena calidad para los 20
especímenes, logrando un éxito del 100% tanto para matK como para rbcL. Los
productos amplificados fueron exitosamente purificados y secuenciados para matK y
rbcL (100%).
La comparación de las secuencias de orquídeas en la base de datos de

GenBank usando BLAST (GenBank nucleotide database) mostró las secuencias más
similares a las secuencias analizadas. Es importante mencionar que en la base de
datos de GenBank no están incluidas las secuencias de todas las especies que se
utilizaron en este trabajo.
28
Tabla 4. Secuencias de la región del gen de cloroplasto matK con mayor similitud a las secuencias de
Orchidaceae en la comparación a través de BLAST.
(*) Secuencias de orquídeas que no están registradas en la base de datos de GenBank.
N° Taxa Resultado en BLAST Numero de Similitud

accesión (%)
a GenBank
M1 Rhynchosthele cordata Rhynchostele cordata FJ565145.1 776/781 (99%)
M2 Rhynchosthele rosii Rhynchostele rossii FJ563880.1 761/764 (99%)
M3 Rhynchosthele beloglossa Rhynchostele beloglossa FJ564740.1 765/767 (99%)
M4 Oncidium incurvum Oncidium incurvum FJ563954.1 790/798 (98%)
M5 Stanhopea tigrina Stanhopea tigrina AY368430.1 786/794 (98%)

M6 Stanhopea oculata* Stanhopea jenischiana FJ565129.1 789/799 (98%)
M7 Cypripedium irapeanum* Cypripedium passerinum AJ581441.1 701/722 (97%)
M8 Trichocentrum Trichocentrum stramineum FJ564842.1 779/793 (98%)

stramineum
M9 Aspidogyne stictophylla* Goodyera brachyceras AM902104.1 765/778 (99%)
M10 Acineta barkeri * Goodyera brachyceras AM902104.1 761/801 (95%)

M11 Anathallis abbreviata* Pleurothallis cardiantha AF265462.1 723/753 (96%)
M12 Vanilla planifolia Vanilla planifolia AF263687.1 777/806 (96%)
M13 Barbosella prorepens Barbosella prorepens EU214140.1 729/736 (99%)
M14 Chysis bractescens Chysis bractescens AF263640.1 771/779 (98%)

M15 Cycnoches ventricosum* Cycnoches sp. EF079264.1 737/763 (96%)
M16 Mormodes maculata Barbosella geminata EU214308.1 694/754 (92%)

var. Unicolor *
M17 Prosthechea vitelina Prosthechea vitellina AY396129.1 771/776 (99%)
M18 Lacaena bicolor* Prosthechea vitellina AY396129.1 792/806 (98%)
M19 Euchile citrina Euchile citrina AY396106.1 788/799 (98%)

M20 Euchile mariae Euchile mariae AF263795.1 781/790 (98%)
Para el fragmento de matK (Tabla 4) la base de datos de GenBank tiene

secuencias para 12 especies y careciendo de las restantes ocho que están incluidas en
el trabajo, sin embargo pudieron corresponder a sus respectivos géneros excepto para
Lacaena bicolor, Mormodes maculata, Acineta barkeri y Anathallis abbreviata.
29
Tabla 5. Secuencias de la región del gen de cloroplasto rbcL con mayor similitud a las secuencias de
Orchidaceae en la comparación a través de BLAST.
N° Taxa Resultado Numero de Similitud

accesión (%)
en BLAST
a GenBank
M1 Rhynchosthele cordata* Oncidium Gower GQ324949.1 599/601 (99%)
M2 Rhynchosthele rossii* Oncidium Gower GQ324949.1 610/615 (99%)
M3 Rhynchosthele beloglossa* Oncidium Gower GQ324949.1 609/611 (99%)

M4 Oncidium incurvum* Oncidium Gower GQ324949.1 590/593 (99%)
M5 Stanhopea tigrina* Stanhopea ecornuta AF074230.1 585/587 (99%)

M6 Stanhopea oculata* Stanhopea ecornuta AF074230.1 592/595 (99%)
M7 Cypripedium irapeanum* Cypripedium acaule EF370111.1 607/610 (99%)
M8 Trichocentrum stramineum* Guadua sp. AM849367.1 578/605 (95%)

M9 Aspidogyne stictophylla* Gonatostylis vieillardii FJ571328.1 607/616 (98%)
M10 Acineta barkeri* Acineta chrysantha AF074102.1 543/552 (98%)
M11 Anathallis abbreviata* Isochilus amparoanus AY368361.1 597/599 (99%)
M12 Vanilla planifolia* Cephalanthera rubra FJ454876.1 533/545 (97%)
M13 Barbosella prorepens* Dendrobium ochreatum HM055132.1 602/609 (98%)
M15 Cycnoches ventricosum* Galeandra devoniana AF074171.1 602/606 (99%)

M16 Mormodes maculata Mormodes sp AF074196.1 596/598 (99%)
var. unicolor*
M17 Prosthechea vitelina* Dendrobium densiflorum FJ216580.1 605/611 (99%)

M18 Lacaena bicolor* Flickingeria albopurpurea FJ216574.1 611/616 (99%)
M19 Euchile citrina* Dendrobium densiflorum FJ216580.1 607/610 (99%)
M20 Euchile mariae * Dendrobium densiflorum FJ216580.1 611/614 (99%)
En el caso de rbcL (Tabla 5) no se encontraron secuencias de las orquídeas

analizadas en la base de datos de GenBank, excepto para Chysis bractescens donde la
coincidencia con la secuencia problema fue del 99%, para Trichocentrum stramineum el
resultado de BLAST sugiere que su secuencia es semejante en a Guadua sp
(Poaceae).
30
Se realizó una segunda comparación utilizando BLAST empleando las
secuencias concatenadas de matK + rbcL como un código de barras genético
multilocus, en este caso los resultados de la búsqueda fueron los mismos a los
obtenidos por matK de forma individual (Tabla 4), excepto para la secuencia de
Mormodes maculata var. unicolor donde en BLAST la asemeja a un 100% con la
secuencia de Cycnoches egertonianum (Tabla 6).
Tabla 6. Secuencias concatenadas matK + rbcL con mayor similitud a las secuencias de Orchidaceae en
la comparación a través de BLAST.
N° Taxa Resultado en BLAST Numero de Similitud

accesión (%)
a GenBank
M1 Rhynchosthele cordata Rhynchostele cordata FJ565145.1 776/781 (99%)
M2 Rhynchosthele rosii Rhynchostele rossii FJ563880.1 761/764 (99%)
M3 Rhynchosthele beloglossa Rhynchostele beloglossa FJ564740.1 765/767 (99%)
M4 Oncidium incurvum Oncidium incurvum FJ563954.1 790/798 (98%)
M5 Stanhopea tigrina Stanhopea tigrina AY368430.1 786/794 (98%)

M6 Stanhopea oculata* Stanhopea jenischiana FJ565129.1 789/799 (98%)
M7 Cypripedium irapeanum* Cypripedium passerinum AJ581441.1 701/722 (97%)
M8 Trichocentrum Trichocentrum stramineum FJ564842.1 779/793 (98%)

stramineum
M9 Aspidogyne stictophylla* Goodyera brachyceras AM902104.1 765/778 (99%)
M10 Acineta barkeri * Goodyera brachyceras AM902104.1 761/801 (95%)

M11 Anathallis abbreviata* Pleurothallis cardiantha AF265462.1 723/753 (96%)
M12 Vanilla planifolia Vanilla planifolia AF263687.1 777/806 (96%)
M13 Barbosella prorepens Barbosella prorepens EU214140.1 729/736 (99%)

M15 Cycnoches ventricosum* Cycnoches sp. EF079264.1 737/763 (96%)
M16 Mormodes maculata Cycnoches egertonianum. AY368355.1 590/590 (100%)

var. Unicolor *
M17 Prosthechea vitelina Prosthechea vitellina AY396129.1 771/776 (99%)
M18 Lacaena bicolor* Prosthechea vitellina AY396129.1 792/806 (98%)
M19 Euchile citrina Euchile citrina AY396106.1 788/799 (98%)

M20 Euchile mariae Euchile mariae AF263795.1 781/790 (98%)
31
Euchile mariae
Prosthechea vitellina
Euchile citrina
Chysis bractescens
Barbosella prorepens
Anathallis abbreviata
Aspidogyne stictophylla
Cypripedium irapeanum
Lacaena bicolor
Cycnoches ventricosum
Mormodes maculata var. unicolor
Oncidium incurvum
Rhynchostele cordata
Rhynchostele beloglossa
Rhynchostele rossii
Stanhopea oculata
Stanhopea tigrina
Trichocentrum stramineum
Acineta bark eri
Vanilla planifolia
0.005
Figura 1. Árbol Neighbor-Joining del fragmento del gen rbcL, construido usando el modelo Kimura-2
parámetros. Este árbol ilustra el grado de disimilitud para 20 especies de orquídeas. Las unidades
empleadas son el número de sustituciones de base por sitio.
Los árboles Neighbor-Joining (NJ) mostraron el grado de disimilitud entre los

taxa; en el caso de las secuencias de rbcL el valor de disimilitud fue muy bajo como
puede observarse en la tabla 5. Entre los taxa Euchile mariae con Euchile citrina así
como Rhynchostele rossii con Rhynchostele beloglossa no hay disimilitud entre ellas
(Figura 1), por lo tanto no hay variación en sus secuencias para poder diferenciarlas a
nivel de especie.
32
Euchile citrina
Euchile mariae
Lacaena bicolor
Chysis bractescens
Stanhopea oculata
Stanhopea tigrina
Oncidium incurvum
Rhynchostele rossii
Acineta bark eri
Vanilla planifolia
0.02
Figura 2. Árbol Neighbor-Joining del fragmento del gen matK, construido usando el modelo
Kimura-2 parámetros. Este árbol ilustra el grado de disimilitud para 20 especies de orquídeas. Las
unidades empleadas son el número de sustituciones de base por sitio.
En las especies Stanhopea oculata y Stanhopea tigrina hay una disimilitud de

0.002 sustituciones de base por sitio entre sus secuencias, Prosthechea vitellina tiene
una secuencia cercana a las especies del género Euchile (Euchile citrina y Euchile
mariae) teniendo una disimilitud con estas dos especies de 0.002 sustituciones de base,
esta cifra es la misma a la disimilitud existente entre Rhynchostele rossii con R. cordata
y entre R. beloglossa con R. cordata. En los restantes taxa la disimilitud es >0.002 pero
<0.096 sustituciones de base por sitio (Tabla 7).
33
Euchile citrina
Euchile mariae
Lacaena bicolor
Chysis bractescens
Stanhopea oculata
Stanhopea tigrina
Oncidium incurvum
Rhynchostele rossii
Acineta bark eri
Vanilla planifolia
0.01
Figura 3. Árbol Neighbor-Joining de matK+rbcL, construido usando el modelo Kimura-2 parámetros. Este
árbol ilustra el grado de disimilitud para 20 especies de orquídeas. Las unidades empleadas son el
número de sustituciones de base por sitio.
En el caso de las secuencias de matK, el árbol Neighbor-Joining (Figura 2)

muestra mayor disimilitud entre los 20 taxa ya que a diferencia de los datos obtenidos
con rbcL, el fragmento de matK logra discriminar a todos los taxa a nivel de especie.
Entre las especies Euchile mariae y Euchile citrina hubo una disimilitud entre ellas de
0.015 sustituciones de bases, entre Stanhopea tigrina y Stanhopea oculata la disimilitud
es de 0.009, cifra mayor a la obtenida con rbcL. Dentro de los taxa del género
Rhynchostele, matK fue exitoso para separarlas, entre R. beloglossa y R. cordata la
34
disimilitud fue de 0.012, entre R. rossii y R. cordata es de 0.009 y entre R. rossii y R.
beloglossa es de 0.014, en los restantes taxa la disimilitud fue >0.005 pero es <0.220
sustituciones de bases por sitio (Tabla 8).
Tomando en cuenta que CBOL Plant Working Group asignó como código de
barras estándar utilizando dos locus matK+rbcL, se realizó un árbol NJ (Figura 3) con
ambas secuencias concatenadas pudiéndose diferenciar a los taxa analizados. En el
caso de las especies Euchile mariae y Euchile citrina la disimilitud es de 0.008 y entre
Stanhopea oculata y Stanhopea tigrina es de 0.006, ambas cifras resultaron ser
menores a las obtenidas por matK individualmente y mayores a la que dio rbcL de
forma individual para estos taxa. Dentro del grupo de las especies del género
Rhynchostele los valores de disimilitud también fueron bajos en contraste a los
obtenidos de manera individual por matK y mayores a los logrados por rbcL ya que
entre Rynchostele beloglossa y R. cordata la disimilitud fue de 0.008, misma cifra a la
disimilitud existente entre Rhynchostele rossii y R. beloglossa, mientras que entre R.
rossii y R. cordata el valor de disimilitud es de 0.006. En las restantes especies, el valor
de disimilitud entre ellas fue >0.006 y <0.136 (Tabla 9).
35
Tabla 7. Matriz de distancia para el fragmento del gen rbcL. El análisis representa el número de sustituciones de bases por sitio entre las
secuencias de nucleótidos de los 20 taxa analizados usando el modelo Kimura-2 parámetros. Las celdas en color gris señalan que no hay
sustituciones en las secuencias entre esos taxa.
TAXA
TAXA 10M 11M 9M 13M 14M 15M 7M 19M 20M 18M 16M 4M 17M 1M 3M 2M 6M 5M 8M 12M
10M. Acineta barkeri
11M. Anathallis abbreviata 0.061
9M. Aspidogyne stictophylla 0.074 0.034
13M. Barbosella prorepens 0.057 0.011 0.034
14M. Chysis bractescens 0.063 0.011 0.038 0.014
15M. Cycnoches ventricosum 0.057 0.021 0.034 0.021 0.025
7M. Cipripedium irapeanum 0.061 0.014 0.027 0.014 0.018 0.021
19M. Euchile citrina 0.057 0.007 0.031 0.007 0.007 0.022 0.014
20M. Euchile mariae 0.057 0.007 0.031 0.007 0.007 0.022 0.014 0.000
18M. Lacaena bicolor 0.051 0.012 0.029 0.016 0.016 0.009 0.012 0.012 0.012
16M. Mormodes maculata var. unicolor 0.053 0.018 0.031 0.018 0.022 0.004 0.018 0.018 0.018 0.005
4M. Oncidium incurvum 0.051 0.020 0.036 0.023 0.018 0.016 0.020 0.016 0.016 0.011 0.012
17M. Prosthechea vitellina 0.059 0.009 0.032 0.009 0.009 0.023 0.016 0.002 0.002 0.014 0.020 0.018
1M. Rhynchostele cordata 0.049 0.022 0.034 0.022 0.020 0.014 0.022 0.014 0.014 0.012 0.014 0.005 0.016
3M. Rhynchostele beloglossa 0.051 0.020 0.036 0.023 0.018 0.012 0.020 0.016 0.016 0.011 0.012 0.004 0.018 0.002
2M. Rhynchostele rossii 0.051 0.020 0.036 0.023 0.018 0.012 0.020 0.016 0.016 0.011 0.012 0.004 0.018 0.002 0.000
6M. Stanhopea oculata 0.045 0.018 0.034 0.022 0.020 0.014 0.018 0.018 0.018 0.009 0.011 0.009 0.020 0.011 0.009 0.009
5M. Stanhopea tigrina 0.047 0.020 0.036 0.023 0.022 0.016 0.020 0.020 0.020 0.011 0.012 0.011 0.022 0.012 0.011 0.011 0.002
8M. Trichocentrum stramineum 0.078 0.078 0.096 0.083 0.076 0.074 0.074 0.079 0.079 0.065 0.071 0.072 0.080 0.074 0.072 0.072 0.067 0.065
12M. Vanilla planifolia 0.045 0.074 0.092 0.076 0.078 0.070 0.070 0.074 0.074 0.061 0.066 0.072 0.076 0.074 0.072 0.072 0.070 0.068 0.074
36
Tabla 8. Matriz de distancia para el fragmento del gen matK. El análisis representa el número de sustituciones de bases por sitio entre las
secuencias de nucleótidos de los 20 taxa analizados usando el modelo Kimura-2 parámetros.
TAXA
7M. Cypripedium irapeanum 0.075 0.087 0.102 0.087 0.063 0.104
20M. Euchile mariae 0.073 0.066 0.101 0.056 0.037 0.085 0.074 0.015
16m. Mormodes maculata var. unicolor 0.122 0.113 0.155 0.090 0.096 0.137 0.134 0.102 0.104 0.099
37
Tabla 9. Matriz de distancia para matK+rbcL. El análisis representa el número de sustituciones de bases por sitio entre las secuencias de
nucleótidos de los 20 taxa analizados usando el modelo Kimura-2 parámetros.
TAXA
7M. Cypripedium irapeanum 0.069 0.055 0.069 0.055 0.043 0.067
20M. Euchile mariae 0.066 0.040 0.070 0.034 0.024 0.057 0.047 0.008
16M. Mormodes maculata var. unicolor 0.092 0.070 0.098 0.058 0.063 0.076 0.081 0.064 0.065 0.057
38
7. DISCUSIÓN
La información obtenida por Flores-Palacios y Valencia-Díaz (2007), nos da
una idea de la presión de colecta que sufren las poblaciones de orquídeas del centro
de Veracruz por la colecta ilegal; muchas orquídeas listadas en la NOM-059-
SEMARNAT-2001 actualmente siguen sufriendo de la extracción de sus hábitats
naturales. Doce especies protegidas propias de la zona central del estado sufren
una fuerte demanda en el mercado ilegal, principalmente especies incluidas en los
géneros Acineta, Mormodes, Oncidium, Rhynchostele y Stanhopea que sobresalen
del resto de los géneros por sus llamativas flores. Muchas de especies de estos
géneros tienen poblaciones formadas por pocos individuos como Acineta barkeri lo
que las hace más propensas a desaparecer en un menor tiempo. En el caso de
orquídeas terrestres como Aspidogyne stictophylla que carecen de interés hortícola,
sufren una disminución crítica de sus poblaciones debido a la pérdida de sus áreas
de distribución natural ya que como mencionan Pillon y Chase (2006) la mayor parte
de estas orquídeas son incapaces de sobrevivir en ambientes perturbados e
inclusive son imposibles de mantener en cultivo fuera de sus hábitats naturales como
el caso de Cypripedium irapeanum. Por lo anterior es importante implementar
métodos eficientes que permitan controlar el tráfico de especies protegidas y un
buen punto de inicio es llevar a cabo identificaciones de material biológico aplicando
herramientas que faciliten esta tarea como lo es el código de barras genético. Así
estos medios de identificación pueden utilizarse por las autoridades nacionales e
internacionales que regulan el tráfico de fauna y flora.
Una de las contribuciones de este trabajo es que se logra identificar a estas

especies de Orchidaceae mediante el uso de secuencias de ADN de cloroplasto
como código de barras genético. Lahaye et al. (2008) han mencionado que las
orquídeas son un grupo de plantas difíciles de identificar, particularmente cuando
carecen de estructuras reproductivas lo que las hace un grupo modelo para probar si
los códigos de barras genéticos son útiles para identificarlas. Así mismo estas
secuencias van a permitir que en un futuro puedan emplearse como una herramienta
de trabajo en aduanas lo que ayudaría a controlar el comercio ilegal de especies
39
protegidas como bien sugiere Carrión (2009) y tener una mejor idea del nivel de
tráfico ilegal que sufren las orquídeas de Veracruz.
La extracción de ADN fue exitosa usando el método por CTAB de Doyle y

Doyle (1987) logrando obtener ADN de calidad para la realización de los análisis
posteriores. La amplificación por PCR fue exitosa usando los primers rbcLa.f de
Erickson et al. (2008) y rbcLajf-634R de Fazekas et al. (2008), en el caso de la
región rbcL mientras que en matK se usaron los primers Xf y 5r de Ford et al.
(2008). Resultados similares fueron obtenidos en algunos trabajos como los de
Lahaye et al. (2008) quienes secuenciaron también el gen matK pero usando
primers diferentes, Nicolalde et al. (2009) tuvieron buenos resultados en la
amplificación de rbcL, e igualmente Kress et al. (2005) y Kress et al. (2007)
amplificaron fácilmente a rbcL. Una desventaja que CBOL Plant Working Group
(2009) menciona para matK es la que no hay un grupo de primers universales que
sean reconocidos para trabajar con eficiencia en todos los grupos de plantas; sin
embargo esto es poco probable que suceda debido a la enorme variación que
presenta matK. Los primers usados en este trabajo para amplificar la región de matK
fueron recientemente señalados junto a otros primers como opciones favorables en
la obtención de códigos de barras genéticos por Dunning y Savolainen (2010). La
alineación de las secuencias de matK y rbcL fueron sencillos de realizar siendo
similar al éxito en el trabajo expuesto por Lahaye et al. (2008).
La herramienta BLAST a través de la base de datos de "GenBank" fue

utilizada únicamente como una prueba para conocer si las secuencias obtenidas en
este proyecto resultaban similares a las depositadas en este banco de genes. Estuvo
limitado por la ausencia de algunas secuencias de orquídeas, principalmente de rbcL
que careció casi de todas excepto de Chysis bractescens. Una secuencia destaca de
todas las demás pertenecientes al gen rbcL, ya que la secuencia de la especie
Trichocentrum stramineum tiene un parecido al 95% con Guadua sp. que es una
planta perteneciente a la familia Poaceae; de igual forma para el caso de la
secuencia de Mormodes maculata var. unicolor de la región matK + rbcL nos da una
semejanza del 100% entre Cycnoches egertoniamun según los resultados en
40
BLAST, esto podría deberse a la falta de resolución de rbcL o a que tanto las
secuencias de T. stramineum y M. maculata var. unicolor no están dentro de la base
de datos en GenBank como menciona De Groot et al. (2011). Sin embargo, debe
tomarse en cuenta que el uso de la herramienta BLAST es una ayuda únicamente
inicial, una herramienta de aproximación ya que como se ha mencionado no se
encuentran todas las especies de plantas en esta base de datos.
El análisis de distancia del vecino más cercano (NJ) empleando el fragmento

del gen matK de forma individual encontró una disimilitud entre las secuencias de
las especies que integran el análisis oscilando entre 0.009 y 0.220 sustituciones de
base por sitio pudiendo diferenciar a las 20 especies por lo que se comprueba de
esta forma la alta variación que tiene para diferenciar individuos a nivel de especie,
de manera particular en el caso de orquídeas y que ya había sido mencionado
anteriormente por Lahaye et al. (2008) con éxito para este grupo. Así mismo
Hollingsworth et al. (2009) mencionan que a pesar de ser una región variable y
exitosa en la discriminación de especies, tiene una resolución baja en algunos
grupos como ya se reportó en cícadas por Nicolalde et al. (2009).
Un buen desempeño en la diferenciación de especies fue para el código de

barras utilizando dos locus matK + rbcL que al igual que matK de forma individual,
también logro diferenciar a las 20 especies del estudio pero teniendo valores de
sustituciones de bases más bajos ya que la disimilitud de secuencias en los taxa
osciló entre 0.006 y 0.136. El CBOL Plant Working Group (2009) menciona que el
código de barras de dos locus debe ser el código de barras estándar en plantas ya
que matK tienen un buen nivel de variación en angiospermas y en el caso de rbcL a
pesar de no tener gran poder para diferenciar especies, tiene universalidad, sus
secuencias son de buena calidad, se pueden recuperar fácilmente a través de linajes
filogenéticamente divergentes y se desempeña bien en pruebas de discriminación en
combinación con otros loci, esto último pudo confirmarse en este trabajo al tener los
mismos buenos resultados que se obtuvieron con solo matK. En este trabajo, la
región 5’ de matK presenta una variación alta permitiendo diferenciar organismos a
41
nivel de especie, Lahaye et al. (2008) menciona que esta región es particularmente
apropiada para usarse como código de barras genético
Finalmente, el análisis de distancia con sólo rbcL nos dio como resultado el
menor valor de sustituciones de bases, ya que en este caso, la disimilitud de
secuencias ocurrió entre 0.002 y 0.096 sustituciones de base por sitio, tuvo un poder
discriminatorio a nivel de especie muy bajo, ya que solo pudo identificar a 16
especies, en las restantes cuatro especies, no fue posible diferenciarlas ya que entre
Euchile mariae y Euchile citrina la disimilitud fue de 0.00 al igual que entre
Rhynchostele rossii y Rhynchostele beloglossa; como ya se había mencionado
anteriormente rbcL ha sido caracterizado como un gen que tiene poco poder para
diferenciar individuos a nivel de especie debido a su ritmo lento de sustitución
nucleotídica comparado con otros genes, a pesar de esto, ha sido considerado como
un gen importante dentro de los marcadores moleculares candidatos a códigos de
barras genéticos por ser universal, tener una amplificación y alineación fácil como lo
menciona Newmaster et al. (2008). Es importante hacer mención que en en los
casos en que se consideraron dos o más especies del mismo género en este trabajo
como fueron Stanhopea oculata y S. tigrina y Rhychostele rossii, R. beloglossa y R.
cordata, se pudo observar que el gen rbcL careció de sitios polimórficos para
diferenciarlos. De igual forma en el caso de Euchile citrina y Euchile marie las agrupo
cercanamente a Prosthechea vitellina teniendo ambas especies del genero Euchile
una disimilitud de apenas 0.002 con Prosthechea vitellina, anteriormente tanto E.
mariae como E. citrina estaban incluidas dentro del género Prosthechea.
Una investigación similar al presente fue el realizado por Asahina et al. (2009) en
el cual también realizaron una identificación de especies de un género de orquídeas
asiáticas empleando los genes matK y rbcL obteniendo resultados similares en los
cuales el gen matk fue el marcador más variable y el que pudo realizar la
identificación de los individuos a nivel de especie, en el caso particular de este
trabajo, los resultados brindan información sobre las divergencias de especies
mexicanas, algunas de ellas endémicas del país lo que incrementa la importancia de
este trabajo.
42
8. CONCLUSION
Un código de barras genético es una herramienta que tiene como objetivo
lograr la identificación de especies a partir de secuencias de ADN cortas y
estandarizadas en todos los organismos. El uso de esta herramienta ayudaría a
estimar la biodiversidad real en el planeta en un lapso menor de tiempo. En el caso
de las orquídeas esta técnica ayudaría a poder identificarlas a pesar de carecer de
estructuras florales y de esta manera las autoridades encargadas de sancionar el
tráfico ilegal de orquídeas podría apoyarse en este método para determinar
precisamente las especies recolectadas ilegalmente o en exportación. Los genes
matK + rbcL son los códigos de barras que propuso CBOL Plant Working Group en
el 2009 como estándares para plantas, sus resultados en la identificación de
Orchidaceae a nivel de especie fue exitoso logrando identificar al 100% de las
especies, aunque cabe mencionar que los mismos resultados se obtuvieron al
emplear solamente matK, por lo que se podría considerar a esta única región como
el código de barras genético en orquídeas, de esta manera trabajando con esta
región se ahorraría tiempo y presupuesto invertido al trabajar con dos marcadores
moleculares. rbcL de forma individual es un gen que no tiene variación en orquídeas
por lo que no es considerado un buen marcador en este grupo de plantas para
realizar discriminación a nivel de especie, sin embargo es muy útil al discriminar a
nivel de género.
43
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51
10. ANEXOS
Anexo 1. Especímenes analizados. Los vouchers obtenidos de los ejemplares que se usaron en este
trabajo se depositaron en el herbario XAL.
Acineta barkeri (Bateman) Lindl. Agüita Fría, Municipio San Andrés Tlalnehuayocan,
Veracruz. M. Cuéllar 15 (XAL). Anathallis abbreviata (Schltr.) Pridgeon & M. W.
Chase. Carretera hacia Tlapanalán, sobre ladera derecha, municipio Ixhuacán de los
Reyes MCZ 88 (XAL). Aspidogyne stictophylla (Schltr.) Garay. Obtenido de
ejemplar cultivado en el Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero del Instituto de
Ecología, A. C. M. Cuéllar 24 (XAL). Barbosella prorepens (Rchb. f.) Schltr. La
Cortadura, municipio de Coatepec, faldas del Cofre de Perote, Veracruz. M. Cuéllar
19 (XAL). Chysis bractescens Lindl. Obtenido de ejemplar cultivado. M. Cuéllar 26
(XAL). Cycnoches ventricosum Bateman. Obtenido de ejemplar cultivado. M.
Cuéllar 29 (XAL). Cypripedium irapeanum Lex. Sobre ladera de cerro de
Chavarrillo, camino Chavarrillo- Monte Oscuro, Veracruz. M. Cuéllar 14 (XAL).
Euchile citrina (La Llave & Lex.) Withner. Obtenido de ejemplar cultivado. M. Cuéllar
27 (XAL).Euchile mariae (Ames) Withner. Obtenido de ejemplar cultivado. M. Cuéllar
28 (XAL). Lacaena bicolor Lindl. Obtenido de ejemplar cultivado. M. Cuéllar 30
(XAL). Mormodes maculata (Klotzsch) L. O. Williams var. unicolor (Hook.) L. O.
Williams. Cafetal cerca a Barranca de Ramírez, municipio de Coatepec, Veracruz. M.
Cuéllar 17 (XAL). Oncidium incurvum Barker ex Lindl. La Cortadura, municipio de
Coatepec, faldas del Cofre de Perote, Veracruz. M. Cuéllar 20 (XAL). Prosthechea
vitellina (Lindl.) W. E. Higgins. Bosque mesófilo de montaña, hacia Xico Viejo,
municipio de Xico, Veracruz. M. Cuéllar 18 (XAL). Rhynchostele beloglossa (Rchb.
f.) Dressler & N. H. Williams. Obtenido de ejemplar cultivado en el Jardín Botánico
Francisco Javier Clavijero del Instituto de Ecología, A. C. M. Cuéllar 22 (XAL).
Rhynchostele cordata (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar. La Cortadura, municipio de
Coatepec, faldas del Cofre de Perote, Veracruz. M. Cuéllar 21 (XAL). Rhynchostele
rossii (Lindl.) Soto-Arenas & Salazar. Obtenido de ejemplar cultivado en el Jardín
Botánico Francisco Javier Clavijero del Instituto de Ecología, A. C. M. Cuéllar 23
(XAL). Stanhopea oculata (Lodd.) Lindl. Cerro cercano a Ixhuacán de los Reyes por
carretera rumbo a Ayahualulco, municipio Ixhuacán de los Reyes. M. Cuéllar 24
(XAL) Stanhopea tigrina Bateman. Obtenido de ejemplar cultivado en el Jardín
Botánico Francisco Javier Clavijero del Instituto de Ecología, A. C. M. Cuéllar 25
(XAL). Trichocentrum stramineum (Bateman ex Lindl.) M. W. Chase & N. H.
Williams. A un lado de camino a Chavarrillo Monte Oscuro Vanilla planifolia Jacks.
Camino a 3.5 km de San Fernando, municipio de Soteapan, Veracruz. M. Cuéllar 16
(XAL)
52
Anexo 2. Imágenes de las especies de orquídeas analizadas.
 Fotos tomadas de la AMO (www.amo.com.mx) y de fichas de proyecto W029; información actualizada
sobre las especies de orquídeas del PROY-NOM-059-ECOL-2000. Soto-Arenas, M. A. (compilador).
 Acineta barkerii  Anathallis abbreviata
 Aspidogyne stictophylla  Barbosella prorepens
53
Chysis bractescens  Cycnoches ventricosum
 Cypripedium irapeanum Euchile citrina
 Euchile mariae  Lacaena bicolor
54
Mormodes maculata var. Unicolor  Oncidium incurvum
Prosthechea vitellina  Rhynchostele cordata
 Rhynchostele beloglossa Rhynchostele rossii
55
 Stanhopea oculata Stanhopea tigrina
 Trichicentrum stramineum  Vanilla planifolia
56
Anexo 3. Imágenes de las matrices de secuencias en Se-Al Secuence Alignment Editor, V2. 0a11. La imagen 3A correspondiente
a la matriz de secuencias del fragmento del gen rbcL y la 3B a la matriz de secuencias del fragmento matK.
3A
3B
57
Anexo 4. Protocolo de extracción de ADN con CTAB de Doyle y Doyle (1987).
I. Agregar 750 µL de 2X de buffer CTAB y 3.0 µL de 2-mercaptoetanol a tubos de

Eppendorf.
II. Moler de 0.5-1.0 g de tejido fresco con nitrógeno líquido y arena estéril hasta que
quede finamente molida.
III. Agregar el tejido molido a cada tubo y mezclar bien.
IV. Incubar a baño María a 65°C por 4 horas.
V. Agregar 700 µL de SEVAG a cada tubo y mezclar bien. Centrifugar 15,000 rpm
por 10-15 min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo Eppendorf.
VI. Agregar un volumen de 0.33 de isopropanol congelado y almacenar a -30°C por
24 horas.
VII. Centrifugar a 15,000 rpm por 10 min a temperatura ambiente. Desechar el
sobrenadante sin perturbar el sedimento. Secar al vació. Repita los pasos 6 y 7
de dos a cuatro veces si la fase acuosa es viscosa.
VIII. Volver a suspender el precipitado en 100-200 µL de agua. Agregar 1-2 µL de 10
mg/ml. De RNase. Mezclar bien e incubar por 30 min a 65°C.
IX. Agregar 20 µL (0.1 vol) de NaOAc 2.5 M. y 500 µL (2-2.5 vol) de etanol
congelado al 95% y almacenar a -20°C durante 2 horas. Centrifugar a 15,000
rpm durante 5 min. Desechar el sobrenadante.
X. Lavar el precipitado con 1 mL de etanol al 70%. No perturbar el precipitado.
Centrifugar a 15,000 rpm durante 4 min y retirar el etanol. Secar al vació. No
sobre-seco.
XI. Volver a suspender el precipitado en ~100-200 µL de agua. Almacenar a -20°C.
58
Anexo 5. Protocolo de purificación de muestras de PCR QIAquick (Qiagen, California, USA.)
I. Agregar 5 volumenes de buffer PB a 1 volumen de la muestra de PCR y mezclar.

Por ejemplo, agregar 500 µL de buffer a 100 µL de muestra de PCR.
II. Colocar una columna QIAquick en un tubo de colecta de 2 ml.
III. Agregar la muestra dentro de la columna QIAquick y centrifugar por 30-60 seg.
IV. Desechar el sobrenadante y colocar de nuevo la columna QIAquick dentro del
mismo tubo.
V. Para lavar, agregar 0.75 ml de buffer PE a la columna QIAquick y centrifugar por
30-60 seg.
VI. Desechar el sobrenadante y colocar la columna QIAquick dentro del mismo tubo
y centrifugar la columna por 1 min adicional.
VII. Colocar la columna QIAquick en un tubo limpio para microcentrifuga de 1.5 ml.
VIII. Agregar 50 µL de buffer EB o H2O en el centro de la membrana de la columna
QIAquick y centrifugar por 1 min. Alternativamente, para aumentar la
concentración de ADN, agregar 30 µL de buffer de elución en el centro de la
membrana QIAquick. Dejar reposar la columna por 1 min y luego centrifugar.
IX. Desechar la columna y almacenar el tubo que contiene el ADN.
59
Anexo 6. Protocolo de purificación de secuencias
I. Se agregan 45 µL de isopropanol al 75% a los 10 µL de la reacción,

mezclando suavemente y si es necesario se centrifuga.
II. Se pasa los 55 µL a un tubo mediano de 0.6.
III. Se dejan reposando por 30 minutos a temperatura ambiente, pero cubiertos
con papel aluminio para que no les de la luz.
IV. Se centrifuga a velocidad máxima durante 30 min.
V. Se elimina todo el isopropanol que se pueda, volteándolos sobre una sanita.
VI. Se agregan 250 µL de etanol al 70%, se agita con la punta de los dedos.
VII. Se centrifuga a máxima velocidad durante 5 min.
VIII. Se elimina todo el etanol para que no queden fluroforos, volteándolos sobre
una sanita por 1 min.
IX. Se secan en el termoblock de 5 a 10 min. A 75°C.
X. Se almacenan en al refrigerador hasta que se lleven al secuenciador.
60
Anexo 7. Secuencias de las 20 especies de orquídeas del gen de cloroplasto matK.
>Acineta barkeri
ATTACTTGGAATGCTGGATCAAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTGATTTTCCACGAATATC
ATAATTTGAAGAGTCTCATTACTTCAAATAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAATATTTTTT
TGGTTCCTACATAATTCTTATGTATATGAATGCGAATATATATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTT
ATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTTTATGGAAAAATTGAATCTATTCT
AGTCGTGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCCTCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCG
ATATCAAGGAAAAGCAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGT
TGTGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCC
AACTATTCCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACCAAAAAATCCTTTAGAAGTAAGAAATCAAA
TGCTAGAGAATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTATTTCTCT
TATTGGATCATTGTCGAAAGCTAATTTTGTACTGTATCGGGTCATCCTATTAGTAAACCAATCTGGACC
GATTTATCGGAATCTGATATTATTGATCGATTTGTCGGAAATGTCGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGG
AACCTCAAAGAAAACAGGTTTGTG-CATCCGTTAGAAGTTAAGGCG
>Anathallis abbreviata
CCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATATCATAATTTGAATCGTCTCATTACTTCAAATA
AATCTATTTACGTCTTGTCAAAAATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTTCCTACATAATTCTTATGTATATGA
ATTCGAATATCTATTCCTTTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACGATCAATATCTTCTGGATTCTTTC
TTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGACTATCTTATAGTCGTGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGA
TCTTATGGTTCCTCAACGATACTTTCATACATTATGTTAGATATCAAGGAAAAGCGATTATGGCTTCAA
AAGGGACTCTTTTTCTGATGAATAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTT
TTGGTTTCAACCTTCTAGGATCCTTATAACGCAATTACCCAACTATTCTTTCTCTTTTCTGGGGTATTTT
TCAAGTGTACGAAAAAATCCTTTGGTAATAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTATAATAAATACG
CTGACTACTAAATTAGATACCATAGTCCCAGCTATTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTAAATTTT
GTACTGTATTAGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGATTCTGATATTCTTGATC
GATTTGTCGGATATGGAGAAAAGATTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAAGAAAAAG
>Aspidogyne stictophylla
AATACTTCCTTTGCTGGGATCAAAATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTGATTTTCCACGAATATC
ATAATATGAAGAGTATCATTACTTCAAATAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAATATTTTTT
TGGTTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATGCGAATATATATTCCTGTTTCTTCGTAAACAATCTTCTT
ATTTACGATCAACATCTTTTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACAATTTTTTATGTCAAAATTGAATCTATTTC
TAGTAGTGTATTTTAATTCTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCCTCAAAGATCCTTTAATACATTATGTTCA
ATATCAAGGAAAAGTAATTTTGGCTTCAAAAGGGAACTCTTTTTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATG
TTGTGAATTTTTGGCAATTTTATTTTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACC
CAACTATTCCTTTTCCTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACCAAAAAAATTTTTGGAAGTAAGAAATCAA
ATGCTAGAGAATTCCTTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTATTTCT
CTTATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCGGGTCATCCTATTAGTAAACCAATCTGG
ACCGATTTATCGGATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGAAAATGTCGAAATCTTTGTCGTATCACA
GCGGATCCTCAAAAAAAAAGGCTTGATTCGAAAAGGGTATGCCG
>Barbosella prorepens
GGATTCAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATGTCATAATTTTAATAGTCTC
ATTACTTCAATGAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTAGGTTCCTACATAATT
CTTATGTATCTGAATGCGAATATATATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACGATCAATATC
TTCTGGAGTCTTTCTTGAACGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCGTGTGTTGTAA
TTCTTTTCAGAGTATCTTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTAGATATCAAGGAAAAGC
GATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAATAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGAA
ATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCGTATAAGGCAATTACCCAACTATTCTTTCTCT
GTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACGAAAAAATCCTTTGTTAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCA
TTTAGAATAAATATTCTATCTAATAAATTAGATACCATAGTCCCAGCTATTTCTCTTATTGGATCATTGT
61
CGAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTAGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGATT
CTGATATTCTTGATCAATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAAGAAA
CAGGTTTGATCGAGAATGTAA
>Chysis bractescens
GATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAGTATCATAATTTGAATAGTCTCATTACTT
CAAATAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGGTTCTTTTGGTTCCTACATAATTCTTATGT
ATATGAATGCGAATATCTATTCCTGTTTCTTCGTAAAAAGTCTTCTTATTTACGATCAATATCTTCTGGA
GTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCGTGTGTTGTAATTCTTTTC
AGAGGATCCTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTCGATTTCAAGGAAAAGCGATTCTGG
CTTCAAAAGGGACTCTTATTATGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATCTTTGGCAATCTTATTT
TCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAGTTATTCCTTCTCTTTTCTGGG
GTATTTTTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTAATA
GATACTCTGACTAATAAATTAGATACCATAGCCCCAGTTATTTCTCTTATTGGATCATTGTCGAAAGCT
CAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGATTCTGATATT
CTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTAGTCGTATCACAGCGGATCCTCAGAGAAA-
CAGGTTTGATCGTAAAAAAG
>Cycnoches ventricosum
GGATCCTCGTGTTCCTTCTTTGCATTTCTTACGATCTGTGTTTCCACGAATCTCGTAATTTGAATAGTC
TCATTACTTCAAATATTTCTATTTACGTGTTTTCAAAAAGAAAGAACACATTCTTTTGGTTCCTACGTAA
TTTGACATGTATATGAATTCGAATATCTATTCCTTTTTATTCGTAAACAGTCTTATTATTCACGATCAATA
TCTTATGGAGTATTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTTGTGTGTTGT
AATTCTTTTAAGAGGATCCTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATTTTCGATATCAAGGAAAAT
CAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTATGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGC
AATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCA
TATAAAGCAATTACCTAACTATTCCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTG
GTAGTAAGAAATCAAATGTTAGGGAATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATA
GTCCCAGTTATTTCTCATATTGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTGTACTGGGTCATCCTATA
AGTAAACCGATCTGGACCGATTTACCGGATTAAGATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGCAGAATC
TTGTCGTATCACAACGGATCCTCAAAGTATCAGGATCGAGAGTTTACTGG
>Cypripedium irapeanum
TAGGTCACGAATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGCTTTTCCACGAATATCATAATTTGAATAGTC
TCATTACTTCAAATAAATTAATTTACGCCTTTTCAAAAATAAAGAAAAGATTCCTTTGGTTCCTATATAAT
TCTTATGTATATGAATGCGAATATCTATTCCAGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACGATCAACAT
CTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGTGAAAATAGAACATCTTATAGTAGTGTGTTGTA
ATTCTTTTCATAGGATCCTATGCTTTCTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTCGATATCAAGGAAAAG
CAATTCTGGCTTCAAAGGGAACTCCTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGC
AATCTTATTTTCACTTTTGGTCTCAACCGTATAGGATCCATATAAAGCAATTATCCAACTATTCCTTCTC
TTTTATGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAGAAAATCCTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTC
ATTTCTAATAAATATTATGACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCTGTTATTTCTCTTATTGTATCATTG
TCGAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCAATCTGGACCGATTTATCGGAT
TCTGATATTCTTGATCGATTTGCCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAAGAA
ACAGGTTTCGCATCGAGAAAAGTTA
>Euchile citrina
CCTTCTTTTCATGCTGGATCAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTACGATTGTTTTTCCACGAATATCAT
AATTTGAATAGTCTCATTACTTCAAAGAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTT
GGTTCTTACATAATTCTTATGTATATGAATGCGAATATCTATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTA
TTTACGATCAATATCTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGTAAAAATAGAATATCTTATA
GTCGTGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTCGA
TATCAAGGAAAAGTGATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTTATCTT
62
GTGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATTCATATAAAGCAATTACCCA
ACTATTCCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGCGTACTAAAAAATCCTTCGATAGTAAGAAATCAAAT
GCTAGAGAATTCATTTCTAATAAATACTCTAA
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CTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCAATTTATCGGATTCTGATATTCTTGATCAAT
TTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAAGAAACAGGTTTGATCGATAA
GGTAGGCCGC
>Euchile mariae
GCCTACTCATGCTGGATCAAGATTGTTCCTTCTTTGCATTTATTACGATTGTTTTTCCACGAATATCATA
ATTTGAATAGTCTCATTACTTCAAAGAAATCTATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTTG
GTTCTTACATAATTCTTATGTATATGAATGCGAATATCTATTCCTGTTTCTTCGTAAAAAGTCTTCTTATT
TACGATCAATATCTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAG
TCGTGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTCGAT
ATCAAGGAAAAGTGATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTTATCTTG
TGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAA
CTATTCCTTATCTTTTCTGGGGTATTTGTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATG
CTAGAGAATTCATTTCTAATAAATACTCTAACTAATAAATTAGTTACCATAGCCCCGGTTATTTCTATTA
TTGGATCATTGTCGAACGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCA
ATTTATCGGATTCTTATATTCTTGATCAATTTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCATATCACAGCGGA
TCCTCAAAGAAACCAGGTTTGATCGTAAAGGGTGGTATC
>Lacaena bicolor
ATCTTTCAATGCTGGATCAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATATCGTG
ATTTGAATAGTCTCATTACTTCAAAGAATTCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTTG
GTTCTTACATAATTCTTATGTATATGAATGCGAATATCTATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTAT
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ATCAAGGAAAAGCGATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTT
GTGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCA
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GCTAGAGAATTCATTTCTAATAAATATTCTAACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCGGTTATTTCTATT
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AATTTATCGGATTCTGATATTCTTGATCAATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGG
ATCCTCAAAGAAACAGGTTTGATCGATTAAAGTATACTC
>Mormodes maculata var. unicolor

AACTTCATGCGCTGACAGGATCAGCCTTCTGTGCATTTGTTCGCATTGTGTCTTCTGCATCTCATAAG
GTGAATAGTCTCATTACTTCAAGTGAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAGGATTCGTTGGG
TTCCTACATAATTCTTATGTAGATGAATGCGAATATATATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTATT
TACGATCAAGATCTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAG
TCGTGTGTTGCAATTCTTTTCAGAGGATGCTATGGTCCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTAGAT
ATCAAGGAAAAGCGATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTT
GTGAAGGGTTGGAAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAACGCAATTACCC
GGACTATTCTTTCTCTTTTCTGGGGTACTTGTCAAGTGTACGAAAAAATCCTTTGTTAGTAAGAAATCA
AATGCCAGAGAATTCATTTAGAATAAATACTCTGGCTAAGACATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTA
TGATAATGGATCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTACTAGTAACCCGATCTG
GACCGATCTATCGGATTCTGAGATTCAAGATCAATTTGTCGGATTTGTAGAAATCTTTGTAGTCTCACA
GCGGATCCTCAAAGAGACGGTTCTGTACAGACTTAAGCATC
63
>Oncidium incurvum
CTTTCATGCTGGATCAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATCTCATAATTTG
AATAATCTCATTACTTCAAAGAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTTCTT
ACATAATTCTTATGTATATGAATTCGAATATCTATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACAAT
TAATATCTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCATGT
GTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTTCTCAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGG
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TTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCTAACTATTCC
TTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAGAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATGCTAGAG
AATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATCTGATTGGAT
CATTGTCAAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTAT
CGGATTCTGATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTATCACAGTGGATCCTCA
AAGAAGCAGGTTTGATCGATAAAGT
>Prosthechea vitellina
AACTTTTTATGCTGGATCAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTACGATTGTTTTTCCACGAATATCATAA
TTTGAATAGTCTCATTACTTCAAAGAAATCCATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTTGG
TTCTTACATAATTCTTATGTATATGAATGCGAATATCTATTCCTGTTTCTTCGTAAACAGTCTTCTTATTT
ACGATCAATATCTTTTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGT
CGTGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTCAAAGATACTTTCATACATTATGTTCGATA
TCAAGGAAAAGCGATTCTGGCTTCAAAAGGGACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTG
TGAATTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAA
CTATTCCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATG
CTAGAGAATTCATTTCTAATAAATATTCTAACTAAGAAATTAGATACCATAGCCCCGGTTATTTCTATTA
TTGGATCATTGTCGAACGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCA
ATTTATCGGATTCTGATATTCTTGATCAATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGA
TCCTCAAAGAAACAGGCATGATCGATAAAGGAACCCC
>Rhynchostele cordata
TACTTCAATGCTGGATCAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGCATCTCATAAT
TTGAATAATCTCATTACTTCAAATAAATTTATTTACGTCTTTTCAAACATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTT
CCTACATAATTCTTATGTATATGAATTCGAATATATATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTATTATTTAC
GATCAATATCTTTTGGAATATTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCAT
GTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTAAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAA
GGAAAAGCAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAATAAATGGAAATTTCATCTTGTGAAT
TTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATCAAGCAATTACCTAACTATT
CCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAGAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATGCTAG
AGAATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATATTATTGG
ATCATTGTCAAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTT
ATCGGATTCTGATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTATCACAGCGGATCCT
CAAAGAAGCAGG
>Rhynchostele beloglossa
ACAGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATCTCATAATTTTAATAATCTCATTA
CTTCAAATAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAATAAATAAAAGATTCTTTTGGTTCCTACATAATTCTTAT
GTATATGAATTCGAATATATATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTATTATTTACGATCAATATCTTTTG
GAATATTTATTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCATGTGTTGTAATTCTTT
TCAGAGGATCCTATGGTTCCTAAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGCAATTTT
GGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGCAATCTTA
TTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATCAAGCAATTACCTAACTATTACTTCTCTTTTCTG
GGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAGAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCATTTCTA
ATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATCTTATTGGATCATTGTCAAAAG
CTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGATTCTGATA
64
TTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTATCACAGTGGATCCTCAAAGAAGCAGGTT
TGATCGAT
>Rhynchostele rossii
TGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATCTCATAATTTGAATAATCTCATTACTTCA
AAGAAATTTAGTTACGTCTTTTCAAAAATAAAGAAGAGATTCTTTTGGTTCCTACATAATT-
CTTATGTATATGAATTCGAATATATATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTATTATTTACGATCAATATCT
TTTGGAATATTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCATGTGTTGTAATT
CTTTTCAGAGGATCCTATGGTTCCTAAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGCAA
TTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAATAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTTGGCAATC
TTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATCAAGCAATTACCTAACTATTCCTTCTCTTTT
CTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAGAATCCTTTGATAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATTCATTT
CTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATCTTATTGGATCATTGTCAA
AAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCAATTTATCGGATTCTG
ATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAAGAAGCA
GGTTT
>Stanhopea oculata
CAATGCTGGATCAAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTCTTGCGATTGTTTTTCCAAGAATTTCAAAATTTGA
ATAATCTCATTACTTCAAAGAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTTCCTA
CATAATTCTTATGTATATGAATTCGAATATCTATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACGATC
AATATCTTCTGGAGTATTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCATGTG
TTGTAATTCTTTTAAGAGGATCCTATGGTCCCTCAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGA
AAAGCAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATTTTT
GGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCGTATAAAGCAATTACCTAACTATTCCTT
CTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACGAAAAAATCCTTTAGTAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAA
TTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTACCAGTTATTTCTCTTATTGGATCA
TTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTTGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGAACGATTTATCG
GATTCTGATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGATCCTCAAA
GAAACAGGTTTGATCGTTAAAGGTATCCCG
>Stanhopea tigrina
TTAATGCTGGATCAAGATGTTCCTTCTTTGCATTTCTTGCGATTGTTTTTCCACGAATTTCATAATTTGA
AGAATCTCATTACTTCAAAGAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAATAAAGAAAAGATTCTTTTGGTTCCT
ACATAATTCTTATGTATATGAATTCGAATATATATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTCTTATTTACGAT
CAATATCTTCTGGAGTATTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCATGT
GTTGTAATTCTTTTAAGAGGATCCTATGGTCCCTCAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCAAG
GAAAAGCAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAATT
TTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCGTATAAAGCAATTACCTAACTATTC
CTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTAGTAGTAAGAAATCAAATGCTAGA
GAATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTACCAGTTATTTATCTTATTGGA
TCATTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTTGGTCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGAACGATTTA
TCGGATTCTGATATTCTTGATCGATTTGTCGGATATGTAGAAATCTTTGTCGTATCACAGCGGATCCTC
AAAGAAGCAGGTTTGATCGTTAAAGGTAA
>Trichocentrum stramineum
CTTTTACATGCTGGATCACGATGTTCCTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGAATATCATAAT
TTGAATAATCTCATTACTTCAAATAAATTTATTTACGTCTTTTCAAAAAGAAAGAAAAGATTCTTTTGGTT
CCTACATAATTCTTATGTATATGAATTCGAATATCTATTCCTGTTTATTCGTAAACAGTCTTCTTATTTAC
GATCAATATCTTCTGGAGTCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAATATCTTATAGTCA
TGTGTTGTAATTCTTTTCAGAGGATCCTATGGTTTCTCAAATATACTTTCATACATTATGTTCGATATCA
AGGAAAAGCAATTTTGGCTTCAAAAGGAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAAATTTCATCTTGTGAA
TTTTTGGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTTTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATCACCTAACTAT
65
TCCTTCTCTTTTCTGGGGTATTTTTCAAGTGTACTAAAAAATCCTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGCTA
GAGAATTCATTTCTAATAAATACTCTGACTAAGAAATTAGATACCATAGTCCCAGTTATTTATCTTATTG
GATCATTGTCAAAAGCTCAATTTTGTACTGTATTGGGTCATCCTATTAGTAAACCGACCTGGACCGATT
TATCGGATTCTGATATTCTTGATCAATTTGTCGGATATGTAGAAATATTTGTCGTATCACAGCGGATCC
TCAAAGAAGCAGGTTTGATCGTTAAAGGAAGCGC
>Vanilla planifolia
CGCCCATTTTTTATTAGTTTGGGTTAAAGATGTTCCTTTCTTTGCATTTATTGCGATTGTTTTTCCACGA
ATATCAAAAAAAAGATAATCTCGTTACTTCAATTATTTTATTTATGTCTTTTCAAAAAAAAATAAAAGATT
CTTTTTATTCCTACATAATTTTTATGTATATGAATTCGAATATCTTTTCATGTTTCTTCGTAAACAGTCTT
CTTATTTACGATCAACATCTTCTGGAGTGTTTCTTGAACAAACACATTTTTATGGAAAAATAGAACATAT
TCATCTTATAGTAGTAGTGTGTTTTAATTCTTTAAAAAGAGACCTATGGTTTCTCGAAGATCCTTTCATG
CATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGCTATTCTGGGTTCAAAAGGAAACTCTTATTCTGTTGAATAAATG
GAAATATTATATTATTTATTTTTTGCAATCTTATTTTCACTTTTGGTCTCAACCAGATAGGATCTATAGAA
AGCAATTCTCTGACTATTCCTTTTCTTTCCTGGGGTATTTTTCAAGTGTATTAAAAAATACTTTGGTAGT
CAGAAATCAAATGCTAGGGAATTGCTTTCTCATAAATATTCCGACTCAGAAATTAGATACCACAGCCC
CGGTGATTTCTCTTATTGGATCCTTGTCGAAGGCAAAATTTTGTACGTTAATGGGTCATCCCATTAGTA
AACCGATCTGGACTGATTTATCGGATTCTGAGATTATTGATCGATTTGTCGCATATGTAGACTCTTGTC
GTATCACAGTGGATCTCAAAAAAAACAGGTTTGTATCGTTTAAAGTAG
Anexo 8. Secuencias de las 20 especies de orquídeas del gen de cloroplasto rbcL.
>Acineta barkeri
AGCGTTGGAATGACTATTGAGTTTGTATACATGCGTTGGAGAGACCGTTTCAACCACGAAACCAAAGA
TACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGGGGGC
TGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTT
GATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTT
ATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTA
ATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCA
AAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCC
CTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGA
ATGTCTACGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAACTCACACCATTATGCTTA
>Anathallis abbreviata
ACCAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACC
AAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGG
GGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCCTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAG
TCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGTCGTTCTTGGGGAGGAAAATCAATATATTG
CTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGG
GTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTAT
TCCAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCG
TCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCAGTTT
ATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACC
>Aspidogyne stictophylla
AAAAGCAAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAGTTGACTTATTATACTCCTGACTACGA
AACTAAAGTACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAG
CGGGCGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACTGATGGACTTA
CAAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGCCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATTT
ATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTG
TGGGTAATGTTTTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCT
TATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGG
TCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAAAAGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGG
66
TTTATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTGAACTCACACCCTTTAT
GC
>Barbosella prorepens
AAAGCGGGTTGGATTTAAGCTGGTGTGAAAGATTACAAATTACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCA
AAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGG
GGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGT
CTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGTCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGC
TTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGT
AATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTC
CAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTC
CCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCAGTTTAT
GAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATTTATGCGT
G
>Chysis bractescens
TTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATACTGAT
ATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGGGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGGGCTGCGGTA
GCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTA
CAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGTCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTT
ATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTG
GTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAACTTTC
CAAGGTCCACCTCATGGAATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCCCCTATTGG
GATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCAGTTTATGAATGTCTAC
GGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACG
>Cycnoches ventricosum
AAGCAAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAA
CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTTACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGC
GGGGGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTAC
CAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATAT
ATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGATCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTG
TGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTCCGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCT
TATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGG
TCGTCCCTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGG
TTTATGAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATTT
>Cypripedium irapeanum
AGCGTCGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAA
GATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGG
CTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCT
TGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTT
ATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCCCTTCTTATTCC
AAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTC
CCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTAT
GAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAGGATGATGAAAACGTGAACTCACACCATTTATGCTG-
>Euchile citrina
CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGC
GGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACC
67
AGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGTCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATAT
TGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTG
GGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTA
TTCCAAAACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTC
GTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCAGTT
TATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATT
>Euchile mariae
TATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATTTATGT
>Lacaena bicolor
AAAGCAAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAA
ACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAG
CGGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTAC
TGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCT
TTTATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATTTAT
GC
>Mormodes maculata var. unicolor

CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGC
ATTGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGATCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTG
TTTATGAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACAAATTTG
>Oncidium incurvum
CGTGGATTAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGATAC
TGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGGGGGCTGC
GGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACGACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGAT
CGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGT
AGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGT
ATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAAAA
CTTTCCAAGGTCCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCCCTTA
TTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCTGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATG
TCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCAC
68
>Prosthechea vitellina
TGCTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTC
TATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAATCACACCATTTGTG
>Rhynchostele cordata
CGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGA
TACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTTACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGGGGGCT
GCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTG
ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTAT
GTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAAT
GTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCCAA
AACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCT
TATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCTGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAAT
GTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACAACCA
>Rhynchostele beloglossa
CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTTACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGC
CAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATAT
TATTCCAAAACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGT
CGTCCCTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCTGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGT
TTATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACACCATTTTGT
G
>Rhynchostele rossii
GCAAGCGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACC
AAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTTACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGG
GGGCTGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAG
TCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTG
CTTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGG
GTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTAT
TCCAAAACTTTCCAAGGTCCACCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCG
TCCCTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCTGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTA
TGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAAGGATGATGAAAACGTAATTCACACCTTTTATGCG
69
>Stanhopea oculata
CGTGGAATTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGAT
ACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGGGGGCT
GCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTG
ATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAGTATATTGCTTAT
GTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAAT
GTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCAAA
AACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCCCT
TATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAA
TGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACGTAAATTCACAA
>Stanhopea tigrina
CGTTGGAATTAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTACGAAACCAAAGA
TACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCGGGGGC
TGCGGTAGCAGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCAGTCTT
GATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGGCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAGTATATTGCTT
ATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATTCCCACTTCTTATTCA
AAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTCGTCC
CTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTATGGTAGAGCGGTTTATGA
ATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAGGATGATGAAAACG
>Trichocentrum stramineum
AAGTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGCATTGGAGAGACCGTTTCACTTCGAAAC
CAAGGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAGCCGGGGGTTCCGCCCGAAGAAGCA
GGGGCTGCAGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACCA
GTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTATCACATCGAGCCTGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATC
GCTTATGTAGCTTATCCATTAGACCTATTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTG
GGTAACGTATTTGGTTTCAAAGCCCTACGCGCTCTACGTCTGGAGGATCTGCGAATTCCCACTTCTTA
TTCAAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAGTTGAACAAGTACGGCC
GTCCTTTCTTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAAATATGGTAGAGCGGTTT
ATGAATGTCTACGGGGTGGACTTGATTTTACTAAAGGATGATGAAAACGTAAACTCAC
>Vanilla planifolia
AAAGCTGTGTTGGAAATTTTCAAATTGACTTTGAATACATGCGTTGGAGAGACCGTTTCACTTCGAAA
CCAAGGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCCAGTAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCCGAAGAAGC
AGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGATGGACTTACC
AGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATAT
TTCCAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTACGGTC
GTCCCTTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAAAACTATGGTAGAGCGGTT
TATGAATTGCTACGGGGGTGACTTGATTTTACTAAAGATGATGAAAACGTAAATTCAC
70

Cuellar Martinez

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

CÓDIGO DE BARRAS GENÉTICO DE ALGUNAS ORQUÍDEAS

TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

MANUEL ADRIÁN CUÉLLAR MARTÍNEZ

VICTORIA SOSA ORTEGA

XALAPA, VER. 2011

 Al Instituto de Ecología, A. C. por otorgarme las facilidades para la realización de

 A la Dra. Victoria Sosa por concederme la oportunidad de desarrollar este

 A Etelvina Gándara Zamorano y Diego Francisco Angulo Pérez por ayudarme a

 Al personal del Instituto de Ecología y del Jardín Botánico Francisco Javier

 A todos mis amigos de la Facultad de Biología por brindarme su amistad y

Manuel Gregorio Cuellar Rojas y Gloria Martínez Cuevas

Mayra Lídice y Fernando Iván

De manera especial a la memoria de mi abuela Pilar Rojas, que me cuida y me guía

A mis amigos que son mi segunda familia:

2.1 ORCHIDACEAE .......................................................................................................................................... 8

3.1 OBJETIVO GENERAL: .............................................................................................................................. 19

4.ANTECEDENTES DE LOS CÓDIGOS DE BARRAS GENÉTICOS................................................ 20

5.MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................... 25

5.1 MUESTREO DE MATERIAL BIOLÓGICO .................................................................................................... 25

9.LITERATURA CITADA ........................................................................................................................ 44

Tabla 1. Lista de orquídeas veracruzanas incluidas en alguna categoría de riesgo en la

Tabla 7. Matriz de distancia para el fragmento del gen rbcL. ........................................................ 36

Tabla 8. Matriz de distancia para el fragmento del gen matK. ....................................................... 37

Tabla 9. Matriz de distancia para matK+rbcL.. ................................................................................. 38

Anexo 1. Especímenes analizados.. ................................................................................................... 52

Anexo 2. Imágenes de las especies de orquídeas analizadas. ...................................................... 53

Anexo 5. Protocolo de purificación de muestras de PCR Qiaquick ............................................ 59

Anexo 6. Protocolo de purificación de secuencias ......................................................................... 60

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3.2 Objetivos particulares:

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