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tóxicos
Artículo
Caracterización ecotoxicológica del litio como “bomba de tiempo” en
sistemas acuáticos: renacuajos del sapo sudamericanoRhinella
arenarum(Hensel, 1867) como organismos modelo
Paola Peltzer1,2, Ana P. Cuzziol Boccioni1,2,*, Andrésmis M. Attademo1,2, Maria F. Simoniello3, Germenan Lener2,4
y Rafael C. Lajmanovich1,2,*
Citación:Peltzer, PM; Cuzziol Boccioni, AP;
Attademo, AM; Simoniello, MF; Lener, G.;
Lajmanovich, RC Caracterización
Ecotoxicológica del Litio como “Bomba de
Relojería” en Sistemas Acuáticos:
Renacuajos del Sapo Sudamericano
Rhinella arenarum(Hensel, 1867) como
organismos modelo.tóxicos2024,12, 176.
https://doi.org/10.3390/
tóxicos12030176
Editores académicos: Ruijuan Qu y
Zunyao Wang
Recibido: 10 de enero de 2024
Revisado: 21 de febrero de 2024
Aceptado: 22 de febrero de 2024
Publicado: 25 de febrero de 2024
Derechos de autor:© 2024 por los
autores. Licenciatario MDPI, Basilea,
Suiza. Este artículo es un artículo de
acceso abierto distribuido bajo los
términos y condiciones de la licencia
Creative Commons Attribution (CC BY)
(https:// creativecommons.org/
licenses/by/4.0/).
Tóxico s2 0
24,12, 176. https://doi.org/10.3390/toxics12030176
1 Laboratorio de Ecotoxicologíaia, Facultad de Bioquimica y ciencias biológicasogicas, Universidad Nacional del
Litoral, Santa Fe S3001XAI, Argentina; paolapeltzer@hotmail.com (PMP); mattademo@hotmail.com (AMA) Consejo
2 Nacional de Investigaciones Cientificas Tmiclínicas (CONICET), Buenos Aires C1425FQD, Argentina;
germanlener@gmail.com
3 Catedra de Toxicologíaia, Farmacólogoiay bioquéimica Legal, Facultad de Bioquimica y ciencias biológicaso
gicas, Universidad Nacional del Litoral, Ciudad Universitaria, Santa Fe S3001XAI, Argentina;
fersimoniello@yahoo.com.ar
4 Instituto de Investigaciones en Fisico-Quimica de Cordoba-CONICET, Departamento de Quimica teorica y
Computacional, Facultad de Ciencias Quimicas, Universidad Nacional de CoCórdoba, C.oCórdoba X5000GYA,
Argentina
* Correspondencia: anapaulacuzziolboccioni@gmail.com (APCB); lajmanovich@hotmail.com (RCL)
Abstracto:El objetivo de este estudio fue evaluar la letalidad aguda y los efectos subletales crónicos del litio (Li)
enRhinella arenarumLos renacuajos como organismos modelo. Primero se realizó un ensayo de toxicidad de 96
h exponiendo los renacuajos a concentraciones de Li de 44,08 a 412,5 mg L−1estimar la mortalidad y los efectos
letales y subletales. Se llevó a cabo otro bioensayo exponiendo renacuajos a dos concentraciones de Li
ambientalmente relevantes (2,5 y 20 mg L−1) durante una y dos semanas. Los efectos subletales del Li en los
renacuajos se evaluaron mediante el análisis de biomarcadores bioquímicos, genotóxicos y fisiológicos. La
mortalidad de los renacuajos expuestos al Li aumentó con el tiempo. La concentración letal media (LC50) osciló
entre 319,52 (281,21–363,05) mg L−1a las 48 h a 66,92 (52,76–84,89) mg L−1
a las 96h. Exposición a Li a 2,5 y 20 mg L−1alteraciones inducidas en enzimas relacionadas con la desintoxicación, los
mecanismos antioxidantes y hepáticos, la alteración endocrina de las hormonas tiroideas, la genotoxicidad y los efectos
sobre la fisiología del corazón y los sistemas gastrointestinales. Renacuajos expuestos a la mayor concentración en el
bioensayo crónico (20 mg L−1Li), que es la concentración comúnmente registrada en los sitios mineros de Li, mostró una
mortalidad significativa después de una semana de exposición. Estos resultados alertan sobre el alto riesgo
ecotoxicológico del Li como contaminante de creciente preocupación para los anfibios.
Palabras clave:Li; riesgo ambiental; renacuajos; contaminación acuática
1. Introducción
El litio (Li) es un metal blando de color blanco plateado que pertenece al grupo de los metales
alcalinos y se encuentra en salmueras (aguas salinas), minerales de pegmatita de roca dura y minerales
arcillosos. Las salmueras son las principales fuentes de Li registradas en diferentes etapas de desarrollo
geológico en países de América del Norte y del Sur como Argentina, Bolivia, Chile y Estados Unidos.1]. Sin
embargo, durante las últimas dos décadas, los usos de Li han aumentado drásticamente más del 256%
debido a la creciente demanda intensiva de este combustible por la revolución y las tecnologías de la
energía verde.2,3]. Actualmente, el Li se utiliza en diferentes industrias, incluidas las de vidrio y cerámica
resistentes al calor, lubricantes y grasas de Li y electrodomésticos. Además, en la próxima década, el
aumento de la demanda de baterías de iones de litio para vehículos eléctricos y dispositivos móviles será
un fuerte impulsor del consumo de Li, y se espera que la demanda mundial alcance los 2,4 millones de
toneladas métricas de carbonato de Li equivalente.4,5]. En América del Sur, el Li se extrae principalmente
de salmueras continentales que están restringidas geográficamente al Li.
https://www.mdpi.com/journal/toxics
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Triángulo (noroeste de Argentina, suroeste de Bolivia y norte de Chile), con aproximadamente entre el 50% y el
85% de los depósitos de salmuera continentales ricos en Li en todo el mundo.1,6]. El método utilizado para
extraer Li de los depósitos de salmuera continentales es la evaporación al aire libre para concentrar la salmuera.
Este método implica altos niveles de contaminación (más fuertemente asociados con la minería a cielo abierto) y
un uso insostenible del agua, los cuales alteran la calidad ambiental y amenazan las tierras ancestrales de las
comunidades indígenas.7,8].
Los estudios sobre las concentraciones de Li en aguas superficiales y sobre los efectos tóxicos
del Li en los organismos acuáticos son escasos.9]. Las concentraciones ambientales de Li varían
entre 0,014 y 14 mg L−1[10], mientras que aquellos en regiones de salar (como la “Puna de
Atacama” en Bolivia) varían entre 0,2 y 20 mg L−1, y puede aumentar hasta 400 mg L−1[11]. Según
los datos del Servicio Geológico de los Estados Unidos (USGS) recopilados en 17 países, la
distribución geográfica global de Li en cuerpos de agua podría clasificarse en un amplio rango:
<0,06, 0,07–3, 3,1–10, 10,1–20 y >20. mg L−1[3].
Aunque hay varios conjuntos de datos disponibles sobre la acumulación de Li en la cadena
alimentaria, pocos estudios han determinado los efectos de la exposición crónica al Li a través de la
ingesta de agua en la salud humana y la biodiversidad.3,12]. En particular, muchas especies de vida
silvestre en las áreas de extracción de Li dependen de los humedales [13]. Estos incluyen flamencos
andinos (Phoenicopa-rrus andinusyP. jamesi), que se reproducen específicamente en la región y se
alimentan de artemia en lagos hipersalinos andinos [14], y especies de anfibios endémicos del género
amenazado Telmatobio[15]. Respecto a lo primero, Gutiérrez et al. [dieciséis] señaló que el tamaño de las
poblaciones de flamencos está correlacionado negativamente con la minería de Li. Varios estudios
también han informado sobre los impactos negativos de la extracción de Li en América del Sur, donde el
bombeo de salmuera ha provocado que los niveles de agua subterránea caigan [17] y alteró la calidad de
los ecosistemas de humedales y las especies que dependen de ellos, como peces y anfibios [15]. En este
contexto, algunos estudios han descrito los efectos del Li en especies de peces y anfibios relacionados
con efectos perjudiciales sobre el desarrollo embrionario y la organogénesis que conducen a una
teratogénesis severa o un desarrollo y crecimiento anormales.18–21].
Por otro lado, el Li y sus compuestos también se utilizan en la medicina humana, prescribiéndose
como psicofármaco contra el trastorno bipolar desde su descubrimiento en 1970.22]. Estudios sobre la
toxicidad del Li han determinado que el Li podría tener un mecanismo análogo al del cobre, que
interfiere con la producción de energía y la regulación de iones.23]. Algunos de los objetivos directos del
Li son enzimas intracelulares dependientes de Mg.24]. En este sentido, Srinivasan et al. [25] proporcionó
pruebas de competencia entre [Li+] y [Mg2+] para los sitios de unión de las proteínas de unión de
nucleótidos de guanina (proteínas G). Además, se ha descubierto que la exposición crónica al Li tiene
efectos sobre la modulación de la función sináptica en las terminales nerviosas.26]. En este contexto, El-
Tekreti y Çilingir Yeltekin [27] demostró que el Li tiene un efecto tóxico sobre el metabolismo cerebral al
inhibir las actividades antioxidantes. También se ha demostrado que el Li induce cambios en los canales
de sodio que disminuyen el potasio intracelular, lo que aumenta el voltaje de los miocitos cardíacos,
provocando inestabilidad eléctrica en las aurículas y los ventrículos.28]. Además, la exposición al Li causa
efectos citotóxicos y genotóxicos relacionados con el daño al equilibrio antioxidante/oxidante en las
células.29] e induce anomalías de la tiroides [30].

Los estudios de múltiples biomarcadores en anfibios han encontrado que estos biomarcadores
pueden inferirse como señales de advertencia temprana de efectos sobre la salud ecológica de un medio
ambiente.31,32]. La falta de especificidad de un solo biomarcador ha llevado a un aumento en el uso de
diferentes biomarcadores en la evaluación del riesgo ecotoxicológico y la caracterización de un
contaminante.33]. En los renacuajos de anfibios, las respuestas ecotóxicas pueden examinarse mediante
diferentes niveles jerárquicos de biomarcadores, como marcadores bioquímicos, celulares, tisulares,
orgánicos, sistémicos y de todo el organismo, lo que hace que un estudio ecológico sea relevante.32].
Recientemente, la contaminación del agua ha sido señalada como una “bomba de tiempo” (sentidoTozer
et al. [34]) que amenaza los ecosistemas acuáticos en América del Sur, lo que resalta la urgente necesidad de su
control, mitigación y remediación por parte de los gobiernos. En este contexto, el objetivo de este estudio fue
evaluar la letalidad aguda y los efectos subletales crónicos del Li como contaminante de preocupación
emergente en renacuajos deRhinella arenarum(Hensel, 1867). Una primera toxicidad de 96 h.
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El ensayo se realizó exponiendo renacuajos a una amplia gama de concentraciones de Li para

estimar la mortalidad y las concentraciones de Li letales y subletales. Otro bioensayo crónico se
llevó a cabo exponiendo renacuajos a dos concentraciones de Li ambientalmente relevantes (2,5 y
20 mg L−1). Se analizaron biomarcadores bioquímicos, genotóxicos y fisiológicos para la
caracterización de los efectos subletales.
En el escenario actual de demanda global de extracción de Li a partir de salmueras, se necesitan
urgentemente evaluaciones de riesgos ecotoxicológicos del Li para garantizar que las tecnologías verdes no
conduzcan a una disminución de especies de humedales como los anfibios.

2. Materiales y métodos
2.1. quimicos
En la naturaleza, el Li no se encuentra en su forma libre como elemento reactivo.35]. Se puede
encontrar asociado a varias especies y componentes minerales, formando oxosales como el carbonato
de Li (Li2CO3), arcillas como la espodumena y cloruro de Li (LiCl), una sal iónica [8,36,37]. En términos
cristaloquímicos, Li se aloja como una especie de Li en todas esas estructuras. El método común utilizado
en la explotación industrial de salmuera de Li es el proceso evaporítico, principalmente debido a su
tecnología de bajo costo. Este proceso implica sucesivas etapas de concentración de salmuera por
evaporación solar y eólica en grandes estanques [6]. Luego del proceso de concentración, se producen
varias sales residuales en los pasos de purificación para finalmente obtener LiCl y luego Li.2CO3[7]. Cada
paso implica grandes volúmenes de agua dulce e inevitablemente produce LiCl como contaminante.7,13
]. En el presente estudio utilizamos LiCl 99% (CAS N◦
7447-41-8, Anedra®Research, Buenos Aires, Argentina) como fuente de Li, ya que se ha utilizado en
ensayos ecotoxicológicos en renacuajos de anfibios como organismos modelo [19,21,38]. Para
simplificar, en el resto del texto nos referiremos a él como Li. Los tratamientos de Li se prepararon
con agua del grifo declorada (DTW) con las siguientes propiedades químicas: pH 8,1±0,05,
conductividad 410µmhso/cm−1, concentración de oxígeno disuelto 5,5±1,5 mg·litro−1, y dureza 83
mg L−1como CO3CA a las 24±2◦C.

2.2. Especies de estudio

Rhinella arenarum(Bufonidae) es una especie de sapo sudamericano con una amplia

distribución geográfica, incluyendo Brasil, Uruguay, Paraguay, Bolivia y Argentina.39]. En Argentina
se encuentra en casi todas las provincias desde Chubut hacia el norte.40]. Ha sido ampliamente
utilizado como animal modelo en estudios de laboratorio para análisis fisiológicos, anatómicos y
toxicológicos.41–43]. Además, esta especie es de particular interés para el presente estudio porque
es una de las especies de anfibios más abundantes en el área del Triángulo de Li en Argentina.

renacuajos (n≈1000) deR. arenarumfueron recolectados de pequeños estanques temporales

ubicados en la llanura aluvial del ParanáaRío (31◦11′31"S, 60◦9′29"W), que se considera natural y
libre de contaminación según estudios previos [44,45]. La recolección fue autorizada por el
Ministerio de Ambiente de la Provincia de Santa Fe (EXP. N◦02101-0026248-0), Argentina. Los
renacuajos fueron inmediatamente transportados en DTW al laboratorio y aclimatados a un ciclo
de luz/oscuridad de 12 h y 24±2◦C antes del ensayo. Los experimentos se realizaron con renacuajos
del mismo estadio de Gosner (GS) [46,47] y tamaño, que fueron seleccionados entre los
recolectados.

2.3. Diseño experimental

2.3.1. Prueba de letalidad aguda

Se realizó un ensayo exploratorio de toxicidad aguda de 96 h con renacuajos deR. arenarum (GS 26)
expuesto a una amplia gama de concentraciones de Li (44,08, 56,51, 72,45, 92,89, 119,09, 152,68, 195,75,
250,5, 321,75 y 412,5 mg L−1) por triplicado. También se añadió por triplicado un tratamiento de control
negativo (CO) con DTW. Cada réplica consistió en diez renacuajos en 1 litro de solución de prueba
contenida en un matraz de vidrio. El bioensayo se mantuvo en condiciones fijas de laboratorio (24◦C±2◦C,
ciclo de luz/oscuridad de 12 h). Se registró la mortalidad de renacuajos y los animales muertos se
retiraron cada 24 h. Tasas acumuladas de mortalidad y supervivencia.
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para cada tratamiento, así como la concentración letal media (CL50) y las concentraciones sin
efecto y con el efecto más bajo observado (NOEC y LOEC, respectivamente) se calcularon cada 24
h, hasta 96 h de exposición.

2.3.2. Bioensayo crónico

Se realizó otro bioensayo para el análisis de diferentes biomarcadores subletales. Los renacuajos
fueron expuestos a tres tratamientos: (A) un control negativo con DTW (CO); (B) 2,5 mg·litro−1Li (Li 2,5),
que es una concentración que se ha considerado ambientalmente segura en América del Sur [21,38]; y (C)
20 mg L−1de Li (Li 20), que es la concentración máxima de Li reportada para cuerpos de agua argentinos [
3]. Originalmente se planeó que la exposición crónica a todos los tratamientos fuera de dos semanas, un
tiempo estandarizado experimentalmente antes de que los renacuajos alcancen la fase prometamórfica
de desarrollo (GS 36-41). Sin embargo, en el tratamiento con Li 20, la mortalidad de los renacuajos
superó el 10% después de la primera semana. En consecuencia, luego se evaluaron dos tiempos de
exposición: una semana para los tres tratamientos (CO, Li 2.5 y Li 20), y dos semanas solo para los
tratamientos CO y Li 2.5. Los tratamientos se realizaron por triplicado, con n = 10 renacuajos en un
matraz de vidrio de 1 L para cada réplica. Las soluciones se renovaron cada 48 h. Los renacuajos fueron
alimentados con raciones iguales de lechuga hervida, que se agregaron a cada tanque cada vez que se
renovaban las soluciones. Las condiciones de laboratorio fueron las mismas que las de la prueba aguda y
permanecieron constantes durante todo el bioensayo.

2.4. Biomarcadores
2.4.1. Biomarcadores bioquímicos
Determinar las actividades de diferentes enzimas (glutatión-S-transferasa, GST;
carboxilesterasa, CbE; fosfatasa alcalina, ALP; alanina aminotransferasa, ALT; y aspartato
aminotransferasa, AST) y los niveles de hormona tiroidea (T4) al final de cada exposición al
tratamiento. , n = 8 renacuajos por tratamiento fueron pesados (g) y homogeneizados (1:10,w/v)
en sacarosa 25 mM helada, tampón Tris-HCl 20 mM (pH = 7,4) con EDTA 1 mM, utilizando un
triturador de tejidos Polytron. Luego los homogeneizados se centrifugaron a 10.000 rpm a 4±1◦C
durante 15 min y se almacena a−80◦C hasta el análisis de biomarcadores bioquímicos.

Actividades enzimáticas

La actividad de GST se determinó mediante espectrofotometría a 340 nm en tampón

fosfato de sodio 100 mM (pH = 6,5), 20µM 1-cloro-2,4-dinitrobenceno y 50µM glutatión
reducido (GSH), siguiendo el método descrito por Habig et al. [48] y adaptado para la
actividad GST en suero de mamíferos por Habdous et al. [49]. La actividad de CbE se midió
utilizando acetato de 1-naftilo (1-NA) como sustrato [50]. Brevemente, la hidrólisis de 1-NA se
determinó según el método de Gomori [51] que fue adaptado por Bunyan y Jennings [52].
Las actividades de GST y CbE se expresaron como nmol min.−1mg−1de proteínas.
Las actividades de ALP, ALT y AST se midieron utilizando kits comerciales (Wiener Lab®,
Rosario, Argentina) según las instrucciones del fabricante y procedimientos estandarizados [
50,53]. Las actividades de ALP, ALT y AST se expresaron como U mg.−1de proteínas.

Niveles de hormona tiroidea

Los niveles totales de T4 se determinaron utilizando kits de inmunoensayo electroquímico
luminiscente ligado a enzimas (ECLIA) (COBAS®, Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EE. UU.),
según las instrucciones del fabricante. El límite de detección de T4 fue de 0,42 ng g−1[54].

2.4.2. Biomarcadores genotóxicos

La prueba de micronúcleos (MN) se realizó siguiendo el protocolo de Cabagna et al. [55] y

Lajmanovich et al. [56,57]. Brevemente, se prepararon frotis de sangre en portaobjetos, se fijaron y
se tiñeron con tinción de May-Grünwald-Giemsa. Un observador simple ciego calificó los
portaobjetos codificados y aleatorizados. La frecuencia de MN se determinó en 1000 eritrocitos de
cada renacuajo utilizando un microscopio bajo 100×aumento.
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La presencia de otras anomalías nucleares eritrocitarias (ENA) también se determinó en

eritrocitos maduros según Carrasco et al. [58], Guilherme et al. [59], y Lajmanovich et al. [57],
y se clasifican en los siguientes tipos: núcleos lobulados, binucleados, con muescas, con
forma de riñón, picnóticos y eritroplastos o eritrocitos anucleados. Los resultados se
expresaron como frecuencia de ENA y el valor medio de la suma de todas las lesiones
observadas [57].

2.4.3. Biomarcadores fisiológicos

Frecuencia cardíaca

La frecuencia cardíaca (FC) se evaluó siguiendo la metodología descrita por nuestro grupo para
otras especies de anfibios nativos [60,61]. Brevemente, los renacuajos (n = 7 por tratamiento) se
colocaron en posición ventral hacia arriba en una placa cóncava delgada. El área del corazón se
transiluminó de abajo hacia arriba con una luz fría puntual (Luxeon Rebel LED de 3 vatios ©Philips
Lumileds, San José, CA, EE. UU.). Los videos se grabaron con un microscopio digital USB portátil activado
remotamente (resolución de captura de video: 640×480, 30 fps) en condiciones de laboratorio
(temperatura constante de 24◦C) durante 15 s. La FC (latidos min−1) se cuantificó a partir de vídeos
digitales de baja velocidad mediante examen visual directo del latido máximo del ventrículo en sístole [61
,62]. El número de latidos medidos en los 15 s registrados se multiplicó por cuatro para obtener el valor
de 1 min.60,63].

Producción de pellets fecales (FPP)

La FPP es una medida no invasiva efectiva que podría usarse para estimar el índice de
consumo, el efecto tóxico y el daño al tracto gastrointestinal y el estrés fisiológico en renacuajos
anfibios.64,sesenta y cinco]. La FPP de los individuos expuestos a cada tratamiento se midió
durante 48 h. Se tomaron fotografías sagitales de los tanques para cada réplica de tratamiento
antes de la renovación de las soluciones. Los campos fotografiados fueron procesados con
Imagen J.®versión de software 1.54f. Se establecieron ajustes de umbral para permitir la medición
del área total del fondo (TBA) del tanque y el área del fondo que contiene gránulos fecales (AFP). La
FPP se expresó como la cobertura del fondo del tanque con materia fecal (expresada como
porcentaje de cobertura fecal, %FC) y se calculó como %FC = (AFP.100)/TBA.

2.5. Análisis de los datos

La mortalidad acumulada de cada tratamiento del ensayo agudo se expresó como tasa
de supervivencia (% de individuos vivos en cada tiempo de exposición;sentidoLajmanovich et
al. [66]). la LC50Los valores y sus respectivos límites de confianza del 95% se calcularon a las
48, 72 y 96 h, utilizando el método Trimmed Spearman-Karber, que se considera un método
de cálculo exacto y preciso para investigaciones toxicológicas.67]. El LOEC y el NOEC se
obtuvieron analizando la tasa de supervivencia y se definieron como la concentración
probada que mostró la mortalidad mínima y la concentración probada que no mostró
mortalidad, respectivamente.68]. Cuando el LOEC era superior al LC50, se consideró no
aplicable [69].
Los datos de biomarcadores subletales se expresan como media.±DAKOTA DEL SUR. Se realizaron
las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene para verificar la normalidad y homogeneidad de la
varianza de los datos de los biomarcadores.70]. Se realizaron análisis de varianza univariante (ANOVA)
seguidos de la prueba post hoc de Dunnett para los análisis de los conjuntos de datos registrados
durante la primera semana del bioensayo crónico (tratamientos Li 2.5 y Li 20), mientras que la prueba t
de Welch no apareada se realizó para los análisis de los conjuntos de datos obtenidos durante la
segunda semana (tratamiento con Li 2.5). Para todas las pruebas estadísticas, los valores depag<0,05 se
consideraron significativos. Todos estos análisis estadísticos se realizaron utilizando el software BioEstat
5.0 [71] e InfoStat/P versión 1.1 (Grupo InfoStat Professional, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad
Nacional de CoCórdoba, Argentina).
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3. Resultados

3.1. Prueba de letalidad aguda

En las primeras 24 h, no se observó mortalidad de renacuajos en los tratamientos con CO y en todos los
tratamientos con Li (supervivencia del 100%, Figura1). La tasa de supervivencia comenzó a disminuir después de 48 h en
los tratamientos con mayores concentraciones de Li (321,75 y 412,5 mg L−1). La tasa de supervivencia fue menor a las 72
y 96 h, incluso en los tratamientos con menores concentraciones de Li (hasta 56,51 mg L−1), como se muestra en la
figura1.

Figura 1.Porcentajes de tasa de supervivencia deRhinella arenarumrenacuajos expuestos a diferentes concentraciones

de Li (mg L−1) y un control negativo (CO) a las 24, 48, 72 y 96 h de exposición.

A medida que la mortalidad en los tratamientos con Li aumentó con el tiempo, los valores de
LC50, LOEC y NOEC fueron menores en los tiempos de exposición más largos (Tabla1). El método
recortado de Spearman-Karber nos permitió determinar la CL50valores de Li para cada tiempo de
exposición, que oscilaron entre 319,52 (281,21–363,05) mg L−1a las 48 h a 66,92 (52,76–84,89) mg L
−1a las 96h. Además, el LOEC disminuyó de 119.09 mg L−1(72 h) a 56,51 mg L−1(96 h), y la NOEC a
partir de 250 mg L−1(48 h) a 44,08 mg L−1(96 h) (Tabla1).

Tabla 1.Valores de la concentración letal mediana (LC50) y las concentraciones sin efecto y con el efecto más
bajo observado (NOEC y LOEC, respectivamente) de Li (mg L−1) paraRhinella arenarumrenacuajos (GS 26).

48 horas 72 horas 96 horas

319,52 167.026 66,92

LC50
(281,21–363,05) mg L−1 (107,68–246,47) mg L−1 (52,76–84,89) mg L−1
LOEC n/A 119,09 mg·litro−1 56,51 mg·litro−1
NOEC 250 mg·litro−1 92,98 mg·litro−1 44,08 mg·litro−1

na: no aplicable ya que el valor LOEC fue mayor que el LC50.

3.2. Bioensayo crónico

3.2.1. Biomarcadores bioquímicos
La actividad de GST disminuyó significativamente (F = 3,61,pag<0,05) en el tratamiento Li 2,5 en la primera
semana de exposición respecto al CO (Figura2a). La actividad de CbE también aumentó significativamente
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disminuyó en la primera semana (F = 3,55,pag<0,05) de exposición en el tratamiento Li 20. De manera

similar, el CbE disminuyó (t = 4.387,pag<0,05) tras la segunda semana de exposición en el tratamiento Li
2,5 respecto al CO (Figura2b).

(a) (b)

(C) (d)

(mi) (F)

Figura 2.Biomarcadores bioquímicos deRhinella arenarumrenacuajos expuestos al tratamiento de control

negativo (CO), 2,5 mg L−1Li (Li 2,5) y 20 mg L−1(Li 20) Li durante la primera semana de exposición, y CO y Li 2,5
durante la segunda semana: (a) glutatión-S-transferasa, GST; (b) carboxilesterasa, CbE; (C) fosfatasa alcalina,
ALP; (d) alanina aminotransferasa, ALT; (mi) aspartato aminotransferasa, AST; (F) hormona tiroidea T4. Los datos
se expresan como la media.±DAKOTA DEL SUR. Diferencias significativas respecto al control: *pag<0,05; **pag<
0,01.

Las actividades de ALP, ALT y AST aumentaron significativamente en los renacuajos expuestos a Li
2,5 en la primera semana (F = 73,58pag<0,01, F = 57,22pag<0,01 y F = 11,63pag<0,01, respectivamente).
De manera similar, estas actividades enzimáticas también aumentaron en la segunda semana de
exposición (t = 4,11pag<0,01,t = 2,73pag<0,05, t = 3,5pag<0,01, respectivamente). En todos los casos se
trata de incrementos respecto al CO (Gráfico2c-e). Por el contrario, las actividades ALT y AST fueron
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se redujo significativamente en renacuajos expuestos a Li 20 en la primera semana (F = 57,22pag<0,05 y F =

11,63pag<0,05, respectivamente) con respecto a los renacuajos de CO.
Los niveles de T4 aumentaron significativamente (t = 3,107,pag<0,01) en el tratamiento Li 2,5 en la
segunda semana de exposición respecto al CO (Figura2F).

3.2.2. Biomarcadores genotóxicos

Se observó una frecuencia de MN significativamente mayor en la sangre de todos los renacuajos

tratados con Li con respecto al CO, tanto en la primera como en la segunda semana de exposición (F =
29,29, pag<0,01 y t = 4,747,pag<0,01, respectivamente; Cifra3a). La frecuencia de MN en los renacuajos
de CO no superó la media de 1 MN por 1000 eritrocitos en la primera o segunda semana de exposición.
La frecuencia de MN fue mayor en el tratamiento Li 20 (8±2,12 MN por 1000 eritrocitos) en la primera
semana que en el tratamiento con Li 2,5 tanto en la primera como en la segunda semana de exposición
(6,8±1,48 y 6,4±2,3 por 1.000 eritrocitos, respectivamente).

(a) (b)

(C) (d) (mi) (F) (gramo)

Figura 3.Frecuencias de (a) micronúcleos (MN) y (b) otras anomalías nucleares de los eritrocitos (ENA) en
Rhinella arenarumrenacuajos expuestos a un tratamiento de control negativo (CO), 2,5 mg L−1Li (Li 2,5) y
20 mg L−1(Li 20) Li durante la primera semana de exposición, y CO y Li 2,5 durante la segunda semana.
Las frecuencias se expresan como la media.±Número DE de MN o ENA por 1000 eritrocitos. Diferencias
significativas respecto al control: **pag<0,01. Microfotografías (ampliación 1000×) muestran eritrocitos
teñidos con May-Grünwald-Giemsa: (C) normal; (d) con micronúcleo; (mi) lobulado; (F) con núcleo en
forma de riñón; (gramo) con núcleo binucleado.

La frecuencia de ENA fue significativamente mayor (F = 16,93,pag<0,01; Cifra3b) en ambos

tratamientos con Li en la primera semana de exposición (9,25±4.35 y 12.25±2,21 ENA por 1000
eritrocitos para Li 2,5 y Li 20, respectivamente) respecto al CO (3,25±0,97 ENA por 1.000 eritrocitos).
La frecuencia de ENA también fue mayor (t = 2,67pag<0,01) en Li 2,5 en la segunda semana de
exposición (7,4±4,76 ENA por 1000 eritrocitos) en comparación con el CO (3,5±0,95). Los tipos de
ENA más frecuentes observados en todos los tratamientos fueron los eritrocitos con núcleos
lobulados y reniformes, seguidos de los binucleados (Figura3e – g) y núcleos con muescas.
tóxicos2024,12, 176 9 de 17

3.2.3. Biomarcadores fisiológicos

Frecuencia cardíaca

La FC disminuyó significativamente (F = 7,56,pag<0,01) en renacuajos expuestos a Li 20 durante una

semana (97,6±10,8 latidos mínimo−1) con respecto al CO (119,6±4,56 latidos mínimo−1). Por el contrario, la FC
aumentó significativamente (t = 3,55,pag<0,01) en renacuajos expuestos a Li 2,5 durante dos semanas (138,4±
11,52 latidos min−1) con respecto al CO (118,8±4,38 latidos mínimo−1). Los resultados del análisis de recursos
humanos se muestran en la figura.4.

(b)

(a) (C)

Figura 4.(a) Frecuencia cardíaca (FC) de renacuajos deRhinella arenarumexpuesto a un tratamiento de control negativo
(CO), 2,5 mg L−1Li (Li 2,5) y 20 mg L−1(Li 20) Li durante una semana, y CO y Li 2,5 durante dos semanas. Las imágenes
muestran las fases del ritmo del ciclo cardíaco utilizadas para medir los latidos: sístole ventricular (b) y diástole (C).
Diferencias significativas respecto al CO **pag<0,01.

Producción de pellets fecales (FPP)

Los renacuajos expuestos a los tratamientos Li 2.5 y Li 20 mostraron una FPP

significativamente mayor que los renacuajos de CO (F = 147.13,pag<0,01). A las 48 h de exposición,
el FPP en el CO fue de 1,41±0,26% FC, mientras que en Li 2,5 fue 2,69±0,9% FC y el de Li 20 fue 8,47
±1,39% FC (Figura5).

(b)

(C)

(a) (d)

Figura 5.(a) Producción de pellets fecales (FPP) deRhinella arenarumrenacuajos expuestos a un tratamiento de
control negativo (CO), 2,5 mg L−1Li (Li 2,5) y 20 mg L−1(Li 20) durante 48 h, expresado como porcentaje de
cobertura fecal (%FC) del fondo del tanque. Las imágenes muestran los vectores obtenidos de las fotografías del
fondo de los tanques de cada tratamiento, (b) CO, (C) Li 2,5, y (d) Li 20, para el cálculo del %FC. Diferencias
significativas respecto al CO: *pag<0,05; **pag<0,01.
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4. Discusión
La ecotoxicidad del Li se ha determinado en diferentes organismos acuáticos, incluyendo algas,
cladóceros, insectos y peces.27,72–74]. Al igual que en nuestro estudio, en estos estudios
ecotoxicológicos, la forma de Li probada fue cloruro de Li (LiCl) [21,38]. Es importante señalar que los
estudios en anfibios siguen siendo escasos y que sólo unos pocos se han centrado en los efectos del Li
en las primeras etapas embrionarias.74]. Los resultados de nuestro presente estudio resaltan que, en
concentraciones ambientalmente relevantes, el Li es altamente ecotóxico para etapas avanzadas de
desarrollo deR. arenarumrenacuajos después de un tiempo de exposición corto (bioensayo agudo) y
medio (bioensayo crónico medio, dos semanas). Después de una exposición prolongada, las respuestas
subletales pueden provocar efectos irreversibles en el crecimiento y el desarrollo (durante todas las
etapas de embriogénesis y metamorfosis) [75,76].
Además, los resultados obtenidos en el bioensayo agudo realizado en el presente estudio
sugieren que los efectos del Li sobre la mortalidad de los renacuajos de anfibios dependen tanto
de la etapa de desarrollo como del tiempo de exposición. la LC50a las 96 h (66,92 mg L−1Li)
disminuyó aproximadamente un 80% respecto al valor obtenido a las 48 h (319,52 mg L−1
Li). En anfibios, un valor mucho más bajo de LC de 96 h.50de 2 mg L−1ha sido reportado porXenopus
laevisembriones [19]. El hecho de que la mortalidad aguda fuera significativamente mayor con altas
concentraciones de Li después de una exposición corta puede explicarse en términos de la sensibilidad
de las etapas de desarrollo evaluadas (la susceptibilidad al contaminante depende del período de
desarrollo durante el cual ocurre la exposición, siendo los embriones mucho más sensible que los
renacuajos) [19]. La amplia gama de LC50Los valores obtenidos en este estudio según el día de
exposición son consistentes con otros estudios que informaron CL variada a 96 h.50valores en varias
especies de peces, que van desde 13 a más de 100 mg L−1Li a las 96 h, en contraste con un rango menor
con exposiciones más prolongadas, alcanzando valores de 0,6 y 1,4 mg L−1a los 26 días [73,77]. Este
efecto tardío del Li probablemente también influyó en la mortalidad inesperada de los renacuajos en el
tratamiento con Li 20 en el bioensayo crónico después de la primera semana. Aunque el Li 20 está muy
por debajo del valor NOEC en el bioensayo agudo, una exposición más prolongada también podría
significar efectos letales. En una exposición aguda, es posible que el Li aún no se absorba
completamente en el cuerpo y, por lo tanto, no se mostrarán todos sus efectos [74,78]. Además, el hecho
de que una concentración estimada no letal haya mostrado mortalidad también podría explicar el efecto
antagonista u hormético observado para ciertos biomarcadores como GST, ALT, ALP y AST en relación
con el tratamiento no letal más bajo (Li 2,5). . Estas diferencias podrían deberse a un agotamiento
metabólico que pueden estar sufriendo los organismos expuestos al Li 20 a través de la exposición antes
de morir, lo que conduce a una disminución drástica en el funcionamiento normal de su metabolismo.

Dado que enzimas como GST y CbE desempeñan un papel clave en la desintoxicación de los
xenobióticos y su metabolismo, se espera que aumenten en escenarios de exposición tóxica.79,80]. Sin
embargo, enR. arenarumrenacuajos expuestos a Li, se inhibieron las actividades de ambas enzimas.
Principalmente, la actividad de GST disminuyó significativamente en el grupo de tratamiento con Li 2.5
después de la primera semana de exposición, un hecho que puede explicarse en términos de su
inactivación por Li o debido al agotamiento del conjugado de glutatión, lo que conduce a la pérdida de
actividad de GST. [81]. Como el GST contribuye a proteger los tejidos del estrés oxidativo, su disminución
podría sugerir alteraciones en el sistema de defensa antioxidante.60]. Además, la mayor sensibilidad de
GST a la menor concentración y tiempo de exposición también podría sugerir una adaptación fisiológica
al Li, como ya se describió para los renacuajos deR. arenarum expuesto a otros contaminantes como
pesticidas y antibióticos [44].
Respecto a la CbE, esta enzima juega un papel importante en el metabolismo xenobiótico. De manera
similar a nuestros resultados, algunos otros estudios han informado la inhibición de la CbE por diferentes
compuestos (agroquímicos y microplásticos) en renacuajos de anfibios.82–84]. En nuestro estudio, se observó
una disminución en la actividad de CbE en renacuajos tratados con Li 20 durante una semana así como en
renacuajos tratados con Li 2.5 durante dos semanas, lo que sugiere un efecto inhibidor a medio-largo plazo del
Li sobre esta enzima. Este resultado no es consistente con estudios previos sobre los efectos del Li en la CbE, ya
que se han informado respuestas variadas de la enzima en diferentes animales. Por ejemplo, Prabha et al. [85]
encontró que Li tiene un efecto positivo en la liberación de CbE en
tóxicos2024,12, 176 11 de 17

ratas, mientras que Cunha et al. [86] no mostró efectos significativos de la exposición al Li sobre la CbE
en el mejillón.Mytilus galloprovincialis. Se necesitan más estudios con tiempos de exposición más
prolongados para comprender mejor los efectos del Li sobre estas enzimas y los procesos biológicos en
los que intervienen, así como los mecanismos por los que se produce la respuesta.
Además de las alteraciones en el proceso de desintoxicación, observadas por la modificación de la
actividad de enzimas clave como GST y CbE, los renacuajos expuestos al Li también mostraron
alteraciones en las actividades de ALT, AST y ALP, lo que sugiere alteraciones en el metabolismo de los
aminoácidos y daño al tejido. En particular, un aumento de AST y ALT indica daño a los tejidos hepáticos.
87]. Además, un aumento de la FA indica una obstrucción en el sistema biliar intra y extrahepático.53].
También se observó una vesícula biliar más coloreada en comparación con los renacuajos de control en
las larvas expuestas al Li (obs. personal), lo que puede respaldar esta hipótesis. La ALP es una enzima
clave en muchos procesos biológicos relacionados con la desintoxicación, biosíntesis y metabolismo de
macromoléculas energéticas, y las alteraciones en sus actividades están relacionadas con alteraciones en
la permeabilidad de la membrana plasmática o necrosis celular.88]. De acuerdo con esto, se han
informado varios efectos citotóxicos de la exposición al Li, como necrosis, vacuolización e inflamación de
varios tejidos.89,90]. Se deben realizar más estudios para dilucidar el grado de los efectos citotóxicos y la
inflamación de los tejidos.
Las actividades de ALT y AST mostraron el mismo patrón de aumento en los renacuajos tratados con Li 2,5
y disminución en los renacuajos tratados con Li 20. Estos resultados resaltan una respuesta de estas enzimas
dependiente de la concentración de Li. También se ha registrado una disminución comparativa en la actividad
de ambas enzimas en concentraciones más altas en ratas expuestas a LiCl.91]. Estudios previos también
sugieren una respuesta dependiente del tiempo tanto de ALT como de AST debido a la actividad normal
encontrada en la exposición aguda al Li en contraste con su mayor actividad después de una semana de
exposición al Li.92].
En cuanto a la hormona tiroidea T4, sus niveles aumentaron después de dos semanas de exposición al Li
2.5. Este resultado sugiere un efecto de la exposición prolongada al Li sobre esta hormona, ya que no se
observaron diferencias significativas en los niveles de T4 para el mismo tratamiento con respecto al CO después
de la primera semana de exposición. Pinto et al. [38] también sugirió un aumento en la disponibilidad de T4 en
renacuajos de la rana toro americana (Lithobates catesbeianus) expuesto a 2,5 mg L−1
Li. Además, Palm también ha informado de una sobreproducción de T4.mir et al. [93] como efecto
de la toxicidad del Li en humanos. Benzd et al. han informado de hallazgos similares. [94], quien
también propuso una asociación entre la duración de la exposición y el grado de persistencia del
efecto. Además, los niveles de T4 podrían estar relacionados con la inactivación de los receptores
sensores de Ca2+por Li, e interferencia con la señalización que puede mejorar la producción
tiroidea y Ca2+en sangre [95]. De acuerdo con la similitud de la T4 y sus mecanismos de acción en
los vertebrados, el mecanismo de alteración endocrina del Li sugerido para los humanos también
podría explicar la tirotoxicosis del Li observada en los renacuajos de anfibios.96]. Además, el
aumento de T4 en anfibios también podría ser causado por la corticosterona, ya que, en muchos
casos de estrés por contaminantes, provoca una aceleración de la metamorfosis para permitir que
el animal abandone el ambiente contaminado.38,97].
Con respecto a los biomarcadores genotóxicos, la alta frecuencia de MN y otros ENA
observada en renacuajos tratados con Li indica un fuerte efecto genotóxico. Algunos autores [57,
72,73] han propuesto que las variaciones en la forma de los glóbulos rojos y una alta frecuencia de
ENA podrían indicar un buen enfoque complementario para detectar daños por genotoxicidad. La
mayor frecuencia de estas anomalías nucleares es indicativa de una reacción celular adversa y/o
un mecanismo de vigilancia para eliminar células con daño genético.57]. La aparición de eritrocitos
con núcleos lobulados y citoplasma segmentado se considera indicativa de división celular directa
(amitosis), que, junto con la proliferación de células mitóticas, podría representar un medio a corto
plazo para aumentar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre en renacuajos de
anfibios.77]. La genotoxicidad del Li ha sido ampliamente estudiada en organismos modelo como
ratones mediante la prueba de macronúcleos y el estudio de aberraciones cromosómicas.98]. Los
efectos de la exposición a altas concentraciones de Li incluyen cambios conformacionales en el
ADN, así como la inhibición de la biosíntesis de proteínas y amidas.99]. Se ha sugerido que el daño
al ADN podría deberse al estrés oxidativo inducido por Li.29,100]. Los mecanismos
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implicados en el daño del ADN inducido por Li han sido profundamente estudiados y están relacionados principalmente
con la regulación negativa inducida por Li de p57, una proteína multifuncional relacionada con el control de la
expresión genética, el crecimiento, la diferenciación, la organización citoesquelética y la apoptosis.101,102].
Finalmente, en cuanto a los marcadores fisiológicos, los renacuajos expuestos a Li 20 durante una semana
mostraron una frecuencia cardíaca (FC) más baja que los renacuajos de CO, mientras que los renacuajos
expuestos a Li 2,5 durante dos semanas mostraron una FC más alta que los renacuajos de CO. Las alteraciones
en el ritmo de los latidos del corazón podrían estar asociadas con la interferencia del Li en la homeostasis iónica
celular del Na+ y K+, alterando el voltaje de los miocitos y provocando inestabilidad eléctrica en el ventrículo del
corazón.103,104]. Dado que el Li se utiliza en farmacología y medicina como parte de tratamientos psiquiátricos,
sus efectos secundarios en órganos clave como el corazón están bien estudiados en humanos.105]. Los efectos
cardiotóxicos del Li, incluyendo bloqueo sinoauricular, retraso de la conducción intraventricular, arritmias y
prolongación o acortamiento de diferentes partes del ciclo cardíaco, ya se han informado en humanos.28].
Además, Truedson et al. [78] descubrió que el Li puede afectar la frecuencia cardíaca en diferentes tiempos de
exposición, incluidas condiciones crónicas, agudas e incluso terapéuticas. Está más que claro que el Li tiene un
efecto cardiotóxico no sólo en humanos, sino también en organismos no objetivo como los anfibios, como se
demuestra en nuestro estudio. Son necesarios más estudios para dilucidar los mecanismos implicados en estas
alteraciones cardíacas por Li en la vida silvestre y sus consecuencias en la supervivencia de los organismos.

Por último, el aumento de FPP observado en renacuajos expuestos a Li durante 48 h sugiere un

signo claro de diarrea. Las alteraciones gastrointestinales, incluida la diarrea, son uno de los efectos
agudos más comúnmente descritos del Li.35,106]. Además, Lei et al. [107] informaron que la exposición
al LiCl causa inflamación del colon y disbiosis de la microbiota intestinal, así como la regulación negativa
de la IgA, que está relacionada con la inmunidad intestinal en ratones. Hasta donde sabemos, este es el
primer estudio que utiliza la FPP como biomarcador fisiológico en anfibios. El uso de FPP resultó útil ya
que permitió obtener resultados rápidos, económicos y no invasivos. Además, puede usarse como
método estándar para estudios futuros con biomarcadores clásicos para explorar la pérdida de
almacenamiento de energía en los alimentos y los efectos del Li en la función gastrointestinal, como los
efectos sobre la microbiota histológica y bacteriana.44],.

5. Conclusiones
Los resultados de nuestro estudio muestran que la exposición a concentraciones de Li ambientalmente
relevantes causa una alta ecotoxicidad en los renacuajos de anfibios. Las respuestas de los biomarcadores
demostraron genotoxicidad, tirotoxicosis, cardiotoxicidad, pérdida del almacenamiento de energía de los
alimentos a través de disfunción gastrointestinal y una disminución en los perfiles enzimáticos de los sistemas
antioxidantes y de biotransformación, lo que conduce a un desequilibrio entre la generación y eliminación de
especies reactivas de oxígeno. Estas alteraciones proporcionan la primera evidencia de ecotoxicidad de Li en
especies nativas de Argentina y sirven como alerta temprana para organismos cuya distribución incluye el
Triángulo de Li. Además, es importante señalar que, incluso cuando se expone a concentraciones bajas que se
consideran ambientalmente seguras (2.5 mg L−1Li),
R. arenarumlos renacuajos mostraron respuestas severas, lo que puede representar una preocupación
ecotoxicológica. Aún más preocupante, los renacuajos expuestos a la concentración más alta en el bioensayo
crónico, que representa concentraciones ambientales de Li (20 mg L−1Li) en humedales y agua dulce cerca de
áreas mineras, mostró una mortalidad significativa después de la primera semana de exposición.
Estas evaluaciones de riesgos ambientales y respuestas de biomarcadores en renacuajos anfibios
están lejos de lo que significa la sostenibilidad a largo plazo y la protección de la biodiversidad en los
informes anuales de las empresas multinacionales de Li que están explotando el Triángulo de Li en
Argentina. Es importante señalar que, si bien el EscazúProtocolo está aprobado en Argentina y
considerando que la salud ecológica es un tema que concierne a todo lo que está dentro del ambiente
(visión ecocéntrica), no se permiten aportes públicos y científicos a las decisiones y gestión ambiental por
parte de los gobiernos actuales. Esta nueva revolución energética “verde”, que ha creado una alta
demanda global de Li, un contaminante de creciente preocupación en los sistemas acuáticos, es
probablemente una futura “bomba de tiempo”.
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Contribuciones de autor:Conceptualización, APCB y RCL; metodología, APCB, AMA y MFS;

software, APCB, validación, PMP; análisis formal, APCB, PMP y RCL; redacción: preparación del
borrador original, APCB y RCL; redacción: revisión y edición, PMP y RCL; supervisión, AMA y GL;
administración de proyectos y adquisición de financiamiento, PMP y
RCL Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Este estudio fue parcialmente financiado por becas de investigación de la Agencia Nacional de
Promoci.on de la Investigacion, el Desarrollo Tecnologico y la Innovacion de Argentina (MINCyT-FONCyT
PICT 2021 N◦419), PIP-CONICET-037, y CAI + D-UNL-PIC N° 50620190100036LI.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:Los animales fueron tratados según el Comité

Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC), y se obtuvo la aprobación del comité de bioética
de la Facultad de Bioquí.imica y ciencias biológicasogicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe,
Argentina (Res. Nº 388/06).

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud a los autores
correspondientes.

Expresiones de gratitud:Agradecemos enormemente a la central estándar de distribución de medicamentos de

la Facultad de Bioquimica y ciencias biológicasogicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina y
Bioq. Silvina Villetti por facilitarnos el LiCl para los experimentos. Este estudio está dedicado al “Tercer Malon de
la Paz”, que une a los pueblos indígenas de la provincia de Jujuy en Argentina y representa la voz de los pueblos
que luchan contra la extracción de Li en sus tierras ancestrales, lo que aumenta tanto el agotamiento del agua
como la fractura de su etnocultura sin acciones democráticas ni ecológicas. -visión perspectiva. Agradecemos
especialmente a topf. Victoria Eusevi que mejoró mucho la gramática y el estilo. Finalmente, agradecemos a los
revisores y al editor por sus observaciones constructivas y sugerencias para mejorar este estudio.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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