Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos. Medios de cultivo. Métodos de aislamiento, Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio liquido. Cre- cimiento microbiano en medio sélido. Concepto de muerte de un microorganismo. Me- dida del crecimiento y enumeracién de microorganismos. Crecimiento microbiano equilibrado, Cinética de crecimiento de un cultivo estanco. Factores fisicos y quimicos que influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cinética de crecimiento en un cultivo continuo. Tipos de fermentadores. Bibliografia recomendada: Cap. 1 de la 8° edicién de Brock: Biologia de los microorga- nismos CRECIMIENTO MICROBIANO Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nimero de microorganis- mos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico mi- croorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demografico de una poblacién. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y seré tratada al final de este capitulo. Denominamos cielo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada, A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicacién del material genético, la sintesis de componentes celulares, la elongacién de la bacteria para alcanzar un tamaiio doble del inicial y su division por biparticién para dar lugar a dos eélulas hijas. La duracién del ciclo celular coincide con el tiempo de generacién y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una poblacién resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacién. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asinerénicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que estin replicando su ADN, otras que estén credciendo, otras que estan iniciando la divisién celular, ete. En un cultive sincrénico todas las células se encuentran simulténeamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sinerénicos son muy dificiles de mantener por lo que su importancia esta principalmente ligada a los estudios basicos de biologia microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento proximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sineronizacién del culti- vo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sinerénicas.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes nime- ros en un periodo de tiempo muy reducido, Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayoria de los casos depende de su niimero, entender e6mo se produce el cre~ cimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados, CULTIVO DE MICROORGANISMOS, El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fisicas, quimicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivs iquidos y sélidos en funcién de las caracteristicas del medio y eultivos discontinuos y continuos en funcién de la disponibilidad de nu- trientes en el medio. MEDIOS DE CULTIVO Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energia y elemen- tos quimicos para la sintesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbo- no orgénico. La formula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H;0;,N Jo que supone que los componentes de las células son: earbono que representa alrede- dor del 50% del peso seco, oxigeno (32%), nitrégeno (14%), fosforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cuy Zn. La elaboracién de medios de eultivo requiere proporcionar los elementos antes dos en una forma asimilable. Asi, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono or- ‘gdnico para los heterotrofos y como CO> para los autotrofos, el N en forma de NHy, de NOs" 0 de NOy o en forma de aminodcidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO,", el S procede de aminodcidos sulfurados 0 de SO,” ete. Ademis, en ciertos casos, es necesario afiadir a los medios de cultivo algunos amino: dos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la formula elemental mas concreta es: C3.nHo.1101, '0.6180.017P o.035Ko.os6 esta composicién puede variar ligeramente en funcién de las condiciones de cultivo 0 de fase de crecimiento. El conocimiento de la formula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacién del medio de cultivo mas adecuado para el mismo.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicién quimica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estén com= puestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de came, ete Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser liquidos o sélidos si se afiade algin agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar) En funcién de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferencia- les cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematies para identificar colonias de micro- organismos hemoliticos), seleetivo-diferenciales cuando combinan las dos caracteristi« cas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganis- ‘mo a partir de una mezela una poblacién mixta de gran tamafio. METODOS DE AISLAMIENTO El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayorfa de los casos, mediante la produccién de colonias aisladas en cultivos sélidos. creci- miento explosivo de las bacterias permite producir un gran nimero de ellas a partir de una tinica célula inicial de forma que, tras un periodo de ineubacién en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrin- secas en el cultivo (microorganismos pardsitos de otros), al desconocimiento de los re- querimientos especificos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofia por ejemplo). Se estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del nimero de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el nimero de ciertos tipos de microorganis- ‘mos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento, CONCEPTO DE CULTIVO PURO Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sélo un tipo de microorgani mos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composicién genética. Los cultivos puros sonMicrobiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: esenciales para poder estudiar las caracteristicas de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce mas sobre el funcionamiento de las comunida- des bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologia de los mi- croorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en con ciones de cultivos puros, CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LiQUIDO Si la bacteria crece en un medio liquido, en la mayoria de los casos las eélulas que se producen en cada divisién contintian su vida independientemente forméndose una sus- pensién de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio liquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucién de los pardmetros que miden el crecimiento microbiano: 1.- Fase lag o de adaptacién durante la que los microorganismos adaptan su meta- bolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. 2.- Fase exponencial o logaritmica: en ella la velocidad de crecimiento es maxima y el tiempo de generacién es minimo. Durante esta fase las bacterias consumen a veloci- dad maxima los nutrientes del medio. La evolucién del nimero de células durante esta fase se explica con los modelos matematicos que describiremos a continuacién. exponencial estacionaria mverte Pardmetro de medida Tiempo de cultive 3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nimero de bacterias (ni la masa u otros parimetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolis- mo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacién y libe~ racién de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrialMicrobiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algiin nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhéspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabélico real de los microorganismos en los ambientes na- turales. 4.- Fase de muerte: se produce una reduccién del némero de bacterias viables del cultivo. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SOLIDO Las fases, pardmetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos liquidos se presentan también en cultivos sélidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucién del nimero de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una eélula aislada e inmévil comienza a crecer sobre un substrato sélido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia, Por consiguiente, se deno- mina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produc- cién de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nimero inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se lla- ma un eésped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio, En el caso de microorganismos méviles (deslizantes) o en el de los hongos filamen- tosos que tienen un crecimiento tréfico no se producen colonias aisladas sino forma- ciones mas difusas 0 miceliares. co! NCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO Desde el punto de vista microbiolégico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, no se produce aumento en el niimero de microorganisms y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbio- légico y continuar desarrollando una actividad metabélica que se traduzea, por ejemplo, cn liberacién de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacién (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones 0 por las con= diciones fisicas 0 quimicas del entorno. En estos casos, podriamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. MEDIDA DEL CRECIMIENTO Y ENUMERACION DE MICROORGANIS- MOS Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales, se enumeran a continuacién: 1 Recuento directo: consiste en la observacién al microscopio de volimenes muy pequefios de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denomina~ dos cémaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de células sea del orden de 10° por ml. 2.- Medida de la masa de células: el sistema se basa en que las células en suspen- sién dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez. depende de la masa en suspensi6n y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella, Este es el pardmetro de medida mds facil de usar en los cultivos de laboratorio, La densidad de células debe ser del orden de 10° por ml. 3. Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo sélido adecuado para estimar el nimero de viables contando el mimero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una célula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadistico, es necesario contar mas de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, éstos se pueden recolectar por filtracién a través de una membrana (de 0.2 um de tama~ fio de poro) y posterior colocacién de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las coloni - Medida del mimero de particulas usando contadores electrénicos de particulas. Estos sistemas no nos indican si las particulas corresponden a células vivas 0 muertas; pero nos pueden dar una idea del tamaiio de las particulas. 5.- Medida de pardmetros bioquimicos tales como la cantidad de ADN, ARN, proteinas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo. 6. Medida de actividad metabélica de Jas bacterias como que respiran producen una disminucién del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxigeno (utilizacién de colorantes sensibles a oxidaciénereduccién tales como el azul de metileno). CRECIMIENTO MICROBIANO EQUILIBRADO, Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los pardmetros del cultivo (biomasa, niimero de células, cantidad de proteinas, de ADN, ete.) evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasio- nes en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicacién en cl laboratorio (o en microbiologia industrial). Sin embargo, es itil porque permite estu- diar el crecimiento microorganismos.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. CINETICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de micro- organismos que crecen aislados que no forman ningiin tipo de estructura, Esta es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias. Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir cémo va a evolucionar un cultivo, cémo va a ir consumiéndose el substrato y cémo se van a ir acumulando los productos del cultivo. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10,000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuando va a completarse el crecimiento, cémo se va a acumular el producto, etc. Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez gue pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético. El tiempo que tarda una célula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacién (x) y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones 6ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo, Cada vez que transcurre un tiempo de generacién, el nimero de células se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESION GEOMETRICA Las bacterias crecen siguiendo una progresién geométriea en la que el nimero de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de genera- cién (z). De esta forma, podemos calcular el numero de bacterias (N) al cabo de un ni- mero de generaciones (n) usando la ecuacién siguiente: N=No2" (ecuacién 1) siendo No el namero de células en el momento actual. El nimero de generaciones se puede calcular de la siguiente forma n=t/t (ecuacién 2) donde (¢s el tiempo transcurrido, Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2: N=No2"" (ecuacién 3) Los tiempos de generacién de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de t de 20 min). Esto lleva a que una tinica célula (No=1) ere- ciendo con un t= 20 min, Ilegue a poder producir 4.7 x 10”! células en 24 horas.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Las ecuaciones exponenciales son muy dificiles de manejar graficamente, por ello es mejor transformarlas en otras més simples. Para transformar una ecuacién exponencial cen una recta, tomamos logaritmos en los dos términos y resulta InN No + (t/t) In2 (ecuacién 4) Esto es: el logaritmo del mimero de células crece linealmente con el tiempo a razon de una constante igual a In2/t. Si el tiempo de generacién t es muy grande, el cre miento tendrd poca pendiente (sera lento) y si t es pequeito el crecimiento sera rpido, En un crecimiento equilibrado, todos los pardmetros de crecimiento (niimero de cé- lulas, biomasa de cultivo, acumulacién de metabolitos primarios, proteinas, dcidos nu cleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuacién anterior N puede repre- sentar cualquiera de estos factores. ‘TRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCION DE LA TASA DE CRE- CIMIENTO Otra forma de representar la cinética es considerando el incremento en el nimero de células (AN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacién que deseribe Ja cinética es la siguiente: aNd uN (ecuacién 5) esto es: el ineremento del niimero de células (AN) por unidad de tiempo (dt) es propor- cional al mimero de células presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionali- dad (1) se le denomina tasa de crecimiento Integrando la ecuacién anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la guiente funcién exponencial: N=NpeM (ecuacién 6) Ja transformacién de esta ccuacién en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente: InN No + ut (ccuacién 7) esto es: el incremento del logaritmo del nimero de células aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad p. Comparando esta ecuacién (7) con la similar presentada mas arriba (4), podemos concluir que t= In2/t y, por consiguiente, que t = In2/p. Es decir, que hay una correla- cidn inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (i) y el tiempo de generacién (7). Estas ecuaciones nos permiten predecir cudl serd el mimero de células, masa celular, ete, después de un cierto tiempo de cultivo (1) si conocemos i; 0 bien, poder calcular la tasa de crecimiento ja partir de medidas experimentales del incremento en el nimero de células, biomasa, etc,Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: 12.- FACTORES FiSICOS Y QUIMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECI- MIENTO. 1- Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento ade- cuada, Si estudiamos la variacién de la velocidad de crecimiento en funcién de la tem= peratura de cultive, podemos observar una temperatura minima por debajo de la que no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velo- cidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se aleanza la temperatura 6ptima a la que la velocidad es maxima. Por encima de esta temperatura éptima, la ve- locidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular. El incremento de Ia velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incre- mento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimaticas con la temperatura, Se denomina coeficiente de temperatura a la relacién entre el incremento de la velocidad de reaccién y el de temperatura, En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquimicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10°C la temperatura a la que tienen lugar. La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reduecién de la veloci« dad de crecimiento por la reduecién de la velocidad de reaccién y al cambio de estado de los lipidos de la membrana celular que pasan de ser fluids a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacién de las protefnas y a las alteraciones producidas en las membranas lipidicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la éptima, se produce la muerte celular répidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de divisién si baja posteriormente la ‘temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fio. Hay varios tipos de microorganisms en funcién de sus temperaturas de creci- miento minima, maxima y éptima. Tipode Temperatura Temperatura Temperatura microorganismo minima a Psicrofilo “545 12-15 Psicrétrofo “545 25-30 30-35 Meséfilo 5-15 30-45 35-47 Terméfilo 40-45 55-75 60-90 Los microorganismos psicrétrofos son meséfilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrdfilos facultativos. Esto es impor- tante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando ali« mentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeracion (4 - 8°C) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 °C).Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Los microorganismos capaces de producir infecciones son los meséfilos y algunos psicrétrofos ya que sus temperaturas 6ptimas de crecimiento coinciden con las corpora- les. sin embargo, tanto meséfilos como psicrOfilos, psicrétrofos y terméfilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias, 2. Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relacién entre la presién de vapor de agua del substrato de cultivo (P)y la presién de vapor de agua del agua pura (Ps). El valor de la actividad de agua esté relacionado con el de la humedad relativa (HR). El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabélicamente, Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua estin libremente disponibles para reacciones quimicas con el agua presente en una disolucién saturada de sal comin (NaCI) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatacién de los iones de la sal disuelta, En este iltimo caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencién del crecimiento no suele Ile- var asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo més 0 menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada practicamente ilimitada. La gran mayorfa de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores minimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a titulo orientativo, los siguientes: bacterias ay >0.90, levaduras a,>0.85, hongos filamentosos ay >0.80, Como puede verse, los hongos fila- mentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho mas secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razén se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almibares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias En funcién de su tolerancia a ambientes con baja d,, los microorganismos que pue- den crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, haléfilos y xeréfilos segtin toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente. La reduecién de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene im- portancia aplicada en industria alimentaria, La utilizacién de almibares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 3.- pH: Es un pardmetro critico en el crecimiento de microorganismos ya que cada lipo de microorganismo sélo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rapidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtencién de energia metabélica depende de la existencia de una diferencia en la concentracién de protones a ambos lados de la membrana citoplismica El pH interno en la mayoria de los microorganismo esté en el rango de 6.0 a 7.0. 10Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismos. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidéfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alealé- filos que toleran pH=10.0 Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pHT del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. Asi, por ejemplo, las bacterias lacticas que produ= cen grandes cantidades de acido lictico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacte- rias competidoras (Ilegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lacticas se convierten en la poblacién dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacién de acidos orginicos de cadena corta (férmico, acético, léctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la accién bactericida de estos écidos orgdnicos de cadena corta es mas potente que la debida tinicamente a la bajada del pH que produ- cen. Esto es, los dcidos orgdnicos de cadena corta son t6xicos para algunas bacterias por si mismos. El efecto etal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacién en la conser- vacidn de alimentos acidificdndolos. De esta forma, la adicién de dcido acético en forma de vinagre permite la conservacién de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la produccién de dcidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la ‘vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo). 4.= Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar elec= trones, esto es: sus caracteristicas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que in- tervienen en el potencial redox, aunque no el tinico, es la concentracién de oxigeno [oO]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganis- mos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes 0 reducto- ras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxigeno para que se produzca el crecimiento. En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (0 menos oxidantes) realizan un metabolismo fer- mentativo, Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxigeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, como Saccharomyces cerevisiae; 0 anaerobios acrotolerantes como las bacterias lacti- cas) 0 cuando muere en presencia de oxigeno (anaerobios estrictos como los clostri- dios). Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxigeno (anaerobios) que, in embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de uWMicrobiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: electrones que actiia como oxidante ambiental, Por ejemplo, las bacterias que "respiran" nitratos (NOs), sulfatos (SO,*) u otros compuestos organics oxidados (respiracién anaerobia), Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxigeno, no son capaces de utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermen tativo (las bacterias lacticas que son anacrobias aerotolerantes, por ejemplo) Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabo- lismo. Esto es: en presencia de oxigeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando, En el curso de ciertas reacciones metabélicas redox se forman compuestos altamen- te reactivos (radicales libres, formas superdxido) que pueden dafiar las proteinas, mem= branas y dcidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Las eélulas se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superdxido dismutasa (SOD) y eatalasa, Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen nix veles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxigeno, La deteccién de estas enzimas tiene valor taxonémico. 13. RENDIMJENTO DE LOS CULTIVOS. El grafico siguiente representa la yariacién de la biomasa (o mimero de células, etc.) de un cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cu- concentracién decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa. Biomasa Substrato Tiempo de cultivo Definiremos el rendimiento de utilizacién del substrato (Ys) al valor que repre- senta la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido: 12Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Y,= dN/dS (ecuacién 8) El rendimiento de utilizacién de diferentes substratos puede ser diferente (hay subs- tratos, 0 alimentos, que "engordan"! mas que otros), varia entre diferentes microorga- nismos (hay mictoorganismos que "engordan” més que otras comiendo lo mismo) y varia también en funcién de otras condiciones ambientales o fisioligicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si esta sano o enfermo o si esta en verano o en invierno). También varfa el rendimiento en funcién de que el metabolismo sea oxidativo o fer mentativo (estos conceptos seran revisados més adelante). Podemos calcular el rendimiento de la utilizacién del substrato en funeién de la can tidad de substrato afiadido al cultivo, o en funcién de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total (gramos de eélulas, por ejemplo) 0 de carbono presente en las células (aproximada- mente el 50% de la masa celular corresponde a carbono), Haciendo las transformaciones que se indican a continuacién sobre la formula que relaciona la variacién de biomasa con la de substrato (8), Ilegamos a la definicién de un nuevo concepto qs denominado tasa especifiea de consumo de substrato por el orga~ nismo, Y,= dN/dS (ccuacién 8) AN/at = Y, (dS/at) (ecuacién 9) (aN/dt)/N = Y, (AS/dt)/N (ecuacién 10) como, de acuerdo con la ecuacién (5), w= (AN/At)/N, H=Y.qy (ecuacién 11) Esto es, la tasa especifica de consumo de substrato (q,) la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto ma- yor sea la tasa de consumo mayor sera la tasa de crecimiento (1). = Yu (ccuacién 12) Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor serd la tasa de crecimiento, Sin embargo, hay una cierta compensacién entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento mas bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta relacién inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur. " La expresién "Zengordar" estd usada de forma metaférica: las bacterias no engordan. La uso porque resulta itil esta metéfora antropomérfica para entender algunos de los eonceptos relacionados con el ren- dimiento de cultivos.Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Por tiltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento (12) con la concentracién de substrato (S). En condiciones de substrato abundante, la concentracién de este no afecta al valor de 1; pero cuando el substrato se hace limitante, si existe ese efecto. La expre= j6n matematica que relaciona ambos parimetros se conoce con el nombre de ecuacién, de Monod y es la siguiente: H= Hamar [SAK +S)] (ecuacién 13) En esta ecuacién Ia tasa de crecimiento (jt) depende de 1a maxima que puede alean- zar el microorganismo (Himax), de 1a concentracién de substrato (S) y de un valor cons- tante, K,, que representa la concentracién de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la maxima, La ecuacién de Monod tendré mucha i portancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuacién el ren miento debe ser independiente de la concentracién de substrato, En la practica, los valores de K, suelen ser muy bajos, lo que indica que los microor- ganismos crecen con tasas (j1) muy préximas a las mAximas (mmx) a concentraciones de substrato bajas y s6lo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de creci- miento se reduce. Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Ky, considerablemente reducidos (La Kp indica la concentracién de substrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la maxima) 14, NTI ETICA DI IMIENTO EN UN CULTIVO. En un cultive continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se afiade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nu- trientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) ala misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente pro- ductos de interés (biomasa, metabolitos secundarios, ete.). Este tipo de cultivo es tam- bign importante en los estudios de fisiologia y de ecologia microbiana, En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo, Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se ‘van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. QUIMIOSTATO El tipo mas frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilucién (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parimetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuacién: 14Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: D=fV (ecuacién 14) donde f es la velocidad de flujo (ml hr) y Vel volumen del recipiente en ml. Por consi« guiente, las dimensiones de D son [h"']. El valor D indica el ntimero de volimenes de reactor (voltimenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el reciproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de subs- trato esta dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento p1 como el nivel de poblacion microbiana estan relacio- nados con el valor de D. densidad celular o biomasa concentracién de substrato Velocidad de dilucién A velocidades de D muy bajas, pequefios incrementos de la velocidad de dilucién producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan mas nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (1) segin Jo indicado en la ecuacién de Monod (ecuacién 13). La velocidad de crecimiento aumenta (ji aumenta y t disminuye) cuando la energia aportada por los nutrientes entrantes supera la energia de mantenimiento de los micro- organisms del cultivo, A valores bajos de D la concentracién de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que al- canzan unas poblaciones de gran tamafio creciendo a una tasa (\1) baja porque se en- cuentran en condiciones de limitacién de nutrientes (S j1msx, €l microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S al- canza un valor maximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la con= centracién del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (1) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). La evolucién de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuacién siguiente: X/dt = crecimiento - salida = wX - DX (couacién 15) Por consiguiente, si jt > D hay un incremento positivo de la poblacién en el qui- miostato, cuando ft = D el tamafio de la poblacién se mantendré estable (equilibrio) y si ht < D la poblacién disminuiré como consecuencia de la dilucién de las bacterias. En el steady-state, como (dN/dt) = 0, 1 = D como se habia explicado anteriormente.” Habida cuenta de que en el estado estacionario D = p, 1a ecuacién de Monod ((13) puede reformularse en los siguientes términos D> \hoax [Sd(Ky+8,)] (ecuacién 16) donde §, es la concentracién de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo. Despejando de la ecuacién 16 el valor de §, en funcién de los demés, se obtiene la = DKM(maD) (couacién 17) que permite calcular cémo varia la concentracién del nutriente limitante en el efluente en funcién de la tasa de dilucién D. Si llamamos Spa la concentracién de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentracién de este nutriente en el efluente; considerando que el substrato consumido en el fermentador (Sg-S,) es transformado en biomasa durante el estado es- tacionario (N) con un rendimiento Y,, podemos calcular la produccién de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones Yi(Se-S,) (couacién 18) N=Y{Se-(DK (thn) (couacién 19) Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilucién del fermentador. TURBIDOSTATOS Fen realidad, esto no es una demostracién de que en el steady state las tasas de dilueién y crecimiento se igualan, ya que en los céculos se partia de esta condicién para poder reformular la ecuacién de Monod. 16Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato en el que se ajusta la veloci- dad de dilucién de tal forma que la densidad Sptica del cultivo se mantiene constante El valor D en un turbidostato, por tanto, es variable, Por otra parte, en un turbidostato el medio de cultivo no contiene nutrientes limitantes. Los turbidostatos funcionan mejor valores de D altos, mientras que el quimiostato a valores de D bajos. CULTIVO SEMI-CONTINUO Un cultivo semi-continuo (feed-batch) es un cultivo estanco al que se aftaden en di- ferentes momentos nutrientes concentrados para permitir un mayor crecimiento o una produccién mas efectiva de metabolitos secundarios. En un cultivo de estas caracteristi- cas el nutriente afiadido suele ser una fuente que aporte el carbono necesario para obt ner energia y elementos para la sintesis de los metabolitos secundarios de interés. Por ejemplo, la produccién de penicilina se realiza mediante un cultivo de estas caracteris- ticas. TIPOS DE FERMENTADORES Podemos distinguir dos grandes tipos de fermentadores segtin el estado del medio de cultivo: fementadores liquidos y sé] FERMENTADORES LiQUIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desa- rrollan flotando libremente en el volumen de medio de cultivo o formando agregados mis 0 menos esféricos (pellets) en el caso de los cultivos de hongos. Este tipo de culti- vos se denomina en ocasiones eultivo sumergido. El disefio de un fermentador liquido requiere tener en cuenta una serie de factores que influyen en el crecimiento, y en el rendimiento del proceso: temperatura, pH, airea- cién, ete. Por consiguiente, el disefio fisico de los fermentadores liquidos tienen que incluir la presencia de sondas que permitan medir estos parimetros durante el cultivo y de sistemas que permitan corregir las desviaciones que se puedan producir (sistemas de refrigeracién para control de temperatura, sistemas de ajuste de pH mediante la adicis de fcidos o bases, ete.) Un aspecto adicional que considerar en el disefio de un fermentador drostatica que se alcanza en su base y que puede limitar el crecimiento de microorga- nismos. En general, la altura méxima de un tanque de fermentacién se sitiia en los 15 m ya que por encima de esa altura se aleanzan valores de presién inhibidores. Tienen especial importancia dos problemas: la agitacién destinada a asegurar una mezela correcta de los ingredientes del medio y de los microorganismos que erecen en ayia 17Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: Fermentadores en tanque Son los fermentadores mas sencillos. La agitacién se consigue por un sistema de palas unidas a un eje y un motor y por las turbulencias ereadas por un sistema de bafles adosados a las paredes de la cuba de fermentacién, La aireacién se consigue por un difusor de aire que emite desde la parte inferior de la cuba de fermentacién. La transferencia de oxigeno al cultivo se hace por las burbujas que van ascendiendo por el volumen de cultivo. El principal problema de estos fermentadores es el elevado coste del sistema mecé- nico de agitacién, principalmente cuando se realizan cultivos de hongos filamentosos en Jos que la viscosidad debida al micelio aumenta mucho. Fermentadores Air-lift En estos fermentadores la agitacién y a aireacién se logran mediante la inyeccién de aire por la parte inferior de la cuba de fermentacién, Ja entrada de aire produce un conveccién que se canaliza por un tubo vertical interior en a cuba, La aireacién también permite reducir la cantidad de calor producida durante la fermentacién, En este fermentador, las burbujas de aire van aumentando de tamaiio conforme as- cienden por el tubo interior por lo que su relacién superficie/volumen disminuye y la transferencia de oxigeno al cultivo es menor. Fermentadores Deep-Jet En ellos el aire se inyecta a presién desde la parte superior de la cuba de fermenta- cién de forma que las burbujas de aire se van haciendo mas pequefias (mejor transferen- ia de oxigeno) hasta llegar al final del cilindro interior, y a partir de ahi las burbujas vuelven a crecer al ascender por la parte exterior de la cuba de fermentacién, En la practica, es un fermentador similar al anterior; pero operado al revés. 18Microbiologia General Tema 2.- Cultivo de microorganismo: FERMENTADORES SOLIDOS En ellos los nutrientes se encuentran en esta forma y los microorganismos se desa- rrollan en la superficie del substrato o penetrando en él. Es un tipo de fermentacién muy aplicada en la produccién de algunos alimentos (setas cultivadas, koji, etc.) y también la que tiene lugar en los procesos de compostaje de residuos orginicos. Hay varios modelos de fermentadores sélidos: 1, Tambor 2. Bandejas 3. Sistema de lecho (bed system) Por otra parte, existen sistemas semisélidos en los que los microorganismos estén adheridos a superficies estiticas y los nutrientes pasan por filtracién 0 goteo a través de ellos (sistema de la produccién de vinagre por goteo), 0 los microorganismos se en- cuentran formando agregados que se mantienen en suspensién por medio de una co- rriente de medio de cultivo liquido (reactores de lecho fluidificado). 19.