Asignatura Entera Apuntes María Cerezo

Técnicas de inmunodiagnóstico.
Ciclo de grado superior LCB
UT.1 El sistema
inmunitario
María Cerezo Ibáñez

CONTENIDOS DE ESTA UNIDAD
El sistema inmunitario es un complejo sistema que pretende protegernos de la agresiones externas y para ello debe
distinguir lo ajeno de lo propio.
Estas agresiones pueden ser: agentes infecciosos, neoplasias (es endógena), injertos.
Para realizar esta importantísima función, tiene lugar una serie de mecanismos complejos interrelacionados entre sí , que
se activan de forma diferente en función del agente agresor y que pueden actuar de forma inespecífica o específica.
El Sistema inmunitario comprende diferentes tipos de células, moléculas y órganos que vamos a presentar a
continuación.
Organizaremos la unidad de trabajo de la siguiente manera :
1.Barreras físicas.
2.Células del sistema inmunitario.
3. Componentes humorales del sistema inmunitario

4.Órganos del sistema inmunitario.
5.Antígenos .
6.Anticuerpos.
7.MHC:
.
1
BARRERAS FÍSICAS
Introducción
Antes de que entre en juego el sistema inmunitario propiamente
dicho, las barreras naturales impiden la entrada de los m.o, e
incluso son capaces de desencadenar una primera respuesta
defensiva.
La piel y los epitelios del aparato digestivo, respiratorio y genito-
unitario, conforman estas barreras físicas.
Como hemos dicho anteriormente, no sólo tienen función de

barrera mecánica, sino que poseen mecanismos para controlar la
infección si el m.o patógeno ha conseguido trasvasar esta barrera.
La piel
Su papel protector se debe a varios factores:
§ La continuidad, como eficaz barrera
§ Descamación continua, que impide su colonización por m.o
patógenos.
§ Relativa poca humedad.
§ ph ácido (5 a 6)
§ Células de Langerhans (dendríticas) y queratinocitos en la
epidermis (éstos últimos actúan como instigadores primarios
de procesos inflamatorios locales en la piel.
§ Nutrida población de células T, CD4 y CD8, más del doble que
en la sangre, en su mayoría de memoria.
Continuidad del epitelio (intestinal)
Los epitelios que componen los tractos no presentan una organización única. La
mucosa intestinal está cubierta por un epitelio simple, mientras que en la faringe,
esófago, uretra y vagina el epitelio es estratificado.
El epitelio intestinal se compone de una única capa de células epiteliales cilíndricas

que separan el medio interno del contenido de la luz intestinal, densamente poblado
por m.o . Estos m.o integran mayoritariamente la flora comensal.
La continuidad del epitelio constituye una barrera formidables frente a los m.o
presentes en la luz intestinal.
El complejo sistema de uniones establecido entre los enterocitos garantiza esta
continuidad del epitelio. No obstante, la permeabilidad selectiva que imponen estas
uniones suele modificarse en el trascurso de fenómenos inflamatorios debido a la
acción de citoquinas inflamatorias (como TNF-α e IF-γ) que, mediante diferentes
mecanismos, incrementan su permeabilidad.
Secreción de mucosas
Las mucosas secretan una sustancia viscosa denominada moco, que permite
que los m.o no se adhieran al tejido y sean arrastrados para su eliminación. Este
moco está formado fundamentalmente por mucinas, que son proteínas de alto
peso molecular.
Las células de Globet son las principales productoras de mucinas en el epitelio

intestinal. Las propiedades adhesivas y elásticas del moco permiten que sea
retenido en la superficie epitelial.
El moco expresa una permeabilidad selectiva; permite la entrada y salida de

nutrientes, gases y numerosos productos metabólicos, mientras suele excluir a
patógenos y toxinas microbianas.
Es secretado de forma continua y tiene una vida media de minutos u horas; esta
alta tasa de recambio le permite mediar una acción protectora eficaz, al barrer
rápidamente los m.o depositados en él.
Los enterocitos secretan también péptidos antimicrobianos: defensinas,

lisozima, lactoferrina
La IgA secretora también juega un papel muy importante.

Mecanismos innatos de la luz
intestinal
Frente a una agresión infecciosa, las células epiteliales
producirán citoquimas y quimiocinas, que mediarán
una entrada masiva al lugar de infección.
Los enterocitos, al activarse, producen también un

patrón de citoquinas, entre ellas IL-1 e IL-6, que
favorecen el desarrollo de una respuesta local
inflamatoria.
2
CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO
2.1 Inmunidad innata 2.2 Inmunidad específica

2.1.a.Monocitos/ macrófagos 2.2.a Linfocitos B
2.1.b Neutrófilos 2.2.b Linfocitos T
2.1.c.Eosinófilos
2.1.d Basófilos y mastocitos
2.1.e Células dendríticas
2.1.f Células N.K

2.1 Inmunidad innata
Especialización de la respuesta innata
Participación de los diferentes componentes celulares y humorales

de la inmunidad innata en la defensa frente a las infecciones
parasitarias, bacterianas y virales.
Reconocimiento entre :
1. RRP (receptor de reconocimiento de patrones) de las células y
2.a PAMP (patón molecular asociado a patógenos) presentes en los

m.o ó
2. b DAMP (patrón molecular asociado a daños)
Técnicas de inmunodiagnóstico María Cerezo Ibáñez
2.1.a Monocitos/ macrófagos

Características y funciones principales
Los monocitos cuando abandonan la sangre periférica y alcanzan los tejidos
adquieren capacidad macrofágica. Los macrófagos pueden ser.
Residentes: cumplen misiones concretas en cada uno de los tejidos, pudiendo

recibir, en su caso, denominaciones peculiares. Por ejemplo:
• Células de Kupffer, en las paredes vasculares de los sinusoides hepáticos

• Células mesangiales de los glomérulos renales
• Macrófagos alveolares de los pulmones
• Macrófagos de las serosas (p. ej., de la cavidad peritoneal)
• Células de la microglía del cerebro
• Osteoclastos de los huesos
• Histiocitos del tejido conjuntivo
Libres: están estratégicamente situados para atrapar material extraño en

órganos linfoides secundarios:
• Macrófagos de los sinusoides esplénicos (en el bazo)

• Macrófagos de los senos medulares (en los ganglios linfáticos)
Sus funciones son: fagocitosis, CPA, síntesis de citoquinas, mediadores de la

inflamación
Síntesis de citoquinas
Perfil inflamatorio
Perfil inflamatorio- antiinflamatorio

2.1.b Neutrófilos
GRÁNULOS:
• PRIMARIOS (mieloperoxidasa, hidrolasas, lisozima, fosfatasa

ácida)
• SECUNDARIOS (poseen sustancias de ataque bacteriano,

mediadores inflamatorios, activadores del C) lisozima
(bacteriolítico) y lactoferrina (bacteriostático)
• TERCIARIOS (gelatinasa, marcadores de adhesión)
• CUATERNARIOS Ó FOSFOSOMAS (F.A.L)
Su función principal es la fagocitosis

2.1.c Eosinófilos
GRÁNULOS:
• PEROXIDASA (DIFERENTE DE A LA LOS NEUTRÓFILOS)

• MBP (proteína básica mayor)
• ECP (proteína catiónica de los eosinófilos)
• ARILSULFATASA
• HISTAMINASA
FUNCIONES:
• Algo de fagocitosis
• Ataque a parásitos grandes extracelulares CCDA (citotoxicidad
celular dependiente de Ac)
• Modulan la respuesta alérgica
2.1.d Basófilos y mastocitos

Gránulos (sustancias preformadas)
• Heparina
• Histamina
• NCF, ECF, FAP
• Algunas IL
Mediadores de síntesis reciente:

• Leucotrienos
• Prostaglandinas
• Tromboxanos
Funciones:
• Liberan sustancias quimiotácticas
• Liberan sustancias vasoactivas
• Responsables de la hipersensibilidad inmediata o tipo I
(que incluye las alergias
Mastocitos
El origen clonal hemopoyético del mastocito o célula cebada queda actualmente demostrado, a través de diversos estudios,
que es a partir de un progenitor pluripotente mieloide. Los precursores comprometidos abandonan la médula ósea,
determinando el microambiente de los tejidos el desarrollo de propiedades diferenciales entre las células cebadas y los
basófilos.
El mastocito es una célula ampliamente distribuida en la piel, tracto digestivo y respiratorio, ganglios linfáticos y médula ósea,
donde adopta preferentemente una situación perivascular. Algunas células cebadas ofrecen un contorno redondeado,
mientras que otras presentan una forma alargada, en cometa, ocupando el núcleo una situación central o excéntrica. Rara vez
contiene nucléolos y su cromatina es generalmente bastante condensada. La granulación es muy abundante
(aproximadamente 9000 gránulos por célula) y grosera, constituyendo la organela más representativa de esta célula. Suele
disponerse también sobre el núcleo, que en ocasiones llega a ocultar; es intensamente metacromática y posee características
diferenciales con la granulación de los basófilos, aunque citoquímicamente tienen características similares.
Dichas células poseen además receptores para el fragmento Fc de la Ig E, que aparecen al mismo tiempo que los gránulos, y
la interacción entre alergenos y la Ig E adherente a la célula cebada induce a que ésta segregue sustancias biológicamente
activas (heparina, histamina, etc.) causantes de las manifestaciones de alergia.
2.1.e Células dendríticas

Tienen un origen común con monocitos y macrófagos.
Se caracterizan por sus prolongaciones alargadas.
Su función fundamental es ser CPA (células presentadoras de
antígenos) y son las únicas capaces de activar a los LT
vírgenes (responsables de parte de la respuesta específica o
adaptativa del S.I)
2.1.f Células N.K

Las NK constituyen de un 10 a un 15 % de los linfocitos circulantes
y tienen una vida media de 2 semanas en la circulación.
Aunque tienen mayor granularidad y tamaño que los B y los T,
difícilmente se les puede diferenciar morfológicamente, por ello se
utiliza el inmunofenotipo.
A diferencia de los B y T, que circulan por s.p en un estado de

reposo y cuya activación y expansión clonal requiere varios días, las
NK median poderosos mecanismos microbiocidas durante las
primeras etapas de los procesos infecciosos a través de 2
mecanismos:
q producción de citoquinas y quimiocinas
q destruyen células infectadas o neotransformadas (tumorales)
Como se observa en este diagrama de puntos, que refleja un estudio realizado por citometría de flujo en células
mononucleares totales de sangre periférica humana, es posible diferenciar en las células NK dos supoblaciones: una
que expresa altos niveles de CD56 y bajos niveles de CD16 y otra con baja expresión de CD56 y alta expresión de
CD16. Estas dos poblaciones se asocian con diferentes perfiles funcionales, como se describe en el texto.
2.2 Inmunidad específica
Etapas y perfiles de la respuesta
adaptativa
La inducción de la respuesta inmunitaria adaptativa transcurre a
través de diferentes etapas:
1) Captación del antígeno por las células dendríticas y

procesamiento antigénico (ambos procesos ocurren en los tejidos
periféricos)
2) Presentación antigénica a los linfocitos T vírgenes en los órganos

linfáticos secundarios
3) Activación de linfocitos T y B, expansión clonal y diferenciación

de los linfocitos T en diferentes perfiles efectores, en los órganos
linfáticos secundarios
4) Producción de anticuerpos por los plasmocitos y activación de

respuestas T efectoras antimicrobianas en los tejidos periféricos.
Origen de los linfocitos
Los linfocitos proceden de un progenitor

linfoide común (PLC).
No está claro cómo y dónde el PCL se

diferencia al linaje B o T, pero hay
evidencias de la presencia de un receptor,
Notch 1, cuya señal de activación induce
la diferenciación hacia el linaje T, de tal
forma que la ausencia o inhibición de esa
señal favorecerá la diferenciación a B
2.2.a Linfocitos B Formación y características
Los LB son los responsables de la respuesta humoral con producción de
Ac, encaminada a eliminar m.o extracelulares y a evitar la
diseminación de de m.o intracelulares
Durante el desarrollo linfocitario los esfuerzos se centran en:
1. Lograr el reordenamiento exitoso de las cadenas que darán lugar a

su receptor antigénico
2. Evaluar la capacidad del linfocito de reconocer Ag propios en el
marco del órgano linfoide primario (tolerancia central), de tal forma
que aquellos linfocitos que resulten autorreactivos serán eliminados
por apoptosis
En la figura de la izquierda se representa el BCR (receptor de células B),

que se irá adquiriendo a lo largo de su maduración.
Está formado por 2 Ig de membrana IgM e IgD, y por otra 2 estrcturas:
Igα e Ig β
Tipos
Existen 3 poblaciones de linfocitos B:
q células B2: la más abundante en s.p y en tejidos linfáticos

secundarios. Los plasmocitos que se derivan de ellos producen Ac
contra Ag proteicos . Necesitan la colaboración de los CD4+ (Tfh).
Es la activación que estudiaremos en la siguiente UT
q células B1:no requieren la colaboración de los CD4+ para

activarse y producir Ac frente a Ag no proteicos (timo-
independientes). Se localizan en la cavidad peritoneal y pleural
Tienen 2 funciones fundamentales: producción de Ac naturales
(tipo IgM) y producción de Ac frente a Ag foráneos en muy poco
tiempo (72 horas)
q células B de la zona marginal del bazo (BZM): características

similares a los anteriores, pero se localizan en el bazo. Son
particularmente dependientes del Complemento (CR2) para
activarse
Maduración
El desarrollo de los B ocurre en M.O. y depende de
las células estromales de ésta, que liberan IL-7.
Los estadios son los siguientes:
1) Pro-B: reordenamiento de las cadenas pesadas de

las Ig.
2) Pre-B: reordenamiento de las cadenas ligeras.
3) B inmaduro: se integra la IgM con el heterodímero

Igα-Igβ, formando el pre-BCR.
4) Inducción de la tolerancia central aquellos que son

autorreactivos son eliminados.
5) BTr: B transicionales, son B que se encuentran en la

periferia y están en un estadio anterior del B maduro.
Se va formando la IgD.
6) B maduros: los BTr se dirigen al bazo y allí se

someten de nuevo a una tolerancia periférica. Su
maduración termina con la coexpresión de IgM e IgD
para formar el BCR maduro
Inducción de tolerancia
central
Los linfocitos B inmaduros que no reciben
señales a través del BCR continúan su
desarrollo y emigran de la médula ósea.
Aquellos que reciben señales en esta
instancia intentan modificar el parátopo
de su inmunoglobulina mediante la
edición del receptor o el reemplazo del
fragmento VH, a fin de evitar la anergia o
deleción del clon por apoptosis.
2.2.b Linfocitos T
Características y formación
La mayor parte de linfocitos que se encuentran en sangre,
linfa, ganglios linfáticos y timo son LT
Los linfocitos T, al igual que el resto de las células del sistema

inmunitario se originan en M.O., pero los eventos más
importantes de su desarrollo ocurren el timo.
Los diferentes estadios en su desarrollo se distinguen no sólo

por la expresión de las cadenas de su TCR (receptor de
células T), sino también por la expresión de determinadas
proteínas en la membrana celular (Ag de membrana)
Encontramos 2 subpoblaciobnes:
a. CD4+ ó LTh
b. CD8+ ó LTc
También se distingue una subpoblación funcional: LTs (inhiben

la respuesta inmunitaria frente a Ag específicos)
Maduración
Cuando los precursores T ingresan en el timo se
denominan timocitos.
Los diferentes estadios que encontramos son:
• Estadio DN (doble negativo) comienzana a expresar

CD2, pero no portan todavía ningún marcador
característico de los T.
Comienza la reordenación de las cadenas α y β que
formaran el TCR.
Primero la cadena β + sustituto de α + CD3à pre-TCR
• Estadio DP: la expresión del pre-TCR induce la

expresión de CD4 y CD8
Se produce la inducción de la tolerancia central: primero
positiva y después negativa
• Estadio SP: finalizado el proceso de tolerancia central,

los T maduros migran del timo con sólo CD4 ó CD8. Lo
que determina la expresión de uno de los correceptores
ocurre durante la selección positiva.
L T δγ
La mayoría de los LT tienen el TCR compuesto por
cadenas α y β, pero un % mínimo expresan cadenas δ y γ.
Estos T δγ desempeñan un papel importante en la fase

temprana de los procesos infecciosos que se instalan en
las mucosas de los ap. digestivo, respiratorio y urogenital.
Sus características más representativas:
• Limitado repertorio de receptores
• Al emigrar del timo a la periferia , muestran un fenotipo

preactivado, lo que les permite generar una rápida
respuesta efectora
• Presentan un tropismo diferencial por las superficies

epiteliales, por eso se concentran fundamentalmente en
las zonas indicadas anteriormente y cumplen un papel
central en el control de las mucosas.
3
COMPONENTES HUMORALES DEL SISTEMA INMUNITARIO
3.1 Citoquinas
3.2 Proteínas inflamatorias
3.3 Sistema del complemento
3.4 Anticuerpos
4
ÓRGANOS DEL SISTEMA INMUNITARIO
4.2 Órganos linfoides

4.1 Órganos linfoides primarios
secundarios
4.1.a Médula ósea (M.O) 4.2.a Bazo
4.1.b Timo 4.2.b Ganglios linfáticos
4.2.c Tejido MALT

4.1 Órganos linfoides primarios
4.1.a Médula ósea
Biopsia de médula ósea. 40x

4.1.b Timo Características y funciones principales
El timo es un órgano plano y blando situado en la cavidad torácica, por encima del
corazón.
Está formado por dos lóbulos rodeados por cápsula de tejido conjuntivo.
A su vez, los lóbulos están divididos en lobulillos separados entre sí por trabéculas de
tejido conjuntivo.
Cada lobulillo tímico está relleno de células linfoides denominadas timocitos,
dispuestas en una corteza de gran densidad celular y una médula (interior) de menor
densidad celular.
Desde la corteza hasta la médula existe un gradiente de diferenciación, de modo que
en la corteza se encuentran los timocitos más inmaduros, mientras que en la médula
se localizan los timocitos en fases madurativas más avanzadas. Tanto la corteza como
la médula están rellenas de una red de células no linfoides que constituyen el
estroma tímico, y que consta de varios tipos celulares:
a) Células epiteliales
b) Células dendríticas interdigitantes sobre todo en el límite cortico-medular.
c) Macrófagos, con una localización similar a las dendríticas.
Todas estas células no linfoides del estroma expresan en sus superficies moléculas
MHC de tipo I y/o II, y participan en la maduración y selección de los
timocitos hacia células T maduras.
En la médula tímica aparecen los denominados corpúsculos de Hassall: acúmulos
concéntricos de células epiteliales. Su función es desconocida, pero su
número va aumentando con la edad.
4.2 Órganos linfoides secundarios
4.2.a Bazo
El bazo está constituido por :
q Pulpa roja à (porción mayoritaria) encargada de la

destrucción de eritrocitos
q Pulpa blanca à forman regiones definidas organizadas
alrededor de las arteriolas centrales, formando el tejido
linfoide esplénico.
La región que rodea la arteriola central se denomina vaina

linfoide periarteriolar (PALS) y está poblada mayoritariamente
por LT y un tipo especial de LB. Otras poblaciones de LB
pueden encontrarse en los folículos (coronas de B) como en la
zona marginal.
La arquitectura del bazo guarda semejanzas con la de los

ganglios linfáticos; sin embargo, en el bazo los Ag ingresan
preferentemente por la sangre
4.2.b Ganglios linfáticos Características y funciones principales
La estructura del ganglio linfático comprende 3 partes:
• Corteza àen su parte más externa presenta los

folículos 1rios (compuestos por LB maduros en
reposo). Avanzando hacia la médula contiene los
folículos 2rios (contienen LB activados y células
dendríticas foliculares dispuestos en otros 2 estratos,
manto y centro germinal)
• Paracorteza à contiene LT maduros y células

dendríticas interdigitantes.
• Médula àLB, LT, células plasmáticas y abundantes

macrófagos.
• Seno subcapsular à es la región a donde van a parar

los Ag timodependientes.
4.2.c Tejido MALT o tejidos linfoides terciarios
El MALT consiste en agregados de tejido linfoide

no capsulado que se localizan en la lámina propia y
áreas submucosas de los tractos gastrointestinal,
respiratorio y genitourinario.
• Amígdalas: linguales (en la base de la lengua),

palatinas (en la parte posterior de la boca) y
faríngeas o adenoides. Constan de nódulos
linfoides no capsulados, con linfocitos,
macrófagos, granulocitos y mastocitos. Las
células B se organizan en numerosos folículos,
incluyendo secundarios con sus centros
germinales. Poseen un papel defensivo frente a
patógenos que entran por los epitelios nasales y
orales.
• Placas de Peyer del íleon: son 30 a 40 nódulos

no capsulados en esta parte del intestino
delgado.
• Apéndice, en el inicio del intestino grueso.

Técnicas de inmunodiagnóstico
ANEXO UT.1 ANTÍGENOS
1.- Propiedades generales
Se define como antígenos aquellas sustancias capaces de inducir una repuesta

inmune específica.
Los antígenos exhiben (o pueden mostrar) una serie de propiedades inmunológicas:
Ø inm unogenicidad: capacidad de inducir una respuesta inmune específica,

humoral y/o celular. En este sentido, antígeno sería sinónimo de inmunógeno.
Ø antigenicidad: capacidad de combinarse con anticuerpos y/o con receptores
de células T (TCR).
Si una molécula es inmunogénica, también es antigénica; sin embargo, la inversa

no siempre es verdad: p. ej., más adelante en este capítulo hablaremos de los
haptenos, que por sí mismos no desencadenan respuesta inmune, pero que pueden
ligarse a Ac preformados.
Ø alergenicidad: capacidad de inducir algún tipo de respuesta alérgica. Los

alergenos son inmunógenos que tienden a activar ciertos tipos de respuestas
humorales o celulares que dan síntomas de alergia.
Ø tolerogenicidad: capacidad de inducir una falta de respuesta específica en
la rama celular o en la humoral.
2.- Factores que condicionan la inmunogenicidad
El sistema inmune reconoce moléculas de los microorganismos, pero no todos los

tipos de moléculas tienen la misma capacidad inmunogénica:
Las más inmunogénicas son las proteínas
Los hidratos de carbono poseen menor capacidad inmunogénica
Los lípidos y los ácidos nucleicos sólo son inmunogénicos cuando van unidos a
proteínas o a carbohidratos.
Por otro lado, hay que tener ya presente que en la rama humoral pueden actuar de
inmunógenos todos los tipos moleculares que acabamos de citar, mientras que en la
rama celular específica sólo lo son las proteínas.
1
Los Ag se pueden clasificar en:

ü timo-dependientes à necesitan a los Th para inducir la respuesta inmune (las
proteínas)
ü timo-independientes à pueden activar a determinados linfocitos B, sin
necesidad de los Th (glúcidos y lípidos)
A continuación trataremos los factores que condicionan la inmunogenicidad de los

antígenos, diferenciando los que dependen de la propia molécula antigénica y los
que dependen del sistema biológico (el hospedador donde ocurre la respuesta
inmune).
2.1 Factores de la molécula inmunogénica
2.1.1 Carácter de no-propia
Ante todo, la molécula ha de ser reconocida como una molécula extraña, ajena al
individuo. Tenemos pues, que un primer rasgo condicionador de la inmunogenicidad
es el grado de falta de parecido entre el antígeno con respecto a moléculas propias.
En general, moléculas que han divergido ampliamente en los distintos linajes

evolutivos actúan como buenos inmunógenos en especies heterólogas.
En cambio, moléculas evolutivamente conservadas (como el colágeno, el

citocromo c) no son buenas inmunógenas.
Por otro lado, ciertas moléculas propias pueden actuar como autoantígenos,
debido a que proceden de órganos inmunológicamente privilegiados (secuestrados
respecto del sistema inmune) en las fases tempranas del desarrollo (p. ej., del
esperma, tejido de la córnea).
2.1.2 Tam año m olecular
En general, se puede decir que, a mayor tamaño, mayor inmunogenicidad. Sustancias

de unos 100.000 dalton (Da) suelen ser buenos inmunógenos, mientras que las de
menos de 5.000-10.000 Da son malos inmunógenos.
2.1.3 Heterogeneidad en la com posición quím ica
A mayor heterogeneidad de composición química, mejor inmunogenicidad.
Los copolímeros sintéticos repetitivos de un solo aminoácido, o los

polisacáridos a base de un solo azúcar son malos inmunógenos.
2
La poli [glu-lys] requiere tener 30-40 kDa de p.m. para ser inmunogénica; pero
el poli {[glu-lys]-tyr} sólo requiere 10 kDa; si al anterior copolímero lo volvemos más
complejo añadiendo unidades de phe, ya sólo se necesitan tamaños moleculares de 4
kDa para desencadenar respuesta inmune.
La complejidad química se expresa también en el hecho de que contribuye la

estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas.
2.1.4 Degradabilidad
Sólo las moléculas degradables por el hospedador son buenas inmunógenas. Como
veremos, ello se debe a que la inmunidad humoral y la celular dependen de la
activación de los linfocitos TH, que a su vez depende de que éste reconozca antígeno
degradado, procesado y presentado por moléculas MHC-II de las células
presentadoras de antígeno (APC).
Las moléculas no degradables no son buenas inmunógenas. Por ejemplo, los

polímeros de D-aminoácidos no pueden ser degradados por los macrófagos (éstos no
tienen enzimas hidrolíticas adecuadas), por lo que no pueden se procesados y
presentados a los linfocitos TH.
En general, las moléculas grandes e insolubles son mejores inmunógenos, ya que son
mejor fagocitadas y procesadas.
2.2 Factores del sistema biológico
2.2.1 Genotipo del receptor
La influencia del genotipo del hospedador se puede comprobar en experimentos

usando razas puras de animales de laboratorio. Supongamos que disponemos de una
raza pura A que induce altos niveles de Ac en respuesta a un determinado Ag, y otra
raza B que produce bajos niveles de Ac ante ese mismo Ag. Los individuos de la F1
procedentes del cruce de AxB exhiben niveles intermedios de Ac al ser enfrentados
con el citado Ag.
Por análisis de retrocruzamiento se comprobó que los genes que controlan la mayor o
menor respuesta se cartografiaban en una zona concreta de un cromosoma, dentro
del llamado complejo principal de histocompatibilidad (MHC).
Las proteínas sintetizadas por dicho complejo MHC funcionan para presentar el Ag
procesado a las células T, y juegan un papel esencial en determinar el grado de
respuesta a cada antígeno.
3
Aparte de la dotación de alelos del complejo MHC que cada individuo posee, existen
otros genes que también influyen en el grado de respuesta inmune, como los que
codifican el BCR, el TCR y los de citoquinas. Esto será tratado en el capítulo dedicado
a la regulación de la respuesta inmune.
2.2.2 Dosis y ruta de adm inistración del antígeno
Para cada inmunógeno experimental existe un protocolo de administración más

adecuado, que supone usar una determinada ruta y cierta dosis, lo que condiciona
una respuesta inmune óptima. Determinar estos parámetros reviste un especial interés
a la hora de la administración de las vacunas.
Dosis:
Dosis muy bajas de Ag pueden no estimular a los linfocitos (falta de respuesta);
Dosis demasiado altas pueden provocar un estado activo de tolerancia

inmunológica, por el que los linfocitos entran en una situación de no respuesta.
Dosis adecuadas son capaces de estimulación.
Un protocolo de dosis repetidas espaciadas a lo largo de varias semanas es

mejor que una dosis única, porque provoca una mayor proliferación clonal de
linfocitos t y B específicos.
Rutas de adm inistración: determinan a qué órgano linfoide irá a parar el antígeno.
Por vía oral se estimula sobre todo el MALT del tracto digestivo (pero al mismo
tiempo se puede inducir tolerancia sistémica)
Intravenosa: el antígeno podrá quedar retenido en el bazo
Subcutánea: el antígeno terminará en algún ganglio regional
3.- Epitopos
Los epítopos o determinantes antigénicos son cada uno de los sitios discretos de una
macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o
por un TCR específico. Son las regiones inmunológicamente activas de un
inmunógeno (las que se unen de hecho a un receptor de linfocitos o a un Ac libre).
Por lo tanto, a partir de ahora habremos de acostumbrarnos a pensar en los antígenos

como estructuras complejas que suelen constar de varios tipos de epítopos, cada uno
de ellos capaz de unirse con un Ac o un TCR específico diferente. En este sentido, las
4
macromoléculas son antígenos multivalentes, con muchos tipos de determinantes

antigénicos distintos.
Si hablamos de Ag proteicos, esta unión suele implicar varios niveles de la

estructura del antígeno, desde la primaria a la terciaria (y, en su caso) a la cuaternaria.
En el caso de los polisacáridos, las ramificaciones debidas a distintos enlaces

glucosídicos suponen conformaciones peculiares que son reconocidas de modo
específico.
3.1 Propiedades de los epítopos de células B
1. El tamaño de un epitopo depende del tamaño del sitio de unión que posea la
inmunoglobulina específica respectiva. Cada sitio de unión a un epitopo en una
inmunoglobulina se denomina paratopo.
2. Los epitopos de células B de proteínas nativas suelen consistir en varios

aminoácidos hidrófilos de la superficie de la proteína, y son los que están más
accesibles al Ac libre o al Ac de membrana (del BCR).
3. Los epitopos reconocidos por células B pueden ser secuenciales (es decir, una
serie de aminoácios contiguos) o no secuenciales (también llamados
conformacionales). Los epitopos secuenciales suelen depender de regiones en forma
de bucle, situadas entre cadenas a consecutivas. Los epitopos conformacionales
dependen de la configuración nativa de la proteína.
4. Si desnaturalizamos una proteína, se perderán los epitopos conformacionales

pero permanecerán los secuenciales.
5. Los epitopos de B tienden a situarse en regiones flexibles de la molécula, capaces

de "moverse" molecularmente. Parece que ello tiende a facilitar el encaje con las
regiones complementarias (paratopo) del Ac.
6. La mayor parte de la superficie de una proteína globular es potencialmente

antigénica, y consiste en numerosos epitopos parcialmente superpuestos. Ahora bien,
dada una determinada proteína, no todos los epitopos son igualmente
inmunogénicos para distintos individuos de la misma especie. Para cada individuo y
para cada Ag suele existir un epitopo llamado inmunodominante.
3.2 Propiedades de los epítopos reconocidos por células T
1. El tamaño del epitopo de células T queda determinado por el tamaño del surco
de unión al Ag de la molécula de MHC.
5
Las moléculas de MHC-I unen péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos.
Las moléculas de MHC-II unen péptidos de entre 11 y 17 aminoácidos.
2. Los péptidos antigénicos reconocidos por células T forman un complejo

trimolecular junto con el TCR del linfocito T y el MHC de la célula presentadora o
diana. El antígeno reconocido por células T tiene dos zonas de unión: una para ligarse
al TCR, denominada epítopo, y otra para engarzar al MHC, denominada agrétopo.
3. Los péptidos antigénicos implicados en el complejo trimolecular proceden del

procesamiento intracelular del inmunógeno proteico original.
4. Los antígenos reconocidos por las células T presentan péptidos anfipáticos.

Precisamente, quizá la función del procesamiento sea "desplegar" el Ag y exponer
estas regiones internas anfipáticas, de modo que la porción hidrófoba suele actuar de
agrétopo, mientras que la porción hidrófila actúa de epítopo propiamente dicho.
5. Debido a que los Ag reconocidos por células T lo son unidos a las moléculas de
MHC del individuo, y debido a que a su vez existe una gran diversidad de alelos de
MHC en las poblaciones de una especie, los epítopos inmunodominantes en cada
individuo dependen en parte del juego de moléculas MHC de ese individuo (lo cual,
depende de su dotación genética, obviamente). En una proteína sólo una minoría de
zonas peptídicas tienen capacidad para unirse a las moléculas MHC de cada
individuo, y de esas zonas, sólo algunos estimulan de hecho a la célula T.
4.- Haptenos
Se define como hapteno aquel grupo químico definido, de pequeño tamaño, que por
sí mismo es incapaz de desencadenar una respuesta inmune (es decir, no es
inmunógeno), pero que unido covalentemente a una molécula portadora se comporta
como inmunógeno (llegando a constituir el único determinante inmunodominante del
conjugado).
6
5.- Mitógenos y superantígenos
5.1 Mitógenos
Los mitógenos son agentes capaces de inducir la proliferación de una gran cantidad
de clones de linfocitos T y/o B, de modo inespecífico (por lo que también se
denominan activadores policlonales).
Ejemplos de mitógenos:
Lectinas: conllevan la aglutinación de células (entre ellas linfocitos), pero aquí nos
interesan sobre todo por su capacidad de activación policlonal de células T, B, o de
ambas.
Lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas. Su actividad como mitógeno

reside en la porción de lípido A.
5.2 Superantígenos
Los superantígenos son unos potentes activadores policlonales de células T que

expresan secuencias comunes en sus receptores: llegan a activar hasta la quinta parte
del total de estos linfocitos). Esta activación es independiente de la especificidad
hacia una combinación particular de Ag procesado-MHC.
Unen la porción Vb del TCR y lo entrecruzan con la parte externa del MHC, fuera del
surco que normalmente sirve para exponer y presentar el antígeno. De esta forma,
entrecruzan de modo inespecífico las células TH con las APC, de modo que los
linfocitos T se activan sin haber reconocido Ag procesado y presentado en el surco de
MHC-II de las APC. El resultado es que un gran número de clones de células T
segregan grandes niveles de citoquinas, lo que puede llevar a shock y a muerte.
Ejemplos de superantígenos son ciertas toxinas de Staphylococcus aureus, como la

toxina del síndrome del choque tóxico (TSS-1), o la enterotoxina.
NOTA: Texto extraído de la página

http://www.ugr.es/~eianez/inm uno/cap_04.htm
7
UT.1.3 ANTICUERPOS
Los Ac son glucoproteínas que forma el organismo como respuesta al contacto con un
un Ag (no necesariamente à Ac naturales) y que reaccionan específicamente contra
él. También se les denomina Ig (inmunoglobulinas) porque en la electroforesis migran
junto con otras globulinas, casi todos en la franja de las gamma.
1. Estructura básica
La parte proteica está compuesta por 4 cadenas polipeptídicas unidas entre sí por
enlaces covalentes y puentes disulfuro intercatenarios. Dos de ellas son pequeñas y se
llaman L (light) y las otras 2 son grandes o pesadas y se llaman H (heavy). Se organizan
formando una I griega.
Mediante la papaína (enzima proteolítica), la Ig se rompe en 3 fragmentos:
- Dos de ellos son idénticos y constan de una cadena ligera y la porción

aminoterminal de una cadena pesada. Reciben el nombre de Fab.
- El tercero está constituido por las porciones carboxiterminales de las cadenas

pesadas y se llama Fc
Cada cadena está compuesta por varias regiones de tamaño uniforme denominadas
dominios.
María Cerezo Ibáñez 1

En el dominio aminoterminal la secuencia de aa es muy cambiante de unas Ig a otras,

por lo que se llama región variable (V). El resto de la cadena está formada por
dominios muy parecidos en la mayoría de las Ig, por lo que se denominan regiones
constantes (C).
Cada cadena ligera consta de 1 región variable (VL) y 1 región constante (CL)
Las cadenas pesadas se componen de 1 región variable (VH) y 3 ó 4 constantes

(dependiendo del isotipo) (CH)
Dentro de las regiones variables hay

algunos segmentos polipeptídicos cortos
cuya secuencia de aa es aún más variable.
A estos segmentos se les llama Regiones
hipervariables o Regiones determinantes
de complementariedad (CDR) y los
segmentos intermedios se denominan
Regiones de entramado o armazón (FR).
En cada región V hay 3 CDR y 4 FR.
La porción de las regiones hipervariables

que entra en contacto con el Ag recibe el
nombre de parátope.

2. Isotipos
Los isotipos son variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y
ligeras, que están presentes en todos los individuos sanos de la especie.
Hay 5 variaciones isotípicas en las CH (algunas de las clases se dividen a su vez en

subclases):
Gamma γ à Ig G
Mu µ à Ig M
Alpha α à Ig A
Delta δ à Ig D
Épsilon ε à Ig E
Sólo hay 2 isotipos de cadenas ligeras Kappa (κ) y lambda (λ), que pueden estar
asociados a cualquiera de los isotipos de las cadenas pesadas, pero teniendo en
cuenta que en cada molécula de Ig sólo hay un isotipo de cadena ligera.



3. Unión Ag-Ac
La unión Ag-Ac es reversible (no covalente) y su permanencia depende del grado de

adaptación entre ambas moléculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las
unen.
3.1 Afinidad
Es la fuerza de unión entre un Ac y un único determinante antigénico. Ésta viene dada

por la suma de las fuerzas de los enlaces que intervienen en dicha unión.
Es la expresión de la atracción que existe entre las moléculas del Ag y las del Ac.
3.2 Avidez
Es la fuerza con la que un Ac multivalente se une a un Ag multivalente.
Los Ac son multivalentes, pues tienen al menos 2 zonas de unión con el Ag. Pero los
Ag también pueden ser multivalentes, pues pueden poseer varios determinantes
antigénicos y cada uno de éstos pueden presentar más de un área de contacto .
La fuerza total de unión es significativamente mayor que la suma de las afinidades

existentes en cada uno de los sitios de unión; esto se debe a que todos los lazos
existentes entre el Ag y el Ac han de romperse a la vez para que ambos se separen.

La avidez es una medida de la estabilidad del complejo Ag multivalente-Ac

multivalente.
Imágenes obtenidas de: J.R. Regueiro & Co .2011.“Inmunología: Biología y patología

del sistema inmunitario”.4ª edición. Editorial Médica Panamericana
Bibliografía:
“Fundamentos y Técnicas
de Análisis Hematológicos
y Citológicos”, Ed.
Paraninfo. Rubio, García
Espinosa y Carrasco.

F. y T. de Análisis Hematológicos y Citológicos
UT 1.4 Presentación de Ag
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCMPATIBILIDAD (MHC)

MHC I
MHC II
CÉLULA NUCLEADA
CÉLULA PRESENTADORA DE Ag
Las CPAs son células profesionales capaces de

procesar proteolíticamente un Ag y
presentárselo a los LT a través de su MHC I y
su MHC II.
Los LT no son capaces de reconocer un Ag en

estado nativo (soluble) sólo son capaces de
hacerlo si está procesado y en el marco del
MHC.
Las CPA como tal son:
q células dendríticas
q macrófagos
q LB
Las únicas CPA que son capaces de activar a

un LT virgen son las células dendríticas
Las células de la inmunidad innata tienen un

nº limitado de receptores ( receptores de
reconocimiento de patrones RRP) que
reconocen estructuras moleculares
conservadas en los m.o, denominadas
“patrones moleculares asociados con
patógenos” (PAMP)
Los PAMP presentan estructuras químicas

muy diversas, pero comparten 3
características:
1.- están presentes en los m.o. pero no en sus

huéspedes.
2.- son esenciales para la supervivencia o
patogenicidad de los m.o.
3.- muchos de ellos son compartidos por m.o
diferentes.
Estructuralmente pueden ser: lípidos, H de C,

proteínas, o ác. nucléicos.
Células dendríticas
Ciclo de la células dendríticas El ciclo de vida de las células dendríticas

transcurre a través de diferentes etapas:
a) las células dendríticas se originan a

partir de precursores hematopoyéticos
pluripotenciales presentes en la médula
ósea que darán lugar, en última instancia,
a precursores inmediatos de las células
dendríticas que alcanzan la circulación.;
b) precursores de células dendríticas y
células dendríticas provenientes de la
circulación se extravasan en la piel y las
mucosas, donde conforman una extensa
e intrincada red celular;
c) al activarse, en respuesta a un proceso
infeccioso, las células dendríticas se
activan, migran a los ganglios linfáticos
drenantes del sitio de infección y
completan su proceso madurativo;
d) ya en el ganglio linfático, las células
dendríticas maduras activan los linfocitos
T vírgenes e inducen su expansión clonal
y su diferenciación en distintos perfiles
efectores.
La activación de las células dendríticas

Activación de la células dendríticas inmaduras , en respuesta a PAMP, DAMP
(daño asociado a patrón molecular) y
citoquinas, induce su maduración.
Según la naturaleza de los estímulos que
indujeron su activación, podrán madurar en
diferentes perfiles capaces de activar a los
TCD4+ y orientar su diferenciación en células
efectoras de una diferente funcionalidad:
Th1: inducen la activación del macrófago en

tejidos periféricos, los Tc y las NK
Th2: inducen la movilización de eosinófilos y
mastocitos y la producción de IgE,
participando en el ataque a parásitos
extracelulares grandes, asma y reacciones
alérgicas
Th17: inducen la producción, movilización e
infiltración de neutrófilos en el tejido afectado.
Tfh: median la colaboración con LB y les
permite diferenciarse en plasmocitos
productores de Ac.
T reg: median un efecto supresor sobre la
activación de diferentes poblaciones B y T.
ACTIVACIÓN DE TCD4+ Y LTCD8+

Bibliografía:
q “ Introducción a la inmunología humana”, Fainboim & Geffner 6ª edición. Ed. Médica

Panamericana
q “ Inmunología: Biología y patología del Sistema Inmunitarios”, J.R.Regueiro & col.

4ª edición Ed. Médica Panamericana,
UT.1.5 CITOQUINAS
1 . Concepto
Son polipéptidos glucosilados o no, de bajo peso molecular, y que actúan como
mensajeros intercelulares.
Las citoquinas son producidas por múltiples tipos celulares, principalmente del
sistema inmune. En concreto los productores más importantes de citoquinas son los
macrófagos y los linfocitos TH.
Cuando son secretadas por los linfocitos pueden llamarse linfocinas o linfoquinas.
Si son producidas por los macrófagos, monocinas o monoquinas.
Las que intervienen en la respuesta inflamatoria y en la quimiotaxis se conocen como
quimioquinas o quimiocinas.
Sin embargo, actualmente se desaconseja el uso de estas denominaciones y se
recomienda agruparlas a todas bajo el nombre genérico de citoquinas.
2. Características
Las citoquinas, al intervenir como mensajeras entre todas las células que intervienen
en la respuesta inmunitaria, regulan la amplitud y la duración de la respuesta.
Realizan su función al unirse a receptores específicos para cada citoquina, que están
presentes en la membrana de las células donde van a ejercer sus efectos. Esta unión
genera la activación de la transcripción de algunos genes de estas células. Y esto da
lugar a la síntesis de productos que son los verdaderos responsables de los efectos de
dichas citoquinas.
Las citoquinas son muy potentes, pero son producidas de una forma transitoria y
tienen una vida muy corta. Esto asegura que sólo van a actuar en un estrecho margen
de tiempo y en las cercanías de la zona donde se producen.
Generalmente, son pleiotrópicas, es decir, pueden ejercer múltiples efectos al

actuar sobre diferentes tipos celulares.
Además, pueden actuar aisladamente o en colaboración con otras para la

consecución de un efecto que se potencia mutuamente (sinergism o)
A veces, varias citoquinas pueden presentar los mismos efectos biológicos

(redundancia).
Por el contrario, muchas citoquinas pueden ejercer un bloqueo mutuo de sus efectos
(antagonism o)
En otro sentido, la acción de una determinada citoquina puede ejercerse sobre la

misma célula que se produce, mediante una especie de mecanismo de

retroalimentación positiva (secreción autocrina), o sobre las células que circundan

(secreción paracrina)
3. Funciones
Las funciones ejercidas por las citoquinas son múltiples, pro genéricamente se
resumen en las siguientes:
Ø Regulación de la proliferación, diferenciación y activación de las células del

sistema inmunitario.
Ø Regulación de la producción de Ac
Ø Regulación de la secreción de otras citoquinas.
4. Regulación de su actividad
La actividad biológica de las citoquinas está regulada fisiológicamente por 2 tipos de

antagonistas: bloqueadores de receptor y los inhibidores de citoquinas
a) Bloqueadores de receptor à anulan la acción de una citoquina al unirse a

éste. Un ejemplo es el receptor de la IL-1Ra, que impide la unión de la IL-1 a
su receptor.
b) Inhibidores de citoquinas à suelen ser versiones solubles de los
respectivos receptores, que mantienen su capacidad de unirse a la citoquina
correspondiente, por lo que impiden la interacción de ésta con su auténtico
receptor de membrana. Un ejemplo es el sIL-2R, qu es capaz de unirse a IL-2
Algunos virus han evolucionado para producir proteínas que se unen e inactivan
citouinas. Un ejemplo es el caso del poxvirus que produce una proteína que se una al
TNF-α y otra que se liga a la IL-1
5. Tipos
Hay múltiples tipos de citoquinas. Se distinguen una serie de grupos que reúnen
citoquinas relacionadas entre sí:
a) Interferones (IFN) à podemos diferenciar 3 tipos:
§ IFN- α e IFN-β à son liberados por muchas células enfermas al inicio

de una infección viral. Ambos presentan una función primordialmente
antiviral, actúan sobre los genes de las células infectadas induciendo la
síntesis de nuevas enzimas, que degradan el RNAm viral y de la célula

huésped. Esto impide la diseminación de las infecciones virales y es

muy importante en la fase de recuperación de las mismas.
Además estos interferones activan la actividad matadora de las NK
§ IFN –γ à es producido por los LT y por las NK. Además de su función

antiviral también realiza otras como:
Ø Acercamiento de los fagocitos al foco infeccioso

Ø Activación de los macrófagos
Ø Expresión de moléculas de clase I y II del MHC en la superficie
de los macrófagos
Ø Diferenciación de los Tc
Ø Diferenciación de los B
Ø Síntesis de IgG por los B activados
b) Interleuquinas (IL) à Hay muchos tipos, las vamos a agrupar en forma de

patrones por sus mecanismos más representativos, y las células que las
producen:
• Células dendríticas:
§ IL-12, IFN-γ à Th1
§ IL-4 àTh2
§ IL-1, IL-6, IL-21, IL-23 àTh17
§ IL-21 à Tfh
• Linfocitos Th:
§ Th1 : IL-2, IFN-γ
§ Th2: IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-25
§ Th17 : IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22
§ Tfh : IL-10, IL-4, IL-21
• Macrófagos:
§ IL-1, IL-6, TNF-α à inducen respuesta inflamatoria
§ Quimiocinas
§ IL-12, IL-18 à favorecen la diferenciación de los Th en el perfil
Th1
§ IL-23 à favorecen la diferenciación de los Th en Th17
§ IL-10, TGF-β à perfil antiinflamatorio
§ G-CSF, M-CSF, GM-CSF
§ PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), FGF
(factor estimulante del crecimiento de los fibroblastos) y VEGF
(factor estimulador del crecimiento del endotelio vascular) à
participan en los fenómenos de reparación tisular y angiogénesis.
§ IL-15 à contribuyen a la producción y activación de las NK y a la
expansión clonal de los CD4 y CD8 ya activados

c) Factores estim uladores de colonias (CSF) à son un grupo de moléculas

que estimulan la proliferación en médula ósea de determinados tipos
celulares. Un ejemplo es el GM –CSF
d) TNF (factores de necrosis tum oral) à se diferencian 2 tipos:
§ TNF – α à producido por los macrófagos, colabora en el acercamiento

de los fagocitos al foco infeccioso.
§ TNF – β à sintetizado por los Th, colabora también en el acercamiento
de los fagocitos al foco infeccioso y participa en su activación.
Bibliografía:
q “ I n t r o d u c c i ó n a l a i n m u n o l o g í a h u m a n a ”, Fainboim & Geffner

6ª edición. Ed. Médica Panamericana.
q Texto ha sido extraído de los apuntes realizados por Benjamín García

Espinosa para el temario de la oposición de la especialidad de
“Procedimientos de Diagnóstico Clínico y Productos Ortoprotésicos”

UT.2 La respuesta
inmunitaria

La respuesta inmunitaria puede ser innata (ó inespecífica) o adquirida (ó específica). Las diferencias entre una y otra se
pueden resumir en:
• La rapidez: la innata se pone en marcha en horas y la adaptativa en una respuesta primaria puede tardar de 4 a 7 días
• La especificidad: los mecanismos de la inmunidad innata reconocen PAMP a través de sus RRP; en cambio la
específica reconoce Ag a través de las Ig o de los TCR
• La memoria inmunológica: la inmunidad adaptativa es capaz de generar memoria inmunológica frente a Ag timo-
dependientes, mientras que la innata no
Pero debemos destacar que ambos tipos de mecanismos son fundamentales, de tal manera que la inmunidad innata se
centra en frenar el avance del agente infeccioso y la adaptativa finaliza el mecanismo de eliminación.
También podemos clasificar la respuesta inmunitaria en función de los elementos que ejercen la función principal de
ataque:
• Inmunidad celular: cualquier respuesta en la que los Ac desempeñan un papel secundario o subordinado
• Inmunidad humoral: La que se centra en la producción de Ac, y también se pueden considerar dentro de esta
categoría otros mecanismos en los que no participan células de forma prioritaria, como por ejemplo el Complemento
1. Inmunidad celular.
1.1 Fagocitosis
1.2 CCDE (citotoxicidad celular directa específica)
1.3 CCDI (citotoxicidad celular directa inespecífica)
1.4 CCDA (citotoxicidad celular dependiente de Ac)

2. Inmunidad humoral (Ac)
2.1 Respuesta humoral primaria
2.2 Respuesta humoral secundaria
2.3 Dinámica de la producción de Ac
3. Control de la respuesta inmunitaria
4. El sistema del complemento
4.1 Descripción
4.2 Vías de activación
4.3 Regulación
1
INMUNIDAD CELULAR
1.1 Fagocitosis
1.2 CCDE
1.3 CCDI
1.4 CCDA
1.1 Fagocitosis
§ Algunas proteínas
bacterianas, como
formil-met-leu-phe
§ Algunos componentes del

C, como el C5a
§ El NCF, producido
producido por
mastocitos y basófilos
§ Leucotrieno B4, producido

por mastocitos
y basófilos.
q LAM-1 ó L-selectina (molécula de
adhesión de los leucocitos) à
interacción de baja afinidad
q Integrinas à fuerte interacción
q PSGL-1 (ligando glucoprotéico de P-

selectina) àinteracción indispensable
para la salida de las células fuera del
vaso sanguíneo.
NETs
1.2 CCDE
Activación de los CD4+
La activación de las células dendríticas inmaduras ,
en respuesta a PAMP, DAMP (daño asociado a
patrón molecular) y citoquinas, induce su
maduración.
Según la naturaleza de los estímulos que indujeron
su activación, podrán madurar en diferentes perfiles
capaces de activar a los TCD4+ y orientar su
diferenciación en células efectoras de una diferente
funcionalidad:
q Th1: inducen la activación del macrófago en

tejidos periféricos, activación de las NK y de los
CD8+ y el desarrollo de su memoria inmunológica
q Th2: inducen la movilización de eosinófilos y
mastocitos y la producción de IgE, participando en
el ataque a parásitos extracelulares grandes, asma y
reacciones alérgicas
q Th17: inducen la producción, movilización e
infiltración de neutrófilos en el tejido afectado.
q Tfh: median la colaboración con LB y les permite
diferenciarse en plasmocitos productores de Ac.
q T reg: median un efecto supresor sobre la
activación de diferentes poblaciones B y T.
Reconocimiento de la célula infectada
Mecanismo perforina/granzima
Mecanismo FasL7/Fas
Apoptosis
1.3 CCDI
1.2 CCDA
2
INMUNIDAD HUMORAL
2.3 Dinámica en la producción de Ac

Activación de Tfh y encentro del LB con el Ag
Los linfocitos T CD4+ que se activaron y
expandieron por reconocimiento del péptido
antigénico presentado por las células
dendríticas a través de moléculas de clase II
del CMH, se diferencian en linfocitos Tfh y
migran hacia el folículo primario. Los linfocitos
B vírgenes reconocen el antígeno sobre la
membrana de los macrófagos subescapulares
o en forma soluble, preferentemente dentro
del folículo primario.
Al reconocer el antígeno, el linfocito B se

activa, aumenta la expresión de CCR7 y migra
hacia la zona paracortical. La colaboración Tfh-
linfocito B se produce en el borde del folículo
primario, donde ambas poblaciones celulares
se expanden. B.
Formación de centroblastos: hipermutación somática
La mayoría de las células B activadas se dirigen al folículo

primario, donde proliferan activamente (centroblastos) y sufren
el proceso de hipermutación somática, que redundará en un
incremento en la afinidad de los anticuerpos producidos.
La hipermutación somática es un mecanismo por el cuál los

genes que codifican la porción variable de las cadenas
pesadas y ligeras de las Ig sufren mutaciones puntuales con
una tasa muy alta. Como consecuencia, después de cada
mitosis dan lugar a centrocitos con BCR diferentes de los que
partían
Algunos linfocitos abandonan este primer foco de proliferación, se dirigen a los cordones medulares del ganglio linfático
y se diferencian en plasmocitos de vida corta , que producen los primeros Ac de la respuesta humoral, de tipo Ig M
Formación de centrocitos
El centro germinal está formado por una zona

oscura, que contiene centroblastos en proliferación, y
una zona clara compuesta por centrocitos, linfocitos
TFH y células foliculares dendríticas (CFD).
Los centrocitos expresan en su superficie

inmunoglobulinas mutadas, y los que las expresan de
mayor afinidad por el antígeno lo reconocen sobre la
superficie de la CDF.
Allí, los antígenos se encuentran sin procesar y

forman parte de complejos inmunes.
Selección darwiniana
Los centrocitos capaces de unir el antígeno con alta

afinidad, lo “arrancarán” de la superficie de las CDF, lo
endocitarán y procesarán, presentándolo a los linfocitos
Tfh a través de moléculas de clase II del CMH.
La colaboración con los linfocitos Tfh induce señales de

supervivancia en los centrocitos, que lo “rescatan” de la
apoptosis.
Formación de células plasmáticas y LB de memoria
Los centrocitos que han sobrevivido a la selección, dan

lugar a 2 tipos de células:
• Plasmoblastos: que abandonan el centro germinal para

complementar su diferenciación hacia células plasmáticas
en M.O à liberación de Ac
• B memoria: su BCR es mucho más específico que el BCR

del B de origen y la respuesta frente a una nueva entrada
del Ag será más rápida
2.3 Dinámica en la producción de Ac
CONTROL DE LA RESPUESTA INMUNITARIA
3
Control celular
Existe una regulación negativa cruzada entre los Th1 y
los Tfh (antes (Th2):
• La activación de los Th1 conlleva una producción
de IL-2 e IFN-γ que inhibe el desarrollo de la
respuesta mediada por Tfh.
• La activación de los Tfh implica una secreción de
Il-4 e IL-10 que inhibe el desarrollo de una
respuesta mediada por los Th1
EL SISTEMA DEL COMPLEMENTO
4
Es un grupo de más de 30 proteínas que forman un sistema enzimático en cascada
Principales funciones qActivación de macrófagos

q Citolisis
q Opsonización
q Amplificación de la R.I.H.E
q Eliminación de I.C
4.1 Vía clásica
4.2 Vía alternativa
4.3 Vía de las lectinas
También se denomina Vía clásica independiente de Ac
MBL
MASP1
MASP2
C4
C2
C3 convertasa
4.4 Regulación
La actividad del complemento debe estar muy regulada, pues puede resultar muy lesiva
para el organismo.
Los diferentes mecanismos de regulación que se establecen son:
§ Los componentes se encuentran inactivados y sólo si se recibe algún estímulo se activan

§ El hecho de ser una cascada enzimática hace que se vayan activando poco a poco
§ La vida media de los componentes activados es relativamente corta
§ Es muy importante la actuación de inhibidores:
a. séricos:
- Factor H
- Factor I
- Factor S ó vitronectina à impide el anclaje del M.A.C
- C1 INH
b. celulares:
- PCM (proteína cofactor de membrana) à impide la formación de C4b2b
- D.A.F (Cd 55) à disocia C4b2b y C4b2b3b
- CD59 à interfiere la polimerización de C9 y formación del MAC
- HFR (factor homólogo de restricción)
4.5 Funciones
qIncremento en la permeabilidad vascular
q Opsonización y endocitosis
q Anafilotoxinas
q Quimiotaxis
q Adherencia inmune
q Lisis reactiva
F. y T. De Análisis Hematológicos y
Citológicos 2014-15 María Cerezo Ibáñez
4.5 Enfermedades asociadas al complemento
q Déficit genético de uno ó más de sus componentes

Ejemplos: qC1, C2, C4 à L.E.S
qC3 à septicemia grave
qC5, C6, C7, C8à diseminación por Neisseria
q Ac específicos que dirigen la acción del complemento contra células propias
q Falta de control del sistema que produce un daño tisular excesivo

Bibliografía:
• Rubio,F.; B. García; R.Romero. 2016.Técnicas de inmunodiagnóstico. 1 ed. Paraninfo
• Fainboim.L; J.Geffner. 2012. Introducción a la inmunología humana. 6 ed.Panamericana

UT 2.2 INFLAMACIÓN
La inflamación es la reacción del tejido conectivo vascularizado frente a un daño.
Los factores que pueden inducir esta reacción se clasifican en:

§ Endógenos:
• Necrosis tisular
• Rotura ósea
• S.I dirigido contra estructuras propias (patología autoinmune)
§ Exógenos:
• Mecánicos
• Físicos (quemaduras)
• Químicos
• Biológicos
• Inmunológicos
Los agentes que participan en esta reacción son:

a. Componentes sanguíneos (células, citoquinas, etc.)
b. Tejido conectivo (mastocitos y fibroblastos)
c. Matriz extracelular (elastina, colágeno,etc.)
Los signos que se presentan son los siguientes:

§ Coloración
§ Dolor
§ Calor
§ Hinchazón
Los tipos de inflamación que podemos encontrar son:
a) Inflamación aguda: se produce un exudado inflamatorio, que es rico en

proteínas. Las células más importantes son los neutrófilos.
b) Inflamación crónica: La reacción inflamatoria es más productiva que

exudativa, es decir, que la formación de tejido fibroso prevalece sobre el
exudado de líquidos. Las células efectoras son macrófagos y linfocitos.
La inflamación crónica, puede ocasionarse como:
• Progresión de una inflamación aguda
• Episodios recurrentes de una inflamación aguda
• Como una inflamación crónica desde el inicio ocasionada por agentes
infecciosos especiales (Mycobacterium)
Técnicas de inmunodiagnóstico 1
INFLAMACIÓN AGUDA
La I.A (inflamación aguda) se ve muy potenciada por la acción del complemento,

debido a la acción de componentes como el C 3a y el C 5a, con acción quimiotáctica
y anafilotóxica.
Los macrófagos activados en un perfil inflamatorio (comúnmente denominados M1),

también pueden iniciar esta respuesta inflamatoria con la producción de citoquinas
como: IL-1, IL-6, TNF-α y quimiocinas inflamatorias. También producen IL-10 y
TGF- , que modulan la producción de mediadores inflamatorios por el macrófago y
ejercen así un control autocrino y paracrino sobre el potencial inflamatorio del
macrófago.
Las citoquinas IL-1, IL-6, TNF-α, son las encargadas de orquestar la reacción
inflamatoria aguda, local y sistémica, que intentará resolver el proceso infeccioso
con la eliminación de su agente causal.
a) Respuesta local à se pone en marcha la cascada de la coagulación,

(intentando aislar el agente inflamtorio) la de las quininas y la fibrinolisis.
Se induce la aparición de moléculas de adhesión en las células endoteliales
para favorecer la diapédesis (ICAM, VCAM, ect.)
La IL-1 y TNF- inducen la producción de IL-8, que es un potente factor
quimiotáctico de neutrófilos.
Se activa el C (complemento) por la vía alternativa à se potencia más la
quimiotaxis y anafilotaxis.
b) Respuesta sistémica à Las acciones inflamatorias sistémicas mediadas por

estas citoquinas se ejercen en 3 niveles:
§ Hepático: con la producción de RFA (reactantes en fase aguda).
§ Hipotalámico: inducen el aumento de la temperatura corporal y de la CRH

(hormona liberadora de corticotropina) , que estimula a la hipófisis para
liberar ACTH, induciendo así un aumento de glucocorticoides.
La fiebre es una respuesta adaptativa, que se produce por un aumento del
metabolismo de grasas y proteínas en el tejido adiposo, hepático y muscular;
de esta forma se inhibe el crecimiento de mucho m.o.
§ En M.O y PGM: inducen neutrofilia.
Los RFA son sintetizados en su mayoría por los hepatocitos. Su producción se

incrementa en forma rápida y notable, unas 10.000 veces en 6 – 48 horas.
Los hepatocitos también pueden producir RFA cuando son estimulados por el C5a y
por péptidos formilados.
Estas proteínas median, centralmente, dos funciones:
a) ejercen una actividad microbiostática o microbicida

b) protegen a los tejidos propios de las acciones nocivas asociadas con el curso de
las reacciones inflamatorias.
REGULACIÓN DE LA INFLAMACIÓN AGUDA
Con el fin de modular el desarrollo de la respuesta inmunitaria y evitar efectos

nocivos sobre el huésped, cada uno de los diversos mecanismos efectores que
componen esta respuesta están bajo estricto control de mecanismos inhibidores.
Los propios macrófagos, al activarse producen citoquinas que modulan su
funcionalidad e inhiben la capacidad inflamógena: IL-10 y TGF-β
Estas citoquinas inhiben:
a) La producción de IL-1, TNF- , IL-6 y quimiocinas inflamatorias por el

macrófago y otros tipos celulares presentes en el entorno inflamatorio
b) El incremento en la expresión de las moléculas MHC II y de las moléculas
coestimuladoras CD80 y CD86 en los macrófagos y en las células dendríticas
Bibliografía:
q “ Introducción a la inmunología humana”, Fainboim & Geffner 6ª edición.

Ed. Médica Panamericana
UT 2.3 ACTUACIÓN DEL SISTEMA INMUNE FRENTE A LA ENTRADA DE UN Ag
1.- Barreras naturales (piel, epitelios, etc)
Si consigue atravesarlas
Entran en acción varios mecanismos rápidos e inespecíficos
1.- Activación del complemento (C) por la ruta alternativa à mecanismo humoral
natural à opsonización por fragmentos del C y lisis directa por el MAC (complejo
de ataque a la membrana).
2.- Macrófagos à principales efectores de la inmunidad natural en los tejidos, y

sirven como CPA (célula presentadora de Ag) de linfocitos T no vírgenes.
Los macrófagos tienen diferentes receptores Para LPS

Para Fc de Ac
Para C3b
Para MHC I y MHC II
Si el macrófago reconoce por algunos de los receptores al Ag pueden ocurrir
varias cosas:
a) Fagocitosis y destrucción celular (pero no puede con todos)

b) Liberación de citoquinas esenciales para la siguiente fase de la respuesta
natural.
c) Procesamiento proteolítico con la presentación de alguno de sus péptidos en
el surco del MHC II
3.- Células dendríticas à Son las únicas CPAs capaces de activar LT vírgenes,
captan al Ag y vía linfa lo llevan a los ganglios linfáticos para presentárselo a los LT
2ª ETAPA DE LA RESPUESTA NATURAL
Si el m.o (microorganismo) ha escapado a la fase anterior, esta etapa tiene como

objetivo mantener a raya al patógeno a la espera de la actuación del sistema
adaptativo.
Es un mecanismo rápido porque no requiere expansión clonal.
Son una serie de respuestas carentes de memoria y especificidad, que son
importantes porque:
Ø En muchos casos pueden acabar con el patógeno por sí mismas.
Ø Mantiene a raya al m.o mientras se está preparando la
respuesta adaptativa ( o específica)
Ø Influyen sobre la respuesta adaptativa ( con el patrón de
citoquinas que generan)
1
Las citoquinas que habían secretado los macrófagos van a servir para atraer a más
fagocitos y células efectoras al lugar de infección.
El TNF- , IL-6 e IL-1son muy importante para iniciar la respuesta inflamatoria,

cuyas consecuencias son:
• Vasodilatación
• Extravasación de leucocitos al tejido
• Coagulación sanguínea local para evitar que el m.o entre en la
circulación y se disemine
• El fluido que se ha vertido al espacio tisular transporta al patógeno,
sólo o con CPA por la linfa, a los ganglios linfáticos, donde se va a
iniciar la RI específica
Si el m.o a pesar de esto, logra pasar a la circulación sanguínea (septicemia) se

pone en marcha un mecanismo que puede ser catastrófico para el hospedador:
Los macrófagos liberan TNF- que se distribuye por todo el cuerpo à causa
vasodilatación y pérdida de plasma generalizado àshock séptico.
Coagulación diseminada à formación de pequeños trombos y agotamiento de
factores de coagulación à pérdida de la capacidad de coagular adecuadamente
à fallo funcional de diferentes órganos vitales (riñones, hígado, corazón y
pulmones) àpeligro de muerte
Las citoquinas secretadas por los macrófagos activados también conducen a

respuestas defensivas sistémicasà como la RFA (respuesta de fase aguda)
Se debe a la acción de la IL 6 (producida por los macrófagos), sobre los
hepatocitos, que producen gran cantidad de proteínas de fase aguda:
• Proteína C reactiva à al unirse a una bacteria la opsoniza y activa el

C(depende del Ca2+)
• Proteína de unión a manosa (MBP) à es una lectina Ca2+ dependiente.
Se parece mucho a C1q del Cy puede activar un complejo proteolítico
capaz de iniciar la ruta clásica de actuación del C.
La RFA logra al cabo de 1 ó 2 días que se disponga de 2 tipos de moléculas

inespecíficas para que hagan algo similar a las Ig à opsonización del patógeno y
activación del C.
2
OTROS MECANISMOS DE DEFENSA INESPECÍFICA
• Los IFN y inhiben la multiplicación intracelular de los virus y pueden

activar ciertos
mecanismos
a) Mejoran la capacidad de las células infectadas por virus de
presentarlo a los CD8 (inducen mayor expresión de MHC I)
b) Activan las NK (estas células cumplen un papel defensivo en las
primeras fases de infecciones por parásitos intracelulares)
• Células B CD5à poseen un repertorio muy limitado de receptores.

Parece que están especializadas en reconocer Ag polisacáridos de tipo TI-2
(timo independientes tipo II).
No hay maduración de afinidad ni cambio de clase.
La Ig predominante es la Ig M.
Tampoco hay memoria inmunológica.
Pero su respuesta es mucho más rápida que la la otros LB.
Puede considerarse como parte de la respuesta temprana previa a la
inmunidad específica.
RESPUESTA ADAPTATIVA O ESPECÍFICA
Se induce cuando los mecanismos naturales no han sido suficientes.

Tarda varios días en ser operativa, debido al tiempo requerido para la activación de
LT y LB y su proliferación para diferenciarse en las correspondientes células
efectoras.
A. Activación de las células Th cuando los LT específicos circulantes

encuentran el Ag en los órganos linfoides periféricos.
Los Ag son drenados hasta los ganglios linfáticos regionales.

El hecho de que el Ag esté atrapado por las CPA y los LT estén recirculando
continuamente , asegura que las pocas células T específica de un Ag determinado
terminen por interactuar con él en la superficie de una CPA
Si reconoce al Ag específicoà activación del LT à proliferación à diferenciación
a células efectoras.
Las citoquinas producidas durante las primeras fases de la infección influyen en la

diferenciación funcional de los Th.
Durante la interacción de los Th (CD4) vírgenes con el Ag en los tejidos linfoides
periféricos es cuando se decide la diferenciación hacia los diferentes tipos de TH.
3
a) Th1à producen IL-2 e IF- à funciones inflamatorias de los
macrófagos y respuesta celular frente a parásitos intracelulares
b) Th2à producen IL-4, Il-5, IL-13 à inducen la movilización y activación
de de eosinófilos y mastocitos, favoreciendo la producción de Ig-E por
los LB.
c) Th17à producen IL-17 àproducción, movilización e infiltración por
neutrófilos del tejido infectado.
d) Tfhà producen IL-4, IL-10 à median la colaboración con los LB:
Lo que decide uno u otro resultado à patrón de citoquinas presentes en las

primeras fases de activación y proliferación de los CD4.
B. Las T efectoras acuden a los sitios de infección debido a que expresan

determinadas moléculas de superficie
Las TC que salen activadas de los órganos linfoides secundarios aumentan la

expresión de moléculas de superficie, como la integrina VLA-4 que se une con la
VCAM-1 existente en la superficie de las células endoteliales cercanas a la
infección (la VCAM-1 ha sido inducida debido al estímulo de las citoquinas
producidas en el foco de la infección).
No todas las células efectoras y de memoria que migran a los tejidos van a
encontrarse con el Ag específico, en este caso vuelven al ganglio linfático y
retornan al circulatorio, por lo que tienen otra oportunidad.
Si después de varios días, las células TC siguen sin encontrar el Ag mueren por
apoptosis y las de memoria tienen una vida de varios años (incluso decenios).
Las células T armadas secretan TNF y IFN à interactúan para cambiar la

forma de las células endoteliales, lo que favorece el flujo de los leucocitos y
plasma.
C. LA RESPUESTA ESPECÍFICA HUMORAL SE DESARROLLA EN LOS

TEJIDOS LINFÁTICOS PERIFÉRICOS BAJO LA DIRECCIÓN DE LOS
Tfh
Los CD8 y los Th1 ejercen sus acciones en los tejidos infectados, en cambio las Tfh
deben interaccionar con las células B, y ello sólo es posible en el entorno
especializado de los órganos linfoides secundarios.
4
Una de las cuestiones más interesantes y (aún no totalmente resuelta), es cómo 2
linfocitos específicos diferentes, el LB virgen maduro y el Th específico activado,
se llegan a encontrar para iniciar la respuesta humoral frente a Ag timo
dependientes1. La posible respuesta estriba en la ruta migratoria que siguen los LB
a través de los tejidos linfoides y el hecho de que existan Th en esa ruta.
Las células B maduras vírgenes entran al ganglio de modo parecido a las T, a través
del endotelio venoso alto (HEV).
Se piensa que las Th en reposo son activadas e inducidas a proliferar por el
contacto con el Ag presentado por la célula dendrítica interdigitante à así hay un
aumento en la cantidad de Th específicos activados.
Cuando la célula B en reposo y específica para ese Ag llega a esa zona, sufrirá una
1ª fase de activación tras internalizar el Ag à inmediatamente, algunos de los Th
específicos contacta a su vez con el LB (que actúa ahora como CPA para el Th) à
formándose el conjugado Th:B.
De esta forma, se produce una primera oleada de proliferación y maduración de LB
a células plasmáticas à Ac.
Pero unas pocas células B que han proliferado en esta primera oleada migran de la
corteza hasta el folículo primario, donde al seguir su proliferación y maduración
constituirán el centro marginal del folículo secundario bajo la influencia del Ag
atrapado en la superficie de las células dendríticas foliculares. Es aquí donde se
produce la hipermutación somática (fase de centroblasto) y la selección darviniana
en base a la mayor afinidad de las variantes de Ig de membrana de los centrocitos
por unirse al Ag sobre las células dendríticas foliculares.
De esta forma conforme pasa el tiempo va madurando la afinidad de los Ac.
El Ac formado al inicio, no sólo suministra protección, sino que parte de él se une al

Ag, para formar complejos Ag-Ac, que a su vez quedan retenidos sobre las células
dendríticas foliculares y que dirigen la maduración de la afinidad en fases más
tardías de la respuesta primaria y son predominantes en la respuesta secundaria.
Las células plasmáticas pueden tener 2 destinos:
1
Los Ag se pueden clasificar en timo dependientes (TD), que son de naturaleza protéica y
necesitan de la ayuda de Th para poder activar al resto de linfocitos, y timo independientes
(de naturaleza no proteíca) que no necesitan ser reconocidos por los Th.
Sólo los LB CD5+ pueden interaccionar con Ag timoindependientes.
5
• Permanecen en el órgano secundario donde se producen
• Algunos centrocitos abandonan el centro germinal y migran a médula ósea
como plasmoblastos, donde se terminan de diferenciar a células plasmáticas
El 90 % de las células plasmáticas que residen en médula ósea viven más
tiempo y secretan más Ac que las otras.
LOS MECANISMOS EFECTORES QUE ELIMINAN FINALMENTE EL

PATÓGENO DEPENDEN DEL AGENTE INFECCIOSO
Muchos virus son neutralizados extracelularmente por Ac y las células enfermas

infectadas son eliminadas por los CD8 y NK
Muchas toxinas bacterianas son neutralizadas por Ac, sobre todo Ig G.
Paro la mayoría de las bacterias extracelulares el mecanismo de eliminación

efectiva depende de las funciones secundarias del Ac:
Opsonización à fagocitosis ó activación del C por la ruta clásica
Las bacterias y protozoos intracelulares desencadenan mecanismos celulares,

principalmente, respuestas de hipersensibilidad retarda (con implicación de Tdth y
macrófagos) y en menor medida actuación de Tc
6
GENERACIÓN DE MEMORIA INMUNOLÓGICA
La memoria inmunológica sólo se puede producir frente a Ag timo-dependientes

(proteínas), porque es indispensable la colaboración de los Th y éstos sólo pueden
reconocer Ag proteicos previamente procesados y presentados en el MHC II de
una CPA.
En general, la memoria inmunológica permite una respuesta específica secundaria
mucho más rápida y eficaz.
MEMORIA DE CÉLULAS B:
La memoria de las células B está relacionada con 2 aspectos:
a. Células plasmáticas de vida media-larga

Son aquellas que se encuentran en M.O y proceden del centro germinal, en el
que han sufrido una hipermutación somática y una selección darviniana; se ha
producido el switch (cambio) isotípico y producen IgG.
Estos Ac tiene una vida de unos 20 días, pero su liberación mantenida por parte
de las células plasmáticas es lo que permite la presencia de estos Ac durante
muchos años (algunos pueden llegar a estar presentes toda la vida)
b. Células B de memoria:
Las BM proceden de los centrocitos que sobrevivieron en la selección darviniana.
Expresan en su superficie el marcador CD 27, de forma que se pueden
determinar por citometría de flujo.
Estas células recirculan por los O.L.S o se asientan en ellos.
Tienen 2 características que les confieren ventajas con respecto a los B2

vírgenes ante la reexposición al mismo Ag:
§ Su BCR está mejorado y presenta más afinidad y especificad por el Ag
que los B vírgenes
§ El MHC II presenta niveles aumentados, con lo cuál permite contactar
mejor con los Tfh
7
Principales características de la respuesta primaria y secundaria
Componente Respuesta primaria Respuesta secundaria
Células B Células no preactivadas Células de memoria
Tiempo de respuesta 5 – 10 días 1 – 5 días
Duración respuesta Corta Largo período
Isotipo de Ac predominantemente IgM predominantemente IgG
Afinidad del Ac baja alta
MEMORIA DE CÉLULAS T
Al igual que lo mencionado para las céllulas B, las T de memoria responden a la

reestimulación antigénica en forma más rápida y eficaz que las T vírgenes.
Las T vírgenes expresan en su membrana CD45RA, y las T de memoria CD45RO,
cuyo análisis por citometría de flujo, permite diferenciarlas.
8
Durante la repuesta aguda en un proceso infeccioso, se produce una fuerte
expansión de los clones T reactivos. Cada una de las T vírgenes activadas
producirá, en 5 - 8 días, una progenie de 10.000 células hijas.
Sin embargo, las células efectoras presentan una vida media corta, estimada entre
2 a 3 semanas. Así, a la primera etapa de expansión le sigue una etapa de
contracción, en la cual, el 90-95 % de las células efectoras mueren por apoptosis.
Las células que sobreviven se diferenciarán en células de memoria de vida media-
larga.
Este fenómeno de contracción no depende de que se haya eliminado o depurado el

antígeno inductor
A pesar de la contracción que sufren las células efectoras, la frecuencia de células
de memoria que quedan con respecto a células T vírgenes para el mismo epítopo es
de 100 a 1000 memoria/vírgenes.
Un fenómeno importante que condiciona la generación de la memoria en las células

T, es la dosis y persistencia del Ag; de esta forma dosis altas presentes por
períodos cortos de tiempo generan una memoria inmunitaria eficaz.
Las células T de memoria pueden clasificarse en:

a) Células de memoria centrales TMCà se encuentran en s.p., O.L.S y M.O y
su misión central es patrullar los O.L.S.
Se autorrenuevan por proliferación homeostática en los O.L.S
b) Células de memoria efectoras TMEà se encuentran en s.p, y tejidos
periféricos y su misión es conformar una primera línea de defensa.
Su presencia en los tejidos periféricos disminuye a medida que nos alejamos
en el tiempo del evento infeccioso. No obstante, el pool total de células de
memoria suele mantenerse relativamente constante a lo largo de los años.
9
Activación de las células T memoria:
La eficacia de la respuesta de las T memoria ante una reinfección se basa en:

1. Mayor presencia de células de memoria que de T vírgenes
2. Las TME ya se encuentran localizadas en los tejidos periféricos
3. Las TME median una producción de citoquinas inflamatorias (para los Th de
memoria) y una capacidad citotóxica más rápida y eficiente que las T
efectoras.
4. Las TME pueden activarse no sólo en respuesta al Ag, sino también en
respuesta a citoquinas inflamatorias. Este modo de activación, no
dependiente de la especificidad de las células T activadas suele llamarse
activación bystander o inespecífica.
Cuando las TME se activan, proliferan y se diferencian en T efectoras secundarias.

En una segunda etapa, la generación de una respuesta inflamatoria local conduce al
reclutamiento de nuevas TM (no todas serán específicas del Ag). En esta misma
etapa, las células dendríticas que han capturado el Ag en el tejido infectado se
dirigirán al O.L.S más cercano.
En la tercera etapa, las TMC presentes en el O.L.S, serán activadas por las células
dendríticas, produciéndose un alto número de células efectoras secundarias que
migrarán por vía circulatoria al tejido infectado.
Bibliografía:
q “ Introducción a la inmunología humana”,

humana Fainboim & Geffner 6ª
edición. Ed. Médica Panamericana
q http://www.ugr.es/~eianez/inmuno/inmuno.htm
10
UT.3 Diagnóstico
serológico

1. Introducción
2. Importancia de los estudios serológicos
3. Validación de las pruebas serológicas
4. Técnicas empleadas
5 . Expresión de los resultados
6. Tipos de pruebas
INTRODUCCIÓN
1 El diagnóstico serológico se encuadra dentro de las competencias del

laboratorio de microbiología.
Es un método indirecto empleado para poner de manifiesto la presencia

de un agente infeccioso, ya que no está basado en la demostración de la
presencia de ese agente en el organismo infectado, sino en la respuesta
inmunitaria que ha provocado en él.
El diagnóstico etiológico de las enfermedades infecciosas debe realizarse
demostrando la presencia del microorganismo causal en la muestra procedente
del proceso patológico.
Muestras: Sangre, esputo, orina, heces, etc
Realizaríamos un aislamiento y cultivo e identificación del m.o.
Sin embargo no siempre es posible, ya que hay bacterias incapaces de crecer en medios
de cultivo (como por ejemplo Treponema pallidum, el agente causante de la sífilis) ó bien
se necesitan medios de cultivo especiales y /o son de crecimiento lento ( Ej: Legionella ,
Bordetella pertussis y Rickettsia).
En estos casos es necesario utilizar métodos indirectos, demostrando la presencia de

antígenos bacterianos (es el caso del diagnóstico de Legionelosis detectando la presencia
de antígenos de esta bacteria en orina) ó bien buscando anticuerpos específicos frente a
estas bacterias en el suero de los pacientes.
El diagnóstico serológico se basa en el hallazgo en
el suero del paciente de ANTICUERPOS específicos
frente a un agente infeccioso.
El hecho de encontrar anticuerpos frente a los
diversos antígenos de un microorganismo nos hará
suponer que un paciente tiene o ha tenido contacto
con ese agente patógeno.
La característica más importante de este sistema es la
ESPECIFICIDAD.
En general, la presencia de anticuerpos IgM tiende a indicar infección reciente o fase
aguda de una enfermedad.
Mientras que la presencia de IgG sin IgM solo indica contacto con el antígeno
mediante vacunación, infección pasada o crónica.
Las IgG que aparecen en la respuesta primaria son de BAJA AFINIDAD, y las de la
respuesta secundaria son de ALTA AFINIDAD, por lo que si realizamos una prueba
con un kit en el que sólo podemos detectar IgG, sabríamos si estamos ante una
infección primaria porque las IgG unidas al antígeno que hemos preparado, se
despegarían más fácilmente que unas IgG de alta afinidad.
2
IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS SEROLÓGICOS
Cuando lo hacemos??
1. Cuando el cultivo de la muestra es negativo o se trata de un virus y no

disponemos de la tecnología necesaria para su cultivo.
2. Cuando el cultivo es mixto y no sabemos exactamente cuál es el patógeno
causante de los síntomas.
3. Cuando se aísla el patógeno en individuos sanos, ya que en esas ocasiones
nos sirve para determinar su estado de portador.
4. Para hacer estudios epidemiológicos.

3
VALIDACIÓN DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS
Empleamos los parámetros de sensibilidad, especificidad y valor predictivo como datos

para su evaluación.
SENSIBILIDAD: proporción de resultados verdaderos positivos (VP) que son detectados

en pacientes con esa enfermedad y esa técnica. Se puede calcular tb en porcentaje. Es
el tanto por ciento de pacientes correctamente diagnosticados.
VP
VP: verdaderos positivos
VP + FN FN: falsos negativos
ESPECIFICIDAD: proporción de verdaderos negativos (VN) que son detectados en ese grupo
de personas sanas. El tanto por ciento de pacientes sanos correctamente identificados.
VN
VN+FP
Cuanto más específica sea una técnica menos reacciones cruzadas detecta (no habrá falsos
negativos)
También se puede expresar en porcentaje
VN: verdaderos negativos

FP: falsos positivos
El VALOR PREDICTIVO de una prueba diagnóstica para una determinada enfermedad nos
indica si la prueba realmente es válida para diagnosticar una enfermedad en un determinado
grupo de población.
Viene definida por el VPP y el VPN
El VALOR PREDICTIVO POSITIVO es el porcentaje de personas con resultado positivo en

la prueba que realmente están enfermos.
VP
VPP = x 100
VP + FP
El VALOR PREDICTIVO NEGATIVO es el porcentaje de personas con resultado negativo en

la prueba que realmente están sanos.
VN
VPN = x 100
VN + FN
El valor predictivo depende de la prevalencia.
En una zona endémica para una determinada

enfermedad, el más importante es el valor
predictivo negativo.
Estos datos nos indican la probabilidad de una
persona de padecer o no una enfermedad
después de realizar la prueba diagnóstica.
En la tabla vemos un ejemplo del cálculo de

estos valores. Tenemos una población de 10.000
habitantes con una prevalencia de la enfermedad
estudiada del 1 %. Si tenemos una técnica
diagnóstica con un 99 % de sensibilidad y un 99
% de especificidad, los valores predictivos serán
los siguientes:
Para ver cómo varían esos datos
con la prevalencia, en la siguiente
tabla tenemos la misma población
con una prevalencia del 50 %, y la
misma técnica diagnóstica.
4
TÉCNICAS EMPLEADAS EN SEROLOGÍA
4.1 Uso de Ag
Existen gran variedad de métodos para detectar y cuantificar las principales Ig séricas (IgM,
IgG e IgA) de manera específica frente a un antígeno bacteriano conocido, pero para
detectar esos Ac en el suero del paciente específicos de un patógeno es necesario disponer
de los ANTÍGENOS de ese patógeno.
Los principales antígenos bacterianos serán partes de su composición, pared bacteriana,
antígeno (K), antígeno somático (O), antígeno flagelar (H) sus toxinas, (estreptolisina O)… se
pueden obtener de lisado de bacterias conocidas en el laboratorio, o se obtienen por
biología molecular.
4.2 Uso de Ac
Si se quiere determinar la presencia de un antígeno, se utilizará un anticuerpo

complementario. Hoy en día existen gran cantidad de ANTICUERPOS
MONOCLONALES que nos facilitan la detección de cualquier analito que
queramos buscar.
La obtención de anticuerpos se realiza inmunizando un animal con el antígeno que
deseamos detectar, obtendremos en su suero multitud de anticuerpos procedentes
de distintos clones de LB que irán frente a distintos epítopos del antígeno, se llaman
anticuerpos policlonales.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen mediante la técnica del hibridoma

desarollada por Koehler y Milstein en 1975.
Se extraen linfocitos B del bazo de un animal expuesto al antígeno, se fusionan con

células tumorales de mieloma múltiple, que se multiplican indefinidamente,
1LB+1MM=1HB por tanto forman hibridomas que además de crecer y multiplicarse
indefinidamente generan gran cantidad de anticuerpos.
Actualmente, se pueden obtener AcMo de segunda generación o AcR por la

metodología del ADN recombinante
4.3 Determinación de las distintas clases de Ig
Tenemos distintos tipos de Ig en el organismo, IgM, IgG, IgA…
¿Cómo determinamos en el paciente una Ig concreta por ejemplo IgM o IgG?
El fragmento Fc (constante) de cada tipo de inmunoglobulina es diferente y se

puede cortar con papaína y emplearlo como antígeno. Si inoculamos en un animal
de experimentación estos fragmentos Fc de IgG humana, producirá anticuerpos
frente a esa clase de inmunoglobulinas concreta. Si utilizamos Fc de IgM producirá
anticuerpos frente a Fc de esa IgM. (lo más común es hacerlo con IgG)
Si estos anticuerpos anti-IgG humana se marcan en la región Fc con un
enzima, una sustancia quimioluminiscente o una fluorescente, dispondremos
de un sistema para detectar específicamente la presencia de IgG en el suero
del paciente.
4.3 Avidez de las IgG
Las IgG de producción reciente son poco afines al antígeno y su unión puede
desestabilizarse con sustancias como la urea.
Para diferenciar si la infección es aguda (poco afín) o crónica (muy afín)…. Hacemos
una prueba ELISA por duplicado, una con urea y otra no, utilizando el mismo suero
del paciente (mismas IgG para las dos ELISAS)
Si la prueba con urea es negativa y la otra positiva, significa que las IgG son
recientes. Infección aguda.
Si las dos pruebas son positivas, las IgG son de producción antigua. Infección
crónica.
5
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Según el objetivo de los estudios serológicos los resultados se pueden

expresar de diferentes maneras:
a. Cualitativos
b. Cunatitativos
5.a Métodos cualitativos
Resultado de una técnica de aglutinación
Resultado de una técnica de

cromatografía en capa fina
5.a Métodos cuantitativos
Título de anticuerpos a la inversa de la mayor dilución del suero del paciente en la

cual aún se puede detectar el anticuerpo.
Normalmente el diagnóstico serológico requiere la
realización de las pruebas sobre sueros pareados, (tomar
dos muestras de suero en períodos separados,
generalmente 2-3 semanas) con objeto de demostrar un
aumento significativo en el título de anticuerpos.
Suele considerarse indicativo de infección, un aumento del titulo de anticuerpos de cuatro
veces o superior entre una muestra recogida durante la fase aguda, generalmente durante
la primera semana del inicio de los síntomas, y otra durante la convalecencia, usualmente
de 2 a 4 semanas después.
Este aumento del título 4 veces o más se denomina seroconversión. (Un aumento por 4 en
el título de anticuerpos sería por ejemplo la obtención de un resultado positivo a la dilución
1/8 del suero en fase aguda).
Otro método que avala la infección aguda es la demostración de la IgM específica, siempre
que esté probada su desaparición con el tiempo y la carencia de reacciones cruzadas
En otras ocasiones seroconversión podría ser la aparición de anticuerpos que antes no

estaban: resultado negativo de anticuerpos en fase aguda y positivo en fase de
convalecencia. (Depende de la patología, en VIH con que existan Ac se ha producido la
seroconversión).
Generalmente los títulos se expresan en unidades del S.I, y se calculan comparando el valor
obtenido en la muestra con el de un patrón o calibrador à
§ Resultados con un valor > al del patrón à positivo

§ Resultados con un valor < al del patrón à negativo
También se puede expresar en forma de índice, que es el coeficiente entre el valor de la

muestra problema y el del calibrador:
§ Muestras con un índice > 1 à positivo

§ Muestras con un índice< 1 à negativo
Para el diagnóstico de las infecciones congénitas,
se realiza la determinación de IgM en sangre de
recién nacidos. Las IgG debido a su pequeño tamaño
atraviesan la barrera placentaria y su hallazgo en el
suero de un recién nacido indica que son heredados
de la madre, pero las IgM son demasiado grandes
por lo que significa que es el sistema inmunitario del
recién nacido quien las genera.
6
TIPOS DE PRUEBAS
Las pruebas de diagnóstico serológico suelen clasificarse según los

métodos empleados para la detección de la reacción antígeno-
anticuerpo que queremos determinar.
Actualmente se clasifican en reacciones antígeno-anticuerpo primarias y

secundarias.
Las primarias, necesitan ser reveladas porque no son visibles a
simple vista, se revelan generalmente con un anticuerpo conjugado
formado por un anticuerpo anti-IgG unido a un marcador
(radioisótopos, enzimas, cofactores, fluorocromos, etc.) que pueden
ser cuantificados. (Destacan los EIA, RIA, Inmunoensayos
quimioluminiscentes, Inmunofluorescencia, Inmunoblot,
inmunocromatografía)
Se utilizan para determinar Ac IgM ó IgG

Las reacciones antígeno-anticuerpo secundarias no
necesitan ser reveladas ya que son visibles a simple vista.
(Reacciones de precipitación, aglutinación, fijación del
complemento)
• Son más rápidas que las tradicionales en
Microbiología.
• Con las técnicas de biología molecular se producen
antígenos específicos de manera sencilla y rápida.
El empleo de anticuerpos monoclonales da mayor

especificidad a las técnicas serológicas.
Se usan para determinar Ac totales

Bibliografía:

Bibliografía:
• Fainboim.L; J.Geffner. 2012. Introducción a la inmunología humana. 6 ed.Panamericana

UT.4 Reacciones de
aglutinación

1. Introducción a las técnicas secundarias
2. Concepto
3. Tipos de reacciones de aglutinación:
a. Aglutinación directa
b. Aglutinación indirecta
c. Inhibición de la aglutinación
d. Test de Coombs
4. Formas de realizar las pruebas
5. Valoración de la aglutinación
INTRODUCCIÓN A LAS
1
TÉCNICAS SECUNDARIAS
Las técnicas secundarias no valoran directamente los complejos inmunes sino que
lo hacen de forma indirecta, atendiendo a los cambios que se producen en el
medio.
Las reacciones Ag-Ac producen varias reacciones, visibles entre las que destacan
dos:
• Aglutinación: 1Ac se une a varios Ag y éstos a varios Ac… Red de aglutinación

visible
• Precipitación: Los Ag y Ac solubles, no se ven a simple vista, pero si se unen

formando una red pesan mucho y precipitan y sí los podemos ver.
También producen reacciones no visibles à Fijación del complemento.

Reacciones de • Se forma una red de Ag – Ac que dan
aglutinación lugar a una aglutinación
Reacciones de • La unión Ag – Ac da lugar a uniones muy

precipitación pesadas que precipitan en el medio
• Se valora un cambio de color en el medio

Técnicas de fijación del
complemento • Se utilizan los hematíes como sistema
revelador
2
CONCEPTO DE AGLUTINACIÓN
Las reacciones de aglutinación se producen entre partículas que están en suspensión.
Una suspensión es un sistema disperso heterogéneo formado por partículas de un sólido

en el seno de un líquido, siendo el sólido prácticamente insoluble en el líquido.
PartÍcula con Ag
en superficie
Para que se produzca aglutinación tienen que cumplirse los siguientes factores:
§ El Ag sea particulado y multivalente

§ El Ac sea una aglutinina completa à sólo las IgM lo son. En los casos de las IgG
se puede solventar este problema de varias formas:
a. Aumentar la viscosidad del medio en el que se encuentran las células. Esto se consigue añadiendo a éste
sustancias como la seroalbúmina bovina al 30 %, dextrano o polivinil pirrolidina.
b. Eliminar los residuos negativos de ácido siálico de la membrana celular. Esto se alcanza exponiendo las
células a la acción de enzimas como la tripsina, papaína, bromelina, etc.
c. Disminuir la fuerza iónica del medio que circunda a los hematíes, haciendo que éste contenga alguna
sustancia de tipo Baja Fuerza Iónica (LISS)
§ La concentración de Ag y Ac tiene que ser equilibrada, en caso contrario se

produce el fenómeno de zona:
a. Prozona: Exceso de Ac con respecto a Ag à conviene diluir el suero
b. Postzona: Exceso de Ag
Antígenos multivalentes: los que tienen varios epítopos
Partículas inertes Partículas vitales
La aglutinación ocurre cuando
las concentraciones de antígeno
y anticuerpo son equivalentes.
(NO IGUALES)
Si existe desequilibrio, tanto por

exceso de antígeno o de
anticuerpo se produce un
Fenómeno de zona y el
resultado es un falso negativo.
3
TIPOS DE REACCIONES AGLUTINACIÓN
Dependiendo de que el antígeno sea particulado o haya necesidad de

insolubilizarlo mediante fijación sobre un soporte (partículas o células) existen
dos tipos de reacciones de aglutinación: directa o indirecta
3.a Aglutinación directa
Las pruebas de aglutinación directa o activa son aquellas en las que la aglutinina
reacciona con un aglutinógeno presente de una forma natural en la superficie de un
tipo de células.
Aglutinación directa sobre bacterias de Brucelosis por diagnóstico
serológico en placa
Aglutinación directa sobre hematíes para
tipar los grupos eritrocitarios
3.b Aglutinación indirecta
Las pruebas de aglutinación indirecta o

pasiva son aquellas en las que la
aglutinina reacciona con un
aglutinógeno que ha sido transferido
pasivamente a la superficie de una
partícula vital o inerte porque
inicialmente era soluble.
Al proceso mediante el cual las

partículas son recubiertas con
aglutinógenos que no les son propios se
le denomina SENSIBILIZACIÓN.
Hay varios sistemas que facilitan la sensibilización de las células:
§ Uno de ellos consiste en exponer las células a la acción de algunas sustancias: ácido
tánico (adhiere)
§ Otro se basa en emplear moléculas bifuncionales,

1. Se unen a la célula por fuera,
2. El antígeno se une a ellas.
Hay una clase especial de prueba de aglutinación indirecta, llamada INVERSA, en la

que el aglutinógeno está libre en la muestra problema y reacciona con la aglutinina
que está fijada a la superficie de la partícula.
Aglutinación indirecta de látex en placa
Antiestreptolisina ASO: Fiebres reumática (estreptococos del grupo B)
Hemaglutinación indirecta (HAI)
§ Soporte: Utilizamos hematíes tratados.

§ Se sensibilizan con los Ag problema.
§ Se efectúa en placa de microtitulación con diluciones seriadas de suero.
§ Evidencia del positivo:
Velo rosáceo/ marrón
+
§ Requiere de un control negativo:
Descartar la presencia de hemaglutininas en el suero problema (Ac que aglutinan
hematíes).
Hemaglutinación de Treponema pallidum en
el diagnóstico de sífilis
3.c Inhibición de la aglutinación
Estas técnicas son una modificación de las técnicas de aglutinación y PERMITEN DETECTAR ANTÍGENOS
SOLUBLES, que no van unidos a ninguna partícula.
1.Consiste en una incubación previa del antígeno a estudiar del paciente (aglutinógeno) con su anticuerpo
(aglutinina) correspondiente. De esta manera quedan cubiertos los sitios de unión del anticuerpo.
2. Posteriormente se añade el mismo antígeno pero sobre la superficie de una partícula. Si el anticuerpo
está saturado con el antígeno soluble presente en la muestra, no se producirá aglutinación.
3. Ausencia de aglutinación: prueba positiva.

Inhibición de la hemaglutinación
Se usa usa mucho en microbiología para

detectar Ac frente determinados virus con
Ag capaces de aglutinar hematíes
3.d Test de Coombs
4
FORMAS DE REALIZAR UNA AGLUTINACIÓN
Las aglutinaciones pueden hacerse en diferentes soportes:

a. Portaobjetos
b. Tarjetas
c. Placas de microtitulación
d. En tubo
Aglutinación en portaobjetos
Aglutinación en tarjeta
Aglutinación en placa de microtitulación
Aglutinación en tubo
5
VALORACIÓN DE LA AGLUTINACIÓN
Las técnicas de aglutinación son muy usadas en la actualidad debido a su

rapidez y fácil manejo
Las aglutinaciones pueden ser:

§ Cualitativas
§ Semicuantitativas (mediante diluciones de suero)
Es difícil hacer una cuantificación del antígeno o anticuerpo buscado. La mayoría de las
veces las pruebas de aglutinación son meramente cualitativas, es decir, sólo establecen la
presencia o la ausencia de la sustancia buscada en la muestra problema.
Una forma de dar una idea aproximada de la cantidad de sustancia problema que hay en la
muestra utilizada consiste en asignar más o menos cruces (+) a la aglutinación,
dependiendo del número de agregados que aparecen y del tamaño de estos.
Es posible hacer una semicuantificación. Consiste en preparar diluciones seriadas de la
muestra problema, de forma que se disponga de una batería de diluciones en la que la
sustancia investigada esté en unas concentraciones decrecientes.
Después se realiza el ensayo de aglutinación con cada una de las diluciones preparadas.
De esta forma, aunque con las primeras diluciones la prueba nos dé positiva (haya una
aglutinación distinguible), llegará un momento en el que la concentración de la sustancia
problema en una dilución sea lo suficientemente pequeña como para que la prueba se
torne negativa (no aparezca aglutinación).
La UMD es la cantidad mínima de sustancia que es capaz de detectar una técnica:

Concentración = UMD x inversa de la última dilución con aglutinación
Bibliografía:

UT.5 Reacciones de
precipitación

1. Concepto
2. Tipos de reacciones de precipitación:
a. En medio líquido o floculación
b. En medio semi-sólido
3. Otros factores factores que influyen en las reacciones de inmunoprecipitación

CONCEPTO
1 Las reacciones de Inmuno-precipitación se producen cuando se enfrenta un

antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente, de modo que se forma
un complejo antígeno-anticuerpo insoluble que da lugar a un precipitado
observable a simple vista
Las técnicas de precipitación se basan en la reacción de la precipitación

que ocurre cuando un antígeno soluble multivalente se une con su
anticuerpo específico (bivalente en el caso de las IgG, o decavalente en el
caso de las IgM), dando lugar a inmunocomplejos que precipitan en el
medio de la reacción.
Al igual que sucede con las reacciones de
aglutinación, es necesario trabajar con
concentraciones equimoleculares de antígeno y
anticuerpo, es decir, en el PUNTO DE
EQUIVALENCIA.
En caso contrario, se puede producir un

«FENÓMENO DE ZONA», con un resultado falso
negativo.
Tanto el exceso de anticuerpo (izquierda)

como el exceso de antígeno (derecha)
comportan una disminución de la
concentración de inmunocomplejos
formados.
TIPOS DE REACCIONES
2
Las reacciones de inmunoprecipitación pueden producirse en medio
líquido o en medio semisólido:
a. En medio líquido o floculación:
1. Turbidimetría
2. Nefelometría
b. En medio semi-sólido à se conocen como reacciones de
precipitación en gel ó inmunodifusión:
1. Doble difusión
2. Inmunodifución radial (IDR)
3. Inmunoelectroforesis
4. Inmunofijación
5. Contrainmunoelectroforesis
6. Electroinmunodifusión
2.a Reacciones en medio líquido
Se basan en medir la turbidez
Han sido desplazadas por las técnicas de

inmunodifusión
Los complejos antígeno-anticuerpo quedan en

suspensión en la muestra dando un aspecto
turbio al líquido. Estos agregados pueden
precipitar con mayor o menor rapidez dando
copos de diferentes tamaños.
Para favorecer su determinación con métodos
automatizados, es preferible evitar la
sedimentación y hacer la medición lo antes
posible desde el momento en que se han
formado todos los inmunocomplejos.
2.a.1 Turbidimetría
§ Muestras con grandes concentraciones de partículas dispersantes.
§ Usa relación entre:
§ Concentración de analito
§ Transmitancia medida con un espectrofotómetro
§ Determinación cuantitativa de IgA, IgG e IgM en suero humano, se utilizan antisueros.
§ La cantidad de inmunocomplejos formados es proporcional a la concentración de

inmunoglobulina presente en la muestra.
T= I / I0: determina cuánto se atenúa un haz de luz que se traslada a través de una
suspensión.
2.a.2 Nefelometría
En esta técnica se mide la cantidad de luz dispersada por las partículas en suspensión, es decir, se
cuantifica la cantidad de luz que es desviada por éstas, en un determinado ángulo, con respecto a la
dirección del rayo incidente.
El ángulo utilizado, normalmente, para evaluar la cantidad de luz dispersada, está comprendido
entre los 30º y los 90º. Lo mas frecuente 70º
§ Muestras con pequeñas concentraciones de partículas dispersantes.

§ Estimación de Ig, componentes del complemento, proteína C reactiva, etc.
§ Usando Ac. monoclonales.
§ Método sencillo y reproducible
§ Requiere el uso de un blanco de muestra:
§ Descarta turbidez por agregados insolubles no inmunológicos

Esquema de funcionamiento de un nefelómetro.
Tipos de determinaciones
a. Determinaciones a punto final: En estas técnicas se deja transcurrir el tiempo

suficiente para que se formen los agregados. Empleamos un blanco de reactivos y
una curva de calibración para interpolar los resultados.
b. Determinaciones continuas (cinéticas): en estas técnicas lo que se calcula es la

velocidad con la que se forman los agregados.
Esta velocidad está directamente relacionada con la cantidad de antígeno
presente en la muestra
2.b Reacciones en medio semisólido
Consisten en el desplazamiento o difusión, a través de dicho medio, del antígeno, del anticuerpo o de
ambos simultáneamente, dando un arco o banda de precipitación cuando ambos se encuentran a la
concentración adecuada.
La difusión puede ser espontánea o utilizando un campo eléctrico.
Existen diferentes modalidades según:
§ Difundan por el gel uno o los dos componentes de la

reacción.
§ La difusión sea espontánea o forzada por aplicación de

un campo eléctrico.
§ Se trate de una técnica cualitativa o cuantitativa.

2.b.1 Doble difusión o método de Ouchterlony
En este método se taladran unos pocillos en el

gel y en ellos se depositan el antígeno y el
anticuerpo, que migrarán hasta encontrarse y dar
un arco de precipitación.
Si colocamos muestras distintas en pocillos
adyacentes, podemos saber si los antígenos que
contienen son iguales, diferentes o si comparten
algún determinante antigénico.
A medida que los dos componentes de la reacción van difundiendo libremente por
el agar, se irá formando un gradiente de concentraciones.
En el espacio entre los dos pocillos habrá una determinada zona en la que los
reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, y es ahí donde se formará un
precipitado que sobre el gel se detectará como una banda blanca visible a simple
vista.
§ Técnica cualitativa.
§ Gradiente de concentraciones.
§ Informa sobre la concentración relativa.

Se formará la banda más próxima al
pocillo con menos concentración y/o de
mayor tamaño
§ Estudios de identidad entre Ag.

Estudios de identidad entre Ag
Identidad total (I), antígenos que comparten

todos los determinantes antigénicos –las bandas
de precipitación se fusionan.
No identidad (II) ningún determinante es

compartido y por lo tanto son antígenos
distintos.
Identidad parcial (III), hay algunos determinantes

comunes y otros diferentes, siendo estos últimos
los responsables de que se forme un espolón
dirigido hacia el pocillo con menos
determinantes reactivos.
Informa sobre la concentración relativa.
Se formará la banda más próxima al pocillo

con menos concentración y/o de mayor
tamaño.
Por esta razón, si enfrentamos un antígeno a

diferentes diluciones de un suero que
contiene anticuerpos específicos, la distancia
a la que se for man las bandas de
precipitación va variando en función de la
concentración de anticuerpos.
Titulaciones
El hexágono que Ac
tienden a formar las
bandas resultantes de
la precipitación aparece Ac Ac
desplazado, respecto
del pocillo central,
hacia los pocillos que Ag
contienen la menor
concentración de
anticuerpos, es decir Ac Ac
hacia las diluciones más
altas.
Ac
2.b.2 Inmunodifusión radial (IDR) ó técnica de Mancini
En este caso el gel contiene disuelto uno de los reactantes, generalmente el

anticuerpo.
Después se hacen los pocillos en los que se deposita el otro reactante,
generalmente el antígeno.
El antígeno difunde de manera circular por el gel y al reaccionar con el anticuerpo
precipita.
El área del anillo final de precipitado, expresado en forma de diámetro al cuadrado
(d2), es directamente proporcional a la concentración del antígeno en la muestra,
por lo tano es una técnica cuantitativa
La difusión ocurre en todas las direcciones a partir del pocillo, y se irá formando, como en la
doble difusión, un gradiente de concentración.
Difusión radial Doble difusión
La diferencia es que en este caso, sea cual sea la dirección en que difunda el componente
depositado en los pocillos, llegará un momento en que se encuentre con la concentración
equivalente del componente incorporado en el gel.
En consecuencia, EL RESULTADO NO SERÁ UNA LÍNEA SINO UN ANILLO DE

PRECIPITACIÓN.
Si en los pocillos excavados en un gel con anticuerpo incorporado se dispensa una serie
de diluciones de un antígeno, se puede establecer una recta patrón, representando
gráficamente el diámetro de los anillos de precipitación frente a la concentración de
antígeno en cada pocillo.
Esto permite conseguir una determinación cuantitativa

dE
dD
dC
dB
dA
El área del anillo final de precipitado, expresado en forma de diámetro al cuadrado (d2),
es directamente proporcional a la concentración del antígeno en la muestra.
Hay muchos FACTORES QUE INFLUYEN EN EL DIÁMETRO FINAL del anillo formado:
- volumen de la muestra,
- concentración del anticuerpo en el medio,
- pH del medio
- tiempo de incubación
Que han de ser mantenidos constantes para determinar un valor fiable de concentración.
En este vídeo se puede ver la técnica de la inmunodifusión radial:
https://www.youtube.com/watch?v=Bn-w6P_9TUA
Esta técnica resulta muy útil en inmunología clínica para cuantificar fracciones plasmáticas
de proteínas como inmunoglobulinas, factores de coagulación o componentes del
complemento.
Por ejemplo,
si se pretende determinar la concentración de IgG en un suero, se utilizan placas con
inmunoglobulinas anti-IgG humanas en el gel.
?
Anti-IgG diluciones de IgG
de [ ] conocida
Reacción Ag-Ac:
si uso anti-Ac
las IgG que quiero detectar actúan
como Ag aunque sean en realidad Ac
PASOS:
-Añadimos patrones en los que

el antígeno está a
concentraciones conocidas en
varios pocillos.
-Incubamos el tiempo necesario

en condiciones determinadas.
-Medimos los diámetros (d) de

sus correspondientes anillos
finales y trazamos una curva
estándar o de calibrado.
-
-Calculamos la concentración del
antígeno mediante la
interpolación del cuadrado de su
diámetro en la misma.
2.b.3 Inmunoelectroforesis
Combina la separación proteica por

electroforesis y la inmunodifusión
En esta técnica se emplea una electroforesis

previa para separar los componentes de la
muestra.
La muestra se deposita en un gel y se hace
pasar la corriente eléctrica.
Posteriormente se coloca el anticuerpo en

un surco y se deja que difundan y precipiten
los complejos antígeno-anticuerpo.
Estudio de inmunoglobulinas con antisueros
2.b.4 Inmunofijación
• Es una variante de la anterior, se utiliza para evaluar las proteínas del mieloma.
Proliferación anómala de CÉLULAS PLASMÁTICAS MALIGNAS que producen
excesivas inmunoglobulinas cuyas cadenas ligeras y pesadas son características.
• El suero problema, dispuesto en 5 carriles se somete a electroforesis. Después cada

carril se recubre con un anticuerpo de animales frente a las cadenas pesadas y ligeras
de las IgM, IgA, IgG, el Ac reconoce el Ag, precipita.
• Teñimos y observamos unas bandas donde haya inmunocomplejos.

Las cadenas ligeras son las proteínas de Bence-Jones características de mieloma
múltiple de bajo peso molecular, excretables por orina.
Proteinuria de Bence-Jones
2.b.5 Contrainmunoelectroforesis
Esta técnica es una DOBLE DIFUSIÓN forzada por una corriente eléctrica.
El anticuerpo y el antígeno están enfrentados y migran hasta encontrarse y precipitar.
También se realiza en un gel de agarosa y es una técnica más rápida que las anteriores.
2.b.6 Electroinmunodifusión o técnica en cohete
Se realiza una INMUNODIFUSIÓN RADIAL forzada por aplicación de corriente eléctrica, lo

que, acorta el tiempo de aparición de los resultados y facilita la lectura de los mismos.
En el gel va disuelto el anticuerpo y por la altura de los “cohetes” podemos cuantificar la
concentración del antígeno.
OTROS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA
3
INMUNOPRECIPITACIÓN
Además de los factores principales que hemos visto que influyen en la

inmunoprecipitación, existen otros que también son importantes:
a. Temperatura
b. pH
c. Concentración de las sales del medio
d. Carga de los I.C
e. Afinidad y avidez
Bibliografía:

UT.6 Técnicas de
fijación del complemento

1. Concepto
2. Tipos de técnicas de fijación del complemento:
a. Técnicas en una etapa
b. Técnicas en dos etapas
c. Muestras y reactivos
CONCEPTO
1 Las técnicas de fijación del complemento están basadas en la capacidad de

unión de la mayoría de los componentes a los complejos Ag-Ac
Estas técnicas permiten evaluar:

§ La actividad del complemento en general
§ La actividad de un componente en particular
§ La concentración de Ag o Ac presentes en el suero problema (están en
desuso pero siguen usando en el diagnóstico de determinadas
infecciones)
2
TIPOS DE REACCIONES
Este tipo de técnicas se basan en la activación del complemento por la

vía clásica, en la que el C1 se une al Ac fijado sobre un Ag.
No todos los Ac son capaces de activar el complemento, y entre los
que sí los son las IgM son las más eficaces
En general, todas las técnicas utilizan una suspensión de hematíes de

carnero, sobre los que actúa el complemento, y al lisarse se produce
una liberación de Hb que se determinará fotométricamente
2.a Técnicas en una etapa
Sirven para cuantificar el nivel total del

complemento de cualquiera de sus factores
Para cuantificar la actividad total à se mezclan

con los eritrocitos de carnero sensibilizados con
diferentes diluciones del suero
El grado de lisis es proporcional a la
cantidad de complemento
Para cuantificar alguno de sus componentes al
suero problema se le añade un exceso de el resto
Normalmente se mide la CH 50 à cantidad de
de los componentes, para que así el componente
complemento necesaria
objeto de estudio sea el factor limitante Para lograr la lisis del 50 % de los eritrocitos
2.b Técnicas en dos etapas
PROCEDIMIENTO:
1.Incubación del suero problema con el antígeno y el complemento.
① Inactivar antes el complemento del suero problema calentándolo a 56 ºC, 30 min.
② Se preparan diluciones crecientes del suero problema inactivado.
③ Se añade una cantidad conocida del suero a una cantidad de antígeno conocida. Si hay anticuerpos
(Ac), se formarán los correspondientes inmunocomplejos.
④ Se añade complemento. En caso de que haya inmunocomplejos, estos fijarán el complemento y lo

agotarán. Hay que utilizar la cantidad exacta de complemento.
2. Añadir un sistema indicador (eritrocitos con hemolisinas en su superficie).
Se añade el «sistema hemolítico», constituido por hematíes de carnero y suero de conejo con
anticuerpos (Ace) contra los eritrocitos de carnero (hemolisina), que forman complejos antígeno-
anticuerpo.
3. Interpretación de los resultados:
§ Lisis de los eritrocitos: negativo. Hay complemento libre que no se fijó en la primera reacción.
Por tanto, que no hay anticuerpos en el suero.
§ No se observa la lisis de los eritrocitos: positivo. El complemento se ha agotado en la
reacción anterior debido a la presencia de anticuerpos específicos en el suero problema. Esos
anticuerpos han provocado la formación de inmunocomplejos y la fijación del complemento
(lo cual hace que no quede complemento libre).
2.c Muestras y reactivos
Muestra:
§ Mejor suero que plasma (debido a los anticoagulantes)
§ No hemolizada
§ Para técnicas de dos etapas à inactivar previamente
§ Para medir el complemento à almacenar a 4ºC durante 2 semanas, a - 20º C para 2 meses
y para más tiempo a – 70º C
Reactivos:
§ Deben prepararse según métodos estandarizados
§ Titularse antes de cada prueba
Bibliografía:

UT.7 Introducción al
inmunoanálisis

1. Introducción
2. Clasificación de los inmunoanálisis:
a. En función de separar fracciones ligada y libre
b. En función de la disponibilidad del reactivo
c. Según el tipo de marcador
3. Radioinmunoanálisis (RIA)
4. Análisis inmunorradiométrico
INTRODUCCIÓN
1 Estas técnicas, como las que hemos visto en unidades anteriores, ponen de
manifiesto la unión entre un Ag y Ac específicos; pero a diferencia de las
anteriores, éstas se consideran primarias o indirectas.
Primarias à porque ponemos de manifiesto la unión Ag-Ac y no cómo esta

unión modifica el medio circundantes
Indirectas à porque no se puede observar el resultado a simple vista, hay

que hacer un revelado en función del marcador que se haya utilizado
2
CLASIFICACIÓN DE LOS INMUNOANÁLISIS
Podemos clasificar los inmunoanálisis en función de :

a. La necesidad de separar los complejos Ag-Ac formados de los
inmunocomponentes libres
b. Si el reactivo que se utiliza es limitante (competitivos) o está en
exceso (no competitivos)
c. Del marcador utilizado: que puede generar una reacción
colorimétrica, ultravioleta, fluorescente, quimioluminiscente,
radiactiva, etc.
2.a Tipos de inmunoanálisis en función de la necesidad de separar fracciones ligada y libre
2.a.1 Ensayos homogéneos
El compuesto marcado presenta un comportamiento diferente, dependiendo de si está

ligado o libreà no requiere separación física
Son muy fáciles de automatizar
Se usan mucho para determinar drogas y hormonas
2.a.1 Ensayos heterogéneos
El compuesto marcado se comporta igual estando ligado o libreà requiere separación

física
Son los más utilizados por su alta sensibilidad y especificidad y amplio espectro de
determinación de moléculas
Requieren más tiempo de análisis.
Los principales métodos son:
§ Adsorción
§ Precipitación química
§ Precipitación inmunológica
§ Fase sólida
2.b Tipos de inmunoanálisis en función de la disponibilidad del reactivo
2.b.1 Ensayos competitivos
Se utiliza una cantidad limitada de Ac (normalmente se quiere valorar un Ag) y el analito compite con
Un Ag por unirse al Ac.
De tal forma que la concentración del Ag que queremos determinar es inversamente proporcional a
la señal emitida
Inmunoensayo competitivo en un solo paso Inmunoensayo competitivo en dos pasos

2.b.1 Ensayos no competitivos
Existe un exceso de Ac ligado a

una fase sólida, al que se une al
Ag.
El Ag de la muestra reacciona con
dos Ac, marcados y no marcados, y
se queda unido a modo de
sandwich.
Este formato proporciona mayor
nivel de sensibilidad y
especificidad
2.c Tipos de inmunoanálisis en función del marcador
2.c.1 Enzimoinmunoensayos
El marcador es una enzima. Para detectarla y

medirla se adiciona un sustrato sensible a
ella; la reacción que se producirá tendrá
efectos detectables y medibles.
Por lo general se eligen enzimas que inducen

cambios de coloración en el sustrato, con lo
que se detecta fácilmente por colorimetría la
presencia de la enzima y, por tanto, del
inmunocomplejo.
2.c.2 Fluoroinmunoensayos
Utilizan la propiedad que tienen ciertas

sustancias de emitir fluorescencia cuando son
excitadas con energía radiante. En este caso, el
marcador consiste en moléculas de un
fluorocromo que convierten la luz absorbida de
alta energía (longitud de onda más corta) en luz
de menor energía (longitud de onda más larga).
Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión
y excitación característico que se puede medir.
2.c.3 Inmunocromatografía
El marcado se realiza con

nanopartículas coloreadas,
generalmente de metales pesados.
Estas técnicas se aplican
mayoritariamente para realizar
diversos test sobre un soporte
sólido, en el que se observarán
líneas coloreadas de precipitación.
2.c.4 Inmunoensayos con luminiscencia
Se define como la emisión de luz, normalmente

en la zona visible o IR cercano a partir de una
reacción química ( si es mediada por una
enzima también se le puede llamar
bioluminiscencia)
En estas reacciones se forma un compuesto
intermediario en estado excitado de alta
energía que vuelve a su estado normal
liberando fotones de luz
2.c.5 Radioinmunoensayos
El marcador utilizado es un isótopo

radiactivo, fundamentalmente 125I,
131I (emisores tipo gamma) , 3H
(emisor tipo beta), 14C.
La forma de introducir los isótopos
radiactivos en los Ag es sustituyendo
algunos átomos por los
correspondientes radiactivos, 3H, 32P,
14C) o introduciendo isótopos ajenos
a la molécula
3
RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)
§ Es un inmunoensayo heterogéneo competitivo

§ Marcador: isótopo radiactivo
§ La molécula marcada (normalmente Ag) se llama trazador ó Ag caliente
§ El Ag presente en la muestra se llama Ag frío
§ La cantidad de Ac es limitada e inferior a la de Ag total
§ La radiactividad total en el tubo permanece constante antes y después de la
reacción por lo que hay que separar la fase ligada de la libre.
De los principales métodos de separación el más usado es el de fase sólida
§ Se puede usar tanto para determinar Ag como Ac
3.1 Instrumentación de medida
Detector Geiger-Muller Detector de centelleo

3.2 Confección de la recta de calibrado
3.3 Variaciones del RIA
RIST para medir IgE totales RAST para medir IgE específica de Ag
4
ANÁLISIS INMUNORRADIOMÉTRICO (IRMA)
§ Se marca el Ac y se evita la pérdida de estabilidad y eficacia

que sufre el Ag Al ser marcado (en una zona alejada del
parátope)
§ Puede ser de dos tipos:
a. IRMA competitivo o de inhibición
b. IRMA no competitivo o tipo sandwich
4.a IRMA competitivo o de inhibición
Para determinar Ac:
4.b IRMA no competitivo o tipo sandwich
Bibliografía:

UT.8 EIA, FIA y CLIA

1. Enzimoinmunoensayos (EIA)
1. EMIT
2. ELISA
2. Fluoroinmunoensayos (FIA)
1. Inmunofluorescencia
2. Fluoroanálisis
3. Fluoroenzimoinmunoensayo
3. Ensayos quimioluminiscentes (CLIA)
1. Quimioenzimoinmunoensayo magnético
2. Electroquimioluminiscencia
EINZIMOINMUNOENSAYOS (EIA)
1 Ensayos cuantitativos (curva patrón)

Usan una enzima como marcador
La enzima actúa sobre un sustrato
El sustrato se transforma en un compuesto coloreado
Para aumentar la sensibilidad: sistema biotina-estreptavidina
1.Inmunoensayos enzimáticos multiplicados

(EMIT) Enzyme multiplied immunoassay technique
2.Análisis de inmunoadsorción ligado a Enzimas

(ELISA) Enzyme-linked immunosorbent assay
Fig. 1 Esquema EIA

1.1 EMIT
Marcador: ENZIMA CONJUGADA con el analito de interés.

Ensayos HOMOGÉNEOS: no requiere la separación de los complejos unidos
Reacción inmunológica COMPETITIVA en medio líquido entre Ag problema y Ag
marcado:
Si el Ag marcado forma inmunocomplejo: enzima inactiva
Si el Ag marcado no se combina: Enzima activa reacciona con sustrato.
Relación DIRECTA
Aplicaciones: Determinación de drogas.
Determinación de proteínas en suero y orina
1. Mezclamos muestra (que contiene el Ag)
[ ]conocida de Ac
sustrato de la enzima.
2. Esperamos a que se formen los

inmunocomplejos.
3.Añadimos el Ag marcado con la enzima en [ ]conocida
4.Medimos la velocidad de aparición de color.
5.Determinamos [ ]de Ag problema mediante comparación con [ ] conocidas

de Ag marcado (patrón).
Fig. 2 Esquema EMIT
1.2 ELISA
Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
Técnica heterogénea.
Uso de Ag o Ac conjugados con una enzima de forma que tenga:
Actividad inmunológica.
Actividad enzimática.
Proceso:
Un componente está marcado con enzima e insolubilización sobre soporte:
Reacción Ag-Ac inmovilizada.
Revelado mediante adición de un sustrato
Color observable tras la acción enzimática.
El soporte debe ser inmunoadsorbente
Fig. 3 Placa de poliestireno

Las enzimas más utilizadas para marcar antígenos o anticuerpos en las reacciones de ELISA son:
Fosfatasa alcalina
Peroxidasa de rábano
β-galactosidasa.
Propiedades de las enzimas que es necesario tener en cuenta son:
El IMPEDIMENTO ESTÉRICO. La enzima se debe unir a un antígeno o a un anticuerpo, y tras

esta conjugación ambas moléculas deben mantener su actividad: el antígeno o el anticuerpo
tienen que ser capaces de formar inmunocomplejos, y la enzima de unirse a su sustrato.
Debido a su tamaño, la β-galactosidasa, causa con frecuencia impedimento estérico.
La RELACIÓN DE CONJUGACIÓN. Cuantas más moléculas de enzimas se puedan conjugar con

cada molécula de anticuerpo, mayor será la intensidad de la señal.
Fig. 4 Comparación de enzimas
Los sustratos cromogénicos (cromógenos) son compuestos incoloros inicialmente que
se colorean de forma evidente después de la reacción enzimática. Para cuantificar la
reacción se mide la variación de densidad óptica que se produce.
Fig. 5 Principales enzimas y sustratos
10
Fig. 6 Placas de ELISA coloreada con OPD
Conceptos básicos de la técnica ELISA.

https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM&t=298s min 6
1
Pasos comunes a las distintas técnicas ELISA:
Tapizado: adsorción de Ag o Ac en el soporte.

Bloqueo: adición de proteína irrelevante.
Evitar fijaciones inespecíficas (BSA).
Conjugación: unión de Ag o Ac con la enzima marcadora. Incubaciones y lavados:
Adición de Ag y/o Ac para la formación de inmunocomplejos.
Eliminación de elementos sobrantes.
1
1.2. 1 ELISA NO COMPETITIVO
1. ELISA directo para detección de Ag

2. ELISA indirecto para detección de Ac
3. ELISA directo sándwich para detección de Ag
4. ELISA indirecto sándwich para detección de Ag
1.2. 2 ELISA COMPETITIVO
1. ELISA competitivo para detección de Ac

2. ELISA competitivo para detección de Ag
3. ELISA de inhibición para detección de Ac
4. ELISA de inhibición para detección de Ag
Ag complicados de detectar
Poca cantidad de Ag
1.2. 1 ELISA NO COMPETITIVO
1. ELISA directo para detección de Ag

2. ELISA indirecto para detección de Ac
3. ELISA directo sándwich para detección de Ag
4. ELISA indirecto sándwich para detección de Ag
1.2.1.1 ELISA no competitivo directo para detección de Ag
Fig. 7 Esquema ELISA directo

1
1.Tapizado con Ag
(muestra problema)
2. Lavado
3.Adición conjugado
(Ac) marcado
4. Incubación y lavado
5. Adición del sustrato
6. incubación
7. Frenado
8. Lectura 1
Fig. 8 Técnica ELISA directo
1.2.1.2 ELISA no competitivo indirecto para detección de Ac
Fig. 9 Esquema ELISA indirecto 1

1.Tapizado con Ag/lavado
2.Adición del suero

(Ac: muestra problema)
3. Lavado g
4.Adición conjugado
(Anti Ac) marcado
7. Incubación
8. Frenado
Fig. 10 Técnica ELISA indirecto 1
9. Lectura
Fig. 11 Resultados ELISA indirecto
1.2.1.3.a ELISA no competitivo sándwich directo para detección de Ag. DAS
DAS: Double Antibody Sandwich Sensible

Específico
Amplificación de la señal
Fig. 12 Esquema ELISA sándwich directo. DAS

2
1. Tapizado con Ac/lavado
2.Adición de la muestra
(Ag: muestra problema)
3. Incubación /lavado
4.Adición conjugado marcado

(Ac contra otro epítopo)
7. Incubación
8. Frenado
9. Fectura
2
Fig. 13 Técnica ELISA sándwich directo. DAS
1.2.1.3.b ELISA no competitivo sándwich directo para detección de Ag. HADAS
HADAS: Heterologous Antiglobulin Double Antibody Sandwich
Fig. 14 Esquema ELISA sándwich directo. HADAS

2
1. Tapizado con Ac/lavado
2.Aadición de la muestra
(Ag: muestra problema)
3.Incubación /lavado
4. Adición Ac
(Ac contra otro epítopo)
6. Adición anti-Ac conjugado

Fig. 15 Técnica ELISA sándwich directo. HADAS 2
9. Incubación/frenado/lectura
La concentración de antígeno
es directamente proporcional
a la concentración de la señal
en los formatos no
competitivos.
Fig. 17 Relación concentración –señal en ensayos no competitivos

1.2. 2 ELISA COMPETITIVO
1. ELISA competitivo para detección de Ac

2. ELISA competitivo para detección de Ag
3. ELISA de inhibición para detección de Ac
4. ELISA de inhibición para detección de Ag
1.2.2.1 ELISA competitivo para detección de Ac
Ac + Ac MARCADO
Fig. 18 Esquema ELISA competitivo para detección de Ac. 2

1. Tapizado con Ag/lavado
2.Adición de la muestra (Ac)

y Ac marcado
5. Incubación
6. Frenado
7. Lectura
Fig. 19 Técnica ELISA competitivo para detección de Ac. 2

1.2.2.2 ELISA competitivo para detección de Ag
Ag + Ag MARCADO
Fig. 20 Esquema ELISA competitivo para detección de Ag. 3

1. Tapizado con Ac
2.Adición de la muestra (Ag)

y Ag marcado
5. Incubación
6. Frenado
7. Lectura
Fig. 21 Técnica ELISA competitivo para detección de Ag. 3

Fig. 22 Relación concentración-señal en ensayos competitivos
1.2.2.3 ELISA competitivo de inhibición para detección de Ac
PRE-incubación
Ac + Ag
Tapizado
Ac
Fig. 23 Técnica ELISA competitivo de inhibición para detección de Ac. 3

1.2.2.4 ELISA competitivo de inhibición para detección de Ag
PRE-incubación
Ag + Ac
Tapizado
Ag
Fig. 24 Técnica ELISA competitivo de inhibición para detección de Ac. 20

La concentración del antígeno
está relacionada inversamente
con la concentración de la señal
obtenida en los formatos
competitivos.
Fig. 25 Relación concentración-señal en ensayos competitivos

FLUOROINMUNOENSAYOS (FIA)
2 Los fluoroinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan como

marcadores sustancias capaces de emitir fluorescencia cuando son
excitadas con energía radiante.
Técnicas:
1. Inmunofluorescencia.
2. Fluoroanálisis
2.2 Fluoroenzimoinmunoensayo.
3
2.1 Inmunofluorescencia. IF
La visualización del complejo antígeno-

anticuerpo no es inmediata.
Para poder observar la unión Ag – Ac

es necesario utilizar sustancias
fluorescentes que se unen a un Ac o a
un Anti-Ac
Los Ag son particulados (tejidos,
bacterias….)
Puede ser directa (IFD) ó indirecta (IFI)
Fig. 26 . De izquierda a derecha esquema de IFD y esquema de IFI

Observación en un microscopio de
fluorescencia:
Lámpara ultravioleta.
Filtros especiales
Excitación del fluorocromo con λ corta (UV)
emisión a λ mayor (visible)
Fig. 27 De izquierda a derecha, imagen de un microscopio de flluorescencia . Portaobjetos y adición del conjugado 3
Fig. 28 Esquema de los componentes de un microscopio de flurescencia
2.1.1 Inmunofluorescencia indirecta IFI
Sirve para detectar Ac (también Ag)

• El suero se aplica sobre el Ag
fijado al porta o placa
• Se incuba y se lava
• Se añade Anti-Ac fluorescente que se
unirá a los Ac unidos a la muestra
• Se leen resultados
Fig. 29 Microfotografía de un preparado obtenido por IFI, de células tumorales de línea Hep-2 expuestas a suero de
un paciente con lupus eritematoso sistémico (anticuerpos primarios) y luego marcado con un anticuerpo secundario
de ratón anti IgG humana. El preparado muestra un patrón de fluorescencia nuclear debido a la presencia de
anticuerpos antinucleares en el suero del paciente y un cierto grado de depósito inespecífico citoplasmático
2.1.2 Inmunofluorescencia directa. IFD
Sirve para detectar Ag

• Se añade el Ac fluorescente sobre el
Ag que ha sido previamente fijado al
porta o placa (la muestra)
• Se leen resultados
Fig. 30 IFD de Yersinia pestis 200x

2.2 Fluoroanálisis
Se basan en la utilización de compuestos fluorescentes para el marcaje de

inmunocomplejos
Existen multitud de técnicas, de tipo homogéneo y heterogéneo
Homogéneas: FPIA (fluoroinmunoanálisis de polarización de fluorescencia)
SLFIA (inmunoanálisis de fluorescencia con le sustrato marcado)

FETI (inmunoanálisis de transferencia de energía de fluorescencia)
Heterogéneas: DELFIA (fluoroinmunoanálisis de disociación aumentada por lantánidos)

Fig. 31 A la derecha detección de la energía que libera la fluoresceína cuando se excita. A la izquierda se muestra cómo se
diferencian las fracciones ligadas y libres debido a la diferente velocidad de rotación que presentan (las moléculas ligadas
que son más grandes rotan más despacio). Esto unido al uso de un filtro de luz polarizada, permite que sólo la fluorescencia
emitida por la fracción ligada sea capaz de llegar al detector, por lo tanto la señal obtenida es inversamente proporcional a
la cantidad de analito presente
2.2.1. FPIA (fluoroinmunoanálisis de polarización de fluorescencia)
Fig. 32 Esquema técnica FPIA

2.2.2 DELFIA (fluoroinmunoanálisis de disociación aumentada por lantánidos)
Sin embargo, los fluoroinmunoensayos de compuestos biológicos estuvieron durante mucho

tiempo limitados por el background o fluorescencia residual producida por la unión no específica
de los compuestos fluorescentes a determinados componentes del ensayo o el equipo, tales como
los propios anticuerpos, plásticos, lentes, espejos...etc. Era evidente pues, que
para que la fluorometría pudiera sustituir el contaje radiactivo, la señal específica tenía que ser
separada de las interferencias de fondo o bien ser ampliada varios órdenes de magnitud.
Una de las alternativas más exitosas para solventar el problema fue el desarrollo de la fluorometría
en tiempo retardado (TRF). En este sistema, la señal se distingue del background residual, por la
resolución temporal, es decir, no es medida inmediatamente después de la excitación del
compuesto fluorescente, se deja pasar un cierto tiempo (400 µseg en el caso del eupropio) que
permite excluir el background de corta duración
Fig. 33 Principio de la fluorometría en tiempo retardado. Las barras negras verticales representan pulsos de excitación
de la sonda fluorescente. Tras el primer pulso se produce un espectro de emisión con largo periodo de caída; también
se puede apreciar que la ventana de contaje queda retrasada con respecto a dicho pulso para evitar así el background.
Fig. 34 Cuadro de componentes y propiedades de la solución intensificadora DELFIA
Fig. 35 Comparación de la sensibilidad de las técnicas ELISA y TRF en determinación de distintos compuestos
biológicos
2.3 Fluoroenzimoinmunoensayos (FEIA)
Producto enzimático fluorescente a partir de especies no fluorescentes con la

participación de una enzima
Detección: Fluorímetro.
Las más importantes son :
1. ELFA
2.Inmuno CAP
2.3.3.MEIA
4
2.3.1 ELISA ligada a fluorescencia (ELFA).
Sándwich con lectura final en fluorescencia

Resultado proporcional a la cantidad de Ag presente.
Detección rápida de Salmonella y Listeria
Fig. 36 Esquema de la técnica ELFA

2.3.2 Inmuno CAP
Matriz plástica recubierta de

alérgenos
Detección de IgE específico contra
proteínas alergénicas
Se hace reaccionar con la IgE del
suero
El AntiAc (conjugado) está unido a
una sustancia que tras añadirle el
sustrato determinado dará lugar a
fluorescencia
Fig. 37 Esquema de la técnica inmunoCAP
Fig. 38 Técnica InmunoCAP
2.3.3 Enzimoinmunoensayo microparticulado (MEIA)
1. Aislamiento de complejos Ag-Ac sobre la superficie de micropartículas.
2. Técnica sándwich no competitiva:

Resultado proporcional a la concentración de analito presente.
3. Aplicación:
Medición de moléculas grandes (marcadores tumorales, etc.).
4. Componentes:
Fase sólida: micropartículas de látex recubiertas de Ac específicos para el analito
Conjugado: Ac específicos de la molécula problema marcados con la enzima
Sustrato.
Fig. 39 Esquema Técnica MEIA
ENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES (CLIA)
3 Los inmunoensayos quimioluminiscentes utilizan sustratos

quimioluminiscentes que emiten luz cuando se da la reacción enzimática.
Más sensibles que las reacciones colorimétricas.
Detección: luminómetro.
MARCADORES: compuestos químicos que emiten luz cuando se oxidan

(peróxidos + catalizadores).
Es decir, deben ser activados con un agente oxidante : Luminol, Éster de
acridino, Lucigenina
Fig. 40 Luminómetro para tubos de ensayo - FB14
Los marcadores quimioluminiscentes emiten luz
cuando se oxidan con peróxidos con ayuda de
catalizadores (peroxidasa, catalasa, etc). Los más
habituales son:
§ Luminol: Necesita un oxidante fuerte,H2O2, y
catalizador (pH 11)
§ Éster de acridino: Necesita H2O2 en pH
alcalino
§ Lucigenina: Necesita H2O2 en pH alcalino e
iones
Fig. 41 Esquema de técnica CLIA
Fig. 42 Aplicaciones de la Quimioluminiscencia en ciencia forense
Fig. 43 Quimioluminiscencia para detectar sangre en ciencia forense
LUMINOL INVESTIGACIÓN CSI
https://www.youtube.com/watch?v=zVFpxOvDTaw
Fig. 44 Quimioluminiscencia en la Naturaleza. De izquierda a derecha: Luciérnaga, floración de algas en Letonia, Medusa
3.1 Quimioinmunoensayo magnético. CMIA
• Detección de FR, PCR y monitorización de fármacos

• Similar a MEIA (sándwich no competitivo)
• La cantidad de luminiscencia medida es proporcional al analito de la muestra
Las diferencias entre MEIA y CMIA son:

CMIA emplea partículas magnéticas (MEIA de látex)
En la etapa de separación se utiliza un imán (MEIA matriz de fibra de vidrio)
El marcador es una sustancia quimioluminiscente (MEIA fosfatasa alcalina)
La lectura se hace con un lector de luminiscencia (MEIA detector de fluorescencia)
3.2 Electroquimioluminiscencia. ECL
Es un proceso por el cual se generan
especies altamente reactivas a partir de
precursores estables en la superficie de
un electrodo.
La emisión de luz se porduce por la
oxudación de un compuesto marcador de
tris (bipiridil) de rutenio en la superficie
de un electrodo, en presencia de
tripropilamida (TPA) para formar especies
de rutenio 2+ excitadas, las cuales
vuelven a su estado basal emitiendo luz
Fig. 45 Esquema de ECL (Electroquimioluminiscencia) Es un CLIA inducido por corriente
eléctrica
Fig. 46 Quimioluminiscencia para revelado de Western blot
Bibliografía:
• Cuéllar. C; A. García-Barrio. 2016. Técnicas de inunodiagnóstico . 1 ed. Altamar
An. vet. (Murcia) 20: 35-47 (2004). Fluorometría en tiempo retardado: generalidades.
Parra, Mª.D., et al
UT.9
Inmunocromatografía y
electrotransferencia

1. Inmunocromatografía
1. Para detección de Ag
2. Para detección de Ac
3. Inmunocromatografía competitiva
2. Electrotransferencia
1. Dot ELISA
2. Western blot
INMUNOCROMATOGRAFÍA
1 La inmunocromatografía, cromatografía de flujo lateral, prueba de un

solo paso o test rápido, es un tipo de inmunoensayo en que se usan
como marcador nanoparticulas coloreadas.
• Son pruebas que se utilizan con frecuencia

• Es una prueba de un solo paso o test RÁPIDO
• Se utilizan NANOPARTÍCULAS que son de metales pesados (ejemplo, oro o
selenio)
• La reacción se utiliza para detectar ANTÍGENOS O ANTICUERPOS en una muestra
problema
• Se hace sobre una tira de NITROCELULOSA
• En esta tira hay 5 zonas diferenciadas:
• Zona de siembra
• Zona del conjugado
• Zona de detección
• Zona de control
• Región absorbente
Fig. 1 Zonas de una tira de inmunocromatografía

1.1 Inmunocromatografía para detección de Ag
Fig. 2 Inmunocromatografía para detección de Ag

1. Se coloca la muestra (con el Ag buscado) en la zona de siembra
2. Dejar que la muestra fluya por capilaridad
• Zona del conjugado (Ac marcado) -----> formación de inmunocomplejos
• Los inmunocomplejos siguen migrando por la nitrocelulosa
• Zona de detección ----> Ac contra otro epítopo del Ag que se está estudiando
• Fijación de los Inmunocomplejos a estos Ac
• Se forma una banda coloreada
• La muestra sigue hasta la zona de control: hay un Ac frente al conjugado que lo captura
dando lugar a una banda coloreada
5. Realizar lectura
• Si se forma una banda en la zona de detección: los Ag están presentes: prueba positiva
• Si en la zona de control se forma una banda: hay un exceso de inmunocomplejos unidos
al conjugado -----> la prueba es correcta
Fig. 3 Ejemplos de innmunocromatografía para detección de Ag
1.2 Inmunocromatografía para detección de Ac
Fig. 4 Esquema de innmunocromatografía para detección de Ac

Fig.5 Resultados de inmunocromatografía para detección de Ac
• Para detección de Ac la técnica es:
• Zona del conjugado -----> está inmovilizado un AG ESPECÍFICO MARCADO

• En la zona de detección esta inmovilizado una ANTI-AC PARA EL AC QUE SE
ESTÁ BUSCANDO ----> Este Anti-Ac captura los inmunocomplejos que se han
formado
• Zona control ------> está un AC PARA EL CONJUGADO QUE CAPTURA EL

EXCESO DE AG
Leishmaniasis Visceral - Diagnóstico por Inmunocromatografía
https://www.youtube.com/watch?v=nU6n-bti5RI
1.3 Inmunocromatografía competitiva
Esta técnica se usa para determinar

Ag de pequeño tamaño y que no
presentan más de un epítopo, con lo
cual no se pueden unir a varios Ac.
Fig.6 Imagen izquierda muestra el resultado positivo de una IC no

competitiva y la imagen de la derecha, el resultado positivo para una
IC competitiva
ELECTROTRANSFERENCIA
2 La electrotransferencia o inmunoblot consiste en detectar proteínas

previamente fijadas en una membrana y posterior revelado con Ac
marcados con una enzima.
a. Puede ser de una muestra compleja à Dot blot

b. Previa separación por electroforesis à Western blot
Es una poderosa herramienta tanto en investigación como en diagnóstico, por ejemplo

para el V.I.H
1
2.a Dot blot
• MUESTRA: mezcla de proteínas

• Puede detectar Ag o Ac.
• Usa membrana de nitrocelulosa
Fig.7 Imagen superior dispositivo para la

transferencia de la muestra a la membrana y en
la imagen inferior resultado de un dot blot
2.a.1 Dot blot ELISA para detección de Ag
• Se fijan Ac en la membrana de
nitrocelulosa.
• Se bloquean uniones inespecíficas (con
proteína irrelevante)
• Se añade la muestra que puede contener
los Ag
• Se añade un segundo Ac marcado
• Si hay Ag en la muestra dará un
producto coloreado al añadir el sustrato
Fig.8 Esquema de Dot blot

El procedimiento es el siguiente:
1. Depositar sobre la membrana una gota del Ac y dejar secar
2. Bloquear la membrana con otra proteína
3. Sumergir la membrana en la muestra problema (Ag). Incubar y lavar

4. Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con enzima. Incubar y lavar
5. Sumergir la membrana en una solución con el sustrato ----- dará lugar a un

producto insoluble y coloreado
6. Recuperar la membrana y hacer la lectura:
• Si había Ag en la muestra: COLORACIÓN
• Si no había Ag en la muestra: COLOR BLANCO DE LA MEMBRANA

Evaluación de un Dot ELISA para la detección de antígeno de Rotavirus
1
AcMo antiRotavirus unidos a la base de una placa
multipocillo comercial
muestra: heces fecales En buffer con PBS pH 8; BSA al 2 % Tween 20

2 0,05 %; NaN3 0,1 %.
Vortex
3 000 r.p.m. ,10 min.
Añadir 250 µl del sobrenadante
conjugado constituido por

3 un anticuerpo monoclonal
marcado
Fig.9 Esquema de Dot blot para detección de Ag de Rotavirus

1 2 3 4 5 6
Fig. 10 Imagen de la izquierda representa un esquema Dot ELISA e imagen de la derecha resultado de la membrana
2.a.2 Dot blot ELISA para detección de Ac
1. Depositar sobre la membrana una gota del Ag y dejar secar
2. Bloquear la membrana con otra proteína irrelevante (albúmina)
3. Sumergir la membrana en la muestra problema (Ac). Incubar y lavar.
4. Sumergir la membrana en una solución de Anti-Ac marcado con enzima. Incubar y

lavar.
5. Sumergir la membrana en una solución con el sustrato ----- dará lugar a un producto
insoluble y coloreado
6. Recuperar la membrana y hacer la lectura:
• Si había Ac en la muestra: COLORACIÓN
• Si no había Ac en la muestra: COLOR BLANCO DE LA MEMBRANA

• Se coloca sobre la membrana de nitrocelulosa una pequeña cantidad de solución
antigénica (diámetro de 1mm).
• Se bloquean uniones inespecíficas (con proteína irrelevante)
• Se añade la muestra con los posibles AC
• Se añade el anti-AC marcado
Fig.11 Esquema de Dot ELISA de afinidad. Un Ag es fijado a la membrana, después de incubarlo con el Ac primario se
forma el inmunocomplejo. La estabilidad de este complejo se valora añadiendo un agente caotrópico (NH4SCN), de tal
forma que los AC con baja afinidad se pierden al hacer el lavado y los que tienen mayor afinidad se mantienen.
Finalmente, los inmunocomplejos que resisten se unen a un Ac secundario marcado con peroxidasa sobre la que se
añade DAB
Fig.12 Titulaciones con Dot blot ELISA
2.b Western blot
Se trata de una técnica que combina:
1. Separación de proteínas
(electroforesis mediante SDS-PAGE.)
2. Transferencia de las proteínas

separadas a una membrana de
nitrocelulosa (soporte).
Inmunorreacción
3. Técnica enzimáticas para

reconocimiento de las proteínas.
Fig.13 Imagen superior dispositivo de PAGE,

imagen inferior gel de electroforesis
Fig.14 Esquema de Western blot
2.b.1 Electroforesis
Separación de las proteínas en función

del peso molecular
Se requieren patrones de comparación

de pesos conocidos.
La muestra se mezcla con SDS (desnaturaliza
las proteínas y las carga negativamente para
que migren al polo positivo
Electroforesis:
Geles PAGE (poliacrilamida):
Gel separador.
Fig.15 Poder de resolución del gel en función de la
Gel de empaquetamiento. concentración de poliacrilamida
• Gel de poliacrilamida:
• Es un gel estable e inerte
• Se pueden hacer varios tamaños de poro
• Resiste el voltaje
• Se puede secar
• Permite teñir y extraer las proteínas
• El gel está compuesto por:
• Separador o gel de resolución – donde ocurre la separación (running/
separating)
• Gel de empaquetamiento o de apilamiento – para que se puedan alinear
todas las proteínas (stacking)
Stacking
Running
Fig. 16 Representación de un gel de poliacrilamida con las zonas de Stacking (superior) y Running (inferior)
Fig. 17 Gel de PAGE
Fig. 18 Esquema del procedimiento PAGE
https://www.youtube.com/watch?v=RNbvJR9JQKQ
Fig. 19 Esquema de PAGE
Fig. 20 Patrones de migración de Tris-Gly para PAGE
2.b.2 Transferencia. Electroblotting
• Las proteínas separadas se transfieren electricamente (o por difusión) a un soporte:

• Nitrocelulosa. Es el más usado
• Nailon
• Son reutilizables
• Dan color en el fondo y reacciones inespecíficas
• PVDF
• Gran capacidad de unión
• Se humedece con dificultad

• La transferencia de proteínas se puede hacer por dos métodos: húmedo y
semiseco.
• El método más utilizado es la transferencia en medio húmedo:

• Se utilizan unas carcasas de plástico donde se coloca el gel y la membrana
• Se protege con capas de papel y esponjas
• Se empapa en tampón de transferencia
• Se introduce la carcasa en la cubeta
• Y se aplica el tampón de transferencia y voltaje

Fig. 21 Dispositivo para electroblotting o electrotransferencia
Una vez hecha la transferencia se tiñe con Rojo Ponceau (para verificar que se he
hecho correctamente)
Fig. 22 Membrana después de electroblotting y tinción con Rojo Ponceau

2.b. Detección por método enzimáticos
• La membrana se incuba con una solución de

bloqueo
• Se añaden los Ac primarios y se deja

incubando entre 3 y 4 horas en agitación
• Se realizan los lavados correspondientes
• Se añaden los Anti-Ac conjugados con enzima

durante el tiempo determinado y en agitación
Fig. 23 Esquema de ELISA sobre membrana

• Sobre la membrana directamente se utilizan sustratos que forman un producto insoluble y coloreado o quimioluminiscencia
• Se emplea un sustrato para el enzima que marca en Anti Ac
• Las enzimas más usadas son:
Peroxidasa de rábano
• Se puede añadir sustrato cromogénico o quimioluminiscente.
• Al añadir el sustrato cromogénico se forma un precipitado marrón o azul (según el que se utilice).
• Hace que las membranas no sean reutilizables (evitable si se usa un sustrato quimioluminiscente y se utiliza
una cámara)
Fosfatasa alcalina
• Sustrato cromogénico
• Sustrato luminiscente
• Otros sistemas utilizados: radiactivos, oro coloidal (Golden blot)

Fig. 24 Esquema de detección de Western blot
https://www.youtube.com/watch?v=HocmMZUieFg
Bibliografía:
An. vet. (Murcia) 20: 35-47 (2004). Fluorometría en tiempo retardado: generalidades.
Parra, Mª.D., et al
UT.10 Citometría de
flujo

1. Fundamento del citómetro de flujo
2. Preparación de la muestras
3. Componentes
1. Sistema de fluidos
2. Sistema óptico
3. Sistema electrónico ó informático
4. Aplicaciones
1. Estudio de poblaciones
2. Cuantificación de moléculas
3. FACS (Cell Sorting)
5. Control de calidad y calibración
INTRODUCCIÓN
1 La CITOMETRÍA DE FLUJO permite:

Separar e identificar las diferentes poblaciones celulares
Conocer su estado de activación y funcionalidad
Midiendo la expresión de diferentes marcadores (de superficie e intracelulares).
La principal aplicación es la caracterización de subpoblaciones de linfocitos, tiene

un alto poder resolutivo y permite analizar grandes cantidades de células en un
modo multiparamétrico.
El único inconveniente es que necesita que las células estén en suspensión
U.Valencia
https://www.youtube.com/watch?v=f1Eiexfqi4w&t=180s
Fig. 1 Equipamiento necesario para la citometría de flujo.
Fig. 2 Parámetros que se pueden medir por citometría de flujo
Fig. 3 Parámetros que se pueden medir por citometría de flujo
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
2 Las muestras usadas en CMF deben ser convertidas en una suspensión

celular.
Estas muestras pueden proceder de: M.O, s.p, exudados y trasudados,
LCR, tejidos sólidos (como ganglios), células procedentes de cultivos
celulares, productos de aféresis.
Las muestras de sangre suelen recogerse con EDTA K3 y las procedentes
de tejidos sólidos con PBS.
Deben procesarse lo antes posible para evitar la pérdida de Ag, si no, se
conservan en PBS a 40 C y en oscuridad
Se pueden preparar a partir de la disgregación de material fresco.
En materiales sólidos, existen diferentes métodos de disgregación métodos mecánicos

o enzimáticos basados en tripsina, proteasas, colagenasas, hialuronidasas o mezclas de
ellas.
Pueden producir alteraciones de las características celulares.
Hay que tener en cuenta estas alteraciones y escoger un método de preparación que no
afecte a la población celular que se estudia.
Las suspensiones deben cumplir unos requisitos:
• Ser representativas del tejido que es objeto de análisis.
• Ser de alta calidad, con pocos agregados y restos, y bajo coeficiente de variación.
• Preservar las características celulares.
• Contener suficiente muestra celular.

Las células en suspensión isotónica, pasan, alineadas y de una en una, por delante de uno o
varios detectores que recogen y miden sus diversas características físicas y/o químicas
mientras son iluminadas por un láser.
• Las mediciones se realizan sobre cada célula, no sobre un promedio de toda la población.
• Algunos modelos permiten separar las diferentes subpoblaciones (p.ej. diferenciación de

poblaciones CD4/CD8).
Hay diferentes métodos de separación y enriquecimiento celular
Los más habituales se basan en el tamaño y densidad celular mediante centrifugación.
Fig. 4 Separación y enriquecimiento de células sanguíneas

Si las células han estado incubadas con anticuerpos específicos marcados
que emiten fluorescencia, se excitarán con el láser y emitirán luz.
Ventajas de la citometría: objetividad, elevada sensibilidad, velocidad de análisis y

posibilidad de realizar análisis multiparamétricos sobre una célula.
Desventajas: coste del instrumento e imposibilidad de visualizar las células analizadas.
https://www.youtube.com/watch?v=LQFQjsDsf4A
También se pueden preparar suspensiones de núcleos para analizar ADN en el
estudio de tumores:
El empleo combinado de la cuantificación de ADN (para determinar aneuplodías) y
el marcaje de diferentes Ag de células tumorales permite la identificación y
recuento de población neoplásica
En tejidos parafinados à método de Hedley (desparafinización + digestión

enzimática + extracción + purificación)
3
COMPONENTES
Los componentes del citómetro de flujo se resumen en:

1. Sistema de fluidos: inyección de la muestras y cámara de flujo
2. Sistema óptico: fuentes de luz, detectores, espejos y filtros
3. Sistema electrónico o informático: amplificador-convertidor analógico/
digital y software de adquisición/anñalisis
Las señales de cada una de las
células son enviadas a un
ordenador.
A partir de estos impulsos se

obtendrán unos gráficos
tridimensionales con la
frecuencia de cada una de las
poblaciones que se están
estudiando
Fig. 5 Sistemas de un citómetro de flujo
3.1 Sistema de fluidos
Conduce la suspensión celular a una velocidad

constante y controlada a través de la cámara de flujo
o zona de detección, donde incide el haz de luz.
Está formado por un capilar por el que pasa un
líquido isotónico que envuelve la suspensión:
Permite la formación de un FLUJO LAMINAR sin
turbulencias.
Las células viajan centradas y una tras otra en el
chorro de inyección
Fig. 6 Imagen superior sistema hidráulico, imagen
inferior comparación de un flujo turbulento con
uno laminar
3.2 Sistema de óptico
Sistema de iluminación
Proporciona el haz de luz que ilumina la muestra, generalmente un LÁSER.
La luz emitida es una mezcla de longitudes de onda.
LONGITUDES DE ONDA MÁS UTILIZADAS (nm):
488, 568, 630 y 647.
EMISORES LÁSER MÁS UTILIZADOS:
De argón con luz monocromática de 488 nm

Señales de dispersión
Fig.7 Señales de dispersión

Tamaño celular (FSC).
• Forward Scatter.
• Difracción (Tamaño).
• Refracción (Estructura externa).
Fig. 8 Forward Scatter (FSC).

Fig. 9 Difracción y refracción
Complejidad celular (SSC)
• Side Scatter.
• Luz dispersada lateralmente.
• Estructura celular interna.
Fig. 10 Side Scatter SSC

Fig.11 Side Scatter SSC
Counts
Forward scatter
Counts
Side scatter
forward scatter
Side scatter
Fig. 12 Señales de dispersión y fluorescencia
Señales de fluorescencia
Fig. 13 Señal de fluorescencia

596 nm Rojo Texas (RT) 615 nm
Fig.14 Longitudes de onda de excitación y emisión de los fluorocromos más utilizados

Fig.15 Longitudes de onda de excitación y emisión de los fluorocromos más utilizados
La distancia entre los puntos
máxima de excitación y emisión se
conoce como variación de Stokes.
Para cada fuente de luz pueden

usarse distintos fluoróforos siempre
que ambos emitan a una λ distinta
y se puedan diferenciar.
Fig. 16 Stokes Shiff

Detectores y filtros
Los detectores pueden ser de 2 tipos:
a. Fotomultiplicadores : para el SSC y la señal

de fluorescencia
b. Fotodetectores (o fotodiodos): para el FSC
Los filtros pueden ser de 2 tipos:
a. Coloreados o de absorción: absorben

ciertas λ y dejan pasar otras
b. Dicroicos: no absorben la luz, reflejan

aquella que tiene una λ inferior o superior a
la que dejan pasar. Se suelen colocar a 450 Fig. 17 Detectores y filtros de un citómetro de flujo
de la fuente de luz
Fig.18 Fotodiodo y fotomultiplicadores
3.3 Sistema de electrónico o informático
Convierte la señal analógica a digital

Amplifican la señal de forma lineal o logarítmica
Permite la adquisición multiparamétrica, el análisis en tiempo real de los datos y el análisis

de las subpoblaciones seleccionadas.
Procesamiento informático de la señal, proporciona la información estadística de los datos

y los representa en forma de HISTOGRAMAS MONOPARAMÉTRICOS, BIPARAMÉTRICOS
ó GRÁFICAS TRIDIMENSIONALES
Los citómetros de flujo analizan las suspensiones celulares a velocidades tan altas como
500-1.000 células/segundo, y el paso de cada célula es contabilizado como un evento
individual.
Todos los parámetros que registra el sistema son integrados mediante un ordenador
que emplea programas específicos de captura y análisis.
Los datos se pueden reflejar de manera tanto numérica como gráfica.
Lectura de linfocitos por citometría

https://www.youtube.com/watch?v=ZagDYAnGv3s
Fig.19 Citómetro conectado a un ordenador. El software que proporciona el fabricante del equipo permite visualizar y
gestionar los datos obtenidos en distintos forma
Fig.20 Representaciones gráficas obtenidas con CMF
Fig. 21 Histogramas y Dot plot (abajo a la derecha)
Fig. 22 Arriba a la izquierda histograma, abajo izquierda contour plot, derecha dot plot
Fig. 23 Células sanguíneas en dot plot SSC/FSC
Fig. 24 Células sanguíneas en dot plot SSC/FSC
Fig. 25 Células en dot plot SSC/FSC
Fig. 26 Arriba izquierda dot plot SSC/CD45 (marcador de leucocitos). Arriba derecha histograma linfocitos CD3 (T).
Abajo izquierda dot plot CD4/CD3. Abajo centro dot plot CD16+56/CD3. Abajo derecha histograma linfocitos CD19 (B)
Fig 27. Gráficos tridimensionales. A) Histograma tridimensional que identifica las poblaciones de linfocitos T cooperadores y
linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de CD4 y CD8; la altura de los picos indica el número de células
registradas. B) Dot plot tridimensional que muestra a las poblaciones de linfocitos B (por exclusión), linfocitos T Cooperadores
y linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de CD3, CD4 y CD8.
Histogramas
Fig. 28 Histograma de fluorescencia
Fig. 29 Izquierda arriba histograma SSC. Izquierda abajo histograma FSC. Histogramas derecha: FL-1 CD3, FL-2
CD16 y FL-3 CD19
Fig.30 Esquema de histograma de fluorescencia
Fig.31 Histogramas de fluorescencia
Dot plot
Se puede mostrar el % que representa cada cuadrante

Fig. 32 Esquema cuadrantes Dot plot
Fig. 33 Interpretación cuadrantes Dot plot
Fig. 34
Fig. 35 Dot plot SSC/FSC de leococitos
Fig. 36 Dot plot CD14/CD15 para discriminar monocitos y neutrófilos
Análisis de datos
Se basa en la obtención de concentración de células o partículas y de los porcentajes de células

fluorescentes y de la media de intensidad de fluorescencia.
Una vez obtenidos los datos, se realizan comparaciones entre las muestras problema y los
controles.
Los experimentos deberán repetirse un mínimo número de veces.
Los datos generados por la mayoría de los citómetros de flujo comerciales se almacenan en el formato
FCS (Flow Cytometry Standard)
El análisis de datos se hace mediante necesario filtrado o gating.
Se seleccionan células que cumplan los criterios de las células que nos interesan y se utilizan filtros
geométricos con los que selecciona la población a estudiar, rectangulares, poligonales o elipsoidales
Selección de la información Gates (puertas) y ventanas (windows)
Gates biparamétricos
Fig. 37 Imagen superior izquierda dot plot SSC/FSC de s.p. Imagen flecha roja gating linfociots. Imagen flecha
azul gating monocitos. Imagen flecha violeta gating granulocitos
Fig.38 Imágenes superiores gating para diferenciar CD4/CD8. Imágenes inferiores para diferenciar linfocitos B/ linfocitos T
Contour plot. Diagrama de contornos. Representación 3D
Fig.39 Imagen izquierda dot plot CD3/CD2 densidad. Imagen derecha contour plot CD3/CD2
Fig.40 Diagramas de colores de densidad dot plot
Fig.41 Dot plot SSC/FSC densidad
4
APLICACIONES
Las aplicaciones son múltiples, entre ellas:

a. Inmunofenotipado
b. Cuantificación de moléculas
c. Separación celular por cell sorting
d. Medida de la apoptosis
e. Medida de la capacidad fagocítica
f. Medida de la viabilidad celular
g. Estudio del ciclo celular
https://www.youtube.com/watch?v=uvh_f0T-4oU
Fig.42 Aplicaciones de CMF
4.a Inmunofenotipado
• Estudio de leucemias y linfomas
Fig.43 Marcadores celulares en LLA de células B y T
https://www.labclinics.com/pasos-exito-citometria-flujo-intracelular/#seccion1
Fig.44 Ag de superficie de células B en los diferentes estados de maduración
Fig. 45
Fig. 46 Detalle distribución de subpoblaciones linfocitarias
Fenotipado de leucemias y linfomas
Fig.47 Marcadores de membrana en SLP de tipo B (arriba) y de tipo T (abajo)
Fig.48 Célula plasmática productora de AC
Fig.49 Imagen de mieloma múltiple con producción de Is monoclonales
Fenotipado de otras células
Fig. 50 Caracterización de células troncales mesenquimales (MSC)
4.b Cuantificación de moléculas
Fig. 51 Microesferas para cuantificación de proteínas por CMF
Fig. 52 Cuantificación de Ac con microesferas
4.c Cell sorting
Algunos modelos tienen la capacidad de separar

células mediante la técnica denominada FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorter)
El FACS (separador de células activado por

fluorescencia), permite separar las células
mediante la aplicación de carga eléctrica
momentánea.
Fig. 53 Imagen superior dispositivo de FACS en un
citómetro de flujo. Imagen inferior representación del
sistema
Existe una gran separación entre células en relación con su diámetro
•Un mecanismo de vibración ultrasónico provoca que la corriente de líquido conteniendo las células
se rompa en pequeñas gotitas.
•El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que más de una célula quede
contenida en cada gota justo antes de que la corriente se rompa en gotitas, el flujo pasa a través de
una estación de medición de fluorescencia, donde se mide el carácter fluorescente de interés de
cada célula
•Según la medición de la intensidad de fluorescencia recogida para cada célula, el sistema
proporciona una determinada carga eléctrica, como consecuencia las gotitas se cargan
eléctricamente
•Las gotitas cargadas caen a través de un sistema que desvía las gotas en los contenedores
dependiendo de su carga.
Fig. 54 Esquema de FACS
Fig. 55 Esquema de FACS
MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO SE PUEDEN ANALIZAR:
• A escala supracelular: organismos pluricelulares, esferoides e hibridomas.
• A escala celular: protoplastos vegetales, células animales, levaduras y bacterias.
• A escala subcelular: viriones, liposomas, cromosomas, orgánulos y núcleos.
• A escala molecular: proteínas, ácidos nucleicos e inmunocomplejos.

5
CONTROL DE CALIDAD Y CALIBRACIÓN
5.1 Control de calidad diario
5.2 Verificación de la alineación de cada láser respecto a la celda de flujo
5.3 Mantenimiento preventivo
5.4 Preparación de un ensayo
Se preparan:
§ Tubo con todos los fluorocromos juntos
§ Tubos con los fluorocromos por separado
§ Control negativo: células sin marcar, para eliminar la posible autofluorescencia de las
las células
§ Control positivo:para validar los resultados negativos
§ Control isotipo: Ac que sean como los que utilizamos en el ensayo pero que reconozca
alguna molécula o célula que no hay en la muestra à debe dar negativo
Una vez comprobada la especificidad del Ac conjugado debemos TITULARLO para decidir
la concentración más adecuada para el ensayo
Bibliografía:

UT.11 Otras técnicas de

separación celular

1. Introducción
2. Técnicas físicas
1. Gradiente de Ficoll
2. Rosetas - E
3. Basados en la adherencia
3. Técnicas inmunológicas
1. Pannig para linfocitos
2. Inmunomagnéticas
3. Microesferas no magnéticas
4. Inmunotoxicidad
INTRODUCCIÓN
1 Es necesario analizar las principales propiedades de las células implicadas

(tamaño, densidad, comportamiento, cambios superficiales, estimulación
frente a antígenos, etc.), para establecer cuál de ellas será útil para aplicarla
como criterio de separación.
TÉCNICAS FÍSICAS
2
2.1 Gradiente de densidad. Ficoll
Permite obtener preparaciones de

PBMN (peripheral blood mononuclear
cells)
Esta técnica separa los leucocitos

mononucleares, incluyendo tanto
LINFOCITOS como MONOCITOS.
Fig 1. Sangre periférica antes y después de

centrifugar en un tubo con ficoll
Ficoll 400. Polímero sintético de sacarosa de densidad mayor que la de los linfocitos pero
menor que la de los eritrocitos y granulocitos; además, provoca la aglutinación de los
eritrocitos.
Diatrizoato de sodio. Provee la densidad óptima para la separación de las células y la

osmolaridad necesaria para mantener su viabilidad.
7
Fundamento de la separación
Los granulocitos, más densos que el medio de separación,

pasan a través de él y quedan depositados en el fondo del
tubo.
Los eritrocitos se aglutinan en contacto con el Ficoll, y los

aglutinados se depositen en el fondo del tubo.
Las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se quedan

en la interfase entre el plasma y el medio de separación,
debido a que tienen una densidad menor.
Fig 2. Esquema de gradiente de densidad con Ficoll

Tras la centrifugación se observan varias fases en el tubo
8
Protocolo
1. Poner Ficoll-Paque a temperatura ambiente.
2. Invertir Ficoll-Paque PLUS varias veces.
3. Diluir la sangre 1:1 en PBS, cerrar la botella y mezclar

invirtiéndola con cuidado.
4. Poner 15 mL de Ficoll-Paque en cada uno de los

tubos cónicos de 50 mL
5. Cubrir el Ficoll-Paque con la mezcla de sangre/PBS

usando una pipeta serológica a la velocidad más baja.
6. Centrifugar la muestra en el rotor basculante que

desee a 400 x g y 20 °C durante 30 min, seleccionando
tasas de aceleración/ deceleración de 9/0 o 9/3*,
Fig 3. Dispensación de sangre periférica en
respectivamente, en el ajuste «at set rpm» un tubo con ficoll
9
Consejos
CONSEJO: Para evitar comprometer la pureza de las PBMC, hay

que evitar por todos los medios mezclar el Ficoll-Paque y la sangre.
Por eso es mejor sujetar el tubo en ángulo y para conseguir un buen
recubrimiento, la mezcla de sangre debe salir de la pipeta
.
lentamente y tocándola pared del tubo.
CONSEJO: Los frenos del rotor tienen que estar totalmente

desactivados para evitar, eficazmente, la mezcla de fases. También
es muy importante cumplir estrictamente las temperaturas
especificadas porque las diferencias de temperatura cambiarán las
tasas de densidad de los líquidos y podrán tener un impacto
negativo en los resultados de la separación. Fig 4. Esquema de separación de PBMC
con ficoll
El colorante vital azul tripán se utiliza para cuantificar la viabilidad de las células, diluido
en PBS.
Fig 5. Estudio de viabilidad celular con azul tripán

2.2 Rosetas espontáneas
La molécula CD2 de la superficie de los

linfocitos T viables, ó SRBC se une a los
eritrocitos de carnero formando
agrupaciones llamadas rosetas.
Una tinción permite observar las rosetas y

contar los linfocitos viables.
Fig 6. Esquema de formación de rosetas en L.T

Fig 7. A la izquierda microfotografía (al fresco) de una roseta E formada por un L.T humano. A la derecha una
roseta fijada y teñida
13
Fig 8. Imágenes de rosetas E

2.3 Métodos basados en la adherencia
Fig 9. Enriquecimiento de LT por no adherencia al nylon
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
3
3.1 Panning para linfocitos
Método de separación sencillo, desarrollado para el
fraccionamiento de linfocitos T y B.
Se utilizan placas de plástico tapizadas con anticuerpos específicos

que se unen selectivamente a los linfocitos T.
Para separar poblaciones de linfocitos será necesaria la utilización

de placas sensibilizadas con anticuerpos específicos de los
marcadores de superficie de las subpoblaciones que se quiere
Fig 10. Panning para linfocitos
separar (por ejemplo, anti-CD4 y anti-CD8).
Las células de interés se unirán a los Ac y el resto serán eliminadas

por lavados
Fig 11. Panning para linfocitos
3.2 Técnicas inmunomagnéticas
LA TÉCNICA PERMITE:
Selección positiva: la población deseada es

marcada magnéticamente y aislada en la
fracción celular retenida.
Selección negativa: eliminación de las células no

deseadas mediante marcado magnético y
elución de la fracción que contiene la población
deseada no marcada.
Además, la técnica admite la separación manual

Fig 11 Sistema de separación magnética
o automatizada.
Magnetic Separation using Dynabeads®
https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg
Fig 12 A la derecha esquema de la separación magnética. A la izquierda kit de separación

3.3 Técnicas con microesferas no magnéticas
3.4 Técnicas de inmunotoxicidad
Fig 13. Esquema de eliminación celular utilizando el complemento
Bibliografía:
• Apuntes de Inmaculada García Ruiz

UT.12 Estudio de la
funcionalidad celular

1. Introducción
2. Estudio de linfocitos T
1. Pruebas de proliferación celular
2. Determinación de citoquinas (CD4+)
3. Ensayos de citotoxicidad (CD8+ y NK)
3. Estudio de linfocitos B
4. Estudio de macrófagos y neutrófilos
1. Test de actividad fagocítica
2. Capacidad bactericida
3. Prueba de NBT
4. Estudio de quimiotaxis
5. Estudio del complemento
1. CH50
2. Técnica de hemólisis en gel de agarosa
INTRODUCCIÓN
1 El estado inmunitario de un individuo no viene determinado únicamente

por el número de sus componentes, si no por su capacidad funcional. Por
eso, es necesario evaluar estas capacidades, sobre todo en determinadas
situaciones en las que las las manifestaciones clínicas y los recuentos
celulares y moleculares no sean concordantes.
Las técnicas empleadas son complicadas y los resultados obtenidos in vitro,

en algunos casos, no pueden asegurar que la respuesta in vivo sea la misma
ESTUDIO DE LINFOCITOS T
2 En este tipo de pruebas vamos a evaluar cómo responden estos linfocitos

cuando son expuestos a sustancias químicas o antigénicas que
normalmente activan el sistema inmunitario
1. Pruebas de proliferación celular
2. Determinación de producción de citoquinas (TCD4+)
3. Ensayos de citotoxicidad (TCD8+ y NK)
2.1 Pruebas de proliferación celular
Se basan en estimular los linfocitos con un determinado Ag y valorar activación y

proliferación.
Hay 3 tipos de ensayos fundamentales:

a. Ensayo de proliferación o estimulación blástica
b. Reacción linfocitaria mixta
c. Ensayos de proliferación con citometría de flujo
2.1.a Ensayo de proliferación o estimulación linfoblástica
Se realiza sobre linfocitos aislados con ficoll

Se emplea con 2 fines: evaluar la respuesta
celular y diagnosticar una exposición previa a
un m.o intracelular, por infección o por
vacunación.
Se basa en la capacidad que tienen los
linfocitos de responder de forma específica
frente a un Ag que ha inducido linfocitos de
memoria, o de forma inespecífica frente a
Fig. 1 Ensayo de proliferación linfoblástica
lectinas de origen vegetal como la PHA o la
concanavalina A
1. Separar los linfocitos por centrifugación con medio Ficoll
2. Lavar varias veces con medio de cultivo celular.
3. Ajustar a una concentración del orden de 5 · 106 células/ml.
4. Dispersar en placas de microtitulación de 96 pocillos.
5.Incorporar la solución de antígeno problema (excepto a los
controles).
6. Incubar durante 72 h a 37 °C.
7. Añadir timidina tritiada e incubar durante al menos 16 h. Fig. 2 Ensayo de proliferación linfoblástica
8. Poner las células en contacto con un líquido de centelleo.
9. Establecer la tasa de proliferación comparando la radioactividad de las

células estimuladas y la de las células control.
Comparando las reacciones linfoproliferativas in vitro de células cultivadas en el
propio suero del paciente y una mezcla de sueros normales se puede establecer el
motivo de una alteración linfocitaria (intrínsecamente celular o debido a factores
séricos extrínsecos)
2.1.b Reacción linfocitaria mixta
Se basa en que los linfocitos proliferan

cuando se incuban en presencia de otras
células con Ag MHC II diferentes.
Se emplea para determinar la

histocompatibilidad en trasplantes.
La técnica es similar a la que hemos visto en
el punto 2.1.a
Fig. 3 Ensayo de reacción mixta linfocitaria

2.1. Ensayo de proliferación con citometría de flujo
En este tipo de estudio se valora el

descenso de CFSE (diacetato de
carboxifluoresceína éster succinimidil) a
lo largo de las divisiones que sufre una
célula, puesto que se une a moléculas
intracelulares de larga vida cuya
concentración en las células va
disminuyendo en el reparto mitótico
Fig. 4 Esquema fundamento de CFSE

Fig. 5 A la izquierda resultado de un histograma CFSE. A la derecha dot plot CD4/ CFSE
2.2 Determinación de producción de citoquinas (TCD4+)
La producción de citoquinas evidencia

la funcionalidad de los LTh, e incluso
puede identificar la subpoblación de
cada uno
Se pueden estudiar analizándolas en el
sobrenadante de un cultivo de
linfocitos estimulados antigénicamente,
o cuantificar células individualmente
que están secretando una determinada
citoquina Fig. 6 Perfiles de Th y citoquinas
2.2.a Prueba del interferón γ (IFN γ)
Es un ensayo de valoración de esta

citoquina producida por Th1 tras su
estimulación con el Ag (sólo se
estimulan los linfocitos con contacto
previo con el mismo Ag).
Es un ELISA tipo sándwich
Fig. 7 Esquema del ensayo de liberación de citoquinas

1. Tapizar las placas con anticuerpo monoclonal producido frente a la citoquina que se va a determinar
(primer anticuerpo).
2. Añadir la muestra problema, incubar y realizar los lavados.
3. Añadir otro anticuerpo monoclonal anti-citoquina, marcado con biotina (segundo anticuerpo),
incubar y realizar los lavados correspondientes.
4. Añadir el conjugado (estreptavidina-peroxidasa), incubar a temperatura ambiente durante 1 h y

realizar los lavados correspondientes.
5. Añadir el sustrato
6. Cuantificar el color en un lector de placas de ELISA

2.2.b ELISPOT (ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos)
Este estudio es similar al anterior, aunque más

sensible que el ELISA (200 veces).
La liberación de la citoquina de estudio puede
mapearse en una célula individual y puede
calcularse la proporción de células T que
responden con la producción de esa citoquina
Es una técnica cualitativa y cuantitativa
Fig. 8 Resultado ELISPOT

16
Fig. 9 Esquema técnica de ELISPOT

Fig. 10 Esquema ELISPOT
Fig. 11 Respuesta de IFN-γ en diabetes tipo 1 tras administración de proinsulina
2.2.c Determinación de citoquinas intracelulares por CMF
Permite determinar el perfil de citoquinas

producidas por un determinado tipo de Th,
mediante CMF intracelular, utilizando tampones
permeabilizantes.
Para Th1 se determina IL-2 e IFN γ (respuesta
celular)
Para Tfh se determina IL-4 e IL-10(respuesta
humoral)
Para Treg se determina FoxP3 y CD-25 en la
membrana Fig. 12 Dot plot IL-2/CD3
Fig. 13 Dot plot densidad de citoquinas/CD4
2.3 Ensayos de citotoxicidad celular (TCD8+ y NK)
Se basa en la capacidad que tienen los LT de destruir un

determinado número de células diana (con el complejo
péptido-MHC I) al ponerlas en contacto. Permite
detectar CD8+ específicos de Ag
Existen varios métodos, el que de momento tiene más

sensibilidad y reproductibilidad es el de la liberación de
Cr 51.
También está tomando relevancia la determinación de la
impedancia, del cuál os cuelgo un enlace de vídeo más
Fig. 14 Ensayo de citotoxicidad celular Cr51
adelante
Las células diana que expresan el Ag en su MHC I se marcan
con Cr51
Se ponen en contacto con con una proporción adecuada de

células efectoras, separadas previamente por ficoll.
Se incuban un tiempo determinado
Se centrifugan y se toma el sobrenadante (donde estará el Cr

liberado por las células destruidas
Se mide la radiación en un contador de partículas gamma,

Fig. 15 Ensayo Cr 51 siendo la relación de la señal y la capacidad citotóxica
directamente proporcionales
Ensayo de Cr51 https://
www.jove.com/v/10505?
language=Spanish
Ensayo de impedancia
Fig. 16 Relación radiactividad / % lisis obtenida en el
ensayo de Cr51
https://www.jove.com/v/3683/determining-
optimal-cytotoxic-activity-human-her2neu-
specific-cd8-t
ESTUDIO DE LINFOCITOS B
3 Podemos determinar la capacidad funcional de los linfocitos B de varias

formas:
1. Determinación de su capacidad para dividirse (mitosis): como ya

hemos visto en el punto 2
2. Determinación de la producción de anticuerpos:
Cuantificación de IgG, IgM e IgA.
Medición de subclases de inmunoglobulinas.

3.2 Determinación de la producción de Ac
1. Un método utilizado para la

cuantificación sérica de IgG, IgM e IgA
es la inmunodifusión radial y la
turbidimetría
2. Para la cuantificación de un tipo de Ac

específico se utiliza el ELISA
2
Fig. 17 IDR de IgG, IgA e IgM
5
26
ESTUDIO DE MACRÓFAGOS Y NEUTRÓFILOS
4 La metodología de estudio de ambos tipos de células es la misma puesto

ejercen el mismo mecanismo de defensa, la fagocitosis.
Los métodos para evaluar la capacidad fagocítica que vamos a estudiar

son:
1. Test de actividad fagocítica
2. Capacidad bactericida
3. Prueba de de reducción del NBT (Nitroblue tetrazolium)
4. Respuesta quimiotáctica
27
4.1 Test de actividad fagocítica
Se incuba una porción de leucocitos de sangre periférica con una

suspensión de partículas inertes o microorganismos para permitir
la fagocitosis.
La fagocitosis se cuantifica mediante la observación de las células

teñidas. Los resultados se expresan como índice fagocítico
(número de bacterias ingeridas/100 PMN)
Inconveniente: no permite distinguir entre fagocitosis y moléculas
adheridas a la superficie.
También se puede evaluar mediante citometría de flujo marcando
la bacteria con un colorante fluorescente. Fig. 18 Esquema de inclusión del m.o

en la fagocitosis
28
4.2 Test de capacidad bactericida
Se incuba una suspensión de leucocitos con

bacterias en rotación continua a 370 C
Se toman alícuotas para el recuento de colonias
por dilución en una placa a los 30, 60 y 120 min.
Los resultados se expresan como un índice

bactericida ó
no de bacterias vivas a 120´/ no bacterias vivas a Fig. 19 Estudio de la capacidad bactericida
30´
Esta prueba y la anterior se complementan

4.3 Prueba de NBT
Esta prueba también se llama Estallido

respiratorio.
El estallido respiratorio es el proceso por el
que algunas células son capaces de
producir y liberar especias reactivas del O 2
como radicales libres, anión superóxido y
. peróxido.
Se caracteriza por un aumento muy violento
de la demanda de O 2 y el consumo de
energía a nivel celular
Fig. 20 Esquema del mecanismo de destrucción dependiente de O2 ó
estallido respiratorio
30
Técnica NBT
El NBT es un compuesto químico soluble de color

amarillo en estado oxidado.
El estado reducido del NBT se llama formazán, que
es insoluble en agua y de color azul muy oscuro casi
negro.
Así, las células que son capaces de producir el
estallido repiratorio también son capaces de reducir
el NBT
Las células se exponen a NBT y a un estimulante de
la fagocitosis, PMA (acetato miristato de forbol).
Posteriormente se observan al microscopio y se hace
el % de las células fagociticas que se han coloreado. Fig. 21 Imagen superior resultado
negativo. Imagen inferior resultado
Los valores normales son > 85% positivo
Fig.22 Imagen izquierda pertenece a un paciente normal. Imagen derecha a un paciente con
E.G.C (enfermedad granulomatosa crónica
32
4.4 Respuesta quimiotáctica
Evalúan la capacidad de locomoción de los

fagocitos atraídos por un estímulo.
Se utilizan dos cámaras aisladas separadas por

un filtro (cámara de Boyden): en la cámara
interior se colocan las células fagocíticas y en la
exterior, un agente quimiotáctico.
Los fagocitos intentan desplazarse hasta el

agente quimiotáctico y se quedan enganchados
en la membrana.
Posteriormente, esta se tiñe y se observa al

microscopio.
Fig. 23 Ensayo de quimiotaxis
33
ESTUDIO DEL COMPLEMENTO
5 Para el estudio del complemento se requiere que la muestra sea suero y se debe almacenar
a -80 0C, porque el complemento es termolábil y con el calor disminuye su actividad
Para iniciar el estudio, se analizan el C3 y el C4 a modo de cribado, por IDR ó

inmunonefelometría)
En las inmunodeficiencias la actividad suele ser < 5%, y hay que realizar un estudio
individualizado del componente que se sospecha afectado.
Los ensayos más utilizados son:
1. CH50
2. Técnica de hemólisis en gel de agarosa
5.1 CH50
Al mezclar suero con eritrocitos sensibilizados con

anticuerpos, el complemento se activa lisando los
eritrocitos.
Se realiza una curva patrón con cantidades crecientes
de suero problema (cantidades crecientes de
complemento).
Se calcula el volumen de suero para lisar el 50 % de los
eritrocitos.
El estudio de los componentes de la vía alternativa
suelen hacerse con eritrocitos de conejo que son
Fig. 24 Eritrocitos sensibilizados para CH50
potentes activadores de los mismos
Fig. 25 La hemólisis causada por cantidades crecientes de complemento tiene un comportamiento
sigmoidal (gráfico A). El gráfico B muestra una transformación logarítmica que permite una
interpolación más adecuada del valor del 50 % de hemólisis
5.2 Técnica de hemólisis en gel de agarosa
Es una variación del CH5o

Los eritrocitos sensibilizados se encuentran en un gel de
agarosa.
En la placa se taladran pocillos donde se añade el suero
Se observa la hemólisis en los pocillos y se mide el halo
generado.
El diámetro del halo será proporcional a la cantidad de
suero presente en la muestra
Fig. 26 Hemólisis en gel de agarosa
Bibliografía:

UT.13
Inmunodeficiencias

1. Introducción
2. Inmunodeficiencias primarias (IDP)

1. Deficiencias de linfocitos T
2. Deficiencias de linfocitos B
3. Deficiencias combinadas de linfocitos B y T
4. Deficiencias de células fagocíticas
5. Deficiencias del complemento
3. Inmunodeficiencias secundarias
4. Diagnóstico de las inmunodeficiencias

INTRODUCCIÓN
1 Son un conjunto de enfermedades ocasionadas por algún defecto a nivel

de la inmunidad específica o de la inmunidad innata, que se caracteriza por
un aumento de la susceptibilidad al padecimiento de infecciones graves y
recurrentes en los pacientes que las sufren.
La naturaleza de las infecciones depende del componente del sistema

inmunitario que esté afectado (los defectos en la inmunidad humoral se
asocian a infecciones ocasionadas por bacterias piógenas y los defectos en
la inmunidad celular suelen ocasionar infecciones por virus y otros m.o
intracelulares)
Señales de alerta
Fig. 1 Tabla de señales de alerta (parte 1)

Fig.2 Tabla de señales de alerta (parte 2)
INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (IDP)
2 Son trastornos causados por defectos genéticos, que en la mayoría de los casos se
heredan de forma autosómica recesiva
Se conocen más de 200 enfermedades genéticas, con una incidencia global de 1 de

cada 10.000 recién nacidos vivos.
Las manifestaciones clínicas se inician durante la primera infancia.
La mayor parte de estas enfermedades confiere más susceptibilidad a infecciones
La importancia del diagnóstico precoz en las IDPs viene determinada porque un

retraso en el mismo puede comprometer el tratamiento definitivo y dar lugar a
secuelas graves e irreversibles, e incluso desembocar en la muerte del niño
Fig.3 Clasificación de las IDPs
Las IDP afectan a diferentes órganos y
sistemas, de manera que en un niño con
infecciones frecuentes, aumenta la
posibilidad de que padezca una IDP si
existen manifestaciones sistémicas no
relacionadas con la infección.
Un ejemplo ilustrativo es el síndrome de

DiGeorge, en el que existen, además de
una inmunodeficiencia celular de grado
variable, hipoparatiroidismo con
Fig. 4 Alteraciones en el paladar características del
hipocalcemia, cardiopatía, anomalías síndrome de DiGeorge
faciales y alteraciones autoinmunes.
2.1 Deficiencias en los linfocitos T
2.1.a Síndrome de DiGeorge
Es un trastorno en el que se produce un defecto en la

embriogénesis que afecta al timo, a la paratiroides, al
arco aórtico y a porciones de los labios y las orejas.
Los enfermos presentan rasgos faciales anómalos,
malformaciones congénitas del corazón, hipocalcemia
e hipoplasia o aplasia tímica.
Pero sólo un 20% presenta una alteración en el

número o función de los LT, porque algún tejido
Fig. 5 Alteración cromosómica del síndrome de
extratímico asume la función de maduración de los LT DiGeorge
Fig. 6 Glándula paratiroides y funciones
2.1.b Síndrome de Wiskott Aldrich
Es un trastorno hereditario recesivo ligado al

cromosoma X.
Se caracteriza por trombopenia, eczema y
susceptibilidad al padecimiento de infecciones por
bacterias piógenas y oportunistas.
El producto del gen alterado, es una proteína
denominada WASP que está implicada en la
regulación de la función linfocitaria y plaquetaria. La
respuesta proliferativa de los LT está muy disminuida o
ausente, hay un descenso en la producción de Ig sobre
Fig. 8 Alteración cromosómica del síndrome de
todo frente a Ag tipo polisacárido, y las IgE pueden Wiskott- Aldrich
estar aumentadas
Fig. 7 Mutaciones en el gen WAS (Xp11.21 p11.4), que codifica para la proteína del
síndrome de Wiskott-Aldrich, expresada exclusivamente en células hematopoyéticas
2.1.c Síndrome de hiper IgM ligada al sexo
El Síndrome de Hiper-IgM (SHIM) es una
inmunodeficiencia primaria congénita poco frecuente,
caracterizada por infecciones recurrentes y niveles
plasmáticos normales o aumentados de
inmunoglobulina M (IgM) y niveles disminuidos de IgG,
IgA e IgE1.
Esta enfermedad se hereda típicamente como un
rasgo genético recesivo ligado al cromosoma X
(XSHIM). La causa es un defecto molecular en el gen
que codifica para el ligando del CD40 (CD40L),
molécula presente normalmente en los linfocitos T
Fig. 9 Esquema de la interacción entre los LT Y LB. Los LT activados, imprescindible para la diferenciación y
activados interactúan a través del CD40L induciendo la
cambio de isotipo de inmunoglobulinas (Igs) en los
priliferación, diferenciación y cambio de clase de Ig (switch
linfocitos B2.
Las manifestaciones clínicas del SHIM se inician
generalmente durante el primer o segundo año de
vida. Es frecuente observar infecciones recurrentes de
las vías respiratorias altas y bajas de etiología
mayoritariamente bacteriana, aunque existe cierta
predisposición a presentar neumonías por
Pneumocystis carinii.
Otras características clínicas de estos individuos son la
presencia de fenómenos autoinmunes, neutropenia,
diarrea crónica, hepatoesplenomegalia y
predisposición al desarrollo de neoplasias de estirpe
Fig. 10 Determinación de CD40L de un control y un paciente linfoide (leucemias y linfomas)
tras estimular los LT con forbol miristato acetato (PMA) e
ionomicina
2.2 Deficiencias en los linfocitos B
2.2.a Agammaglobulinemia de Bruton

La agammaglobulinemia ligada al cromosoma X es un
trastorno de inmunodeficiencia primaria que implica
deficiencias de la inmunidad humoral. Se debe a
mutaciones en un gen situado en el cromosoma X que
codifica la tirosina cinasa de Bruton (BTK). La BTK es
esencial para el desarrollo y la maduración del linfocito
B; sin ella, la maduración se detiene antes del estadio
de célula B lo cual da como resultado células B no
maduras y por ende sin anticuerpos.
Fig. 11 Alteración cromosómica de la enfermedad de

Bruton
Como resultado de ello, los lactantes varones
tienen amígdalas muy pequeñas y no presentan
ganglios linfáticos; tienen infecciones piógenas
recidivantes de pulmón, senos y piel con bacterias
encapsuladas (p. ej., Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae). Los pacientes son
también susceptibles a infecciones persistentes
del sistema nervioso central por la vacuna viva
oral de la poliomielitis y los virus echo y coxsackie;
Fig. 12 CMF para el estudio de LB

2.2.c Deficiencia selectiva de la IgA
Fig. 13 Deficiencia selectiva de IgA

La deficiencia selectiva de inmunoglobulina A (IgA) es la inmunodeficiencia primaria más común. Se
conoce muy poco sobre los mecanismos etiopatogénicos que conducen a esta enfermedad. Se estima
que la incidencia de la enfermedad en España es de 1:163.
La mayoría de las personas con déficit selectivo de IgA suelen estar asintomáticas y se diagnostican
por casualidad; sin embargo, deberíamos tener presentes a los pacientes con infecciones de vías
respiratorias recurrentes, gastrointestinales, alérgicas y enfermedades autoinmunes que pueden estar
asociadas a esta afección. A pesar de que no existe tratamiento en el momento actual, su importancia
radica en las asociaciones con diferentes enfermedades como la enfermedad celíaca o púrpura
trombocitopénica idiopática.
Por otra parte, es importante conocer el riesgo de anafilaxia tras realizar transfusiones y su posible
progresión a una inmunodeficiencia común variable. Es importante conocer la correcta vacunación en
esta enfermedad.
Las infecciones recurrentes del tracto respiratorio son el hallazgo más común en personas con
deficiencia de IgA. Estas infecciones se deben principalmente a bacterias, por ejemplo,
Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. Se ha visto que algunos pacientes
pueden desarrollar daño orgánico final, como bronquiectasias secundarias a infecciones
recurrentes o crónicas.
https://www.elsevier.es/es-revista-medicina-familia-semergen-40-articulo-importancia-del-deficit-
selectivo-inmunoglobulina-S1138359313000245
2.3 Deficiencia combinada de linfocitos T y B
Los tipos de IDCS típica más comunes son: IDCS ligada al cromosoma X, IDCS por deficiencia de
adenosina desaminasa (ADA), IDCS por deficiencia completa de RAG-1 o RAG-2 e IDCS por
mutación del gen IL7RA.
Existe una:
○ Disminución de células T
○ Disminución de NK
○ Presencia de LB no funcionales
○ Defectos en los receptores de IL-2, IL4, IL7, IL9 e IL 15
https://primaryimmune.org/es/scid-compass/tipos-de-idcg
2.3.a IDCS ligada al sexo
Es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X

que conduce a una mutación del receptor de
IL-2; debido a ello los progenitores linfoides no
pueden ser estimulados para su normal
desarrollo y diferenciación
Fig. 14 Esquema del receptor de IL-2

La IDCG-X1 se manifiesta durante los primeros meses de vida con infecciones virales,
bacterianas o fúngicas graves y que a menudo amenazan la vida (p.e. Pneumocystis jiroveci
pneumonitis, infección de BCG diseminada tras la vacunación), y retraso en el crecimiento.
La diarrea crónica es un hallazgo frecuente.

Algunos pacientes pueden tener erupciones en la piel y alteraciones de la función hepática.
La enfermedad injerto contra huésped asociada a transfusión materno-fetal también está
asociada a la enfermedad.
Los hallazgos inmunológicos son linfopenia con ausencia de células T y NK,
hipogammaglobulinemia, y recuento normal o aumentado de células B.
2.2 Deficiencias de la función fagocítica
Las bacterias catalasa positivas quedan
2.4.a Enfermedad granulomatosa crónica (E.G.C) confinadas en un fagosoma en donde no
se produce H2O2, al mismo tiempo que las
pequeñas cantidades de H2O2 producido
por las bacterias como desecho
metabólico son neutralizados por la
catalasa de origen microbiano.
Las bacterias catalasa negativos como lo

neumococos producen H2O2 que no llega a
neutralizarse (por la falta de la enzima) y
que por lo tanto se concentra en el
fagosoma participando en el suicidio
Fig. 15 Déficit de NADPH en la E.G.C
microbiano.
Fig. 16 Esquema de la formación de un granuloma en el caso de infección por M.tuberculosis
Fig. 17 Imagen de un granuloma
2.4.b Deficiencia de adhesión leucocitaria
Fig. 18 Esquema de la activación de los leucocitos y el proceso de adhesión al endotelio y diapédesis

Es una enfermedad genética autosómica
recesiva
Provoca:
§ Leucocitosis
§ Infecciones en las partes blandas
§ Periodontitis
§ Mala cicatrización de heridas
§ Desprendimiento tardío de del cordón
umbilical
Fig. 19 Esquema representativo de cómo afecta cada tipo de DAL
La DAL está provocada por la alteración de una de las etapas del proceso inflamatorio, en concreto, en la
migración de los leucocitos desde los vasos sanguíneos a los lugares de infección, la cual necesita la
adhesión de los leucocitos al endotelio.
La DAL-1 está causada por mutaciones en el gen ITGB2 (21q22.3), que codifica para la CD28 beta-2-
integrina.
La DAL-2 resulta de mutaciones en el gen SLC35C1 (11p11.2), que codifica para el transportador
guanosina 5-difosfato fucosa.
La DAL-3 está provocada por mutaciones en el gen FERMT3 (11q13.1), que codifica para la kindlin-3 en
las células hematopoyéticas.
Fig. 20 Esquema de la mutación para DAL-1

El diagnóstico se basa en las manifestaciones clínicas y en la presencia de neutrofilia en un
recuento sanguíneo completo.
Para DAL-1 y DAL-2 debe realizarse una citometría de flujo para CD18 y CD15,
respectivamente.
En los pacientes con DAL-3 debe realizarse un examen de agregación plaquetaria. En todos
los casos, el análisis genético confirma el diagnóstico.
2.4.c Síndrome de Chediak Higashi
El síndrome de Chediak Higashi implica una mutación

autosómica recesiva en el gen regulador del tráfico
lisosomal (LYST). Esta mutación afecta al sistema
inmunitario debido a que provoca un defecto en la
función fagocitaria, vital en la primera línea de defensa
de nuestro organismo. Este defecto es el fallo de la
creación de fagolisosomas en los neutrófilos, cosa que
impide la lisis de las bacterias que son fagocitadas por
la célula. Además, también se ve afectada la función
de las células T citotóxicas.
Fig 21. Síndrome de Chédiak-Higashi A –
Eosinofilo; B – Linfocito C – Neutrófilo D - Monocito
Las mutaciones que provocan la incorrecta fusión del
lisosoma con el fagosoma y por tanto la digestión del
patógeno son las que incrementan la susceptibilidad a
padecer infecciones.
La formación defectuosa del melanosoma (orgánulo
contenedor de la melanina) en los melanocitos es la
que provoca el albinismo y fotofobia.
Las alteraciones lisosómicas en las células del sistema
nervioso provoca daños neurales.
Los daños plaquetarios provocan trastornos
hemorrágicos.
Fig. 22 Esquema de la mutación para DAL-1
2.5 Deficiencias en el sistema del complemento
Edema angioneurótico hereditario
Fig. 23 Esquema de los puntos de control del C1-INH

Déficits de factores activadores
Además, se han descrito deficiencias permanentes de casi todos los componentes del
complemento.
§ El déficit de C1, C2ó C4 à enfermedades autoinmunes como el L.E.S

§ Ausencia de C3 à infecciones recurrentes severas de bacterias gram+ y gram-
§ Déficit de C5, C6, C7ó C8 à más susceptibles a desarrollar infeccione por Neisseria sp.
INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS
3 Las inmunodeficiencias secundarias se adquieren con posterioridad al

nacimiento, debido a numerosos factores ambientales.
En los países en vía de desarrollo, la principal causa es la desnutrición.
En los países desarrollados están causadas por tratamientos

farmacológicos, infecciones o por el cáncer.
Fig. 24 Esquema de causas que originan una inmunodeficiencia secundaria
3.1 Inmunodeficiencias por tratamientos
a. Tratamientos para receptores de trasplantes:

Inmunosupresor para evitar la respuesta del sistema inmunitario
frente al órgano trasplantado.
b. Tratamientos de enfermedades autoinmunes:

Para modular la respuesta autoinmune causante de la enfermedad.
Se usan corticoides, que son antiinflamatorios pero también
inmunosupresores.
c. Tratamientos del cáncer:

Antineoplásicos, que son citotóxicos para los linfocitos maduros e
inmaduros y para los precursores de granulocitos y monocitos.
3.1.a Tratamientos de receptores de trasplantes
Fig 26. Inhibidores de calcineurina: Ciclosporina y Tacrolimus

3.1.b Tratamientos de enfermedades autoinmunes
Tienen el efecto de suprimir el

sistema inmune, la defensa de
nuestro organismo ante virus o
bacterias, lo que es de utilidad
en casos de enfermedades
autoinmunes
Fig. 25 Esquema del efecto de los corticoides en el tratamiento de

enfermedades autoinmunes
3.1.c Tratamientos frente al cáncer
Fig. 27 Esquema de fármacos anticancerosos y diana de actuación

3.2 Inmunodeficiencias secundarias a infecciones
Virus: el más importante es el V.I.H que causa el S.I.D.A

3.4.a Bacterias
los superantígenos son unas proteínas bacterianas que

se unen al MHC II fuera de la hendidura de unión y
activan a los LT a través de TCRs de la familia Vβ en
forma no específica .Esta unión al TCR induce la
proliferación de la célula T como se observa "in vitro"
pero no siempre "in vivo" ya que en ocasiones los
superantígenos "in vivo" pueden anular la respuesta de
la célula T en subsecuente exposición con el mismo
superantígeno, es decir ocasionan una falta de respuesta
o anergia de la célula T
Fig. 28 Esquema de superantígenos
3.4.b Virus VIH
El VIH destruye los linfocitos

CD4+ y comporta una
disminución de
las respuestas humoral y celular,
y un aumento de la
susceptibilidad
a infecciones oportunistas.
Fig. 29 Estructura del VIH

Fig 30. Evolución de la infección por VIH
1. Fase aguda: Periodo de viremia caracterizado por síntomas inespecíficos de infección.
Periodo de infección antes de la seroconversión, y se confirma por la detección del
antígeno denominado p24 o de ARN viral.
2. Fase crónica: Se inicia alrededor de 12 semanas después de la infección, con una reducción
considerable del virus en sangre. Durante este tiempo, el virus queda retenido en tejidos
linfáticos y se recupera moderadamente el nivel de linfocitos CD4+, que después irá
disminuyendo paulatinamente.
3. Fase final: Es realmente el denominado Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (sida),

que evoluciona con aumento notable de la viremia y disminución de linfocitos T CD4+ por
debajo de 200 células/mm3.
Fig. 31 Gráfica que representa la evolución del recuento de CD4 con respecto a la carga viral a lo largo de la
enfermedad
Fig. 32 Organización general del genoma del VIH
Fig. 33 Detalle de la región 5´ UTR del ARN del VIH
Fig. 34 Localización de los genes más importantes y proteínas a las que da
lugar del VIH
3.3 Inmunodeficiencias secundarias al cáncer
Factores de riesgo asociados con infecciones en pacientes con cáncer:

Alteración de las barreras cutáneo-mucosas.
Alteración de la inmunidad celular y/o humoral.
Neutropenia severa.
Desnutrición.
Alteraciones de la flora microbiana endógena y exógena.
Enfermedad de Hodgkin:
Función de los linfocitos T seriamente alterada, se encuentran en estado
de anergia.
DIAGNÓSTICO DE LA INMUODEFICIENCIAS
Fig. 35 Tabla que recoge las pruebas de cribado de las IDPs

Fig. 36 Tabla que recoge los marcadores de linfocitos para el escrutinio de IDPs
Análisis clínicos generales
Valoración global del sistema

inmunitario
Función de los linfocitos y

las células fagocíticas.
Fig. 37 Tabla que recoge las diferentes pruebas que se hacen

en el diagnóstico de las IDP
4.1 Pruebas de la primera etapa
Fig. 38 Esquema de pruebas de primera etapa

La electroforesis ofrece una visión general de la distribución de las proteínas y de la
relación entre albúmina y globulinas.
Aporta información sobre el estado nutricional.
Fig. 39 La imagen de la izquierda representa un proteinograma normal y la de la derecha un proteinograma

con hipogammaglobulinemia
Fig. 40 Proteinogramas de hipogammaglobulonemia (izquierda) y agammaglobulinemia (derecha)
4.2 Pruebas de la segunda etapa
a. Cuantificación de Ig: IDR, turbidimetría, nefelometría, ELISA
b. Cuantificación de LB: Citometría de flujo
c. Cuantificación de subpoblaciones de LT: Citometría de flujo
d. Pruebas para medir la inmunidad mediada por linfocitos T: hipersensibilidad retardada
e. Pruebas para medir la actividad de las células fagocíticas: Reducción de nitroazul de

tetrazolio (NBT), Medición de radicales libres de oxígeno, Ensayos de quimiotaxis
f. Pruebas para medir la actividad del complemento: niveles de C3 y C4 (IDR), CH50,

antígeno CD59 en eritrocitos.
4.2.a Pruebas que estudian los LB
4.2.b Pruebas que estudian los LT
a. Prueba de hipersensibilidad retardada:

Se utiliza un antígeno denominado candidina.
Se inyecta por vía intradérmica.
Se considera positiva si aparece una induración

mayor de 5 mm al cabo de 48 horas.
b. Cuantificación de subpoblaciones
linfocitarias:
Fig. 41 Prueba de hipersensibilidad retardada
Mediante citometría de flujo.
4.2.c Pruebas que estudian el complemento
Fig. 42 Tabla estudio de los valores de C3 yC4

4.3 Pruebas de la tercera etapa
4.3.a Pruebas que estudian los LB

4.3.b Pruebas que estudian los LT
4.3.c Pruebas que estudian las células fagocíticas
Determinación de la expresión de las proteínas del complejo NADPH

oxidasa:
Se realiza mediante un western blot, utilizando anticuerpos

monoclonales específicos para la proteína que se va a estudiar.
Evaluación de la capacidad fagocítica y actividad microbicida de los

neutrófilos.
En esta prueba se cuantifica la fagocitosis midiendo el «estallido

respiratorio».
Bibliografía:

UT.14 Enfermedades
autoinmunes y
detección de
autoanticuerpos
1. Introducción
2. Factores predisponentes
3. Patogenia de las enfermedades autoinmunes
4. Tipos de autoanticuerpos
5. Clasificación de las enfermedades autoinmunes
6. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes
INTRODUCCIÓN
1 El término autoinmunidad engloba una serie de procesos patológicos en los que el S.I
desarrolla una repuesta frente a componentes del propio organismo.
Witebsky postuló que para establecer la naturaleza autoinmune de una enfermedad

tienen que cumplirse los siguientes requisitos:
1. Existencia de autoAc ó LT-autorreactivos (los fagocitos no suelen generar
respuesta autoinmune porque las moléculas que reconocen (PAMP) sólo suelen
presentarlas los m.o
2. Identificar el autoAg implicado
3. Inducir una respuesta autoinmune análoga en animales de experimentación ,
acompañada de una enfermedad similar a la humana
Existe una autoinmunidad
fisiológica o positiva,
encaminada a eliminar
determinados metabolitos y
células envejecidas o alteradas, o
restos de las mismas.
Ej: Ac naturales frente a las
lipoproteínas del LDL
Fig. 1 Esquema de la formación de depósitos de colesterol en los vasos

sanguíneos
FACTORES PREDISPONENTES
2 Las enfermedades autoinmunes pueden ser:

a. Primarias: surgen debido a la confluencia de varios factores
(naturaleza multifactorial)
b. Secundarias: se originan tras una lesión de diversa índole que
expone autoantígenos que normalmente no se encuentran
expuestos al S.I (antígenos secuestrados). Ej: proteínas intraoculares
y del semen.
Los factores predisponentes son:
a. Edad: La mayoría de las EAIs aparecen en la edades juveniles o medias (aunque algunas lo hagan
en la edad gerátrica). Los niveles de Ac aumentan en la edad avanzada y se piensa que es por el
deterioro del S.I
b. Sexo: Afecta mucho más a mujeres y se ha observado una correlación con factores hormonales,
sobre todo el estrógeno
c. Genéticos (HLA): Se ha comprobado una tendencia familiar al padecimiento de determinadas EAIs,
lo que sugiere un componente genético. A este respecto, los alelos del HLA parecen tener un
papel determinante
d. Ambientales : Por agentes infecciosos (estreptococo β-hemolítico del grupo A provoca fiebres
reumáticas, V.E.B puede provocar LES, S.S y E.M), físicos (radiaciones U.V) y químicos (disolventes
orgánicos)
e. Medicamentosos: Insulina, F.VIII-c, ó fármacos que se adhieran a una molécula endógena dirigiendo
al S.I contra él ( difenilhidantoína, α-metildopa, β-bloqueantes, y el IFN)
Fig. 2 Frecuencias relativas de algunas EAIs según el sexo
Fig. 3 A la izquierda tabla que relaciona alelos con EAIs .Imagen superior izquierda representación del gen MHC
(HLA). Imagen inferior derecha número de alelos de los diferentes HLA
Fig. 4 Mimetismo molecular (semejanza entre antígenos del patógeno y antígenos propios). También existen otros
mecanismos que asocian determinadas infecciones con EAIs como son la modificación de las proteínas que expresa la
célula, es muy característico de las infecciones víricas donde virus penetra en la célula e introduce su material genético
utilizándola para la síntesis de sus propias proteínas
3
PATOGENIA DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES
El sistema inmunitario se encarga de:
○ Elaborar una respuesta frente a todo lo extraño

○ Reconocimiento de lo propio
TOLERANCIA INMUNOLÓGICA: falta de respuesta inmune frente a un antígeno al

que se ha expuesto anteriormente
○ Nuestro sistema inmune genera una TOLERANCIA a lo propio
○ Si este sistema falla, da lugar a linfocitos autorreactivos es decir, linfocitos

que inician respuestas frente a nuestras propias células y tejidos.
Fig. 5 Esquema que representa las diferentes acciones del S.I frente a un antígeno
Los mecanismos de lesión están mediados
por una mayor respuesta celular (LTh1) ó
una mayor respuesta humoral (LTh2).
En general, los podemos agrupar en:
a. Citolisis: por CCDA , activación del
complemento, fagocitosis, lesión
mediada por inmunocomplejos
b. Mecanismos que no implican citolisis:
bloqueo, activación, internalización,
unión a moléculas extracelulares
Fig. 6 Desregulación en una EAI
Fig.7 Múltiples puntos de control en el desarrollo de las enfermedades autoinmunes.
Célula diana
Fig.8 Mecanismo de lesión producido por CCDA y por el complemento

Fig. 9 A la izquierda imagen que representa una hiperestimulación por autoAc en la enfermedad de Graves. A la derecha
bloqueo de los receptores de acetilcolina (AChR en la miastenia gravis
4
TIPOS DE AUTOANTICUERPOS
Los autoanticuerpos pueden ser:

a. Naturales: Suelen ser IgM, producidos por LB CD5+,aparecen de manera espontánea y son de baja
afinidad y poliespecíficos, y suelen estar implicados en la protección natural frente a infecciones
bacterianas
b. Patogénicos: están implicados en la producción de una enfermedad autoinmune. Deben cumplir
una serie de características:
1. Los niveles de autoAc deben correlacionarse con la actividad de la enfermedad
2. La eliminación del autoAc debe mejorar la enfermedad
3. Deben ser detectados en el tejido dañado con el posible antígeno
4. Deben ser capaces de causar las mismas lesiones en sistemas experimentales que las que se
les atribuye in vivo
5. Si se inmuniza adecuadamente se deben originar Ac similares que produzcan lesiones
análogas
Para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes, además del estudio de
los autoanticuerpos más comunes, se utilizan también otros parámetros como:
1. VSG ( velocidad de sedimentación globular): Se encuentra aumentada

2. PCR ó CRP (Proteína C reactiva): es una RFA que está aumentada en una
situación inflamatoria, por una EAI o por un proceso infeccioso
3. C3 y C4 del complemento disminuidos
4. Hipergammaglobulinemia policlonal
5. Crioglobulinas: son Igs que se agregan y precipitan en frío y se vuelven a
disolver por calentamiento a 37º. Suelen detectarse en conectivopatías y
pueden da lugar a glomerulonefritis
4.1 Factor reumatoide (FR)
Fig. 10 Estructura de una IgM, isotipo fundamental del FR

El FR es una IgM dirigida frente al Fc de las IgG alteradas estructuralmente al combinarse con un Ag
exógeno, generalmente bacteriano o viral
Se encuentra en el 70 % de las AR ( artritis reumatoides) y aquellas en las que no se detectan se

denominan AR seronegativas
El hallazgo de FR de tipo IgA se correlaciona con la progresión y la intensidad de la enfermedad
El FR, también se puede encontrar en el S.S y a concentración baja en una pequeña proporción de
la población sana (que aumenta con la edad) y en infecciones agudas
Tradicionalmente el FR de tipo IgM se determina por aglutinación, aunque en la actualidad es

preferible el ELISA
4.2 Ac antipéptido cíclico citrulado (anti-CCP)
La citrulina es una modificación de la Arg, en la que se

pierde un grupo amino y una carga positiva en las
proteínas que la contienen
Los anti-CCP se dirigen frente a estos residuos
peptídicos, que están presentes en la AR
La detección de los anti-CCP es una prueba muy
sensible y específica de la AR, además de permitir un
diagnóstico precoz puesto que aparecen de forma muy
temprana en la enfermedad.
Fig. 11 Anti-CCP
También se asocian con un mayor riesgo de daño
articular
Son IgG y se determina por ELISA
4.3 Ac antifosfolípidos (AAF)
Se encuentran en el SAF (síndrome antifosfolipídico) que se
caracteriza por un mayor padecimiento de fenómenos
trombóticos
Incluyen los AAC (Ac anticardiolipina) y elAL (anticoagulante
lúpico)
Los AAC actúan frente aun complejo formado por cardiolipina-
β2GPI. Se detectan por ELISA
Los AL se han detectado en LES y en S.S y su acción es
dependiente de la β2GPI y de la protrombina, con lo cual alargan
la TTPA y cualquier prueba de la coagulación.
Para su detección específica se utiliza el SCT (tiempo de
coagulación con sílice) y el RWT ( tiempo de acción del veneno
Fig.12 Fosfolípidos y Ac antifosoflípidos
de la serpiente Russell
4.4 Ac anticitoplasma del neutrófilo (ANCA)
Son AC dirigidos contra diferentes sustancias incluidas
en los gránulos de los neutrófilos.
Se usa IFI y se pueden observar diferentes patrones,
entre los que destacan ANCA-c (citoplasmático) y
ANCA-p (perinuclear)
Son marcadores serológicos de vasculitis sistémicas

necrosantes:
ANCA-c à Granulomatosis de Wagener
ANCA-p à Poliarteritis nudosa microscópica
Estos AC también se pueden detectar por ELISA Fig.13 Imagen superior neutrófilo. Imágenes
inferiores, IFI de ANCA-c y ANCA-p
4.5 Ac antimitocondriales (AMA)
Los AMA están dirigidos contra la subunidad E2

del complejo mitocondrial 2-OADC y son
específicos de la cirrosis biliar primaria, ya que
aparecen en un 95 % de los casos.
También se detectan en algunos casos del S.S, lo
cual es indicativo de afectación hepática.
Normalmente se detectan por IF
Fig.14 IFI de AMA

4.6 Ac antinucleares (ANA)
Los ANA están dirigidos contra autoAg del núcleo, pero

también contra otros elementos celulares.
Se encuentran en numerosas EAIs. No obstante, la
presencia de ANA se incrementa con la edad a títulos
bajos, en infecciones virales, enfermedades hepática y
algunos tipos de cáncer. También pueden aparecer por
la administración de algunos medicamentos.
La detección se hace habitualmente por IFI, en la que
se determinan diferentes parones. Pero para buscar
mayor especificidad se realiza un ELISA
Fig. 15 Imagen de ANA
Fig. 16 Tabla que recoge los subtipos de ANA y EAIs asociadas
§ Anti-DNA ds à L.E.S
§ Anti-DNA ss à LES, AR y LIF
§ Anti-centrómero à marcador específico de CREST
§ Anti-histonas à LIF
§ Anti-ENA:
• anti-RNP à LES, SS, esclerodermia, polimiositis y EMTC
• anti-Sm à patognomómicos de LES pero sólo aparecen en el 20 % de los enfermos
• anti-Ro(SS-A) à SS y menos en LES
• anti-La (SS-B) à SS y menos en LES
• anti- topoisomerasa I (Scl-70)à esclerodermia
• anti-Jo-1 à alteraciones inflamatorias y degenerativas en los músculos: polimiositis (PM) y
dermatomiositis (DM)
4.7 Ac anticélula endotelial (AACE)
Son Ac dirigidos contra determinantes antigénicos de las células endoteliales

Suelen ser IgG ó IgM y se asocian a LES, vasculitis sistémicas y SS
4.8 Ac antimúsculo liso (AML ó ASMA)
Son Ac dirigidos contra el músculo

liso y en concreto pueden reaccionar
contra Ag presentes en el estómago,
en los vasos sanguíneos, en el
glomérulo renal y en los canalículos
biliares.
Son los principales marcadores de la
hepatitis autoinmune tipo I
Fig. 17 IFI de AML
4.9 Ac anti-RNA polimerasa
Se distinguen tres tipos I, II y II

Los anti-RNA polimerasa III se suelen
detectar en la esclerodermia y
raramente en el LES
La presencia de anti-RNA polimerasa
I se asociado a un peor pronóstico
Fig. 18 Modelo de patogénesis de la esclerosis sistémica (esclerodermia)

5
CLASIFICACIÓN DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
Dependiendo del tejido diana (el que deja de ser «contemplado» como propio y tolerado
por el sistema inmune) se puede establecer una clasificación de las enfermedades
autoinmunes.
5.1 Enfermedades autoinmunes organoespecíficas
En estas enfermedades se produce una

activación de los macrófagos y los LTc.
Los LTh adquieren perfil sobre todo Th1
(respuesta celular) que secretan TNF-α y TNF-β
También pueden producirse Ac, lo que
contribuye al diagnóstico
Fig. 19 Esquema de los órganos a las que más afectan las EAIs
Tiroiditis de Hashimoto
Fig. 20 Tiroiditis de Hashimoto

Fig. 21 Síntomas y signos de la tiroiditis de Hashimoto
Enfermedad de Graves Basedow
Fig. 22 Enfermedad de Graves-Basedow

Fig. 23 Algoritmo de cribado de la enfermedad tiroidea autoinmune
Diabetes mellitus tipo 1
Se origina por una destrucción de las células
beta de los islotes de Langerhans del
páncreas .
Estás asociada al HLA DR3 y DR4
Entre los marcadores de la destrucción
inmunológica de las células b se encuentran:
• anticuerpos a las células b de los islotes
(ICAs)
• anticuerpos a la insulina (IAAs)
Fig. 24 Esquema de la patogenia de la Diabetes tipo 1 • anticuerpos a la decarboxilasa del ácido

glutámico (GADA)
• anticuerpos a tirosin-fosfatasas IA-2 e IA-2
Fig. 25 Tabla que recoge los autoanticuerpos presentes en la Diabetes tipo 1
Cirrosis biliar primaria
• Los AMA M2 son específicos de la CBP

• Su existencia se asocia con una lesión específica en el
conducto biliar
• Aunque no se ha podido demostrar el papel patogénico de
los AMA en la CBP, la reacción cruzada con antígenos
bacterianos sugiere un mecanismo en el que que ciertos
agentes exógenos, probablemente de origen bacteriano,
podrían ser los iniciadores de la lesión en el endotelio biliar
por un mecanismo de mimetismo molecular
Fig. 26 Cirrosis biliar primaria

Enfermedad de Addison
Cuando la enfermedad de Addison tiene un

origen autoinmune se observan Ac anti-ACS
(contra las células d la corteza adrenal)
Con ELISA se detectan anti-21OH (contra la
hidrolasa esteroide)
Fig. 27 Enfermedad de Addison

Fig. 28 Clínica de la enfermedad de Addison
Síndrome de Goodpasture
Es la patología renal
autoinmune más reseñable.
Combina afección renal y
pulmonar
Se detectan anti-MBG (contra
la membrana basal de los
capilares glomerulares, suelen
ser IgG1
Fig. 29 Síndrome de Goodpasture

5.1 Enfermedades autoinmunes sistémicas
En las EAS se produce una actuación de LTh2

que favorece una respuesta humoral con
producción de Ac
Es más prevalente en mujeres
Su curso clínico es variable, a menudo con
brotes
El diagnóstico es complicado porque suelen

debutar de manera inespecífica.
En estas patologías la determinación de autoAc
es la herramienta más relevante para el
diagnóstico
Fig. 30 Ilustración de nombres de EAI sistémicas
Lupus eritematoso sistémico
Se caracteriza por un trastorno inflamatorio que afecta al

tejido conjuntivo.
Las manifestaciones clínicas son muy variables entre los
distintos pacientes.
Ante la sospecha clínica y analítica (descenso de los niveles
del complemento, acompañado de aumento de la VSG) se
deben estudiar los ANA.
Si los ANA son + con patrón homogéneoà confirmar con

anti-Sm , anti-ADNds, AAC y el AL
También pueden aparecer anti-Ro, anti-La, anti-RNP, anti-
ADNss y AACE
Para determinar el LIF ( lupus inducido por fármacos) hay
que determinar los Ac anti- histonas, aunque aparezcan
también en LES y AR
Fig. 31 Síntomas de L.E.S
Fig. 32 Tabla que recoge los autoAc más importantes en el LES
Síndrome de Sjögren
En esta enfermedad los Ac más

detectados son los ANA con patrón
de fluorescencia moteado fino, y los
más específicos anti-Ro(SS-A) y anti-
La (SS-B).
El FR también es positivo en el 50 %
de los casos
Fig. 33 Manifestaciones clínicas del S.S

Artritis reumatoide
Es una enfermedad inflamatoria crónica de las

articulaciones periféricas.
Afecta sobre todo a mujeres entre 35 y 50 años y
existe una asociación con el HLA DR4 y DR1
Se detecta un aumento de la PCR y de
autoanticuerpos, entre los que cabe destacar el FR.
Otros Ac útil es el anti-CCP, es muy sensible y
específico y se asocia a un curso más agresivo de la
enfermedad.
También se han estudiado otros Ac como el
Fig. 34 Manifestaciones clínicas de A.R anticolágeno II y la anticalpastatina
Esclerosis sistémica (Esclerodermia) Es un síndrome caracterizado por anomalías en la
vascularización y por una acumulación excesiva de tejido
fibroso en múltiples órganos: piel, pulmón, riñón, vasos
sanguíneos y tracto digestivo.
Los ScL-70 son específicos de esta enfermedad y se detectan

en un 40 5 de los pacientes.
También pueden aparecer anti –RNApol I y III
Existe una esclerodermia localizada o limitada , que sólo afecta

a la piel de las manos y de la cara.
Un tipo especial de esclerodermia es CREST (calcinosis,
Raynaud, esclerodactilia, lesión esofágica, telangiectasia)
Los Ac anticentrómero están muy asociados a la esclerodermia

limitada y son marcadores específicos de CRESt
Fig. 35 Manifestaciones clínicas de la esclerodermia
6
DIAGNÓSTICO ENFERMEDADES AUTOINMUNES
El diagnóstico de estas enfermedades se basa entre otros parámetros en

poner de manifiesto los autoanticuerpos.
Las técnicas más usadas son IFI y ELISA, pero también se pueden usar LIA
(inmunoensayo en línea) y aglutinación
Fig. 36 Metodología para estudio de
EAI. De la imagen A a la H IFI. Imagen I
identificación de autoAc por
inmunotransferencia. Imagen J: bandas
policlonales de Ig por isoelectroenfoque
e IT. Imagen K: identificación de
polimorfismos de HLA por PCR-agarosa.
Imagen L: subpoblaciones de LB por
CMF. Imagen M: Identificación de
mutaciones por secuenciación. Imagen
N: Identificación de polimorfismos de
HLA por qPCR
6.1 IFI
La técnica más utilizada es la inmunofluorescencia indirecta (IFI):
Los anticuerpos o suero problema se aplican sobre un antígeno inmovilizado en un soporte.
Se añade un anti-anticuerpo fluoresceinado contra las inmunoglobulinas del primero.
Según los autoanticuerpos que se desee detectar, se utilizan diferentes células diana.
Siempre hay que hacer diluciones del suero para poder establecer el título.
Generalmente, para los ANA:
§ Títulos < 1/40 à negativo
§ Títulos entre 1/40 y 1/60 à de baja positividad

§ Titulos > 1/60 à de alta positividad
Fig. 37 Tabla que relaciona los autoAc que se quieren estudiar con los Ag utilizados, como soporte para el IFI
Fig.38 Estructura de las Células Hep-2 de carcinoma escamoso esofágico
6.1.a Detección de autoAc no organoespecíficos
Los autoAc no organoespecíficos

que se detectan más
frecuentemente mediante
inmunofluorescencia indirecta son
los ANA, los anti-ADNds, y los
ANCA.
Para valorar el resultado hay que
considerar el patrón de
fluorescencia y el título del suero
Fig. 39 Tabla que recoge los patrones de ANA y las EAIs asociadas
Fig. 40 Descripción de los patrones de fluorescencia
Fig. 41 Patrones de fluorescencia
Fig. 42 IFI sobre Crithidia Luciliae
Fig. 43 Anticuerpos anti DNA nativo (nDNA o dsDNA). El sustrato antigénico utilizado es el
parásito Crithidia luciliae. Se observa fluorescencia en el kinetoplasto
Fig. 44 Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo. Patrón citoplasmático (c-ANCA) sobre neutrófilos
Fig. 45 IFI ANA centromérico
Fig. 46 IFI ANA centromérico
Fig. 48 IFI ANA periférico
Fig. 49 IFI ANA homogéneo
Fig. 50 IFI ANA moteado
Fig. 51 IFI ANA nucleolar
6.2 Detección de autoAc por aglutinación
En la ARTRITIS REUMATOIDE se determina la presencia del factor

reumatoide (FR):
Es un autoanticuerpo IgM que reconoce la IgG.
La determinación de títulos altos al inicio de la enfermedad es un mal

pronóstico.
Se utiliza la técnica de aglutinación indirecta, con eritrocitos o bolitas

de látex sensibilizados con IgG.
Fig. 52 Fundamento de la determinación del FR por aglutinación
Fig. 53 Aglutinación indirecta Waller Rose para FR
Fig. 54 Reactivos Waller rose
Fig. 55 Interpretación Waller rose
6.3 Detección de autoAc por ELISA
La IFI, considerada como estándar de oro para la detección, está siendo desplazada por
técnicas inmunoenzimáticas, más sencillas.
Ventajas de la técnica ELISA:

§ Bajo coste.
§ Rapidez.
§ Permite analizar muchos sueros a la vez.
§ Interpretación menos subjetiva que la IFI.
§ Muy sensible.
La tecnología es similar a la IFI, solo cambia el tipo de marcador conjugado (enzima y

sustrato cromogénico).
Fig. 56 Tiras de nitrocelulosa. LIA. Imagen de la izquierda resultado positivo. Imagen de la
derecha comparación de resultado negativo y positivo
Bibliografía:

UT.15 Reacciones de
hipersensibilidad

1. Introducción
2. Clasificación de las hipersensibilidades
3. Hipersensibilidad tipo I
4. Hipersensibilidad tipo II
5. Hipersensibilidad tipo III
6. Hipersensibilidad tipo IV
7. Hipersensibilidad tipo V
8. Técnicas de diagnóstico de la hipersensibilidad tipo I o alergia
INTRODUCCIÓN
1 Se denomina hipersensibilidad a una respuesta inmunológica exagerada o inapropiada

que causa alguna lesión. Para que esto suceda, el individuo debe haber tenido un
contacto previo con el Ag que lo provoca y haberse sensibilizado frente a él.
Gell y Coombs clasificaron la hipersensibilidad en 4 tipos, atendiendo a su mecanismo

de producción. A estos cuatro tipos Roitt añadió un quinto.
No obstante, esta clasificación es un poco imprecisa, puesto que hay mecanismos que
se solapan.
CLASIFICACIÓN
2 Podemos clasificar las reacciones de hipersensibilidad en función de varios parámetros:

a. Componentes del S.I implicados:
1. Mediadas por Ac
2. Mediadas por células (LT)
b. Tiempo que tarda en producirse la respuesta
1. Reacciones inmediatas (tienen lugar en menos de 1 hora después del contacto
con el alérgeno
2. Mediadas por células (LT) (se desarrollan varias horas después del contacto,
unas 24 horas)
Fig. 1 Clasificación de las hipersensibilidades ( No contempla la hipersensibilidad tipo V)
5
Fig. 2 Representación gráfica de los diferentes tipos de hpersensibilidades
HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Ó
3
ALERGIA
1. Sensibilización:
Es el primer contacto: sin síntomas. Desencadena una síntesis exagerada de IgE.
Las moléculas de IgE se unen a mastocitos y basófilos, que se mantienen

sensibilizados.
2. Desencadenamiento:
En el segundo contacto, el alérgeno se une a la IgE, provocando la formación de

mediadores (histamina, prostaglandinas, etc.).
La liberación masiva de estos mediadores provoca el proceso inflamatorio que da

el cuadro clínico de la alergia.
7
Fig. 3 Etapas de la hipersensibilidad tipo I
8
Fig. 4 Etapas de la hipersensibilidad tipo I
En la producción de IgE tienen un papel
central los Th2, que secretan citoquinas
como IL-4, IL-5 e IL-13 que estimulan a
los LB en la síntesis de IgE y también la
diferenciación y proliferación de los
eosinófilos
Fig. 5 Formación de células plasmáticas productoras de IgE

En el segundo contacto con el alérgeno, éste se fija
a las IgE que están sobre la membrana de
mastocitos y basófilos.
Esto conduce a la liberación de 2 tipos de
sustancias:
a. Mediadores preformados: heparina, histamina,
proteasas y factores quimiotácticos
b. Mediadores neoformados: derivados del
metabolismo del ácido araquidónico
(prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos,
PAF,etc.)
Fig. 6 Desgranulación de mastocitos y basófilos en la fase 2

de la hipersensibilidd tipo I
Manifestaciones clínicas de la alergia
Las manifestaciones clínicas que se observan en

la alergia, se derivan de la acción de los
mediadores liberados por basófilos y mastocitos,
que originan una reacción inflamatoria tisular,
acompañada de un aumento de la permeabilidad
vascular, contracción del músculo liso,
hipersecreción mucosa y estimulación de las
terminaciones nerviosas
Fig. 7 manifestaciones clínicas de la alergia

Fig. 8 Tabla que recoge la relación entre los tipos de alérgenos, vía de entrada y manifestaciones
clínicas que producen
Asma bronquial
Es una enfermedad en la que se inflaman las vías aéreas, los
bronquios. Entonces se hincha su pared, se estrecha su luz y
hay dificultad para respirar, y con frecuencia tos o sensación
de peso en el pecho
El asma se diferencia según la causa en:

§ Asma atópico, extrínseco o alérgico: secundario a ácaros,
pólenes, epitelios de animales, hongos, alimentos. Es el
más frecuente.
§ Asma intrínseco: de causa no conocida.
§ Asma profesional: harinas, productos industriales, tintes de
peluquería, cuidadores de granja, aves de corral, otros.
Fig. 9 Comparación de un bronquiolo normal (a la izquierda) y § Asma por medicamentos: aspirina, antiinflamatorios, etc.
uno asmático (a la derecha)
§ Asma inducido por el ejercicio.
Reacciones anafilácticas Son un conjunto de manifestaciones
producidas por descargas masivas de
mediadores originadas por un episodio de
hipersensibilidad inmediata mediada por IgE.
Es una reacción alérgica generalizada y
alejada del sitio de entrada del alérgeno.
La forma más grave es el shock anafiláctico

que se caracteriza por una fuerte hipotensión
causada por la pérdida de líquido del espacio
intravascular. Puede conducir a la muerte por
por obstrucción de las vías aéreas y/o
Fig. 10 Manifestaciones clínicas que se producen en una reacción colapso cardiovascular
anafiláctica
HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Ó
4
CITOTÓXICA
La hipersensibilidad citotóxica está mediada por IgG e IgM, que se unen a

antígenos, propios (hematíes o plaquetas) o externos (tejidos de injertos ó
fármacos) fijados sobre células propias.
El sistema inmunitario ataca a las células que presentan dichos antígenos, lisándolas.
Provoca enfermedades autoinmunes o hipersensibilidad frente a medicamentos y

otras sustancias que se fijan a las membranas de las células propias.
16
Fig. 11 Mecanismos de lesión que tienen lugar en la hipersensibilidad tipo I
Fig. 12 Fármacos que originan AHÍ por hipersensibilidad tipo II
HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Ó MEDIADA
5
POR INMUNOCOMPLEJOS
Se forman agregados de IgG e IgM con los antígenos que, al no

poder ser eliminados (por su gran tamaño), se depositan en los tejidos.
Allí, disparan la inmunidad activando el sistema del complemento, que es

responsable del daño tisular.
Puede causar diferentes lesiones, por ejemplo, la enfermedad del suero o la

Reacción de Arthus (es una respuesta cutánea inflamatoria localizada por el
depósito de IC en vasos sanguíneos dérmicos)
Fig. 13 Depósito de los IC en los vasos sanguíneos originando vasculitis
Fig. 14 Hipersensibilidad III o mediada por inmunocomplejos
Además los inmunocomplejos solubles
son capaces de:
a. Activar el complemento
produciendo C3a y C5a que son
anafilotoxinas (producen la
desgranulación de basófilos)
b. Agregar plaquetas: porque tienen
rFc de los Ac e inducir la
producción de aminas vasoactivas
por las mismas
Fig. 15 Lesiones cutáneas por la enfermedad del suero
HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV Ó
6
RETARDADA MEDIADA POR CÉLULAS
Causada por linfocitos T específicamente sensibilizados.

Provoca la lisis de las células afectadas o la formación de granulomas y podemos
encontrar los siguientes subtipos:
a. Dermatitis por contacto: se induce por un compuesto químico reactivo (hapteno) que
se acopla a proteínas epidérmicas y actúa como inmunógeno.
b. Reacción de Jones-Mote
c. Reacción tuberculínica
d. Reacciones granulomatosas: los granulomas son lesiones resultantes de agregados de
fagocitos mononucleares activados que han fagocitado al agente responsible.
e. Reacción adversa a medicamentos.
f. Rechazo de trasplantes.
Fig. 16 Tipos de hipersensibilidad tipo IV
Fig. 17 Mecanismos de lesión originados en la hipersensibilidad tipo IV
La primera fase involucra el procesamiento y
presentación por las células presentadoras
locales a los LT en los nódulos linfáticos.
Luego en un contacto posterior estos LTh1

sensibilizados reconocen al Ag y liberan citoquinas
que actúan sobre la pared vascular.
Esto provoca el reclutamiento de fagocitos y
plasma al sitio de ingreso causando una
reacción inflamatoria visible.
Ocurre 48 a 72 horas del contacto con el Ag
específico y el sujeto previamente
Fig. 18 Hipersensibilidad tipo IV ó retardada
mediada por células
6.a Dermatitis por contacto
Se produce en respuesta a determinadas

sustancias (Cr, Ni, etc.) presentes en objetos que
entran en contacto con la piel y que son capaces
de atravesar las barreras cutáneomucosas y
funcionar como haptenos dentro del organismo
Éstos, forman complejos con proteínas y son
presentados por las células de Langerhans y
originan un infiltrado de linfocitos y macrófagos en
la epidermis.
Se originaun eccema que cursa con eritema,
Fig. 19 Lesiones cutáneas producidas por dermatitis
por contacto edema, exudación, aparición de vesículas, costras y
descamación
6.b Reacción de Jones Mote
Se caracteriza por una infiltración de basófilos del área situada inmediatamente debajo de
la epidermis. La tumefacción máxima cutánea es máxima a las 24 h y la infiltración es
máxima a los 7-10 días.
Se induce por Ag solubles: la inyección intradérmica de ovoalbúmina o el adyuvante

incompleto de Freund (FIA), que provocan un estímulo antigénico leve. Si a lo anterior se
le añade ciclofosfamida, da una reacción tipo tuberculina porque esta reacción esta
fuertemente controlada por LTs que son muy sensibles a ciclofosfamida.
6.c Reacción tuberculínica
Descrita inicialmente por Koch al inyectar tuberculina subcutáneamente. 12

horas después de la prueba hay un infiltrado de LT en regiones
perivasculares a la zona y aumenta hasta las 48 horas.
§ Los LTh son mayoría en 2:1 sobre los LTc.
§ Hay células CD1+ similares a las de Langerhans. También hay algunas
células de Langerhans.
§ Hay macrófagos (y no PMN) que son las principales CPA. Secretan TNF e
IL1 que activan a los LTCD4+. Los queratinocitos, a las 48-96 horas,
pueden expresar HLA-DR y funcionar como CPA.
§ No hay infiltrado basófilo normalmente.
Los Ag solubles de M. tuberculosis, M. leprae y L. tropica inducen
reacciones similares en personas sensibilizadas. La lesión tuberculínica
puede evolucionar a granulomatosa por la persistencia del Ag en los
Fig. 20 Prueba de Mantoux tejidos
§ Mantoux negativo: induración menos a 5mm
§ Mantoux positivo: la prueba se valorará como positiva en función del riesgo de tuberculosis.
a. Induración mayor o igual a 5 mm en persona con riesgo alto de desarrollar TBC: VIH positivos, casos recientes de
TBC,evidencia radiológica de lesiones previas de TBC, pacientes trasplantados, inmunosuprimidos…
b. Induración mayor o igual a 10 mm en personas con riesgo medio de desarrollar TBC: residentes o empleados en
instituciones sanitarias, residencias de ancianos, instituciones penitenciarias. También en personas con factores de riesgo:
silicosis, diabetes, insuficiencia renal crónica….
c. Induración mayor o igual a 15 mm en personas con riesgo bajo de desarrollar TBC
§ Efecto booster: fenómeno de refuerzo o empuje que puede aparecer en individuos vacunados con BCG o con infección
por Mycobacterias atípicas.
§ Falsos positivos: vacuna contra TBC. Infección por otras mycobacterias
§ Falsos negativos: TBC miliar. Enfermos de Sida. Algunas infecciones. Ancianos. Las vacunas de sarampión, paperas y
rubéola administrada el mismo día o en las seis semanas anteriores a la PT pueden ocasionar falsos negativos de ésta.
6.d Reacción granulomatosa
Se pone en marcha para intentar aislar y después destruir

Ag persistentes (metales, agentes infecciosos, etc.) Es
típica de las enfermedades granulomatosas como
tuberculosis, lepra, sarcoidosis, etc.
Se forma una lesión que se denomina granuloma,

formado por un núcleo central con macrófagos activados,
células epiteloides y células gigantes multinucleadas,
rodeado de linfocitos (CD4+ en el centro y CD8+ en la
periferia) y fibras de colágeno.
Además puede originarse, edema y necrosis tisular
necrosis caseosa)
Fig. 21 Formación de granuloma. Las enzimas líticas liberadas A nivel dela piel adoptan un aspecto de nódulo indurado
desde los macrófagos activados contenidos en el granuloma
pueden provocar una lesión tisular extensa
HIPERSENSIBILIDAD TIPO V Ó
7
ESTIMULADORA
Este tipo de hipersensibilidad se denomina

estimuladora. Algunos Ac pueden unirse a
los receptores de determinadas células,
produciendo el mismo efecto que las
moléculas reguladoras oportunas.
Este es el caso de la enfermedad de

Graves Basedow
Fig. 22 Mecanismo de hipersensibilidad
tipo V en la enfermedad de Graves
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE LA
8
HIPERSENSIBILIDAD
1. Técnicas diagnósticas in vivo.

a. Pruebas intraepidérmicas o prick test.
b. Pruebas intradérmicas.
c. Test de provocación.
d. Pruebas epicutáneas o patch test.
e. Intradermorreacciones
2. Técnicas diagnósticas in vitro

a. Técnicas serológicas
b. Técnicas celulares
8.1 Técnicas de diagnóstico in vivo
a. Pruebas intraepidérmicas o prick test
Se reproduce la reacción de hipersensibilidad en la

piel del paciente.
a. Prick-test o test por punción: Consiste en exponer

a la persona a diferentes alérgenos comerciales y
ver si se produce reacción cutánea.
b. Prick-prick: Similar al anterior pero se pincha el

alérgeno en estado natural (por ejemplo, un
alimento fresco).
Fig. 23 Prick test (I)

Como control positivo se administra clorhidrato
de histamina en una concentración de 10 mg/
ml (6,14 mg/ml de histamina base), que
produce una pápula con un diámetro igual o
superior a 3 mm.
Como control negativo se utiliza solución salina

glicerinada al 50%, que es el conservante
habitual de los extractos.
Fig. 24 Prick test (II)

Fig. 25 Prick test (III)
Fig. 26 Prick test (IV)
b. Pruebas intradérmicas
• Consiste en inocular el alérgeno en la dermis.

• Para el control negativo habitualmente se emplea el
conservante utilizado en los extractos alergénicos, lo que permite valorar que no da
reacción inespecífica y como control positivo se suele utilizar clorhidrato de histamina a
0,1 mg/ml, que permite valorar la respuesta cutánea y comparar con el resto de
positividades
La lectura de las reacciones no inmediatas se lleva a cabo a las 48-72 h de la
realización de la prueba y excepcionalmente a las 96 horas.
Para ello se evalúa el diámetrodeleritemayel crecimiento, la infiltración y la

induración de la pápula.
Es una pruebamás sensible que elprick, pero es más dolorosa, ya que causa
irritación. También existe mayor riesgo de reacciones anafilácticas y se han
descrito más falsos positivos.
Fig. 27 Criterios de King y Norman de evaluación de las pruebas intradérmicas
c. Pruebas de provocación
Las pruebas de provocación (o pruebas de
exposición) consisten en exponer al paciente
a la sustancia sospechosa de causarle la
alergia bajo circunstancias controladas.
Pueden realizarse con sustancias que
producen alergia a través de la vía
respiratoria, como pólenes o ácaros, aunque
habitualmente es un método diagnóstico
que se utiliza para las alergias a alimentos o

Fig. 28 Prueba de provocación de alimentos
medicamentos
Las pruebas de provocación se realizan siempre de forma controlada y por
personal sanitario especializado.
La administración de la sustancia puede realizarse por ingesta, inhalación o por

inyecciones subcutáneas, intramusculares o intravenosas; aunque habitualmente el
alimento o el medicamento se administra por vía oral.
El estudio completo dura varias horas.
La prueba consiste en la administración cada 30-60 minutos de cantidades
progresivamente mayores del alimento estudiado, hasta darle la cantidad habitual del
alimento:
§ Si después de la provocación el paciente presenta síntomas en la piel, digestivos,

respiratorios o generales, se dice que la prueba es positiva.
§ Si no presenta ningún síntoma, se dice que la prueba es negativa y que el paciente

tiene tolerancia al alimento estudiado
d. Pruebas epicutáneas o patch test
Evalúan la hipersensibilidad retardada

Aplican el alérgeno sobre la piel para establecer las
dermatitis de contacto.
Test del parche o patch test: Similar al Prick-test.
Se expone al paciente a diferentes alérgenos, pero sin

punción.
Se aplica para el diagnóstico del eczema de contacto.
Lectura retardada, a las 48-72 h. Fig. 29 Patch test

Fig. 30 Resultados de Patch test
Fig. 31 Reacciones positivas de patch test
e. Intradermorreacciones
El alérgeno se aplica por vía intradérmica.
Permite determinar un contacto previo a una infección y el seguimiento
de algunas inmunodeficiencias
Prueba de la Tuberculina o reacción de Mantoux:

Se utiliza un extracto proteico (PPD, protein purified derivative) de
cultivos de Mycobacterium tuberculosis.
Inyección por vía intradérmica.
Lectura a las 72 h. Se mide la induración.
Si hay induración de más de 10 mm, se considera positiva.

Fig. 32 Prueba de Mantoux
Esta prueba no indica tuberculosis activa, sino una exposición previa
Fig. 33 Intradermorreacciones de hipersensibilidad retardada
Fig. 34 Interpretación de intradermorreacciones
8.2 Técnicas de diagnóstico in vitro
8.2.1 Pruebas serológicas
Permiten cuantificar moléculas en el suero del

paciente, que tienen relación con el proceso
alérgico.
Estas moléculas son:
a. Mediadores de alergia
b. Inmunoglobulinas
Estos ensayos se basan en las técnicas
inmunológicas que ya conocemos (sobre todo
CLIA y FEIA), en función del mediador que
queramos estudiar o la Ig, usamos Ac
específicos o alérgenos inmovilizados para
Fig. 35 Pruebas serológicas de diagnóstico de hipersensibilidad reconocer las Igs
8.2.1.a. Determinación de mediadores de alergia
La triptasa es liberada por los mastocitos y es

responsable de la inflamación y el broncoespasmo. Se
encuentra elevada en las reacciones alérgicas graves
(alcanza el pico 1 h después de la reacción y a las 24h
vuelve a los valores normales. Es un marcador útil para
diferenciar una reacción alérgica de otras reacciones.
La histamina se encuentra en gránulos de mastocitos y

basófilos y también se libera en las reacciones
alérgicas. Su determinación es una técnica en desuso,
porque es poco fiable y la histamina se degrada muy
rápidamente. Además hay otros factores, como
alimentos o inadecuada manipulación de la muestra
Fig. 36 Evolución de los valores de triptasa e histamina tras
reacción anafiláctica por picadura de himenópteros que pueden inducir un incremento de la misma)
8.2.1.b Determinación de Igs
Se pueden determinar IgE totales o específicas de

alérgeno.
En los últimos años se utilizan los microarrays, que
permiten la detección de IgE específica frente a más de
100 productos alergénicos de forma simultánea.
En los casos en los que esté implicado un alérgeno
poco frecuente se realiza inmunoblot.
Existe otro tipo de Ig, las precipitinas (forman
precipitados cuando se unen al alérgeno) que se elevan
en cuadros como la alveolitis alérgica, que provoca
inflamación de los alveolos por inhalación de alérgenos.
Fig. 37 Imagen que recoge los pasos en un ImmunoCAP ISAC®
Excepto el estudio de las precipitinas y el inmunoblot,
el resto de las técnicas están automatizadas.
Ig E totales
La IgE totales se encuentra elevada en alergias y en infecciones parasitarias.
Todos los métodos se basan en la utilización de un anticuerpo específico de

la cadena épsilon de la IgE.
§ Radioinmunoensayos: Se utilizan isótopos radiactivos para el revelado de

la reacción (RIST)
§ Enzimoinmunoensayos: Revelado cromogénico de la reacciónó con

producción de luz o fluorescencia
InmunoCAP:
Es la técnica de elección actual.
Es un inmunoanálisis en sándwich extremadamente

sensible.
Utiliza un polímero altamente ramificado que une

las proteínas irreversiblemente.
Los anticuerpos anti-IgE están unidos a la fase

sólida, donde se añade el suero problema.
Se añade un segundo anticuerpo marcado con β-

galactosidasa que se unirá a la IgE y emitirá
fluorescencia.
Fig. 38 InmunoCAP Ig E totales
Fig. 39 Aparato InmunoCAP
Ig E específicas de alérgeno
IgE específica de un alérgeno: su

determinación es necesaria para el
diagnóstico de la alergia y establecer el
tratamiento.
Los valores de IgE específica se dividen el

clases:
Fig. 40 Tabla de clases de valores de IgE específicas

Existen varios métodos para determinar IgE
específicas de Ag, por ejemplo:
§ RAST
§ CAP IgE à Actualmente, se utilizan sistemas
de fluoro-enzima-inmuno-ensayo (FEIA):
§ ImmunoCAP Specific IgE®: utiliza el
mismo principio que para IgE total
§ ImmunoCAP ISAC®: sistema

miniaturizado que permite el análisis
simultáneo de IgE específica frente a
un amplio espectro de alérgenos
Fig. 41 Esquema de la técnica RAST

ImmunoCAP Specific IgE®
Utilizan alérgenos unidos a soportes sólidos a

los que se unen los anticuerpos específicos.
Posteriormente, estos se detectan mediante

un anticuerpo anti-IgE con diferentes
métodos de revelado (color, fluorescencia,
etc.).
Fig. 42 ImmunoCAP Specific IgE

Fig. 43 Esquema de InmunoCAP específico (primera parte)
Fig. 44 Esquema de InmunoCAP específico (segunda parte)
ImmunoCAP Specific ISAC®
En esta técnica se inmovilizan las proteínas

purificadas de los alérgenos sobre un
biochip.
A continuación se añade el suero del
paciente y finalmente el anti-IgE marcado.
Con un láser se excita cada pixel y se
recoge la fluorescencia emitida.
Se basa en un ensayo heterogéneo, por lo

tanto, es necesario el lavado después de
Fig. 45 Esquema de InmunoCAP Specific ISAC® cada paso.
Fig. 46 InmunoCAP Specific ISAC®.
Imagen superior izquierda: diagrama
esquemático de la distribución del
microarray de componentes alergénicos.
Imagen superior derecha: diagrama
esquemático del principio del ensayo.
Imagen inferior izquierda: barrido del
microscopio confocal de fluorescencia con
iluminación láser que muestra diferentes
intensidades, que van del negro (negativo)
al blanco (positivo fuerte) en una escala de
colores. Imagen inferior derecha:
diagrama esquemático de un informe del
kit de InmunoCAP Specific ISAC®
Microarrays de alérgeno
La técnica consiste en un microchip de unos 5 × 5

mm, en cuya superficie están fijados 103
componentes moleculares (alergenos).
Tras bañar dicha superficie con el suero oplasma
del paciente, los anticuerpos IgE específicos (del
suero) se fijan a los componentes. Se trata de una
reacción Ag-Ac sobre un soporte o matriz sólida en
la que se utilizan pequeñísimas cantidades de
alérgeno y de suero problema, con una velocidad
Fig. 47 Microarray para detección de IgE
de reacción que no supera los 10 minutos. específicas
Esta técnica consigue diferenciar la sensibilización frente a distintas proteínas recombinantes
o naturales purificadas, que pueden estar presentes en alimentos vegetales y pólenes, en
ácaros y mariscos, o en aves y huevo, etcétera.
Los datos obtenidos mediante esta técnica nos ayudan a dar consejos más precisos acerca
de los alimentos que se deben eliminar de la dieta o a decidir la composición de la vacuna.
El resultado se analiza en un scanner del microchip, que lee cada una de las imágenes.
Fig. 48 ImmunoCAP Rapid®
8.2.2 Técnicas celulares
8.2.2.a Test de activación de basófilos (T.A.B)
Fig. 49 Test de activación de basófilos (T.A.B)

Detecta la sensibilización midiendo el porcentaje de basófilos que se activan en contacto
con el alérgeno.
Los basófilos representan menos del 0,5% del total de los leucocitos de sangre
periférica. En condiciones normales no se encuentran en los tejidos, y solo emigran a
estos cuanto se produce una reacción inflamatoria. Tienen receptores de alta afinidad
para la IgE (FcεRI) y gránulos citoplasmáticos que contienen histamina.
Mide la proteína CD63 (expresada en la superficie de basófilos activados) mediante el

citómetro de flujo.
Indicaciones: alergias alimentarias, a inhalantes (polvo, polen, etc.), al látex o a
himenópteros.
El TAB se realiza con muestras de sangre periférica completa o tras el aislamiento previo
de los leucocitos, y se desarrolla en las siguientes fases:
Pasos:
1. Estimulación y degranulación. se incuban con
diferentes concentraciones del alérgeno a testar
durante un periodo de 15-40 minutos a 37 ºC
2. Marcaje con anticuerpos fluorescentes. anti-
CD63 (o anti-CD203c)
3. Lisis y fijación celular. Eliminación de GR
4. Adquisición en el citómetro de flujo.
Fig. 50 Etapas del T.A.B
Fig. 51 Marcadores celulares de activación de basófilos
Fig. 52 TAB a diferentes concentraciones de omeprazol
8.2.2.b Test de liberación de histamina
Se trata de un método directo que mide la cantidad de

histamina liberada in vitro en presencia de un
determinado antígeno.
Se añade el alérgeno a leucocitos de sangre periférica.
Si existe sensibilización, se libera histamina, la cual se

puede medir mediante FLUOROMETRÍA.
Existen test comerciales.
Permite el diagnóstico de alergias a alimentos,

medicamentos, insectos, etc.
Fig. 53 Exposición de los basófilos y mastocitos a alérgenos

y diferentes ensayos que se pueden realizar
8.2.2.c Test de urticaria
La URTICARIA CRÓNICA está causada en un 30-40 % de los casos por

enfermedades autoinmunes. Estos pacientes desarrollan anticuerp anti-
IgE o alguno de sus receptores que se encuentran en la superficie de
mastocitos y basófilos, induciendo la liberación de histamina.
Para su diagnóstico, se utilizan basófilos de un donante sano
Estos se ponen en contacto con el suero del paciente. Si este tiene
anticuerpos anti-IgE, los basófilos se activan y se libera histamina.
Se mide la relación entre la histamina liberada y el contenido total de
histamina de las células del donante y se da como positivo si esta

Fig. 54 Fisiopatología de la urticaria crónica
relación es superior al 16,5 %. autoinmune
8.2.2.c Test de transformación linfoblástica
Este test mide la capacidad funcional de los

linfocitos de proliferar frente a un estímulo
inducido por un Ag y se puede determinar por
diferentes métodos, tal y como estudiamos en la
unida de trabajo de pruebas funcionales.
Este test está indicado en es estudio de

manifestaciones alérgicas mediadas por células
( hipersensibilidad tipo IV). Se considera positivo
cuando el índice de estimulación es superior a 3
Fig. 55 Test de transformación linfocblástica Es una técnica laboriosa que no está automatizada
Bibliografía:

UT.16 Complejo mayor

de histocompatibilidad
(MHC)
1. Introducción
2. Genes del MHC
3. Estructura de las moléculas HLA
4. Expresión molecular de los genes MHC
5. Funciones de las moléculas HLA
6. MHC y procesamiento y presentación de antígeno
7. Estudios de histocompatibilidad
8. Nomenclatura de alelos HLA
INTRODUCCIÓN
1 El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) está formado por un conjunto de

genes cuyos productos se expresan en diferentes células y desempeñan una función fundamental en
la respuesta inmunológica, presentando los Ag a los linfocitos T.
Las moléculas (complejos proteicos) que se expresan en las células se denominan HLA
(antígeno leucocitario humano). Estas moléculas fueron descubiertas en 1958 y en primer lugar se les
atribuyó la participación en el rechazo de tejidos y órganos, pero luego se descubrió su función en la
respuesta inmunitaria.
Las moléculas HLA son diferentes de unos individuos a otros, por ello se les puede
considerar los verdaderos marcadores de “lo propio de cada individuo”.
Los genes MHC son los más polimórficos del organismo, originando un amplísimo espectro de HLA
en la especie humana
Fig. 1 Loci del MHC, situados en el brazo corto del cromosoma 6
GENES DEL MHC
2 Los genes que codifican las moléculas HLA se encuentran en el MHC (Complejo Mayor de
Histocompatibilidad), situado en le brazo corto del cromosoma 6. consta
aproximadamente de 4 millones de pb y 200 genes.
Estos genes se clasifican en tres clases principales:
§ Clase I: Codifican para las moléculas HLA I, que se expresan en casi todas las células
nucleadas. Se diferencian en clásicas (A, B y C) y no clásicas (G,E,F y H)
§ Clase II: Codifican para las moléculas HLA II o serie D (DP, DQ, DR), que se expresan
en las CPAs (células dendríticas, macrófagos y LB).
§ Clase III: Codifican para proteínas no relacionadas con el reconocimiento antigénico,
pero que participan en la respuesta inmunitaria, como factores del complemento (C2,
C4a, C4b y factor B) o citoquinas (sobre todo FNT- α y FNT-β
Fig. 2 Codificación de los componentes de las moléculas HLA I
Fig. 3 Codificación de los componentes de las moléculas HLA II
Estos genes, se heredan según la genética mendeliana de
padres a hijos como caracteres codominantes.
Este complejo MHC es el más polimórfico que se conoce en
el humano y se debe probablemente a una adaptación
evolutiva y está relacionado con su función de presentar
péptidos procedentes de m.o.
El polimorfismo no puede explicarse únicamente como

resultado de una combinación al azar de sus genes, ya que
algunos haplotipos se encuentran en mayor frecuencia de la
esperada. Este fenómeno que se denomina desequilibrio de
ligamiento y podría deberse a varios procesos:
§ Que los haplotipos más frecuentes procedan de los
miembros más ancestrales de una dterminada población
§ Que una determinada combinación o haplotipo pueda ser
Fig. 4 Polimorfismos de moléculas HLA I clásicas y HLA II más ventajosa inmunológicamente y por esto se selecciona
positivamente
ESTRUCTURA DE LAS MOLÉCULAS HLA
3 Las moléculas HLA se encuentran en la membrana de la mayoría de las

células del organismo y están formadas por la unión no covalente de 2
glucoproteínas que se organizan en dominios.
Las HLA I están formadas por una cadena α con tres dominios que se une a
una β -2-microglobulina (que se une al dominio α- 3)
Las moléculas HLA II están formadas por cadenas α y β muy similares en

tamaño
9
Fig. 5 Estructura de las moléculas HLA I a la izquierda y HLA II a la derecha
10
3.1 Moléculas HLA I
Fig. 6 Polimorfismo y ubicación de los residuos polimorfos en el

sitio de unión al péptido en las moléculas de clase I del CMH.
En el gráfico de cintas de la parte superior se representan, como
círculos rojos, las posiciones en las que mayormente los
aminoácidos muestran variaciones en las moléculas de clase I.
Estas posiciones han sido identificadas a través del análisis de
las secuencias de las moléculas de clase I. En el gráfico de
barras de la parte inferior puede verse, en las barras en rojo, la
frecuencia con que estas posiciones muestran aminoácidos
diferentes (polimorfismo) a lo largo de la cadena polipeptídica ?
(nótese que esta variabilidad está limitada mayormente a los
dominios α1 y α2). Estos sitios polimorfos tapizan los bolsillos
que permiten acomodar péptidos diferentes.
3.2 Moléculas HLA II
Fig. 7 Polimorfismo y ubicación de los residuos polimorfos en el

sitio de unión al péptido en las moléculas de clase II del CMH.
Se muestran los aminoácidos polimorfos de la molécula de clase
II HLA-DR (la cadena ? es monomorfa) que permiten que se
acomoden diferentes péptidos en sus bolsillos. En el gráfico de
cintas de la parte superior se representan, como círculos rojos,
los aminoácidos que muestran polimorfismo en las moléculas de
clase II. Estas posiciones han sido identificadas a través del
análisis de las secuencias de las moléculas de clase II. En el
gráfico de barras de la parte inferior se puede ver, en las barras
en rojo, la frecuencia con que estas posiciones muestran
aminoácidos diferentes (polimorfismo). Nótese que el
polimorfismo esta restringido al dominio β1.
3.3 Moléculas CD1
Fig. 8 Estructura de moléculas CD1.

Representan un tercer linaje de moléculas
HLA, pero el tipo de Ag presentado es no
protéico. Su estructura adopta una forma
muy parecida a los HLA de clase I (imagen
B), sin embargo la cavidad donde se aloja
el antígeno es más estrecha y más
profunda en las CD1
La molécula CD1 se comporta como una molécula de MHC clase II en cuanto a la forma en la que "carga" o adquiere
sus ligandos.
Se expresa específicamente en: timocitos corticales, células de Langerhans, células dendríticas, linfocitos B, epitelio
intestinal, músculo liso y endotelio de vasos sanguíneos.
Hay varias proteínas CD1 que se expresan en los seres humanos, y aunque las vías de tráfico celular difieren de formas
sutiles, todas las moléculas CD1 se unen a los lípidos y los muestran por una sola vía.
Las moléculas CD1 recién sintetizadas captan lípidos celulares y los llevan a la superficie celular. Desde aquí, los
complejos CD1-lípido son captados por endocitosis en los endosomas o los lisosomas, donde se capturan los lípidos
que han sido ingeridos del ambiente externo, y los nuevos complejos CD1-lípido vuelven a la superficie celular. De
este modo, las moléculas CD1 adquieren los antígenos lipídicos interiorizados por endocitosis durante el reciclado y
los presentan sin un procesamiento aparente. Los linfocitos NKT que reconocen a los antígenos lipídicos pueden
intervenir en la defensa contra los m.o, en especial contra las micobacterias (ricas en componentes lipídicos).
Fig. 9 Sitios de unión del Ag procesado a las moléculas HLA y CD1
EXPRESIÓN CELULAR DE LOS
4
GENES MHC
Fig. 10 Imagen izquierda: célula nucleada con las moléculas HLA I en la membrana. Imagen derecha CPA
con moléculas HLA I y HLA II en la membrana
FUNCIONES DE LAS MOLÉCULAS HLA
Fig. 11 Tabla izquierda: clases de moléculas HLA. Tabla derecha: funciones de las moléculas HLA
6
MHC Y PROCESAMIENTO Y
PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS
Fig. 12 Procesamiento y presentación de antígenos

6.1 Ruta citosólica de procesamiento
El Ag vírico o las proteínas sintetizadas por

una célula tumoral se degradan en el
proteasoma y se introducen en el RER donde
se unirá a la molécula HLA I y este complejo
será transportado a la superficie.
Paso a paso:
1. La cadena α recién sintetizada se asocia
la proteína calnexina en el RER (la
mantiene estable)
2. Se une la β -2-microglobulina
3. Los péptidos antigénicos entran en el RER
por el sistema TAP-1 y TAP-2 (complejo
de transporte de péptidos
4. La unión HLA-I con el péptido abandonan
Fig. 13 Ruta citosólica de procesamiento de Ag y unión a HLA I el RER y se dirigen a la membrana
6.1 Ruta endocítica de procesamiento
El Ag exógeno penetra en la célula por endocitosis

o fagocitosis y son procesados en un fagolisosoma
Por otro lado,las HLA II :
1. Se unen a la molécula Li para que no se unan
péptidos que se deben unir a las HLA I
2. Se escinde Li por acción de catepsina L
(proteasa) y se añade CLIP al surco del HLA II
3. La vesícula que contiene el HLA II se fusiona con
la que contiene los péptidos y se desplaza CLIP
para que entren los péptidos en el surco
4. El complejo HLA II-péptido asciende a la
membrana
Fig. 14 Ruta endocítica de procesamiento de Ag y unión a HLA II

Fig.15 Presentación de Ag a los LT CD8+ (a la izquierda) y LT CD4+ (a la derecha)
ESTUDIOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
7 En muchas ocasiones es necesario conocer los tipos de HLA o sus alelos génicos en un individuo, a
este tipo de análisis se le denomina tipaje HLA.
Los estudios de tipaje HLA son útiles en la siguientes situaciones:
§ Estudios de histocompatibilidad para trasplante de órganos vascularizados
§ Estudios de histocompatibilidad para trasplante de M.O
§ Estudios de paternidad
§ Estudios de asociación de alelos HLA con determinadas EAI
§ Estudios antropológicos para establecer relaciones entre poblaciones
El tipaje puede hacerse por diferentes técnicas:
1. Serológicas
2. Biología molecular
3. Celulares
7.1 Estudios serológicos
Esta técnica consiste en:
1. Se enfrentan los linfocitos a un panel AcMo
específicos para cada una de las moléculas
HLA
2. Se añade complemento
3. Se añade naranja de acridina (que se une al
ADN) y bromuro de etidio
4. Las células muertas se verán naranjas y las
vivas verdes
Fig. 16 Prueba de microlinfotoxicidad o Terasaki (izquierda). Resultados del test (derecha)

7.2 Estudios de biología molecular
7.2.1 PCR- SSP (Sequence Specific Priming)
Fig. 17 Esquema de la técnica PCR-SSP para tipar HLA

7.2.2 PCR- SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide)

1. Amplificación de los alelos
2. Se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa que contiene sondas
específicas de alelo inmovilizadas
3. Hibridación
4. Lavados de post-hibridación
5. Detección de la hibridación en función
del marcador utilizado
Fig. 18 Detección de alelos HLA por PCR-SSOP

Fig. 19 Sondas de la técnica SSOP
Fig. 20 Amplificación de los exones estudiados de HLA por PCR
Fig. 21 Desnaturalización de los fragmentos amplificados e hibridación a la izquierda. Detección de los alelos a la derecha
7.2.3 Luminex

1. Amplificación con primers biotinilados
2. Desnaturalización
3. Hibridación con las perlas
4. Agregar SAPE (estreptavidina +
ficoeritrina) para amplificar la señal
5. Lectura en el citómetro de flujo
Fig. 22 Tipaje HLA de alta resolución por ensayo en fase sólida, microbeads array o tecnología luminex
7.2.4 SBT ( Sequence Bases Typing)
Fig. 23 Tipaje del HLA por secuenciación basada en métodos de terminación de cadena
Fig. 24 Ventajas y desventajas de cada método de tipaje
7.3 Métodos de detección celular
7.3.1 Cultivo mixto de linfocitos bidireccional

El fundamento de esta técnica es que, al cultivar
los linfocitos de dos personas con HLA diferente,
los LT responden con una intensa proliferación y
liberación de citoquinas. Se debe a que los LT
CD4+ reconocen las HLA II extrañas.
Los LT CD8+ también se activan al reconocer el
HLA ajeno.
Se puede cuantificar la incorporación de timidina
tritiada al ADN de las células que proliferan o
cuantificar las citoquinas liberadas al medio
Fig. 25 Cultivo mixto de linfocitos bidireccional para estudiar la histocompatibilidad donante-receptor

7.3.2 Cultivo mixto de linfocitos unidireccional
En esta técnica sólo se pretende obtener
la respuesta de una población de
linfocitos (la del receptor)
Para ello las células del donante son
tratadas con mitomicina (un inhibidor de
la mitosis) o por irradiación, para impedir
su proliferación y que actúen como
estimuladoras de la respuesta proliferativa
de los LT del receptor
Cuando las células tienen un HLA idéntico
permanecen en reposo
La proliferación se desencadena sobre
todo por las diferencias de las moléculas
Fig. 26 Cultivo mixto de linfocitos unidireccional donante-receptor HLA II
NOMENCLATURA ALELOS HLA
Fig. 23 Nomenclatura de los alelos HLA

Bibliografía:

Asignatura Entera Apuntes María Cerezo

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Técnicas de inmunodiagnóstico.

Ciclo de grado superior LCB

María Cerezo Ibáñez

Organizaremos la unidad de trabajo de la siguiente manera :

2.Células del sistema inmunitario.

3. Componentes humorales del sistema inmunitario

Como hemos dicho anteriormente, no sólo tienen función de

El epitelio intestinal se compone de una única capa de células epiteliales cilíndricas

Las células de Globet son las principales productoras de mucinas en el epitelio

El moco expresa una permeabilidad selectiva; permite la entrada y salida de

Los enterocitos secretan también péptidos antimicrobianos: defensinas,

La IgA secretora también juega un papel muy importante.

Los enterocitos, al activarse, producen también un

2.1 Inmunidad innata 2.2 Inmunidad específica

2.1.b Neutrófilos 2.2.b Linfocitos T

2.1.d Basófilos y mastocitos

2.1.e Células dendríticas

2.1.f Células N.K

Participación de los diferentes componentes celulares y humorales

1. RRP (receptor de reconocimiento de patrones) de las células y

2.a PAMP (patón molecular asociado a patógenos) presentes en los

2.1.a Monocitos/ macrófagos

Residentes: cumplen misiones concretas en cada uno de los tejidos, pudiendo

• Células de Kupffer, en las paredes vasculares de los sinusoides hepáticos

Libres: están estratégicamente situados para atrapar material extraño en

• Macrófagos de los sinusoides esplénicos (en el bazo)

Sus funciones son: fagocitosis, CPA, síntesis de citoquinas, mediadores de la

Perfil inflamatorio- antiinflamatorio

• PRIMARIOS (mieloperoxidasa, hidrolasas, lisozima, fosfatasa

• SECUNDARIOS (poseen sustancias de ataque bacteriano,

• TERCIARIOS (gelatinasa, marcadores de adhesión)

• CUATERNARIOS Ó FOSFOSOMAS (F.A.L)

Su función principal es la fagocitosis

• PEROXIDASA (DIFERENTE DE A LA LOS NEUTRÓFILOS)

2.1.d Basófilos y mastocitos

Mediadores de síntesis reciente:

2.1.e Células dendríticas

2.1.f Células N.K

A diferencia de los B y T, que circulan por s.p en un estado de

1) Captación del antígeno por las células dendríticas y

2) Presentación antigénica a los linfocitos T vírgenes en los órganos

3) Activación de linfocitos T y B, expansión clonal y diferenciación

4) Producción de anticuerpos por los plasmocitos y activación de

Los linfocitos proceden de un progenitor

No está claro cómo y dónde el PCL se

Durante el desarrollo linfocitario los esfuerzos se centran en:

1. Lograr el reordenamiento exitoso de las cadenas que darán lugar a

En la figura de la izquierda se representa el BCR (receptor de células B),

q células B2: la más abundante en s.p y en tejidos linfáticos

q células B1:no requieren la colaboración de los CD4+ para

q células B de la zona marginal del bazo (BZM): características

1) Pro-B: reordenamiento de las cadenas pesadas de

2) Pre-B: reordenamiento de las cadenas ligeras.

3) B inmaduro: se integra la IgM con el heterodímero

4) Inducción de la tolerancia central aquellos que son

5) BTr: B transicionales, son B que se encuentran en la

6) B maduros: los BTr se dirigen al bazo y allí se

Los linfocitos T, al igual que el resto de las células del sistema

Los diferentes estadios en su desarrollo se distinguen no sólo

También se distingue una subpoblación funcional: LTs (inhiben

• Estadio DN (doble negativo) comienzana a expresar

• Estadio DP: la expresión del pre-TCR induce la

• Estadio SP: finalizado el proceso de tolerancia central,