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Antes del descubrimiento de la estructura del ADN, a partir del trabajo pionero de
Watson y Crick (1953), se conocía lo siguiente sobre los genes y el ADN:
El descubrimiento que los genes son portados por los cromosomas, a partir del
trabajo de Sutton y Boveri (1902), conocida como “Teoría cromosómica de la
herencia”, y del trabajo de Morgan (1910) con genes ligados a cromosomas
sexuales.
El segundo experimento consistió en matar las bacterias S virulentas, por medio del
calor, inyectarlas a los ratones y observar que sucedía con los mismos. Griffitth observó
que los ratones vivían (Fig. 1c), y además que en la sangre extraída de los ratones no se
encontraban bacterias de S. pneumoniae.
El tercer experimento consistió en mezclar cepas S virulentas, muertas por calor,
con cepas R no virulentas vivas, e inyectó la mezcla a los ratones y observó que sucedía
con los mismos. Sorprendentemente, los ratones se morían (Fig. 1d), y además en la
sangre de los ratones muertos aisló bacterias S vivas.
A partir de los resultados de sus experimentos, Griffitth concluyó que algunas
bacterias R no virulentas habían sido transformadas en bacterias S virulentas. Al agente
que produjo la transformación de las cepas bacterianas, él lo denominó principio
transformante. Sin embargo, Griffitth no logró determinar cuál era ese principio
transformante. Él creía que se trataba de las proteínas. El descubrimiento de Griffitth es
lo que hoy conocemos como Transformación Bacteriana.
Luego del descubrimiento de Griffitth, el próximo paso fue determinar cuál era el
componente químico que actuaba como principio transformante. Es decir, cuál era la
sustancia responsable de cambiar el genotipo de las bacterias receptoras, con lo cual,
sería un potencial candidato de ser el material hereditario.
En 1944, Oswald Avery, un biólogo americano, y sus colegas Colin M. MacLeod y
Maclyn McCarty, continuaron con los experimentos de Griffitth. Ellos intentaron
identificar cuál era el principio transformante, estudiando la transformación de las cepas
bacterianas R en S, pero en un tubo de ensayo. Ellos lisaron las cepas S con un
detergente y usaron una centrífuga para separar los componentes celulares, el extracto
celular, de los desechos celulares. Luego, incubaron el extracto celular con un cultivo de
cepas R, y realizaron un “plaqueo” sobre una placa de Petri conteniendo medio de
cultivo para bacterias. Si aparecían sobre la placa colonias con aspecto liso era una
demostración que el extracto celular contenía el principio transformante.
Avery y sus colaboradores sabían que algunos de los componentes
macromoleculares del extracto celular de las cepas virulentas S, polisacáridos, lípidos,
proteínas, ARN o ADN, debía ser el principio transformante. Para determinar cuál de
ellos era, realizaron una serie de tratamientos enzimáticos para degradar cada uno de
ellos por separado, y luego probar si ocurría la transformación. Para ello, pusieron a
incubar cepas bacterianas R, con los componentes celulares que no se habían
degradado, y luego observaron si se desarrollaban colonias lisas (S). Primero
degradaron los polisacáridos, luego pusieron el extracto restante de las cepas S con las
bacterias R vivas, y observaron que se producía transformación. Hicieron lo mismo con
los lípidos, proteínas, ARN y ADN. En el único caso donde no se observó
transformación de bacterias R en S fue cuando se degradó el ADN con enzimas
específicas denominadas Deoxyribonucleasas (DNasa) (Fig. 2).
Figura 2. Experimento de Avery y col. que demostró que el ADN fue el principio
transformante.
Ellos infectaron E. coli con los dos tipos de fagos T2 marcados radioactivamente.
En las bacterias infectadas con T2 marcado con 32P la mayor parte de la radioactividad
fue encontrada dentro de la bacteria, luego de la infección, y muy poca en la proteína de
la cápside de los fagos (“fantasmas”), los cuales quedan afuera de la bacteria. Los
“fantasmas” fueron separados de las células bacterianas por agitación en un refrigerador
y luego por medio de una centrífuga. De esta forma midieron la radioactividad en las
dos fracciones. Por otra parte, ellos encontraron 32P en las progenies del fago luego de
la lisis celular. Cuando ellos usaron los fagos marcados con 35S la radioactividad
aparecía en los “fantasmas” pero no adentro de la célula o en las progenies del fago.
Esto indicaba que la proteína nunca ingresó dentro de la célula bacteriana.
Con estos resultados se llegó a la conclusión que el ADN es el material genético
responsable de la herencia y que las proteínas del fago son componentes estructurales
que forman parte de la cápside, la cual es descartada una vez que el fago inyecta su
ADN a la bacteria.
Hay 2 clases de bases nitrogenadas: las purinas, las cuales poseen estructura de
doble anillo, y las pirimidinas que poseen un solo anillo. Las purinas son la adenina
(A) y guanina (G), y hay tres pirimidinas: timina (T), citocina (C) y uracilo (U) (Fig.
5). Tanto el ADN como el ARN contienen adenina, guanina y citosina; mientras que la
timina sólo es encontrada en el ADN y el uracilo en el ARN.
Figura 5. Estructura química de las bases nitrogenadas en el ADN y ARN
Rosalind Franklin y Maurice Wilkins estudiaron fibras de ADN aisladas, por medio
de la técnica de difracción de rayos X. Un haz de rayos X paralelos es dirigido a la
molécula de ADN. El haz es difractado (roto) por los átomos en un patrón que es
característico del peso atómico y el ordenamiento espacial de las moléculas. Los rayos
X difractados son registrados sobre una placa fotográfica. Analizando las fotografías,
Franklin obtuvo información sobre la estructura atómica de las moléculas. Ella concluyó
que el ADN es una larga y delgada estructura helicoidal que tiene dos partes similares,
que están paralelas una de la otra, y corren a lo largo de la longitud de la molécula. Ella
detectó dos regularidades distintivas a lo largo del eje de la molécula de 0,34 nm y 3,4
nm (Fig. 7).
Figura 7. Análisis del ADN por difracción de rayos X. El patrón de difracción de rayos
X que usaron Watson y Crick para desarrollar su modelo de doble hélice. Las áreas
oscuras que forman una X en el centro de la fotografía indican que se trata de una hélice
de ADN. Las machas más oscuras arriba y debajo de la fotografía indican la distancia de
0,34 nm entre los pares de bases.
Figura 8. Estructura molecular del ADN. (a) Modelo molecular tridimensional del
ADN presentado por Watson y Crick. (b) Representación estilizada de la doble hélice
de ADN. (c) Estructura química de un segmento de la doble cadena de ADN.
1. Los 4 dNTPs
2. Un fragmento de ADN para actuar como molde
3. ADN Pol I
4. Iones magnesio (Mg2+), necesarios para una actividad óptima de la ADN
Polimerasa
Además de la ADN Pol I descubierta por Kornberg, también existen otras dos ADN
polimerasas, la ADN Pol II, que no participa de la replicación del ADN, y la ADN Pol
III que actúa junto con la ADN Pol I en la síntesis del ADN. Ambas ADN Pol I y III
replican ADN en dirección 5´- 3´ y tienen actividad exonucleasa 3´- 5´, es decir puede
eliminar los nucleótidos mal incorporados en el extremo 3´ de la cadena, y los
reemplaza por los correctos. Este mecanismo evita que la frecuencia de errores
cometidos en la síntesis sea alta, reduciéndola a una frecuencia de 10-9. En términos
generales, se cree que se comete un error con una frecuencia de 10-6.
La ADN Pol I también tiene actividad exonucleasa 5´- 3´ pudiendo remover, tanto
de ADN como ARN, nucleótidos del extremo 5´ de la cadena. Esta actividad es
importante en el proceso de replicación del ADN que describiremos a continuación.
Luego que la helicasa separa el ADN para producir cadenas simples que servirán de
molde para la replicación, proteínas de ligamiento a ADN de cadena simple (SSB
proteins) se unen a éstas para estabilizarlas y prevenir que se vuelvan a unir (Fig. 10 y
12). Los “primers” de ARN son alargados por la ADN polimerasa III, la cual sintetiza
ADN complementario a la cadena molde, mientras simultáneamente desplaza a las
proteínas SSB ligadas a las cadenas. Como la ADN polimerasa solo puede sintetizar en
dirección 5´- 3´ y las dos cadenas tienen polaridad opuesta, la síntesis se produce de
manera opuesta en las dos cadenas. La cadena nueva sintetizada en dirección 5´- 3´ en la
misma dirección del movimiento de la horquilla de replicación es llamada cadena
adelantada o líder (leading strand), mientras que la cadena sintetizada en dirección
opuesta al movimiento de la horquilla de replicación se llama cadena retrasada
(lagging strand) (Fig. 11). La cadena líder necesita un simple “primer” de ARN para su
síntesis; mientras la cadena retrasada necesita varios “primers” de ARN para completar
la síntesis.
A medida que la horquilla se mueve, la helicasa separa más ADN, y una ADN
girasa (una forma de topoisomerasa) relaja las tensiones producidas a continuación de
la horquilla de replicación (Fig. 10). La cadena líder es sintetizada continuamente a
medida que la horquilla avanza. Sin embargo, la síntesis sobre la cadena retrasada se
produce de manera discontinua, por tramos, a medida que la horquilla progresa. Por eso
se dice que en conjunto la replicación ocurre de manera semidiscontinua. Los
fragmentos discontinuos que se forman sobre la cadena retrasada se denominan
fragmentos de Okazaki, en honor a su descubridor, Reiji y Tuneko Okazaki.
En la cadena retrasada se sintetizan nuevos “primers” de ARN cada 1.000 a 2.000
nucleótidos incorporados. Los extremos de los fragmentos de Okazaki son unidos por la
actividad de la ADN polimerasa I y la ADN ligasa. La ADN polimerasa I es la
encargada de remover el segmento del primer de ARN, por medio de su actividad
exonucleasa 5´- 3´. Cuando la ADN polimerasa I ha reemplazado todos los “primers” de
ARN por nucleótidos de ADN, una muesca (nick) es dejada entre los dos fragmentos.
Los dos fragmentos son unidos por la ADN ligasa para producir una larga cadena de
ADN (Fig. 12).
Figura 12. Modelo de los eventos que ocurren alrededor de una horquilla de replicación
del cromosoma de Escherichia coli. (a) Iniciación. (b) Posterior desenrrollamiento y
elongación de la nueva cadena de ADN. (c) Posterior desenrrollado y continuación de la
síntesis de ADN. (d) Remoción de los “primers” por ADN Polimerasa I. (e) Unión de
fragmentos de ADN adyacentes por acción de ADN ligasa. Verde = RNA; Rojo =
Nuevo ADN.
Este proceso replica la mayor parte del ADN cromosomal, pero hay un problema
con los dos extremos de la molécula de ADN lineal, llamada telómeros. La síntesis
continua sobre la cadena líder puede proceder en la forma correcta hasta la punta del
molde. Sin embargo, la síntesis de la cadena retrasada requiere iniciadores (“primers”)
por delante del proceso, de tal forma que cuando el último iniciador es removido, un
extremo de cadena simple permanece en una de las moléculas de ADN hija (Fig. 14). Si
el cromosoma hijo con esta molécula de ADN se replica nuevamente, la cadena con la
secuencia faltante en su extremo se convertiría en una molécula doble cadena más corta.
En cada ronda de replicación posterior, los telómeros continuarán acortándose, hasta
que eventualmente información codificante esencial se pierda.
Figura 14. El problema de replicación en los extremos del cromosoma. Una vez que el
primer de la última sección de la cadena retrasada es removido, no hay manera de
polimerizar aquel segmento, y debería resultar en un cromosoma acortado cuando el
cromosoma conteniendo la cadena incompleta replica.
Las células han desarrollado un sistema especializado para evitar esta pérdida. Para
ello, adicionan al extremo del ADN cromosómico unas copias múltiples de una
secuencia simple no-codificante para prevenir el acortamiento. Por ejemplo, en el
protozoario Tetrahymena, copias de la secuencia 5' -TTGGGG- 3' son adicionados a
los extremos 3' de cada cromosoma. En humanos, copias de la secuencia 5' -TTAGGG-
3' son agregadas. Este alargamiento de la molécula de ADN crea ADN no-codificante
que puede ser “sacrificado” en el proceso de replicación.
En la Fig. 15 se muestra un diagrama simplificado del mecanismo en Tetrahymena.
La telomerasa actua en el estado mostrado en la Fig. 15c, donde un extremo
cromosómico ha sido producido con un “hueco” (gap) en el extremo 5' del nuevo ADN
(Fig. 15a). La telomerasa es una enzima que produce, tanto proteína y ARN. El
componente de ARN de la enzima incluye una secuencia de bases que es
complementaria a la unidad repetida del telómero del organismo en el cual esta se
encuentra. Por lo tanto, la telomerasa se une específicamente a la repetición del
telómero sobre-expuesta en el extremo del cromosoma (Fig. 15b). Luego, la telomerasa
cataliza la síntesis de 3 nucleótido de ADN nuevo (TTG), usando el ARN de la
telomerasa como molde (Fig. 15c). Luego, la telomerasa se mueve hacia el extremo del
molde de ARN, que ahora se apareó con la secuencia TTG recientemente sintetizada
sobre el ADN (Fig. 15d). La telomerasa sintetiza el resto de la repetición del telómero
TTGGG (Fig. 15e). El proceso se repite y se adicionan más repeticiones teloméricas.
De esta manera, el cromosoma es alargado por el agregado de un número de
repeticiones teloméricas. Luego, los huecos son llenados por la síntesis del iniciador y la
síntesis del ADN catalizada por la ADN polimerasa en la forma conveniente, y el nuevo
ADN cromosomal es alargado (Fig. 15f). La síntesis de ADN a partir de un molde de
ARN es llamada transcripción inversa, por lo tanto la telomerasa es un ejemplo de una
enzima transcriptasa inversa.
Figura 15. Síntesis del ADN telomérico por la telomerasa. El ejemplo es de los
telómeros de Tetrahymena. (a) El punto de inicio es el extremo del cromosoma con el
gap 5' dejado después de la remoción del primer. (b) Unión de la telomerasa a la
repetición telomérica sobre-expuesta en el extremo del cromosoma. (c) Síntesis de un
segmento de ADN de tres nucleótido en el extremo del cromosoma, usando el molde de
ARN de la telomerasa. (d) La telomerasa se mueve de tal manera que el molde de ARN
pueda unirse al TTG recién sintetizado en una manera diferente. (e) La telomerasa
cataliza la síntesis de una nueva repetición telomérica, usando el molde de ARN. (f)
Después que la telomerasa ha dejado, nuevo ADN es sintetizado sobre el molde,
comenzando con un primer de ARN. (g) Después que el primer es removido, el
resultado es un cromosoma más largo que al comienzo, con un nuevo gap 5´.
4. El FUNCIONAMIENTO DEL ADN
4.1. Transcripción
4.1.1. ARN
Figura 17. Promotor, secuencia codificante del ARN, y regiones de terminación de un gen. El
promotor está “río arriba” (5´) de la secuencia codificante y el terminador “río abajo” (3´). La
secuencia codificante comienza en el nucleótido +1.
4.3.1.1. Iniciación de la transcripción
4.2. Traducción
Figura 26. Ejemplo del tambaleo en el apareamiento de bases. Dos codones de leucina
diferentes (CUC, CUU) pueden ser leídos por la misma molécula de ARNt leucina,
contrario a las reglas de apareamiento regular de bases.
Posee tres pasos. Además del ARNm, los ribosomas, y los ARNt específicos se
necesitan varios factores llamados Factores de Iniciación IF1, IF2 y IF3 (Fig. 27).
1) Se liga el ARNm a la subunidad 30S del ribosoma. Este es estimulado por el factor
IF3 (las subunidades del ribosoma sólo se unen cuando se inicia el proceso de
síntesis).
2) El factor IF2 se liga a GTP y al iniciador fMet-ARNt y estimula el ligamiento de
fMet-ARNt al complejo de iniciación, dejando a fMet-ARNt dentro del sitio P.
3) Una proteína ribosomal separa el GTP ligado a IF2, ayudando a ensamblar las dos
subunidades ribosomales. En esta etapa se liberan los factores IF1 y IF2.
Figura 27. Iniciación de la síntesis de proteína en procariotas. Una subunidad ribosomal
30S forma un complejo con factores de iniciación y GTP, unidos al ARNm y fMet-
tRNA para formar un complejo de iniciación 30S. Luego, la subunidad ribosomal 50S
se une, formando un complejo de iniciación 70S. Durante este evento, los factores de
iniciación son liberados y el GTP es hidrolizado.
Los tres codones de terminación UAG, UAA y UGA no son reconocidos por un
ARNt, pero sí por factores proteicos denominados Factores Liberadores RF1 y RF2.
RF1 reconoce los tripletes UAA y UAG, y RF2 reconoce a UAA y UGA. Existe un
tercer factor RF3 que ayuda a catalizar la terminación. Cuando el peptidyl-ARNt está
en el sitio P, el factor liberador, en respuesta a codones de terminación, se liga al sitio
A. Entonces el polipéptido es liberado del sitio P, y los ribosomas se disocian en sus
dos subunidades (Fig. 29).
Figura 29. Terminación de la traducción. Los ribosomas reconocen un codón de
terminación (UAG) con la ayuda de factores de liberación. Un factor de liberación lee el
codón stop, iniciando una serie de eventos de terminación específicos que conducen a la
liberación del polipéptido completo.
2. Las células deben ser capaces de reconocer condiciones del medio en la cual
ellas deberían activar o reprimir la transcripción de los genes.
El primer sistema descubierto por François Jacob y Jacques Monod en la década del
50 fue el control de las enzimas de la lactosa. El metabolismo de la lactosa requiere de
dos enzimas: una permeasa, para transportar la lactosa dentro de la célula, y una -
galactosidasa para desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa. La permeasa y -
galactosidasa son codificadas por dos genes contiguos, Z e Y, respectivamente. Un
tercer gene denominado A, codifica la enzima Transcetylasa, la cual no es requerida
para el metabolismo de la lactosa. Los tres genes son transcriptos en una sola molécula
de ARNm multigénica (policistrónico) (Fig. 30).
El gen I, adyacente a Z, Y y A, codifica una proteína represora, la cual bloquea la
expresión de Z, Y y A. El represor se liga a la región del ADN cercana al comienzo del
gen Z y cerca del punto de inicio de la transcripción del ARNm. Este sitio se denomina
operador. Esto impide el inicio de la transcripción a través de la ARN polimerasa.
Normalmente la ARN polimerasa se liga a la región de ADN denominada Promotor. El
segmento POZYA constituye un Operón, es decir una unidad genética de expresión
coordinada (Fig. 30).
Figura 30. Regulación del operon lac. El gen I produce la proteína represora en forma
continua. El represor se une a la región O (operador) impidiendo que la ARN
polimerasa unida a P (la región promotora) transcriba los genes adyacentes. Cuando la
lactosa está presente, esta se une al represor y cambia su forma de tal manera que el
represor no se pueda unir al operador. La ARN polimerasa es entonces capaz de
transcribir los genes estructurales Z, Y, y A, y las tres enzimas son producidas.
El represor lac posee dos sitios de reconocimiento: uno que reconoce la secuencia
específica del operador en el operón lac (Fig. 31), y el otro que puede reconocer la
lactosa o análogos de la lactosa. Cuando el represor se une a derivados de la lactosa,
éste sufre un cambio conformacional de tal forma que el represor pierde afinidad por el
operador. Esto satisface el segundo requerimiento para el sistema de control.
Figura 31. Estado funcional del el operon lac en Escherichia coli silvestre (wild-type)
creciendo en ausencia de lactosa.
El auxilio de la represión para sistemas como el lac se los llama Inducción; en el
cual derivados de la lactosa inactivan al represor y conducen a la expresión de los genes
lac (Inductores) (Fig. 32). Existen otros sistemas bacterianos operados por moléculas
proteicas activadoras, las cuales se unen al ADN como un prerrequisito para la
transcripción.
Figura 32. Estado funcional del operon lac en E. coli silvestre (wild-type) creciendo
en presencia de lactosa como única fuente de carbono.
Figura 34. Efecto de dominancia en Cis de la mutación lacOc en una raza de E. coli
diploide parcial. (a) En ausencia del inductor, el operon lacO+ está apgado, mientras el
operon lacOc produce -galactosidasa funcional a partir del gen lacZ+ y permeasa no-
funcional del gen lacY- con una mutación con pérdida de sentido. (b) En presencia del
inductor, la -galactosidasa funcional y la permeasa defectiva son producidas del
operon lacOc, mientras el operon lacO+ produce -galactosidasa no-funcional a partir
del gen lacZ- (mutación sin sentido) y permeasa funcional a partir del gen lacY+. Entre
los dos operones en las células, -galactosidasa y permeasa funcional son producidas.
Figura 35. Efecto de una mutación lacI-. (a) Efecto sobre la expresión del operon lac en
una célula haploide, donde el mutante, una molécula represora Lac inactiva no puede
unirse a el operador lacO+, de tal forma que los genes estructurales son transcriptos
constitutivamente. Efecto en una raza diploide parcial lacI+ lacO+ lacZ- lacY+ / lacI-
lacO+ lacZ+ lacY-. (b) en ausencia del inductor o (c) en presencia del inductor.
5.3. Control positivo del Operon lac
En el operón lac, la proteína represora ejerce un efecto negativo sobre la expresión
de los genes lac, bloqueando la acción de la ARN polimerasa en ausencia del inductor.
Existe un sistema de control positivo que regula la expresión del operón lac. Este
sistema permite que el operón lac se exprese a altos niveles si la lactosa es la única
fuente de carbono y nada de glucosa se encuentra presente.
Una proteína llamada proteína activadora de catabolitos (CAP) se une con AMP
cíclico (cAMP) para formar un complejo CAP-cAMP. Este complejo es la molécula
reguladora positiva. El complejo CAP-cAMP se une al sitio CAP, el cual se ubica “río
arriba” del sitio de unión de la ARN polimerasa al promotor. La unión provoca que el
ADN se doble, facilitando las interacciones proteína-proteína entre el dominio activado
de CAP y sitios específicos sobre la ARN polimerasa, produciendo la activación de la
transcripción (Fig. 36).
Figura 37. Control negativo y positivo del operon lac por el represor lac y la proteína
activadora de catabolito, respectivamente. (a) en ausencia de lactosa que sirve como un
inductor, el represor Lac se une al operador; más allá de los niveles de cAMP y la
presencia de CAP, la producción de ARNm está reprimida. (b) Con lactosa presente
unida al represor, el represor es incapaz de unirse al operador; sin embargo, pequeñas
cantidades de ARNm son producidas debido a que la presencia de glucosa baja los
niveles de cAMP, y entonces el complejo cAMP-CAP no se forma y une al promotor.
(c) con el represor inactivado por la lactosa y con altos niveles de cAMP presente (en
ausencia de glucosa), cAMP se une a CAP. El complejo cAMP-CAP es entonces capaz
de unirse al promotor; siendo activado el operon lac, y grandes cantidades de ARNm
son producidas.
5.4. Regulación de la expresión génica en Eucariotas