PRACTICA N° 4

GLUCOGENO HEPATICO

RELACION DE EXPERIMENTOS

1. Determinación de glucógeno hepático en animal alimentado

2. Determinación de glucógeno hepático en animal en ayunas
3. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con adrenalina
4. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con aloxano

INTRODUCCION

El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable. Al

igual que la amilopectina del almidón, es un polisacárido ramificado, constituido por
unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) , y ramificaciones ligadas por
enlaces alfa (1-6). Las ramificaciones están separadas unas de otras por lo menos cuatro
residuos en las porciones más centrales de la molécula haciéndola más compacta.

El glucógeno, polisacárido de reserva, se encuentra en los tejidos animales, pero abunda

especialmente en el hígado y en el músculo. Aparece en las células como partículas discretas,
las cuales evidentemente son agregados de moléculas con un peso molecular que varia
alrededor de 2 X 107. La cantidad de glucógeno varia ampliamente, no solamente entre
diferentes tejidos, sino también dentro de un mismo tejido, dependiendo del suministro de
glucosa y de la demanda metabólica de energía. El hígado y el músculo contienen los más
grandes depósitos de glucógeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de su metabolismo en
estos órganos.

En general la dieta afectará más el contenido de glucógeno del hígado que el del músculo,
mientras que el ejercicio físico afectará más el contenido de glucógeno muscular que el del
hígado. Además los depósitos de glucógeno hepático y muscular tendrán diferentes roles. El
glucógeno muscular esta presente para servir como una reserva de combustible para la
síntesis de ATP dentro del músculo, mientras que el glucógeno hepático funcionará como
una reserva de glucosa para el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre
(glicemia).
 Un valor típico para el contenido de glucógeno hepático en una persona bien alimentada
es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos después del ayuno y mucho más
después de una dieta rica en carbohidratos. El músculo esquelético típicamente tiene
1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho después del ayuno nocturno o con una dieta
rica en carbohidratos.

El glucógeno hepático puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacáridos

(glucogénesis), como también de residuos provenientes del metabolismo intermediario de
los hidratos de carbono, proteínas y lípidos (gluconeogénesis). Las vías de síntesis de
glucógeno (glucogénesis) y de degradación hasta glucosa (glucogenolisis), son
independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del
glucógeno actúen independientemente.

La glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de síntesis

y degradación de glucógeno respectivamente. Ellas son reguladas recíprocamente; cuando
una es estimulada, la otra es inhibida, nunca están completamente activas simultáneamente.

Síntesis de glucógeno favorecida

GLUCOGENO SINTEASA A ACTIVA OH

GLUCOGENO FOSFORILASA B INACTIVA OH

Pi ATP

H 2O ADP
GLUCOGENO FOSFORILASA A ACTIVA O-P

GLUCOGENO SINTEASA B INACTIVA O-P

Degradación de glucógeno favorecida

Regulación recíproca de la glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa por fosforilación

y defosforilación. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P

OBJETIVOS:
1. Realizar la determinación de glucógeno hepático
 2. Cuantificar los niveles de glucógeno hepático en diferentes estados nutricionales y
hormonales:
- Animal alimentado normalmente (ad libitum)
- Animal en ayunas

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES

a) Rata A: Que recibirá su alimentación habitual sin restricción alguna.

b) Rata B: Que permanecerá en ayunas por lo menos 24 horas antes del experimento.
c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025
mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipación a la
práctica. Utilizar una solución de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectará por vía subcutánea una
solución de aloxano ( 50 mg / ml ) a razón de 200 mg / Kg de peso.

2. EXTRACCIÓN DEL GLUCÓGENO

Método: Método de krisman

Fundamento:

Se trata un trozo de tejido hepático con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo
degradadas las proteínas y otros constituyentes; quedando preservado el glucógeno, el cual
es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinación
colorimétrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reacción con la presencia del cloruro de
calcio.

Reactivos:

1. Solución iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio.

Disolver en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de
calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solución de cloruro de calcio con 0,5 ml
de la solución iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 °C, durante siete días
máximo.

Procedimiento:
1. En un tubo de centrífuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un baño
maría hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitación y tan rápido como sea posible extraer el
hígado y pesar 100 mg de él. Colocar inmediatamente el trozo de hígado en la
solución de KOH que se encuentra en el baño hirviente y dejarlo allí por 20
minutos, agitando de vez en cuando para permitir la disgregación del tejido.
3. Retirar el tubo del baño y enfriar. Añadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y calentar
la solución hasta la ebullición teniendo cuidado que no se proyecte. Enfriar
inmediatamente en baño de hielo por 5 minutos, para permitir la precipitación del
glucógeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el tubo
boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de álcali añadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y
mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solución
añadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo

6. Preparar un blanco para lo cual se mide 0,4 ml de agua destilada y 2,6 ml del
reactivo de yodo; proceder enseguida igual que las muestras problema.
7. Colocar el tubo en baño maría hirviente durante 15 minutos y enfriar. Añadir 0,2
ml de agua destilada y 2,6 del reactivo de yodo. Si la cantidad de glucógeno
precipitado es grande, hacer en esta etapa una dilución apropiada.
8. Medir la absorbancia utilizando filtro verde
9. Para preparar las soluciones estándar se pueden medir 0,4 ml de soluciones que
contengan 0,06 mg, 0,18 mg 0,24 mg de glucógeno. A cada una de estas tres
soluciones estándar, añadir 2,6 ml del reactivo de iodo , mezclar y proceder de la
misma forma que la señalada para la muestra de hígado.

Resultados.
1. Anotar el aspecto y tamaño del hígado de los animales de experimentación
Rata A: ...........................................
Rata B: ............................................

2. Observar la cantidad de precipitado después de centrifugar.

Absorbancia Absorbancia Concentración Factor de

bruta neta de Glucógeno calibración
(mg)
BLANCO 0.118
ESTANDAR 1 0.192
ESTANDAR 2 0.338
ESTANDAR 3 0.416

3. Calcular el factor de calibración: ..........................

4. Graficar la curva de calibración con los datos anteriores. Utilizando papel

milimetrado
 5. Calcular la concentración de glucógeno en cada una de las muestras Expresar los
resultados en mg de glucógeno por 100 mg, 200 mg y en el peso total del tejido
hepático
Peso del Ab Bruta Ab CONCENTRACION en mg
hígado Neta / 100 mg / Hígado
(mg) Hígado Total
Rata A 5.35 1.20
(Alimentado )
Rata B 4.50 0.50
(ayunas)
Rata C 4.32 0.44
(trat. con adrenalina)
Rata D 3.98 0.38
(trat. con aloxano)
6. Calcular el porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg de hígado con
relación al animal alimentado

mg de glucógeno/ Porcentaje de disminución en

100 mg de hígado relación al animal alimentado
RATA A
RATA B
RATA C
RATA D

7. Haga la interpretación de los resultados para cada rata:

Rata A:

Rata B:

Rata C:

Rata D

INTEROGANTES

1. ¿Qué ventaja tiene la fosforólisis del glucógeno en comparación con la hidrólisis.

2. ¿Qué diferencia hay entre la acción glucogenolílitica de la adrenalina y glucagon en el

hígado y en el músculo.
3. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la adrenalina sobre la
regulación en el metabolismo del glucógeno.

3. Si se administra leucina marcada con C-14 será factible ala identificación posterior de
glucógeno marcado con C-14.

4. ¿Cómo se explica que el animal diabético tenga menores niveles de glucógeno hepático
que su contraparte normal.

5. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la insulina sobre el

metabolismo del glucógeno.

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