Universidad Nacional de La Pampa

Facultad de Ciencias Veterinarias

Departamento de Ciencias Básicas

CÁTEDRA DE HISTOLOGÍA I

Apuntes de Histología

Microscopia y Técnica Histológica

Año 2023

Título: Apuntes de Histología. Microscopia y Técnica Histológica

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Autores: Mg. Valeria Buey; MV. Mónica García; MV. Daniel Lacolla.
Cátedra: Histología I
Departamento de Ciencias Básicas
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Pampa

Foto de portada: https://biositio.com/biologia/histologia/

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 MICROSCOPÍA
El estudio de las células y los tejidos se ve dificultado en primer término por el tamaño celular. Con
pocas excepciones, la mayoría de las células son de un tamaño muy pequeño, indistinguibles como tales
al ojo humano.
Es necesario, por lo tanto, el uso de aparatos denominados MICROSCOPIOS, que tienen la virtud de
amplificar las imágenes.
El concepto mismo de CÉLULA surgió gracias a la invención de estos aparatos que datan del siglo XVII, y
que todavía son de uso corriente e irremplazable en citología e histología.
Clásicamente se consideran dos tipos básicos de microscopios: ÓPTICO y ELECTRÓNICO.

MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO (MOC)

El microscopio óptico es el instrumento más utilizado para la observación de células y tejidos. La

denominación de "compuesto" se debe a que está integrado por dos sistemas de lentes acoplados. Se
lo denomina también microscopio de luz o fotónico, por utilizar rayos luminosos del espectro visible. Los
especimenes se observan por transparencia (transiluminación) en la forma corriente de extendidos de
células libres o finísimos cortes de tejidos. La luz atraviesa el objeto a observar, ingresando luego a un
sistema de lentes que determinan que se forma una imagen final aumentada.
El microscopio óptico brinda detalles de la estructura celular o tisular.
Todo microscopio óptico consta de una parte mecánica y una parte óptica. La parte mecánica sostiene a
la parte óptica, a la preparación a observar, y permite los movimientos destinados a un correcto
enfoque e iluminación.
La parte óptica incluye sistemas de lentes, cuya función es canalizar los rayos luminosos hacia la
formación de una imagen aumentada del espécimen en estudio.
Antes de comenzar con una descripción mas detallada del microscopio óptico conviene familiarizarse
con las unidades de medida que más se utilizan en microscopio, y que serán de uso corriente durante el
presente curso. Al respecto, el siguiente cuadro sinóptico resume las unidades, símbolos, equivalencias y
utilidad de cada una:

Unidad Símbolo Equivalencia Para medir

Centímetro cm 0.01 m Algunos huevos (la yema del huevo de gallina es una célula)
Milímetro mm 0.1 cm Células grandes: musculares, prolongaciones neuronales
Micrómetro m 0.001 mm Células, núcleos, organoides grandes
Nanómetro nm 0.001 m Organoides pequeños, macromoléculas, virus
Ángstrom A 0.1 nm Moléculas, átomos

Unidades de medida en microscopia

Algunos valores a modo de ejemplo

Los glóbulos rojos tienen un diámetro de unos 7 m en casi todos los mamíferos. Por estar presentes en
casi todos los cortes de tejidos son de gran utilidad como unidad para estimar magnitudes relativas en el
microscopio óptico.
Un ovocito de un mamífero mide aproximadamente 100 m de diámetro., un espermatozoide 60 m de
largo, la membrana celular 75 nm, una bacteria 1.5 m.

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Partes del microscopio óptico compuesto

El MOC está formado por dos partes básicas: la mecánica (que incluye el pie, la columna, el tubo, la
platina y la subplatina) y la óptica (fuente de luz, condensador, lentes objetivos y oculares).

Parte mecánica:

a) PIE: Punto de apoyo a la mesa. Suele ser pesado para asegurar la estabilidad.
b) COLUMNA: relaciona el pié con el resto de los elementos. En algunos microscopios está dividida por
una articulación móvil (charnela) en pilar y brazo. Sobre la columna están los tornillos de enfoque
macrométrico (de movimiento rápido) y micrométrico (de movimiento lento)
e) TUBO: Soporta al sistema de lentes superior (ocular) e inferior (objetivo). Puede tener un cabezal
móvil.
d) PLATINA: Plataforma de metal, plana, con un orificio circular central. Destinada a sostener la muestra
a observar. En histología, las muestras son finísimas rebanadas de tejido, teñidas con colorantes
especiales, adosadas sobre vidrios rectangulares (portaobjetos), y protegidas con otros vidrios más
pequeños y delgados (cubreobjetos). El orificio de la platina permite el pasaje (desde abajo) de los rayos
luminosos para que atraviesan el preparado histológico y permitan la formación de la imagen. Existe un
dispositivo (charriot) destinado a sujetar el portaobjeto y a darle movilidad mediante dos tornillos.
e) SUBPLATINA: Es un conjunto de elementos situados por debajo de la platina que incluye: diafragma
(que permite regular el pasaje de luz), soporte móvil para el condensador y aro portafiltros. Por debajo
de la platina se sitúa el espejo, que permite dirigir los rayos luminosos hacia el eje óptico del aparato.

Microscopio óptico compuesto Olympus donde se muestran sus principales partes.

Parte óptica:

a) FUENTE DE LUZ: Puede ser natural o artificial. Este último caso es el más común. Muchos MOC tienen
fuente de luz incorporada. Si la fuente es externa, el microscopio posee un espejo redondo, móvil
destinado a dirigir los rayos hacia el eje óptico del aparato.
b) CONDENSADOR: Es un sistema de lentes convergentes ubicado en la subplatina, cuya función es
concentrar los rayos luminosos en forma de cono a nivel de la preparación a observar. Habitualmente
puede subirse o bajarse para lograr mayor o menor concentración del haz.
c) OBJETIVOS: Son sistemas de lentes acoplados que globalmente se comportan como una lente
convergente. Los microscopios suelen tener varios objetivos, de distintos aumentos e intercambiables

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mediante un "revolver". Los objetivos de mayor uso son los de 4x, l0x, 25x, 40x y 100x. Los objetivos de
100x son los de máximo aumento y se los denomina de inmersión, dado que se requiere intercalar una
gota de aceite especial (del mismo índice de refracción que el vidrio), entre la preparación y la lente
frontal del objetivo. Los objetivos de aumentos menores no suelen necesitar aceite y se denominan
secos.
Los objetivos, producen una imagen real, aumentada e invertida del objeto. La combinación de varios
lentes de distinto poder dispersivo está destinada a corregir las aberraciones (aromática y de
esfericidad), brindando así imágenes nítidas en toda la superficie del campo de observación.
d) OCULARES: Son las lentes superiores del microscopio. Los más comunes se componen de dos lentes
convergentes entre las cuales se ubica un diafragma fijo y son de 7 a 15x, por lo común 10x. Hay
microscopios mono y binoculares.
La imagen del objetivo es recogida por el ocular, que forma otra imagen que es virtual, aumentada, y
derecha respecto a la del objetivo, y es la que capta el ojo del observador o sea que, en conjunto, el
microscopio óptico compuesto produce una imagen virtual, aumentada, e invertida respecto del objeto.

Microfotografía obtenida al microscopio óptico donde se observan

túbulos renales.

Cálculo del aumento del MOC

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.

PODER DE RESOLUCIÓN Y LÍMITE DE RESOLUCIÓN

Poder de resolución se define como la capacidad de un sistema óptico para mostrar como separados a
dos puntos situados a muy pequeña distancia entre sí. Es decir, su capacidad para discriminar detalles.
Se lo expresa corrientemente mediante su inversa, el límite de resolución, que se define como la
mínima distancia que debe existir entre dos puntos para que aparezcan como individualizados. El límite
de resolución de los mejores microscopios ópticos es de unos 0,2 m. Dos puntos separados por .una
distancia menor que 0,2 m se verán como uno solo al MOC. El límite de resolución del ojo humano es
de 0.2 mm.

Calculo del límite de resolución del MOC

donde:
Se calcula mediante la siguiente fórmula:

k.
LR: Límite de resolución

LR 
k : Constante estimada en 0,61
: Longitud de onda de la luz
AN empleada.(para la luz visible 380 a
700 nm)
AN: Abertura numérica del objetivo
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La abertura numérica es un valor que viene inscripto en la montura del objetivo. Depende de las
características de construcción de la misma y se calcula mediante la fórmula:

AN n . seno 

donde:

n: Indíce de refracción del medio interpuesto entre el objeto y la lente

 : Semíángulo de apertura (Fig. 2)

Esquema de lente objetivo donde se muestra el semiángulo de apertura ().

La abertura numérica expresa la mayor o menor capacidad del objetivo de captar rayos de luz para la
formación de una imagen. De la fórmula de Limite de Resolución (LR) se desprende que éste será menor
cuanto menor sea  y cuanto mayor sea la APERTURA NUMÉRICA (AN) del objetivo. Por lo tanto para
aumentar el poder resolutivo (o para disminuir el LR que es su inversa) se debe o bien disminuir , lo
que se logra utilizando radiaciones que tengan longitudes de onda menores, como la luz ultravioleta o
los electrones, o aumentar la AN utilizando, en el caso de los microscopios ópticos objetivos con
aceite de inmersión.
El aceite de inmersión, al tener el mismo índice que refracción del vidrio, evita que los rayos de desvíen
hacia el exterior incorporando mayor cantidad de ellos para formar la imagen, dicho de otra forma,
aumenta la AN.

MICROSCOPIOS ÓPTICOS ESPECIALES

Existen microscopios de luz que permiten realizar observaciones de estructuras o elementos que el MOC
no podría lograr. Se enumeran a continuación algunos de ellos y sus fundamentos básicos y utilidades.
Microscopio de fondo oscuro
Los rayos de luz inciden en forma oblicua, o sea no atraviesan el objeto, que se ilumina y aparece
brillante y claro sobre el fondo no iluminado. Sirve para ver elementos muy pequeños, como bacterias.

Microscopios de fluorescencia y de luz ultravioleta

Emplean luz ultravioleta que no es visible al ojo humano.. El observador debe protegerse su vista puesto
que los rayos ultravioletas la dañan. El microscopio de fluorescencia permite detectar sustancias
fluorescentes, se usa en inmunohistoquímica e histoquímica. El microscopio de luz ultravioleta al
utilizar este tipo de luz (que tiene una longitud de onda de 200 nm, que es menos de la mitad de la

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longitud de onda de la luz visible de 380 a 700 nm), disminuye el limite de resolución a 0.1 m. La
imagen se forma en una placa fotográfica. Se usa por ejemplo, para detectar ácidos nucleicos.

Microscopio de luz polarizada

Utiliza dos cristales especiales llamados prismas de Nicol que hacen vibrar la luz en un solo plano (la
polarizan). Cuando una sustancia es atravesada por la luz polarizada a la misma velocidad cualquiera sea
el plano de incidencia a de la luz, se dice que es monorrefringente o isótropa. Si esa velocidad varía
según la incidencia de la luz, es birrefringente o anisótropa. La fibras colágenas, y las bandas A de los
sarcómeros de las fibras musculares estriadas son anisótropas.

Microscopio de contraste de fase

Transforma las diferencias de fase de las ondas que atraviesan un objeto en diferencias de brillo. Esto
permite aumentar el contraste en componentes celulares vivos sin necesidad de teñirlos.

Microscopio de contraste interferencial

Es similar al anterior, Agrega la posibilidad de contar con imágenes coloreadas y cuantificar la masa de
los elementos celulares a través de su densidad óptica.

Microscopio confocal
Es capaz de obtener imágenes tridimensionales de la célula. Se utiliza un láser como fuente luminosa, y
con él se va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imágenes
bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del
objeto.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Utiliza como fuente de radiación un haz de electrones en lugar de luz, cuya longitud de onda es 0.1 nm,
lo que permite disminuir notablemente el límite de resolución. Es el instrumento que permite la
observación de los detalles mas fino de tejidos y células. Permite ver con claridad organoides,
componentes de membranas, virus, macromoléculas. O sea, brinda detalles de la ultraestructura
celular o tisular.
Hay varios tipos de microscopios electrónicos que ofrecen distinto tipo de información, entre ellos:
microscopio óptico de transmisión (MET o TEM ), microscopio electrónico de barrido (SEM, MEB o
Scanning), microscopio electrónico de alto voltaje, microscopio explorador de efecto túnel, microscopio
de fuerza atómica, etc. Se describen los mas utilizados.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

El un gran tubo mayor de 1 metro de largo, de disposición vertical (ver Fig. 3) que contiene:
a) CÁTODO o FUENTE EMISORA DE ELECTRONES: es un filamento de tungsteno calentado
eléctricamente que emite electrones. Se ubica en la parte superior del tubo.
b) ÁNODO: acelera los electrones que forman un haz que se dirige hacia la parte inferior del tubo.
c) BOBINAS ELECTROMAGNÉTICAS: son tres y se disponen a lo largo del tubo. Hacen las veces de lentes:
lente condensador, que concentra el haz de electrones, este atraviesa la muestra y es captada por el
lente objetivo, que aumenta la imagen y lente de proyección, que recibe y aumenta la imagen anterior
y la proyecta sobre una pantalla fluorescente.
d) PANTALLA FLUORESCENTE: captan la imagen y permiten su visualización.
e) SISTEMA DE ALTO VACÍO: extrae constantemente el aire del tubo para impedir que se dispérsenlos
electrones y estos puedan circular sin obstáculos.

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Funcionamiento básico: la muestra (que es un corte ultrafino) es atravesada por electrones y según su
densidad son mas o menos dispersados o absorbidos. Las bobinas, que actúan como lentes, modifican la
trayectoria del haz que termina impresionando una pantalla fluorescente o una placa fotográfica. Las
fotografía obtenidas, que brindan imágenes en blanco y negro, pueden ser ampliadas. La zonas oscuras
señalan zonas donde los electrones han sido muy desviados y las claras menos desviados. Fig. 4
El MET posee un gran poder de resolución (su LR puede llegar 1 A) puesto que la longitud de onda de la
radiación utilizada es muy pequeña. Es equivale a que es capaz de aumentar una muestra en casi
1.000.000 de veces, frente a 2000 veces que puede lograr un Microscopio óptico. La desventaja del MET
es que las técnicas para preparar el material son complejas y costosas, así como su mantenimiento y
uso. Además no permite observar estructuras vivas por el alto vacío al que son sometidas las muestras y
no pueden ser coloreadas porque las moléculas del colorante dificultarían el paso de los electrones.

Microscopio electrónico de Microscopio electrónico de transmisión. Mitocondria

transmisión. Imagen tomada de y retículo endoplásmico rugoso. Imagen tomada de
www.cecyt15.ipn.mx www.med.uva.es

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

El SEM ofrece una imagen tridimensional de la superficie externa de células o tejidos (Fig. 5). Su poder
de resolución no es tan alto como en el MET , siendo su LR 25 nm. Logra aumentos de alrededor de
30.000 veces pero tiene una gran profundidad de foco lo que permite ver con detalles células, tejidos y
hasta insectos pequeños. En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una
capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la
cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de
mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de televisión.

Microscopio electrónico de barrido. Linfocito. Imagen tomada de www.ugr.es

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TÉCNICA HISTOLÓGICA

La técnica histología consiste en una serie de pasos cuyo resultado es la preparación de material para
poder observarlo en algún tipo de microscopio. Es sumamente útil no solo para el estudio histológico de
células y tejidos sino también como invalorable elemento de diagnóstico histopatológico.
Existen diferentes técnicas para poder observar células o tejidos, en estado vivo o post mortem. En
histología se utilizan generalmente, técnicas post mortem, las que permiten observar células o tejidos
que han sido separados de un animal o sea muestras que no tienen vida.
Estas técnicas deben garantizar por un lado la posibilidad de apreciar la mayor cantidad posible de
detalles y por otro la preservación de la estructura original. Esto último es fundamental ya que si la
estructura original es alterada su estudio no será posible o inducirá a errores.
Se describe a continuación la técnica histológica de rutina para microcopia óptica, que es la más
frecuente para confeccionar las preparaciones que se observan en los trabajos prácticos y se enumeran
luego otras técnicas para microscopía óptica.

Técnica histológica de rutina para microcopia óptica

Sus pasos son:

1. Toma de muestra
2. Fijación
3. Deshidratación
4. Aclaración
5. Inclusión
6. Confección del taco
7. Corte
8. Montaje
9. Coloración
10. Montaje final

1. Toma de muestra

Es un paso trascendental ya que un error en el mismo puede invalidar los pasos siguientes o inducir a un
falso diagnóstico final. Requiere de ciertos conocimientos anatómicos ya que por ejemplo si se desea
tomar una muestra de una glándula salival y equivocadamente se toma una de un ganglio de la zona
obviamente los resultados de la observación serán muy diferentes. También requiere cuidado, alguna
destreza y diligencia. Este paso y el siguiente suelen ser los únicos que hace el veterinario, a campo o en
la clínica ya que el resto se realiza en el laboratorio de histología o histopatología.
La muestra puede obtenerse de un animal vivo, esto es una biopsia o de un cadáver al realizar una
necropsia.
Al tomar una muestra para su estudio histológico o histopatológico se debe tener en cuenta:
Tamaño: en general no debe exceder el cm3 ya que los fijadores que se utilizan en el paso siguiente no
podrían penetrar correctamente si la muestra fuera mas grande pudiéndose esta, alterarse. Si la misma
fuera mayor deben realizarse cortes que permitan la penetración del fijador.
Incisión: al tomar la muestra los cortes deben ser netos, utilizando elementos filosos como un bisturí o
tijera bien afilada, evitando arrancamientos, aplastamiento que la deformen. Pueden usarse pinzas
atraumáticas.

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Elección del material: debe elegirse una zona representativa de todo el órgano a estudiar. Para estudios
histopatológicos la muestra debe contener tejido sano y alterado.
Tiempo: debe realizarse con premura para poder pasar rápidamente al siguiente paso o fijación.

2. Fijación

Cuando una muestra es separada del animal vivo, sus células mueren rápidamente. Lo que ocurre es
que al no recibir su correspondiente irrigación, se desestabilizan sus membranas, liberándose entro
otras, las enzimas lisosómicas que causan su propia destrucción. Este fenómeno se conoce como
autólisis y comienza rápidamente al morir la célula y su resultado es el deterioro de la arquitectura
normal de la misma. Algo similar, aunque posteriormente, ocurre por acción de las enzimas de
microorganismos del ambiente que colonizan rápidamente a la muestra, esto es la putrefacción La
fijación consiste en someter a la muestra a un proceso que impida la autolisis y la putrefacción, con el
objeto de conservar la misma en un estado similar al que tenía mientras estaba con vida. Obviamente
debe realizares rápidamente pues estos procesos comienzan cuando las células mueren. Por ejemplo las
células nerviosas se alteran a los 5 minutos, otros tejidos, muscular, conectivo, se deterioran a los 20
minutos. No tiene sentido para realizar un estudio histológico o histopatológico común, tomar una
muestra de un individuo muerto hace 24 horas.
Existen dos métodos de fijación, la fijación física y la fijación por agentes químicos.
La fijación física consiste en someter a la muestra al frío e incluso a la congelación a los efectos de
impedir la acción de las enzimas. El método mas conocido es el de congelación-desecación, que consiste
en congelar rápidamente la muestra y luego deshidratarla en frío y al vacío. Se coloca la muestra a
temperatura de -160 oC a -190 oC, en nitrógeno líquido, por ejemplo, y luego se deshidrata a -40 oC. Se
utiliza cuando se quieren estudiar la composición química o la presencia de enzimas, que son
preservadas de esta forma Al actuar ser muy rápidamente, suele ser útil para procesar una muestra
durante una cirugía, cuando se requiere de un diagnóstico urgente.
Ese a ser un excelente método, tiene escaso uso en histología, por su poca practicidad y porque los
métodos físicos son sumamente eficaces.
La fijación por agente químicos consiste en hacer actuar sobre la muestra sustancias químicas llamadas
fijadores o mezclas fijadoras. Estos coagulan las proteínas y estabilizan las membranas celulares
impidiendo toda actividad enzimática, evitando la autólisis de la muestra. Los fijadores químicos deben
reunir algunas condiciones para ser efectivos:

 Buena conservación de los componentes celulares y extracelulares

 Rapidez de acción y buen poder de penetración
 No interferir en pasos posteriores de la técnica histológica
 Fácil adquisición y preparación
 Bajo costo

El fijador que reúne mejor estas condiciones es el formol o formaldehído, que se prepara al 10%, o sea
1 parte de formol y 9 de agua corriente.
Otras sustancias como el alcohol etílico, el alcohol metílico, el bicloruro de mercurio, etc, se han
utilizado como fijadores pero en realidad no son buenos y solo se suelen utilizar en mezclas fijadoras.
Las mezclas fijadoras combinan propiedades de sus componentes para obtener algún beneficio. Las mas
conocidas son el líquido de Bouin (contiene ácido pícrico, formol y ácido acético), el líquido de Zenker
(bicloruro de mercurio, bicloruro de potasio, sulfato de sodio, ácido acético yagua destilada), el de Helly
((bicloruro de mercurio, bicloruro de potasio, sulfato de sodio, formol y agua destilada), etc.
En la práctica, este paso consiste en colocar la muestra convenientemente tomada en un recipiente que
contenga el fijador. Se debe tener en cuenta:
Tipo de recipiente: de boca ancha, que permita introducir fácilmente la muestra sin presionar, con tapa
a rosca o hermética. De vidrio o plástico, no utilizar elementos metálicos por que se oxidan fácilmente.

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Volumen del fijador: debe ser entre 20 a 1 a 40 a 1 con respecto al volumen de la muestra. Conviene
agregar la muestra al frasco conteniendo el fijador y no al revés para evitar que la misma se adhiera la
sus paredes. La muestra debe estar totalmente sumergida, Identificación de la muestra: el frasco debe
estar rotulado con todos los datos que se crean convenientes: datos de propietario o establecimiento,
del paciente (especie, sexo, raza, edad), datos del material enviado (órgano, color, aspecto
macroscópico, tamaño, consistencia), si existiera un diagnóstico presuntivo, fijador utilizado, fecha de la
toma de muestra y remisión al laboratorio. Es conveniente utilizar varios frascos pequeños con una
muestra en cada uno, si se colocan varias en un mismo recipiente debe identificarse correctamente.
Duración de la fijación: para una muestra de 1 cm3 la fijación se completa a las 24 horas. Este tiempo
puede reducirse si la muestra es mas pequeña. El material fijado dura años si se vigila que no se evapore
el fijador y que la muestra no se adhiera al frasco.
Otras consideraciones: puede ser conveniente lavar la muestra antes de colocarla en el frasco con
fijador, sobre todo si se trata de una víscera hueca. En este caso hacerlo con agua corriente y muy
suavemente para retirar el material orgánico que puede dificultar la fijación. Si la muestra fuera una
serosa, como el peritoneo, para evitar que se arrugue y fije de esta forma, puede colocarse sobre un
trozo de telgopor, sostenido por palillos de madera, sumergiendo lo en el fijador. Si la muestra flotara,
como el pulmón, puede colocarse algodón en la parte superior de modo que este la mantenga siempre
sumergida.

Fijación química

Luego de realizada la fijación, antes de proseguir con el paso siguiente, debe lavarse la muestra, con
agua si el fijador usado es el formol, para retirar el mismo.
Hasta este momento, nos encontramos con un trozo de órgano o tejido fijado y lavado,, sumergido en
agua corriente. Nuestro objetivo es obtener una laminilla muy delgada de la muestra para poder
observarla al MOC y apreciar su estructura. Para obtener estas láminas debemos congelar la muestra o
incluirla en algún material que le brinde soporte y le confiera rigidez. El medio de inclusión de rutina en
histología es la parafina. Como esta no es soluble en agua debe deshidratarse previamente la muestra
con alcoholes y luego aclararse en un solvente orgánico que sea soluble tanto en alcohol como en
parafina. Para esto se realizan los pasos de deshidratación y aclaración.

3. Deshidratación

Su objetivo es eliminar el agua de la muestra. Se realiza en recipientes con alcoholes de graduación

creciente:
Alcohol 70, Alcohol 96, Alcohol 100.
Es conveniente agitar el frasco varias veces durante la deshidratación.

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4. Aclaración

Se realiza con solventes orgánicos (xilol, benzol o toluol) que son miscibles tanto en alcohol como en
parafina. Es un paso intermedio entre la deshidratación y la inclusión en parafina. Se realiza para que
la parafina pueda penetrar en la muestra al realizar la inclusión. Si no se realizara, la parafina quedaría
solo en la superficie y el tejido quedaría blando en el interior.

5. Inclusión en parafina

La parafina es un hidrocarburo, que a temperatura ambiente es sólida y entre los 45 y 70 grados

centígrados se torna líquida. De esta forma penetra en los tejidos durante la inclusión y les confiere una
consistencia que permite en el momento del corte obtener laminillas delgadas de 3 a 10 micras de
espesor.

6. Confección del taco

Luego de realizada la inclusión, se fabrica un molde, de forma cúbica, se lo llena de parafina líquida y se
coloca dentro de ella la muestra que se extrae de la estufa. Al solidificarse el resultado es un bloque o
cubito de parafina que contiene a la muestra en su interior. Se fija este bloque a un soporte plástico o
de madera para poder manipularlo y colocarlo en el aparato de corte que es el micrótomo. Este paso es
muy delicado y hay que prestar especial atención a como se orienta la muestra en el molde y en que
cara se coloca el soporte ya que esto va influir en el sentido del corte, por ejemplo, no es lo mismo
obtener una lámina transversal de un intestino que una longitudinal.

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7. Corte

Es obtener láminas o rebanadas de 3 a 10 micrómetros de la muestra mediante aparatos complejos

llamados micrótomos. El espesor del corte está en relación al tamaño de las células, que miden
alrededor de 10 micrómetros, un espesor mayor no nos permitiría hacer un correcto foco al observar el
corte en el microscopio. Existen distintos modelos de micrótomos. Estos poseen un receptáculo donde
se coloca la muestra y cuchillas muy delgadas que, mediante un sistema de precisión que permiten
obtener las citadas láminas. Hay micrótomos donde se mueve el taco y la cuchilla está fija y otros donde
el taco está fijo y la cuchilla va pasando sobre él y se van obteniendo las láminas. Hay cuchillas
descartables y otras que pueden afilarse y reutilizarse.

Micrótomo de deslizamiento.

8. Montaje

La rebanada del bloque de parafina conteniendo la muestra obtenida, se coloca sobre una fuente con
aguja tibia para que se despliegue. Luego se toma la misma con una lámina de vidrio o portaobjetos.
Este fue tratado previamente con un pegamento, albúmina de Mayer (clara de huevo y glicerina) o
gelatina que evita que se desprenda. Esta adherencia se completa posteriormente al secar la muestra ya
montada en estufa a 40 grados centígrados.
Tenemos hasta el momento un portaobjeto que contiene adherido en su cara superior una lámina o
corte que se ha obtenido con el micrótomo.

https://www.leicabiosystems.com/es/equipo-histologia/microtomos/leica-
hi1210/

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9. Coloración

Las células y los tejidos sin teñir no permiten apreciar sus estructuras, por su transparencia natural y por
la delgadez del corte. Por eso se utilizan colorantes que son capaces de teñir los distintos componentes
y permiten su visualización. Existen numerosos colorantes histológicos que actúan en general por
afinidad química logrando contrastes fácilmente visualizables.

Las sustancias ácidas de las células o tejidos tienen afinidad por los colorantes básicos. Se dice
que estas sustancias son basófilas.
Las sustancias básicas de las células o tejidos, tienen afinidad por colorantes ácidos. Estas
sustancias son acidófilas.

El término BASOFILIA se refiere a la afinidad que tiene las sustancias ácidas por los colorantes básicos,
mientras que ACIDOFILIA hace referencia a la afinidad de las sustancias básicos por los colorantes
ácidos.

En la mayoría de las células las sustancias ácidas (BASOFILAS) son los componentes nucleares
(cromatina, nucleolo) y los ribosomas, que contienen ácidos nucleicos. Por eso decimos, por ejemplo,
que el núcleo es basófilo. En cambio, en el citoplasma existen proteínas que se comportan como bases
(ACIDOFILAS), por lo que en general se dice el citoplasma es acidófilo. Las células productoras de
proteínas, al tener un gran desarrollo del retículo endoplásmico rugoso y de sus ribosomas, presentan
citoplasma basófilo.

La técnica de coloración, mas utilizada en histología e histopatología, dentro de la técnica de rutina que
se está describiendo, utiliza dos colorantes, uno básico y otro ácido que son la Hematoxilina y la eosina.
Se la conoce como Técnica de Hematoxilina - eosina (H/E), y se detalla a continuación.

La hematoxilina es un colorante natural, que se obtiene de la corteza de un árbol tropical el palo

campeche (Haematoxylum campechianum). No es un componente básico pero actúa como colorante
básico, porque se lo usa junto a sales de aluminio o hierro, que hacen las veces de mordientes y le dan
esa reacción. Tiñe a las estructuras ácidas de las células de color azul o violeta. Las sustancias que se
tiñen con la hematoxilina, al tener afinidad por ella que se comporta como una base, son basófilas. En
general el núcleo de las células es basófilo.
La eosina es un colorante sintético, ácido. Tiñe las estructuras básicas de las células o tejidos de color
rosado. Las sustancias que se tiñen con eosina, al tener afinidad por ella que es un ácido, son
acidófilas o eosinófilas. En general el citoplasma de las células es acidófilo o eosinófilo.

En las preparaciones teñidas con la técnica de H/E, se van apreciar las estructuras celulares y
extracelulares teñidas, según su composición química de colores que varían del azul o violeta al rosado.

Resumiendo:

Colorante Hematoxilina Eosina

Reacción Básica Ácida
Tiñe estructuras Ácidas (Por ej., núcleo) Básicas (por ej. citoplasma)
Color Azul - violeta Rosa
Las estructuras teñidas se
Basófilas Acidófilas o eosinófilas
denominan

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10. Montaje final

El corte coloreado se cubre con una fina laminilla de vidrio llamada cubreobjeto. Se utiliza un
pegamento incoloro y con un índice de refracción similar al vidrio para evitar las distorsiones ópticas. El
Bálsamo de Canadá cumple estas condiciones, y se coloca una gota del mismo entre el porta y
cubreobjeto para proceder al montaje final. Debe tenerse precaución para evitar que se formen
burbujas de aire que dificultarían la visión
Por último debe rotularse la preparación con una etiqueta identificatoria o marcando el portaobjetos
con un lápiz con punta de diamante o con tinta indeleble.

Otras técnicas para microscopía óptica

Existen otras formas de confeccionar preparaciones para microscopía óptica que se utilizan en forma
especial, según la necesidad: se nombran algunas de ellas:
Cortes por congelación: se congela la muestra recién obtenida y se realizan los cortes. Permite obtener
resultados rápidamente, por ejemplo durante una cirugía. Estos deben confirmarse luego utilizando la
técnica de rutina de inclusión en parafina. También se utilizan para poder observar. lípidos o enzimas. En
algunos casos puede utilizarse el crióstato, que en realidad es un micrótomo que funciona dentro de una
cámara cerrada a temperatura de menos 10 a menos 20 oC Se manipula desde afuera de la cámara y
trabaja con muestra congeladas.
Citología exfoliativa: es el estudio de células que se descaman de superficies. Se obtienen mediante
raspajes o improntas. Luego son colocadas sobre un portaobjetos y se tiñen con distintos colorantes. Por
ejemplo las coloraciones de Shorr y Papanicolau.
Técnicas para el estudio de sangre: se realizan extendidos de sangre (frotis) formados por una
monocapa de células (glóbulos rojos, blancos y plaquetas) que se tiñen y luego se observan al
microscopio.
Técnicas para el estudio de huesos:
Descalcificación: como los huesos son sumamente duros por estar la sustancia intercelular ósea
calcificada, deben descalcificarse para poder realizar los cortes en el micrótomo. Se realiza
sometiendo al hueso una solución de un ácido débil (nítrico, pícrico o fórmico). Permite observar
las células y componente orgánicos del hueso.
Desgaste: consiste en lijar el hueso hasta obtener una lámina muy fina que pueda verse al
microscopio. No se colorea o se le agrega una gota de lugol para mejorar los contrastes. Solo
permite observar la arquitectura ósea que esta dada por los componentes inorgánicos.

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Otras coloraciones para microscopía óptica

En ocasiones debe recurrirse a coloraciones especiales que permitan identificar componentes celulares
que no se hacen evidentes con la técnica de H/E.. Se describen brevemente algunas de ellas.

Técnica de P.A.S. (Periodic acid Schiff): se utiliza para distinguir glucosaminoglicanos (Gags) y
glucógeno, sustancias que no se tiñen con H/E. Se somete al corte a la acción de ácido periódico que
expone a los grupos aldehídos presentes en los polisacáridos mencionados. Luego se lava y se trata el
corte con el reactivo de Schiff, que es un colorante, la fucsina que ha sido decolorado previamente con
anhidridido sulfuroso. Los aldehídos presentes recolorean la fucsina y las zonas donde hay Gags o
glucógenos se ven de color fucsia. A estas sustancias se las llama P.A.S. positivas y a las que no se tiñen
P.A.S. negativas. Es, igual que muchas, una técnica histo o histoquímica ya que estudia las características
químicas de células o tejidos.

Técnica de Feulgen: similar al anterior, los cortes se tratan con ácido clorhídrico en lugar de con ácido
periódico. Sirve para identificar ADN. El ácido clorhídrico expone los grupos aldehídos de la
desoxirribosa que luego recolorean la fucsina de color fucsia. Se aprecia el núcleo de este color y el
nucleolo sin teñir.

Técnicas de Sudán: sirven para poner en evidencia lípidos intracelulares. Los colorantes que se utilizan
son el Sudán III o rojo y Sudán IV o negro actúan por afinidad física tiñendo los lípidos de los colores
mencionados. El inconveniente para la visualización de los lípidos es que estos se disuelven en presencia
de solventes orgánicos como los utilizados durante la aclaración. Por esto no puede usarse la técnica de
inclusión en parafina. Se recurre a los cortes por congelación, la muestra obtenida se congela y corta o a
la utilización de crióstatos, en este caso, las muestras se fijan en formol previamente.

Tricrómicos: utilizan combinaciones de tres colorantes, lo que ofrece mayores posibilidades para
diferenciar células o tejidos. Por ejemplo tricrómico de Masson (fucsina Ponceau, azul de anilina y
hematoxilina, tiñe el conectivo de azul claro y el músculo de fucsia), tricrómico de Mallory (azul de
anilina, orange G y fucsina ácida, tiñe algunos fibras y sustancias intercelular de azul, músculo de rojo,
fibras elásticas de amarillo), tricrómico de van Gieson (acido pícrico, fucsina, hematoxilina, tiñe el
colágeno de rojo brillante y los epitelios y músculo de amarillo), etc.

Impregnaciones argénticas: consiste en el depósito de sales de plata sobre estructuras fibrilares de

células o tejidos. Se las utiliza para el estudio del tejido nervioso y de fibras de tejido conectivo.

Colorantes metacromáticos: hay algunos colorantes llamados metacromáticos, que varían su color al
teñir una estructura. Por ejemplo el azul de toluidina, el azul de tionina y el azur A, que tiñen de rojo
rosa o púrpura. Son condiciones para esto que la estructura a teñir contenga grupos fosfato y sulfato y
sea de alto peso molecular. Por ejemplo los glucosaminoglicanos de las sustancia intercelular de los
tejidos conectivos, los gránulos de los basófilos y de los mastocitos.

Técnicas inmunohistoquímicas: son muy específicas ya que se basan en la reacción antígeno-

anticuerpo. Por ejemplo se quiere determinar en qué células de los islotes de Langerhans del páncreas
se produce o almacena la hormona insulina. Para ello se exponen cortes fijados de tejido pancreático a
una solución que contenga un anticuerpo anti-insulina bovina, que a su vez lleva un sistema químico
revelador que puede ser un colorante fluorescente o una enzima que al adicionarle sustrato genere un
producto que se pueda colorear y evidenciar al microscopio. Posteriormente debe lavarse el corte y la
fluorescencia o la coloración aparecerá solo en los sitios donde hay presente insulina.

Técnicas de procesamiento para microcopia electrónica

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1) Procesamiento del material para MET

Los pasos son similares a los que se utilzan para microscopia óptica pero con algunas variantes:

1. Toma de muestra

Debe hacerse rápidamente, sobre todo se es a partir de una necropsia, ya que las alteraciones ultra
estructurales aparecen a los 5 minutos de muerto el animal. No deben ser mayores a 1.5 mm3, por el
bajo poder de penetración de los fijadores que se utilizan.

2. Fijación

Se utiliza glutaraldehído al 2 a 2.5 % y tetróxido de osmio al 1 %, habitualmente en asociación. El

primero produce uniones covalentes entre las proteínas vecinas y el segundo une y estabiliza las bicapas
lipoproteicas de las membranas. También puede usarse la mezcla de Karnovsky, que contiene
paraformaldehído y glutaraldehído.

3. Deshidratación

Se realiza con alcoholes de graduación creciente o acetona o mezcla de ambos compuestos.

4. 5. y 6. Aclaración, inclusión y confección del taco

Se utilizan resinas epoxi, que al polimerizar se tornan sumamente duras, lo que permite realizar cortes
muy finos. Algunas de estas resinas son el Maraglas, la Araldita, el Epon, los polímeros del metacrilato.
Como intermediario (correspondería al paso aclaración para microscopía óptica) se utiliza acetona u
oxido de propileno, que facilitan la penetración. La inclusión se realiza en moldes en forma de pirámide
trunca en cuyo vértice queda la muestra. Las resinas endurecen por polimerización gracias al agregado
de un acelerador en estufa o a temperatura ambiente.

7. Corte

Se utilizan ultramicrótomos, de mas precisión que los micrótomos para MOC. Permiten obtener cortes
mas finos. Se realizan dos tipos de cortes:
Cortes gruesos: de 0.5 a 1 micrómetros. Se montan en portaobjetos de vidrio y se tiñen con azul de
policromo Unna. Estos se observan al MOC y se elige en ellos la zona de los que se van a obetener los
cortes finos. Una vez identificada la zona, se talla el taco y se realizan los
Cortes finos: mide 40 a 70 nanómetros de espesor.
Los ultramicrótomos utilizan cuchillas de vidrio o de diamante, y debido a lo delgado de los cortes, se
utiliza una lupa binocular, acoplada al mismo, para observar como se realizan los cortes. La resina que
queda en los cortes no impide el paso de los electrones al colocar la muestra en el microscopio.

8. Montaje

Los cortes obtenidos se recogen en una pequeña cubeta con agua y se montan en grillas de cobre
(pequeñas rejillas metálicas de 3 mm de diámetro), que hacen las veces de portaobjetos. Por los
espacios que quedan entre las rejillas pasan los electrones que atravesarán la muestra (el vidrio de un
portaobjetos común impediría el paso de los electrones).

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9. Coloración

No se colorean las muestras, los detalles ultraestructurales se distinguen por su diferente densidad
electrónica y se visualizan en blanco y negro, en diferentes tonos de grises. Para mejorar el contraste
entre los elementos se recurre al depósito de sales metálicas de uranilo, citrato de plomo o
ácidofosfotúngstico.

10. Montaje final

Se cubre la muestra en la grilla con un material inerte que no impide el pasaje de los electrones.

2) Procesamiento del material para MET

Las muestras pueden ser grandes, o sea que a veces no es necesario cortarlas. El material necesita
resistir el alto vacío generado por el microscopio por lo que se las fija y deshidrata de forma similar al la
técnica para MET. Luego se lo deseca por distintos métodos (al vacío, por congelación desecación o
punto crítico) y posteriormente se la sombrea con un depósito de una delgada capa de carbono y otra
de oro o paladio, para evitar el efecto que produce sobre la muestra el bombardeo de electrones.

BIBLIOGRAFÍA

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Banks, W. (1986) Histología Veterinaria Aplicada. Editorial El Manual Moderno. México.
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