Facultad de Odontología – III Semestre

ACTIVIDAD DE MICROBIOLOGÍA PRÁCTICA

Práctica N° 5
Tema: Microorganismos anaerobios

Objetivo: Generar una ruta de aprendizaje para la orientación y entendimiento de la importancia de las bacterias anaerobias en la cavidad oral
y su diagnóstico

La cavidad oral representa un ecosistema constituido por diferentes microambientes que albergan una gran diversidad de especies bacterianas.
Se conoce que del 100% de la microbiota normal de la cavidad oral un 70% está conformado por microorganismos anaerobios no esporulados,
estos microorganismos son fundamentales para mantener la homeostasis de la cavidad bucal, sin embargo, muchos de estos se comportan
como bacterias oportunistas y cuando encuentran el microambiente ideal podrían favorecer la disbiosis favoreciendo infecciones orales.

La abundante evidencia científica indica que las infecciones orales son de origen polimicrobiano y que a causa de las condiciones del
microambiente dentro del surco gingival o del conducto radicular solo un grupo restringido de especies bacterianas pueden predominar y producir
enfermedad. Las bacterias anaerobias son los microorganismos más frecuentemente involucrados en las infecciones de la cavidad oral, dentro
de las cuales figuran principalmente bacterias cultivables como: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter (Actinobacillus)
actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Eubacterium nodatum, Prevotella intermedia/nigrescens, Eikenella corrodens, Campylobacter
rectus, Parvimonas micra (Micromonas micros) y Treponema denticola (Haffajee et al., 2008).

Una gran cantidad de microorganismos que se encuentran asociados a salud oral y otros a enfermedades como la periodontitis solo pueden ser
identificadas por métodos moleculares, incluida la secuenciación (Wade et al., 2013; Bostanci et al., 2019).

La identificación de los organismos patógenos en dicha comunidad tan compleja es una tarea complicada si consideramos que la microbiota
está en recambio permanente, las especies patógenas pueden estar presentes en ausencia de la enfermedad y algunos patógenos pueden
actuar solamente dentro de un consorcio de especies o pueden requerir la ausencia de ciertos organismos benéficos (Socransky et al., 1998).
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En 1998 se clasificaron las bacterias asociadas con la enfermedad periodontal en los complejos microbianos, en este momento se les asignó
un color a cada grupo, diez años después el mismo grupo realizó una nueva clasificación que es vigente actualmente. Los análisis estadísticos
realizados por componentes principales lograron asociar grupos específicos que además coinciden con el orden de colonización y con aquellas
bacterias que son consideradas microbiota normal y las que son consideradas patógenas. De allí se puede resumir que dentro del orden de
colonización se distinguen como colonizadores primarios a las bacterias de complejo amarillo, posteriormente llegarán las de complejo azul,
seguidas de dos complejos que llegan casi al tiempo y son el complejo verde y el complejo purpura, para dar entrada a uno de los mas grandes
que es el complejo naranja; todas las bacterias hasta este complejo son consideradas microbiota oral normal. Por último llega el complejo rojo
en el que se encuentran patógenos orales asociados con periodontitis y periimplantis (Socransky et al., 1998; Haffajee et al., 2008).

Aunque los bacilos anaerobios Gram negativos y las espiroquetas dominan la microbiota subgingival de muchos pacientes con periodontitis, es
claro que existen marcadas diferencias cualitativas y cuantitativas entre los pacientes. Los factores que influyen en la composición de dicha
microflora subgingival incluyen edad, higiene oral deficiente, cigarrillo, estrés, enfermedades sistémicas, inmunosupresión y factores genéticos.

En la actualidad el estudio microbiológico en Odontología es empleado principalmente en cariología, implantología, periodoncia y endodoncia y
constituye una herramienta de gran utilidad para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas si consideramos que además de
identificar el agente etiológico en determinada patología, ayuda al clínico a seleccionar la terapia antibiótica que lleve al paciente a una completa
recuperación. En dichos estudios los métodos de muestreo y las técnicas para detectar y cuantificar el agente etiológico son muy importantes
ya que la cantidad de bacterias y el agente aislado facilitan al clínico la elección de la terapia mecánica y/o antibiótica más adecuadas.
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Microbiota normal. Aspecto cuantitativo

Relación
Lugar Cantidad de bacterias anaerobio/aerobio
BOCA
Saliva 108 -109 10:1
Placa supragingival 109 - 1010 1:1
Placa subgingival 1011- 1012 100-1000:1
TRACTO DIGESTIVO
Estómago 102-105 1:1
Yeyuno 102-104 1:1
Íleon distal 104-107 1:1
Colón 1011-1012 1000-10000:1
GENITALES FEMENINOS
Vagina 108-109 5-10:1
Endocervix 108-109 5-10:1
Tomado de: Koneman. Diagnóstico Microbiológico.

Para el adecuado diagnóstico de las enfermedades infecciosa es de gran importancia la toma de la muestra de manera adecuada, en el caso
particular de las muestras usadas para el diagnóstico de infecciones en las que el agente etiológico pueden ser bacterias anaerobias el transporte
de esta muestra debe garantizar que estas bacterias no sufran alteraciones, para esto se usan medios de transporte específicos para este fin
(Dahlén et al., 1993).
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Las muestras deben ser sembradas en medios no selectivos, selectivos y de enriquecimiento. Inicialmente las muestras deben se sembradas por
agotamiento o de forma masiva haciendo diluciones cuando se trata de muestras provenientes de la cavidad oral como placa subgingival, saliva,
conducto radicular, entre otros; esto se hace con el fin de diluir la muestra para poder identificar un gran número de microorganismos causantes
de la infección. La siembra inicial se hace en medios no selectivos y se puede usar un caldo de enriquecimiento como el caldo Schaedler o BHI
(infusión cerebro corazón). Los medios más usados para la identificación de bacterias de origen oral son el Wilkins Chanlgren y el agar Brucella,
estos medios son suplementado con 5% de sangre de cordero desfibrinada, L- cistina, extracto de levadura, vitamina K (Menadiona) y hemina
(Slots 1986).
Además de un buen medio de cultivo para garantizar las necesidades nutricionales muy exigentes de estas bacterias, se debe garantizar la
ausencia de oxígeno durante el tiempo de incubación. Recordemos que estas bacterias por tener un metabolismo exigente su tasa de
multiplicación es menor a la de una bacteria aerobia, por lo que se debe incubar entre 8 y 15 días para algunas especies. La atmósfera de
anaerobiosis se garantiza haciendo incubación con diferentes sistemas en los que se busca la eliminación del oxígeno dentro de un recipiente
que se conoce como Jarra de anaerobiosis.
El principio básico es la eliminación del oxígeno por oxido reducción, el oxígeno es reducido a agua con el uso de un catalizador:
Catalizador
2H2 + O2 2H2O

Las jarras con sobres generadores de anaerobiosis (de diferentes marcas comerciales como BD, Biomeriux, Oxoid) utilizan catalizadores fríos,
los gránulos de aluminio recubiertos con paladio no requieren de calentamiento. Al contacto con el oxígeno se genera una reacción de oxido
reducción exotérmica que permite la eliminación del O2 y la formación del agua como se muestra en la ecuación
(Ver: https://www.youtube.com/watch?v=OwnGnLMNn2U).

Otro método es el que usa generadores de hidrógeno-dióxido de carbono, el procedimiento de evacuación- reemplazo, en el que el aire es
reemplazado por 85% de N2, 10% de H2 y 5% de CO2, usando la mezcla de los gases con sistemas automatizados o cámara de guantes, estos
métodos son menos usados ya que requieren de equipos que tienen costos elevados e infraestructura específica, sin embargo estos métodos
garantizan una mejor anaerobiosis los que los sobres (Ver: https://www.youtube.com/watch?v=9ghSOnjD3Ls).

Con cualquiera de estos sistemas se debe utilizar un indicador de anaerobiosis que puede ser de azul de metileno o de resazurina, este es
reducido, después de 5 horas a 37°C pero cuando este vuelve a condiciones de aire aerobio vira nuevamente a azul o rosado en minutos. Las
concentraciones de oxígeno bajan hasta más o menos 0.2%- 0.6 % dentro de los siguientes 60 minutos y menos del 0.2% a los 100 minutos y
poco a poco sigue bajando hasta –115mV y –300mV.
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Pasado el tiempo de incubación (8 días aproximadamente) se debe hacer una observación macroscópica de las colonias y se deben realizar
pruebas bioquímicas de acuerdo con el microorganismo que se sospeche.

RUTA DE APRENDIZAJE:
ACTIVIDAD 1. Contextualización

Instrucciones: Con el fin de lograr los objetivos realizar los siguientes pasos:

1. Revise el artículo titulado “Microbial complexes in supragingival plaque” disponible en el aula virtual. Analice específicamente la figura 1.

Referencias:

- Haffajee, A. D., Socransky, S. S., Patel, M. R., & Song, X. (2008). Microbial complexes in supragingival plaque. Oral microbiology and
immunology, 23(3), 196–205.
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ACTIVIDAD 2.

Fecha de entrega: miércoles 06 de septiembre de 2023

a las 10:59am
Instrucciones:

Una vez completado el punto anterior complete el siguiente esquema con ÚNICAMENTE 2 bacterias de cada grupo e indicando si son
consideradas: microbiota normal o patógena en cavidad oral.
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EVALUACIÓN

La evaluación de esta guía de actividades comprende los siguientes ítems que serán tenidos en cuenta para la nota final que corresponde a 10
puntos.

Porcentaje de DESCRIPCIÓN
valoración sobre
10 puntos
Actividades 2 Entrega en el Aula virtual de la asignatura Microbiología
40% (4 puntos) Hasta: Miércoles 06 de septiembre de 2023 a las 10:59am
60% (6 puntos) Sesión práctica: Asistencia, participación en clase, socialización de la guía de
actividades, resolución de preguntas y aclaraciones.

Bibliografía.

- Bostanci, N., Bao, K., Greenwood, D., Silbereisen, A., & Belibasakis, G. N. (2019). Periodontal disease: From the lenses of light microscopy
to the specs of proteomics and next-generation sequencing. Advances in clinical chemistry, 93, 263–290.
- Giovanniello, O. (2008). Koneman diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color (6a. ed.). BUENOS AIRES: MÉDICA PANAMERICANA.
- Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL Jr. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol. 1998
Feb;25(2):134-44.
- Wade W. G. (2013). The oral microbiome in health and disease. Pharmacological research, 69(1), 137–143.