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MÉTODOS DE ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICOS
DE ALIMENTOS
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MICROBIOLÓGICOS
DE ALIMENTOS
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E-mail: ediciones@diazdesantos.es
Internet://http:www.diazdesantos.es
ISBN: 84-7978-524-1
Depósito legal: M. 23.431-2002
Autores
• MARTA ESCOLÀ RIBES, Ingeniero Agrónomo. Este libro es una versión mo-
dificada y adaptada de su Proyecto de Fin de Carrera.
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Agradecimientos
A Robert Garrofé Forca, por su fiel y eficaz colaboración técnica para la puesta a punto de
los métodos y la integración de los mismos en los sistemas de calidad del laboratorio.
Reflexiones
«La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusión, de tensio-
nes y desahogos, en la constante transformación de creación y destrucción.»
EDWARD C. WHITMONT
«As microbiologists, dealing with living organisms, we should probably have learned by now
to always expect the unexpected.»
SHEILA EATON, Responsable de la Organización de EQUAL del PHLS.
ÍNDICE
CAPÍTULO PRIMERO
CAPÍTULO SEGUNDO
CAPÍTULO TERCERO
XIII
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XIV ÍNDICE
CAPÍTULO CUARTO
CAPÍTULO QUINTO
ÍNDICE XV
CAPÍTULO SEXTO
XVI ÍNDICE
PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparación del agar Oxford .............................. 191
PNT - ME - 039: Procedimiento para la preparación del agar Palcam .............................. 192
PNT - ME - 040: Procedimiento para la preparación del agar triptona de soja-extracto de
levadura (TSYEA) ....................................................................................................... 194
PNT - ME - 041: Procedimiento para la preparación del caldo para la utilización de los
glúcidos (ramnosa y xilosa) ......................................................................................... 195
PNT - ME - 042: Procedimiento para la preparación del caldo de Park y Sanders ........... 196
PNT - ME - 043: Procedimiento para la preparación del agar de Karmali (AK) .............. 197
PNT - ME - 044: Procedimiento para la preparación del agar Butzler modificado ........... 199
PNT - ME - 045: Procedimiento para la preparación del caldo de Brucella (CB) ............. 200
PNT - ME - 046: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Columbia .......... 201
PNT - ME - 047: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Mueller-Hinton 202
PNT - ME - 048: Procedimiento para la preparación del agar citrato de hierro tres azúca-
res (TSI) ....................................................................................................................... 203
PNT - ME - 049: Procedimiento para la preparación del caldo triptona de soja (TSB) .... 205
CAPÍTULO SÉPTIMO
CAPÍTULO OCTAVO
CAPÍTULO NOVENO
ÍNDICE XVII
PNT - RE - 017: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar
Palcam .......................................................................................................................... 234
PNT - RE - 018: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «A»
para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... 235
PNT - RE - 019: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «B»
para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... 236
PNT - RE - 020: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar
de Karmali ................................................................................................................... 237
PNT - RE - 021: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar
Butzler .......................................................................................................................... 238
PNT - RE - 022: Procedimiento para la preparación del reactivo de Kovacs .................... 239
PNT - RE - 023: Procedimiento para la preparación de la solución salina (SS) ................ 240
PNT - RE - 024: Procedimiento para la preparación del reactivo para la investigación de la
β-galactosidasa (ONPG) .............................................................................................. 241
PNT - RE - 025: Procedimiento para la preparación de la solución de fenilalanina al
0,5% (FA) .................................................................................................................... 242
PNT - RE - 026: Procedimiento para la preparación de la solución de cloruro férrico al
10% .............................................................................................................................. 243
INTRODUCCIÓN
XIX
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XX INTRODUCCIÓN
• ISO: http://www.iso.ch
• EN: http://www.cenorm.be
• AFNOR: http://www.afnor.fr
• AENOR: http://www.aenor.es
INTRODUCCIÓN XXI
El año 2000 vio la aparición de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para
la competencia de los laboratorios de calibración y ensayos. Esta norma es el resulta-
do de un intento de armonización entre los diferentes documentos existentes, como la
Guía ISO 25, la norma EN 45001 y las ISO 9000.
Los cambios a destacar son los que hacen hincapié en la relación laboratorio/clien-
te, teniendo en cuenta la información que busca el cliente y para qué quiere esta infor-
mación. En el caso de los ensayos, el método empleado para dar esta información es
fundamental, así como características como la precisión en términos de repetibilidad y
reproducibilidad, incertidumbres y validación.
En una nota se explica que para validar métodos conviene emplear una combina-
ción de las siguientes técnicas:
CAPÍTULO PRIMERO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la redacción de los pro-
cedimientos de análisis de alimentos.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Manual de Calidad del Laboratorio de Microbiología.
• Procedimiento General de Redacción de Documentos.
• Guías ENAC y ISO 17025.
4. METODOLOGÍA
5. PROCEDIMIENTO
Los PNT realizados según el presente documento son instrucciones de trabajo para facilitar y agi-
lizar el análisis en el laboratorio, de manera que presentan una forma esquematizada de realizar
los ensayos. Por consiguiente, en caso de necesitar más detalles, se deberá acudir a la docu-
mentación original (norma en la que se basan).
Estos procedimientos de métodos de análisis de alimentos están formados por dos partes bien
diferenciadas:
• Instrucciones de trabajo
• Esquema del proceso.
0. Carátula.
1. Definición.
2. Medios de cultivo.
3
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3. Reactivos.
4. Siembra.
5. Recuento (en caso que se realice).
6. Confirmación (en caso que se realice).
7. Expresión de resultados.
8. Esquema.
5.1. Carátula
La carátula debe encabezar cada una de las páginas del PNT y ha de incluir los siguientes apar-
tados:
Para homogeneizar los distintos títulos que aparecen en la documentación (método de refe-
rencia, método de rutina, directiva general...) se ha optado por nombrar como MÉTODO HO-
RIZONTAL, que es la denominación que se aplica como título en las nuevas normas interna-
cionales. Con esta denominación indicamos que los métodos se aplican a todo tipo de productos,
salvo raras excepciones; estos casos particulares estarán indicados en los PNT sobre preparación
de la porción analítica y diluciones decimales y son específicos de cada laboratorio.
De esta manera, los métodos de referencia y de rutina se distinguen según la norma en la cual
están basados (los métodos de referencia se basan en normas ISO/EN y los de rutina en normas
AFNOR).
Asimismo, también se ha unificado el nombre del tipo de análisis, sustituyendo ENUME-
RACIÓN por RECUENTO.
En el caso que nos ocupa, el número del documento vendrá precedido por las siglas PNT - AL,
en referencia a su condición de procedimiento normalizado de análisis de alimentos, seguidas de
un número de tres cifras (por ejemplo, PNT - AL - 011).
En determinados análisis, por ejemplo, cuando se realiza un recuento del mismo microor-
ganismo por dos técnicas distintas, el PNT se divide en dos partes. Este hecho se indicará en la
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numeración, de manera que junto al número de tres cifras seguirá un punto «.» y el número «1»
o «2», según corresponda (por ejemplo, PNT - AL - 017.1).
Dado que estos PNT son una adaptación de las normas correspondientes, según el método de tra-
bajo del laboratorio y, por tanto, se han hecho ciertos cambios en ellas, no se puede decir que se
han resumido sino que, basándose en ellas, para asegurar que los ensayos se realizan correcta-
mente, se ha esquematizado el proceso en función de su uso en el lugar de trabajo. Estos cam-
bios, en ningún caso son sustanciales.
Así pues, en la carátula debe figurar «BASADO EN» la norma ISO/EN (para métodos de re-
ferencia) o AFNOR (para métodos de rutina) correspondiente al ensayo, indicando su número y
la fecha de edición (mes y año).
5.2. Definición
En este apartado incluiremos todas aquellas definiciones de términos, acciones, etc., que apare-
cen en el procedimiento cuya descripción puede ser importante a la hora de realizar el análisis y
adaptarlo a la petición del cliente. Así, encontraremos en todos los casos la definición del mi-
croorganismo ensayado y, opcionalmente, otras explicaciones de aspectos del análisis que pue-
dan ser de utilidad.
El término o términos definidos se subrayarán, empezando la definición con letra mayúscula.
En la definición se ha hecho una unificación de las definiciones, de manera que, en todos los
casos, se termina con la frase «cuando el ensayo se realiza según el siguiente método», inde-
pendientemente de que el documento esté basado en una norma ISO/EN o en una AFNOR.
A continuación se exponen dos definiciones cuya explicación, para simplificar, se ha ex-
cluido de los PNT (pues se repiten de manera idéntica en todas las normas), pero que son de gran
importancia a la hora de realizar los ensayos.
En esta sección se da la relación de todos los medios de cultivo que se utilizan en el ensayo, dis-
puestos según su orden de utilización, y acompañados, si se da el caso, de las siglas o abrevia-
turas con las que se los conoce habitualmente, entre paréntesis.
Dado que muchos de estos medios se denominan de distinta manera, según la casa comercial
que los suministra, los nombres que se les ha dado son aquéllos con los que se les conoce en el
laboratorio en el cual se han redactado estos PNT.
Para cada uno de estos medios de cultivo se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre
otras cosas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - ME correspon-
diente).
1
Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.
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5.4. Reactivos
Este apartado estará formado por una lista de los reactivos necesarios para realizar el análisis.
Como en algunos métodos no son necesarios, esta sección puede no aparecer en el PNT.
Entendemos por reactivos:
NOTA 3: Los suplementos que se añaden a los medios de cultivo sólo se incluyen a la lista
de reactivos cuando se incorporan al medio base en el momento de realizar el análisis.
Para cada uno de estos reactivos se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre otras co-
sas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - RE correspondiente).
Las cantidades a añadir, así como su presentación, corresponden a la marca utilizada en el la-
boratorio en el cual se han realizado los PNT, de manera que pueden variar en función del pro-
veedor; en este caso se deberá cumplir con sus instrucciones.
5.5. Siembra
En este apartado se explican, paso por paso, cada una de las acciones a realizar en el ensayo, des-
de la siembra hasta la incubación, indicando:
En los procedimientos donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el apartado en las
distintas fases: Pre-enriquecimiento, Enriquecimiento, Aislamiento, Selección (puede que no se
den todas).
En los casos en que se realice aislamiento y selección de colonias para realizar la posterior
confirmación, se deberán describir las características (color, tamaño, si forman o no halo de lisis
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o de precipitado y, de ser así, de qué color) de las colonias típicas del microorganismo ensayado
en el medio correspondiente (denominadas en todos los casos como «COLONIAS CARAC-
TERÍSTICAS»).
NOTA 4: En general, la dilución madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es lí-
quido) ó 10 gramos (para el resto de productos) de muestra en 90 mL de peptona salina (PS)
a T ambiente.
5.6. Recuento
En esta sección se darán las características de los tubos positivos (ensayo en medio líquido) o de
las colonias que se han de contar de cada placa (ensayo en medio sólido) y, si se da el caso, los re-
quisitos de los tubos/placas que se han de retener para realizar sobre sus colonias las pruebas de
confirmación bioquímica. En este caso, el apartado de RECUENTO puede aparecer después del de
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA incluido en el apartado EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
5.7. Confirmación
En caso de que el método requiera la realización de pruebas bioquímicas y serológicas para con-
firmar las colonias, se explicará cada una de ellas en este apartado, indicando sobre qué colonias
o tubos se realiza, los medios y reactivos necesarios, la temperatura y el tiempo, señalando tam-
bién el resultado que debe considerarse como positivo.
Este apartado es un extracto del PNT - AL - 002 (Procedimiento de Expresión de Resultados) para
cada método de análisis, de manera que se indica únicamente la manera de calcular el resultado
para el caso general y se remite al PNT - AL - 002 para el resto de casos, así como para la con-
sulta del significado de los símbolos que aparecen en las fórmulas, y siempre en caso de duda.
Así, en el caso de recuento en medio sólido, se indicará qué placas se han de retener para cal-
cular el resultado (en función del número de colonias, señalando si se trata de colonias en total,
colonias características o colonias identificadas) y mediante qué expresión se obtendrá el número
de colonias.
En el caso de investigación, se indicarán las características necesarias para considerar que en
la muestra hay presencia o no del microorganismo estudiado.
Para el caso de recuento en medio líquido, se indicará a partir de qué tubos se ha de calcular
el NMP.
5.9. Esquema
El esquema es un resumen visual de todo el proceso, indicando con dibujos el orden a seguir para
realizar cada uno de los pasos del ensayo; este apartado estará en la hoja final del documento.
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En una columna situada a la izquierda de la hoja indicaremos el día de análisis en el que nos
encontramos, de manera que en el resto de la hoja se muestren las operaciones que se deben
realizar durante el mismo. Las acciones a realizar en días distintos están separadas por una barra
con una flecha.
Señalar que en los procedimientos en los que en el texto se han diferenciado las distintas eta-
pas del análisis, también se ha indicado cada paso en el esquema.
El esquema empieza con la preparación de la dilución madre y el banco de diluciones
(cuando es necesario). Es importante destacar que el número de diluciones que se ha dibujado es
orientativo, de manera que se prepararán tantas diluciones como sea necesario, independiente-
mente de la cantidad de tubos que se hayan dibujado.
La muestra líquida, si el ensayo se realiza con un producto líquido, o la dilución madre, si se
realiza con otros productos, están representadas por una bolsa de «Stomacher», y el resto de di-
luciones por un tubo con 9 mL de peptona salina (PS) (salvo en casos particulares, en los
cuales se indicará el medio utilizado para hacer las diluciones). Debajo de cada elemento del
banco de diluciones se indicará el orden de dilución correspondiente, sin paréntesis para ensayos
con productos líquidos y entre paréntesis cuando se realiza dilución madre. Este orden de dilu-
ción se escribirá en todos los pasos de la siembra.
A continuación, mediante unas flechas que salen de cada dilución, se indica la cantidad de
muestra que se ha de sembrar en la placa o tubo. Cuando se siembran placas, cuando se realiza
siembra superficial, el nombre del medio a sembrar estará encima de ellas mientras que se co-
locará debajo si la siembra es por inclusión, indicando en este caso la cantidad y temperatura del
medio a añadir.
Cuando se siembra en placas, en caso de que se deba extender el inóculo con asa de Dri-
galski, en el esquema aparecerá dibujada el asa, mientras que si la siembra es por aislamiento, en
las placas se pintarán estrías (este aislamiento por estrías puede realizarse de distintas maneras).
Si la siembra es por picadura en un tubo con medio sólido, se dibujará una línea vertical que ocu-
pe el medio, desde la parte superior.
Asimismo, cuando se siembra en medio líquido con un asa de Kolle, se dibujará este utensilio
junto a los tubos.
Debajo de las placas o tubos se indicará el tiempo y la temperatura de incubación, señalando
también si hay características particulares que deban ser tenidas en cuenta.
En los pasos de recuento y confirmación se seguirá el mismo procedimiento, dibujando en las
placas el crecimiento de las colonias.
El esquema finaliza con la frase «lectura y expresión de resultados», si no se ha realizado
confirmación; o bien, si se han efectuado pruebas bioquímicas y/o serológicas, se darán los re-
sultados del caso favorable. En los recuentos en medio líquido se remitirá al cálculo del NMP.
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CAPÍTULO SEGUNDO
1. OBJETO
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para el re-
cuento de colonias y expresión de resultados. Caso de recuento en medio sólido.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. GENERALIDADES
El presente documento está formado por una serie de tablas que muestran la manera de reali-
zar la expresión de resultados para cada método horizontal de recuento o investigación según
la norma ISO, EN o AFNOR correspondiente. Estas tablas están ordenadas según su orden de
PNT - AL, y están divididas según los tres casos posibles:
• Caso general.
• Estimación de pequeños números.
• Ninguna colonia.
Para completar este procedimiento, en el ANEJO 1 se adjuntan las tablas necesarias para el
cálculo de los resultados y en el ANEJO 2 se incluyen ejemplos de cálculo para cada uno de los
casos posibles, junto con un diagrama para facilitar su localización.
5. FÓRMULAS
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
11
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Los resultados obtenidos mediante las fórmulas se han de redondear a dos cifras significati-
vas, utilizando las reglas habituales, tal como se describe en el Apartado 6 y retener como re-
sultado el número de microorganismos por mililitro (en productos líquidos) o por gramo (en el
resto de productos), expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la
potencia de 10 adecuada.
Dado que en algunos casos los mismos conceptos se expresaban con letras distintas según la
norma de la que estaban extraídos, se ha hecho una recopilación y homogeneización de términos,
para que cada símbolo tenga el mismo significado en todas las fórmulas.
Para que un resultado se considere válido, se estima que en general es necesario contar las co-
lonias de al menos una placa que contenga un mínimo de 15 colonias.
En las fórmulas que se utilizan en el caso general, aparecen unos símbolos cuyos significados
se explican a continuación:
1
Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.
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En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen unos
símbolos, cuyos significados se explican a continuación:
En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen un sím-
bolo, cuyo significado se explica a continuación.
6. REDONDEO
Proceder de esta forma secuencialmente con todas las cifras del número obtenido hasta que
se obtengan dos cifras significativas.
⎡ ΣC 1, 92 1, 96 ΣC ⎤ 1
δ=⎢ + ± ⎥⋅
⎣ B B B ⎦ d
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con:
siendo:
Dilución
–1 –2
10 10 10–3 10–4
> 300 198 11 2
Número de colonias > 300 202 11 3
Placas retenidas
Con N = 1,9 · 104 por gramo, para 422 colonias contadas en las placas retenidas. El interva-
lo de confianza δ es:
⎡ 422 1, 92 1, 96 422 ⎤ 1
δ=⎢ + ± ⎥⋅
⎣ 2, 2 2, 2 2, 2 ⎦ 10 –2
Para las técnicas de NMP y de estimación de pequeños números, estos límites de confianza,
en la práctica, se suelen obtener mediante las tablas que se adjuntan en el ANEXO 1.
Señalar que las variaciones que se dan aún pueden ser más importantes en la práctica, en par-
ticular entre los resultados obtenidos por distintos microbiólogos.
8. COMENTARIOS
En este apartado queremos recalcar algunos aspectos de la norma AFNOR XP V 08-102 que son
nuevos respecto a las normas publicadas anteriormente y que pueden ser útiles a la hora de re-
solver dudas.
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Los casos particulares, aunque son bastante improbables, se pueden presentar (por ejemplo, nú-
meros muy diferentes de colonias entre las dos placas de una misma dilución, o bien una pro-
porción muy alejada de la del factor de dilución entre las placas de dos diluciones sucesivas). En
estos casos, un microbiólogo competente deberá examinar, interpretar y, si es necesario, recha-
zar los resultados obtenidos.
En el caso que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 colonias
(o cualquier otro número indicado en la norma específica), calcular el número N′ de microorga-
nismos 2 presentes en la muestra de ensayo con ayuda de la ecuación:
C
N′ =
V ⋅d
siendo:
En el caso que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado
en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d1, con un número de colonias
menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente:
• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido
entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a
300), utilizar el modo de cálculo del caso general;
• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 es superior a 324
(límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener
sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños
números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fija-
do en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15).
2
Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.
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9. TABLAS DE RESULTADOS
16
PNT - AL - 003. Recuento sin microorganismos a 30°C (ISO 4833)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
• Hasta 300 colonias, al nivel de ΣC • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas
dos diluciones sucesivas. N= vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
diuctos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
• Una placa ha de tener un míni- madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
mo de 15 colonias. nen menos de 15 colonias, ha- hay colonias, dar el resultado
cer la media m de las colonias como:
contadas en las dos placas y ex-
presar el resultado como: | Menos de 1 microorganismo
por mililitro (productos líqui-
| Ne = m: número estimado de dos).
microorganismos por mililitro
(productos líquidos). | Menos de 1/d microorganis-
mos por gramo (otros produc-
| Ne = m/d: número estimado de tos).
microorganismos por gramo
(otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del ±2% al ±37%
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• Menos de 300 colonias, al nivel ΣC • Si la placa retenida, al nivel de la • Si no hay ninguna colonia en la
de dos diluciones sucesivas. N= muestra a analizar (productos lí- placa al nivel de la muestra a
1,1 ⋅ d
quidos) o de la dilución madre analizar (productos líquidos) ni
• Una placa ha de tener un míni- (otros productos), contiene me- en la de dilución madre (otros
mo de 15 colonias. nos de 15 colonias, dar el resul- productos), dar el resultado
tado como: como:
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del ±10,5% para 300 colonias
contadas y del –37% al +61% para 15 colonias contadas.
17
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18
PNT - AL - 005. Recuento de levaduras y mohos (ISO 7954)
Caso general
• Menos de 150 colonias, al nivel ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra • Si en ninguna de las dos placas
de dos diluciones sucesivas. N= a analizar (productos líquidos) o al nivel de la muestra a analizar
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
de la dilución madre (otros pro- (productos líquidos) o de la dilu-
ductos), contiene menos de 15 ción madre (otros productos)
colonias, expresar el resultado hay colonias, dar el resultado
como número estimado de la si- como:
guiente manera:
| Menos de 1 levadura y moho
| Ne = C: levaduras y mohos por por mililitro (productos líqui-
mililitro (productos líquidos). dos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.
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• Menos de 150 colonias, al nivel • Para recuento en superficie: • Si la placa, al nivel de la muestra • Si no hay ninguna colonia en la
de dos diluciones sucesivas. a analizar (productos líquidos) o placa al nivel de la muestra a
ΣC de la dilución madre (otros pro- analizar (productos líquidos) ni
N=
• Una placa ha de tener un míni- 0,11 ⋅ d ductos), contiene menos de 15 en la de la dilución madre (otros
mo de 15 colonias. colonias, expresar el resultado productos), dar el resultado
• Para recuento en profundidad: como número estimado de la si- como:
guiente manera:
ΣC | Menos de 10 colonias por mi-
N=
1,1 ⋅ d | Ne = 10 × C: levaduras y mo- lilitro (productos líquidos).
hos por mililitro (productos lí-
quidos). | Menos de 10/d colonias por
gramo (otros productos).
| N e = 10 × C/d: levaduras y
mohos por gramo (otros pro-
ductos).
Precisión
19
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20
PNT - AL - 007.1. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica del NMP (ISO 7402)
Caso general Cálculo del número más probable (NMP)
Confirmación • Para productos líquidos, el número de Enterobacteriaceae por mililitro es igual al coeficiente NMP dividido
por 10.
• Si al menos una de las colonias
características seleccionadas • Para el resto de productos, el número de Enterobacteriaceae por gramo es igual al coeficiente NMP.
para la confirmación bioquími-
ca es:
| Oxidasa k
| Glucosa j
Precisión
En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia.
Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.
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PNT - AL - 007.2. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (ISO 7402)
Caso general Estimación de pequeños
• Menos de 150 colonias, al nivel • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas
de dos diluciones sucesivas. confirmación bioquímica reali- vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
zada sobre cinco colonias por ductos líquidos) o de dilución (productos líquidos) o de dilu-
Confirmación placa, calcular el número a de madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
Enterobacteriaceae identificadas nen menos de 15 colonias carac- hay colonias características, dar
• Si al menos un 80% de las colo- a partir de la expresión: terísticas, hacer la media m de el resultado como:
nias características seleccionadas las colonias contadas en las dos
son confirmadas como Entero- b placas y expresar el resultado | Menos de 1 Enterobacteria-
a = ⋅C
bacteriaceae (oxidasa k y glu- A como: ceae por mililitro (productos
cosa j el número de microor- líquidos).
ganismos presentes será el • Calcular el número N de Ente- | Ne = m: número estimado de
encontrado en el recuento. robacteriaceae identificadas pre- Enterobacteriaceae por milili- | Menos de 1/d Enterobacteria-
sentes en la muestra problema tro (productos líquidos). ceae por gramo (otros produc-
• En cualquier otro caso, el núme- con la expresión: tos).
ro de microorganismos se calcu- | Ne = m/d: número estimado de
lará a partir del porcentaje de co- Σa Enterobacteriaceae por gramo
lonias oxidasa k y glucosa j N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d (otros productos).
en relación al número total de
colonias seleccionadas.
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.
21
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22
MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS
PNT - AL - 008. Investigación de Enterobacteriaceae con pre-enriquecimiento (ISO 8523)
• Si una de las colonias características es oxidasa k y glucosa j, la muestra se considera positiva en Enterobacteriaceae.
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Enterobacteriaceae, según la cantidad
examinada, en x gramos de producto.
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PNT - AL - 009. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (NF V 08-054)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
• Un máximo de 150 colonias ca- • A partir de los resultados de la • Si la placa, al nivel de la muestra • Si en la placa, al nivel de la
racterísticas y no características, confirmación bioquímica reali- a analizar (productos líquidos) o muestra a analizar (productos lí-
al nivel de dos diluciones suce- zada sobre cinco colonias por de la dilucion madre (otros pro- quidos) o de la dilución madre
sivas. placa, calcular el número de En- ductos), contiene menos de 15 (otros productos) no hay ningu-
terobacteriaceae identificadas a colonias características, dar el na colonias de Enterobaceria-
• Una placa ha de tener un míni- partir de la expresión: resultado como: ceae, dar el resultado como:
mo de 15 colonias característi-
cas. b | Ne = a: número estimado de | Menos de 1 Enterobacteria-
a = ⋅C
A Enterobacteriaceae por milili- ceae por mililitro (productos
tro (productos líquidos). líquidos).
• Calcular el número N de Ente-
robacteriaceae identificadas pre- | Ne = a/d: número estimado de | Menos de 1/d Enterobacteria-
sentes en la muestra problema Enterobacteriaceae por gramo ceae por gramo (otros produc-
con la expresión: (otros productos). tos).
Σa
N=
1,1 ⋅ d
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los Ver TABLA 1
límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7% para
150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias conta-
das.
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PNT - AL - 010. Recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (ISO 4831)
Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más ele-
vadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentracion más baja de la muestra).
3. Casos particulares:
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no presente
tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que tie-
nen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que al
nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este último caso es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que no
dan tubos positivos.
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Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los re-
sultados de la categoría 2 (ver TABLA 5).
Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4.
El número de coliformes por mililitro o por gramo se obtiene multiplicando el coeficiente NMP por el inverso de la dilución más baja (la que tie-
ne mayor concentración de muestra). Cuando la dilución retenida más baja corresponde a los tubos preparados a partir del medio a doble con-
centración (sembrados con 10 mL) habrá que dividir por 10
PRECISIÓN
En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia.
Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.
25
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26
PNT - AL - 011. Recuento de coliformes totales. Técnica por recuento de colonias (ISO 4832)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
Placas retenidas Cálculo números
• Menos de 150 colonias caracte- ΣC • Si cada una de las placas retenidas con- • Si en ninguna de las dos placas,
N=
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PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251)
Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más ele-
vadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de la muestra).
3. Casos particulares:
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no pre-
sente tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que
tienen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que
al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este último caso, es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que
no dan tubos positivos.
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PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251) (Continuación)
Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los re-
sultados de la categoría 2 (ver TABLA 5).
Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4.
Si el NMP es inferior al 0,3 microorganismos por mililitro o por gramo, y si se ha utilizado el método operativo apropiado para un número bajo
de Escherichia coli presuntivos, el resultado deberá expresarse como «ausencia de Escherichia coli presuntivos en 1 mL o 1 g. de producto».
PRECISIÓN
En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia.
Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.
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PNT - AL - 014. Recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (NF V 08-053)
Caso general Estimación de pequeños
• Menos de 150 colonias caracte- ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra a analizar • Si no hay ninguna colonia en la
rísticas y/o no características, al N= (productos líquidos) o de la dilución ma- placa al nivel de la muestra a
1,1 ⋅ d
nivel de dos diluciones sucesi- dre (otros productos) contiene menos de 15 analizar (productos líquidos) o
vas. colonias características, dar el resultado de la dilución madre (otros pro-
como: ductos), dar el resultado como:
• Una placa ha de tener un míni-
mo de 15 colonias característi- | Ne = a: número estimado de Escherichia | Menos de 1 Escherichia coli
cas. coli β-glucuronidasa positivos por mili- β-glucuronidasa positivos por
litro (productos líquidos). mililitro (productos líquidos).
Precisión
• Hasta 300 colonias, con 150 co- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas,
lonias características y no carac- confirmación, calcular el número vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
terísticas, al nivel de dos dilu- a de CPS identificados por placa ductos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
ciones sucesivas. retenida mediante la expresión: madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos)
nen menos de 15 colonias iden- hay colonias de CPS, dar el re-
• Una placa ha de tener un míni- b c c b nc nc tificadas, expresar el resultado sultado como:
a= ⋅ c = nc ⋅ c
mo de 15 colonias característi- Ac A como:
cas. Siembra de 0,1 mL:
Σa
• Calcular el número N de CPS | Ne = : número estimado
identificados presentes en la V ⋅2 | Menos de 10 CPS por mililitro
muestra problema mediante la de CPS por mililitro (productos (productos líquidos).
expresión: líquidos) | Menos de 10/d CPS por gra-
mo (otros productos).
Σa
N= Σa
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d | Ne = : número esti- Siembra de 1 mL:
V ⋅2⋅d
mado de CPS por gramo (otros
| Menos de 1 CPS por mililitro
productos). (productos líquidos).
| Menos de 1/d CPS por gramo
(otros productos).
Precisión
Ver ISO 7218 Ver TABLA 1
31
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32
PNT - AL - 015.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). (ISO 6888-2)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
• Hasta 300 colonias, con 100 co- ΣC • Si las dos placas, al nivel de la • Si en ninguna de las dos placas,
lonias características, al nivel de N= muestra a analizar (productos lí- al nivel de la muestra a analizar
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
dos diluciones sucesivas. quidos) o de la dilución madre (productos líquidos) o de la dilu-
(otros productos) contienen me- ción madre (otros productos),
• Una placa ha de tener un míni- nos de 15 colonias característi- hay colonias de CPS, dar el re-
mo de 15 colonias característi- cas, expresar el resultado como: sultado como:
cas.
C
|
Ne = : número estimado de | Menos de 1 CPS por mililitro
2 (productos líquidos).
CPS por mililitro (productos lí-
quidos)
| Menos de 1/d CPS por gramo
(otros productos).
C
|
Ne = : número estimado
2⋅d
de CPS por gramo (otros pro-
ductos).
Precisión
Ver ISO 7218 Ver TABLA 1
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PNT - AL - 016.1. Recuento estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (NF V 08-057-1)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
Placas retenidas Cálculo números
• Menos de 150 colonias ca- • Si la placa, al nivel de la muestra a ana- • Si no hay ninguna colonia de
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los Ver TABLA 1
casos, los límites de confianza de este método varían del
+17,3% al +14,7% para 150 colonias contadas y del +63,4%
al –37,8% para 15 colonias contadas.
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PNT - AL - 016.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (NF V 08-057-2)
• Un máximo de 100 colonias ca- ΣC • Si la placa, al nivel de la muestra a analizar • Si no hay ninguna colonia de
racterísticas al nivel de dos dilu- N= (productos líquidos) o de la dilución ma- CPS en la placa, al nivel de la
1,1 ⋅ d
ciones sucesivas. dre (otros productos), contiene menos de muestra a analizar (productos lí-
15 colonias características, dar el resultado quidos) o de la dilución madre
• Una placa ha de tener un míni- como: (otros productos), dar el resulta-
mo de 15 colonias característi- do como:
cas. | N = C: número estimado de CPS por mi-
e
| Menos de 1 CPS por mililitro
lilitro (productos líquidos).
(productos líquidos).
| N = C/d: número estimado de CPS por
e
| Menos de 1/d CPS por gramo
gramo (otros productos).
(otros productos).
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% Ver TABLA 1
de los casos, los límites de confianza de este método varían
del +20% al –17% para 100 colonias contadas y del +63,4%
al –37,8% para 15 colonias contadas.
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Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, Ver TABLA 1
los límites de confianza de este método varían del ±12% al ±37%.
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36
PNT - AL - 018. Recuento de Bacillus cereus (NF V 08-058)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
Placas retenidas Cálculo números
• Un máximo de 150 colo- • A partir de los resultados de • Si la placa, al nivel de la muestra a ana- • Si no hay ninguna colonia de
Precisión
• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas retenidas, al ni- • Si en ninguna de las dos placas,
rísticas y no características, al confirmación, calcular el núme- vel de la muestra a analizar (pro- al nivel de la muestra a analizar
nivel de dos diluciones sucesi- ro a de Clostridium perfringens ductos líquidos) o de la dilución (productos líquidos) o de la dilu-
vas. mediante la expresión: madre (otros productos), contie- ción madre (otros productos),
nen menos de 15 colonias de hay colonias de Clostridium per-
• Una placa ha de contener un mí- b Clostridium perfringens, expre- fringens, dar el resultado como:
a= ×C
nimo de 15 colonias. A sar el resultado como:
| Menos de 1 Clostridium per-
• Calcular el número N de Clos- | Ne = m: número estimado de fringens por mililitro (produc-
tridium perfringens por gramo o Clostridium perfringens por tos líquidos).
por mililitro mediante la expre- mililitro (productos líquidos).
sión:
| Menos de 1/d Clostridium
| Ne = m/d: número estimado de perfringens por gramo (otros
Σa productos).
N= Clostridium perfringens por
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d gramo (otros productos).
Precisión
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38
PNT - AL - 020. Recuento de Clostridium perfringens (NF V 08-056)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
números
• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si la placa, al nivel de la muestra • Si no hay ninguna colonia de
rísticas, al nivel de dos dilucio- confirmación, calcular el núme- a analizar (productos líquidos) o Clostridium perfringens en la
nes sucesivas. ro a de Clostridium perfringens de la dilución madre (otros pro- placa, al nivel de la muestra a
mediante la expresión: ductos), contiene menos de 15 analizar (productos líquidos) o
• Una placa ha de tener un míni- colonias, expresar el resultado de la dilución madre (otros pro-
mo de 15 colonias. b como: ductos), dar el resultado como:
a = ×C
A
| Ne = a: número estimado de | Menos de 1 Clostridium per-
• Calcular el número de Clostri- Clostridium perfringens por fringens por mililitro (produc-
dium perfringens identificados mililitro (productos líquidos). tos líquidos).
presentes en la muestra proble-
ma mediante la expresión: | Ne = a/d: número estimado de
| Menos de 1/d Clostridium
Clostridium perfringens por perfringens por gramo (otros
Σa gramo (otros productos). productos).
N=
1,1 ⋅ d
Precisión
Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, Ver TABLA 1
los límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7%
para 150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias
contadas.
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• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de pro-
ducto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera
PRESENCIA.
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de pro-
ducto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera
PRESENCIA.
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos
de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se con-
sidera PRESENCIA.
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40
PNT - AL - 023.2. Recuento de Listeria monocytogenes (ISO 11290-2)
Caso general Estimación de pequeños Ninguna colonia
• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la • Si las dos placas, al nivel de la • Si en ninguna de las dos placas,
rísticas, al nivel de dos dilucio- confirmación, calcular el núme- muestra a analizar (productos lí- al nivel de la muestra a analizar
nes sucesivas. ro a de colonias de Listeria mo- quidos) o de la dilución madre (productos líquidos) o de la dilu-
nocytogenes confirmadas en (otros productos), contienen me- ción madre (otros productos),
• Una placa ha de tener un míni- cada placa mediante la expre- nos de 15 colonias de Listeria hay colonias de Listeria mo-
mo de 15 colonias característi- sión: monocytogenes, hacer la media nocytogenes, dar el resultado
cas. m de las colonias contadas en las como:
b dos placas y expresar el resulta-
a = ×C
A do como: 1
| Menos de Listeria mo-
d ⋅V
• Calcular el número N de Listeria m nocytogenes por mililitro o por
monocytogenes identificados
| Ne = : número estimado
d ⋅V gramo.
presentes en la muestra proble- de Listeria monocytogenes por
ma mediante la expresión: mililitro o por gramo.
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
Precisión
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos
de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se con-
sidera PRESENCIA.
• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Campylobacter termotolerantes en
x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada
ya se considera PRESENCIA.
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En esta tabla se dan los límites de confianza al nivel del 95% para la estimación de pequeños
números, cuando el número de colonias retenidas sobre las placas es menor que 15 micro-
organismos*.
TABLA 3: Tabla de NMP para 3 × 0,1 g. (mL), 3 × 0,01 g. (mL) y 3 × 0,001 g. (mL)
0 0 0 <3+ — —
0 1 0 3+ <1 17
1 0 0 4+ <1 21
1 0 1 7+ 2 27
1 1 0 7+ 2 28
1 2 0 11+ 4 35
2 0 0 9+ 2 38
2 0 1 14+ 5 48
2 1 0 15+ 5 50
2 1 1 20+ 7 60
2 2 0 21+ 8 62
3 0 0 23+ 9 130
3 0 1 39+ 10 180
3 1 0 43+ 10 210
3 1 1 75+ 20 280
3 2 0 93+ 30 380
3 2 1 150+ 50 500
3 2 2 210+ 80 640
3 3 0 240+ 90 1.400
3 3 1 460+ 100 2.400
3 3 2 1.100+ 300 4.800
3 3 3 >1.100+ —, —0,
Los resultados normales, obtenidos en el 95% de los ensayos, no están seguidos por un más. Re-
sultados «+» improbables, obtenidos en un 4% de los casos, si que están seguidos por un «+».
Las combinaciones de tubos positivos que no se muestran en la tabla, aparecen en menos del
1% de los ensayos; si se observan a menudo, significa que la técnica empleada es defectuosa
o que las suposiciones en las que se basa el NMP estimado no se han cumplido. Para estas
combinaciones que no se reflejan en la tabla se puede extrapolar un NMP a partir de la si-
guiente combinación más elevada que aparece en la tabla (por ejemplo, un caso 2 0 2 tendría
un resultado aproximado de 20, que es el NMP correspondiente al caso 2 1 1.
* Todos los resultados de NMP/g se pueden expresar como NMP/100 g multiplicando por 100.
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Antes de empezar los ensayos se ha de decidir qué categoría será aceptada, es decir:
sólo la 1, la 1 y la 2 o bien la 1, la 2 y la 3.
Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en la tabla de NMP adecuada, si
las series de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son
aceptables desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de
muestras examinadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3.
Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la tabla, la secuencia
2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario, cuando los
resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2 1 será
admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia
2 2 1 es válida para una muestra única.
Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NMP
mediante la correspondiente tabla 3.
Si la decisión es muy importante para ser tomada basándose en los resultados, se habrán de
aceptar únicamente los resultados de la categoría 1 o, como mucho, de las categorías 1 y 2.
Los resultados de la categoría 0 se habrán de considerar con mucha prudencia.
Categoría Definición
Los límites de confianza que se dan en las TABLAS 2 y 3 están destinados únicamente a su-
gerir algunas nociones de la influencia de las variaciones estadísticas sobre los resultados.
Siempre habrá otras fuentes de variaciones que puedan ser por sí mismas, alguna vez, más im-
portantes.
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TIPO DE MEDIO
ANEXO 2: EJEMPLOS
TIPO DE RECUENTO
MÉTODO DE REFERENCIA
Entonces:
Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución
madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contienen me-
nos de 15 colonias (en total, características o identificadas).
Un recuento da como resultado:
Entonces:
ΣC 12 + 13 25
Ne = = = = 1.250
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –2 0, 02
En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d1, con un número de
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colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias
en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del
intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300).
Un recuento da como resultado:
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones rete-
nidas.
En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número
indicado en la norma específica), en las dos placas de una primera dilución d1, con un número
de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de co-
lonias en cada una de las placas de la dilución d1 es superior a 324 (límite superior del interva-
lo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado de los recuentos
de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento
de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es me-
nos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15) (ver
Ejemplo 5).
Un recuento da como resultado:
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos
placas de la dilución 10–3.
En el caso de que únicamente las dos placas de la última dilución sembrada tengan menos de
300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).
Un recuento da como resultado:
Entonces:
MÉTODO DE RUTINA
Entonces:
ΣC 83 + 13 96
N= = = = 8, 727
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [1 + (0,1 ⋅ 1)] ⋅ 10 –2
0, 011
Entonces:
C 12
Ne = = = 1.200
d 10 –2
Caso en el que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución d1, con un número de colonias
menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de
la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una
media ponderada igual a 300).
Un recuento da como resultado:
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones rete-
nidas.
Caso en el que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución d1, con un número de colonias
menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de
la dilución d1 es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponde-
rada igual a 300), retener sólo el resultado del recuento de la dilución d2 y realizar una estimación
de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máxi-
mo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15) (ver Ejemplo 11).
Un recuento da como resultado:
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos
placas de la dilución 10–3.
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Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).
Un recuento da como resultado:
Entonces:
C 125
N′ = = = 1.250.000
V ⋅ d 1 ⋅ 10 –4
MÉTODO DE REFERENCIA
Se han resembrado:
• De las 66 colonias de la dilución 10–3: 8 colonias, de las cuales 6 han respondido a los cri-
terios; así: a = 50.
• De las 80 colonias de la dilución 10–3: 9 colonias, de las cuales 6 han respondido a los cri-
terios; así: a = 53.
• Las 4 colonias de la dilución 10–4, de las cuales las 4 han respondido a los criterios; así:
a = 4.
• De las 7 colonias de la dilución 10–4: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los cri-
terios de identificación; así: a = 6.
Entonces:
Σa 50 + 53 + 6 + 4 113
N= = = = 51.364
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [2 + (0,1 ⋅ 2)] ⋅ 10 –3 2, 2 ⋅ 10 –3
Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución
madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contiene menos
de 15 colonias (en total, características o identificadas).
Un recuento da como resultado:
Entonces:
ΣC 12 + 13 25
Ne = = = = 1.250
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 2 ⋅ 10 –2
0, 02
Si para las dos placas de una primera dilución d1, el número total de colonias características
y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica)
con colonias identificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier
otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.
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El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de
producto.
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones retenidas.
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Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una prime-
ra dilución d1, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en cada una de las dos placas de la dilución d1 es superior
a 167 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener
sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños nú-
meros.
Un recuento da como resultado:
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos
placas de la dilución 10–3.
Caso que únicamente las dos placas de la última dilución sembrada tengan menos de 150 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no caracterís-
ticas.
Un recuento da como resultado:
Entonces:
MÉTODO DE RUTINA
• De las 66 colonias de la dilución 10–3: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los cri-
terios de identificación; así: a = 53.
• Las 4 colonias de la dilución 10–4, de las cuales 3 han respondido a los criterios de identi-
ficación; así: a = 3.
Entonces:
Σa 53 + 3 56
N= = = = 50.909
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d 1 ⋅ [2 + (0,1 ⋅ 1)] ⋅ 10 –3
0, 011
Entonces:
a 12
Ne = = = 1.200
d 0, 01
Si, para una primera dilución d1, el número total de colonias características y no caracterís-
ticas es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) con colonias
identificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número
indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.
Un recuento da como resultado:
El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de
producto.
Si, en una primera dilución d1, el número total de colonias características y no características
es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) sin colonias iden-
tificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número in-
dicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.
Un recuento da como resultado:
En caso de que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilu-
ción d1, con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución d1 está comprendido entre 167 y
150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150).
Un recuento da como resultado:
Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones rete-
nidas.
Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que
150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilu-
ción d1, con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución d2 si-
guiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución d1 es superior a 167 (límite su-
perior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener sólo el resultado
del recuento de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números.
Un recuento da como resultado:
Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en la pla-
ca de la dilución 10–3.
Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 150 co-
lonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no caracterís-
ticas.
Un recuento da como resultado:
Entonces:
Σa 125 125
N′ = = = = 1.250.000
V ⋅ n ⋅ d 1 ⋅ 10 –4 0, 0001
EJEMPLO 27: Al menos una dilución tiene los tres tubos positivos
Escoger la dilución más elevada (aquélla con menor concentración de muestra) que presen-
te tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es de-
cir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 de la primera di-
lución escogida). Ver CASO 1 en la TABLA 5.
Si se ha preparado un número insuficiente de diluciones por encima de la dilución más ele-
vada con tres tubos positivos, escoger en su lugar las tres diluciones más elevadas de la serie (es
decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de muestra). Ver CASO 2 en la TABLA 5.
Cuando el caso 1 no se puede aplicar, escoger las tres diluciones más elevadas de la serie
(aquéllas con menor concentración de muestra) que contengan al menos una respuesta positiva.
Ver CASO 3 en la TABLA 5.
En todos los casos donde más de una de las tres diluciones escogidas según los dos casos an-
teriores no tenga tubos positivos, retener la dilución menos elevada que no presente ningún tubo
positivo (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más ba-
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jas precedentes (es decir, aquéllas con las concentraciones de muestra iguales a 10 y 100 veces la
de la primera dilución escogida, ver CASOS 4 y 5 en TABLA 5), excepto cuando sólo se en-
cuentran tubos positivos al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.
En este caso, es necesario retener las tres primeras diluciones para el cálculo el NMP, igual
que si esta serie tuviera dos diluciones sin ningún tubo positivo.
Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en las TABLAS 2 y 3, si las se-
ries de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son aceptables
desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras exami-
nadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3 (ver TABLA 4).
Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la TABLA 4, la se-
cuencia 2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario,
cuando los resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2
1 será admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia
2 2 1 es válida para una muestra única.
Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NMP
mediante la TABLA 2.
F
Cs = M ⋅ ⋅ Vs
V0
siendo:
Expresar el resultado de microorganismos por mililitro (producto líquido) o por gramo (res-
to de productos) como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x, siendo x el
orden de magnitud apropiado de 10.
Si el NMP es inferior a 0,3 microorganismos por mililitro (para productos líquidos) o por gra-
mo (para el resto de productos) y si se ha utilizado un modo operatorio adecuado para un número
bajo de microorganismos, el resultado deberá expresarse de la manera siguiente: menos de 1 mi-
croorganismo en 1 mL (para productos líquidos) o en 1 gramo de producto (para el resto de pro-
ductos).
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CAPÍTULO TERCERO
1. Definición:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri
estériles.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA a 45°C ± 1°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique 1.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.
5. Expresión de resultados 2:
• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
1
Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me-
dio, después de la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C ±1°C y dejar reposar.
2
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
62
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1. Definición:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA enfriado a 45°C - 47°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique 3.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.
5. Expresión de resultados 4:
• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
3
Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me-
dio, después de la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C - 47°C y dejar reposar.
4
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 4
1. Definición:
Levaduras y mohos: Microorganismos que a 25°C forman colonias en un medio selectivo,
cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medio de cultivo:
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri
estériles.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de CGA a 45°C ± 1°C.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.
4. Recuento:
• Contar las colonias de cada placa a los 3, 4 y 5 días de incubación.
5. Expresión de resultados 5:
• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co-
lonias, si es posible al nivel de dos diluciones sucesivas.
• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
5
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1. Definición:
Levaduras: Microorganismos aerobios mesófilos que, en cinco días, a 25°C, se desarrollan
en la superficie del medio sólido, formando colonias mates o brillantes, presentando fre-
cuentemente contorno regular y una superficie más o menos convexa cuando el ensayo se re-
aliza según el siguiente método.
Mohos: Microorganismos aerobios mesófilos, filamentosos, que en la superficie de un me-
dio sólido a 25°C, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza según el siguiente mé-
todo; este desarrollo puede proceder de la germinación de esporas o del crecimiento de frag-
mentos micelares.
2. Medio de cultivo:
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA) con gentamicina.
3. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en placas Petri con el me-
dio CGA.
• Extender con asa de Drigalski.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.
4. Recuento:
• Contar las colonias de cada placa a los 3, 4 y 5 días de incubación.
5. Expresión de resultados 6:
• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co-
lonias, al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa conten-
ga un mínimo de 15 colonias.
• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:
ΣC
N=
0,11 ⋅ d
6
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1. Definición:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa nega-
tiva cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble y simple concen-
tración.
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar glucosado (AG).
Agar nutritivo (AN).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siembra:
Enriquecimiento:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos con 10 mL de
caldo EE a doble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de caldo EE
a simple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
Aislamiento:
• Aislar en placas de VRBG a partir de cada tubo.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
Selección:
• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo violeta y a veces rodeadas de una
halo de precipitación del mismo color, o mucosas) 7 en placas de AN.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
5. Confirmación bioquímica:
Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva
si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.
Prueba de fermentación de la glucosa:
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxidasa k.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloración amarilla.
6. Expresión de resultados 8:
• Contar el número de tubos positivos para cada dilución. Si al menos una de las colonias es
oxidasa k y glucosa j, consideraremos positivo el tubo a partir de cual se ha realizado el
subcultivo.
• Determinar el número más probable (NMP) con la ayuda de una tabla.
7
Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de manera
que si no se encuentran colonias típicas, sembrar las colonias blanquecinas.
8
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1 Enriquecimiento 1 mL 1 mL 1 mL
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
caldo EE caldo EE
doble simple concentración
oxidaxa k AG
1. Definición:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa nega-
tiva, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar glucosado (AG).
Agar nutritivo (AN).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas
placas Petri.
• Verter unos 15 mL de VRBG a 45°C ± 1°C.
• Una vez solidificado, cubrir con 10-15 mL del mismo medio.
• Dejar solidificar e incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas que tengan un diá-
metro mayor o igual que 0,5 mm, de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de
precipitación o mucosas. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria-
ceae 9.
• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
9
Si la mitad de la superficie de la placa está invadida, la determinación se considerará sin valor. Si la
zona invadida fuera inferior a la mitad de la superficie de la placa, se efectúa el recuento de colonias sobre la
zona clara y se extrapola este valor a la superficie total.
10
Estas pruebas pueden realizarse simultáneamente con la siembra en AN, según criterio del laboratorio.
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Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
11
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
oxidaxa k AG
1. Definición:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa nega-
tiva cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agua de peptona tamponada (APT).
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE).
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar nutritivo (AN).
Agar glucosado (AG).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Realizar una dilución 1/10 en ATP.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 1 mL del cultivo anterior en 10 mL de caldo EE.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
Aislamiento:
• Aislar en placas con VRBG.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un
halo de precipitación del mismo color) 12 en placas de AN.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
5. Confirmación bioquímica:
Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva
si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.
Prueba de fermentación de la glucosa:
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida-
sa k.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloración amarilla.
12
Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de ma-
nera que si no se encuentran colonias típicas, tomar de las colonias blanquecinas y sembrar.
13
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10 mL ATP
Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h-24 h
DÍA 2
Enriquecimiento
1 mL
10 mL caldo EE
Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h
DÍA 3
VRBG
AN
oxidaxa k AG
1. Definición:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa nega-
tiva cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar glucosado (AG).
Agar nutritivo (AN).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre y verter
unos 15 mL de VRBG a 45°C - 47°C.
• Una vez solidificado, cubrir con unos 5 mL del mismo medio.
• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas con un diámetro ma-
yor o igual que 0,5 mm, de color rojo violeta y a veces rodeadas de una halo de precipi-
tación del mismo color. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria-
ceae.
• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
6. Confirmación bioquímica:
Prueba de la oxidasa:
• Se realiza con cada una de les colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg
aparece una coloración violeta.
Prueba de fermentación de la glucosa:
• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las cepas oxidasa k.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo apa-
rece una coloración amarilla.
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b
a= ×C
5
Σa
N=
1,1 ⋅ d
14
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Aislamiento
Tomar 5 colonias características de cada placa y sembrar en AN
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas
cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL).
3. Siembra:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do-
ble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim-
ple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales 15.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante:
— 24 h ± 2 h en tubos de concentración doble.
— 24 h ± 2 h ó 48 h ± 2 h en tubos de concentración simple.
• Realizar lecturas al cabo de 24 h y 48 h.
4. Confirmación:
• Retener los tubos que presentan formación de gas.
• A partir de cada tubo con gas, sembrar con asa de Kolle en BGBL.
• Incubar a 30°C ± 1°C, realizando lecturas al cabo de 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
• Consideramos la reacción positiva si se produce desprendimiento de gas.
15
Realizar un número de diluciones suficiente para que todos los tubos de la última dilución sean ne-
gativos.
16
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
TSL a simple concentración
TSL a doble
concentración
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa cuando el ensayo se re-
aliza según el siguiente método.
2. Medio de cultivo:
Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas
placas Petri estériles.
• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
• Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 2°C.
• Mezclar y dejar solidificar.
• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
• Cubrir con 4 mL del mismo medio a 45°C ± 2°C.
• Dejar solidificar e incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que conten-
gan menos de 150 colonias características y/o no características.
ΣC
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
17
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Placa
testigo
1. Definición:
Coliformes: Bacterias que a 30°C forman colonias características en el agar lactosado con
bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL) cuando el ensayo se realiza según el siguiente
método.
2. Medio de cultivo:
Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.
• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
• Verter 15 mL de VRBL a 45°C - 47°C.
• Mezclar y dejar solidificar.
• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
• Cubrir con unos 5 mL del mismo medio a 45°C - 47°C.
• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que con-
tengan menos de 150 colonias características y/o no características.
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
18
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1. Definición:
Escherichia coli: Bacterias que a 45°C fermentan la lactosa con producción de gas y que a
esta misma temperatura producen indol a partir del triptófano cuando el ensayo se realiza se-
gún el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo Escherichia coli (Caldo EC).
Agua de triptona (AT).
3. Reactivo:
Reactivo de Kovacs.
4. Siembra:
• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do-
ble concentración.
• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim-
ple concentración.
• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.
• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
5. Confirmación:
• A partir de cada tubo con formación de gas, sembrar con asa de Kolle en Caldo EC y en
AT, atemperados a 45°C ± 2°C.
• Incubar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 48 h ± 2 h.
6. Recuento:
Prueba del Indol:
• Añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT.
• Mezclar y examinar al cabo de 1 min.
• Una coloración roja en la fase alcohólica indica reacción j.
Formación de gas:
• La formación de gas en la campana de Durham indica reacción j.
19
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
TSL a doble TSL a simple concentración
concentración
EC AT
Determinar el NMP
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1. Definición:
Escherichia coli β-glucuronidasa positivos: Bacterias que a 44°C forman colonias caracte-
rísticas en el agar con tergitol (PTX), adicionado de un substrato cromogénico (BCIG) que
revele la presencia de β-glucuronidasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente mé-
todo.
2. Medio de cultivo:
Agar con tergitol - BCIG (PTX)
3. Siembra:
• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.
• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
• Verter 15 mL de PTX a 45°C - 47°C.
• Mezclar y dejar solidificar.
• Incubar a 44°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
4. Recuento:
• Contar las colonias características de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (de color
azul) en las placas que contengan menos de 150 colonias características y no característi-
cas.
Σa
N=
1,1 ⋅ d
20
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 2
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características y/o
no características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacción
positiva en la prueba de la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo de cerebro-corazón (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en dos
placas Petri con medio BP.
• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 21.
• Extender con asa de Drigalsky.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.
• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.
5. Recuento:
• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1
a 1,5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
• Incubar durante 24 h ± 2 h más.
• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no ca-
racterísticas (éstas pueden no tener zona clara).
• Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150 colonias característi-
cas y no características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una
placa contenga un mínimo de 15 colonias.
21
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
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6. Confirmación:
• Elegir al azar de cada placa seleccionada:
— 5 colonias características si sólo hay colonias características.
— 5 colonias no características si sólo hay colonias no características.
— 5 colonias características y 5 colonias no características si están presentes ambos tipos.
— Si hay menos de 5 colonias, de cualquier tipo, elegirlas todas.
• Sembrar en un tubo con BHI.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
• Incubar a 37°C ± 1°C.
• Examinar la coagulación del plasma al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa
más de 1/2 del volumen ocupado inicialmente por el líquido.
NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo con CPS.
b c c b nc nc
a= ⋅ c + nc ⋅ c
Ac A
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
22
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL
BP
0,3 mL
plasma de conejo
Incubar a 37°C ± 1°C
Examinar la coagulación al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)
DÍA 5
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características en el
medio de agar selectivo de plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza según
el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).
3. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en dos pla-
cas Petri.
• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 3 mm de RPF a 47°C ± 0,5°C 23.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
• Incubar durante 18 h - 24 h a 37°C ± 1°C (+ 18 h - 24 h si es necesario).
4. Recuento:
• Retener las placas que contengan que contengan un máximo de 300 colonias, con 100 co-
lonias características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos
una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.
• Contar las colonias características de cada placa, que en RPF pequeñas, negras o grises, o
incluso blancas, están rodeadas de un halo de precipitación que indica la presencia de
coagulasa.
ΣC
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
23
Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.
24
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características y no
características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacción po-
sitiva a la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo cerebro-corazón (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en una placa Petri con BP.
• Repetir la operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 25.
• Extender con asa de Drigalsky.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.
• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.
5. Recuento:
• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1
a 1,5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
• Incubar durante 24 h ± 2 h más.
• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no ca-
racterísticas (éstas pueden no tener zona clara).
• Retener las placas que tengan menos de 150 colonias características y no características al
nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las placas contenga un
mínimo de 15 colonias.
25
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado). En este caso, realizaremos las operaciones de recuento y confirmación sobre el conjunto de estas
placas.
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6. Confirmación 26:
• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada (opcionalmente también
3 colonias no características) y sembrar en un tubo con BHI.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
• Incubar a 37°C ± 1°C.
• Examinar la coagulación del plasma al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa
más de 3/4 del volumen ocupado por el líquido.
NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo sembrando CPS.
b c c b nc nc
a= ⋅ c + nc ⋅ c
Ac A
Σa
N=
V ⋅ 1,1 ⋅ d
26
Realizar la prueba de la catalasa (facultativa), reteniendo las colonias catalasa j.
27
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
0,3 mL
plasma de conejo
Incubar a 37°C ± 1°C
Examinar la coagulación al cabo de 1/2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)
DÍA 5
1. Definición:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características en un
medio sólido selectivo con plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza según
el siguiente método.
2. Medio de cultivo:
Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).
3. Siembra:
• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.
• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 10 mL de RPF a 47°C ± 0,5°C 28.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 18 h - 24 h si fuera necesario).
4. Recuento:
• Contar las colonias características de cada placa, que son negras o grises, pequeñas y es-
tán rodeadas de una zona opaca o turbia, indicativa de la presencia de coagulasa.
• Retener las placas que contengan menos de 100 colonias características al nivel de dos di-
luciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 co-
lonias características.
ΣC
N=
1,1 ⋅ d
28
Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.
29
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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DÍA 1 1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 2
1. Definición:
Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa j que no fermentan el manitol cuando el
análisis se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Agar glucosado (AG).
Medio Voges-Proskauer (MR-VP).
Medio nitrato (MN).
3. Reactivos:
• Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP):
— solución de α-naftol.
— solución de hidróxido potásico.
— cristales de creatina.
• Reactivos para la investigación de nitritos:
— solución de 5-2 ANSA.
— solución de ácido sulfanílico.
— solución de ácido acético.
— zinc en polvo.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre una placa
de MYPA.
• Extender con asa de Drigalski.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales 30.
• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min. a T ambiente.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).
5. Recuento:
• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu-
ciones sucesivas. Es necesario que una placa contenga un mínimo de 15 colonias carac-
terísticas.
• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan ma-
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismos manitol j, el color ro-
sado característico puede desaparecer.
30
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
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6. Confirmación:
• Elegir al azar 5 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay
menos de 5 elegirlas todas) y sembrar:
— Por picadura en los tubos de AG, regenerado (10 min en agua hirviendo).
— Por emulsión en tubos de MR-VP.
— Por emulsión en tubos de MN a 30°C (1°C.
• Incubar a 30°C (1°C durante 24 h (+ 24 h para MR-VP).
7. Lectura:
AG:
Interpretación: Positivo cuando aparece coloración amarilla.
MR-VP:
• Transferir de cada tubo 1 mL de cultivo a un tubo vacío.
• Añadir 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio, 0,6 mL de solución de (-naftol y al-
gunos cristales de creatina.
• Mezclar enérgicamente y dejar reposar durante 1 h.
Interpretación: Una coloración rosa eosina en la superficie del tubo indica reacción posi-
tiva.
MN:
• Añadir a cada tubo de 0,2 a 0,5 mL de reactivo completo para la investigación de nitritos.
Interpretación: Consideramos nitritos (si aparece una coloración roja. Generalmente la re-
acción es instantánea; si no aparece coloración roja en 15 minutos, añadir zinc en polvo, y si
a los 10 minutos no se colorea, consideramos la prueba positiva.
Manitol en MYPA k
Lecitina en MYPA j
Glucosa j
Voges-Proskauer j
Nitritos j
Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
31
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
1 mL
+ reactivos
+ reactivos
Nitritos j si aparece
VP j si aparece AG j si aparece coloración roja o si
coloración rosa coloración amarilla después de añadir Zn
no se colorea
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1. Definición:
Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa j que no fermentan el manitol cuando el en-
sayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Agar sangre (AS).
Agar movilidad (AM).
3. Siembra:
• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en una placa de MYPA.
• Extender con asa de Drigalski.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales 32.
• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min a T ambiente.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).
4. Recuento:
• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu-
ciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias
características.
• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan ma-
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismos manitol j, el color ro-
sado característico puede desaparecer.
5. Confirmación:
• Elegir al azar 3 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay
menos de 3, elegirlas todas) y sembrar:
— Estrías paralelas en AS (prueba de la hemólisis)
— Por picadura en AM (prueba de la movilidad) 33.
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
32
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm.
33
La movilidad se pone en evidencia por el desarrollo bacteriano a lo largo del tubo y en profundidad a
partir del punto de picadura.
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6. Interpretación:
Bacillus cereus presenta las siguientes características:
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Bacillus ce-
reus por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
34
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
AS AM
Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h
DÍA 3
1. Definición:
Clostridium perfringens: Bacterias que forman colonias características (rodeadas de un
halo negro) en el medio selectivo especificado, y que dan reacciones de confirmación posi-
tivas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar triptona-sulfito con cicloserina (TSC).
Medio tioglicolato (TIO).
Medio lactosa sulfito (LS).
3. Reactivos:
Metabisulfito sódico al 1,2%.
Citrato férrico amoniacal al 1%.
4. Siembra:
• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL dilución madre en placas Petri es-
tériles.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C 35.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Añadir 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre-
suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece-
sario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
6. Confirmación:
• Elegir al azar 5 colonias características de cada placa seleccionada (si hay menos de 5 ele-
girlas todas) y sembrar con pipeta Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en
agua hirviendo).
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h en jarras para anaerobios.
• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).
• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h.
35
Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.
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7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan más de 1/4 de gas en la campana Durham y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar
según lo descrito.
8. Interpretación:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostridium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
(n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
36
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
+ reactivos
1. Definición:
Clostridium perfringens: Bacterias que forman colonias negras en el medio selectivo espe-
cificado y que dan reacciones de confirmación positivas cuando el ensayo se realiza según el
siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agar triptosa-sulfito con cicloserina (TSC).
Medio tioglicolato (TIO).
Medio lactosa sulfito (LS).
3. Reactivos:
Metabisulfito sódico al 1,2%.
Citrato férrico amoniacal al 1%.
4. Siembra:
• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.
• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.
• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C (0,5°C) 37.
• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
• Añadir unos 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.
5. Recuento:
• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre-
suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece-
sario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
6. Confirmación:
• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada y sembrar con pipeta
Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en agua hirviendo) 38.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.
• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).
• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 24 h ± 2 h.
37
Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.
38
Si no es posible seleccionar colonias características bien aisladas, sembrar 3 grupos de colonias en el
medio TIO. Incubar en anaerobiosis a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h y aislar en placas con TSC (ver punto
3). Escoger de cada placa al menos una colonia característica aislada y confirmar.
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7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan más de 1/3 gas en la campana Durham y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar
según lo descrito.
8. Interpretación:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.
b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostridium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
1,1 ⋅ d
39
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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1 mL 1 mL 1 mL
DÍA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
+ reactivos
1. Definición:
Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos
especificados, y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el
ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agua de peptona tamponada (APT).
Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modifi-
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Agar rojo fenol y verde brillante (BGA).
Medio Hektoen (HK).
Agar nutritivo (AN).
Agar Kligler.
Agar nutritivo semisólido (ANS).
3. Reactivos:
Solución salina (SS).
Reactivo para la investigación de la β-galactoxidasa (ONPG).
Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).
Solución de cloruro férrico al 10%.
Galerías miniaturizadas de orientación e identificación bioquímica (API).
4. Sueros:
Antisueros polivalentes «O», «Vi» y «H».
5. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
• Sembrar 10 mL del cultivo en un frasco con 100 mL de SC.
• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
• Incubar el frasco de SC a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario).
Aislamiento 40:
• Aislar en placas de BGA a partir de cada tubo de RV incubado durante 24 h ± 2 h.
• Realizar la misma operación en HK.
• Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC 41 incubado durante 24 h ± 2 h.
• Realizar la misma operación en HK.
40
Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella,
incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
41
No agitar el frasco de SC.
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6. Confirmaciones:
• Retener de cada aislamiento 5 colonias típicas o sospechosas de Salmonella (si en algu-
na placa hay menos de 5, elegirlas todas), que sobre BGA son incoloras o rosas, con un
halo rojo y sobre Hektoen son verde-azulado con un centro negro.
• Sembrar en placas de AN.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h 42.
Pruebas bioquímicas:
* KLIGLER
• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:
42
Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.
43
Existen algunas cepas de Salmonella lactosa j. En este caso, una confirmación preliminar de Sal-
monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el Kligler.
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Pruebas serológicas:
* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.
• Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificación serológica.
* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «O» y «Vi»
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de cada uno de los sueros polivalen-
tes sobre un portaobjetos 45.
• En caso de no obtener un resultado positivo, hacer una emulsión del cultivo puro en
una gota de antisuero «Vi» sobre un portaobjetos 45.
• Remover durante 30 s - 60 s.
• Realizar las pruebas con los sueros monovalentes «O» correspondientes al suero po-
livalente que ha dado positivo (según tabla del proveedor).
Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.
* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «H»
• Sembrar una colonia pura no auto-aglutinable en ANS.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de antisuero «H», sobre un portaob-
jetos 45.
• Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.
NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas de glucosa. Las subespecies IIIa y IIIb pueden
ser lactosa j o k, pero son siempre β-galatosidasa j. Salmonella Paratyphi A da reac-
ción negativa a la descarboxilación de la L-lisina. Así que para el estudio de estas cepas
puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias.
44
La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniaturizada (API).
45
Utilizar los sueros polivalentes y monovalentes uno después del otro.
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Reacciones Auto-
Reacciones serológicas Interpretación
bioquímicas aglutinación
Típicas No Antígeno «O», «Vi» o «H» positivo Salmonella
Típicas No Negativo Posible Salmonella
Típicas Sí No realizadas Posible Salmonella
No típicas No Antígeno «O», «Vi» o «H» positivo Posible Salmonella
No típicas No Negativo No Salmonella
9. Confirmación definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centro especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación
definitiva del serotipo.
Pre-riquecimiento 25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de APT
DÍA 2
Enriquecimiento
0,1 mL 10 mL
10 mL de RV 100 mL de SC
Incubar a 42°C ± 1°C Incubar a 37°C ± 1°C
durante 24 h ± 2 h durante 24 h ± 2 h
(+24 h si es necesario)
DÍA 3
Aislamiento
BGA HK BGA HK
BGA HK
Confirmaciones
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Pruebas bioquímicas
DÍA 6 AGAR KLIGLER
Añadir 1 gota de
cloruro férrico
DÍA 8
Pruebas serológicas
ELIMINACIÓN DE LAS ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS
CEPAS AUTOAGLUTINABLES
ANS
«H»
1. Definición:
Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos
especificados y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el
ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agua de peptona tamponada (APT).
Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modifi-
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Medio Hektoen (HK).
Agar nutritivo (AN).
Agar Kligler.
3. Reactivos:
Solución salina (SS).
Reactivo para la investigación de la β-galactoxidasa (ONPG).
Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).
Cloruro férrico al 10%.
Galerías miniaturizadas de orientación e identificación bioquímica (API).
4. Suero:
Antisuero «O».
5. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra (x mL
o x g de muestra + 9x mL de APT).
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
• Sembrar 2 mL del cultivo en un tubo con 20 mL de SC.
• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
• Incubar el frasco de SC a 37°C ± 1°C 18 h - 24 h.
Aislamiento 46:
• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de RV.
• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de SC 47.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).
46
Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella,
incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.
47
No agitar el frasco de SC.
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6. Confirmaciones:
• Retener de cada aislamiento 2 o más colonias típicas o sospechosas de Salmonella 48, que
en medio HK son de color verde-azulado, con o sin centro negro.
Pruebas bioquímicas:
* KLIGLER
• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:
Interpretación: Los cultivos típicos de Salmonella responden a una pendiente roja con
o sin formación de gas y base amarilla, con formación de H2S en un 90% de los casos 49.
* INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA
• Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.
• Añadir 0,25 mL de ONPG.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h, haciendo lecturas al cabo de
1
/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración amarilla.
NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa j o una β-galactosidasa j que al mis-
mo tiempo presente formación de sufhídrico, sembrar en medio lisina-hierro para des-
cartar así las salmonelas del grupo IIIa y IIIb.
* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA DESAMINASA
• Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.
• Añadir 0,5 mL de FA.
• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 4 h.
• Añadir una gota de cloruro férrico al 10%.
Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración verde espinaca,
mientras que cuando ésta es negativa, el color que aparece es amarillo.
* GALERÍA DE IDENTIFICACIÓN 50
• Realizar una emulsión en SS.
• Sembrar según las indicaciones del fabricante.
Interpretación: Comparar los resultados obtenidos con el patrón de colores y consultar
el índice analítico y/o el «software» APILAB PLUS.
48
Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.
49
Existen algunas cepas de Salmonella lactosa j. En este caso, una confirmación preliminar de Sal-
monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el agar Kligler.
50
La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniaturizada (API).
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Pruebas serológicas:
* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.
• Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificación serológica.
* ESTUDIO DEL ANTÍGENO «O»
• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de antisuero «O», sobre un portaob-
jetos 51.
• Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.
Reacciones Auto-
Reacciones serológicas Interpretación
bioquímicas aglutinación
Típicas No Antígeno «O» positivo Salmonella
Típicas No Negativo Posible Salmonella
Típicas Sí No realizadas Posible Salmonella
No típicas No Negativo No Salmonella
9. Confirmación definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centro especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación
definitiva del serotipo.
51
Utilizar los sueros poli y monovalentes uno después del otro.
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10 mL de RV 20 mL de SC
Incubar a 42°C ± 1°C Incubar a 37°C ± 1°C
durante 18 h-24 h durante 18 h-24 h
DÍA 3
Aislamiento
HK HK
Confirmaciones
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AGAR KLIGLER
DÍA 5 Pruebas bioquímicas
DÍA 8
Pruebas serológicas
SS «O»
1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios
selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisio-
lógicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
Agar PALCAM.
Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).
Agar sangre (AS).
Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).
Agar movilidad (AM).
3. Reactivos:
Solución de peróxido de hidrógeno.
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL x g
de muestra + 9x mL de medio).
• Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 48 h ± 2 h.
Aislamiento:
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar PALCAM.
• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar PALCAM.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).
En agar PALCAM, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son pequeñas,
de color verde con reflejos grisáceos, eventualmente con un centro negro y siempre rodeadas
de un halo negro. Después de incubar 24 h más, aparece una depresión central.
NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
loras, translúcidas y con bordes regulares.
Prueba de la catalasa:
Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.
Coloración de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram j.
Examen de movilidad 53:
• Sembrar por picadura una colonia en AM.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo
típico en forma de sombrilla.
52
En caso necesario, realizar el test de iluminación de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con
una superficie granulada.
53
Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.
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8. Interpretación:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles, catalasa j.
Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:
siendo:
* V: reacción variable
* (+): reacción débil
* +: reacción positiva en más del 90%
* –: ausencia de reacción
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Pre-enriquecimiento
DÍA 1 25 mL o 25 g de muestra
225 mL de FS
DM + suplemento (x mL)
+0,1 mL de suplemento
AM
AM: Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)
Confirmación de la especie*
INVESTIGACIÓN HEMÓLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP
AS Ramnosa Xilosa AS
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)
DÍA 6
Lectura
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1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los me-
dios selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y
fisiológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Agua de peptona tamponada (APT).
Agar PALCAM.
Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).
Agar sangre (AS).
Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).
Agar movilidad (AM).
3. Reactivo:
Solución de peróxido de hidrógeno.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 100 mL de APT a 10 mL o 10 g de muestra (x mL
o x g de muestra + 9x mL de medio).
• Dejar en reposo durante 1 h ± 5 min.
• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la dilución madre en agar PALCAM.
• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales 54.
• Extender con asa de Drigalsky.
• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 18 h - 24 h si es necesario).
6. Recuento:
• Contar las colonias que, tras 24 h de incubación, sean pequeñas, de color grisáceo y ro-
deadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, las colonias son mayores, even-
tualmente con reflejos verdosos y con una depresión central.
• Retener las placas con menos de 150 colonias características, si es posible al nivel de dos
diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 co-
lonias.
54
Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 10 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
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NOTA: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
loras, translúcidas y con bordes regulares.
Prueba de la catalasa:
Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.
Coloración de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram j.
Examen de movilidad 56:
• Sembrar por picadura una colonia en AM.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h ± 3 días.
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un culti-
vo típico en forma de sombrilla.
9. Interpretación:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles, catalasa j.
Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características descritas
en la tabla del PNT-AL-023.1.
55
En caso necesario, realizar el test de iluminación de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con
una superficie granulada.
56
Si se observa al microscopio, Listeria sp aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.
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b
a= ⋅C
A
• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Listeria
monocytogenes por mililitro o por gramo con la expresión:
Σa
N=
V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d
57
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de FS
DM
1 mL 1 mL 1 mL
AS Ramnosa Xilosa AS
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)
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1. Definición:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios
selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisio-
lógicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.
2. Medios de cultivo:
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
Agar PALCAM.
Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).
Agar sangre (AS).
Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).
Agar movilidad (AM).
3. Reactivos:
Solución de peróxido de hidrógeno.
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (CIP 5869).
Cepa de Staphylococcus aureus (CIP 5710).
5. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL o
x g de muestra + 9x mL de medio).
• Incubar a 30°C ±1°C durante 24 h ±2 h.
Enriquecimiento:
• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 48 h ± 2 h.
Aislamiento 58:
• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 24 h.
• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 48 h.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario).
NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son
pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, do-
blan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo
negro y una depresión central.
58
Según el tipo de flora acompañante de las muestras, podemos sustituir el agar Oxford por agar
PALCAM.
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NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, inco-
loras, translúcidas y con bordes regulares.
Prueba de la catalasa:
Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.
Coloración de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram j.
Examen de movilidad 60:
• Sembrar por picadura una colonia en AM.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).
• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo
típico en forma de sombrilla.
59
En caso necesario, realizar el test de iluminación de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con
una superficie granulada.
60
Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for-
ma de voltereta.
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8. Interpretación:
Todas la Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram j, móviles catalasa j. Lis-
teria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:
siendo:
* V: reacción variable
* (+): reacción débil
* +: reacción positiva en más del 90%
* –: ausencia de reacción
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Pre-enriquecimiento 25 mL o 25 g de muestra
DÍA 1 225 mL de FS
DM + suplemento (x mL)
0,1 mL
+0,1 mL de suplemento
Agar OXFORD FC
Incubar a 37°C ± 1°C Incubar a 37°C ± 1°C
DÍA 3 durante 24 h ± 2 h* durante 24 h ± 2 h* durante 48 h ± 2 h*
DÍA 4
Aislamiento
Agar OXFORD
Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)
DÍA 5
Confirmación del género
Sembrar 5 colonias de cada placa en TSYEA
Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h
DÍA 6
AM
AM: Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)
Confirmación de la especie*
INVESTIGACIÓN HEMÓLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP
AS Ramnosa Xilosa AS
Lectura
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1. Definiciones:
Campylobacter termotolerantes: Microorganismos que forman colonias típicas en me-
dios selectivos sólidos cuando se incuban a 42°C y que poseen una movilidad característi-
ca y las propiedades bioquímicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente
método.
2. Medios de cultivo:
Caldo de Park y Sanders.
Agar de Karmali (AK).
Agar Butzler modificado.
Caldo de Brucella (CB).
Agar de sangre Columbia.
Agar citrato de hierro tres azúcares (TSI).
Agar de sangre Mueller Hinton.
3. Reactivos:
Sangre de caballo desfibrinada.
Solución de antibióticos «A».
Solución de antibióticos «B».
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
Solución H2O2 al 3%.
Reactivo para la detección de la hidrólisis del hipurato.
• Solución de hipurato sódico.
• Solución de nihidrina al 3,5%.
Discos de ácido nalidíxico.
Discos de cefalotina.
4. Siembra:
• Preparar la dilución madre añadiendo 9x mL de caldo Park y Sanders a x (g o mg) de
muestra.
• Sembrar con asa en AK.
• Sembrar con asa en agar Butzler modificado.
• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila, inspeccionando al cabo de 48 h y 72 h
(+ 2 días si es necesario).
Pre-enriquecimiento 61:
• Incubar la dilución madre de caldo Park y Sanders durante 4 h a 32°C ± 1°C en atmósfe-
ra microaerófila.
61
En ciertos casos, se puede sustituir el caldo Park y Sanders por caldo Preston. Ver norma ISO
10272.
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Enriquecimiento:
• Añadir la solución antibiótica «B» al 5%.
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 2 h y luego 40 h ± 2 h a 42°C ± 1°C en atmósfera microae-
rófila.
Aislamiento:
• Sembrar el cultivo enriquecido en AK.
• Sembrar el cultivo enriquecido en agar Butzler modificado.
• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila durante 24 h (+ 4 días si es necesario).
NOTA: En AK las colonias de Campylobacter termotolerantes son grises, planas y húme-
das, con tendencia a extenderse. En agar Butzler las colonias características pueden virar a
marrón y pueden tener distintos tamaños.
5. Confirmación:
• Retener de cada medio 5 colonias características o sospechosas.
Morfología y movilidad:
• Hacer una tinción Gram de una colonia de cada placa y examinar al microscopio.
• Emulsionar cada colonia de bacilos Gram k curvados en 1 mL de CB y observar la mo-
vilidad; Campylobacter se mueve en forma de sacacorchos.
• Sembrar las colonias que posean estas características en agar Columbia sangre e incubar
en atmósfera microaerófila a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.
6. Identificación
Crecimiento a 25°C:
• Sembrar con asa las colonias anteriores en CB.
• Incubar a 25°C ± 1°C durante 2-5 días en atmósfera microaerófila.
• Examinar si hay crecimiento.
Pruebas bioquímicas:
* PRUEBA DE LA OXIDASA
* AGAR TSI
• Sembrar en TSI las colonias seleccionadas.
• Incubar a 42°C (1°C durante 24 h (+ 5 días si es necesario) en atmósfera microaerófila.
Interpretación: Consideraremos los siguientes resultados:
* PRUEBA DE LA CATALASA
* SENSIBILIDAD AL ÁCIDO NALIXÍDICO Y A LA CEFALOTINA
• Realizar una suspensión en CB de densidad 0,5 en la escala McFarland.
• Diluir la suspensión 1:10 con el mismo caldo.
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• Inundar la superficie de una placa de agar Mueller Hinton al 5% de sangre con la sus-
pensión.
• Dejar en contacto durante 5 minutos y eliminar el exceso.
• Secar las placas en la estufa a 37°C ± 1°C durante 10 minutos.
• Colocar en la superfície del agar un disco de ácido nalidíxico (30 μg) y un disco de ce-
falotina (30 μg).
• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2h en atmósfera microaerófila.
Interpretación: Consideraremos resistente la bacteria si hay crecimiento hasta el límite
del disco y sensible si hay zonas sin crecimiento (zonas de inhibición).
* DETECCIÓN DE LA HIDRÓLISIS DEL HIPURATO
• Sembrar las colonias de bacilos Gram k aisladas en tubo de hemolisis con 0,4 mL de
solución de hipurato sódico.
• Mezclar e incubar a 37°C ± 0,5°C durante 2 h en un baño de agua.
• Añadir, sin mezclar, 0,2 mL de solución de nihidrina en la superficie de la solución de
hipurato sódico.
• Incubar durante 10 minutos más.
Interpretación: Consideramos la reacción positiva si aparece coloración violeta oscuro.
7. Interpretación de resultados:
Las colonias de Campylobacter sp. son:
Bacilos pequeños y curvados.
Con movilidad característica.
Gram k.
Oxidasa j.
Glucosa k.
Lactosa k.
Sacarosa k.
Producción de gas k.
Consideramos presencia de Campylobacter sp. si al menos una colonia presenta estas ca-
racterísticas.
62
Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.
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x g o x mL de muestra
DÍA 1 9x mL de caldo de Park y Sanders DÍA 1
+ suplementos
Pre-enriquecimiento
AK Agar Butzler modificado
Incubar a 42°C ± 1°C en atm. Incubar a 32°C ± 1°C en atm.
microaerófila durante 48 h y 72 h microaerófila durante 4h
(+2 días si es necesario)
DÍA 3
Enriquecimiento
Identificación
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j si al cabo de 30 s
aparecen burbujas j si aparece
coloración violeta
139
Incubar a 25°C ± 1°C en atm. microaerófila durante 24 h ± 2 h
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CAPÍTULO CUARTO
1. OBJETO
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los en-
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. PROCEDIMIENTO
Se redactará un PNT para cada uno de los medios de cultivo necesarios para realizar los ensa-
yos de el laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su prepa-
ración.
Estos procedimientos se denominan PNT - ME y constan de los siguientes apartados:
0. Carátula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparación.
4. Composición en g/l.
5. Controles del medio preparado.
6. Conservación.
4.1. Carátula
143
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La finalidad de uso explica la utilidad del medio de cultivo en el ensayo en el que se utiliza.
4.3. Principios
En este apartado se explica, de manera resumida, la actividad del medio o de alguno de sus com-
ponentes en el análisis.
4.4. Preparación
Se señala, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el medio de cul-
tivo, indicando:
Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es ne-
cesario) y cantidad exacta.
NOTA 1: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti-
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
Estos controles se realizan para confirmar la calidad del medio de cultivo y constan de cuatro
pruebas 1:
1
Estos controles se explican en el PNT - ME - 002 sobre control de calidad de medios de cultivo.
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En este apartado se exponen las características físicas y de pH que debe reunir el medio pre-
parado, indicando asimismo las cepas a ensayar y los caracteres a estudiar en el control de efi-
cacia, basados principalmente en la morfología y el color de las colonias y en las reacciones de
diferenciación y selectividad.
4.7. Conservación
Indicar, para cada tipo de recipiente utilizado, las condiciones de tiempo y temperatura necesarias
para la conservación del producto en condiciones óptimas, de manera que su eficacia no se vea
alterada.
En aquellos medios de cultivo que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indi-
carse estas condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 2: Cuando se indica que el medio de cultivo debe utilizarse inmediatamente, se per-
mite que el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su prepa-
ración.
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CAPÍTULO QUINTO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los con-
troles de medios de cultivo.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los en-
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. PROCEDIMIENTO
Los medios de cultivo utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que
se especifican en el apartado 5 de su PNT - ME correspondiente.
En general se realiza:
• Un control macroscópico.
• Un control de pH a 25°C.
• Un control de esterilidad.
• Un control de eficacia.
Los controles del medio se deben realizar el mismo día o como máximo al siguiente de su
preparación.
El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des-
cartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (lí-
quida o sólida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co-
rresponden con los que se indican en el PNT.
4.2. Control de pH
Se realiza con un pHímetro una medición del pH del medio a una temperatura de 25°C; el valor
obtenido ha de corresponder con el indicado en el PNT correspondiente, donde se da un intervalo
de aceptación de ± 0,2.
149
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Este control se efectúa para comprobar que el medio de cultivo no está contaminado, cosa que lo
haría inadecuado para su finalidad.
Después de incubar el medio (un 10% del lote preparado) a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 4 h,
se observa su aspecto, transparencia, si hay turbidez o cambio en el color, si hay gas en la
campana de Durham... Se desechará el medio que presente alteraciones en alguno de estos ca-
racteres.
En el caso de los medios no transparentes, realizar un subcultivo en un medio de cultivo no
selectivo (AN, PCA, TSA). Los medios destinados a controles de esterilidad deberán incubarse
en su totalidad.
Este control se realiza para comprobar la eficacia del medio de cultivo, observando determinados
caracteres que el crecimiento de determinadas cepas (que se especifican en el PNT - ME co-
rrespondiente) produce en el medio que se está controlando.
Se siembran tantas placas o tubos con medio de cultivo como cepas distintas se requieran
para el control y se incuban en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que se necesitan
para el análisis de alimentos o de aguas en que interviene el medio.
Después de la incubación se evalúan las características dadas en el PNT - ME, observando
aspectos como el crecimiento y color de las colonias, el color del medio, la formación de preci-
pitado o de gas, si hay o no halo...
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CAPÍTULO SEXTO
Procedimiento de preparación
de medios de cultivo
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153
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018
025 AGAR SANGRE AS 023.1
023.2
024
018
023.1
026 AGAR MOVILIDAD AM
023.2
024
019
027 AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA TSC
020
019
028 MEDIO TIOGLICOLATO TIO
0020
019
029 MEDIO LACTOSA SULFITO LS
020
CALDO CON VERDE DE MALAQUITA Y CLORURO DE 021
030 RV
MAGNESIO O DE RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO 022
021
031 CALDO SELENTO-CISTINA VSC
022
032 AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE BGA 021
021
033 HEKTOEN
022
021
034 AGAR KLIGLER
022
035 AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO 021
023.1
036 CALDO FRASER SEMI FS
024
023.1
037 CALDO FRASER COMPLETO FC
024
023.1
038 AGAR OXFORD
024
023.1
039 AGAR PALCAM 023.2
024
023.1
040 AGAR TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA TSYEA 023.2
024
023.1
041 CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS 023.2
024
042 CALDO DE PARK Y SANDERS 025
043 AGAR KARMALI AK 025
044 AGAR BUTZLER MODIFICADO 025
045 CALDO DE BRUCELLA CB 025
046 AGAR DE SANGRE COLUMBIA 025
047 AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON 025
048 AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZÚCARES TSI 025
049 CALDO TRIPTONA DE SOJA TSB RE-004
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1. Finalidad de uso:
PS (Peptona Salina) es un diluyente que se utiliza para realizar la dilución madre y los ban-
cos de diluciones.
2. Principios:
Se trata de un medio no inhibidor que facilita la recuperación de microorganismos estre-
sados.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir:
| 9 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm. o
| el volumen necesario, según uso, en frascos de capacidad adecuada (uno de los dos).
4. Composición en g/l:
Peptona .......................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 8,5
Microorganismo Crecimiento
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
PCA (Plate Count Agar) es un medio de cultivo utilizado para la multiplicación y recuento
por inclusión de todos los microorganismos aerobios mesófilos poco exigentes, en alimentos.
2. Principios:
La composición del medio permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 23,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Según el uso:
| Placas:
| Tubos:
4. Composición en g/l:
Triptona.......................................................................................................................... 10
Extracto de levadura....................................................................................................... 2,5
Glucosa........................................................................................................................... 1
Agar bacteriológico........................................................................................................ 15
Microorganismo Crecimiento
Staphylococcus aureus Bueno
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos ........................................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con tapón de rosca .............................................................. 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AB (Agar Blanco) se utiliza en el método ISO 4833 para el recuento en alimentos de mi-
croorganismos aerobios mesófilos poco exigentes cuando se sospecha que el producto a ana-
lizar contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie de los medios.
2. Principios:
El AB cubre el medio de cultivo, facilitando así el recuento de las colonias.
3. Preparación:
• Disolver 18 g de agar en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
4. Composición en g/l:
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 18
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
CGA (Agar Glucosa y Cloranfenicol) es un medio de cultivo utilizado para el recuento de le-
vaduras y mohos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene extracto de levadura y glucosa, que favorecen el crecimiento de las le-
vaduras y mohos.
La presencia del clorafenicol, que es un antibiótico estable al calor, inhibe el crecimiento de
bacterias.
3. Preparación:
• Disolver 40,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.
NOTA: Cuando este medio se utiliza para el recuento de levaduras y mohos según la
norma AFNOR (XF V 08-059), y en caso que se sospeche la presencia de contaminación
importante por bacterias Gram negativas, añadimos al medio 2 mL de SUPLEMENTO
ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA (PNT-RE-003). Homogeneizar sin incorporar
aire. Repartir en placas Petri estériles y dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Extracto de levadura ...................................................................................................... 5
Glucosa .......................................................................................................................... 20
Cloranfenicol ................................................................................................................. 0,1
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 15
Microorganismo Crecimiento
Saccharomyces cerevisiae Bueno
Aspergillus niger Bueno
Escherichia coli Nulo
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
El CALDO EE (Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa) es un medio de cul-
tivo selectivo utilizado para la detección de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
La presencia simultanea de bilis y verde brillante inhibe el crecimiento de la mayoría de bac-
terias Gram positivas y de las Gram negativas no enterobacterias.
Los fosfatos de sodio y potasio hacen que se mantenga el pH del medio, mejorando así su
capacidad de recuperación.
3. Preparación:
• Disolver 43,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona ..................................................................................................................... 10
Glucosa ..................................................................................................................... 5
Fosfato disódico ........................................................................................................ 6,45
Fosfato monopotásico ............................................................................................... 2
Bilis de buey desecada .............................................................................................. 20
Verde brillante .......................................................................................................... 0,015
Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Bueno
Salmonella Enteritidis Bueno
Enterococcus faecalis Nulo
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 3 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
VRBG (Agar Bilis Cristal Violeta y Glucosa) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompañante Gram positiva. La presencia del rojo neutro permite que se forme un halo vio-
leta al borde de las colonias debido a la acidificación de la glucosa y precipitación de las sa-
les biliares.
Las colonias de enterobacterias adquieren en este medio coloración violácea.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 39,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• NO AUTOCLAVAR.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
4. Composición en g/l:
Peptona de carne ....................................................................................................... 7
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Glucosa ..................................................................................................................... 10
Sales biliares ............................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Rojo neutro ............................................................................................................... 0,03
Violeta cristal ............................................................................................................ 0,002
Agar bacteriológico .................................................................................................. 13
Color Color
Microorganismo Crecimiento
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo
Salmonella Enteritidis Bueno Rojo Rojo
Staphylococcus aureus Nulo
6. Conservación:
Utilizar inmediatamente.
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1. Finalidad de uso:
AG (Agar Glucosado) es un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo
estudiado es capaz de fermentar la glucosa.
2. Principios:
La fermentación de la glucosa provoca la acidificación del medio, de manera que el indica-
dor (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al disminuir el
pH.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min.
• Mantener los tubos en posición vertical.
• Justo antes del empleo, fundir, dejándolo hervir durante unos 10 minutos, y enfriar rápi-
damente a la temperatura de incubación (30°C ± 1°C).
4. Composición en g/l:
Triptona .................................................................................................................... 10
Extracto de levadura ................................................................................................. 1,5
Glucosa ..................................................................................................................... 10
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Púrpura de bromocresol ............................................................................................ 0,015
Agar bacteriológico .................................................................................................. 15
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AN (Agar Nutritivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi-
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.
• Según el uso:
| Placas:
| Tubos:
4. Composición en g/l:
Triptona .......................................................................................................................... 10
Extracto de carne ........................................................................................................... 5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 15
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, ligeramente opalescente.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
Staphylococcus aureus Bueno
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
CN (Caldo Nutitivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi-
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 20 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Triptona .......................................................................................................................... 10
Extracto de carne ........................................................................................................... 5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Microorganismo Crecimiento
Staphylococcus aureus Bueno
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
APT (Agua de Peptona Tamponada) es un medio de cultivo utilizado para realizar un pre-en-
riquecimiento de Salmonella en alimentos.
2. Principios:
El medio revitaliza las salmonelas que hayan podido sufrir daños en el tratamiento de los ali-
mentos.
El cloruro sódico actúa manteniendo la balanza osmótica y los dos fosfatos conservan tam-
ponado el medio.
3. Preparación:
• Disolver 25,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL o según uso.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona pancreática de carne ........................................................................................ 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 9
Fosfato monopotásico ................................................................................................... 1,5
Microorganismo Crecimiento
Salmonella Enteritidis Bueno
Escherichia coli Bueno
Staphylococcus aureus Bueno
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
TLS (Caldo de Triptona Lauril Sulfato) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la de-
tección y recuento de coliformes totales y Escherichia coli en alimentos.
2. Principios:
Gracias a su excelente capacidad nutritiva y a la presencia de fosfatos, este medio permite un
rápido crecimiento de coliformes y la producción de gran cantidad de gas a partir de la fer-
mentación de la lactosa, incluso con poco inóculo.
El medio contiene lauril sulfato sódico, que inhibe el crecimiento de la flora acompañante sin
interferir en el crecimiento de los coliformes.
3. Preparación:
Medio de simple concentración:
• Disolver 35,6 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm, provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
Medio de doble concentración:
• Disolver 71,2 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 20 × 200 mm, provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
4. Composición en g/l:
Triptona ...................................................................................................................... 20
Lactosa ........................................................................................................................ 5
Fosfato dipotásico ....................................................................................................... 2,75
Fosfato monopotásico ................................................................................................. 2,75
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Lauril sulfato sódico ................................................................................................... 0,1
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, limpio y sin precipitado.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
BGBL (Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante) es un medio de cultivo utilizado para la
detección y recuento de coliformes totales y fecales en alimentos (prueba presuntiva y
confirmativa).
2. Principios:
El medio contiene bilis al 2% y verde brillante, de manera que inhibe el crecimiento de prác-
ticamente todas las bacterias Gram positivas.
El crecimiento se demuestra por la turbidez del medio, y la fermentación de la lactosa por la
formación de gas en la campana de Durham.
3. Preparación:
Medio de simple concentración:
• Disolver 40 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm, provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
Medio de doble concentración:
• Disolver 80 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 18 × 180 mm, provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
4. Composición en g/l:
Triptona ................................................................................................................... 10
Bilis bacteriológica de buey .................................................................................... 20
Lactosa .................................................................................................................... 10
Verde brillante ......................................................................................................... 0,0133
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
VRBL (Agar Lactosado con Bilis al Cristal Violeta y Rojo Neutro) es un medio de cultivo
selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de coliformes.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompañante Gram positiva.
La fermentación de la lactosa provoca la acidificación del medio, dando unas colonias de co-
lor rojo debido al indicador (rojo neutro) y a veces con un halo de precipitación de ácidos bi-
liares.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 41,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• NO AUTOCLAVAR.
• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.
4. Composición en g/l:
Triptona .................................................................................................................... 7
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sales biliares ............................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Rojo neutro ............................................................................................................... 0,03
Violeta cristal ............................................................................................................ 0,002
Agar bacteriológico .................................................................................................. 15
Color Color
Microorganismo Crecimiento
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo
Pseudomonas aeruginosa Bueno Naranja No cambia
6. Conservación:
Utilizar inmediatamente.
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1. Finalidad de uso:
El CALDO EC (Caldo Escherichia coli) es un medio de cultivo utilizado para la confirma-
ción y recuento (NMP) de coliformes fecales y Escherichia coli.
2. Principios:
Las sales biliares inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas, así como de los mi-
croorganismos no adaptados al medio ambiente intestinal.
La temperatura de incubación (44°C) hace que la técnica sea más selectiva.
El crecimiento se demuestra por la turbidez, mientras que la fermentación de la lactosa se
observa por la formación de gas dentro de la campana de Durham.
3. Preparación:
• Disolver 37 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
4. Composición en g/l:
Peptona pancreática de carne ........................................................................................ 20
Lactosa .......................................................................................................................... 5
Mezcla de sales biliares ................................................................................................. 1,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 4
Fosfato monopotásico ................................................................................................... 1,5
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AT (Agua de Triptona) es un medio de cultivo utilizado para la observación de la producción
de indol por parte de algunos microorganismos, principalmente de la familia de las Entero-
bacterias.
2. Principios:
En condiciones de aerobiosis, algunos microorganismos degradan el triptófano y lo con-
vierten en indol mediante la enzima triptofanasa. Éste es detectado por el reactivo de Kovacs
o por una mezcla de ácido nítrico y nitrato sódico, coloreando de rojo el medio.
3. Preparación:
• Disolver 15 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm con tapón de rosca.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona de caseína ......................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
PTX (Agar con Tergitol-BCIG) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento
de Escherichia coli β-D-glucuronidasa positivos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene tergitol-7, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, limita la
invasión de Proteus y favorece la recuperación de Escherichia coli.
El BCIG es un substrato cromógeno; la mayoría de cepas de Escherichia coli tienen β-D-
glucuronidasa, que hidroliza el BCIG, dándole una coloración azul.
3. Preparación:
• Disolver 20,4 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.
4. Composición en g/l:
Peptona de carne ....................................................................................................... 5
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Fosfato dipotásico ..................................................................................................... 0,3
Tergitol-7 .................................................................................................................. 0,095
BCIG ......................................................................................................................... 0,05
Agar bacteriológico .................................................................................................. 12
6. Conservación:
| Frascos ............................................................ 1 mes a 2°C-8°C, resguardados de la luz.
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1. Finalidad de uso:
BP (Baird-Parker) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento de estafiloco-
cos, principalmente los CPS (Estafilococos Coagulasa Positivos) en alimentos.
2. Principios:
El cloruro de litio y el telurito potásico inhiben la flora acompañante; el telurito también es
el responsable de la coloración negra que adquieren las colonias capaces de reducirlo. La gli-
cina y el piruvato sódico estimulan el crecimiento de los estafilococos.
La adición de sulfametazina inhibe el crecimiento de Proteus, mientras que la yema de hue-
vo deja patente la acción de la lecitinasa.
3. Preparación:
• Disolver 58 g de medio deshidratado en 950 mL de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 190 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:
| 10 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Frascos con medio base .................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 15 días a 2°C-8°C.
1
En caso que se sospeche la presencia de Proteus.
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1. Finalidad de uso:
BHI (Caldo de Cerebro - Corazón) es un medio nutritivo tamponado utilizado para el culti-
vo de una amplia variedad de microorganismos exigentes, tanto aerobios como anaerobios
facultativos, como Streptococcus sp., Meningococcus sp. y Staphylococcus sp.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimien-
to de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, viru-
lencia y toxicidad.
El medio permite realizar la prueba de la coagulasa para los estafilococos.
3. Preparación:
• Disolver 37 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Extracto de cerebro ....................................................................................................... 7,8
Extracto de corazón ....................................................................................................... 9,7
Peptona de gelatina ....................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato disódico ............................................................................................................ 2,5
Glucosa .......................................................................................................................... 2
Microorganismo Crecimiento
Estreptococcus pyogenes Bueno
Staphylococcus aureus Bueno
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
RPF (Agar base Baird-Parker con Plasma de Conejo y Fibrinógeno) es un medio de cultivo
utilizado para el recuento sin necesidad de confirmación de los CPS (Estafilococos Coagu-
lasa Positivos) en alimentos.
2. Principios:
El suplemento RFP (Rabbit Plasma Fibrinogen) permite observar la acción de la coagulasa
de los estafilococos y contiene un inhibidor de la tripsina para evitar la fibrinólisis total o
parcial de los halos formados en torno a las colonias coagulasa positivas.
3. Preparación:
• Fundir el medio base BP y atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Añadir 10 mL de agua destilada estéril a un frasco de suplemento RPF.
• Mezclar suavemente hasta la disolución completa.
• Añadir el suplemento RPF al medio base BP.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
MEDIO BASE:
Triptona ................................................................................................................... 10
Extracto de carne ..................................................................................................... 5
Extracto de levadura ................................................................................................ 1
Piruvato sódico ........................................................................................................ 10
Glicina ..................................................................................................................... 12
Cloruro de litio ........................................................................................................ 5
Agar bacteriológico ................................................................................................. 12,5
SUPLEMENTO RPF:
Fibrinógeno bovino ................................................................................................. 3,75 g
Plasma de conejo ..................................................................................................... 50 mL
Inhibidor de tripsina ................................................................................................ 50 mg
Telurito potásico ..................................................................................................... 25 mg
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, opalescente.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
Utilizar inmediatamente.
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1. Finalidad de uso:
MYPA (Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina) es un medio de cultivo utilizado
para la detección y recuento de Bacillus cereus en alimentos.
2. Principios:
El manitol contenido en el medio nos permite la diferenciación de Bacillus cereus, que es un
microorganismo manitol negativo, frente a la flora acompañante manitol positiva, que hace
que el rojo fenol del medio vire de rojo a amarillo.
Asimismo, el crecimiento de la flora acompañante se ve inhibido por la polimixina, que no
afecta al crecimiento Bacillus cereus.
Bacillus cereus produce lecitinasa, de manera que degrada la lecitina de la yema de huevo
formando un halo de precipitado alrededor de sus colonias.
3. Preparación:
• Disolver 46 g de medio deshidratado en 0,9 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 180 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:
| 20 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Color Color
Microorganismo Crecimiento Halo
colonias medio
Bacillus cereus Bueno Incoloro Rojo +
Staphylococccus aureus Bueno Amarillo Amarilo +/–
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................ 1 semana a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
MR-VP (Rojo de Metil-Voges Proskauer) es un medio utilizado como prueba bioquímica
para diferenciar los microorganismos (principalmente enterobacterias) según la vía que
utilicen para degradar la glucosa.
2. Principios:
Algunos microorganismos fermentan la glucosa por la vía llamada ácido-mixta, produ-
ciendo una importante acidificación del medio. Así, al añadir el indicador rojo de metilo este
se mantendrá de color rojo a pH < 4,4. En caso que pH > 5,1 el medio se volverá amarillo.
Otros microorganismos la fermentan por la vía de degradación del 2,3-butanodiol; este
metabolito se manifiesta con los reactivos para Voges-Proskauer (solución de α-naftol y de
KOH), que en una reacción positiva dan un color rosa violáceo en la parte superior del tubo.
3. Preparación:
• Disolver 17 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm con tapón de rosca.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona de carne .............................................................................................................. 7
Glucosa ............................................................................................................................ 5
Fosfato dipotásico ............................................................................................................ 5
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
MN (Medio Nitrato) es un medio de cultivo que pone en evidencia la capacidad del micro-
organismo de reducir los nitratos a nitritos.
2. Principios:
La presencia de nitritos se manifiesta mediante la adición de reactivos, que hacen que el me-
dio se vuelva rojo.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 × 100 mm.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona ............................................................................................................................ 5
Extracto de carne ............................................................................................................. 3
Nitrato potásico ................................................................................................................ 1
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AS (Agar Sangre) es un medio de cultivo con elevado poder nutritivo utilizado para el re-
cuento, aislamiento y conservación de microorganismos delicados.
2. Principios:
La composición nutritiva del medio permite la recuperación de microorganismos sin inter-
ferir en sus reacciones hemolíticas.
3. Preparación:
• Disolver 40 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.
• Añadir un 5% de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.
• Mezclar suavemente.
• Repartir en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
NOTA: El medio se puede preparar en doble capa poniendo en el fondo de la placa una
capa sin sangre.
4. Composición en g/l:
Peptona .......................................................................................................................... 15
Hígado hidrolizado ........................................................................................................ 2,5
Extracto de levadura ...................................................................................................... 5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Agar ............................................................................................................................... 12
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas ............................................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AM (Agar Movilidad) es un medio de cultivo que permite diferenciar entre microorganismos
móviles o inmóviles.
2. Principios:
El medio contiene una cantidad muy pequeña de agar, permitiendo así visualizar el despla-
zamiento de los microorganismos móviles y el estancamiento de los inmóviles.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Enfriar en posición vertical a temperatura ambiente.
4. Composición en g/l:
Peptona de caseína ........................................................................................................ 20
Peptona de carne ........................................................................................................... 6,1
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 3,5
Microorganismo Movilidad
Proteus hauseri Positivo
Klebsiella pneumoniae Negativo
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ................................................................ 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
TSC (Agar Triptona-Sulfito con Cicloserina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de clostridios sulfito-reductores en alimentos.
2. Principios:
Los clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que reacciona con el citrato de hierro formando
un halo negro alrededor de las colonias por la precipitación del sulfuro de hierro.
La presencia de cicloserina da más especificidad al medio.
3. Preparación:
• Disolver 42 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 20 mL en tubos de 18 × 180 mm o 150 mL en frascos de 250 mL de capacidad,
según su uso.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar los tubos o frascos, añadir el SUPLEMENTO DE CICLO-
SERINA:
| En tubos: 0,2 mL.
4. Composición en g/l:
Triptona .......................................................................................................................... 15
Peptona de carne ............................................................................................................ 5
Extracto de levadura ...................................................................................................... 5
Metabisulfito sódico ...................................................................................................... 1
Citrato férrico amoniacal ............................................................................................... 1
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 15
6. Conservación:
| Frascos con medio base ...................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ......................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
TIO (Tioglicolato) es un medio de cultivo utilizado para controles de esterilidad orientado a
bacterias anaerobias estrictas o facultativas.
2. Principios:
La reducción de la cisteína y del sulfito sódico crea unas condiciones adecuadas para mi-
croorganismos anaerobios, ayudando también a ello la presencia de agar.
La resazurina se utiliza como de indicador de óxido reducción.
La ausencia de agentes selectivos permite el crecimiento de la mayoría de los microorga-
nismos.
3. Preparación:
• Disolver 29,7 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Dejar atemperar a temperatura ambiente.
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un baño hirviendo y dejar atemperar.
4. Composición en g/l:
Triptona .................................................................................................................... 15
Extracto de levadura ................................................................................................. 5
Glucosa ..................................................................................................................... 5,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 2,5
Tioglicolato sódico ................................................................................................... 0,5
Cisteína ..................................................................................................................... 0,5
Resazurina ................................................................................................................ 0,001
Agar bacteriológico .................................................................................................. 0,75
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico:
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
Estreptococcus pyogenes Bueno
Clostridium perfringens Bueno
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón . .............................. 1 mes a T ambiente, resguardados de la luz.
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1. Finalidad de uso:
LS (Lactosa Sulfito) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la identificación de Clos-
tridium perfringens en alimentos.
2. Principios:
La presencia de campana de Durham permite observar la fermentación de la lactosa.
El medio contiene metabisulfito y una sal de hierro, que reaccionan dando lugar a un preci-
pitado negro de sulfuro de hierro.
La temperatura de incubación (46°C ± 1°C) hace que el medio sea más selectivo.
3. Preparación:
• Disolver 20,3 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm, provistos de campana de Durham.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min.
• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo:
| 0,5 mL de METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% (PNT-RE-12).
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un baño hirviendo y dejar atemperar (antes de incorporar los reactivos).
4. Composición en g/l:
Triptona ......................................................................................................................... 5
Extracto de levadura ...................................................................................................... 2,5
Lactosa .......................................................................................................................... 10
Cloruro sódico ............................................................................................................... 2,5
Clorhidrato de cisteína .................................................................................................. 0,3
Gas Precipitado
Microorganismo Crecimiento
(1/4 de la campana) negro
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón ......................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
RV (Caldo de Rappaport-Vassiliadis modificado) es un medio de cultivo selectivo utilizado
para el enriquecimiento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El medio está formulado basándose en cinco características diferenciales de Salmonella res-
pecto a otras enterobacterias:
Capacidad de resistir altas presiones osmóticas.
Capacidad de multiplicación a pH relativamente bajos.
Son relativamente más resistentes a la presencia del verde de malaquita.
Tienen relativamente menos requerimientos nutricionales.
La temperatura de incubación es un factor selectivo.
3. Preparación:
• Disolver 26,75 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Peptona de soja ......................................................................................................... 4,5
Cloruro sódico .......................................................................................................... 7,2
Dihidrogenofosfato de potasio .................................................................................. 1,26
Fosfato dipotásico ..................................................................................................... 0,18
Cloruro de magnesio anhidro ................................................................................... 13,58
Verde de malaquita ................................................................................................... 0,036
Microorganismo Crecimiento
Salmonella Typhimurium Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
SC (Caldo Selenito-Cistina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el enriqueci-
miento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El selenito sódico inhibe el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y enterococos,
principalmente en las primeras 6-12 h siguientes al inicio de la incubación. Después, el efec-
to inhibidor disminuye lentamente. Así, Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhi-
bidos.
La cistina mejora sensiblemete el crecimiento de Salmonella.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 23 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min.
• Repartir 90 mL de medio en frascos estériles de 250 mL o 18 mL en tubos de 18 × 180 mm.
• NO AUTOCLAVAR.
• Enfriar rápidamente en un baño de agua.
NOTA: Al calentar el medio, evitar respirar los vapores, pues son altamente tóxicos.
4. Composición en g/l:
Polipeptona ................................................................................................................. 5
Lactosa ........................................................................................................................ 4
Fosfato monosódico .................................................................................................... 10
Selenito sódico ............................................................................................................ 4
Cistina ......................................................................................................................... 0,01
Microorganismo Crecimiento
Salmonella Enteritidis Bueno
Escherichia coli Regular
Staphylococcus aureus Malo/Nulo
6. Conservación:
| Frascos ............................................................... 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.
| Tubos con sero-tapón ........................................ 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.
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1. Finalidad de uso:
BGA (Agar Rojo Fenol y Verde Brillante) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el
aislamiento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El medio de cultivo tiene una fuerte concentración de verde brillante, de manera que inhibe
notablemente el crecimiento de la mayoría de microorganismos, excepto Salmonella.
La presencia de lactosa y sacarosa permite una buena diferenciación de Salmonella, que da
colonias rosadas con un anillo rojo, frente al resto de flora acompañante, que forma colonias
más pequeñas de color verde-amarillo, debido a la acidificación producida por la fermenta-
ción de la lactosa y/o de la sacarosa.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 53,6 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• NO AUTOCLAVAR.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Triptona .................................................................................................................... 10
Extracto de carne ...................................................................................................... 5
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sacarosa .................................................................................................................... 10
Fosfato disódico ........................................................................................................ 1
Fosfato monosódico .................................................................................................. 0,6
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,09
Verde brillante .......................................................................................................... 0,005
Agar bacteriológico .................................................................................................. 14
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Color Color
Microorganismo Crecimiento
colonias anillo
Escherichia coli Moderado Amarilo Amarillo
Salmonella Enteritidis Bueno Rosa Rojo
6. Conservación:
| Placas .................................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
HK (HEKTOEN) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de entero-
bacterias patógenas, principalmente Shigella y Salmonella.
2. Principios:
El medio tiene un elevado valor nutritivo, y las sales biliares que contiene inhiben el creci-
miento de la flora Gram positiva y algunos Gram negativos.
Los indicadores azul de bromotimol y fucsina ácida permiten la diferenciación de las bac-
terias lactosa positivo (de color amarillo-naranja) de las lactosa negativo (de color azul-ver-
doso).
La presencia de tiosulfato sódico permite la producción de SH2, que al combinarse con ci-
trato férrico forma un compuesto negro en el centro de las colonias.
3. Preparación:
• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
• Disolver 75 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.
• NO AUTOCLAVAR.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar secar la superficie del medio en cabina para evitar posteriores expansiones de
Proteus.
4. Composición en g/l:
Hidrolizado de carne ................................................................................................. 12
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Sales biliares ............................................................................................................. 9
Lactosa ...................................................................................................................... 12
Sacarosa .................................................................................................................... 12
Salicina ..................................................................................................................... 2
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 5
Citrato férrico amoniacal .......................................................................................... 1,5
Azul de bromotimol .................................................................................................. 0,065
Fucsina ácida ............................................................................................................ 0,040
Agar bacteriológico .................................................................................................. 13
6. Conservación:
| Placas ............................................................................................ 1 semana a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
KLIGLER es un medio de cultivo diferencial utilizado principalmente para la identificación
de Enterobacteriaceae mediante la detección de la fermentación de la glucosa y de la lacto-
sa, así como de la producción de gas y ácido sulfhídrico.
2. Principios:
La fermentación de la glucosa se manifiesta por la producción de ácido, de manera que el in-
dicador vira de rojo a amarillo, aunque en la superficie vuelve el color rojo debido a que,
como hay poco azúcar, la producción de ácido es muy limitada y se produce una alcalini-
zación por oxidación.
En cambio, cuando fermenta la lactosa, la abundante producción de ácido impide la reoxi-
dación, y el medio permanece de color amarillo en la parte inclinada del tubo.
La producción de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato se manifiesta por el ennegreci-
miento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro en presencia de citrato férrico.
3. Preparación:
• Disolver 58 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Dejar solidificar en posición inclinada con una pendiente corta y fondo abundante (ambos
de ± 3 cm).
4. Composición en g/l:
Triptona .................................................................................................................... 20
Extracto de carne ...................................................................................................... 3
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Glucosa ..................................................................................................................... 1
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 0,5
Citrato férrico ........................................................................................................... 0,5
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,025
Agar bacteriológico .................................................................................................. 15
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido de color rojo-marrón.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón ......................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
ANS (Agar Nutritivo Semisólido) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o
recuento de microorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Repartir asépticamente en placas.
4. Composición en g/l:
Triptona ......................................................................................................................... 10
Extracto de carne ........................................................................................................... 5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 7,5
Microorganismo Crecimiento
Staphylococcus aureus Bueno
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
FS (Fraser Semi) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Lis-
teria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros mi-
croorganismos Gram positivos.
El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. Preparación:
• Disolver 55 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y añadir 2,25 mL de SUPLE-
MENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI (PNT-RE-014).
• Homogeneizar sin incorporar aire.
4. Composición en g/l:
Polipeptona ................................................................................................................. 10
Extracto de levadura ................................................................................................... 5
Extracto de carne ........................................................................................................ 5
Cloruro sódico ............................................................................................................. 20
Fosfato disódico anhidro ............................................................................................ 9,6
Fosfato monopotásico ................................................................................................. 1,35
Esculina ...................................................................................................................... 1
Cloruro de litio ............................................................................................................ 3
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Nulo
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Frascos con medio completo ........................................................ 1 semana a 2°C-8°C,
resguardados de la luz.
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1. Finalidad de uso:
FC (Fraser Completo) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de
Listeria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros mi-
croorganismos Gram positivos.
El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. Preparación:
• Disolver 55 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y añadir a cada tubo 0,1 mL de
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO (PNT-RE-015).
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mL.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
4. Composición en g/l:
Polipeptona ................................................................................................................. 10
Extracto de levadura ................................................................................................... 5
Extracto de carne ........................................................................................................ 5
Cloruro sódico ............................................................................................................ 20
Fosfato disódico anhidro ............................................................................................ 9,6
Fosfato monopotásico ................................................................................................. 1,35
Esculina ...................................................................................................................... 1
Cloruro de litio ............................................................................................................ 3
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
Listeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Nulo
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Frascos con medio completo ........................................................ 1 semana a 2°C-8°C,
resguardados de la luz.
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1. Finalidad de uso:
OXFORD es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo-
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía para el desarrollo mi-
crobiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
3. Preparación:
• Disolver 58,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU-
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD (PNT-RE-016).
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Polipeptona .................................................................................................................... 20
Extracto de levadura ...................................................................................................... 3
Almidón ........................................................................................................................ 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Esculina ......................................................................................................................... 1
Citrato férrico amoniacal .............................................................................................. 0,5
Cloruro de litio .............................................................................................................. 15
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 13
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido de color amarillo verdoso, con reflejos azulados, li-
geramente opalescente.
| pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
1. Finalidad de uso:
PALCAM es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo-
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
La acción combinada de la ceftazidima y el cloruro de litio hace que el medio sea muy se-
lectivo.
La fermentación del manitol por parte de las bacterias contaminantes hace que el rojo fenol
se vuelva amarillo.
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B, glucosa y almidón, que son la fuente de energía para el de-
sarrollo microbiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene el equilibrio osmótico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.
3. Preparación:
• Disolver 68,9 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Enfriar y mantener en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU-
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM (PNT-RE-017).
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Polipeptona ................................................................................................................. 20
Extracto de levadura ................................................................................................... 3
Glucosa ....................................................................................................................... 0,5
Almidón ...................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Esculina ...................................................................................................................... 0,8
Citrato férrico amoniacal ............................................................................................ 0,5
Cloruro de litio ............................................................................................................ 15
Manitol ........................................................................................................................ 10
Rojo fenol ................................................................................................................... 0,08
Agar bacteriológico .................................................................................................... 13
6. Conservación:
| Frascos con medio base ................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo ........................................................... 1 semana a 2°C-8°C,
resguardadas de la luz.
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1. Finalidad de uso:
TSYEA (Agar Triptona de Soja-Extracto de Levadura) es un medio de cultivo utilizado para
el crecimiento y/o recuento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Triptona ......................................................................................................................... 17
Peptona de soja .............................................................................................................. 3
Glucosa .......................................................................................................................... 2,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Extracto de levadura ...................................................................................................... 6
Agar bacteriológico ....................................................................................................... 15
Microorganismo Crecimiento
Listeria monocytogenes Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
6. Conservación:
| Frascos ............................................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas .............................................................................................. 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
El CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS (RAMNOSA Y XILOSA) es
un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo estudiado es capaz de fer-
mentar estos glúcidos.
2. Principios:
La fermentación de la ramnosa y la xilosa provoca la acidificación del medio, de manera que
el indicador (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al dis-
minuir el pH.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 4,5 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo (según la solución que pre-
paremos):
| 0,5 mL de SOLUCIÓN DE RAMNOSA, o
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Tubos de medio base con tapón de rosca ....................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos de medio base con sero-tapón ............................................. 1 mes a 2°C-8°C.
| Tubos de medio completo con tapón de rosca ............................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos de medio completo con sero-tapón ...................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
El CALDO DE PARK Y SANDERS es un medio de cultivo utilizado para el enriqueci-
miento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimien-
to de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, viru-
lencia y toxicidad.
3. Preparación:
• Disolver los ingredientes en 945 mL de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 250 mL de medio en frascos de 500 mL.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada frasco:
| 50 mL de SANGRE DE CABALLO DESFIBRINADA.
4. Composición en g/945mL:
Triptona ...................................................................................................................... 10
Peptona de carne ......................................................................................................... 10
Glucosa ....................................................................................................................... 1
Extracto de levadura ................................................................................................... 2
Citrato sódico .............................................................................................................. 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Hidrogenosulfito sódico ............................................................................................. 0,1
Piruvato sódico ........................................................................................................... 0,25
Microorganismo Crecimiento
Campylobacter sp. Bueno
Escherichia coli Nulo
6. Conservación:
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 3 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AK (Agar de Karmali) es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Campylo-
bacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de colonias de Campylobacter,
extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía
para el desarrollo microbiano.
La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico, mientras que
la cicloheximida previene el desarrollo de levaduras.
El carbón activo, piruvato sódico y hematina favorecen el crecimiento y la aerotolerancia de
Campylobacter.
3. Preparación:
• Disolver 46,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.
• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU-
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI (PNT-RE-020).
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
4. Composición en g/l:
Extracto de levadura ................................................................................................. 20
Polipeptona ............................................................................................................... 3
Almidón .................................................................................................................... 1
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Piruvato sódico ......................................................................................................... 0,1
Carbón activo ............................................................................................................ 4
Hematina ................................................................................................................... 0,032
Cicloheximida ........................................................................................................... 0,1
Agar bacteriológico .................................................................................................. 13,5
Microorganismo Crecimiento
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno
Campylobacter coli Bueno
Staphylococcus aureus Nulo
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo .......................................................... 1 semana a 2°C-8°C,
resguardadas de la luz.
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1. Finalidad de uso:
El AGAR BUTZER MODIFICADO es un medio de cultivo selectivo utilizado para el ais-
lamiento de Campylobacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene elementos adecuados para el crecimiento de colonias de Campylobacter.
3. Preparación:
• Fundir el medio base AGAR DE SANGRE COLUMBIA (PNT-ME-046) en un baño a
45°C - 48°C.
• Añadir el SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER (PNT-RE-021).
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li-
bre de humedad.
4. Composición en g/l:
Ver PNT-ME-053.
Microorganismo Crecimiento
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno
Campylobacter coli Bueno
Staphylococcus aureus Nulo
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo, sin secar ....................................... 4 horas a T ambiente o
3 días a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
CB (Caldo de Brucella) es un medio de cultivo no selectivo para microorganismos exigen-
tes.
2. Principios:
El medio tiene un elevado poder nutritivo.
El bisulfito sódico actúa como agente reductor.
3. Preparación:
• Disolver 28,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir en frascos o tubos, según uso.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Triptona ......................................................................................................................... 10
Peptona de carne ........................................................................................................... 10
Extracto de levadura ...................................................................................................... 2
Glucosa .......................................................................................................................... 1
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Bisulfito sódico ............................................................................................................. 0,1
Microorganismo Crecimiento
Brucella abortus* Bueno/Muy bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
Campylobacter jejuni Bueno
* Incubar en CO2.
6. Conservación:
| Frascos con medio base .................................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos con tapón de rosca ............................................................... 3 meses a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AGAR DE SANGRE COLUMBIA es un medio de cultivo altamente nutritivo utilizado para
el aislamiento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
El medio contiene peptona, que favorece el crecimiento de las colonias y extracto de leva-
dura, que es una fuente de vitamina B.
El almidón, además de proporcionar energía, actúa como agente desintoxicante.
La adición de sangre de cordero desfibrinada favorece la detección de reacciones hemolíti-
cas y suministra el factor X necesario para el crecimiento de un gran número de bacterias.
3. Preparación:
• Disolver 42,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• En el momento de utilizar, añadir asépticamente 5 mL de SANGRE DE CORDERO
ESTÉRIL.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.
• Dejar solidificar.
• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li-
bre de humedad.
4. Composición en g/l:
Polipetona ................................................................................................................... 17
Peptona pancreática .................................................................................................... 3
Extracto de levadura ................................................................................................... 3
Almidón de maíz ........................................................................................................ 1
Cloruro sódico ............................................................................................................ 5
Agar bacteriológico .................................................................................................... 13,5
5. Controles del medio preparado:
| Control macroscópico: Medio sólido opaco de color rojo.
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo, sin secar ....................................... 4 horas a T ambiente o
1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON es un medio de cultivo utilizado para el estudio
de la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y sulfamidas.
2. Principios:
Este medio se utiliza junto a unos discos de papel impregnados con antibióticos. Al situar los
discos en el agar, estos absorben una cantidad de agua suficiente para disolver el antibiótico,
que se difunde en el medio.
De esta forma de crea un gradiente de concentración de antibiótico alrededor del disco,
mientras que las bacterias inoculadas se van multiplicando hasta que encuentran una zona
con una cantidad inhibitoria de antibiótico.
3. Preparación:
• Disolver 38 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.
• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.
• Añadir 5 mL de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.
• Mezclar suavemente.
• Repartir asépticamente el medio en placas Petri estériles formando una capa de unos 4 mm
de grosor.
• Dejar solidificar.
• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li-
bre de humedad.
4. Composición en g/l:
Hidrolizado de caseína ................................................................................................ 17,5
Infusión de carne ........................................................................................................ 2
Almidón soluble ......................................................................................................... 1,5
Agar bacteriológico .................................................................................................... 17
| Control de esterilidad.
| Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
6. Conservación:
| Frascos con medio base ............................................................. 6 meses a 2°C-8°C.
| Placas con medio completo, sin secar ....................................... 4 horas a T ambiente o
1 mes a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
TSI (Agar Citrato de Hierro Tres Azúcares) es un medio de cultivo utilizado para la identi-
ficación de enterobacterias.
2. Principios:
La fermentación de los azúcares contenidos en el medio (glucosa, lactosa y sacarosa) pro-
duce una acidificación que hace que éste pase de rojo a amarillo.
Las bacterias que fermentan únicamente la glucosa se detectan al volver el medio rápida-
mente a su coloración inicial en la parte superior del tubo. Aquéllas que no fermentan nin-
guno de los tres azúcares no harán cambiar el color del medio.
La producción de ácido sulfhídrico se observa por la presencia de deposiciones negras de
sulfuro de hierro en el fondo del tubo producidas por la reacción del tiosulfato en presencia
del citrato férrico.
Asimismo, la producción de gas en la fermentación se detecta por la aparición de burbujas o
la rotura del agar.
3. Preparación:
• Disolver 60,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 5-6 mL en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
• Inclinar los tubos para obtener un fondo y una pendiente de ±3 cm de profundidad.
4. Composición en g/l:
Extracto de carne ...................................................................................................... 3
Extracto de levadura ................................................................................................. 3
Peptona ..................................................................................................................... 14
Cloruro sódico .......................................................................................................... 5
Lactosa ...................................................................................................................... 10
Sacarosa .................................................................................................................... 10
Glucosa ..................................................................................................................... 1
Citrato férrico ........................................................................................................... 0,3
Tiosulfato sódico ...................................................................................................... 0,3
Rojo fenol ................................................................................................................. 0,024
Agar bacteriológico .................................................................................................. 13,5
6. Conservación:
| Tubos sin inclinar ......................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
| Tubos inclinados ........................................................................... 1 semana a 2°C-8°C.
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1. Finalidad de uso:
TSB (Caldo Triptona de Soja) es un medio de cultivo nutritivo universal utilizado para el
crecimiento y recuperación de microorganismos exigentes (aerobios o anaerobios).
2. Principios:
La composición del medio permite el crecimiento satisfactorio de una amplia variedad de
microorganismos.
El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico, mientras que el fosfato dipotásico man-
tiene el pH.
3. Preparación:
• Disolver 30 gr de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.
4. Composición en g/l:
Triptona ......................................................................................................................... 17
Peptona de soja .............................................................................................................. 3
Glucosa .......................................................................................................................... 2,5
Cloruro sódico ............................................................................................................... 5
Fosfato dipotásico ......................................................................................................... 2,5
Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
6. Conservación:
| Tubos con sero-tapón ..................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.
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CAPÍTULO SÉPTIMO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparación de los re-
activos necesarios para realizar los análisis de alimentos y aguas.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología, y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. PROCEDIMIENTO
Se redactará un PNT para cada uno de los reactivos necesarios para realizar los ensayos de este
laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su preparación.
0. Carátula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparación.
4. Composición.
5. Controles del reactivo preparado.
6. Conservación.
7. Medios utilizados.
4.1. Carátula
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4.3. Principios
4.4. Preparación
Se indica, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el reactivo, in-
dicando la cantidad de los ingredientes necesarios, el tipo, volumen y calidad del diluyente uti-
lizado, el modo de disolverlos y, en caso necesario, el modo de esterilización (tiempo y tempe-
ratura si se esteriliza con autoclave o tipo de membrana si la esterilización es por filtración).
NOTA 1: Es frecuente que los ingredientes del reactivo se presenten en viales cuyo conte-
nido es una mezcla de las cantidades necesarias de los componentes. En este caso, sólo se in-
dicará el volumen de diluyente necesario para reconstituirlo. Estas presentaciones y recons-
tituciones dependen de las marcas comerciales. Siempre habrá que cumplir las indicaciones
del proveedor.
4.5. Composición
Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es ne-
cesario) y cantidad exacta. Incluiremos también la cantidad y calidad de los diluyentes, excepto
cuando la preparación se realiza a partir de un vial a reconstituir.
NOTA 2: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti-
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
Estos controles (detallados en el PNT-RE-002) se realizan para confirmar la calidad del reactivo
y constan de dos pruebas:
Cuando son reactivos preparados por casas comerciales o suplementos de medios de cultivo,
se asume que estos han sido controlados por el proveedor.
4.7. Conservación
Indicar las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para la conservación del producto en
condiciones óptimas, de manera que su finalidad no se vea alterada.
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En aquellos reactivos que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indicarse estas
condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 3: Cuando se indica que el reactivo debe utilizarse inmediatamente, se permite que
el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su preparación.
En este apartado se señalan los medios o reacciones bioquímicas en los que se emplea el reacti-
vo, indicando la cantidad y el momento en que se añade.
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CAPÍTULO OCTAVO
1. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los con-
troles de reactivos.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFERENCIAS
• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi-
crobiológicos.
• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.
• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge-
neral de Redacción de Documentos.
4. PROCEDIMIENTO
Los reactivos utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que se espe-
cifican en el apartado 5 de su PNT - RE correspondiente. Estos controles se adaptan según el tipo
de reactivo y su finalidad de uso.
En general se realiza:
• Un control macroscópico.
• Un control de esterilidad.
• Un control de eficacia.
En algunos reactivos se han de hacer controles periódicos, tal como se indica en su PNT - RE
correspondiente, para asegurar que no pierden calidad durante su almacenamiento.
El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des-
cartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (en
general líquida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co-
rresponden con los que se indican en el PNT.
Este control se efectúa en aquellos productos que, por su composición, son susceptibles de
contaminarse, cosa que les haría inadecuados para su finalidad.
215
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Este control se realiza para comprobar la eficacia del reactivo. Sin embargo, el control se efectúa
únicamente en aquellos productos que se elaboran en el mismo laboratorio, pues se supone
que las preparaciones comerciales garantizan su eficacia. Así pues, en PNT - RE correspondiente
indicará si se debe realizar el control de eficacia, señalando, en este caso, las cepas y el medio
que se han de utilizar.
En ciertos reactivos, como el ONPG y la FA, se hace un control con cepas positivas, otro con
cepas que dan un resultado negativo y un control sin sembrar. En otros casos el control se reali-
za después de la inclusión del producto en el medio de cultivo, como sucede con la yema de hue-
vo, los antibióticos y los suplementos, o se utilizan como reveladores de reacciones bioquímicas,
combinándose con los medios de cultivo u otros substratos.
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CAPÍTULO NOVENO
Procedimientos de preparación
de reactivos
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MEDIO AL
PNT-RE REACTIVOS QUE SE PNT-ME
AÑADE
219
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1. Finalidad de uso:
GENTAMICINA es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade al medio CGA
para el recuento de levaduras y mohos en alimentos según el método AFNOR.
2. Principios:
Este antibiótico inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias, favoreciendo así el desa-
rrollo de levaduras y mohos.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Sulfato de gentamicina............................................................................................... 25 mg.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir .......................................... A 2°C-8°C, protegidos de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ............................................. 1 mes a 2°C-8°C, protegidos de la luz.
| Placas preparadas .............................................. Usar el mismo día de la preparación.
7. Medios utilizados:
| CGA (PNT-ME-006): Añadir 2 mL de suplemento a 100 mL de medio.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO es un aditivo que se añade a algunos
medios para enriquecerlos y para facilitar la identificación por la acción lecitinasa.
2. Principios:
La adición de yema de huevo a medios sólidos en placa permite visualizar una zona clara al-
rededor de las colonias que poseen proteasas y a veces otro halo de precipitación por lipo-
lisis.
3. Preparación:
• Limpiar los huevos con agua y jabón.
• Aclarar, secar y rociar con alcohol, dejándolo evaporar.
• Romper la cáscara por un extremo y hacer un agujero con unas tijeras estériles.
• Aspirar la clara con una pipeta estéril de 5 mL con la punta rota.
• Transferir la yema a un frasco estéril de 250 mL.
• Diluir con agua destilada estéril en una proporción 1:4.
• Homogeneizar por agitación.
• Calentar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 2 h.
• Dejar sedimentar en nevera durante 18 h - 24 h.
• Separar el sobrenadante de forma aséptica y trasvasarlo a un recipiente estéril.
4. Composición:
Yema de huevo ................................................................................... 1 unidad (≅20 mL).
Agua destilada .................................................................................... 80 mL.
6. Conservación:
A 4°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.
7. Medios utilizados:
| BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de
preparar las placas.
| MYPA (PNT-ME-022): Añadir 20 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
El TELURITO POTÁSICO AL 1% es un agente selectivo que se utiliza en algunos medios
para estafilococos como reactivo inhibidor y diferencial.
2. Principios:
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos Gram negativos y de los Gram
positivos que no son capaces de reducirlo.
Hay una correlación entre la capacidad de reducción del telurito potásico a teluro y la pato-
genicidad de los estafilococos.
Los estafolococos que pueden reducir el telurito a teluro, formando colonias negras.
3. Preparación:
• Disolver 1 g de telurito potásico en 100 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Telurito potásico ................................................................................................... 1 g.
Agua destilada ....................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A 4°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| BP (PNT-ME-019): Añadir 2 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de
preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
La SULFAMETAZINA AL 0,2% es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade
al medio BP para facilitar el recuento de estafilococos en alimentos.
2. Principios:
Este antibiótico limita el crecimiento de Proteus.
3. Preparación:
• Disolver cuidadosamente la sulfametazina en la disolución de hidróxido sódico, evitando
la formación de espuma.
• Añadir 90 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,22 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Sulfametazina ......................................................................................................... 0,2 g.
Disolución de hidróxido sódico (0,1 mol/L) ........................................................... 10 mL.
6. Conservación:
| Disolución preparada ....................................................................... 1 mes a 3°C ± 2°C.
7. Medios utilizados:
| BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de disolución a 190 mL de medio, en el momento de
preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
El SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% es un suplemento selectivo utilizado en los me-
dios MYPA y PEMBA para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus.
2. Principios:
Inhibe el crecimiento de la flora acompañante.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente.
• Evitar la congelación.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Polimixina B ...................................................................................................... 50.000 IU.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ....................................... A 2°C-8°C, hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido .......................................... 1 mes a 2°C-8°C.
7. Medios utilizados:
| MYPA (PNT-ME-022): Añadir 2 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
El ROJO DE METILO se utiliza como indicador de pH en la prueba del Rojo de Metilo de
los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3,bu-
tanodiólica.
Así, después de la incubación en el medio predominan los productos ácidos si la vía es la
ácido-mixta, mientras que si es la 2,3,butanodiólica predominan los productos neutros.
Al añadir el indicador al medio, éste virará a rojo si el medio es ácido, mientras que cam-
biará a amarillo si no ha habido acidificación.
3. Preparación:
• Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol absoluto.
• Añadir agua destilada hasta obtener un volumen de 500 mL.
4. Composición:
Rojo de metilo ...................................................................................................... 0,1 g.
Etanol ................................................................................................................... 300 mL.
Agua destilada ...................................................................................................... 200 mL.
6. Conservación:
A T ambiente.
7. Medios utilizados:
| MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 5 gotas de reactivo en un cultivo de unos 2-3 mL, que ha
estado incubado durante 24 h.
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1. Finalidad de uso:
La solución de α-NAFTOL se utiliza junto con el KOH como indicador en la prueba de
Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3, bu-
tanodiólica.
El α-naftol detecta los metabolitos que se forman en la vía 2,3, butanodiólica, haciendo que
la superficie del medio cambie a rojo, en condiciones aerobias.
Este viraje se manifiesta si el medio se encuentra en condiciones alcalinas; éste es el motivo
por el que añadimos también KOH.
3. Preparación:
• Disolver 5 g de α-naftol en 100 mL de etanol absoluto.
4. Composición:
α-naftol ................................................................................................................. 5 g.
Etanol .................................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A 4°C, resguardados de la luz, hasta que se vuelva de color marrón con precipitado.
7. Medios utilizados:
| MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 10 gotas de solución en un cultivo de unos 2-3 mL, que
ha estado incubado durante 24 h. Añadir el KOH y después el α-naftol; agitar y dejar re-
posar de 15 min a 2 h.
Oxigenar el tubo.
1. Finalidad de uso:
La solución de KOH AL 40% se utiliza junto con el α-naftol para alcalinizar el medio en la
prueba de Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
El KOH se añade al medio con la finalidad de aumentar su pH.
3. Preparación:
• Disolver 40 g de KOH en 100 mL de agua destilada.
4. Composición:
KOH ..................................................................................................................... 40 g.
Agua destilada ...................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A T ambiente.
7. Medios utilizados:
| MR-VP (PNT-ME-023): Después de añadir el α-naftol, añadir 6 gotas de solución en un
cultivo de unos 2-3 mL, que ha estado incubado durante 24 h. Agitar y dejar reposar de 15
min a 2 h.
Oxigenar el tubo.
1. Finalidad de uso:
El REACTIVO DE NITRATOS se utiliza para identificar la enzima nitrato-reductasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen el enzima reducen los nitratos a nitritos. Los nitritos, al
reaccionar con estos reactivos, producen un compuesto azoico de color rosa-rojo.
3. Preparación:
• Disolver 0,1 g de 5,2 ANSA en 100 mL de ácido acético (15% v/v).
• Disolver 0,4 g de ácido sulfamínico en 100 mL de ácido acético (15% v/v).
• Filtrar separadamente las dos soluciones en papel de filtro.
4. Composición:
Solución A: 5,2, ANSA ........................................................................................ 0,1 g.
Ácido acético (2,6 mol/L) ................................................................ 100 mL.
Solución B: Ácido sulfanílico .............................................................................. 0,4 g.
Ácido acético (2,6 mol/L) ................................................................ 100 mL.
6. Conservación:
A 5°C, resguardados de la luz, mientras se conserven incoloros o rosa pálido.
7. Medios utilizados:
| MN (PNT-ME-024): Añadir 0,2 mL de cada solución al cultivo incubado durante 24 h ±
2 h.
La reacción acostumbra a ser instantánea; si no hay cambio de color en 15 minutos, aña-
dir zinc en polvo. El zinc reduce los nitratos que quedan en el medio. Si la reacción con-
tinua siendo negativa significa que los nitratos se habían reducido directamente a N2. Una
reacción positiva con zinc indica que no había habido ningún tipo de reducción previa.
1. Finalidad de uso:
El METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% se utiliza como agente reductor e indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reducción del sulfito por parte de los clostridios en presencia del citrato
férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro en el
fondo del tubo.
3. Preparación:
• Disolver 1,2 g de metabisulfito sódico en 100 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Metabisulfito sódico ............................................................................................. 1,2 g.
Agua destilada ...................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A 4°C durante 24 h.
7. Medios utilizados:
| LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 10 mL de medio, en el
momento de utilizar.
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1. Finalidad de uso:
El CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1% se utiliza como componente diferencial y
indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reducción del metabisulfito por parte de los clostridios en presencia del
citrato férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro
en el fondo del tubo.
3. Preparación:
• Disolver 1 g de citrato de hierro en 100 mL de agua destilada.
• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Citrato férrico amoniacal ...................................................................................... 1 g.
Agua destilada ....................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A T ambiente durante 24 h.
7. Medios utilizados:
| LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 8 mL de medio, en el
momento de utilizar.
1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI se utiliza con el
medio para el enriquecimiento primario para la detección de Listeria monocytogenes en ali-
mentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acri-
flavina) y un reactivo (el citrato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del
ADN de las bacterias sensibles a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bac-
terias Gram positivas.
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Listeria.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el
producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Ácido nalixídico ................................................................................................... 5 mg.
Clorhidrato de acriflavina .................................................................................... 6,25 mg.
Citrato de hierro (III) amoniacal .......................................................................... 250 mg.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................ A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ............................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| FRASER SEMI (PNT-ME-036): Añadir 2,25 mL de suplemento a 225 mL de medio, en-
friado a 25°C, en el momento de utilizar.
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1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO se utiliza
con el medio para el enriquecimiento secundario para la detección de Listeria monocytoge-
nes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acri-
flavina), en una concentración distinta a la del medio FRASER SEMI, y un reactivo (el ci-
trato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles
a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Listeria.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el
producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Ácido nalixídico ................................................................................................... 10 mg.
Clorhidrato de acriflavina ..................................................................................... 12,5 mg.
Citrato de hierro (III) amoniacal ........................................................................... 250 mg.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| FRASER COMPLETO (PNT-ME-037): Añadir 0,1 mL de suplemento en cada tubo con
10 mL de medio, enfriado a 25°C, en el momento de utilizar.
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1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD se utiliza para la detección y
recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de tres antibióticos (la colistina, el cefotetán y la fosfomicina),
un agente antifúngico (la cicloheximida) y un tinte antiséptico (la acriflavina).
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el
producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Cicloheximida ....................................................................................................... 200 mg.
Sulfato de colistina ................................................................................................ 10 mg.
Cefotetán ............................................................................................................... 1 mg.
Fosfomicina ........................................................................................................... 5 mg.
Acriflavina ............................................................................................................ 2,5 g.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................ A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ............................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| AGAR OXFORD (PNT-ME-038): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM se utiliza con el medio
para la detección y recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la polimixina y la ceftazidima) y un tinte an-
tiséptico (la acriflavina).
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Listeria.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Sulfato de polimixina B .......................................................................................... 5 mg.
Ceftazidima ............................................................................................................. 10 mg.
Acriflavina .............................................................................................................. 2,5 g.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| AGAR PALCAM (PNT-ME-039): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» se añade al caldo de Park y Sanders para la de-
tección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y el lactato de trimetoprima).
Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así
el crecimiento de Campylobacter.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 10 mL de solución 1:1 de etanol al 95% y agua destilada es-
téril.
• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Vancomicina ........................................................................................................... 0,02 g.
Lactato de trimetoprima .......................................................................................... 0,02 g.
Etanol ...................................................................................................................... 5 mL.
Agua destilada ........................................................................................................ 5 mL.
7. Medios utilizados:
| CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Añadir 10 mL de suplemento a 250 mL
de medio, en el momento de utilizar.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» se añade al caldo de Park y Sanders en el enri-
quecimiento para la detección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y la cicloheximida). Evita el
crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el cre-
cimiento de Campylobacter.
3. Preparación:
• Disolver los componentes en 50 mL de solución 1:1 de acetona y agua destilada estéril.
• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 μ de tamaño de poro.
4. Composición:
Cefoperazona ....................................................................................................... 0, 032 g.
Cicloheximida ...................................................................................................... 0,1 g.
Acetona ................................................................................................................ 25 mL.
Agua destilada ...................................................................................................... 25 mL.
7. Medios utilizados:
| CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Añadir 12,5 mL de suplemento a
250 mL de medio, en el momento de utilizar.
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1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI se utiliza con el medio
para el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla inhibitoria compuesta por dos antibióticos (la vancomicina y la
cefoperazona). La cefoperazona amplía el espectro de acción de la vancomicina, de manera
que hay una mayor inhibición de las bacterias contaminantes.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Vancomicina ............................................................................................................ 10 mg.
Cefoperazona ........................................................................................................... 16 mg.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir .............................................. A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad
| Vial reconstituido ................................................. 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz
7. Medios utilizados:
| AGAR KARMALI (PNT-ME-043): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en
el momento de preparar las placas.
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1. Finalidad de uso:
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER se utiliza con el medio para
el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento está formado por una mezcla de cinco agentes antimicrobianos. Esta combi-
nación permite el crecimiento de Campylobacter a 37°C, especialmente el de las cepas que
no crecen a 43°C.
La colistina del medio provoca la ruptura de las membranas celulares de las bacterias Gram
negativas, mientras que la cicloheximida inhibe el crecimiento de ciertos mohos.
3. Preparación:
• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el
producto liofilizado.
• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.
4. Composición:
Bacitracina ........................................................................................................ 12.500 IU.
Sulfato de colistina ............................................................................................ 5.000 IU.
Cefazolina ......................................................................................................... 7,5 mg.
Novobiocina ...................................................................................................... 2,5 mg.
Cicloheximida ................................................................................................... 25 ml.
6. Conservación:
| Vial sin reconstituir ............................................ A 2°C-8°C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
| Vial reconstituido ............................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.
7. Medios utilizados:
| AGAR BUTZLER (PNT-ME-044): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio.
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1. Finalidad de uso:
El REACTIVO DE KOVACS se utiliza para la detección del indol, resultante de la degra-
dación del triptófano en el medio AT por parte de algunos microorganismos.
2. Principios:
Cuando el reactivo de Kovacs entra en contacto con el indol se desarrolla una coloración
rojo cereza característica, en forma de anillo, en la superficie del tubo (en la zona en contacto
con el oxígeno).
3. Preparación:
• Disolver 5 g de 4-dimetilamino-benzaldehído en 75 mL de alcohol isoamílico a 50°C -
55°C.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Mantener el recipiente en un baño con agua helada.
• Añadir el ácido clorhídrico concentrado mientras se agita.
4. Composición:
Ácido 4-dimetilamino-benzaldehído ...................................................................... 5 g.
Alcohol isoamílico .................................................................................................. 75 mL.
Ácido clorhídrico 1,18-1,19 d ................................................................................. 25 mL.
6. Conservación:
A 4°C, resguardados de la luz.
7. Medios utilizados:
| AT (PNT-ME-017): Añadir 0,5 mL de cada reactivo en cada tubo. Agitar para que el in-
dol entre en contacto con el reactivo y dejar actuar un máximo de 1 minuto.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN SALINA (SS) se utiliza en pruebas bioquímicas y en la prueba de autoa-
glutinación para la investigación serológica de Salmonella.
2. Principios:
La solución salina es un diluyente no tóxico para los microorganismos.
3. Preparación:
• Disolver 8,5 g de cloruro sódico en 1 L de agua destilada.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 × 160 mm.
• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4. Composición:
Cloruro sódico ........................................................................................................... 8,5 g.
Agua destilada ........................................................................................................... 1 L.
6. Conservación:
3 meses a 4°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada
uso.
7. Utilización:
• Sero-aglutinación.
• Emulsión para API.
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1. Finalidad de uso:
El REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LA β-GALACTOSIDASA (ONPG) se
utiliza para detectar la presencia de la enzima β-galactosidasa.
2. Principios:
La β-galactosidasa es una enzima que desdobla la molécula de lactosa en galactosa y glu-
cosa. Cuando el ONPG entra en contacto con la enzima, ésta transforma el reactivo de or-
tofenil a ortofenol, que es de color amarillo.
Los microorganismos que no poseen esta enzima no pueden fermentar la lactosa.
3. Preparación:
• Disolver 80 mg de ONPG en 15 mL de agua destilada a 50°C - 55°C.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Enfriar a T ambiente.
• Añadir 5 mL de solución tampón.
4. Composición:
ONPG ....................................................................................... 80 mg.
Solución tampón: Dihidrogenofosfato de sodio .................................................... 6,9 g.
Hidróxido sódico al 30% .......................................................... 45 mL.
Agua destilada .......................................................................... 3 mL.
6. Conservación:
A 4°C, hasta que el reactivo se observe turbidez, realizando un control de esterilidad antes de
cada uso.
7. Medios utilizados:
| SS (PNT-RE-23): Añadir 0,25 mL de cada reactivo en cada tubo. Realizar lecturas al cabo
de 1/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA) se utiliza, junto con el cloruro férrico,
para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar la
fenilalanina en ácido fenilpirúvico (es decir, convertir aminoácidos en ácidos cetónicos) en
condiciones de aerobiosis.
Esta facultad se utiliza principalmente para diferenciar los géneros Salmonella y Proteus.
3. Preparación:
• Disolver 0,5 g de L-fenilalanina en 100 mL de agua destilada estéril.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Transferir a un recipiente estéril.
4. Composición:
L-fenilalanina ........................................................................................................ 0,5 g.
Agua destilada ....................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A 2°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.
7. Medios utilizados:
| SS (PNT-RE-23): Añadir 0,5 mL en cada tubo.
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1. Finalidad de uso:
La SOLUCIÓN DE CLORURO FÉRRICO AL 10% se utiliza, junto con la fenilalanina,
para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar, en
condiciones de aerobiosis, la fenilalanina en ácido fenilpirúvico. Este ácido, en contacto con
iones férricos, produce una coloración verde oscuro durante unos minutos.
3. Preparación:
• Disolver 10 g de cloruro férrico en 100 mL de agua destilada.
• Homogeneizar sin incorporar aire.
• Transferir a un frasco de 250 mL.
4. Composición:
Cloruro férrico ....................................................................................................... 10 g.
Agua destilada ....................................................................................................... 100 mL.
6. Conservación:
A T ambiente, resguardado de la luz, realizando controles de esterilidad periódicamente y
antes de cada uso.
7. Medios utilizados:
| SS (PNT-RE-23): Añadir 1-2 gotas de reactivo a cada tubo con 0,5 mL de SS y 0,5 mL de
FA, incubado durante 4 h a 37°C ± 1°C.
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BIBLIOGRAFÍA GENERAL
CALVÍS, S. (1998): Redacción e introducción del Manual de Calidad y del Procedimiento Gene-
ral de Redacción y Gestión de la Documentación en el laboratorio de Microbiología de
aguas y Alimentos.
ENAC (1997): Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos.
G-ENAC-04. Rev. 2.
SABATER, J.; VILUMARA, A. (1989): Buenas prácticas de laboratorio (GLP) y garantía de calidad
(Quality Assurance): Principios básicos. Ed. Díaz de Santos. Madrid.
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NORMATIVA
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• ISO 8523 (1992): Microbiologie. Directives générales pour la recherche des Enterobacteria-
ceae avec pré-enriquissement.
• ISO 6579 (1993): Microbiologie. Directives générales concernant les méthodes de recherche
des Salmonella.
• ISO 7402 (1993): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement sans revivifica-
tion des Enterobacteriaceae. Techinque NPP el méthode par comptage des colonies.
• ISO 7251 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement d’Escherichia
coli présumés. Thecnique du nombre le plus probable.
• ISO 7932 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement de Bacillus ce-
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• ISO 7218 (1996): Microbiologie des aliments. Règles générales pour les examens microbio-
logiques.
• ISO 10272 (1996): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for de-
tection of thermotolerant Campylobacter.
• ISO 11290-1 (1997): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1: Méthode de récherche.
• ISO 11290-2 (1998): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 2: Méthode de dénombrement.
• ISO 6888-1 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal mehtod for
enumeration of coagulase positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium.
• ISO 6888-2 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for
enumeration of coagulase positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Rabbit Plasma Fibrinogen agar medium.