La enzima bifuncional quitosanasa-celulasa producida por el microorganismo gramnegativo

Myxobacter sp. AL-1 es muy similar a las endoglucanasas de Bacillus subtilis

Resumen

La bacteria gramnegativa Myxobacter sp. AL-1 produce actividad de quitosanasa-celulasa que se

excreta al máximo durante la fase estacionaria de crecimiento. El análisis de zimograma de
carboximetilcelulasa reveló que la actividad enzimática estaba correlacionada con dos bandas de
32 y 35 kDa. Las preparaciones enriquecidas con cromatografía de intercambio iónico de la enzima
de 32 kDa fueron capaces de degradar los derivados fluorescentes de celulosa 4-metilumbeliferil-
β-D-celobiósido y 4-metilumbeliferil-β-Dcellotrioside. Estas preparaciones enzimáticas también
mostraron una mayor capacidad a 70 ° C que a 42 ° C para degradar los oligómeros de quitosano
de un tamaño mínimo de seis unidades. Por el contrario, la actividad glucanolítica β-1,4 fue más
eficiente para atacar la carboximetilcelulosa y el metilumbeliferil-celotriosido a 42 ° C que a 70 ° C.
La enzima de 32 kDa se purificó más de 800 veces hasta obtener una homogeneidad aparente
mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular. La
secuenciación amino terminal indicó que la quitosanasa-celulasa madura comparte más del 70%
de identidad con las endocelulasas producidas por las cepas DLG, PAP115 y 168 del
microorganismo gram-positivo Bacillus subtilis.

Introducción

Varios microorganismos producen un amplio espectro de enzimas con la capacidad de degradar

polisacáridos unidos por enlaces glucosídicos β-1,4, por ejemplo, celulosa, quitina y quitosano.
Dependiendo del modo de ataque al polímero, estas enzimas pueden clasificarse como
endoglicohidrolasas o exoglicohidrolasas. Los verdaderos microorganismos celulolíticos como
Trichoderma reesei producen una batería enzimática capaz de atacar y degradar sinérgicamente la
celulosa cristalina (Beguin 1990; Saloheimo et al. 1994). En la mayoría de los casos, las β-1,4
glucanasas procariotas catalizan la descomposición de los enlaces glucosídicos de solo formas
solubles de celulosa como la carboximetilcelulosa y la hidroxietilcelulosa (Baird et al. 1990; Beguin
1990). Las β-glucanasas microbianas exocelulares son de interés debido a su potencial aplicación
en la industria cervecera (Enari y Markkanen 1975), en la bioconversión de material de desecho
agrícola en productos útiles (Ryu y Mandels 1980) y en el control biológico de hongos patógenos
de plantas. (Mauch et al. 1988; Grenier et al. 1993).

Los genes que codifican enzimas celulolíticas han sido clonados de diferentes organismos
(Henrissat et al. 1989; Gilkes et al. 1991; Henrissat y Bairoch 1993). Según las similitudes
estructurales, las celulasas y otras glicohidrolasas se han agrupado en varias familias (Henrissat et
al. 1989; Gilkes et al. 1991). Myxobacter sp. AL-1 es una bacteria gramnegativa aislada del suelo;
produce dos peptidasas (Ensign y Wolfe 1965; Wingard et al. 1972) y una glucanasa β-1,4 capaz de
degradar la carboximetilcelulosa y el quitosano completamente desacetilado (Hedges y Wolfe
1974). La propiedad quitosanolítica de esta enzima ha sido explotada para producir protoplastos a
partir de hongos Zygomycete utilizando extractos parcialmente purificados de la enzima excretada
(Genthner y Borgia 1978; TorresGuzmán et al.1994).

Presentamos aquí el estudio de la síntesis de la actividad quitosana-celulasa durante el ciclo de

crecimiento de Myxobacter sp. AL-1 y el establecimiento de un protocolo para su purificación
basado en intercambio de cationes y cromatografía de exclusión molecular. La quitosanasa-
celulasa purificada se caracterizó con respecto a su capacidad para degradar formas oligoméricas
de celulosa y quitosano. La microsecuenciación aminoterminal reveló que la enzima madura posee
más del 70% de identidad con endocelulasas de diferentes cepas de B. subtilis.

materiales y métodos

Organismo y condiciones de crecimiento

La cepa utilizada en este estudio, Myxobacter sp. AL-1, fue aislado por Ensign y Wolfe (1965) y
amablemente proporcionado por P. Sypherd (Universidad de Arizona, EE. UU.). El medio utilizado
contenía 1% (p / v) de extracto de levadura solidificado mediante la adición de agar al 2% (p / v).
Se siguió la cinética de la producción de enzimas en cultivos líquidos agitados a 37 ° C. Se tomaron
muestras de cultivo en varios momentos durante el crecimiento y se almacenaron a –20 ° C hasta
que se procesaron para el ensayo enzimático. El crecimiento de los cultivos se controló midiendo
la densidad óptica a 600 nm.

Ensayos de enzimas y proteínas.

La actividad de la celulasa se midió a 42 ° C usando carboximetilcelulosa como sustrato siguiendo

un protocolo similar al informado por Hedges y Wolfe (1974). Los azúcares reductores formados
durante el ensayo se detectaron por el método de Park y Johnson (1949) con las modificaciones de
Ghuysen et al. (1966) Las unidades de actividad enzimática fueron las reportadas por Hedges y
Wolfe (1974). La actividad específica se expresa como unidades por mg de proteína. La actividad
enzimática contra 4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside, 4 methylumbelliferyl-β-D-cellotrioside, y
4-methylumbelliferyl-β-D N, N diacetylchitobioside se ensayó esencialmente según lo descrito por
Kuranda y Robbins (1987). La actividad quitosanolítica de la enzima quitosanasa celulasa se probó
contra oligómeros de quitosano de 2, 3, 4 y 6 unidades midiendo la liberación de azúcares
reductores de acuerdo con el procedimiento descrito por Hedges y Wolfe (1974). Las unidades y la
actividad específica fueron las descritas por Hedges y Wolfe (1974). La proteína se midió por el
método de Lowry et al. (1951) Los derivados de carboximetilcelulosa y 4-metilumbeliferilo se
compraron de Sigma (St. Louis Mo., EE. UU.). Los oligómeros de quitosano se obtuvieron de
Seikagaku America (Rockville, Maryland, EE. UU.).

Purificación de quitosanasa-celulasa

La quitosanasa-celulasa se purificó del sobrenadante de un cultivo 2-1 cultivado durante 20 ha 37 °

C. Todos los pasos del proceso de purificación se llevaron a cabo a 4 ° C. Después de la eliminación
de las células por centrifugación (17.700 × g, 10 min), las proteínas secretadas al medio de cultivo
se precipitaron con ZnCl2 esencialmente como lo describen Hedges y Wolfe (1974). El precipitado
se disolvió en tampón de acetato 25 mM (pH 5.0) y se cargó en una columna CM-BioGel-A de 50
ml previamente equilibrada con el mismo tampón. La columna se lavó con tampón de acetato 25
mM (pH 5,0) y se eluyó con 250 ml de un gradiente lineal de NaCl 0,0-0,2 M en el mismo tampón.
Se recogieron fracciones de 5 ml cada una, y las que contenían actividad de carboximetilcelulasa
se agruparon, se liofilizaron, se resuspendieron en tampón de acetato 25 mM (pH 5,0) y se
colocaron en una columna BioGel P-60 de 117 ± 1,7 cm previamente equilibradas con el mismo
tampón. La columna se eluyó con el mismo tampón y se recogieron muestras de 3 ml cada una;
Las fracciones que contenían actividad enzimática se agruparon y almacenaron a –20ºC.

SDS-PAGE y detección in situ de actividad de celulasa

La electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida se realizó como se describió previamente por

Laemmli (1970); los geles se tiñeron con Coomassie Blue-R250. Para establecer los zimogramas de
actividad de celulasa, las porciones de separación de geles de SDS-poliacrilamida al 10% se
polimerizaron con carboximetilcelulosa al 0,1% (p / v). Las muestras de proteínas empleadas para
zimogramas se resuspendieron en tampón de carga Tris-HCl 125 mM (pH 6,8) que contenía (p / v)
15% de sacarosa, 2,5% de SDS y 0,02% de azul de bromofenol; Las muestras resuspendidas se
hirvieron 5 min antes de cargarlas en el gel. La renaturalización de las proteínas después de la
electroforesis se realizó incubando los geles en tampón de acetato de sodio 0,1 M que contenía
Triton X-100 desionizado al 1% (v / v) durante 12 ha 45 ° C (Trudel y Asselin 1989). Para identificar
las bandas de proteínas con actividad de celulasa, los geles se tiñeron con 0,2% (p / v) de rojo
Congo y se procesaron según lo informado previamente por Beguin (1983). Alternativamente,
después de la renaturalización con Triton X-100, los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250,
se fotografiaron, se tiñeron con metanol: ácido acético (40:10, v / v) y se procesaron para la
tinción con rojo de Congo como se indicó anteriormente. Los zimogramas de actividad de celulasa
usando metilumbeliferil-celotriosido como sustrato se realizaron como se describió previamente
por Van Tilbeurgh et al. (1986) excepto que el sustrato fluorogénico se usó a una concentración de
0,1 mM.

Secuenciación amino-terminal de quitosanasa-celulasa

La quitosanasa-celulasa (20 g) parcialmente purificada por cromatografía de intercambio iónico se
sometió a electroforesis en un gel de SDSpoliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron a una
membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de acuerdo con las condiciones informadas por
LeGendre y Matsudaira (1989) y se revelaron al teñir la membrana con Coomassie Blue R-250. La
banda de proteína que posee actividad de carboximetilcelulasa (ver más abajo) se escindió de la
membrana y se procesó para la secuenciación amino terminal (LeGendre y Matsudaira 1989).

Resultados

Expresión de quitosanasa-celulasa durante Myxobacter sp. Crecimiento AL-1

La apariencia temporal de quitosanasa-celulasa se siguió en cultivo líquido durante Myxobacter sp.

Crecimiento de AL-1 (Fig. 1A). Como se muestra, la actividad glucanolítica β-1,4 apareció temprano
en la fase exponencial de crecimiento (2 h) y alcanzó su punto máximo a las 7-8 h, mucho más allá
del inicio de la fase estacionaria. Una muestra de cultivo de 20 h aún conservaba el 80% de la
actividad mostrada por la muestra de 7 h (no mostrada). Las proteínas secretadas en el medio de
cultivo se separaron por SDS-PAGE, y la quitosanasa-celulasa se detectó por tinción de actividad
(Fig. 1B). Se observaron dos bandas principales de aproximadamente 32 y 35 kDa en cultivos de las
fases exponencial y estacionaria; sin embargo, la banda de 35 kDa desapareció después de 8 h de
crecimiento.

Purificación de quitosanasa-celulasa de Myxobacter sp. AL-1

La primera etapa de purificación de quitosanasa-celulasa se llevó a cabo mediante la sal de la

actividad enzimática con ZnCl2, y el precipitado se sometió a una purificación adicional mediante
etapas secuenciales de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular. La actividad
celulolítica se unió al soporte CM-BioGel-A y se eluyó con NaCl 75 mM (datos no mostrados). Se
usaron muestras de actividad enzimática de la columna de intercambio iónico para el análisis de
zimogramas en geles de SDS-poliacrilamida que contienen carboximetilcelulosa. Como se muestra,
esta fracción contiene tres bandas de proteínas (Fig. 2, calle 3); sin embargo, solo la banda de 32
kDa poseía actividad de celulasa (Fig. 3A). Siguiendo un enfoque similar, se probó si la banda de
proteína de 32 kDa era capaz de hidrolizar in situ el derivado de celulosa fluorogénico
metilumbeliferil-celotriosido. El zimograma que se muestra en la Fig. 3B indica que la banda de
proteína de 32 kDa presente tanto en el extracto de ZnCl2 como en la fracción de intercambio
iónico catalizó la hidrólisis del compuesto fluorescente. La actividad de β-1,4 glucanasa recuperada
de CM-BioGel-A se sometió a una purificación adicional en una columna BioGel P-60. La enzima se
aplicó al gel y se eluyó como un único pico de actividad (datos no mostrados). El perfil de proteínas
mostró la existencia de un único pico que era paralelo al pico de actividad enzimática. La Tabla 1
muestra que la combinación de los dos tipos de cromatografía condujo a una purificación de
aproximadamente 850 veces de la enzima quitosana-celulasa con una recuperación del 6%. El
análisis SDS-PAGE de las fracciones activas recuperadas en cada paso del protocolo de purificación
se muestra en la Fig. 2. El uso de cromatografía de intercambio iónico permitió la eliminación de la
mayoría de la proteína presente en el precipitado de ZnCl2 (Fig. 2, carriles 2 y 3) dado que después
de esta etapa de purificación, las fracciones activas contenían solo tres bandas de proteínas con
masas moleculares aparentes de 32, 28 y 25 kDa, respectivamente (Fig. 2, calle 3). El uso posterior
de la columna BioGel P-60 dio como resultado la purificación de la enzima ya que solo se observó
la banda de proteína de 32 kDa (Fig. 2, carril 4). Este hallazgo sugiere que la quitosanasa-celulasa
funciona como un monómero de 32 kDa.

Especificidad de sustrato de quitosanasa-celulasa

Investigamos la capacidad de la quitosanasa-celulasa para degradar los derivados de

metilumbeliferil-celobiósido y -celotriosido (Van Tilbeurgh et al. 1982; Van Tilbeurgh y Claeyssens
1985). Debido a la baja estabilidad mostrada por la actividad de celulasa presente en la fracción
BioGel P-60 (datos no mostrados), se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática frente a los
derivados fluorescentes metilumbeliferil-celobiósido y celotriosido con la enzima purificada por
cromatografía de intercambio iónico. La Figura 4 muestra que la enzima presente en la fracción de
intercambio iónico era capaz de degradar no solo el derivado de celotriosido sino también el
celobiósido, aunque el primero era un mejor sustrato para la enzima. La especificidad catalítica de
la fracción enzimática de intercambio iónico se probó por su capacidad para degradar el sustrato
de quitinasa metilumbeliferil diacetilquitobiósido; Los resultados representados en la figura 4
demuestran que el derivado de quitina no es un sustrato para esta enzima. Aunque se ha
informado que la quitosanasa-celulasa tiene actividad lítica contra el quitosano completamente
desacetilado (Hedges y Wolfe 1974), el oligómero de quitosano más corto reconocido como
sustrato por la enzima no ha sido investigado previamente. Con este fin, la enzima presente en la
fracción de intercambio iónico se incubó con oligómeros de quitosano de dos, tres, cuatro o seis
unidades, y las reacciones se llevaron a cabo a 42 o 70ºC. Los resultados indicaron que la
quitosana - la celulasa degradó solo el oligómero de quitosano de seis unidades. Sin embargo,
como se muestra en la Tabla 2, la enzima atacó este sustrato de manera más eficiente cuando la
reacción se llevó a cabo a 70 ° C. Estos hallazgos son consistentes con las observaciones de que la
temperatura óptima de la quitosanasa-celulasa para la degradación total del quitosano polimérico
desacetilado es de 70 ° C (Hedges y Wolfe 1974). También probamos la actividad contra la
carboximetilcelulosa y el metilumbeliferil-celotriosido a 42 o 70 ° C. Los resultados demostraron
que la enzima degradaba los sustratos de celulosa de manera más eficiente a 42 ° C (Tabla 2). Se
observó que, a cualquier temperatura, la enzima era incapaz de hidrolizar quitosano polimérico
parcialmente acetilado (datos no mostrados). A pesar del hecho de que la quitosanasa-celulasa
atacó el quitosano 6-mero más eficientemente cuando la reacción se llevó a cabo a 70 ° C (Tabla
2), la enzima se inactivó por calor (Fig. 5). Aunque la enzima era estable a 42 ° C durante al menos
1 h, perdió más del 90% de actividad hacia el metilumbeliferil celotriosido cuando se incubó a 55 o
70 ° C durante el mismo tiempo (Fig. 5). Como primer enfoque para investigar si la quitosanasa-
celulasa posee diferentes sitios catalíticos para degradar dos sustratos relacionados pero
diferentes, probamos la capacidad del quitosano 6-mer para competir con la hidrólisis enzimática
del derivado de celulosa metilumbeliferil-celotriosida. El quitosano 6-mer presente en
concentraciones 400 veces más altas (es decir, 1.6 mM) que la concentración de metilumbeliferil-
celotriosido (0.004 mM) no causó una inhibición detectable de la actividad enzimática.

Secuencia amino-terminal de quitosanasa-celulasa

Para determinar la secuencia aminoterminal de la quitosanasa-celulasa madura, las muestras de la

enzima purificada por cromatografía de intercambio iónico se separaron por SDSPAGE y se
transfirieron a una membrana de PVDF; luego, la banda de proteína que posee actividad
enzimática (es decir, la banda de 32 kDa) se sometió a microsecuenciación como lo describen
LeGendre y Matsudaira (1989). La Figura 6 muestra los 25 aminoácidos del extremo N de la
quitosanasa celulasa madura; al menos en esta región, la enzima mostró un 76% de identidad con
las endocelulasas producidas por las cepas 168, PAP115 y DLG de B. subtilis (Wolf et al. 1995;
McKay et al. 1986; Robson y Chambliss 1986). Diecinueve de los veinticinco residuos de
quitosanasa-celulasa fueron idénticos a los de las cepas de B. subtilis; otros tres tuvieron cambios
conservadores, es decir, Ser para Thr, Thr para Ser y Leu para lle (Fig.6). Teniendo en cuenta este
resultado, es razonable predecir que la quitosanasa-celulasa podría tener similitud de secuencia
con otras celulasas que se agrupan junto con las endocelulasas de B. subtilis en la Familia 5 de la
clasificación de Henrissat y Bairoch (1993). Curiosamente, la identidad del primer aminoácido
presente en el extremo N de la forma madura de quitosanasa-celulasa fue Ala, un residuo que se
encuentra casi invariablemente en proteínas secretadas del género Bacillus (Simonen y Palva
1993).

Discusión

Myxobacter sp. AL-1, un microbio gramnegativo, secreta en el medio de cultivo proteolítico

(Ensign y Wolfe 1965; Wingard et al. 1972) y actividades de quitosanasa-celulasa (Hedges y Wolfe
1974). Esta batería de enzimas (y quizás otras aún no identificadas) permite que este
microorganismo no solo elimine los desechos de material orgánico, sino que también ataque otras
bacterias (Ensign y Wolfe 1965) u hongos. Según lo informado previamente por Hedges y Wolfe
(1974), un solo polipéptido de 31 kDa contiene la celulasa y las actividades de quitosanasa de
quitosanasa-celulasa. Por lo tanto, utilizamos esta información para analizar la síntesis de esta
enzima durante el ciclo celular de Myxobacter sp. AL-1 mediante el uso de dos criterios: (1)
ensayar la actividad de la celulasa contra la carboximetilcelulosa y (2) realizar un análisis de
zimograma específicamente para detectar el (los) polipéptido (s) que poseen esta actividad. Los
resultados de este análisis mostraron que Myxobacter sp. AL-1 produce actividad de
carboximetilcelulasa que comienza en la fase exponencial, aunque la actividad máxima no se
alcanzó hasta la fase estacionaria de crecimiento (Fig. 1A). El análisis de gel de actividad reveló que
la contribución a la actividad celulolítica podría atribuirse a dos polipéptidos que tienen masas
moleculares de 32 y 35 kDa respectivamente. La apariencia de la banda de 35 kDa fue transitoria
ya que desapareció después de 8 h de crecimiento; Por otro lado, la banda de 32 kDa se mantuvo
incluso después de 20 h de crecimiento. Estas observaciones podrían sugerir una relación de
producto precursor entre estas actividades, probablemente mediante el procesamiento
proteolítico de la celulasa de 35 kDa.

El protocolo reportado aquí para purificar la quitosanasa celulasa mejoró los parámetros de
purificación y la recuperación de la actividad enzimática seis y tres veces, respectivamente, en
comparación con el método reportado por Hedges y Wolfe (1974).

Los experimentos llevados a cabo para probar la capacidad de la quitosanasa-celulasa para

degradar el metilumbeliferil-celotriosido y el metillumbeliferil-celobiósido revelaron que

esta enzima catalizó la descomposición no solo del celotriosido, sino también del derivado del
celobiósido, aunque

la enzima catalizó la hidrólisis del primero más

eficientemente. Este resultado probablemente refleja la preferencia de la quitosanasa-celulasa por

la hidrolización de celulosa

sustratos de cadenas más largas y está de acuerdo con los resultados anteriores de Hedges y
Wolfe (1974), quienes tienen

demostró que la cellodextrina más corta para ser atacada

por la enzima es un celotriosido. Resultados anteriores de Van

Tilbeurgh y col. (1982) habían demostrado que una endocelulasa de Trichoderma reesei era
incapaz de hidrolizarse

methylumbelliferyl-cellobioside y que esta enzima requirió al menos tres unidades de azúcar en el

glucósido fluorescente para catalizar su hidrólisis. Por otro lado, el análisis de la hidrólisis de los
oligómeros de quitosano mostró que la quitosanasa-celulasa reconoce como sustrato un tamaño
mínimo de seis unidades de glucosamina en la cadena de quitosano, curiosamente este sustrato se
degradó mucho mejor a 70 ° C que a 42 ° C . En vista del hecho de que nuestros resultados
demostraron una falta de termoestabilidad de la quitosanasa-celulasa cuando se incubó a 55 o 70
° C (Fig. 5), estos resultados intrigantes podrían conciliarse con los resultados anteriores de Hedges
y Wolfe (1974) , quienes han observado que la temperatura óptima de la quitosanasa-celulasa
para la degradación total del quitosano desacetilado es de 70 ° C, lo que sugiere que este
comportamiento obedece a un efecto protector ejercido por el quitosano sobre la enzima. Por
otro lado, la quitosanasa-celulasa hidrolizó los sustratos de celulosa metilumbeliferilcelotriosido y
carboximetilcelulosa de manera más eficiente a 42 ° C que a 70 ° C (Tabla 2). Teniendo en cuenta
el comportamiento diferencial de la quitosanasa-celulasa en el ataque de los polisacáridos unidos
a β-1,4 de diferentes estructuras químicas, se podría especular que esta enzima posee diferentes
sitios catalíticos para atacar los enlaces glucosídicos de esos polisacáridos. Alternativamente, un
aumento en la temperatura de reacción (es decir, 70 ° C) podría promover la relajación del sitio
catalítico para la actividad de la celulasa en la enzima, permitiendo así el ajuste de un sustrato
estrechamente relacionado. La incapacidad del quitosano 6-mer para competir durante la
hidrólisis de la quitosanasa celulasa del metilumbeliferil-celotriosido podría respaldar la sugerencia
de que la enzima posee diferentes subdominios para catalizar la hidrólisis de dos polisacáridos
relacionados pero diferentes.

Secuenciación amino terminal de Myxobacter sp. AL-1

quitosanasa-celulasa y elucidación de la 25 N-terminal

los aminoácidos revelaron dos aspectos de la enzima. (1) El

enzima posee 76% de identidad con endocelulasas de B.

cepas subtilis (McKay et al. 1986; Robson y Chambliss 1986; Wolf et al. 1995). Por lo tanto, es
razonable especular que Myxobacter sp. AL-1 quitosanasa-celulasa comparte

cierto grado de homología con otras celulasas que, en

junto con las endocelulasas de B. subtilis, se agrupan en

Familia 5 de la clasificación establecida por Henrissat y

Bairoch (1993). (2) El primer aminoácido presente en adultos

se encontró que la quitosanasa-celulasa era Ala, que está en

concordancia con la encontrada en endocelulasas maduras de B. subtilis (Fig. 6). Este resultado
sugiere que el procesamiento del péptido señal durante la exportación de glucanasas puede
ocurrir por

mecanismos similares en ambos tipos de microorganismos. Aunque existen diferencias en el

péptido señal exportado

proteínas entre microorganismos grampositivos y gramnegativos, se conservan algunas

características, a saber, un

terminal amino cargado positivamente, un tramo de residuos hidrofóbicos y una porción de

carboxilo polar con consenso

secuencia de escisión (Simonen y Palva 1993). En el caso

de B. subtilis, la endocelulasa y otras proteínas exportadas conservan la secuencia de división de

consenso Ala-XAla, y la peptidasa señal correspondiente actúa sobre el

lado carboxi del segundo Ala (Simonen y Palva

1993). La clonación del gen que codifica la quitosanasa-celulasa y el esclarecimiento de su

estructura primaria serán fundamentales para el establecimiento de la relación funcional y
estructural existente en su producto bifuncional.
Fig. 1A Expresión temporal de la actividad quitosanasa-celulasa

(P) durante Myxobacter sp. Crecimiento de AL-1 a 37 ° C (L) en medio líquido. B Actividad de
carboximetilcelulosa (CM-celulasa) después de SDS-PAGE de proteínas secretadas en el medio de
cultivo durante el crecimiento de Myxobacter sp. AL-1 a 37 ° C. Muestras de cultivo (1.5

ml cada uno) recolectado durante diferentes períodos de Myxobacter sp. AL-1

el crecimiento se descongeló y centrifugó, y el sobrenadante se precipitó con ácido tricloroacético

al 10% (p / v). Los gránulos de proteína fueron

suspendido en tampón de carga y separado en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% que contiene

1% (p / v) de carboximetilcelulosa. los

el gel se procesó para la renaturalización de proteínas como se describe en Materiales y métodos y

posteriormente se tiñó con Coomassie

Azul R-250. Después de desteñir con una solución de metanol: acético

ácido (10:40, v / v), el gel se procesó para establecer zimogramas de actividad de

carboximetilcelulasa como se describe en Materiales

y métodos Carril 1 marcadores de peso molecular, carriles 2–6 cultivo

muestras recolectadas a las 2, 5, 7, 8 y 9 h de crecimiento

Fig. 2 Análisis SDS-PAGE de las diferentes etapas de la purificación de quitosanasa celulasa. Carril 1
marcadores de peso molecular, 2 ZnCl2

extracto crudo, 3 grupos de fracciones activas de la columna de intercambio iónico y 4 grupos de

fracciones activas de BioGel P-60

Fig. 3A, B Zimogramas de actividad de celulasa. Una proteína variada

Cantidades del conjunto de fracciones activas obtenidas de la columna de intercambio iónico se

precipitaron con tricloroacético al 10% (p / v)

ácido; los gránulos de proteína se lavaron y volvieron a suspender

en el búfer de carga. Las muestras de proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE,

y el gel se procesó para la actividad de carboximetilcelulasa como

descrito en Materiales y métodos. Carriles 1–4 10, 20, 40 y 80

µg de proteína, respectivamente. B Muestras de proteínas del crudo ZnCl2

extracto (carril 1) y el conjunto de fracciones con actividad enzimática de

la columna de intercambio iónico (carril 2) se precipitó con 10%

(p / v) ácido tricloroacético como se describió anteriormente y se sometieron adicionalmente a

SDS-PAGE en un mini gel de poliacrilamida al 13%. El gel

se procesó para renaturalización, se tiñó y luego se procesó para actividad contra 4-

metilumbeliferil-β-D-celotriosido como se describe

en Materiales y métodos. Carril 1 560 µg de proteína, carril 2 30 g de proteína (quitosanasa-

celulasa de células Chs)