UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA”

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MEDINA VETERINARIA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

ASIGNATURA DE:

BACTERIOLOGÍA

SEMESTRE: I

2020

ICA – PERÚ

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 UNIVERSIDAD NACIONAL “SAN LUIS GONZAGA”

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y

ZOOTECNIA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE
MEDICINA VETERINARIA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABOORATORIO

ASIGNATURA DE:

MICROBIOLOGIA

Autor: Mag. MVZ AGUSTIN GUERRERO CANELO

2020

ICA – PERÚ
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 ÍNDICE Pag.

Presentación..................................................................................................................4

Sumilla .........................................................................................................................6

Instrucciones para el uso del Laboratorio.....................................................................7

Procedimiento para las practicas ..................................................................................9

Procedimiento de Primeros Auxilios y Emergencia.....................................................10

Gestión de residuos en el Laboratorio ..........................................................................11

Símbolos de Riesgos (Biológico, Químico y Físico) ...................................................25

Practicas:

I. Reconocimiento de equipos y materiales de Laboratorio .................................26

II. Bioseguridad en el laboratorio y Preparación de medios de cultivos....................46

III. Métodos de siembra para aislamientos y cultivos bacterianos ..............................54

IV. Identificación bacteriana: Coloraciones simples y compuestas ............................65

V. Identificación bacteriana: Coloraciones especiales ...............................................71

VI. Identificación de cocos Gram positivos: Pruebas bioquímicas .............................78

VII. Identificación de Enterobacterias fermentadoras: Pruebas bioquímicas ...............87

VIII. Desinfección y Índice fenol...................................................................................100

IX. Prueba de sensibilidad bacteriana..........................................................................104

X. Identificación indirecta de Ehrlichia canis mediante test rápido ..........................112

XI. Cultivo de Hongos.................................................................................................118

XII. Cultivo de virus en huevos embrionados ..............................................................123

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 PRESENTACIÓN

Hasta fines del siglo XVII, no se sabía de los microrganismos, pero estamos sometidos
constantemente a las consecuencias de su actividad. Las enfermedades infecciosas fueron
hasta hace poco la principal causa de muerte. Pero también tenemos los beneficios de
fermentación de alimentos, interacciones con la agricultura, con la medicina preventiva y
curativa. Robert Hooke (1635 – 1703) y Antony van Leeuwenhoek (1632 – 1723),
descubrieron el mundo microbiano.

En el siglo XX, se ha experimentado mayor conocimiento que a lo largo de toda la historia.

La biología, es una de las ciencias que más ha evolucionado, y la microbiología, en
particular.

La mayoría de microorganismos son de formas de bastones o cocos sin ningunas

características distintivas. Como las células procariotas (bacterias y arqueas) no tienen
orgánulos, a diferencia de las células eucariotas, durante años se creyó que el citoplasma de
los procariotas era un simple saco que contenía enzimas, ribosomas y algunos pocos tipos
de polímeros. Aparte de la complejidad intracelular que empezamos a conocer, los
procariotas no son organismos pasivos, que simplemente se nutren de lo que tienen a su
alrededor y se multiplican, sino que presentan todas las propiedades neuronales de los
organismos superiores. Los procariotas pueden discriminar, aprender, adaptarse y
comunicarse químicamente con otros individuos de su entorno; a veces a grandes distancias.

Estamos en la era de la genómica y de los procesos vitales de los microorganismos. En 1995,

se secuenció el genoma de dos bacterias: Haemophilus influenzae y Mycoplasma genitalium.
El numero de genomas completos publicados en el año 2009 eran 987, de los cuales 58 de
Archaea, 825 de Bacteria y 104 de Eukaria. Se está investigando cual será el genoma
mínimo que permita a una célula procariota vivir de forma libre. En pocos años se producirá
una célula sintética. El estudio de los microorganismos es esencial para entender la vida
sobre nuestro planeta.

Los microrganismos patógenos han representado y representan una amenaza para todas las
formas de vida. Sin embargo, hemos aprendido a coexistir con los microorganismos, y la
interacción mas abundante son con microorganismos no patógenos en forma simbiótica. Los
microorganismos contribuyen de manera esencial al funcionamiento del planeta y ayuda al
desarrollo sostenible de la biosfera. Dependemos de las actividades del mundo microbiano
para el mantenimiento de la vida.

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Desde esta expectativa debemos involucrarnos en la catedra de Microbiología Veterinaria a
través de la presente guía que cuenta con 12 practicas, cuya secuencia está diseñada para que
el estudiante adquiera los conocimientos de términos técnicos y procedimientos para
identificar microorganismos (bacterias, hongos y virus), mediante métodos directos y
métodos indirectos. Cada sesión de practica deberá complementarse con actividades
individuales y grupales que consiste en tareas que deben ser investigadas y presentadas cada
semana.

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 SUMILLA

La asignatura de Microbiología Veterinaria es de naturaleza teórico – práctico; corresponde

al tipo de estudios específicos, tiene como propósito que los estudiantes adquieran

conocimientos específicos del estudio de los microorganismos patógenos y saprofitos, tales

como bacterias, hongos y virus.

Comprende:

Unidad I:

- Importancia de los microorganismos.

- Taxonomía, tamaño y morfología.

Unidad II:

- Fisiología bacteriana, metabolismo.

- Factores del medio ambiente que influyen en el crecimiento bacteriano.

Unidad III:

- Control de microorganismos.

- Estudio de las drogas antimicrobianas.

- Rickettsias y Clamydias: Fisiología (características particulares).

Unidad IV:

- Estudio de los hongos.

- Estudio de los virus.

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 INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL LABORATORIO
El presente documento es de cumplimiento estricto por el personal administrativo, docentes
y estudiantes:

1. Asistir a las prácticas programadas de manera puntal, en la fecha y hora señalada para
su grupo de trabajo.
2. Si el estudiante este resfriado o tiene heridas en las manos, no debe participar
directamente de las labores.
3. El ingreso de los estudiantes será solo con autorización y bajo supervisión del docente
del curso.
4. No ingresar con mochilas, portafolios, carteras, etc.
5. No ingresar alimentos y bebidas para consumo personal.
6. No fumar, comer ni beber.
7. No utilizar lentes de contacto, zapatos abiertos (Tipo sandalias), anillos, pulseras, dijes,
aretes largos, etc.
8. Los estudiantes deben usar de forma obligatoria y permanente el mandil, guantes y
otros equipos de protección personal (EPP) de acuerdo a los riesgos de la práctica y lo
indicado por el docente.
9. Los útiles y pertenencias que no cumplan un contenido en la práctica, deberán ser
colocados en el lugar indicado por el docente.
10. Hacer uso adecuado de las instalaciones, mobiliario, instrumental, materiales y
sustancias. No se permite las bromas pesadas ni los juegos bruscos.
11. Los estudiantes ocuparán el lugar que se les asigne durante todo el curso en las mesas
de trabajo y no deberán desplazarse a otras mesas o intervenir en el trabajo de sus
compañeros de otras mesas.
12. Todos los materiales, equipos y reactivos proporcionados, deberán ser utilizados de
acuerdo a las indicaciones del instructivo de la práctica del docente. Cualquier
accidente, por irresponsabilidad, en que resulten dañados los reactivos, materiales o
equipos, estos deberán ser repuestos al laboratorio por los integrantes del equipo o por
la persona responsable, en un plazo no mayor de 8 días. De no hacerlo, se le suspenderá
el acceso al laboratorio en las prácticas posteriores.
13. Los estudiantes aportarán los materiales, reactivos y muestras faltantes para el desarrollo
de las practicas. Se recomienda al final de cada práctica, leer la próxima para cerciorarse

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 si se requiere traer algún material, reactivo o muestras o en su defecto preguntarle al
docente.
14. Se prohíbe terminantemente realizar cualquier otra actividad ajena a las programadas o
indicadas por el docente. El área del laboratorio es exclusivamente para realizar el
trabajo de la práctica; cualquier tipo de acción ajena al trabajo; como las reuniones
sociales o de cualquier tipo deberán realizarse en otra área apropiada para tal fin.
15. A los estudiantes que se les sorprenda rayando las mesas o butacas, además de limpiarlas
serán suspendidos de la práctica o prácticas a criterio del docente o jefe del laboratorio.
16. Las indisciplinas, según su gravedad, pueden ocasionar la suspensión temporal o
definitiva del estudiante a criterio del docente responsable del laboratorio y estas pueden
ser:
a) No prestar atención a las indicaciones del docente.
b) No utilizar los reactivos, materiales o equipo de acuerdo a las indicaciones.
c) Negarse a reintegrar materiales o equipo cuando las causas sean imputables a un
uso inadecuado.
d) Andar molestando a sus demás compañeros impidiéndoles trabajar
adecuadamente.
e) Llevarse de manos o estar jugando durante el desarrollo de las prácticas.
f) La falta de cumplimiento de los avisos y señalamientos de seguridad del
laboratorio.
g) Las demás que considere inapropiadas el docente.
17. Cuando sea necesaria la utilización del área de laboratorio fuera del horario asignado; o
del material o equipo fuera de las instalaciones de la Facultad, el usuario deberá realizar
la solicitud con al menos 72 horas de anticipación a la persona encargada. El solicitante,
será el responsable, y deberá ser aprobada con la firma del coordinador de carrera o del
docente de la asignatura.

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 PROCEDIMIENTO PARA LAS PRACTICAS
1. Los alumnos deben: guía de práctica, marcador de vidrio, papel lente y encendedor.
2. Cada subgrupo debe contar con los equipos, materiales, reactivos y muestras.
3. El trabajo en equipo no quiere decir que una persona haga todo; por lo que es obligación
de todos participar en el desarrollo de los experimentos.
4. Leer el instructivo y escuchar las indicaciones del docente. Jamás se debe iniciar una
práctica sin estar seguro de lo que se va a hacer.
5. Limpiar la superficie de la mesa de trabajo con alcohol de 70º, antes y después de cada
práctica.
6. Rotular las muestras y materiales con el código asignado a la mesa de trabajo.
7. Manipular las muestras con instrumentos estériles.
8. Mechero de bunsen al encenderse, mantenerse a distancia prudente de la llama para
evitar el contacto con la vestimenta y no dejar material inflamable cerca.
9. La manipulación de las muestras (siembra, trasplantes, diluciones, etc.), se realizarán
cerca de la llama emitida por el mechero de bunsen.
10. Las placas petris solo serán entreabiertas o abiertas ceca de la llama del mechero de
bunsen.
11. No pipetear con la boca. Usar el succionador de pipeta.
12. Colocar las pipetas y portaobjetos contaminados en un recipiente con desinfectante.
13. Los residuos no peligrosos generados en las prácticas deben ser depositados en el bote
o tacho de basura que hay en el laboratorio, el cual posteriormente debe ser evacuado
como residuo no peligroso al camión de basura de la municipalidad.
14. Los residuos químicos y biológicos peligrosos generados en las prácticas serán
depositados en el bote de residuo peligroso de acuerdo al tipo de residuo. Posteriormente
estos residuos son almacenados temporalmente en el almacén de residuos peligrosos,
para finalmente una empresa especializada en la disposición final la retire del almacén.
15. Al finalizar la práctica los estudiantes deben dejar limpia el área de trabajo y entrega los
materiales utilizados limpios y en buenas condiciones.
16. Limpiar los lentes de los microscopios con papel lente y guardarlos.
17. Lavarse las manos.
18. Revisar la llave del balón de gas y del agua.
19. Apagar y/o desconectar los aparatos eléctricos, si fuera necesario.
20. Al finalizar todas las labores, el personal, el docente y/o encargado del laboratorio, hará
una supervisión final para cerrar el recinto.

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 PROCEDIMIENTOS DE PRIMEROS AUXILIOS Y EMERGENCIA

a) Derrame de material infeccioso sobre la superficie:

- Reportar al encargado de la práctica.

- Cubrir con papel toalla impregnada con desinfectante los vidrios rotos y/o cultivos.

- Esperar 30 minutos para la acción del desinfectante.

- Usar guantes para retirar el material con ayuda de nuevas toallas y desinfectar de nuevo

el área contaminada.

- Colocar el material contaminado y los guantes empleados en una bolsa de desecho para

luego ser autoclavado antes de su eliminación.

b) Derrame de material infeccioso sobre el cuerpo:

- Reportar al encargado de la práctica.

- Remover la ropa inmediatamente y colocarla en una solución con desinfectante.

- Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por 5 minutos.

- Remitirlo al centro de salud de la FMVZ.

c) Salpicaduras en los ojos con materiales infecciosos:

- Reportar al encargado de la practica

- Con abundante agua, lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del

parpado durante 15 minutos.

- Remitirlo al centro de salud de la FMVZ.

d) Heridas por pinchazos con material infecciosos

- Reportar al encargado de la practica

- Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón durante 10 minutos.

- Aplicar antiséptico.

- Remitirlo al centro de salud de la FMVZ.

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 GESTION DE RESIDUOS SOLIDOS EN EL LABORATORIO
I. Clasificación de residuos sólidos peligrosos
Clase A: Residuo Biocontaminado
Tipo A.1: Atención al Paciente
Residuos sólidos contaminados con secreciones, excreciones y demás líquidos
orgánicos provenientes de la atención de pacientes, incluye restos de alimentos.
Tipo A.2: Material Biológico
Cultivos, inóculos, mezcla de microorganismos y medio de cultivo inoculado
proveniente del laboratorio clínico o de investigación, vacuna vencida o inutilizada,
filtro de gases aspiradores de áreas contaminadas por agentes infecciosos y cualquier
residuo contaminado por estos materiales.
Tipo A.3: Bolsas conteniendo sangre y hemoderivados.
Constituye las bolsas conteniendo sangre de pacientes, bolsas de sangre vacías; bolsas
de sangre o h e m o d e r i v a d o s con plazo de utilización vencida; muestras de sangre
para análisis; suero, plasma y; otros subproductos.
Tipo A.4: Residuos Quirúrgicos y Anátomo Patológicos
Compuesto por tejidos, órganos, piezas anatómicas, y residuos sólidos contaminados
con sangre y otros líquidos orgánicos resultantes de cirugía.
Tipo A.5: Punzo cortantes
Compuestos por elementos punzo cortantes que estuvieron en contacto con agentes
infecciosos, incluyen agujas hipodérmicas, pipetas, bisturís, placas de cultivo, agujas
de sutura, catéteres con aguja, pipetas rotas y otros objetos de vidrio punzantes
desechados.
Tipo A.6: Animales contaminados
Se incluyen los cadáveres o partes de animales inoculados, expuesto a microorganismos
patógenos, así como sus lechos o material utilizado, provenientes de los laboratorios
de investigación Médica o Veterinaria.
Clase B: Residuos Especiales
Tipo B.1: Residuos Químicos Peligrosos
Recipientes o materiales contaminados por sustancias o productos químicos
con características tóxicas, corrosivas, inflamables, explosivos, reactivas, genotóxicos
o mutagénicos, tales como quimioterapéuticos; productos químicos no utilizados;
plaguicidas fuera de especificación; solventes; ácido crómico (usado en limpieza de

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 vidrios de laboratorio); mercurio de termómetros; soluciones para revelado de
radiografías; aceites lubricantes usados, etc.
Tipo B.2: Residuos Farmacéuticos
Compuesto por medicamentos v e n c i d o s ; contaminados, d e s a c t u a l i z a d o s ; no
utilizados, etc.
Tipo B.3: Residuos radioactivos
Compuesto por materiales radioactivos o contaminados con radionúclidos con baja
actividad, provenientes de laboratorios de investigación química y biología; de
laboratorios de análisis clínicos y servicios de medicina nuclear. Estos materiales son
normalmente sólidos o pueden ser materiales contaminados por líquidos
radioactivos (jeringas, papel absorbente, frascos líquidos derramados, orina, heces,
etc.)
Clase C: Residuo común
Compuesto por todos los residuos que no se encuentren en ninguna de las categorías
anteriores y que, por su semejanza con los residuos domésticos, pueden ser
considerados como tales. Se incluyen: residuos generados en administración,
proveniente de la limpieza de jardines y patios, cocina, entre otros, caracterizado
por papeles, cartones, cajas, plásticos, restos de preparación de alimentos, etc.

II. MANEJO DE LOS RESIDUOS SÓLIDOS

El manejo apropiado de los residuos sólidos hospitalarios sigue un flujo de
operaciones que tiene como punto de inicio el acondicionamiento de los diferentes
servicios con los insumos y equipos necesarios, seguido de la segregación, que es una
etapa fundamental porque requiere del compromiso y participación activa de todo el
personal del establecimiento de salud.
El transporte interno, el almacenamiento y el tratamiento son operaciones que ejecuta
generalmente el personal de limpieza, para lo cual se requiere de la logística
adecuada y de personal debidamente entrenado.
Las etapas establecidas en el manejo de los residuos sólidos, son las siguientes:
a) Acondicionamiento.
b) Segregación y Almacenamiento Primario.
c) Almacenamiento Intermedio.
d) Transporte Interno.
e) Almacenamiento Final.

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f) Tratamiento de los residuos sólidos.
g) Recolección Externa.
h) Disposición final.
2.a. Acondicionamiento
El acondicionamiento es la preparación de los servicios y áreas hospitalarias con los
materiales e insumos necesarios para descartar los residuos de acuerdo a los criterios
técnicos establecidos en este Manual.
Para esta etapa se debe considerar la información del diagnóstico de los residuos
sólidos, teniendo en cuenta principalmente el volumen de producción y clase de
residuos que genera cada servicio del establecimiento de salud.
Requerimientos
- Listado de recipientes y bolsas por servicios.
- Recipientes con tapa para residuos sólidos.
- Bolsas de polietileno de alta densidad de color rojo, negro y amarillo.
- Recipientes rígidos e impermeables pa ra descartar material punzo cortante,
debidamente rotulados.
Procedimiento
- Seleccionar los tipos de recipientes y determinar la cantidad a utilizar en cada
servicio, considerando capacidad, forma y material de fabricación.
- Determinar la cantidad, color y capacidad de las bolsas (que debe ser al menos
20 % mayor de la capacidad del recipiente) a utilizar según la clase de residuos.
Se emplearán:
 Bolsas negras (residuos comunes).
 Bolsas rojas (residuos biocontaminados).
 Bolsas amarillas (residuos especiales).
- El personal encargado de la limpieza colocará los recipientes con sus respectivas
bolsas en los diferentes servicios y áreas hospitalarias, de acuerdo a los
requerimientos identificados en el punto anterior.
- Colocar la bolsa en el interior del recipiente doblándola haci a fuera,
recubriendo los bordes del contenedor.
- Ubicar los recipientes lo más cerca posible a la fuente de generación.
- Para descartar residuos punzocortantes se colocarán recipientes rígidos especiales
para este tipo de residuos.

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 - Ubicar el recipiente para el residuo punzo cortante de tal manera que no se caiga ni
voltee.
- Verificar el cumplimiento del acondicionamiento de acuerdo a la clase de residuo
y volumen que genera el servicio. Es importante verificar la eliminación de
los residuos con la bolsa correspondiente.
2.b. Segregación y Almacenamiento Primario.
La segregación es uno de los procedimientos fundamentales de la adecuada gestión
de residuos y consiste en la separación en el punto de generación, de los residuos
sólidos ubicándolos de acuerdo a su tipo en el recipiente (almacenamiento primario)
correspondiente. La eficacia de este procedimiento minimizará los riesgos a la salud del
personal del hospital y al deterioro ambiental, así como facilitará los procedimientos de
transporte, reciclaje y tratamiento. Es importante señalar que la participación activa
de todo el personal de salud permitirá una buena segregación del residuo.
Requerimientos:
- Servicios debidamente acondicionados para descartar los residuos sólidos.
- Personal capacitado.

Semejante a los residuos domésticos.
Residuos generados en
administración (papeles, plásticos,
etc.). Residuos de alimentos (no
incluye de los pacientes). Papel,
máscaras de nebulización, bolsas de
polietileno, frascos de suero, llaves
de doble y triple vía, papel toalla,
bolsas.
Residuos contaminados con líquidos orgánicos. Residuos químicos peligrosos
Bolsas con sangre y hemoderivados. Residuos (recipientes o materiales contaminados
Quirúrgicos y Anatomo Patológicos. Restos de por sustancias o productos químicos con
alimentos de pacientes. Guantes, bajalengua, características toxicas, corrosivas,
mascarillas descartables, vendas, gasas, inflamables, explosivos, reactivas,
apósitos, algodón, sondas de aspiración, alitas, genotóxicas o mutagénicos. Residuos
agujas hipodérmicas, equipo de venoclisis, Farmacéuticos compuesto por
jeringas, torundas de algodón, catéteres medicamentos vencidos, contaminados,
endovenosos, ampollas de vidrio rotas, sonda desactualizados, no utilizados. Residuos
Foley, sonda nasogástrica, sonda rectal y radioactivos. Envases de desinfectantes
esparadrapo. Materiales punzocortantes. Ropa
manchada con fluidos corporales.

Figura 1. Colores, según clasificación de residuos hospitalarios (recipientes acondicionados

para almacenamiento primario)

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Procedimiento:
- Identificar y clasificar el residuo para eliminarlo en el recipiente respectivo.
- Desechar los residuos con un mínimo de manipulación, sobre todo para aquellos
residuos biocontaminados y especiales.
- Al segregar los residuos cualquiera sea el tipo verificar que no se exceda de las dos
terceras partes de la capacidad del recipiente.
- En el caso de jeringas descartar de acuerdo al tipo de recipiente rígido:
 Si el recipiente tiene dispositivo para separar aguja de la jeringa, descartar
sólo la aguja en dicho recipiente.
 Si el recipiente no cuenta con dispositivo de separación de aguja, eliminar
el conjunto (aguja-jeringa) completo.
 Si la jeringa contiene residuos de medicamentos citotóxicos se depositará
en el recipiente rígido junto con la aguja.
 En caso de que las jeringas o material punzocortante, se encuentren
contaminados con residuos radioactivos, se colocarán en recipientes rígidos, los
cuales deben estar rotulados con el símbolo de peligro radioactivo.
- No separar la aguja de la jeringa con la mano a fin de evitar accidentes.
- Nunca reencapsular la aguja.
- Si se cuenta con un Destructor de Agujas, utilícelo inmediatamente después de usar
la aguja y descarte la jeringa u otro artículo usado en el recipiente destinado para
residuos biocontaminados.
- Para otro tipo de residuos punzocortantes (vidrios rotos) no contemplados en el
tipo A.5 se deberá colocar en envases o cajas rígidas sellando adecuadamente para
evitar cortes u otras lesiones. Serán eliminados siguiendo el manejo de residuo
biocontaminado y deben ser rotuladas indicando el material que contiene.
- Los medicamentos generados como residuos sólidos en hospitales deberán de
preferencia incinerarse, en caso contrario se introducirán directamente en
recipientes rígidos exclusivos, cuyo tamaño estará en función del volumen de
generación. Los medicamentos citotóxicos deberán necesariamente incinerarse.
- En el caso de los residuos procedentes de fuentes radioactivas
encapsuladas, como Cobalto (Co-60), Cesio (Cs-137), o el Iridio (Ir-192) no podrán
ser manipulados por el personal del establecimiento de salud, siendo
competencia exclusiva de su manipulación del personal del IPEN.

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- Los residuos procedentes de fuentes radioactivas no encapsuladas, tales como:
agujas, algodón, vasos descartables, viales, papel, que hayan tenido contacto con
algún radioisótopo líquido, se almacenarán temporalmente en un recipiente especial
plomado, herméticamente cerrado, de acuerdo a lo establecido por el IPEN.
- En caso de los residuos generados en el área de microbiología y específicamente con
los cultivos procesados, estos residuos deberán ser previamente autoclavados.
- Los recipientes deberán ser lavados.

Foto 1. Recipiente con bolsa de color Foto 2. Recipiente rígido para

rojo de almacenamiento primario descartar material punzocortante.
para residuos biocontaminados

2.c. Almacenamiento intermedio

Es el lugar o ambiente en donde se acopian temporalmente los residuos generados por
las diferentes fuentes de los servicios cercanos. Este almacenamiento se implementa de
acuerdo al volumen de residuos generados en el establecimiento de salud. En el caso
de volúmenes menores a 130 litros se podrá prescindir de este almacenamiento.
Requerimientos:
- Ambiente apropiado de acuerdo a las especificaciones técnicas.
- Ambiente debidamente acondicionado, con buena ventilación e iluminación
(recipientes, bolsas, estantes, etc.).
Procedimiento:
- Depositar los residuos embolsados provenientes de los diferentes servicios, en los
recipientes acondicionados, según la clase de residuo. (todos los residuos sólidos
deberán eliminarse en sus respectivas bolsas).

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- No comprimir las bolsas con los residuos a fin de evitar que se rompan y se generen
derrames.
- Mantener los recipientes debidamente tapados.
- Mantener la puerta del almacenamiento intermedio siempre cerrada con la señalización
correspondiente.
- Una vez llenos los recipientes no deben permanecer en este ambiente por más de 12
horas.
- Verificar que los residuos del almacén intermedio hayan sido retirados de acuerdo al
cronograma establecido.
- Mantener el área de almacenamiento limpia y desinfectada para evitar la
contaminación y proliferación de microorganismos patógenos y vectores.

Foto 3. Almacenamiento Interno acondicionado para la clasificación

de los residuos biocontaminados y residuos comunes

2.d. Transporte interno

Consiste en trasladar los residuos del lugar de generación al almacenamiento intermedio
o final, según sea el caso, considerando la frecuencia de recojo de los residuos
establecidos para cada servicio.
Requerimientos
- Coches de transporte ó recipientes c on ruedas, de uso exclusivo y de acuerdo a
especificaciones técnicas.
- Ruta de transporte establecida de acuerdo a:

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  Las rutas serán definidas de manera tal que, en un menor recorrido posible
se transporte los residuos de un almacenamiento a otro.
 Evitar e l cruce c o n l a s r u t a s d e al i m ent os , r o p a l i m p i a , t r a s l a d o d e
pacientes y en caso contrario asegurar que los recipientes de los residuos sólidos
estén cerrados.
 En ningún caso usar ductos.
- Horarios de transporte establecidos, en función de aquellas horas de menor afluencia
de personas, asimismo en horas en las cuales no se transporten alimentos.

Foto 4. Transporte Interno de los residuos sólidos hospitalarios

Procedimiento:
- El personal de limpieza contando con el equipo de protección personal realizará
el recojo de residuos dentro de los ambientes de acuerdo a la frecuencia del servicio
o cuando el recipiente esté lleno hasta las 2/3 partes de su capacidad, en caso del
almacenamiento primario y cuando esté totalmente lleno en el caso del
almacenamiento intermedio.
- Para el recojo de los residuos se debe cerrar la bolsa torciendo la abertura y
amarrándola, no se debe vaciar los residuos de una bolsa a otra.
- Al cerrar la bolsa se deberá eliminar el exceso de aire, teniendo cuidado de no
inhalarlo o exponerse a ese flujo de aire.
- Para el traslado de los recipientes rígidos de material punzocortante, asegurarse de
cerrarlos y sellarlos correctamente.
- Transportar los recipientes de residuos utilizando transporte de ruedas (coches u
otros) con los recipientes cerrados. No se debe compactar los residuos en los
recipientes.

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- Las bolsas se deben sujetar por la parte superior y mantener alejadas del cuerpo
durante su traslado, evitando arrastrarlas por el suelo.
- Los residuos de alimentos se trasladan directamente al almacenamiento final según
las rutas y el horario establecidos.
- En caso de contar con ascensores, el uso de estos será exclusivo durante el traslado
de los residuos de acuerdo al horario establecido (preferiblemente en horas de
menor afluencia de personas) y se procederá a su limpieza y desinfección inmediata
para su normal funcionamiento.
- El personal de limpieza debe asegurar que el recipiente se encuentre limpio luego
del traslado y acondicionado con la bolsa respectiva para su uso posterior.

2.e. Almacenamiento final

En la etapa de almacenamiento final los residuos sólidos hospitalarios provenientes del
almacenamiento s e c u n d a r i o o de la fuente de generación según sea el caso, son
depositados temporalmente para su tratamiento y disposición final en el relleno
sanitario.
Requerimientos:
- Ambiente de uso exclusivo y debidamente señalizado de acuerdo a las
especificaciones técnicas.
- Ambiente debidamente acondicionado: pisos limpios y desinfectados. En el caso de
establecimientos de salud que generen menos de 130 litros por día, se dispondrán de
recipientes.
- El personal de limpieza que ejecuta el almacenamiento debe contar con ropa de
trabajo y equipo de protección personal.
Procedimiento:
- Almacenar los residuos sólidos de acuerdo a su clasificación en el espacio dispuesto
y acondicionado para cada clase (biocontaminados, común y especial). En caso de
que el establecimiento de salud, genere menos de 130 litros por día, las bolsas que
contienen los residuos se depositarán en los recipientes respectivos.
- Colocar los residuos punzocortantes en una zona debidamente identificada con un
rótulo que indique "Residuos Punzocortantes" y con el símbolo internacional de
Bioseguridad.
- Apilar los residuos biocontaminados sin compactar.

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- Colocar l os residuos d e alimentos, e n los recipientes r e s p e c t i v o s , para evitar
derrames.
- Los residuos sólidos se almacenarán en este ambiente por un período de tiempo
corto.
- Limpiar y desinfectar el ambiente luego de la evacuación de los residuos para su
tratamiento o disposición final.

Foto 5. Almacenamiento Final y clasificación de los

residuosospitalarios

2.f. Tratamiento de los residuos solidos

El tratamiento de los residuos sólidos hospitalarios consiste en transformar las
características físicas, químicas y biológicas de un residuo peligroso en un residuo no
peligroso o bien menos peligroso a efectos de hacer más seguras las condiciones de
almacenamiento, transporte o disposición final.
El método de tratamiento a aplicar será sin perjuicio a la población hospitalaria y al
medio ambiente.
Los métodos de tratamiento recomendados son:
- Enterramiento Controlado.
- Esterilización por Autoclave.
- Incineración.
- Desinfección por Microondas.
2.g. Recolección externa
La recolección externa implica el recojo por parte de la empresa prestadora de servicios
de residuos sólidos registrada por DIGESA y autorizada por el Municipio

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correspondiente, desde el hospital hasta su disposición final (rellenos sanitarios
autorizados).
Requerimientos:
- Coches de transporte
- Balanzas
- Registros de cantidad de residuos recolectados
- Personal entrenado c o n equipos de protección personal.
Procedimiento:
- Pesar los residuos evitando derrames y contaminación en el establecimiento
de salud, así como el contacto de las bolsas con el cuerpo del operario. Es
recomendable llevar registro del peso de residuo sólido generado.
- Trasladar las bolsas de residuos a las unidades de transporte utilizando equipos
de protección personal y a través de rutas establecidas.
- Para realizar la recolección y transporte de las bolsas de residuos hacia el camión
recolector, emplear técnicas ergonómicas de levantamiento y movilización de cargas.
- Verificar el traslado al relleno sanitario, al menos una vez al mes.
- Verificar que el camión recolector de residuo sólido hospitalario cumpla con las
normas sanitarias vigentes.
2.h. Disposición final
La disposición final de los residuos sólidos hospitalarios generados deberá ser llevados
a rellenos sanitarios autorizados por la autoridad competente de acuerdo a las normas
legales vigentes.
Tabla 1. Tipos de residuos generados en los Hospitales

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Recomendaciones:
A. De la gestión
- Todo establecimiento de salud, debe implementar un Sistema de Gestión para el
Manejo de Residuos Sólidos Hospitalarios, orientado no solo a controlar los riesgos
sino a lograr la minimización de los residuos sólidos desde el punto de origen.
- La Dirección del establecimiento de salud tiene la responsabilidad de la
implementación del Sistema de Gestión para el Manejo de Residuos Sólidos,
quien podrá a su vez asignar al (los) coordinador(es) del Sistema.
- La documentación correspondiente al Sistema de Gestión para el Manejo de Residuos
Sólidos Hospitalarios debe ser difundida a toda la comunidad hospitalaria.
B. Del acondicinamiento
Todos los ambientes del establecimiento de salud, deben contar con los materiales
e insumos necesarios para descartar los residuos sólidos de acuerdo a la actividad
que en ellos se realizan.
C. De la segregación
- Todo el personal debe participar de manera activa y consciente en colocar los residuos
en el recipiente correspondiente.
- Todo residuo punzocortante debe ser depositado en un recipiente rígido.
D. Del almacenamiento intermedio
Los establecimientos de salud que por su complejidad y magnitud, generen durante la
jornada grandes cantidades de residuos sólidos deben contar con un almacenamiento
intermedio que concentre temporalmente los residuos de los servicios cercanos.
E. Del transporte interno
Determinar horarios y rutas para el transporte de los residuos en sus envases y
recipientes debidamente cerrados, considerando horas o rutas en donde hay menor
presencia de pacientes y visitas.
F. Del almacenamiento final
- Todo establecimiento de salud, debe contar con una instalación adecuada para
centralizar los residuos provenientes de todos los servicios y áreas del establecimiento
de salud, que permita almacenar los residuos sin causar daños al medioambiente y
al personal que allí labora.
- Los lugares destinados al almacenamiento final de residuos sólidos hospitalarios
quedarán aislados de salas de hospitalización, cirugía, laboratorio, toma de muestra,
banco de sangre, preparación de alimentos y en general lugares que requieran completa

22
 asepsia, minimizando de esta manera una posible contaminación cruzada con
microorganismos patógenos.
G. Tratamiento
- Todo establecimiento de salud, debe implementar un método de tratamiento de sus
residuos sólidos acorde con su magnitud, nivel de complejidad, ubicación geográfica,
recursos disponibles y viabilidad técnica.
- Para cualquier método de tratamiento empleado debe realizarse una verificación
periódica de los parámetros críticos (temperatura, humedad, volumen de tratamiento,
tiempo, etc.).
H. Recolección externa y disposición final
El establecimiento de salud, debe asegurarse que la empresa prestadora de servicios de
manejo de residuos sólidos hospitalarios, debe contar con la autorización emitida por el
Municipio y ser depositada en rellenos sanitarios registrados en la DIGESA, además de
contar con la autorización para la disposición final de residuos sólidos hospitalarios.
I. Envasado de residuos sólidos hospitalarios
J. Cada uno de los tipos de residuos considerados en la clasificación debe contar con
recipientes claramente identificados y apropiado:
a) Los residuos contaminados deberán depositarse en bolsa de polietileno virgen, de espesor
mínimo de80 micras y de tamaño mínimo de 60 cm. de ancho y 80cm. de largo, de color
rojo, con pictograma de color negro e identificación del generador, fecha de generación y
lugar de origen, que pueden ser cerradas con un dispositivo que garantice su hermeticidad
durante el traslado.
b) Los RH comunes serán envasados en bolsas negras de polietileno. Luego de completarse
la capacidad de la bolsa (hasta 3/4 partes) es necesario cerrarla con el precinto y
depositarla en un sitio destinado exclusivamente para esto. Los residuos deben
permanecer el menor tiempo posible en las áreas técnicas.
K. Descarte de Vidrios
- Realizar el descartarte en recipiente rígido y grueso (caja dura de cartón o plástica)
- Cerrar bien el recipiente cuando alcance 3/4 parte de su contenido. Con recipiente cerrado
descartar en bolsa roja.
L. Laboratorio (descarte en bolsa roja):
- Reactivos vencidos.
- Placas de Petri, usadas y vencidas.
- Medios de Bioquímica en tubos de plástico

23
- Recipientes de muestras biológicas cerrados (frascos de orina, de hemocultivo,
expectoración, materia fecal, sangre).
- Hisopos con muestra biológicas.
M. Descartador rígido
- Agujas
- Jeringas
- Bisturí
- Láminas
- Cubre objetos
- Punteros plásticos
N. Procedimiento a realizar a los tubos de ensayo de vidrio contaminados:
- Se deja en celdilla para su posterior decontaminación (hipoclorito 5.000 ppm durante 20
minutos).
- Lavado con agua y jabón.
- Se esteriliza a vapor.
- Alcohol Clorhídrico 3 %.
- Alcohol Acetona y colorantes (cristal violeta, safranina, fuscina fenicada y azul de
metileno) se descarta en red.
O. Actividades previas al envasado:
Las sustancias y productos químicos, farmacéuticos y los oncológicos, se neutralizarán o
desactivarán en forma previa a su colocación en recipientes rígidos e identificados, según las
instrucciones del fabricante y/o importador.
P. Desecho de material punzo – cortante.
- No reencapuchar las agujas.
- No doblar las agujas.
- No romper las agujas.
- No manipularlas para separarlas de la jeringa (usar pinza) No retornar al paquete original
el bisturí.
- No llenar el descartador más de ¾ partes de su capacidad.
- Colocar el envase una vez cerrado en bolsa roja con pictograma.
Recordar:
- Las bolsas se deben trasladar sin arrastrar.
- Deben estar identificadas con el lugar de generación y fecha.
- Una vez de precintadas las bolsas no deben ser comprimidas para evitar roturas.

24
 SIMBOLOS DE RIESGOS

A. Biológico

B. Químico

C.
Físico

25
 PRÁCTICA Nº 1

Reconocimiento de equipos y materiales de laboratorio

I. Introducción

Un laboratorio de Microbiología es un ambiente convenientemente habilitado, limpio y

ordenado para aislar y identificar microorganismos. Este tipo de trabajo se lleva a cabo en
condiciones de esterilidad, por lo que se requieren de equipos y materiales. Es necesario el
conocimiento del funcionamiento de los equipos y materiales para optimizar su utilización.
En la presente práctica se describirá detalladamente algunos equipos y materiales
fundamentales para las labores en el laboratorio de Microbiología.

II. OBJETIVO

Reconocer los principales equipos y materiales que se emplean en el Laboratorio.

Objetivos específicos:

- Reconocer los equipos de esterilización.

- Reconocer los equipos y materiales para la preparación de medios de cultivos.
- Reconocer los equipos y materiales para las siembras bacteriológicas.
III. Competencias a desarrollar
- Conoce el funcionamiento de los equipos y materiales de esterilización.
- Conoce los equipos y materiales para la preparación de medios de cultivos in vitro.
- Conoce el funcionamiento de los equipos y materiales para las siembras bacteriológicas.
IV. Equipos y Material a Utilizar en los procesos de esterilización:

Tabla 2. Métodos de esterilización

Agente Sistema de esterilización Método Control de esterilidad

Físico Calor húmedo Autoclave a) Físicos
Calor seco Estufa Pasteur y Horno Poupinell
Incineración y flameado
Radiaciones Ionizantes
- Rayos gamma y beta
No ionizantes: b) Químico
- Rayos ultravioleta
Frio Congelación
Químico Gases Óxido de etileno
Formaldehido
Alternativos c) Biológicos
Líquidos Glutaraldehído, etc.
Mecánico Ondas Sónicas
Supersónicas

26
4.1. Equipos para la Esterilización

4.1.1. Esterilización por métodos físicos

4.1.1.1. Calor húmedo

4.1.1.1.1. Ebullición: consiste en mantener un objeto o sustancia en un baño a 100 ºC

durante 10 – 30 minutos. Destruye la mayoría de las formas vegetativas bacterianas, hongos
y virus lipídicos (Herpesvirus y HIV). En cambio no es efectivo para la destrucción de
esporos y virus no envueltos. La repetición de este proceso durante tres días consecutivos,
constituye la Tindalización. Su fundamento teórico está dado por la destrucción de las
formas vegetetivas durante los períodos de ebullición, permitiendo que los esporos germinen
durante el reposo volviéndose susceptibles al próximo calentamiento. Por lo que con este
método no se llega a la esterilización.

4.1.1.1.2. Autoclave

4.1.1.1.2.1. Autoclave vertical de manejo manual

Consta de dos recipientes cilíndricos, uno externo con tapa de cierre hermético que se
asegura por múltiples tornillos y uno interno donde se pone el material a esterilizar. El
recipiente externo contiene además, una válvula de seguridad, un manómetro o termómetro
y una llave de salida o escape. La fuente de calor puede venir incluida en el equipo como
una resistencia eléctrica o se le suministra aparte, desde abajo, generalmente mediante gas.
En la base del recipiente interno se coloca agua destilada, la cual al llegar al punto de
ebullición producirá el vapor que, al entrar en contacto con los microorganismos, actuará
como agente esterilizante. Los materiales se cargan dentro del recipiente interno que al no
tener tapa permite una fluida entrada de vapor, pero evita el contacto de estos con el agua.
El aire es mal conductor del calor, lo que impide llegar a las temperaturas necesarias, por lo
que una vez cargado y cerrado la autoclave debe purgarse. Esto se consigue dejando la llave
de escape abierta hasta que el vapor, por arrastre, elimine el aire contenido en el equipo. Se
cierra la llave, se deja que la presión llegue a una atmósfera relativa (15 lbs. o 121 ºC) y
luego se cuenta el tiempo de 15 – 30 minutos. Terminado el ciclo, se apaga la fuente de calor
y se deja descender la temperatura.¡¡¡ No debe abrirse la tapa hasta que la presión del sistema
se iguale a la atmosférica !!!. Tampoco se debe provocar una liberación brusca del vapor
(abriendo la llave de escape) ya que, si hay líquidos dentro del autoclave, alcanzarán

27
rápidamente estado de ebullición y se derramarán, debido a que disminuye la presión, pero
no la temperatura.

Figura 2. Partes de la autoclave

4.1.1.1.2.2. Autoclave que opera por gravedad

Son equipos eléctricos, automáticos o manuales. El vapor se produce dentro de una doble
pared y se libera desde la parte superior del autoclave, de manera de desplazar por gravedad
el aire hacia abajo, y promover su escape por una llave de salida inferior. Como precaución
debe introducirse el vapor lentamente para que no se caliente el aire al salir. Luego del
purgado, las etapas son iguales a las de la autoclave vertical.

Mecanismo de acción del calor húmedo:

Desnaturalización y coagulación de las proteínas, son importantes otros mecanismos de

destrucción, que justifican la utilización de calor húmedo a temperaturas inferiores, como
veremos más adelante. El primer efecto letal sería la producción de rupturas de cadena única
en el ADN que provocarían la muerte celular por activación o liberación de enzimas con
actividad de endonucleasas. El punto crítico para la supervivencia de la célula sería su
capacidad para reparar la lesión, función que depende del estado genético y fisiológico de la
bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agregaría la pérdida de la integridad
funcional de la membrana citoplásmica, lo que produciría interferencias en el intercambio
con el medio externo, los procesos respiratorios y la síntesis proteica. Por último, las
temperaturas más elevadas activarían ribonucleasas que degradando el ARNr producen la
pérdida de viabilidad de las células expuestas.

28
Las temperaturas a la cual puede usarse el calor húmedo son:

- Pasteurización (por debajo de 100 ºC).

- Ebullición y Tindalización (a 100 ºC).
- Autoclavado (por encima de 100 ºC).

Pasteurización: se utiliza para eliminar gérmenes patógenos, con resistencia térmica similar
o inferior a Mycobacterium tuberculosis, Brucella y Salmonella. No es un método de
esterilización sino de desinfección, donde no se destruyen ni esporos ni virus no lipídicos.

Métodos de pasteurización:

- Lenta (se calienta a 65 ºC durante 30 minutos luego se enfría rápidamente a 10 ºC.

- Rápida (se calienta a 72 ºC durante 15 segundos, luego se enfría rápidamente a 10 ºC.

Uso: Esta técnica se utiliza fundamentalmente en la descontaminación de la leche.

4.1.1.2. Calor seco

Horno Pasteur o Poupinell: Es un recinto metálico de doble pared con aislante entre ambas
(para no perder calor) y una puerta. La fuente de calor suele ser eléctrica y está incorporada.
Posee un ventilador que facilita la circulación del aire caliente y homogeniza la temperatura.
Un termómetro (alcance mínimo: 200 ºC) visible desde afuera, registra la temperatura
interna. Se pueden esterilizar: materiales de inyectables, vidrios, instrumentos quirúrgicos y
objetos metálicos, así como aceites, vaselinas y polvos, que son impermeables al vapor.

Precauciones: Colocar paquetes pequeños y espaciados, para no interferir con la difusión

del calor. La carga se realiza cuando se encuentre frío, de lo contrario su interior alcanzará
la temperatura antes que el material a esterilizar, por lo que se medirá mal el tiempo.

Figura 3. Estufa de esterilización

29
Control de esterilización:

a) Físicos: están relacionados al operario que realiza el procedimiento y la vigilancia de

ciertos parámetros como: presión, tiempo, temperatura, etc.
b) Químicos: consiste en tiras de papel con una sustancia que cambia de color al ser
expuesto a la temperatura correspondiente. La ventaja de este método, es la rapidez con
que se sabe el resultado, ya que es inmediato. La gran desventaja es que dice poco sobre
el tiempo de exposición, por lo que no asegura un procedimiento correcto. Estos controles
deben utilizarse en todos los ciclos de esterilización.
c) Biológicos: consisten en exponer esporos bacterianos al ciclo de esterilización y luego
verificar su viabilidad. Son los más seguros. Dentro de una ampolla se encuentra un medio
de cultivo apropiado para el desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de esta, un
tubo plástico, contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con esporos de
bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a los procesos realizados. Se utilizan
esporos de Bacillus estearothermophilus en el autoclave y de B.subtilis en la poupinell.
Este sistema se coloca dentro del paquete menos accesible ya sea para el calor o el vapor.
Finalizado el ciclo de esterilización, se rompe la ampolla (por presión manual)

Tabla 3. Principales características de los métodos de esterilización (autoclave y horno)

Características Autoclave Horno

Temperatura requerida 121 ºC 160 ºC

Tiempo 15 – 20 minutos 1 – 2 horas

Mecanismo de acción Coagulación y desnaturalización de las Desnaturalización proteica, lesiones por

proteínas. oxidación y toxicidad por producir
aumento de electrolitos.

Modo de acción Por difusión de vapor de agua. Calentamiento por contigüidad.

Materiales Vidrios, medios de cultivo, gomas, Vidrios, instrumentos metálicos, polvos,

esterilizables telas, algodón, guantes, algunos aceites y vaselinas, etc..
plásticos, etc..

Materiales no Medios con ciertos ATBs, azúcares o Gomas; plásticos; instrumentos

esterilizables proteínas; polvos; vaselinas y aceites; termosensibles; medios con ATBs,
metales oxidables; instrumentos azúcares y proteínas; guantes; algodón;
médicos termosensibles como papeles.
broncoscopio, etc.

30
4.1.1.3. Filtración (Equipo de filtración al vacío)

- Equipo compuesto por un embudo para filtro de membrana o para filtros Seitz,
actualmente se utilizan los filtros membranosos (Millipore) hechos a base de nitrocelular
o colodion, cuyos diámetros de porosidad oscilan desde 0.22 – 10 um.

- Se emplea en la purificación de medios y retención de bacterias, los únicos aplicables a

la filtración de virus. Para acelerar el proceso de filtrado se debe emplear una bomba de
vacío, que mediante succión permite eficacia en el trabajo.

Materiales que se esterilizan:

- Sustancias que pueden alterase por las elevadas temperaturas de las autoclaves; como:
 Ciertos hidratos de carbono (reactivos de fermentación).
 Algunos líquidos orgánicos (suero, plasma o liquido ascítico) empleados para
enriquecimiento de medios de cultivos y que son requeridos en forma íntegra.

4.1.1.4. Radiaciones (Luz ultravioleta)

- La banda ultravioleta de la luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas
vegetativas de los microorganismos que carecen de protección.

- Es utilizada para esterilizar el ambiente de trabajo del flujo laminar, quirófanos y otras
áreas para disminuir infecciones transmitidas a través del aire.

Actividad antimicrobiana

A mayor longitud de onda menor frecuencia y onda menos energéticas. A menor longitud
de onda mayor frecuencia y onda más energética.

31
 Baja energía

Alta energía

Figura 4. Radiaciones ionizantes y radiaciones no ionizantes

4.1.2 Esterilización por métodos químicos

- Fumigación por m3: 53 ml. de formalina + 15 grs. de permanganato de potasio, en

condiciones de temperatura mayor a 18ºC y Humedad de 70 %.
- Oxido de etileno (C2H4O): Gas altamente soluble en agua; sin embargo su acción
esterilizante es lenta, costoso, presenta ciertos riesgos de toxicidad residual (acción
vesicante sobre la piel) y es explosivo (este riesgo se elimina con la combinación con CO2
al 90% o con un Fluorocarbon.
Utilización:

- Materiales que se deterioran por el calor y no pueden ser filtrados (Libros, materiales de
cueros, alhajas; etc.).

32
Mecanismo de acción:

Los gases esterilizantes son y actúan como agentes alquilantes, reemplazando átomos de H+
lábiles en grupos químicos como NH2 y OH, abundantes en proteínas y ácidos nucleicos, y
también en grupos como COOH y SH presentes en proteínas; la sustitución lo hacen por
ambos extremos de la cadena alquilantes estableciendo especie de puentes en una misma
molécula o en moléculas vecinas que presenten estos grupos, lo cual les altera totalmente su
estructura molecular causando la muerte microbiana.

4.2. Equipos y materiales para la preparación de medios de cultivos

4.2.1. Equipos

4.2.1.1. Microondas (para calentar los medios de cultivos)

Figura 5. Microondas.

4.2.1.2. Cabina de bioseguridad

Es un recinto o espacio de trabajo cerrado y ventilado para trabajar de modo seguro con
materiales contaminados (o potencialmente contaminados) con
agentes patógenos (bacterias, virus...). Son la fuente principal de eliminación y prevención
de la contaminación, y suponen una barrera fiable para una triple protección: del usuario
(personal), el experimento (producto) y la habitación y el edificio (medioambiental). Los 3
tipos de protección se conocen como contención primaria. Las cabinas de bioseguridad

33
utilizan un flujo de aire dirigido específicamente para controlar y arrastrar aerosoles y
partículas, y la filtración HEPA para capturarlos y eliminarlos de la corriente de aire.

Existen diferentes tipos, diferenciados por las características específicas de su construcción.

Tabla 4. Tipos de cabinas de bioseguridad

Clasificación de microorganismos según Grupos de Riesgo (OMS, 2005):

Agentes del GRUPO DE RIESGO I

- Bajo riesgo individual y comunitario (Requieren nivel de contención 1).

- Bacterias, hongos, virus y parásitos, que no causan enfermedades a trabajadores de
laboratorio y animales.

Agentes del GRUPO DE RIESGO II

- Moderado riesgo individual y riesgo comunitario limitado (nivel de contención 2).

- Patógenos que pueden causar enfermedades a humanos o animales, pero bajo
circunstancias normales no producen riesgos serios a trabajadores de laboratorio, la
comunidad y el medioambiente. Las exposiciones de laboratorio rara vez conducen a
infecciones que produzcan enfermedades serias.

34
- Existen tratamientos efectivos, medidas preventivas y el riesgo de dispersión en la
comunidad es bajo.
a) Bacterias: Actinobacillus, Actinomyces pyogenes (C. pyogenes), Bacillus cereus,
Bartonella bacilliformis, B. henselae, B. quintana, B. elizabethae, Bordetella pertussis,
B. parapertussis y B. bronchiseptica, Borrelia recurrentis y B. burgdorferi,
Campylobacter spp. (C. coli, C . fetus, C. jejuni), Chlamydia pneumoniae, C. psittaci
(cepas no aviares), C. trachomatis, Clostridium botulinum, Cl. chauvoei, Cl. difficile, Cl.
haemolyticum, Cl. histolyticum, Cl. novyi, Cl. perfringens, Cl. septicum, Cl. sordellii, Cl.
Tetani , Corynebacterium diphtheriae, C. haemolyticum, C. pseudotuberculosis, C.
pyogenes (A. pyogenes), Edwardsiella tarda, Erysipelothrix rusiopathae (insidiosa),
Escherichia coli cepas enterotoxigénica/invasiva/hemorrágica., Francisella tularensis
tipo B, (biovar palaearctica), F. novocida, Fusobacterium necrophorum, Haemophilus
influenzae, H. ducreyi, Helicobacter pylori, Legionella spp., Leptospira interrogans -
todos los serovares, Listeria monocytogenes, Mycobacterium (todas las especies, excepto
M. tuberculosis y M. bovis “líneas no BCG” que corresponden a grupo de riesgo 3),
Mycoplasma pneumoniae, M. hominis Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Nocardia
asteroides, N. brasiliensis, Pasteurella, (todas la especies excepto P. multocida tipo B
que corresponde a grupo 3), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella entérica (S.
choleraesuis), Salmonella entérica serovar arizonae (Arizona hinshawii) Salmonella
entérica ser. gallinarum-pullorum (S. gallinarum-pullorum) Salmonella entérica ser.
meleagridis (S. meleagridis), Salmonella entérica ser. paratyphi B (S. paratyphi B)
(Schottmulleri) Salmonella entérica ser. typhi (S. typhi) Salmonella entérica ser.
typhimurium (S. typhimurium) Shigella boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, S. sonnei,
Staphylococcus aureus Streptobacillus moniliformis,,Streptococcus spp. (Grupos
Lancefield A, B, C, D, G), Treponema carateum, T. pallidum (incluido pertenue), T.
vincentii, Ureaplasma urealyticum , Vibrio cholerae (incl. El Tor), V. parahaemolyticus,
V. vulnificus Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis,
b) Hongos: Cryptococcaceae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Moniliaceae
Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Epidermophyton floccosum, Microsporum
spp., Sporothrix schenckii, Trichophyton spp.
c) Virus: Adenoviridae, Adenovirus, todos los serotipos; Arenaviridae virus de la
coriomeningitis linfocítica (líneas adaptadas en laboratorio); complejo de virus Tacaribe:
Tamiami, Tacaribe, Pichinde Bunyaviridae género Bunyavirus Bunyamwera y virus
relacionados; grupo de la encefalitis de California, (incluyendo La Crosse, Lumbo)

35
género Phlebovirus todas las especies excepto el virus de la fiebre del valle de Rift;
Caliciviridae (todos los aislados incluyendo Hepatitis E y Norwalk); Coronaviridae:
coronavirus humanos (todas las líneas); encefalomielitis transmisible del cerdo;
encefalomielitis hemoaglutinante del cerdo; virus de la hepatitis del ratón; coronavirus
bovino; virus de la peritonitis infecciosa felina; Virus de la bronquitis infecciosa aviar;
coronavirus caninos, de ratas y conejos; Flaviviridae: virus de la fiebre amarilla (línea
vacunal 17D) virus del Dengue (serotipos 1,2,3,4) Kunjin, virus Hepadnaviridae, virus de
Hepatitis B, incluido agente Delta Herpesviridae; Alphaherpesvirinae género
Simplexvirus: (todos los aislados incluyendo HHV1 y HHV2, Herpesvirus B que se
incluyen en el grupo de riesgo 3) género Varicellovirus: (todos los aislados incluso
varicella/zoster “HHV3”) y virus de la pseudorrabia) Betaherpesvirinae género
Cytomegalovirus: (todos los aislados incluyendo CMV – HHV5); género
Muromegalovirus: (todos los aislados); Gammaherpesvirinae; género
Lymphocryptovirus: virus de Epstein Barr (HHV 4) y aislados similares a EB; género
Rhadinovirus: (todos los aislados excepto H. ateles y H. saimiri que se incluyen en el
grupo de riesgo 3) género Thetalymphocryptovirus: (todos los aislados) Herpesvirus sin
clasificación: (incluendo HHV6 -virus alfalinfotrófico humano HHV7, HHV8, etc.)
Orthomyxoviridae; género Influenzavirus: Influenza virus tipo A, (todos los aislados),
Influenza virus tipo B, (todos los aislados) Influenza virus tipo C, (todos los aislados);
Papovaviridae, género Papillomavirus: (todos los aislados); género Polyomavirus: (todos
los aislados) Paramyxoviridae género Paramyxovirus: (todos los aislados); género
Pneumovirus: (todos los aislados); género Morbillivirus: (todos los aislados);
Parvoviridae género Parvovirus: (todos los aislados); Picornaviridae género Aphthovirus;
género Cardiovirus (todos los aislados); género Enterovirus (todos los aislados); género
Hepatovirus (todos los aislados “Hepatitis A”); género Rhinovirus (todos los aislados);
Poxviridae Chordopoxvirinae (poxvirusesde vertebrdos) género Capripoxvirus género
Molluscipoxvirus; género Yatapoxvirus género Avipoxvirus (todos los aislados) género
Leporipoxvirus (todos los aislados) género Orthopoxvirinae (todos los aislados excepto
Variola y Monkeypox en nivel 4); género Parapoxvirus: (todos los aislados); género
Suipoxvirus: Swinepox (Todos los demás poxvirus de vertebrados no agrupados);
Reoviridae; género Orbivirus (todos los aislados); género Orthoreovirus tipos 1, 2 y 3.;
género Rotavirus (todos los aislados); Retroviridae; Oncovirinae; género Oncornavirus C
subgénero Oncornavirus C avian (todos los aislados); subgénero Oncornavirus C
mammalian (todos los aislados excepto HTLV-I, HTLV-II); género Oncornavirus B

36
 (todos los aislados); Lentivirinae (todos los aislados excepto HIVI, HIV-II) Spumavirinae
(todos los ailados); Rhabdoviridae género Vesiculovirus (todas las líneas adaptadas en
laboratorio); género Lyssavirus: virus de la rabia (virus fijado); Togaviridae, género
Alphavirus Semliki forest virus Sindbis O'Nyong Nyong Ross river virus; virus de la
encefalitis equina de Venezuela (Solo líneaTC – 83) género Rubivirus Rubella virus;
género Pestivirus: virus de la Hepatitis C; virus de la diarrea viral bovina; virus de Border
disease; género Arterivirus: virus de la arteritis equina, virus sin clasificar; Toroviridae;
otros virus de la Hepatitis; virus de la enfermedad de Borna; Astro viruses Chronic
infectious neuropathic agents (CHINAs): Scrapie, BSE (excepto Kuru, CJD en grupo de
riesgo 3).
d) Parásitos: Los estados infecciosos de los siguientes parásitos han causado infección por
ingestión, penetración por la piel o mucosas o inyección accidental. Las preparaciones
que se saben libres de los estados infectivos no requieren este nivel de contención.
- Protozoos: Babesia microti; Babesia divergens; Balantidium coli; Cryptosporidium
spp.; Entamoeba histolytica; Giardia spp. (mamíferos); Leishmania spp. (mamíferos);
Naegleria fowleri, Plasmodium spp. (humano o simio); Pneumocystis carinii;
Toxoplasma gondii; Trypanosoma brucei,; T. cruzi.
- Helmintos – Nematodos: Ancylostoma duodenale; Angiostrongylus spp.; Ascaris spp.;
Brugia spp.; Loa loa Necator americanus; Onchocerca volvulus; Strongyloides spp.;
Toxocara canis; Trichinella spp.; Trichuris trichiura; Wuchereria bancrofti.
- Cestodes: Echinococcus (segmentos grávidos); Hymenolepis diminuta; Hymenolepis
nana (origen humano); Taenia saginata; Taenia solium.
- Trematodos: Clonorchis sinensis; Fasciola hepática; Opisthorchis spp.; Paragonimus
westermani; Schistosoma haematobium; Schistosoma japonicum; Schistosoma mansoni.

Agentes del GRUPO DE RIESGO III

- Alto riesgo individual y bajo riesgo comunitario (Requieren nivel de contención 3).
- Patógenos que causan enfermedades humanas o animales serias, o que pueden resultar en
serias consecuencias económicas, pero que normalmente no se transmiten por contacto
casual de un individuo a otro.
- Existe tratamiento con agentes antimicrobianos o antiparasitarios.
a) Bacterias: Bacillus anthracis; Brucella (todas las especies); Burkolderia (Pseudomonas)
mallei; B. pseudomallei; Chlamydia psittaci (solo líneas aviares); Coxiella burnetii;
Francisella tularensis, tipo A (biovar tularensis); Mycobacterium tuberculosis; M. bovis

37
 (no líneas BCG); Pasteurella multocida, tipo B; Rickettsia (todas las especies); Yersinia
pestis.
Nota: La preparación de extendidos y cultivos primarios de M. tuberculois pueden
realizarse en laboratorios con nivel de contención 2. Cualquier otra actividad con M.
tuberculosis requiere laboratorio y prácticas que se ajusten al nivel de contención 3.
b) Hongos: Moniliaceae; Ajellomyces dermatitidis; (Blastomyces dermatitidis)
Coccidioides immitis; Ajellomyces capsulatum (Histoplasma capsulatum incluyendo var.
duboisii); Paracoccidioides brasiliensis.
c) Virus: Arenaviridae; virus de la coriomeningitis linfocítica, cepas neurotróficas;
Bunyaviridae: Bunyavirus sin clasificar, Hantaan, fiebre hemorrágica coreanay virus de
la nefrosis epidémica incluyendo el virus responsable del síndrome pulmonar por
Hantavirus; virus de la fiebre del valle de Rift ; Flaviviridae: virus de la fiebre amarilla
(tipo salvaje); virus de la encefalitis de St. Louis; virus de la encefalitis japonesa; virus
de la encefalitis del valle de Murray; Powassan; Herpesviridae; Gammaherpesvirinae;
género Rhadinovirus: Herpesvirus ateles; Herpesvirus saimiri; Retroviridae;
Oncovirinae; género Oncornavirus C, Human T-cell leukemia/lymphoma virus (HTLV)
(ver nota) género Oncornavirus D; virus Mason-Pfizer de monos; virus de primates no
humanos; Lentivirinae; virus de la inmunodeficiencia humana (HIV todos los aislados)
(ver nota) Rhabdoviridae género Vesiculovirus (cepas tipo salvaje); género Lyssavirus;
Rabies virus (virus de calle); Togaviridae género Alphavirus: virus de la encefalitis
equina del este; Encefalitis equina venezolana de Chikungunya (excepto línea TC-83);
encefalitis equina del oeste; virus sin clasificar: Chronic infectious neuropathic agents
(CHINAs): Kuru, Creutzfeldt-Jakob agent (El nivel de precaución depende del tipo de
manipulación y la cantidad de material con que se trabaja).
Nota: El aislamiento e identificación de HTLV y HIV pueden realizarse en laboratorios
con nivel de contención 2 pero cuidando que las prácticas sean acordes al nivel de
contención 3. Las actividades de producción de masa vírica o investigación requieren
laboratorios y prácticas que se ajusten al nivel de contención 3.
d) Parásitos: Ninguno

Agentes del GRUPO DE RIESGO IV

- Alto riesgo individual y comunitario (Requieren nivel de contención 4).

38
- Patógenos que usualmente producen enfermedades muy serias en humanos o animales, la
mayoría de las veces sin tratamiento, que pueden transmitirse fácilmente de un individuo
a otro, o de animales a humanos y viceversa, directa, indirectamente o por contacto casual.
a) Bacterias: Ninguna.
b) Hongos: Ninguno.
c) Virus: Arenaviridae virus de Lassa, Junín y Machupo, Sabia, Guanarito; Bunyaviridae
género Nairovirus Crimean-Congo hemorrhagic fever Filoviridae: virus de Marburg;
virus de Ebola; Flaviviridae: complejo de la encefalitis Tick-borne; incluyendo encefalitis
rusa, de primavera - verano; virus del bosque de Kyasanur; virus de la fiebre hemorrágica
de Omsk; Herpesviridae; Alphaherpesvirinae; género Simplexvirus: Herpes B virus
(virus del mono) Poxviridae género Orthopoxvirinae Variola Monkeypox.
d) Parásitos: Ninguno.

Figura 6. Partes de la cabina de bioseguridad

39
Figura 7. Filtración del aire contaminado que ingresa a la cabina por los filtros HEPA

4.2.1.3. Balanza Analítica (para pesar los medios de cultivos)

Figura 8. Partes de la balanza analítica

40
4.2.2. Materiales

4.2.2.1. Pipetas graduadas

Es un instrumento que se utiliza para medir pequeñas cantidades de líquido. Suelen ser de
vidrio y de plásticos descartables. Está formado por un tubo transparente que termina en una
de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación indicando distintos volúmenes.

Figura 9. Pipetas de diferentes calibres (1, 2, 5, 10 y 25 ml)

4.2.2.2. Aspiradores de pipetas

Figura 10. Aspiradores de pipetas

41
4.2.2.3. Tubos de ensayos con tapa rosca:

- Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una abertura en la zona superior, y en la zona
inferior se encuentra cerrado y redondeado.

- Este hecho de un Vidrio Especial que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo, los
cambios de temperatura muy radicales pueden provocar el rompimiento de tubo.

- Se emplean para preparar medios de cultivos líquidos, semisólidos y sólidos.

Calibres de tubos con tapa rosca:

- 12 x 75 mm
- 13 x 100 mm
- 16 x 100 mm
- 16 x 125 mm
- 20 x 125 mm
- 20 x 150 mm
- 20 x 200 mm
- 25 x 150 mm

Figura 11. Tubos de prueba con tapa rosca

4.2.2.4. Placas Petri (para prepara medios de cultivos solidos)

Calibre de las placas Petri descartables:

- 90 x 15 mm
- 100 x 15 mm

Figura 12. Placa Petri

42
4.2.2.4. Botellas de vidrio tapa rosca azul (dilución de los medios de cultivos)

4.2.2.5. Probeta (para medir el agua destilada)

Figura 13. Botella con tapa rosca azul Figura 14. Probeta

4.3. Equipos y materiales para la siembra bacteriológica

4.3.1. Asa bacteriológica (para la siembra de las muestras)

Micrón con la punta en aro

(2 – 3 mm de diámetro)

Mango

Figura 15. Partes del asa bacteriológica

43
4.3.2. Espátula de Drigalski (para la siembra por extensión en superficie)

Figura 16. Espátula de Drigalski

4.3.1. Mechero de bunsen (para esterilizar el asa bacteriológica)

Figura 17. Partes del mechero de bunsen

V. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

5.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para identificar
los equipos y materiales que se emplean para la esterilización, preparación de medios
de cultivos y siembras bacteriológicas)

5.2. Realizar un mapa conceptual para el uso de las cabinas de bioseguridad de acuerdo al
Grupos de Riesgo e indicar las diferencias.

VI. Resultados
VII. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (5.1., 5.2., VI y VII) en forma individual y grupal
y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus informes en
carpeta física.

44
VIII. Referencias bibliográficas
1. Vignoli Rafael. Esterilización y Desinfección. Ubicado en:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2027.pdf
2. Jawetz, Ernest. (2011). Microbiología Médica de Jawets(25). s.I.: Mac Graw-Hill.
3. OMS (2005). Manual de Bioseguridad en Laboratorios, 3era Edición.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

45
 PRÁCTICA Nº 2

Bioseguridad en el Laboratorio y Preparación de medios de cultivos para bacterias

I. Introducción

La bioseguridad en el Laboratorio, es indispensable para prevenir infecciones con patógenos

contenidos en las muestras, así como los riesgos relacionados con la exposición a agentes
químicos, físicos o mecánicos. Por lo es necesario establecer normas de bioseguridad a nivel
institucional, aplicables a las diferentes actividades analíticas, de investigación y producción
que se realizan en el Laboratorio.

II. Bioseguridad

La Organización Mundial de la Salud (OMS, 2005), menciona que la seguridad biológica o

bioseguridad es definida como, un conjunto de normas, técnicas y medidas que van a ser
aplicadas con el propósito de proteger la integridad del personal, áreas hospitalarias, así
como también del medio ambiente, de algunos agentes infecciosos o cualquier otro que sea
considerado de riesgo biológico.

La bioseguridad es un enfoque estratégico e integrado que abarca los marcos normativos

(instrumentos y actividades) para analizar y gestión de riesgos (probabilidad de que un
peligro “biológico, genético, físico, mecánico o químico” se materialice en determinadas
condiciones y genere daños) para la vida humana, animal, vegetal y medio ambiente.

Principio de Bioseguridad:

1. Universalidad: Todos deben seguir las instrucciones para prevenir las enfermedades
evitando la exposición de la piel y de las mucosas durante la recepción, procesamiento y
el diagnostico de las muestra clínicas.
2. Contención: Son métodos seguros para el manejo de agentes infecciosos en el
laboratorio. En el intervienen las técnicas de procesamiento de las muestras de
laboratorio, los equipos de seguridad diseñados para la protección del personal y el diseño
del laboratorio

Propósito de la contención: Reducir la exposición del personal del laboratorio y de otras

personas a agentes potencialmente peligrosos y prevenir el escape de estos al exterior.

Tipos de contenciones:

46
a) Contención primaria: Es la protección del personal y del medio ambiente inmediato
contra la exposición a agentes infecciosos y/o productos químicos de riesgo. Es provista
por una buena técnica microbiológica y el uso apropiado del equipo de seguridad. El uso
de vacunas aumenta el nivel de protección personal.
b) Contención secundaria:Es la protección del medio ambiente externo al Laboratorio de
exposición de material infeccioso. Se logra por una combinación de las características de
la edificación y practicas operacionales.
3. Eliminación del material contaminado: Las muestras clínicas y los medios para la
identificación bacteriana deben ser eliminados sin riesgo, para lo cual deben ser
esterilizados en autoclave o incinerados.
III. Medios de cultivos para bacterias

Los medios de cultivos favorecen el crecimiento bacteriano para lo cual contienen en

solución los nutrientes de fácil asimilación como son los compuestos nitrogenados, hidratos
de carbono, vitaminas, sales; que bajo determinada concentración de iones hidrógenos,
concentración de oxigeno, humedad y temperatura adecuada permiten la proliferación
bacteriana, facilitando su identificación. Los medios de cultivos deben reflejar la naturaleza
en la que se encuentran los microorganismos.

3.1 Clases de medios de cultivos

3.1.1 Por su consistencia o estado físico

Esta clasificación depende de la concentración de agar (Polisacárido extraído de varias algas

marinas, no es un nutriente ni es atacable por ninguna enzima bacteriana, tiene la propiedad
de disolverse completamente en agua a temperatura de 90 a 100ºC. y comienza a solidificarse
por debajo de los 46ºC.) El agar fue introducido en la Microbiología por el Alemán Freus
Hesse en el año 1883 y hasta la actualidad se indispensable para los cultivos bacterianos en
forma de colonias; tenemos:

a) Medios líquidos (Caldos): Medio fluido, libre de agar.

Ejemplos:

- Caldo de infusión cerebro corazón.

- Caldo peptonado.
- Caldo nutritivo.
- Caldo selenito, etc.

47
b) Medios semisólidos: Son medios que contienen menos del 1% de agar en su
composición.

Ejemplos:

- Agar manitol movilidad, permite evidenciar la movilidad bacteriana.

- Medio de Hugh – Leifson.
c) Medios sólidos (Agar): Son aquellos medios que contienen más del 1 % de agar en su
formulación. En estos medios se obtienen colonias (conjunto de bacterias provenientes
de una célula madre, con el mismo patrimonio hereditario y las mismas características
fisiológicas)

Ejemplos:

- Agar sangre.
- Agar mac conkey.
- Agar salmonella shigella.
- Agar plate count.
- Agar rambach.
- Agar verde brillante, etc.

3.1.2 Por su composición

a) Medios comunes (Medios generales): Son medios de cultivos que permiten el

crecimiento indiscriminado de bacterias Gram positivas como Gram negativas, pocos
exigentes nutricionalmente. Carecen de inhibidores.

Ejemplos:

- Caldo nutritivo.
- Agar nutritivo.
- Agar plate count.
- Agar tripticasa soya.
b) Medios comunes enriquecidos: Son medios comunes a los cuales se les añade
determinadas sustancias como sangre, yema de huevo, suero sanguíneo, etc. Con el
propósito de mejorar sus propiedades nutritivas para microorganismos exigentes en su
nutrición.

Ejemplos:

48
- Caldo de infusión cerebro corazón.
- Agar sangre (agar triptosa soya + 5% de sangre de carnero estéril).
- Agar chocolate (Se obtiene por sobrecalentamiento del agar sangre); etc.
c) Medios selectivos: Son medios que se caracterizan por poseer en su composición
sustancias que favorecen el desarrollo de ciertas bacterias y a la vez evitan o retardan el
de otros. La selección se efectúa mediante:

c.1 El control de los ingredientes del medio.

Ejemplos:

Para aislamiento de bacterias Gram positiva:

- Agar azida sangre: El azida inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas,

permitiendo el crecimiento de las Gram positivas.
- Agar columbia + 5% de sangre: La colistina y ácido nalidíxico, suprimen el crecimiento
de Proteus, Klebsiella y Pseudomona, pero permite el crecimiento de Estafilococo,
Estreptococo y Enterococo.
- Agar Baird parker: El cloruro de litio, telurito y glicocola estimulan el crecimiento de
Estafilococo e inhiben el crecimiento de otras bacterias.

Para aislamiento de bacterias Gram negativas:

- Agar Salmonella shigella: Poseen sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que
inhiben la flora Gram positivas y lo hace en parte con el grupo de coliforme, sin dejar de
restringir el crecimiento de bacilos patógenos gram negativos. El tiosulfato sódico es
inhibidor y a la vez permite la formación de sulfuro que al unirse con iones de hierro del
citrato amoniacal de Fe, forman el sulfuro de hierro, presentándose colonias ennegrecidas.
- Agar Mac conkey: Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben a las bacterias
Gram positivas.
- Agar cetrimide: La cetrimida (bromuro de cetiltrimetilamonio) inhibe a otras bacterias
que no sean Pseudomona aeroginosa.

c.2 Alteración del medio ambiente:

Concentración de oxigeno

- En presencia de oxígeno para favorecer el crecimiento de bacterias aeróbicas y

facultativas.

49
- En la reducción de oxígeno e incremento de CO2 para el aislamiento de bacterias
microaerófilos.
- En ausencia de oxígeno para aislar bacterias anaeróbicas.

c.3 El ajuste de la temperatura de la incubación.

Ejemplo:

- Estreptococo faecalis a 60 ºC.

- Escherichia coli a 44 ºC.
- Campylobacter jejuni subesp. jejuni a 42 ºC.
- Listeria, capaz de crecer y desarrollarse a 4 ºC.
d) Medios diferenciales: Permiten diferenciar colonias bacterianas que se originan en la
misma placa de cultivo, para lo cual se toma en cuenta algunas propiedades bioquímicas
de las bacterias; como la fermentación de carbohidratos, formación de gas, cambios de
pH, fenómenos de oxidorreducción. Generalmente la diferenciación se evidencia por los
cambios de color.

Ejemplo:

- Agar Mac conkey: contiene lactosa, las bacterias que las fermentan producen la caída
del pH, lo cual va seguido de la absorción del rojo neutro impartiendo un color rojo a la
colonia, y las que no la fermentan tiene colonias blanquecinas. Por lo tanto, mediante este
medio podemos diferenciar Enteróbacterias lactosa positiva de Enteróbacterias lactosa
negativa.
- Agar Salmonella-Shigella: Permite diferenciar fermentadores de no fermentadores de
lactosa.
- Agar Citrato de Simmons:, Enteróbacterias capaces de metabolizar el citrato, crece
exuberantemente, el cual se manifiesta por el cambio de color del medio de verde a azul
oscuro.
- Agar hierro tres azucares (TSI), en este medio se detecta:
Degradación de tres azucares:
 La lactosa, ocurre en la parte superior (pico de flauta).
 La sacarosa, ocurre en la parte intermedia.
 La glucosa, es fermentada en la parte profunda y en condiciones anaeróbicas.

El tiosulfato sódico se reduce a sulfuro de hidrógeno.

50
La presencia de cavidades en el medio es debido a la formación de gas (H+ + CO2).

IV. Objetivo

Preparación de los medios de cultivos para bacterias bajo con normas de bioseguridad

Objetivos específicos

- Preparación de medios de cultivos líquidos.

- Preparación de medios de cultivos semisólidos.
- Preparación de medios de cultivos sólidos.
V. Competencias a desarrollar
- Realiza los cálculos de los requerimientos de los medios de cultivos y del agua destilada
para la preparación de los medios de cultivos.
- Elige los equipos y materiales para la preparación de los medios de cultivos.
- Prepara los medios de cultivos.
VI. Equipos, Materiales y Reactivos

Equipos:

- Balanza analítica.
- Microonda.
- Autoclave.

Materiales:

- Espátula.
- Matraz o frasco con tapa rosca de 100 ml a 1000 ml
- Trípode con su respectiva plancha de asbesto.
- Placas petri estériles.
- Tubos de pruebas estériles con tapa rosca.
- Probeta graduada de 100 a 500 ml de capacidad.
- Guantes de cuero.
- Pipeta pasteur.

Reactivos:

- Médios de cultivos.
- Sangre entera de carnero.
- Agua destilada.

51
 - Peachimetro.
- Frasco gotero con solución N de NaOH.
- Frasco gotero con solución N de HCl.
VII. Metodología.
a) Mezclado del medio de cultivo con agua destilada (según las recomendaciones del
fabricante).
- Mediante el empleo de una balanza analítica, los ingredientes o el medio de cultivo debe
ser pesado en cantidad exacta y verter en un matraz o frasco con tapa rosca cuya capacidad
depende del volumen de preparación final.
- Medir en una probeta el volumen de agua necesaria y adicionar al matraz o frasco con
tapa rosca.
- Homogenizar la solución con movimientos rotatorios de la mano.
b) Calentamiento
La solución se calienta en baño María, al vapor o en microondas para la dilución completa
del medio, que se reconoce por la ausencia de gránulos de agar en las paredes del
recipiente. Procurar obtener de dos a tres hervores.

c) Determinación y ajuste del pH

Ajustar el pH a 7.3 +/- 0.2 a 25ºC de temperatura, o según la indicación del fabricante. Si
el medio de cultivo es ácido, agregar gota a gota la solución de NaOHN, hasta alcanzar
el pH requerido; si tenemos un medio de cultivo alcalino, se agrega gota a gota la solución
de HClN, hasta obtener el pH de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

d) Embazar y etiquetar
Embazar los medios de cultivos sólidos en frascos con tapa rosca y los caldos en tubos de
pruebas con tapa rosca, con sus respectivas identificaciones.

e) Esterilización
Si es necesario, se emplea el autoclave a una temperatura de 121 ºC. (15 libras de presión)
durante 15 minutos, los frascos con tapa rosca o tubos de pruebas con tapa rosca deben
estar tapados, los cuales no deben contener más de los dos tercios de su capacidad total.

f) Plaqueo o entubado
Los medios de cultivos sólidos se vierten en placas petris o tubos de prueba con tapa rosca
y los caldos se mantienen tapados hasta su utilización o se vierten en tubos de pruebas.

52
 En la preparación de agar sangre, la sangre se debe agregar después de la esterilización y
cuando la temperatura este entre 40 a 45°C.

g) Control de esterilidad

Por cada lote de los medios de cultivos plaqueados o entubados deben ser incubados a
37ºC. de 24 a 72 horas. Al término del mismo no debe haber crecimiento de colonias
en los medios sólidos ni turbidez en los caldos. Eliminar las placas contaminadas.

h) Conservación

Las placas petris y los tubos de pruebas con los medios de cultivos que han pasado el
control de esterilidad deben ser conservados en refrigeración a 4ºC. dentro de bolsas
plásticas selladas, hasta el momento de su utilización (se pueden mantener 2 – 4 meses).

VIII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

8.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual sobre los
niveles de bioseguridad en el laboratorio de Microbiología)

8.2. Realizar un mapa conceptual sobre la preparación de los medios de cultivos.

IX. Resultados
X. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (8.1., 8.2., IX y X) en forma individual y grupal
y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus informes en
carpeta física.

XI. Referencias bibliográficas

1. Jawetz, Ernest. (2011). Microbiología Médica de Jawets(25). s.I.: Mac Graw-Hill.
2. OMS (2005). Manual de Bioseguridad en Laboratorios, 3era Edición.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

53
 PRÁCTICA Nº 3

Métodos de siembras para aislamientos y cultivos bacterianos

I. Introducción

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos bacterianos

procedentes de los alimentos o muestras clínicas, es sembrarlo en los medios de cultivos
artificiales preparadas en el laboratorio y cultivarlos de acuerdo a sus requerimientos para
favorecer su proliferación. Permitiendo analizar las características de las colonias
bacterianas para llegar a un diagnostico y tratamiento adecuado para restablecer la inocuidad
de los alimentos y la salud animal respectivamente.

II. Objetivo

Aislar y cultivar bacterias procedentes de muestras de alimentos y de muestras clínicas

III. Objetivos específicos

- Sembrar las muestras en medios de cultivos adecuados.

- Cultivar las bacterianas de acuerdo a sus requerimientos

IV. Competencias a desarrollar

- Siembra las muestras en los medios de cultivos.

- Cultiva las bacterias de acuerdo a sus requerimientos.

V. Equipos, Materiales y Reactivos:

Equipos:
- Mechero de bunsen.
- Incubadora bacteriológica.
- Campana anaeróbica de Brewer.
- Jarra de anaerobiosis.
Materiales:
- Torunda de algodón estéril.
- Asa de siembra bacteriológica con el micrón en aro.
- Asa de siembra bacteriológica con el micrón en punta.
54
- Papel de filtro impregnado con azul de metileno.
- Placa anaeróbica de Brewer.
Reactivos:
- Medios de cultivos en placas petris esterilizados.
- Medios de cultivos en tubos de pruebas esterilizados.
- Agar anaeróbico.
- Acido pirogálico al 20% en solución saturada de carbonato de sodio.
- Sobre gas pak.
Muestras para aislamientos: Deben ser colocados en material estéril, en frascos o en bolsas
de plástico de primer uso y transportados en caja de tekno-port y/o nevera con refrigerantes,
podemos considerar:
 Secreciones (Saliva, leche, semen, moco vaginal).
 Excreciones (Orina, heces).
 Fluidos orgánicos: Sangre, suero sanguíneo, líquido cefalorraquídeo
 Exudados (abdominal, toráxico, uterino).
 Animales pequeños enfermos.
 Vísceras afectadas (Intestino, bazo, pulmón, hígado, etc.)
 Agua.
 Alimentos
Muestras para transplantes:
 Colonias bacterianas.
 Caldo bacteriano.
VI. Metodología

6.1 Siembra bacteriológica

A. En medios sólidos en placas petri:

a) Por agotamiento de superficie sólida: Utilizando la técnica de las estrías, que implica
el descargue gradual del inoculo sobre la superficie del medio, al comienzo de las estrías
las células bacterianas crecerán estrechamente apelmazadas formando colonias que se
desarrollan juntas, pero a medida que la extensión continua, cada vez son menos las
células que originarán colonias bien separadas.

55
 Inoculación primaria Estriado en ángulos rectos Estriado en ángulos rectos
crecimiento en colchón
Figura 18. Tipos de siembras bacteriológicas por estrías

b) Por diluciones sucesivas: Se emplea para cuantificar el número de bacterias por ml. o gr.
de muestra; para lo cual se diluye la muestra de 10-1 - 10-7 y de cada dilución se verterá
1 ml. a cada placa petri, luego se adicionara el medio sólido en estado líquido (temperatura
aproximada de 45ºC), durante la incubación las colonias se desarrollan en todo el medio
y no solamente en la superficie.
c) Por diseminación en superficie: Sobre el medio de cultivo contenido en la placa petri,
se deposita una gota de solución de muestra y mediante una espátula de Drigalski, se
entiende el material en toda la superficie. Este método se emplea cuando existe escasa
carga bacteriana o el medio de cultivo es selectivo.

56
B. En medios sólidos en tubos de prueba
a) Por estría: Con el micrón en aro se realiza la siembra en zig zag sobre la superficie del
medio de cultivo, para el procedimiento:
- Con la mano izquierda, se toman los tubos el que contiene la muestra y el que contiene el
medio de cultivo, colocando las bocas a la misma altura, y sosteniéndolo con los dedos
índice, medio y anular, se usa el pulgar para sujetarlos; poniéndolos muy cerca de la base
de los tubos, de manera de dejar a la vista la muestra y el medio de cultivo.
- Con la mano derecha se toma el asa bacteriológica con el micrón en aro y se esteriliza en
forma vertical a la llama, hasta que llegue al rojo.
- Se destapan ambos tubos a la vez, tomando los tapones entre el dedo meñique y el borde
cubital de la mano derecha.
- Se esterilizan las aberturas de los tubos pasándolos por la llama emitida por el mechero
de bunsen.
- Extraer la muestra con el asa bacteriológica y colocarlo en el fondo de la superficie del
medio de cultivo y luego se siembra con movimientos en zigzag.
A. Por picadura: Con el micrón en punta se introduce la muestra dentro del medio de
cultivo, para realizar la técnica:
- Con la mano izquierda, se toman los tubos el que contiene la muestra y el que contiene el
medio de cultivo, colocando las aberturas a la misma altura, y sosteniéndolo con los dedos
índice, medio y anular, se usa el pulgar para sujetarlos; poniéndolos muy cerca de la base
de los tubos de pruebas, de manera de dejar a la vista la muestra y el medio de cultivo.
- Con la mano derecha se toma el asa de siembra bacteriológica con el micrón en punta y
se esteriliza en forma vertical a la llama, hasta que llegue al rojo.
- Se destapan ambos tubos a la vez, tomando los tapones entre el dedo meñique y el borde
cubital de la mano derecha.
- Esterilizar las aberturas de los tubos, pasándolos por la llama emitida por el mechero de
bunsen.
- Extraer la muestra con el asa de siembra bacteriológica y introducirla en el medio de
cultivo sólido, luego retirar el asa previa esterilización, se quema las aberturas de los tubos
y se tapa.
- El desarrollo de los microorganismos se producirá a lo largo de la picadura. Observar la
Figura 19.

57
 Figura 19. Siembra bacteriológica por picadura y estría

C. En medios líquidos en tubos de pruebas

- Con la mano izquierda, se toman los tubos el que contiene la muestra y el que contiene el
medio, colocando las bocas a la misma altura, y sosteniéndolo con los dedos índice, medio
y anular, se usa el pulgar para sujetarlos; poniéndolos muy cerca de la base de los tubos
de pruebas, de manera de dejar a la vista la muestra y el medio de cultivo.
- Con la mano derecha se toma el asa de siembra bacteriológica y se esteriliza en forma
vertical a la llama, hasta que llegue al rojo.
- Se destapan ambos tubos a la vez, tomando los tapones entre el dedo meñique y el borde
cubital de la mano derecha.
- Se esteriliza la boca de los tubos pasándolos ligeramente por la llama emitida por el
mechero de bunsen, luego se introduce el asa bacteriológica en el tubo que contiene la
muestra, se carga este y cuidando de no tocar las paredes, se introduce en el medio de
cultivo, hasta tocar la superficie del líquido; una vez depositada la muestra, se retira el
asa de siembra bacteriológica previa esterilización, se quema suavemente las bocas de los
tubos y se tapa.
- Se mezcla el material sembrado, haciendo girar el tubo entre las palmas de la mano.
- Cuando la muestra se toma de una torunda, este se deja caer en el tubo con medio de
cultivo.
- Si se utiliza pipeta Pasteur o pipetas graduadas, estas se conservarán en tubos metálicos
portapipetas y deben estar esterilizadas. Con la mano izquierda se toma ambos tubos
(muestra y medio de cultivo) y con la mano derecha los tapones y la pipeta, la cual se
introduce y se aspira cierta cantidad de la muestra; para luego depositarla en la serie de

58
 tubos de pruebas con medios de cultivos líquidos. Una vez terminada la operación, las
pipetas utilizadas se depositarán en una probeta con agua formolada al 10 %.

6.2 Cultivo bacteriano

6.2.1 Requerimientos: Para la identificación de las bacterias es necesario favorecer su

crecimiento in vitro mediante la incubación en medios adecuados, los cuales dependen de
los siguientes factores:

a) Comportamiento biológico:
- Intracelular.
- Extracelular.
b) Comportamiento metabólico:
- Fermentadores de hidratos de carbonos.
- No fermentadores de hidratos de carbonos.
c) Presión atmosférica
c.1 Aerobios:
 Obligados Contienen: Superóxido dismutasa y catalasa.
 Facultativos
c.2 Microaerófilos
c.3 Anaerobios
 Obligados
 Aerotolerantes: Contienen peroxidasa.
Metabolismo aerobio:

- La asimilación de glucosa tiene como resultado final la generación de un radical libre de

superóxido (O2-).
- El superóxido es reducido a : O2 + H2O2 por la enzima Superóxido dismutasa.
- Luego el H2O2 es convertido a : H2O + O2 por la enzima catalasa de las bacterias
aerobias obligadas y facultativas, y en caso de bacterias anaerobias aerotolerante por la
enzima peroxidasa.
- Para demostrar de una manera sencilla, el tipo de bacterias de acuerdo a su requerimiento
de oxígeno, podemos realizar el siguiente experimento:
-

59
Uso de tubos de pruebas con agar dextrosa profundo

- El agar fundido y enfriado se mezcla con la muestra y se vierte en tubo de prueba y se

deja que sodifique rápidamente en agua helada.

Lectura:

- Los aeróbicos obligados crecerán solo en la superficie del medio.

- Los anaeróbicos obligados crecerán en la base del tubo de prueba.
- Los microaerófilos crecerán a cierta distancia por debajo de la superficie del medio de
cultivo.
- Los facultativos crecerán en todo el medio de cultivo.

6.2.2 Tipos de incubación:

a) Incubación aeróbica: Las placas y /o los tubos de pruebas con medios de cultivos
sembrados son llevados a incubación en la incubadora bacteriológica, generalmente a
37ºC.

b) Incubación Microaerófila: Se requiere disminuir la concentración del oxígeno de medio

ambiente, para lo cual se puede realizar de las siguientes maneras:

Método Físico.- Mediante la ignición de una vela en un recipiente cerrado

herméticamente. La combustión de la vela cesa cuando se ha consumido parte del oxígeno
libre y el contenido de anhídrido carbónico se aproxima a 7 %.

Método biológico: Sobre unos de los bordes de la superficie del agar de la placa petri
se siembra Klesiella y el resto de la placa se siembra con la muestra, luego sellar
herméticamente la placa. Durante el proceso de incubación la Klesiella consume parte del
oxígeno del medio ambiente de la placa petri, facilitando el crecimiento de las bacterias
microaerófilas de la muestra.

Este tipo de método es muy empleado en el aislamiento de Campylobacter, portado en el

intestino de las aves y es una de los agentes bacterianos de mayor contaminantes de
carcazas de pollos de carne. En humanos, Campylobacter jejuni produce alteraciones
gastrointestinales.

60
c) Incubación anaeróbica: El propósito de este método es la exclusión de oxígeno libre del
ambiente inmediato de las bacterias o el mantenimiento de un bajo potencial de oxido
reducción.

c.1 Uso del ácido Pirogálico (absorbe O2 en presencia de sal alcalina)

- En un recipiente se deposita el acido pirogálico al 20% en una solución saturada de

carbonato de sodio.
- Se coloca las placas petris y/o tubos de pruebas. Sobre una parrilla.
- Se cierra el recipiente con plasticina.

Figura 20. Anaerobiosis por acción del ácido pirogálico

c.2 Uso de agar anaeróbico y placa anaeróbica de Brewer

- El agar anaeróbico contiene agentes reductores del oxígeno:

 Dextrosa
 L – Cistina
 Tioglicolato de sodio
 Formaldehído sulfoxilato sódico
 Además el medio de cultivo contiene azul de metileno que actúa como indicador de
oxido reducción (en aerobiosis el medio es azul y en anaerobiosis se decolora).
- La base de la placa petri es llenada hasta las ¾ partes de su capacidad con agar anaeróbico.
- Se siembra la muestra en la parte central de la superficie del medio dejando un margen
circular de aproximadamente 2,5 cm. de ancho.
- Se sustituye la tapa de la placa petri por la placa anaeróbica de Brewer. El borde circular
interno de la placa debe descansar sobre la superficie del medio de cultivo y debe
delimitar la siembra bacteriológica, en esta área queda una pequeña cantidad de aire y el
oxígeno reacciona con los agentes reductores del medio anaeróbico, creando un ambiente

61
 anaeróbico, lo cual se evidencia por la decoloración del medio de cultivo en tanto que en
la zona marginal aireada permanece azul.

Figura 21. Anaerobiosis por agar anaeróbico y placa anaeróbica de Brewer

c.3 Uso de la Campana anaeróbica de Brewer

- Contiene conexiones externas para el gas propano y corriente eléctrica, posee un

catalizador platinado de paladio en la parte interna de la tapa de cierre hermético.
- Se coloca las placas y/o tubos de pruebas con los medios sembrados y un papel de filtro
impregnado con azul de metileno (indicador de oxido reducción)
- Tapar la campana herméticamente.
- Mediante una bomba de vacío, extraer aire del recipiente durante 1.5 a 2.0 minutos.
- Conectar simultáneamente a corriente de 110 voltios y a una fuente gas propano durante
30 minutos (el gas es fuente de hidrogeno que se combina con el oxigeno residual
formándose agua y anhídrido carbónico, eliminándose el oxigeno libre; Esta reacción es
acelerada por el catalizador de platino calentada por la corriente eléctrica).
- Incubar a 37 ºC.

Figura 22. Anaerobiosis por campana anaeróbica Brewer

62
c.4 Uso de la jarra de anaerobiosis y sistema gas pak

- La jarra de anaerobiosis posee un catalizador de paladio en la parte interna de la tapa de

cierre hermético y el sobre gas pak contiene dos pastillas (una de bicarbonato de sodio y
otra de borohidrato de sodio)
- Colocar las placas y/o tubos de pruebas con los medios sembrados en el recipiente de la
jarra, y un papel de filtro impregnado con azul de metileno.
- Cortar por un extremo del sobre gas pak y añadir 10 ml. aproximadamente de agua
destilada para genera las siguientes reacciones:
 A partir del bicarbonato de sodio se produce anhídrido carbónico y
 Borohidrato de sodio se genera hidrogeno, el mismo que se combina con el oxigeno
del recipiente dando lugar a la formación de agua, creándose un medio anaeróbico la
misma que se evidencia por la decoloración del papel de filtro. La reacción para la
formación de agua es catalizada con el catalizador de paladio.

Figura 23. Anaerobiosis por jarra anaeróbica y sobre gas pak

Temperatura de incubación:
- Psicrófilas (0-20ºC)
- Mesófilas (25-40ºC)
- Termófilas (50ºC a más)
Generalmente la temperatura de incubación es cercana a la temperatura corporal de los
animales y de las bacterias que las afectan (37ºC).

63
VII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

7.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para el cultivo
de bacterias aeróbica, microaerófilas y anaeróbicas estrictas)

7.2. Realizar una relación de bacterias aeróbicas, microaerófilas, anaeróbicas estrictas y

facultativas.

VIII. Resultados
IX. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (7.1., 7.2., VIII y IX) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

X. Referencias bibliográficas
1. Venegas, M. (2015). Guías para el laboratorio de bacteriología. Bogotá: Editorial de la
Universidad de los Andes.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

64
 PRÁCTICA Nº 4

Identificación bacteriana: Coloraciones simples y compuestas

I. Introducción

Las bacterias por el pequeño tamaño y la falta de contraste entre ellas, resultan difíciles de

observar sus características de tamaños y formas a través del microscopio óptico. El medio

más simple de aumentar el contraste, es la utilización de colorantes simples para observar su

tamaño y morfología. Las coloraciones compuestas permiten identificar las características

de la pared celular.

II. Colorante

Es aquella que tiene la propiedad de conferir color a cuerpos de cualquier naturaleza.

2.1. Clases de colorantes
De acuerdo a su origen:
a) Naturales: Colorantes obtenidos a partir de fuentes animales o vegetales.
Ejemplos: Carmín, hematoxilina.
b) Artificiales: Colorantes, mayormente derivado del alquitrán de hulla.
Ejemplos: Cristal violeta, safranina, etc.
De acuerdo a su comportamiento químico:
a) Básicos: Colorantes que en su parte cromógena llevan carga electro positiva, la que
tendría una fuerte afinidad por los grupos electronegativos que normalmente
presentan las bacterias en su protoplasma como los ácidos nucleicos y derivados.
Ejemplos: Fucsina básica, violeta de metilo, cristal violeta, etc.
b) Ácidos: Colorantes que en su parte cromógena llevan cargas electronegativas la que
tendría fuerte afinidad por los grupos electropositivos del de citoplasma celular.
Ejemplos: Anaranjado de metilo, pardo bismark, acido fenico, etc.
c) Neutro: Colorante que resulta de la combinación de los colorantes, ácidos y básicos.
Ejemplos: Giemsa, wright.
2.2. Tipos de coloraciones
a) Coloración simple: Coloraciones en la que se emplea un solo colorante. Para bacterias
generalmente se utilizan colorantes básicos.
Ejemplos: Se puede emplear, cualquiera de los siguientes colorantes:
65
 - Azul de metileno.
- Azul de lactofenol.
- Cristal violeta, etc.
b) Coloraciones compuestas o diferenciales: Coloraciones que emplean más de un
colorante para identificar las características físicas y químicas entre las bacterias la
cual se visualiza al reaccionar de manera distinta a un determinado colorante.
Ejemplos:
- Coloración de Gram.
- Coloración de alcohol acido resistente (Ziehl Neelsen).
- Coloración de vago.
- Coloración wraight, Etc.
- Coloración con Diff Quik.
III. Objetivo

Colorear las bacterias para su identificación a través del microscopio binocular

Objetivos específicos
- Realizar la coloración de Gram.
- Realizar la coloración de Zielh Neelsen.
IV. Competencias a desarrollar
- Observar la morfología de las bacterias.
- Observar el tamaño de las bacterias.
- Observar la disposición de las células bacterianas y Presencia de gránulos
bacterianoss
- Diferencia bacterias Gram positivas de bacterias Gram negativas.
V. Equipos, Materiales y Reactivos

Equipos:

- Mechero de bunsen.
- Microscopio binocular.

Materiales:

- Asa de siembra bacteriológica.

- Lamina porta objeto.
- Bastidor de coloración.

66
- Algodón.

Reactivos:

- Alcohol de 70º.
- Alcohol ácido.
- Agua destilada.
- Muestras naturales (sangre, pus, linfa, leche, orina, tejidos, pelos, raspado de piel; etc.)
- Muestra de cultivos bacterianos.
- Colorantes: Azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina fenicada.
- Mordiente: Lugol (intensifica la coloración).
VI. Metodología.

6.1. Preparación del frotis bacteriano

a) Extensión: Consiste en la formación de una película delgada de la muestra en el
portaobjeto limpio y desengrasado. Si el cultivo es líquido se realiza con el asa de siembra
bacteriológica con el micrón en aro previamente esterilizada. Si el cultivo es sólido,
previamente colocar una gota de agua destilada estéril en el portaobjeto y con el asa de
siembra bacteriológica con el micrón en punta, tomar el inoculo y homogenizar.
b) Fijación: Se logra calentando moderadamente el frotis en el calor emitida por el mechero
de bunsen.
6.2. Coloraciones
6.2.1. Simple (coloración con azul de metileno)
c) Coloración: Se coloca el frotis bacteriano sobre el bastidor de coloración y cubre con
azul de metileno y dejar en reposo durante 3 – 5 minutos.
d) Lavado: El exceso de colorante, se elimina con agua corriente o agua destilada.
e) Secado: De preferencia al medio ambiente, colocando inclinado para el escurrimiento y
con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar el secado con el calor
emitido por el mechero de bunsen, evitando el sobrecalentamiento.
f) Observación: La observación se realizará con objetivo de 100X con aceite de inmersión.
6.2.2. Compuesta
6.2.2.1. Coloración de Gram
c) Coloración: Se coloca el frotis bacteriano sobre el bastidor de coloración y cubre con
cristal violeta y dejar en reposo durante 1 minuto.
d) Lavado: El exceso de colorante, se elimina con agua corriente o agua destilada.

67
e) Mordiente: Adicionar lugol y dejar reposar por 1 minuto. Intensifica la coloración.
f) Lavado: El exceso de colorante, se elimina con agua corriente o agua destilada.
g) Decoloración: Para la decoloración se puede emplear, el alcohol de 70º, alcohol acetona
o alcohol ácido, dejándose actuar hasta que el líquido aparece incoloro.
h) Lavado: Con agua corriente o agua destilada.
i) Recoloración: Para la tinción de estructuras que se decoloran se emplea la safranina y se
deja en reposo durante 1 minuto.
j) Lavado final: Con agua corriente o con agua destilada.
k) Secado: De preferencia al medio ambiente, colocando inclinado para el escurrimiento y
con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar el secado con el calor
emitido por el mechero de bunsen, evitando sobrecalentamiento.
l) Observación: La observación se realizará con objetivo de 100 X con aceite de inmersión.

Tabla 5. Proceso de coloración de Gram

Secuencia Reacción y apariencia de las bacterias
Gram positivas Gram negativas
Cristal violeta Las bacterias se tiñen en violeta Las bacterias se tiñen en violeta
Lugol Complejo CV – I se forma en el interior CV – I colorea la bacteria de
de la bacterias y se colorea de violeta. color violeta.
Alcohol Pared celular se deshidrata, retracción Extracción de lípidos de pared,
acetona de poros, menor permeabilidad, CV – I mayor porosidad, CV-I, sale y
no sale y la bacteria permanece violeta. la bacteria queda decolorada.
Safranina Las bacterias no requieren Las bacterias se recoloran y se
recolorearse, permanecen violetas. tiñen de color rosado.

Figura 24. Coloración de Gram

68
6.2.2.2. Coloración de ácido resistente o de Zielh Neelsen
c) Coloración: Colocar el frotis fijado de esputo o cultivo bacteriano sobre un bastidor de
coloración y cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar la lámina en forma suave hasta
que desprenda vapores durante 5 minutos, no dejar que se seque el colorante, si es
necesario añadir más colorante.
d) Lavado: Con agua corriente o agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
e) Decolorar: con alcohol acido.
f) Lavado: con agua corriente o agua destilada.
g) Recoloración: Adicionar sobre el frotis, azul de metileno y dejar actuar durante 1 minuto.
h) Lavado: con agua corriente o agua destilada.
i) Secado: al medio ambiente, al calor suave emitido por el mechero de bunsen o con papel
filtro.
j) Observación: en el microscopio con objetivo inmersión y aceite de inmersión.

Figura 25. Coloración de Ziehl Neelsen y bacilos de Mycobacterium tuberculosis

69
VII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

7.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para diferenciar
las paredes de las bacterias Gram negativas, Gram positivas y Alcohol acido resistente)

7.2. Realizar una relación de bacterias Gram negativas, Gram positivas y Alcohol acido
resistente.

VIII. Resultados
IX. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (7.1., 7.2., VIII y IX) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

X. Referencias bibliográficas
1. Venegas, M. (2015). Guías para el laboratorio de bacteriología. Bogotá: Editorial de la
Universidad de los Andes.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

70
 PRÁCTICA Nº 5

Identificación bacteriana: Coloraciones especiales

I. Introducción

Algunas bacterias cuantas con estructuras especiales que favorecen su desplazamiento,

resistencia a la fagocitosis y condiciones adversas del medio ambiente como los flagelos,

capsula y esporas respectivamente. Para sus identificaciones se requieren de coloraciones

especiales.

II. Objetivo
Colorear estructuras de las bacterias para su identificación a través del microscopio
binocular.

Objetivos específicos
- Demostrar la presencia de flagelos mediante coloración de Leifson.
- Identificar la capsula bacteriana a través de la coloración con tinta china.
- Demostrar las esporas bacterianas coloreadas con verde de malaquita.
III. Competencias a desarrollar
- Realiza la coloración Leifson y observa los flagelos a través del microscopio.
- Colorea las bacterias con tinta china y observa las capsulas bacterianas.
- Emplea el verde de malaquita para colorear las esporas bacterias y las observa a través
del microscopio.
IV. Equipos, Materiales y Reactivos
Equipos:

- Mechero de bunsen.
- Microscopio binocular.
Materiales:

- Asa de siembra bacteriológica.

- Lamina porta objeto.
- Bastidor de coloración.
- Algodón.
- Portaobjetos excavado.
- Portaobjetos normal perfectamente limpio en mezcla crómica y desengrasado
71
- Cubreobjetos perfectamente limpio y desengrasado.
- Pipetas Pasteur estéril.
- Gradilla.
- Lápiz graso.
- Encendedor.
- Aplicadores.
- Vaselina.
- Papel absorbente.
- Aceite de inmersión.
Reactivos:

- Suspensión bacteriana.
- Solución salina o agua destilada estéril.
- Colorante de Leifson.
- Mezcla crómica.
- Tinta china.
- Colorante verde de malaquita.
V. Metodología.
5.1. Identificación de flagelos bacterianos
5.1.1. Observación al fresco en gota pendiente
- Limpiar los cubreobjetos frotándolos cuidadosamente entre los dedos con agua y jabón y
enjuagándolos en agua caliente. Luego sumergirlos en alcohol y secarlos con un trapo
limpio sin pelusa. Finalmente, calentarlo suavemente a la flama para retirar los residuos
grasos.
- Depositar en condiciones asépticas tres o cuatro asadas de la suspensión bacteriana en el
centro del cubreobjetos limpio y libre de grasa. También se puede usar una pipeta Pasteur
estéril, procurando que la gota quede lo suficientemente grande para facilitar la
observación.
- Cuando se trata de un cultivo sólido, colocar una gota de solución salina ó agua destilada
estéril en el centro del cubreobjetos limpio y emulsionar una pequeña cantidad del cultivo

72
 bacteriano. Se puede hacer una pequeña marca cerca de la gota en el cubreobjetos para
facilitar la observación.
- Poner un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjeto utilizando un
aplicador.
- Invertir y colocar el portaobjetos sobre el cubreobjetos que contiene la gota de la
suspensión bacteriana cuidando que quede bien centrado para que la excavación quede
directamente encima de la gota. La gota no debe tocar el portaobjeto.
- Presionar suavemente para que se adhieran perfectamente el cubre y portaobjeto.
- Invertir rápidamente. La gota que contiene el material a examinar pende del cubreobjeto
sobre la excavación del portaobjetos.

Figura 26. Preparación de una muestra de Gota Pendiente

73
- Observar al microscopio con el objetivo seco débil y enseguida con el seco fuerte.
- Al localizar la marca hecha en el cubreobjetos, el borde de la gota se encontrará
fácilmente.
- Determinar si hay movilidad real de desplazamiento de las células de un lado a otro dentro
del campo microscópico, ó movimiento browniano.
- Si se desea observar células individuales, colocar una gota de aceite de inmersión sobre
el cubreobjetos y observar con objetivo de inmersión.

Figura 27. Diferente numero y disposición de flagelos bacterianos

5.1.2. Tinción de flagelos
Los flagelos bacterianos, debido a su diámetro tan delgado, no puede ser observados a
microscopía de luz. Con la coloración se puede observar; empleando cristal violeta en
solución alcohólica como colorante primario. Durante el proceso de coloración, la solución
alcohólica se evapora y deja un precipitado alrededor del flagelo, incrementando su tamaño
aparente para el ojo humano. El colorante de flagelo también tiene ácido tánico y fosfato
potásico de aluminio como mordientes, y fenol como agente antifúngico.
Procedimiento:
- Limpiar y desengrasar una lámina porta objeto sumergiéndola en mezcla crómica durante
24 horas, luego lavar con agua destilada, enjuagar con alcohol y secar con un trozo de
tela limpio. Pasarlo varias veces a través de la flama del mechero de bunsen para eliminar
los residuos de grasa.
- Hacer un círculo en un portaobjeto.
- Colocar dentro del círculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensión bacteriana e
inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.

74
- Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se hace usando la flama del mechero
se pueden destruir los flagelos.
- Humedecer la preparación con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura
ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo frío.
- Lavar suavemente con agua corriente.
- Colocar la lamina en posición vertical para que drene el agua y el frotis se seque.
- Observar con objetivo de inmersión.
Interpretación:
- Los flagelos se tiñen bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos
extremadamente delicados.

Figura 28. Flagelos.

5.2. Coloración con tinta china para identificar de la capsula bacteriana

- Mediante el asa de siembra colocar una asada de la suspensión bacteriana en una lámina
porta objeto.
- Añadir una gota de tinta china y homogenizar.
- Cubrir con laminilla cubreobjeto.
- Observar al microscopio con lente de inmersión reduciendo la luz bajando el
condensador. La cápsula se presenta como halos claros sobre un fondo oscuro.

75
 Figura 29 Coloración con tinta china y presencia de capsula alrededor de la bacteria

5.3. Coloración de esporas por el Método de Wirtz

- Cubrir el frotis bacteriano con verde de malaquita y calentar a través de la llama emitida
por en mechero de bunsen por 2 a 3 minutos (evitar la ebullición).
- Lavar con agua corriente o agua destilada.
- Añadir fucsina o safranina por 30 segundos.
- Lavar con agua corriente o con agua destilada.
- Observar con objetivo de inmersión. Se observará las esporas de color verde brillante y el
resto de color rosado.

Figura 30. Coloración de esporas por el Método de Wirtz y ubicación de las esporas

76
 VI. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

6.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual indicando las
estructuras esenciales y no esenciales para la reproducción de las bacterias)

6.2. Realizar una relación de bacterias que poseen flagelos, capsulas y esporas.

VII. Resultados
VIII. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (6.1., 6.2., VII y VIII) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

IX. Referencias bibliográficas

1. Venegas, M. (2015). Guías para el laboratorio de bacteriología. Bogotá: Editorial de la
Universidad de los Andes.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

77
 PRÁCTICA Nº 6

Identificación de cocos Gram positivos: Pruebas bioquímicas

I. Introducción

La identificación taxonómica clásica de las bacterias se basa en sus características culturales,

morfológicas, tintoriales, fisiológicas y bioquímicas. Para las pruebas bioquímicas, la
bacteria se cultiva en medios nutritivos específicos y su presencia se detecta mediante
reactivos específicos generados, facilitando su identificación.

II. Objetivo

2.1. Objetivo general

Identificaciones de cocos Gram positivos mediante pruebas bioquímicas

2.2. Objetivos específicos

- Identificar Staphylococcus.
- Identificar Streptococcus.
- Identificar Enterococcus.
III. Competencias a desarrollar
- Identifican las reacciones bioquímicas generados por las bacterias.
- Diferencia cocos gran positivos.
IV. Equipos, Materiales y Reactivos

Equipos:

- Incubadora bacteriológica.
- Microonda.
- Mechero de bunsen.

Materiales:

- Asa de siembra bacteriológica.

Reactivos:

- Peróxido de hidrogeno.
- Plasma liofilizado de conejo.
- Agar Baird Parker.

78
- Agar sangre.
- Agar manitol salado.
- Cristal violeta.
- Lugol.
- Alcohol de 70º.
- Safranina.
V. Metodología (Identificación cocos gram positivos (Staphylococcus, Streptococcus
y Enterococcus)

5.1. Características generales:

- La diferencia entre estafilococo, estreptococo o enterococo se realiza en base a la

morfología de la colonia, tipo de hemólisis, forma de las bacterias por coloración gram a
partir de un cultivo y de la prueba de reacción de la catalasa.
- Las colonias de estafilococos son comúnmente grandes (2 – 3 mm a las 24 horas),
convexas, lisas, enteras, opacas y con frecuencia pigmentadas, a diferencia de las colonias
de estreptococos y enterococos que son más pequeñas (menos de 2 mm de diámetro),
puntiformes, con aspecto translúcido a semiopaco.
- Los estafilococos pueden ser fuertemente β hemolíticos en agar sangre de carnero, pero
las zonas de hemólisis son menores en relación al tamaño de las colonias que las
generadas por los enterococos y estreptococos hemolíticos.
- Los estafilococos se agrupan generalmente en racimos, a diferencia de los estreptococos
y enterococos que se reúnen en pares o cadenas.

5.2. Identificación de Staphylococcus

Lectura de cultivos en agar sangre de carnero y agar Columbia (CNA) – sangre

a) Morfología de las colonias

- Las colonias de la mayoría de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden
aproximadamente de 1 a 3 mm de diámetro a las 24 horas y de 34 – 37 ºC respectivamente.
A los tres días las colonias pueden medir de 3 – 8 mm dependiendo de las especies.
- Las colonias de S. aureus normalmente son grandes. Son de borde entero, de superficie
lisa, la mayoría presentan un pigmento desde amarillo crema hasta naranja.
- Las colonias de S. epidermidis son algo más pequeñas dependiendo de las cepas,
usualmente no se detecta pigmentos. S. saprophyticus son más grandes que S.

79
 epidermidis, son lustrosas y más convexas que otras colonias de estafilococos. Un 50 %
de las cepas son pigmentadas.

b) Coloración Gram

- Si se observan cocos gram positivos en racimos, realizar la prueba de la catalasa.

c) Prueba de la catalasa (descompone el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno)

- Con el asa de siembra, recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocarla
sobre un portaobjetos limpio.
- Agregar una gota de H2O2 al 3 % usando un gotero o una pipeta Pasteur.
- No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2.
- Observar una inmediata efervescencia (formación de burbujas) que indica una prueba
positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
- Desechar el portaobjeto colocándolo en un recipiente con desinfectante.
- Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles:
 Control positivo: S. aureus.
 Control negativo: Streptococcus spp.
- No invertir el orden del método porque puede producir resultados falsos positivos.

Nota: solo coger la colonia con el asa de siembra y no de un medio con agar sangre debido
a que la catalasa presente en los eritrocitos puede dar resultados falsos positivos.

Si son catalasas positivas realizar la prueba de la coagulasa.

d) Prueba de la coagulasa

Formas de coagulasas

- Ligada o factor de aglutinación unida a la pared celular de la bacteria. Se detecta en

Prueba en porta objetos y Prueba en tubos.
- Libre, es extracelular producida en caldo de cultivo. Se detecta en Prueba en tubos.

Tipos de pruebas para detecta coagulasa

- Prueba en lámina (detecta factor de aglutinación o coagulasa ligada), es usada como

técnica de tamizaje rápida para la identificación de S. aureus. Todas las pruebas negativas
o retardados (más de 20 segundos) deben repetirse mediante la técnica en tubo.
- Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada), es definitiva.

80
Reactivo para detectar coagulasa

- Se utiliza el plasma liofilizado de conejo (se reconstituye de acuerdo a las indicaciones

del fabricante), la cual actúa sobre un constituyente del plasma (factor reactivo de la
coagulasa) para producir una sustancia parecida a la trombina que activa el fibrinógeno
para que forme fibrina, aumentando la velocidad de coagulación del plasma. El resultado
final: formación de coágulo de fibrina.
- Nota: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido cuidadosamente
probado de no contener algún agente infeccioso, capacidad de coagulación e inhibidores.

Controles:

- Positivo: S. aureus.
- Negativo: S. epidermidis o S. saprophyticus.

Procedimiento (Prueba en lámina):

- Preparar una suspensión densa de la colonia en agua destilada o solución fisiológica

mezclando bien para homogeneizar.
- Si hubiera autoaglutinación, no continuar y realizar la prueba en tubo.
- Agregar una gota de plasma y mezclar con movimientos circulares.
- Observar la formación de aglutinación o precipitado dentro de 20 segundos.
- Todas las pruebas negativas y positivas retardadas (20 a 60 segundos) deben confirmarse
con la prueba en tubo.
- Nota: Es una prueba bastante rápida y económica, pero si hubiese de 10 a 15 % de S.
aureus puede dar un resultado negativo, por ello, todos los resultados negativos deben
repetirse utilizando la técnica en tubo.

Procedimiento (Prueba en tubo):

- Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de plasma reconstituido
(en un tubo de vidrio estéril de 13 x 100).
- Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar.
- Incubar la mezcla a 35 – 37 °C (en baño maría de preferencia) por 4 horas; observar si
hay formación de coágulo inclinando lentamente el tubo.
- Observar cuidadosamente si hay formación de coágulo inclinando lentamente el tubo (sin
agitar) en intervalos de hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulación es una prueba
positiva.

81
- La mayoría de los S. aureus formarán coágulo en una hora.
- Si es negativa a las 4 horas, seguir incubando hasta el día siguiente a temperatura
ambiente. Esto es recomendado porque un pequeño número de cepas de S. aureus puede
requerir más de cuatro horas para la formación del coágulo. Considerar que
Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el coágulo.
- Realizar el control de calidad del reactivo utilizando las pruebas de resistencia a la
polimixina B y novobiocina (disco de 5μg) para tener una identificación presuntiva. S.
saprophyticus es resistente a la novobiocina y S. epidermidis es resistente a la polimixina
B.
- Nota: Es preferible utilizar baño maría para esta prueba (Figura 6).
e) Prueba de Manitol en (agar manitol salado, creado por Chapman)
- El agar manitol salado está compuesto por extractos y peptonas de carne bovina, tripteína,
manitol, cloruro de sodio, rojo de fenol y agar.
- Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de cocos Gram positivos
patógenos, especialmente Staphylococcus aureus. Sin embargo, también es útil para aislar
Staphylococus epidermidis, que en ocasiones puede estar presente como patógeno
oportunista, y Staphylococcus saprophyticus, reconocido patógeno urinario, entre otras
especies.Algunos Enterococcus son capaces de crecer en este medio, así como también
ciertos bacilos Gram positivos formadores de esporas.
- Este medio es de gran utilidad en el análisis de muestras clínicas, pero también se usa en
el estudio microbiológico de alimentos y en el control de calidad de productos
industriales, como cosméticos, medicinas, entre otros.

Fundamento:

- El agar manitol es selectivo gracias a la alta concentración de sal que posee. La salinidad
actúa como sustancia inhibitoria y evita el crecimiento de bacterias Gram negativas.
También es diferencial debido a la presencia del carbohidrato manitol y al indicador de
pH rojo de fenol. A partir de este, las bacterias capaces de fermentar el manitol producen
ácidos, acidificando el medio, tornándose las colonias y el medio de color amarillo. Por
otra parte, las colonias que no fermentan el manitol crecen en el medio tomando los
nutrientes que les proporciona los extractos y peptonas de carne y la tripteína. De allí las
bacterias extraen el carbono, el nitrógeno, las vitaminas y los minerales necesarios para
su crecimiento. Las colonias en este caso pueden ser rosadas débil o fuertes, y el medio
se queda del mismo color o cambia a fucsia.

82
Uso:

- Por su alta selectividad, es ideal para sembrar muestras con flora mixta en la que se quiere
buscar la presencia de S. aureus, como principal patógeno de este género.
- Análisis de muestras de exudados faríngeos y secreción nasal, especialmente para detectar
portadores asintomáticos de S. aureus.
- Algunos países han implementado este análisis como requisito obligatorio para personas
que desean trabajar como expendedores de alimentos. Este control previene que se
contraten personas portadoras de S. aureus, evitándose así que haya intoxicaciones
alimentarias masivas, debido al consumo de alimentos contaminados con la enterotoxina
estafilocócica.
- Para siembra de infecciones ( heridas), hemocultivos, LCR, lavado bronco alveolar y otro
- Para reaislar colonias de urocultivos provenientes de agar CLED o agar sangre cuyo Gram
haya revelado cocos Gram positivos en racimos.
- Análisis microbiológico de alimentos, agua potable, suelos, entre otras aplicaciones.

Control de calidad:

- Una vez preparado un lote de placas con agar manitol salado se realiza su control de
calidad. Se siembran cepas controles para evidenciar si hay o no crecimiento.
- Como control positivo se pueden usar cepas conocidas de S. aureus. El mismo debe crecer
satisfactoriamente desarrollando colonias amarillas, y el medio también se torna del
mismo color. Así mismo, es conveniente incluir una cepa conocida de S. epidermidis.
Debe crecer satisfactoriamente desarrollando colonias de color rosadas, y el medio se
queda del mismo color o se oscurece en un rosado más fuerte.
- Como control negativo, se utilizan cepas que no deberían crecer en este medio. Por
ejemplo, se puede sembrar una cepa conocida de Escherichia coli o Klebsiella
pneumoniae. El resultado esperado es inhibición completa, es decir, no crecimiento.
- Incubar una placa sin inocular. No debe haber crecimiento, ni cambio de color.
- Es importante que no se use la placa si se tienen indicios de deterioro, como
contaminación, deshidratación, decoloración, entre otros.

Consideraciones finales:

- Obtener un crecimiento de colonias amarillas no indica que sea S. aureus. Hay que
recordar que algunas cepas de Enterococcus son capaces de crecer en este medio y
fermentar el manitol, así como ciertos bacilos Gram positivos formadores de esporas.

83
- Por tanto, es importante realizar un Gram a la colonia y una prueba de catalasa.
- Por otra parte, hay que considerar que otras especies de Staphylococcus diferentes al S.
aureus también son capaces de fermentar el manitol. Por tanto, es importante sub cultivar
la colonia a un caldo nutriente para tomar de allí y realizar la prueba de la coagulasa.
- Entre las especies de Staphylococcus de importancia clínica para el hombre que fermentan
el manitol están: S. aureus, S. simulans, S. capitis ssp capitis, S. capitis ssp urealyticus,
S. xylosus, S. cohnii ssp urealyticum, entre otros.
- Otras pueden dar reacción variable, es decir, algunas veces positivas y otras negativas.
Algunas son S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. warneri, S. intermedius, entre otras.
- No se recomienda tomar colonias de forma directa del agar manitol para realizar la prueba
de la coagulasa, ya que la alta concentración de sal del medio puede interferir en el
resultado.
- Finalmente se recomienda incubar las placas sembradas de manitol salado hasta durante
48 horas, debido a que algunas cepas de S. aureus pueden fermentar lentamente el
manitol, aunque esto no es muy frecuente.

Figura 31. A: Matraz con medio agar manitol salado. B: Placa de agar manitol salado
sembrados con cepas bacterianas fermentadoras y no fermentadoras de manitol.

84
 Tabla 6. Principales características fenotípicas de las especies de Staphylococus
comúnmente aisladas en infecciones

+: 90 % o mas especies, o cepas positivas o Zona amplia de hemolisis dentro de 24 – 36 horas. -:

90 % o mas especies, o cepas negativas o No hay hemolisis o hay una zona muy angosta (< 1 mm)
dentro de las 72 horas. Algunas cepas pueden producir ligero color verdoso o marron en agar sangre
de carnero. d: 11 – 89 % de especies o cepas positivas. (+): Reacción retardada o Hemolisis
retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 – 72 horas. (d): No hay hemolisis o es
retardada. (*): En agar sangre de carnero.

Fuente: Kloos W, Bannerman T. (1999)

VI. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

6.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para identificar
los cocos Gram positivos)

6.2. Realizar la diferenciación de los cocos Gram positivos

VII. Resultados
VIII. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (6.1., 6.2, VII y VIII) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

85
IX. Referencias bibliográficas
1. Kloos W, Bannerman T. (1999). Staphylococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,
Tenover FC. Yolken RHA. Manual of Clinical Microbiology. 7ª ed. Washington DC:
American Society for Microbiology: 264 – 282.
2. Laboratorios Britania. Manitol salado agar. 2015. Disponible en: britanialab.com «Agar
manitol salado». Wikipedia, La enciclopedia libre. 31 oct 2018, 19:08 UTC. 17 ene 2019,
20:55, disponible en: es.wikipedia.org.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana S.A.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Argentina. Editorial Panamericana S.A
5. Laboratorios BD. BD Mannitol Salt Agar. 2013. Disponible en: bd.com.

86
 PRÁCTICA Nº 7

Identificación de Enterobacterias fermentadoras: Pruebas bioquímicas

I. Introducción
La identificación taxonómica clásica de las bacterias se basa en sus características culturales,
morfológicas, tintoriales, fisiológicas y bioquímicas. Para las pruebas bioquímicas, la
bacteria se cultiva en medios nutritivos específicos y su presencia se detecta mediante
reactivos específicos generados, facilitando su identificación.

II. Objetivo
2.1. Objetivo general

Identificación de Enterobacterias fermentadores mediante pruebas bioquímicas

2.2. Objetivos específicos

- Identificar Eschericja coli.

- Identificar klebsiella.
- Identificar Enterobacter.
III. Competencias a desarrollar
- Identifican las reacciones bioquímicas generados por las bacterias.
- Diferencian Enterobacterias fermentadoras.
IV. Equipos, Materiales y Reactivos
Equipos:

- Incubadora bacteriológica.
- Microonda.
- Mechero de bunsen.
Materiales:

- Asa de siembra bacteriológica.

Reactivos:

- Agar Mac Conkey.

- Medio MIO.
- Agar citrato
- Agar hierro triple azúcar (TSI).
- Agar lisina hierro (LIA).

87
- Medio RM/VP.
- Reactivo de Kovac.
- Alfa naftol al 5 %.
- Hidróxido de potasio (KOH) al 40 %.
- Agar o caldo urea.
V. Metodología (Identificación de enterobacterias fermentadores: Escherichia coli,
Klebsiella y Enterobacter)
5.1. Características generales

Las bacterias Gram negativas fermentadoras se desarrollan en agar sangre de carnero y agar
Mc Conkey, pero en agar sangre de carnero no podemos hacer mayor diferenciación entre
las colonias, sin embargo, en el agar Mc Conkey podemos diferenciar las colonias lactosa
positivas y lactosa negativas.

5.2. Lectura de cultivo en agar Mac Conkey

- Escherichia coli: lactosa positiva forma colonias de borde entero, de color fucsia, opacas,
de 2 mm – 3 mm de diámetro, usualmente rodeadas de una zona opaca alrededor de la
colonia (bilis precipitada). Las cepas de E. coli que son lactosa negativa dan colonias
incoloras de 3 – 4 mm.
- Klebsiella pneumoniae: lactosa positiva forma colonias de borde entero, de color rosado
a rosado oscuro, de 3 – 4 mm de diámetro y aspecto mucoide.
- Enterobacter spp: lactosa positiva forma colonias de borde entero, de color rosado de 2 –
4 mm de diámetro, no tan mucoides como K. pneumoniae.

Las colonias con estas características son subcultivadas en medios diferenciales.

5.3. Pruebas bioquímicas

- Utilización de lactosa.
- Utilización de glucosa.
- Producción de gas de glucosa.
- Descarboxilación de lisina.
- Producción de ácido sulfhídrico.
- Utilización de citrato.
- Producción de ureasa.
- Prueba de Metilo (RM)

88
- Prueba de Voges Proskauer (VP).
- Motilidad.
- Producción de indol.
- Prueba de O – nitrofenil – b – galactopiranosido (ONPG).

5.4. Siembra en medios diferenciales

- Las colonias de E. coli y Klebsiella sp. en TSA, se siembran por estría (citrato); por
picadura y estría (agar hierro triple azucar “TSI” y agar lisina hierro “LIA”); por picadura
(medio MIO) y se inoculó (medio Clark y Lubs) para rojo de metilo (MR) y voges
proskauer (VP).
- Se incuba de 35 – 37 °C durante 18 a 72 horas.

5.5. Lectura en el Agar hierro triple azúcar (TSI)

- La lectura, se realiza entre las 18 – 24 horas para no obtener resultados erróneos.

- En estos medios se determina la capacidad de la bacteria de utilizar la lactosa, glucosa y
sacarosa, con producción o no de gas y la producción de ácido sulfhídrico.
- La lectura se hace en base de tres características: Utilización de hidratos de carbono,
producción de gas y producción de ácido sulfhídrico (H2S).
a) Utilización de hidrato de carbono
- Uso de lactosa: Reacción ácida en el pico de flauta (color amarillo) Abreviatura: (A).
- Uso de glucosa: Reacción ácida en la columna del medio (color amarillo): (A).
- No uso del carbohidrato: Se observa una reacción alcalina (color rojo): (K) o que no hay
cambio de color (permanece del mismo color que el medio no inoculado): (N).

Nota: Cuando la bacteria también produce H2S el precipitado negro puede ocultar la acidez.

b) Producción de gas de glucosa

- Positivo: Presencia de una sola burbuja de gas, burbujas en el medio, división del medio,
desplazamiento completo del medio del fondo del tubo dejando un área clara o una ligera
muesca del medio en el costado del tubo.

– Se registra la lectura por medio de cruces (+).

c) Producción de ácido sulfhídrico (H2S)

- Se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio de cultivo o
sólo en la parte superior.

89
- Se registra la lectura por medio de cruces (+).

Resultados probables:

- K/A – +: alcalinidad en la inclinación y acidez en el fondo (fermentación de glucosa), gas

negativo y H2S positivo.
- N/N – –: no hay utilización de la lactosa y glucosa ni producción de H2S.

Controles Superficie Columna vertical Símbolos

inclinada (fondo)
E. coli lactosa positiva amarillo amarillo/gas A/A + –

Klebsiela pneumoniae amarillo amarillo/gas A/A + –

Shigella rojo amarillo/no gas K/A – –

Salmonella paratyphi B rojo amarillo/gas/negro K/A + +

Recomendaciones: si se observa que no hay cambio de color en el tubo hasta las 48 horas
y hay desarrollo bacteriano, se trata de una bacteria no fermentadora (Figura 14).

5.6. Lectura en el Agar lisina hierro (LIA)

- La lectura, se realiza entre las 18 – 24 horas; si la lectura se realiza antes podemos obtener
resultados falsos positivos, así como falsos negativos si se lee después de las 24 horas.
- En este medio se determina simultáneamente la producción de lisina descarboxilasa y la
formación de ácido sulfhídrico.
- La lectura se realiza en la columna y en la superficie inclinada y se observa la formación
de ácido sulfhídrico el cual se evidencia por una coloración negra.

Nota: Generalmente las cepas del grupo Proteus y Providencia, desaminan la lisina a ácido
α–cetocarbónico. Este último forma compuestos pardo – rojizos en la región superficial del
medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno.

Recomendaciones: No incubar más del tiempo necesario para no ocasionar una

alcalinización en la superficie del medio y por lo tanto producir un viraje hacia el violeta.

90
Controles Columna vertical (fondo) Superficial inclinada

E. coli amarillo violeta

Klebsiella pneumoniae amarillo violeta

Proteus mirabilis amarillo y negro rojo parduzco

Morganella morganii amarillo rojo parduzco violeta

5.7. Lectura en el Agar Citrato

- Se emplea para determinar si una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente
de carbono para su metabolismo.
- La lectura, se realiza de 24 horas – 48 horas. En algunos casos es necesario una incubación
hasta por 4 días. Resultado positivo (crecimiento con un color azul intenso en el pico de
flauta, o presencia de colonias en ausencia del color azul) y resultado negativo (sin
crecimiento en la superficie del medio ni cambio de verde a azul).

Controles Resultados

E. coli Negativo

K. pneumoniae Positivo

K. oxytoca Positivo

Enterobacter cloacae Positivo

5.8. Lectura en la Hidrólisis de la urea (producción de ureasa)

- Es útil para determinar la capacidad de un organismo de degradar la urea, formando dos
moléculas de amoniaco por acción de la ureasa.
- La lectura se realiza después de 18 horas – 24 horas de incubación observando el viraje
de color.

Resultados:

 Prueba positiva: Color rosado intenso en el pico de flauta o todo el agar. Puede haber una
reacción positiva retardada después de 24 horas y hasta 6 días de incubación (algunas
cepas de Klebsiella por ejemplo).

91
 Prueba negativa: No se produce cambio de color.

Controles:

 Negativo: Escherichia coli

 Positivo: Klebsiella pneumoniae

5.9. Lectura del Rojo de Metilo (RM)/Voges Proskauer (VP)

Para la lectura es necesario el conocimiento del destino del piruvato después de la
fermentación.

Fermentación acido mixta

Enterobacteriaceae

Fermentación butanodiólica
Klebsieella, Enterobacter,
serratia, Hafnia
Fig. 32. Destino del piruvato formado durante la fermentación anaeróbica

5.9.1. Lectura del RM (ácido dimetilamino – 4 – fenilazo – 2 benzoico: C15H15N3O2)

a) Rojo de metilo:
- No es tóxico para el humano, a diferencia de otros indicadores y colorantes que se
encuentran en el mercado.
- Cambia su estructura cuando acepta protones o cuando cede protones. Ese cambio
estructural hace que varíe de color. Esta es una característica común con otros indicadores

92
 de pH. Sin embargo, a diferencia de otros, este presenta la propiedad de detectar ácidos a
pH mucho más bajos. Por tanto, detecta ácidos fuertes.
b) Preparación:
- Pesar 0,1 gramos de rojo de metilo y se disuelve en 1 500 ml de metanol.
- Se pesa 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etílico de 95°. Posteriormente, se
agregan 200 ml de agua destilada a la preparación anterior.
- Se recomienda que la solución preparada sea guardada en nevera, y si es posible en
alícuotas a – 20 °C, mejor. En esta forma es estable hasta durante un mes.
c) Utilización:
- El rojo de metilo funciona como indicador de pH. Su uso principal es revelar reacciones
de fermentación bacteriana de carbohidratos.
- El rojo de metilo es por sí solo ácido, y de color rojo. Detecta cambios de pH del medio:
 pH 4.2, se mantiene de color rojo.
 pH intermedio, cambia a diversas tonalidades de anaranjado.
 pH > 6.3, es de color amarillo.
d) Lectura:
- El cultivo bacteriano se siembra en el medio líquido de Clark y Lubs modificado “Rojo
de Metilo/Voges proskauer” (RM/VP), que posee elementos nutritivos (polipeptonas), un
sistema amortiguador de pH y una carga de glucosa.
- Después de ser incubado a 35 – 37 °C de 48 a 72 horas, se le añade 3 gotas del reactivo
rojo de metilo.
- El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la bacteria
fermenta el carbohidrato con la producción de ácidos mixtos que acidifica el medio y baja
el pH a 4,4 y es una prueba positiva. Un color naranja (pH 5 a 5,8) indica una prueba
negativa.

Controles: Positivo: E. coli y Negativa: Klebsiella pneumoniae.

Figura 33. Indicador rojo de metilo a pH acido y pH alcalino

93
5.9.2. Lectura del VP
- La prueba se realiza en el medio de cultivo líquido RM/VP que es una modificación del
medio Clark y Lubs, el cual originalmente contenía menor concentración de peptonas y
glucosa. Por tanto, se producía menos cantidad del ion hidrógeno, requerido para la
reacción positiva de Voges – Proskauer. Está compuesto por polipeptona tamponada,
glucosa, fosfato dipotásico y agua destilada.
Fundamento:
- Pluripeptonas del medio proporcionan los requerimientos nutricionales indispensables
para el crecimiento bacteriano. Por su parte, la glucosa es el compuesto principal. Muchas
bacterias tienen la capacidad de metabolizar la glucosa y formar ácido pirúvico.
- El ácido pirúvico es un punto medio en el metabolismo de la glucosa y a partir de allí
cada microorganismo puede tomar diferentes vías. Algunos formarán ácidos mixtos, tales
como ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico y ácido succínico, y otros forman
productos neutros como el 2,3 – butanediol.
- Bacterias con capacidad de utilizar la glucosa por la vía butilén – glicólica, forman un
producto final neutro denominado acetoína, en presencia de oxígeno y de un pH alcalino.
- El test Voges – Proskauer revela la capacidad de la bacteria de formar acetil metil carbinol
(acetoína), producto intermediario del 2,3 – butanediol en condiciones de aerobiosis.
- La acetoína se reduce y forma 2,3 – butanediol, pero esta reacción es reversible, por tanto
si el 2,3 – butanediol se oxida se forma acetoína. Por ello, el oxígeno es indispensable. El
fosfato dipotásico es el buffer que amortigua la mezcla a un pH 6,9 ± 0,2.
Reactivos de Barrit:
- Medio RM/VP, se prepara con 17 gr del medio y se disuelve en un litro de agua destilada.
Dejar reposar por 5 minutos. Calentar hasta ebullición para disolver completamente.
Servir 3 a 4 ml en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. El pH final
del medio es de 6,9 ± 0,2.
- Voges A, se obtiene pesando 5 grs de α – naftol y se disuele en 50 ml de alcohol etilico
(absoluto) y luego completar hasta 100 ml obteniéndose una solución al 5 % de α – naftol.
- Voges B, se pesa 40 grs de hidróxido de potasio (KOH) y se disuelve con 50 ml de agua
destilada en un beaker y se coloca en baño de agua fría y se trasvasa a un balón aforado
y se completa hasta 100 ml obteniéndose un preparado de KOH al 40 %.
Procedimiento:
- A partir de un cultivo bacteriano puro de 18 a 24 horas de incubación inocular en caldo
RM/VP, el inóculo no debe ser muy denso. Se incuba a 35 – 37 °C por 24 a 48 horas,
94
 aunque en ocasiones es necesaria la incubación por varios días. Cowan y Steel opinan que
5 días es el tiempo mínimo de incubación necesario para detectar todas las especies
Voges-Proskauer (VP) positivo de la familia Enterobacteriaceae.
Revelado de la prueba:
- Separar 1 ml de caldo bacteriano en un tubo y, adicionar 12 gotas (0,6 mL) de Voges A
y 4 gotas (0,2 ml) de Voges B. Mezclar para airear (para exponerlo al oxígeno
atmosférico) y dejar en reposo por 5 – 10 minutos antes de interpretar. Sin embargo, si la
prueba aún está negativa deje reposar y observe el tubo al cabo de 30 minutos a 1 hora.
Respetar el orden para evitar falsos negativos.
- El α – naftol es un catalizador que aumenta la intensidad del color de la reacción, lo que
hace a la prueba más sensible. El α-naftol debe agregarse siempre primero, agitando el
tubo para que el medio entre en contacto con el oxígeno. De esta manera la acetoína
presente se oxida a diacetilo, y el 2,3-butanediol se oxida para formar acetoína, pasando
esta a diacetilo. Es así como el α-naftol se unirá al diacetilo, que a su vez se ha unido al
núcleo guanidina presente en el aminoácido arginina, esta última proveniente de las
pluripeptonas.
- El KOH, se encarga de absorber el CO2 y de reaccionar con las peptonas. Esta reacción
origina la formación de un color rosado-salmón, claramente visible después de agitar muy
bien el tubo.
- Lectura: la aparición de un color rosado – rojo indica que la reacción VP es positiva. Si
el medio se queda amarillo la reacción VP negativa. Generalmente la prueba da positiva
después de 2 a 5 minutos, cuando se puede observar un color rosado débil. Si se deja en
reposo durante 30 min a 1 hora la intensidad del color será máxima (rojo intenso). Una
prueba negativa se pondrá en evidencia cuando el caldo quede de color amarillo. Después
de 1 hora, si la prueba es negativa, se puede formar un color cobrizo producto de la
reacción del hidróxido de potasio sobre el α-naftol.
- Uso:
- Para diferenciar entre cepas de E. coli que son VP negativos, de los géneros Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, entre otros, que son VP positivos.

95
Tabla 7. Reacciones positivas y negativas de la Prueba de Voges Proskauer
Negativo Positivo
Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumonoae
Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca
Klebsiella rhinoscleromatis Klebsiella planticola
Escherichia coli Enterobacter aerogenes
Shigella sonnei Enterobacter cloacae
Edwarsiella tarda Enterobacter sakazakii
Salmonella sp Enterobacter taylorae
Salmonella typhi Hafnia alvei
Citrobacter freundi Pantoea agglomerans (+/-)
Citrobacter koseri Serratia marcescens
Citrobacter amalonaliticus Proteus mirabilis (+/-)
Proteus vulgaris
Morganella morganii
Providencia rettgeri
Providencia stuartii
Providencia alcalifaciens
Yersinia enterocolitica

Control de calidad del medio preparado:

- Cepas (Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus
mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium y Enterobacter cloacae ATCC 13047.
- Resultados esperados: VP positivas (K. pneumoniae y E. cloacae). El resto VP negativas.

Figura 33. Medio RM/VP y Test VP positiva y VP negativa

96
5.10. Lectura del Medio MIO (Movilidad – Indol – Ornitina descarboxilasa)
La lectura, se realiza después de la incubación en aerobiosis, durante 18 – 24 horas a 35 –
37 °C.
a) Movilidad:
Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
b) Indol
- Para determinar la capacidad de la bacteria para producir indol a partir del triptófano, se
le adicionó 3 gotas del reactivo de kovacs.
- Resultados: positivo (anillo de color rojo en la superficie) y negativo (permanece
incoloro – amarillento) (Koneman et al., 1992) y (Mc Faddin, 1991).
c) Ornitina decarboxilasa:
- Resultado positivo: color púrpura
- Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la
superficie del medio.
Tabla 8. Principales características bioquímicas de la Escherichia spp.

97
 Tabla 9. Principales características bioquímicas de la Klebsiella

VI. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

6.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para identificar
Enterobacterias fermentadoras)

6.2. Realizar la diferenciación de las Enterobacterias fermentadoras

VII. Resultados
VIII. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (6.1., 6.2, VII y VIII) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

IX. Referencias bibliográficas

1. Gaytán E, Hernández B, Rodríguez, Negrín Z, Milián D. Determinación

espectrofotométrica de bromo con rojo de metilo. Revista Cubana de Química, 2005; 17
(1): 54-60.
2. Wikipedia contributors. «Methyl red.» Wikipedia, The Free Encyclopedia. Wikipedia,
The Free Encyclopedia, 2 Jul. 2018. Web. 17 May. 2019.

98
3. Mahmoud M.A., Poncheri A., Badr Y., Abd El Wahed M.G. Photocatalytic degradation
of methyl red dye. S. Afr. j. sci. 2009; 105( 7-8 ): 299-303. Available from:.scielo.
4. Laboratorios Britania. MR-VP Medio. 2015. Disponible en: www.britanialab.com
5. Laboratorios Microkit. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Disponible:
http://www.medioscultivo.com
6. Mac Faddin J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
7. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
8. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

99
 PRÁCTICA Nº 8

Desinfección y Coeficiente Fenol

I. Introducción

Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no

solamente en el laboratorio, donde son fundamentales para evitar la contaminación de
medios, cultivos, placas etc., sino también en otros ámbitos tales como los hospitales, donde
fallas en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes.

Pensemos lo que sucede en los quirófanos donde se deben desinfectar pisos, paredes y
techos, esterilizar instrumental quirúrgico e indumentaria del personal, y descontaminar el
aire del ambiente.

El estudiante de medicina, debe rápidamente familiarizarse e interiorizarse con ciertos

procesos de desinfección y antisepsia como: la antisepsia cutánea, previa a la administración
de un inyectable o durante la cura de una herida y la desinfección de un termómetro clínico.

Para empezar las labores de análisis Microbiológicos, es necesario el conocimiento y poner

en práctica los siguientes términos básicos:

a) Limpieza: es el proceso físico mediante el lavado con agua con o sin detergente para
eliminar materias orgánicas o elementos sucios de los objetos en uso. El propósito no es
destruir o matar microorganismos que contaminan los objetos, sino eliminarlos por
arrastre. Es indispensable antes de someterlos a desinfección o esterilización.
b) Asepsia: Conjunto de técnicas que se aplican, con la finalidad de eliminar
microorganismos en general de un área determinada, recurriendo a métodos de:
- Esterilización.
- Desinfección.
- Antiséptico.
c) Esterilización: es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de
vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes,
hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la
capacidad reproductiva del microorganismo. (¿deberían estar incluidos dentro de esta
definición la eliminación de estructuras como los priones?). Se trata de un término
absoluto, donde un objeto está estéril o no lo está, sin rangos intermedios.

100
d) Desinfección: en este proceso se eliminan los agentes patógenos reconocidos, pero no
necesariamente todas las formas de vida microbianas. Es un término relativo, donde
existen diversos niveles de desinfección, desde una esterilización química, a una mínima
reducción del número de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se
aplican únicamente a objetos inanimados.
e) Antisepsia: es el proceso que por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de
microorganismos presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Este término tampoco
implica la destrucción de todas las formas de vida. Existen agentes como los alcoholes
que son antisépticos y desinfectantes a la vez.
f) Coeficiente fenol: es un valor experimental de las sustancias biocida, tomando como
referencia la capacidad biocida del fenol. El coeficiente de un desinfectante puede
definirse como la relación del poder germicida del desinfectante comparado con el fenol
determinados en condiciones fijas. Método adoptado por la USFDA para analizar
desinfectantes en 1931, y adoptado como prueba oficial de desinfectantes por la
Association of Official Agricultural Chemist, en 1950. Desde la creación del test hasta la
actualidad, todas las reglamentaciones de control de germicida en el comercio, se basan
en el test de coeficiente fenol y el test de Confirmación de dilución.
II.Objetivo

2.1. Objetivo general

Evaluar los desinfectantes de uso Veterinario mediante el coeficiente fenol.

2.2. Objetivos específicos

- Evaluar los desinfectantes que se utilizan en los Laboratorio.

- Evaluar los desinfectantes que se utilizan en los centros de producción animal.

III. Competencia a desarrollar

- Evalúa la eficacia de los desinfectantes.
- Evalúa la eficiencia de los desinfectantes.
IV. Equipos, Materiales y Reactivos

Equipos:

- Incubadora bacteriológica.
- Mechero de bunsen

101
Materiales:

- Tubos de pruebas.
- Pipetas y aspirador de pipeta.

Reactivos:

- Cultivos bacterianos.
- Caldo nutritivo.
- Desinfectantes.
V. Metodología (coeficiente fenol)
- Desinfectante prueba, diluir en un volumen de 5 ml: 1:300, 1:325, 1:350, 1:375 y 1:400.
- Diluir en un volumen de 5 ml., el desinfectante fenol: 1:90 y 1:100.
- A cada tubo inocular 0.5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como
prueba (cepas específicas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus).
- Incubar a 37ºC.
- A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una cantidad de alícuota que se inocula en otro tubo
que contenga medio de cultivo estéril.
- Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del
microorganismo (aparición de turbidez).
- La mayor dilución del desinfectante que mate bacteria en 10 minutos pero no los mate
en 5 minutos se divide por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados.
- El número obtenido es el coeficiente fenólico del desinfectante.

Tabla 10. Cálculo del coeficiente fenol

Desinfectante Dilución Tiempo en minutos

5 10 15
Desconocido 1:300 - - -
1:325 + - -
1:350 + - -
1:375 + + -
1:400 + + +
Fenol 1:90 + - -
1:100 + + +
Coeficiente fenol = 350/90 = 3.8 (El agente desconocido es 3.8 veces más potente que el
fenol)

Confirmación de dilución = 3.8 x 20 = 76 (eficacia en superficie dura)

102
 VI. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

6.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para evaluar la
efectividad de los desinfectantes)

6.2. Realizar la diferenciación de los desinfectantes de uso Veterinario.

VII. Resultados

VIII. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (6.1., 6.2, VII y VIII) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

IX. Referencias bibliográficas

1. Baxby, Derrick (2005). The Chick–Martin test for disinfectants. Epidemiol.

Infect. 133 (Suppl. 1): S13-14. doi:10.1017/s0950268805004231.
2. Rideal, S.; Walker, J. T. A. (1902). The standardisation of disinfectants. J. R. Sanit.
Inst. 24: 424-41.
3. Miles, A. A. (1946). Wilson, G. S., Miles, A. A., ed. Topley and Wilson's principles of
bacteriology and immunity, vol. 1 (3 edición). London: Arnold. p. 148. "...at best a grossly
over-simplified answer to a difficult problem and, at worst little short of bacteriological
prostitution".
4. Chick, Harriette; Martin, C. (1908). The principles involved in the standardization of
disinfectants and the influence of organic matter upon germicidal value. J. Hyg. 8 (5):
654-97.

103
 PRÁCTICA Nº 9

Métodos de sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos

I. Introducción

Después de la “era dorada", cuando casi todos los grupos de antibióticos importantes
(tetraciclinas, cefalosporinas, aminoglucosidos y macrólidos) fueron descubiertos y los
principales problemas de quimioterapia se resolvió en la década de 1960, la historia se repite
hoy en día y estos compuestos emocionantes están en peligro de perder su eficacia debido al
aumento de la resistencia microbiana. Actualmente, su impacto es considerable con las fallas
del tratamiento asociado con bacterias resistentes a múltiples fármacos y se ha convertido en
un problema en Salud Publica a nivel mundial.

Por esta razón, es importante el descubrimiento de nuevos antibióticos. Los productos

naturales son uno de las principales fuentes de nuevas moléculas de medicamentos hoy en
día. Ellos son derivados de bacterias procariotas, microorganismos eucariotas, plantas y
diversos organismos animales. Microbios y productos de plantas ocupan la mayor parte de
los compuestos antimicrobianos descubiertos hasta ahora.

II. Objetivo

2.1. Objetivo general

Determinar la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos.

2.2. Objetivos específicos

- Descubrimientos de nuevos fármacos.

- Como herramienta epidemiologia en la vigilancia continua de los patrones de
susceptibilidad de cepas prevalentes para la emergencia de resistencia
- Determinar la sensibilidad de un patógeno para un tratamiento eficiente.
III. Competencias a desarrollar
- Realiza prueba de sensibilidad bacteriana.
- Determina la sensibilidad o resistencia bacteriana.
IV. Equipos, Materiales y Reactivos:

Equipos:

- Potenciómetro pH – metros.

104
- Incubadora bacteriológica.
- Refrigeradora.
- Autoclave.
- Cabinas de bioseguridad.
- Baño maría.
- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro.
- Vortex (digitador para tubos)

Materiales

- Vernier o Regla.
- Termómetros.
- Pinza punta plana.
- Placas Petri.
- Erlenmeyer.
- Hisopos de Algodón.
- Tubos con Tapa Rosca.
- Pipetas

Reactivos:

- Agar Mueller Hinton (no contiene timina o timidina, que son inhibidores de sulfamidas y
del trimetoprim).
- Cultivo bacteriano.
- Discos de sensibilidad antibiótica. Se deben guardar a 4 ºC y dejarlos a temperatura
ambiente 1 hora antes de utilizarlos. Los discos se congelarán si son antimicrobianos beta
– lactámicos y ha de transcurrir más de una semana hasta su utilización. Por regla general,
se recomienda reemplazar los discos de beta – lactámicos que están refrigerados con
aquellos que se encuentran congelados. El deterioro de los discos ocurre si son sometidos
a humedad o a frecuentes fluctuaciones de temperatura. En el caso de utilizar dispensador,
éste debe tener una tapa muy ajustada y un desecante, que será substituido cuando por
exceso de humedad cambie de color el indicador. El dispensador debe mantenerse
refrigerado cuando no se vaya a utilizar.
- Tubos con suero fisiológico (0,85 g de Cl Na en 100 ml de agua destilada esteril)
- Cloruro de Bario (BaCl2).
- Ácido Sulfúrico (H2SO4).

105
 V. Metodología (difusión disco – placa basado “Bauer, Kirby y colaboradores”)

5.1. Fundamento

Es recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) y

consiste en depositar, en la superficie del agar de una placa de petri previamente inoculada
con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos.
Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda
del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde
radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de
concentración. Transcurridas 18 – 24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por
una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en
crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la
concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Sin embargo, los
métodos disco – placa no permiten una lectura directa del valor de la CMI. Para cuantificarla,
basta con haber contrastado previamente el sistema disco – placa con un gran número de
cepas de CMI conocidas que han estado previamente determinadas por otros métodos de
determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos como el método de dilución. Esta
determinación se realiza con cientos de bacterias para minimizar errores. Se mide el diámetro
de la zona de inhibición obtenida por cada una de tales cepas y se grafica dicha medida frente
a la CMI, obteniéndose la línea de regresión o "recta de concordancia" que proporciona la
correspondencia entre las CMI y los diámetros de inhibición. Para determinar la CMI de una
cepa se procede a medir el diámetro de la zona de inhibición y luego extrapolarlo en el
gráfico para obtener la CMI. Existen, por tanto, unos diámetros de inhibición, expresados en
mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición debe
interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) según las categorías
establecidas por el NCCLS.

5.2. Indicaciones y limitaciones

Está indicado cuando se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede
predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar
resistencia a los antimicrobianos más habituales. También son útiles en estudios
epidemiológicos ya que el resultado del antibiograma puede ser considerado como el primer

106
marcador epidemiológico de que se dispone. Es una metodología aplicable a una amplia
variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes, de crecimiento
rápido como:

- Enterobacteriaceae.
- Pseudomonas spp.
- Stenotrophomonas maltophilia.
- Burkholderia cepacia.
- Acinetobacter spp.
- Staphylococcus spp.
- Enterococcus spp.

Además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado:

- Haemophilus spp.
- Neisseria gonorrhoeae.
- Streptococcus pneumoniae.
- Streptococcus spp.

5.3. Procedimiento (estafilococos, enterococos, enterobacterias y bacilos gram

negativos no fermentadores)

5.3.1. Preparación del inoculo

5.3.1.1. Método del medio de cultivo líquido

- Coger de 3 a 5 colonias iguales de la placa de cultivo de 18 a 24 horas y sembrarlas en 5

ml de un medio líquido (Brain – Heart, Todd Hewitt, Tripticasa soja, etc.).
- Incubar en la estufa a 35 ºC durante 2 a 6 horas hasta conseguir o superar una turbidez
del 0.5 de la escala de Mac Farland. Si la turbidez es superior se realiza el ajuste necesario
con suero salino estéril.
- Se recomienda utilizarlo si el cultivo tiene más de 24 horas de incubación.

5.3.1.2. Preparación del inoculo (método de suspensión directa de colonias)

- A partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas coger varias colonias con un asa y ajustar
el inóculo a una turbidez equivalente al 0,5 de la escala de Mac Farland en suero
fisiológico y agitar en un agitador "vortex" durante 15 – 20 segundos.

107
- Es el más adecuado para microorganismos de crecimiento difícil en medios líquidos
(Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae, estreptococos no enterococos,
Listeria, Moraxella y Corynebacterium spp.) y para estafilococos para detectar la
resistencia a oxacilina.

5.3.2. Inoculaciones de las placas

- Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, introducir un hisopo

dentro de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima
del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el exceso de inóculo.
- Sembrar por diseminación sobre la superficie de la placa Petri con agar Mueller – Hinton,
realizarlo en tres direcciones, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último
por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5 minutos
antes de depositar los discos.

5.3.3. Dispensación de los discos

- Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas estériles.
- Debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben
presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm
del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca
superposición de los halos de inhibición. Para placas de 150 mm no se emplearán más de
12 discos y para las de 100 mm no más de 6.
- Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5
placas, a 35 °C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos. Las placas se
incubarán 16 – 18 horas (con estafilococos sensibles a meticilina debe prolongarse la
incubación hasta 24 horas para confirmar la ausencia de resistencia a la meticilina).

5.3.4. Lectura

- Después de 18 horas de incubación leer el diámetro de las zonas de completa inhibición

con un pie de rey o regla. Si el microorganismo es un estafilococo o un enterococo
debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la oxacilina y vancomicina.
- Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los medios
que contienen sangre sobre la superficie del agar. En las pruebas de sensibilidad a
meticilina en estafilococos el halo alrededor de la oxacilina debe observarse utilizando
luz transmitida para visualizar las colonias diminutas.

108
- Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puede tratarse de mutantes
resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogéneas o cultivos mixtos y conviene
volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana. Como
regla general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que aparecen en el halo
de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una
lupa, a excepción de estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a
vancomicina. La interpretación de los resultados puede realizarse en función de las
normas del NCCLS.

Tabla 11. Discos de sensibilidad para Staphylococcus spp

GRUPO I Contenido R I S

Oxacilina 1 µg < 10 11-12 > 13

Penicilina 10 unidades < 28 - > 29

Eritromicina 15 µg < 13 14-22 > 23

Clindamicina 2 µg < 14 15-20 > 21

Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) 1.25/23.75µg < 10 11-15 > 16

Vancomicina 30 µg - - > 15

Gentamicina 10 µg < 12 13-14 > 15

Ciprofloxacina 5 µg < 15 16-20 > 21

GRUPO II Contenido R I S

Cloramfenicol. 30 µg < 12 13-17 > 18

Rifampicina. 5 µg < 16 17-19 > 20

Tetraciclina. 30 µg < 14 15-18 > 19

Teicoplanina 30 µg < 10 11-13 > 14

Nitrofurantoína(1) 300 µg < 14 15-16 > 17

Norfloxacina(1) 10 µg < 12 13-16 > 17

(1) Disco utilizado exclusivamente en infecciones de las vías urinarias.

109
 Tabla 12. Discos de sensibilidad para Enterobacterias

GRUPO I Contenido R I S
Ampicilina 10 µg < 13 14-16 > 17
Cefalotina 30 µg < 14 15-17 > 18
Ampicilina / Sulbactam 10/10 µg < 11 12-14 > 15
Amoxicilina / Ácido Clavulánico 20/10 µg < 13 14-17 > 18
Cefuroxima 30 µg < 14 15-22 > 23
Cefotaxima 30 µg < 14 15-22 > 23
Ceftriaxona 30 µg < 13 14-20 > 21
Gentamicina 10 µg < 12 13-14 > 15
Amikacina 30 µg < 14 15-16 > 17
Ácido Nalidíxico(1) 30 µg < 13 14-18 > 19
Norfloxacina(1) 10 µg < 12 13-16 > 17
Ciprofloxacina 5 µg < 15 16-20 > 21
Cotrimoxazol 1,25/23,75µg < 10 11-15 > 16
(Trimetoprim/Sulfametoxazol) 300 µg < 14 15-16 > 17
Nitrofurantoína(1)
GRUPO II Contenido R I S
Cefoxitina 30 µg < 14 15-17 > 18
Aztreonam 30 µg < 15 16-21 > 22
Ceftazidima 30 µg < 14 15-17 > 18
Cefixima 5 µg < 15 16-18 > 19
Cefoperazona/Sulbactam 75 µg/30 µg < 15 16-20 > 21
Cefepime 30 µg < 14 15-17 > 18
Cefpirome 30 µg < 14 15-17 > 18
Imipenem 10 µg < 13 14-15 > 16
Meropenem 10 µg < 13 14-15 > 16
Cloramfenicol 30 µg < 12 13-17 > 18
Ofloxacina (1) 5 µg < 12 13-15 > 16
(1) Disco utilizado exclusivamente en infecciones de las vías urinarias.

VI. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

6.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para realizar un
test de susceptibilidad bacteriana)

110
6.2. Mapa conceptual para determinar la concentración inhibitoria mínima y concentración
bactericida mínima.

6.3. Mapa conceptual para los mecanismos de resistencias bacterianos.

VII. Resultados

IX. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (6.1., 6.2, 6.3. VII y VIII) en forma individual
y grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

IX. Referencias bibliográficas

1. Gómez Ruiz MD, Gobernado M. (2013). Generalidades de los antimicrobianos. En

(Gómez J, Gobernado M. Eds) Enfoque Clínico de los Grandes Síndromes Infecciosos.
Madrid. Ergón Ed. 5ª edición: 661 – 687.
2. Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. (1992). Diagnóstico microbiológico. Editorial
Médica Panamericana. 3a ed., Buenos Aires.

111
 PRÁCTICA Nº 10

Diagnóstico de Ehrlichiosis y Anaplamosis: Pruebas rápidas

I. Introducción

La ehrlichiosis y la anaplasmosis son producidas por organismos pertenecientes al subgrupo

α – Proteobacteria, orden Rickettsiales, familia Anaplasmataceae, géneros Ehrlichia y
Anaplasma, respectivamente. Se caracterizan por ser bacterias intracelulares obligadas
pequeñas (0,4 a 1,5μm), Gram negativas, generalmente redondas, pero algunas veces
altamente pleomórficas, que se replican dentro de una vacuola derivada de la membrana de
la célula eucariota del hospedero, vertebrado o invertebrado.

Los géneros Ehrlichia y Anaplasma, infectan células hematopoyéticas: E. canis y E.

chaffeensis afectan monocitos y linfocitos. E. ewingii y A. phagocytophilum tienen especial
tropismo por granulocitos, y A. platys predilección por las plaquetas. Las bacterias ingresan
a las células sanguíneas por fagocitosis, y se alojan en vacuolas citoplasmáticas, en donde se
dividen hasta formar colonias de bacterias conocidas como mórulas, característica distintiva
de este grupo de patógenos. Típicamente aparecen en las extensiones sanguíneas, como
inclusiones de 2 a 7 mm de diámetro, redondeadas o elongadas, detectadas mediante diversas
tinciones como: Diff Quik, Romanowsky, Wright y Giemsa.

II. Diagnostico

Para el diagnóstico de Ehrlichiosis y Anaplasmosis se emplean diversas técnicas que

incluyen: la identificación de mórulas o cuerpos de inclusión en frotis sanguíneos y la
detección de anticuerpos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI). Recientemente se ha
incrementado el uso de técnicas moleculares tales como la técnica de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). La secuenciación y el aislamiento primario en cultivo celular son otras
técnicas empleadas en casos importantes y generalmente para fines de investigación.

El método más simple, rápido y económico para detectar la bacteria, es la visualización de

la mórula en células de sangre periférica; sin embargo, es también la técnica menos sensible
e inespecífica, debido a que no se detectarán bajas cantidades circulantes de bacterias en
sangre, y en ocasiones, es posible encontrar inclusiones no relacionadas a Ehrlichia y
Anaplasma que pueden causar confusión en el diagnóstico. Finalmente, esta técnica no

112
permite la diferenciación entre las diferentes especies de la familia Anaplasmataceae, por
presentar una morfología idéntica y poseer tropismo por las mismas células.

Actualmente hay disponibles pruebas serológicas inmunoenzimáticas e inmunofluorescentes

de excelente sensibilidad, especificidad y confiabilidad, pero los anticuerpos generalmente
están ausentes durante las dos primeras semanas de aparición de los síntomas de la
enfermedad, y pueden persistir hasta ocho meses después de la eliminación del agente del
organismo. También es posible que se presenten reacciones cruzadas entre los miembros de
la familia Anaplasmataceae, y con otros agentes Rickettsiales, ocasionando diagnósticos
poco precisos. Solamente un incremento o una disminución de 4 veces en el título de
anticuerpos en sueros pareados tomados con 4 semanas de diferencia se considera como
diagnóstico confirmatorio para casos clínicos de ehrlichiosis y anaplasmosis.

En cuanto el aislamiento mediante cultivo celular, sigue siendo la prueba de oro para
confirmar el diagnóstico; sin embargo, implica la incubación de varias semanas, requiere de
laboratorios de seguridad grado 3 y personal especializado, además es una técnica muy
laboriosa y poca sensible. En el caso de E. ewingii no se ha logrado su cultivo celular.

III. Objetivos

3.1 Objetivo general

Diagnóstico de Ehrlichiosis y Anaplamosis mediante pruebas rápidas

3.2. Objetivos específicos

- Identificación de mórulas o cuerpos de inclusión en frotis sanguíneos.

- Detección anticuerpos mediante SNAP 4Dx.

IV. Competencia a desarrollar

- Detecta mórulas en un frotis sanguíneo.
- Realiza el test SNAP 4Dx.
- Identifica resultados positivos y negativos mediante el SNAP 4Dx.
V. Equipos, Materiales y Reactivos

Materiales:

- Lamina porta objeto.

113
- Lamina cubre objeto.

Reactivos:

- Sangre de animales con diagnostico presuntivo de Ehrlichiosis o Anasplamosis.

- SNAP 4Dx
- Colorante Diff Quik:
 Solución fijadora
Colorante triarilmetano
Metanol
 Solución I (tinción eosinófila)
Colorante Xanteno (Eosina Y)
Disolución reguladora del pH
 Solución II (tinción basófila)
Colorante Tiazina , cloruro de metiltionina y azur A
Disolución reguladora del pH
- Alcohol de 70º
VI. Metodología

6.1. Identificación de mórulas en frotis sanguíneos coloreado con Diff Quik

- Fijación del frotis sanguíneo en el recipiente con metanol durante.

- Tinción de elementos formes con eosina.

- Contra tinción de elementos nucleares y con basofilia usando azul de metileno.

- Lavado, Secado y observación al microscopio con objetivo de 100 X.

Figura 34. Mórula de Ehrlichia canis

114
Inconvenientes:

- Es menos sensible e inespecífica (no detecta bajas cantidades y es posible encontrar

inclusiones no relacionadas a Ehrlichia y Anaplasma.
- No diferencian especies de la familia Anaplasmataceae (presentan una morfología
idéntica y poseer tropismo por las mismas células).

6.2. Detección anticuerpos mediante SNAP 4Dx

a) Colocar 3 gotas de sangre en el dilutor b) Adicionar 4 gotas de conjugado

c) Mezclar 5 veces (invertir el vial) d) Verter en dispositivo

e) Deslizamiento de la solucion f) Activacion del sistema

115
 g) Incubación al medio ambiente durante 8 minutos.
h) Lectura:

VII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

7.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para el

diagnóstico de la Ehrlichiosis y Anaplasmosis)

7.2. ¿Cuál es el fundamento del SNAP 4X?

VIII. Resultados
IX. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (7.1., 7.2, VIII y IX) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

X. Referencias bibliográficas
1. Michael E, Monterroso V, Cardona W. Monitoreo de Ehrlichia canis, Anaplasma
phagocytophilum, Borrelia burgdorferi, y Dirofilaria immitis en perros de tres ciudades
en Colombia. Revista Ces Medicina Veterinaria Y Zootecnia [Internet]. 2015, Jul.

116
2. Domínguez. G. Prevalencia e identificación de Hemoparásitos (Ehrlichia canis, Babesia
canis y Anaplasma phagocytophilum) en perros de la ciudad de Cuenca. Tesis de Grado
previa a la obtención del Título de Médico Veterinario Zootecnista, Universidad de
Cuenca [Internet]. Ecuador; 2011.
3. Ortiz. M. Seroprevalencia de Ehrlichia canis y Anaplasma phagocytophilum en caninos
vagabundos de dos sectores urbanos de la ciudad de Talca, región del Maule. Tesis para
obtener el Título de Médico Veterinario, Universidad Santo Tomas [Internet]. Chile;
2012.

117
 PRÁCTICA Nº 11

Diagnóstico de infecciones causadas por Hongos

I. Introducción
Las enfermedades producidas directamente por los hongos se denominan (Micosis) y a las
enfermedades producidas por sus metabolitos (Micotoxicosis). Para su aislamiento en el
Laboratorio se requieren medios de cultivos y para identificar sus micotoxinas se realiza a
través de ELISA y cromatografía liquida acoplado a espectrometría de masas para prueba
primaria y confirmatoria respectivamnete. El diagnóstico es importante para tomar medidas
correctivas.

II. Clasificación de los hongos

Hongos toxigénicos

Aspergillus Penicillium Fusarium

118
III. Objetivo

3.1. Objetivo general

Diagnosticar infecciones causadas por hongos que afectan a los animales de compañía y
animales de producción.

3.2. Objetivos específicos

- Identificar hongos que afectan la piel de los animales de compañía (Dermatofitos)

- Identificar hongos que producen micotoxinas en los insumos alimenticios (Hongos

toxigénicos).

IV. Competencia a desarrollar

- Conoce las características de los dermatofitos.
- Identifican las características de los hongos toxigénicos.
V. Equipos, Materiales y Reactivos
Equipos:

- Microonda.
- Mechero de bunsen.
Materiales:

- Pinzas.
- Tijeras.
- Laminas porta objeto.
- Laminas cubre objeto.
- Mascarilla.
- Guantes.
- Hoja de Bisturí.

Reactivos:

- Alcohol 70°.
- Agar glucosado Sabouraud.
- Agar Mycosel:
 Agar Sabouraud.
 Antimicótico (Cicloheximida o Actidiona).
 Antibacteriano (cloranfenicol).

pH = 5,6 – 6,6.

119
- Muestras:
 Pelos.
 Raspado de piel.
 Alimentos.

VI. Metodología
6.1. Tipo de examen
a. Directo
- Trabajar alrededor de mechero
- Colocar las muestras clínicas en portaobjeto
- Adicionar KOH 10 % (disuelve la queratina y disgregan las células sin afectar la
morfología del hongo y/o colorantes)
- Azul de lactofenol, azul de metileno, tinta china, giemsa, gram (colorea a la célula)
- Cubrir con laminilla
- Observar al microscopio
b. Indirecto (cultivo)
- Sembrar en medios de cultivos
6.2. Identificación de dermatofitos (Deuteromycetes)

a. Dermatofitos (Microconidias)
Trichophyton
- Trichophyton rubrum
- Trichophyton tonsuran
- Trichophyton mentagrophytes

120
b. Dermatofitos (Macroconidias)

Microsporum

- Microsporum canis

- Microsporum gypseum

Epidermophyton

- Epidermophyton floccosum

c. Hongos toxigenicos:
- Aspergillus
- Penicilium
- Fusarirum

121
VII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

7.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para la

identificación de dermatofitos y hongos toxigénicos).

7.2. Realizar un mapa conceptual para el mecanismo de acción de los antimicoticos.

VIII. Resultados

IX. Conclusiones

Nota: El alumno deberá resolver los puntos (7.1., 7.2, VIII y IX) en forma individual y
grupal y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus
informes en carpeta física.

X. Referencias bibliográficas
1. Arenas, R. (2013). Micología medica ilustrada. México: McGraw – Hill.
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.

122
 PRÁCTICA Nº 12

Cultivo de virus en huevos embrionados

I. Introducción
Los virus necesitan crecer en células vivas. Inicialmente se emplearon los animales de
experimentación. Pero Goodpasture en 1931, descubrió que los virus también podían crecer
en huevos de gallina con embrión.
Esto supuso un gran avance, porque es mucho más fácil manejar huevos que manejar
animales. Los mas empleados son los de gallinas, pero también se pueden emplear de
paloma, codorniz y otras.

II. Diagnostico viral

a) Detección del agente viral completo o de sus componentes:
- Observación del efecto inducido por el virus vivo propagado en un huésped biológico.
- Visualización de la partícula viral total o parcial
- Detección de componentes macromoleculares (antígenos virales o ácido nucleico).

Figura 35. Observación del virus mediante microscopio electrónico

b) Detección de la respuesta inmune del huésped:
- Estudio de anticuerpos antivirales (fase aguda y convalesciente con intervalo de 2 – 4
semanas).

123
III. Aislamiento viral
- Inoculación en animales de laboratorio
- Inoculación en cultivos de células (células en monocapa)

Figura 36. Cultivos de células y Unidades formadoras de placas

- Inoculación en embriones de pollos (Huevos embrionados procedentes de gallinas

libres de patógenos “SPF”).

IV. Objetivo
4. 1. Objetivo general

Aislamiento de virus en huevos embrionados de gallinas.

124
4.2. Objetivos específicos

- Aislar virus de la Enfermedad de Newcastle.

- Aislar virus de la Bronquitis Infecciosa Aviar.

- Aislar virus de la Pneumovirus.

- Aislar Influenza Aviar.

- Aislar Viruela Aviar.

- Aislar el virus de la Laringotraqueitis Aviar.

V. Competencia a desarrollar
- Identifica las lesiones producidas por el virus de Newcastle en el huevo embrionado.
- Identifica las lesiones producidas por el virus de la Bronquitis Infecciosa Aviar en el
huevo embrionado.
VI. Equipos, Materiales y Reactivos
Equipos:

- Incubadora para huevos embrionados.

- Mechero de bunsen.
- Ovoscopio.
- Taladro milimétrico.
Materiales:

- Jeringa de tuberculina.
- Agujas números (0,8 x 40 mm 21G ½ y 0,3 x 12 mm 30G ½).
- Algodón.
- Lápiz marcador.
Reactivos:

- Alcohol yodado.
- Virus de Newcatle.
- Virus de la Bronquitis Infecciosa Aviar.
- Virus de la Pneumovirus.
- Virus de la Influenza Aviar.
- Virus de la Viruela Aviar.

125
 - Virus de la Laringotraqueitis Aviar.
VII. Metodología (vías de inoculaciones de los huevos embrionados)
Para la inoculación de los huevos embrionados, se realizan teniendo en cuenta los siguientes
criterios:
Tabla 12. Vías de inoculación de huevos embrionados, según edad de incubación

Agentes patógenos Edad de Vías de inoculación

incubación
días Saco vitelino Cavidad alantoidea Membrana corioalantoidea

Clamidia 5–6 0,2 mL.

Pneumovirus

Newcastle 8–9 0,2 mL.

Bronquitis Infecciosa
Influenza

Viruela 10 – 12 0,3 mL.

Laringotraqueitis Aviar
a) Vía saco vitelino
- Previa asepsia de las manos con alcohol yodado, identifica en el huevo embrionado la
cámara de aire y delimitarla con lápiz marcador.
- Lugar de inoculación: marca la parte central de la cámara de aire.
- Realizar la asepsia del lugar de inoculación y perforar la cascara con taladro
milimétrico.
- Introducir la ajuga número 0,8 x 40 mm 21G 1/2 perpendicularmente, según el dibujo:

- Depositar el inoculo y sellar la abertura con cera.

126
- Incubarlos a 37 °C por una semana.
- Los embriones que mueren a las 24 horas deben ser descartados (muerte por
contaminación bacteriana).
- Los embriones muertos deben refrigerarse a 4 ºC
- Los embriones vivos deben ser refrigerados después del último día de incubación.
- Cosecha e identificación viral.
b) Vía saco cavidad alantoidea
- Previa asepsia de las manos con alcohol yodado, identifica en el huevo embrionado la
cámara de aire y el ojo del embrión, y delimitarla con lápiz marcador.
- Lugar de inoculación: marcar a 2 mm por encima de la delimitación de la cámara y en
sentido contrario a la ubicación del ojo del embrión.
- Realizar la asepsia del lugar de inoculación y perforar la cascara con taladro milimétrico.
- Introducir la ajuga número 0,3 x 12 mm 30G 1/2, según el dibujo:

- Depositar el inoculo y sellar la abertura con cera.

- Incubarlos a 37 °C por una semana.
- Los embriones que mueren a las 24 horas deben ser descartados (muerte por
contaminación bacteriana).
- Los embriones muertos deben refrigerarse a 4 ºC
- Los embriones vivos deben ser refrigerados después del último día de incubación.
- Cosecha e identificación viral.
127
 c) Vía membrana corioalantoidea
- Previa asepsia de las manos con alcohol yodado, identifica en el huevo embrionado la
cámara de aire y delimitarla con lápiz marcador.
- Lugar de inoculación: marcar la parte central de la delimitación de la cámara.
- Realizar la asepsia del lugar de inoculación y perforar la cascara con taladro milimétrico.
- Introducir la ajuga número 0,3 x 12 mm 30G 1/2, según el dibujo:

- Depositar el inoculo y sellar la abertura con cera.

- Incubarlos a 37 °C por una semana.
- Los embriones que mueren a las 24 horas deben ser descartados (muerte por
contaminación bacteriana).
- Los embriones muertos deben refrigerarse a 4 ºC
- Los embriones vivos deben ser refrigerados después del último día de incubación.
- Cosecha e identificación viral.

VIII. Indicadores de logros y criterios de evaluación:

8.1. Descripción del desarrollo de la practica (realizar un mapa conceptual para el

aislamiento de virus aviares).

8.2. Realizar un mapa conceptual para el aislamiento viral en cultivos celulares.

IX. Resultados
X. Conclusiones

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Nota: El alumno deberá resolver los puntos (8.1., 8.2, IX y X) en forma individual y grupal
y presentarlo al encargado de la practica en portafolio electrónico y archivar sus informes en
carpeta física.

IX. Referencias bibliográficas

1. Liñeiro, E. Fernandez, F. (2016). Manual práctico de virología. Cádiz: UCA.

2. Gay, F. P., y R. Thompson. Ensayos de cultivo de virus para vacunas en el embrión de
pollo en desarrollo. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 26: 556-559,1929.
3. Woodruff, A. M., y E. W. Goodpasture. La susceptibilidad de la membrana coriolantoide
de los embriones de pollo con respecto a la infección provocada por el virus de la viruela
aviar, 1931.
4. Goodpasture, E. W., A. M. Woodruff y G J. Euddinger. Infección vacunal de la membrana
corioalantoide del embrión de pollo. Am. J. Pathol. 8: 271-281. 1932.

129