Referencias: Ing. Ind. química Anal. ed. 15, 524 (1943).

CAS-1406-65-1 (clorofila)

Método oficial AOAC 942.04 Clorofila en plantas

Método Espectrofotométrico para la Clorofila Total y los Componentes a y b

Primera acción 1942

Acción final

A. Aparato

Usar aparatos en 940.03A (ver 3.6.01) (excepto colorímetro fotoeléctrico) y lo siguiente:

(a) Tubos de lavado para lavar soluciones de éter. Tubos abiertos de aproximadamente 20
mm de diámetro en un extremo de cada uno de los cuales se sella un tubo de menor
diámetro aspirado a chorro fino en el extremo inferior.
(b) (b) Espectrofotómetro: región espectral aislante de ca 3 cerca de 660 nm con radiación
parásita insignificante. Use celdas tubulares con tapones de vidrio bien ajustados para
trabajar con éter

B. Reactivos

Los enumerados en 940.03B (ver 3.6.01) y siguientes: El grado Ether-Commercial es

satisfactorio sin más purificación.
C. Determinación
(c) (Lave la cristalería con una solución concentrada de Na, PO para eliminar los rastros de
ácido que pueden descomponer la clorofila).
(a) Extracción de clorofila del tejido: seleccione y prepare la muestra de prueba como
en 940.03C (ver 3.6.01). Desintegre la porción de tex pesada (2-10 g, dependiendo del
contenido de clorofila) de tejido vegetal fresco en un vaso de licuadora que contenga
aprox. 0,1 g de CaCO, o mediante el uso de mortero como en 940.03C (ver 3.6.01).
Después de que el tejido se haya desintegrado por completo, filtre el extracto a través
de Büchner equipado con papel cuantitativo. Lave el residuo con acetona al 85%,
940.03B(a) (ver 3.6.01), y si es necesario, use un poco de éter para eliminar los últimos
restos de pigmento. Si la extracción es incompleta, devuelva los residuos y el papel al
recipiente de la licuadora con más acetona al 85 % y repita la extracción. Filtrar y lavar,
como antes, en el matraz que contiene el primer filtrado. Transferir el filtrado a un
matraz volumétrico de tamaño apropiado y diluir al volumen con acetona al 85%.

(d) Pipetear alícuota de 25-50 ml. en un separador que contenga aprox. 50 ml. éter.
Agregue H.O con cuidado hasta que sea evidente que todos los pigmentos solubles en
grasa han entrado en la capa de éter. Drene y deseche la capa de agua. Coloque el
separador que contiene la solución de éter en la rejilla superior del soporte. Agregue
aproximadamente 100 ml. H.O al segundo separador colocado en la rejilla debajo del
primero Coloque el tubo de lavado en su lugar y deje que la solución de éter corra a
través de él hasta el fondo del separador inferior y suba en pequeñas gotas a través del
H.O. Cuando toda la solución haya salido del separador superior, enjuáguelo y frote el
tubo con un poco de éter agregado del gotero. Coloque el tubo de lavado en el
separador superior y cambie su lugar en el soporte con el separador que ahora
 contiene una solución de éter. Drene y deseche el HO en el separador superior,
agregue una porción similar de agua fresca al separador inferior y repita el proceso de
lavado. Continúe lavando la solución de éter hasta que se elimine toda la acetona (5-10
lavados). Luego transfiera la solución de éter a un matraz volumétrico de 100 ml, diluya
al volumen con éter y mezcle.
(e) (b) Mediciones espectrofotométricas. Agregue una cucharadita (aproximadamente 5
mL) de Na₂SO anhidro a una botella de reactivo de 60 mL y llénela con una solución
etérea de pigmento. Cuando esta solución sea ópticamente clara, pipetee una alícuota
en otra botella seca y diluya con suficiente éter seco para obtener un valor de A de 0,2
a 0,8 en la longitud de onda que se utilizará. (El valor más favorable está cerca de 0,6 a
660 nm, ya que dicha solución produce un valor satisfactorio a 642,5 nm).

(f) Llene 2 celdas de absorción limpias con tapón de vidrio con éter seco de una pipeta y
pula las superficies exteriores de cada una, primero con algodón humedecido con
alcohol y luego con algodón seco. Coloque las celdas en el instrumento y determine si
cada una da la misma desviación del galvanómetro. Si no es así, limpie de nuevo o
seleccione celdas que lo hagan, y hágalo diariamente. Vacíe una celda, llénela con la
solución de éter seca y colóquela en el instrumento. Ajuste las rendijas de entrada y
salida hasta que la región espectral aislada sea de 3-4 nm a 660,0 nm.

(g) Determine si el instrumento está en el ajuste adecuado para la longitud de onda

tomando lecturas de A a través de la solución contra el solvente a intervalos de 1 nm
de 658 a 665 nm. El valor más alto debe estar en 660,0 nm; si no, ajuste el instrumento
hasta que lo esté, o realice lecturas de 660,0 mm en el ajuste de longitud de onda que
dio la A más alta. Con rejilla
(h) instrumento, aplique la misma corrección a 642,5 nm; sin embargo, con el instrumento
de prisma, la corrección a 642,5 nm debe obtenerse de la curva de calibración de
longitud de onda para el instrumento en particular en uso. Calibre el instrumento para
la longitud de onda de esta manera con la frecuencia suficiente para asegurarse de que
permanece en el ajuste adecuado. Determinado a 660,0 y 642,5 mm (o ajustes
corregidos) para cada solución de prueba (e) Cálculo de la concentración de clorofila:
calcular el total
(i) clorofila y cada uno de los componentes a y b (mg/L) de la siguiente manera:
(j) Clorofila total-7.12 +1684
(k) D. Información complementaria
(l) Los factores involucrados en el análisis espectrofotométrico del sistema de clorofila se
han discutido en detalle [Plant Physiol 17, 198 (1942)] Estos autores usaron la ley de
Beer en forma rápido
(m) donde / es la intensidad de la luz transmitida por la celda llena de solvente, / es la
intensidad de la luz transmitida por la celda llena de solución; e es la concentración de
clorofila (g), a es la absortividad, es el espesor de capa de solución en cm, y es
absorbancia Dado que, a una longitud de onda dada, el valor observado de la solución
que tiene 2 componentes representan la suma de 4 valores de cada uno de los
componentes, la siguiente ecuación se cumple en el caso de las clorofilas a y b en una
longitud de onda dada:

Si se utiliza una celda de 1 cm, esta ecuación se puede expresar como

Las concentraciones de clorofilas a y b en una solución de éter dada ahora se pueden calcular
mediante la Ecuación 5 de la siguiente manera: (a) Determine 4 para la solución a 2 longitudes
de onda diferentes (660.0 y 642,5 nm se han encontrado ventajosos para este propósito). (b)
De la Tabla 942.04, seleccione absortividades apropiadas correspondientes a las longitudes de
onda utilizadas. (c) Sustituya el valor 4 observado y las absortividades en la Ecuación 5 para
cada una de las 2 longitudes de onda utilizadas como se ilustra para 660,0 y 642,5 nm en las
Ecuaciones 6 y 7. Resuelva estas 2 ecuaciones simultáneamente para 2 incógnitas, las
concentraciones de clorofilas a y Las ecuaciones 1-3 se derivaron de esta manera

El criterio para la precisión de los valores de clorofila determinados por el método

espectrofotométrico es la concordancia entre los resultados analíticos determinados a
partir de mediciones a diferentes longitudes de onda. Las mediciones a 660,0 y 642,5 nm
son convenientes para el análisis de rutina (Plant Physiol. 17, 198 (1942)); sin embargo, las
lecturas pueden ser

Cuadro 942.04. Constantes de absorción utilizadas en el análisis (después de Comar y

Zscheile)

Absortividades (para soluciones de éter)

Longitud de onda, nanómetro

Absorción en solución de eter

Absorptivities (for ether

solución)
Longitud de onda nm Clorofila a Clorofila b
660.0 102 4.50
642.5 16.3 57.5
600.0 9.95 9.95
581.0 8.05 8.05
568.0 7.11 7.11
613.0 15.6 8.05
589.0 5.90 10.3
hecho en otras longitudes de onda para comprobar estos valores. En la Tabla 942.04 se
presentan las absortividades de las clorofilas a y b en solución de éter que pueden usarse
para este fin.

Estos valores pueden usarse para los cálculos de la siguiente manera: (a) Los valores para la
clorofila total y la composición porcentual pueden calcularse a partir de A a 660,0 y 642,5
nm como se describe.

(b) Los valores de control para la clorofila total se pueden calcular a partir de A en los
puntos de intersección 600,0, 581,0 y 568,0 nm.

(e) Los valores de verificación para la composición porcentual pueden calcularse a partir de
A para cada uno de los puntos 613.0 y 589.0 nm en combinación con el valor de

concentración total obtenida de (a) o (b), Referencias: Ind. Eng. química Anal. ed. 14, 877
(1942).

Fisiol vegetal. 17, 198 (1942).

CAS-1406-65-1 (clorofila)