Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Naturales

Nombre: Camila Rodríguez Ruiz

Carrera: Biología
Cátedra: Genética y Evolución
ANÁLISIS DE UN ARTÍCULO CIENTÍFICO

Anemia arregenerativa en el lactante: 2 casos de síndrome de Pearson

A regenerative anemia in infants: 2 cases of Pearson´s syndrome

Para lograr un análisis adecuado de este artículo, empezaré introduciendo a la anemia,

cuales son sus causas, tipos de anemia y su relación con el síndrome de Pearson.
Hablamos de anemia cuando existe una disminución de la masa eritrocitaria y de la
concentración de hemoglobina (Hb) circulantes en el organismo por debajo de unos limites
considerados normales para un sujeto, teniendo en cuenta factores como edad, sexo,
condiciones medioambientales (Ej. Altitud) y estado fisiológico (neonatalidad, infancia,
pubertad, embarazo, ancianidad…)
La OMS reconoce la anemia en caso de:
• Hb < 13 g/dl en varón adulto
• Hb < 12 g/dl en mujer adulta
• Hb < 11 g/dl en la mujer embarazada
• Un descenso brusco o gradual de 2 gr/dl o más de la cifra de Hb habitual de un
paciente, incluso aunque se mantenga dentro de los límites normales para su edad
y sexo.
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El estudio de un paciente con anemia comienza con el interrogatorio, el examen físico y los
exámenes de laboratorio básicos, a saber: hemograma completo, recuento de reticulocitos
y de plaquetas, perfil de hierro (ferremia, transferrinemia, saturación de transferrina y
ferritina sérica), eritrosedimentación, hepatograma, función renal, perfil tiroideo, LDH y
haptoglobina sérica. Dado que las determinaciones de laboratorio carecen de sensibilidad
y especificidad del 100%, cuando la sospecha diagnóstica es alta se deberán realizar varias
pruebas a fin de cumplimentar los criterios mínimos para establecer la etiología de la
anemia.
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En función de criterios morfológicos la anemia se clasifica de esta

forma, adjuntando también sus síntomas más comunes:

• Cardiovasculares y respiratorios Disnea de esfuerzo, ortopnea, taquipnea, angina

y claudicación Pulso amplio y rápido, cardiomegalia, soplos, edema, ruidos
vasculares
• Neurológicos Cefalea, acúfenos, vértigo, mareo, pérdida de concentración,
cansancio, menor tolerancia al frío
• Cutáneos: Palidez de piel, conjuntivas y lecho ungueal, fragilidad de cabello y uñas
• Gastrointestinales: Anorexia, náuseas, estreñimiento, diarrea
• Genitourinarios: Trastornos menstruales (amenorrea, menorragia), pérdida de la
líbido, impotencia.

Y en función a criterios fisiopatológicos:

• Anemia regenerativa: número de reticulocitos aumentado

El origen de la anemia es por fallo periférico, la médula ósea intenta compensar
produciendo gran cantidad de reticulocitos, ocurre en sangrado, hiperesplenismo y
estados hemolíticos.
• Anemia arregenerativa: número de reticulocitos disminuido o ausentes.
El origen de la anemia es por fallo central; la médula ósea no puede producir un
número suficiente de reticulocitos, y por tanto de hematíes. Ocurre en alteraciones
primarias de médula ósea y eritropoyesis ineficaz secundaria a déficit de nutrientes.
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Anemia arregenerativa en lactantes

La anemia es un trastorno frecuente y, por lo general, benigno en el lactante. Su causa más

usual es la ferropenia por carencia de aporte nutricional, que presenta una prevalencia de
9,6%-35% en menores de 24 meses.

El recién nacido normal de término tiene reservas adecuadas de hierro, suficientes para
cubrir los requerimientos hasta los 4-6 meses de edad. Éstas provienen fundamentalmente
del aporte de hierro materno durante la vida intrauterina, y en menor medida del originado
por la destrucción de los eritrocitos por envejecimiento durante 8 los primeros 3 meses de
vida. Como el hierro materno es incorporado por el feto durante el tercer trimestre del
embarazo, el niño pretérmino nace con menores reservas de hierro.

El defecto habitual es la introducción tardía en la dieta o el rechazo de alimentos ricos en

hierro. La incorporación temprana de la leche de vaca - antes de los 6 meses de vida - es
otro factor causal de importancia. También es frecuente encontrar niños cuya dieta está
principalmente basada en leche y carbohidratos. Este tipo de alimentación, aunque pobre
en hierro, es generalmente adecuada en calorías, dando como resultado un niño con
anemia ferropénica pero dentro del peso normal, u ocasionalmente con sobrepeso, para su
edad.

El diagnóstico debe basarse según la dieta que lleve el paciente, el déficit en la ingesta de
alimentos ricos en hierro, exceso de carbohidratos y leche, suplemento de hierro y tipo de
suplementación, etc.
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Anemia arregenerativa y su relación con el síndrome de Pearson

La anemia puede ser el signo inicial de una patología de mayor gravedad. Por ello, debe
estudiarse siempre su etiología. Se presentan dos casos de anemia en lactantes, en los
que se llegó a confirmar el diagnóstico de una patología muy poco frecuente.

Cuando la anemia es arregenerativa, puede deberse a aplasia medular, síndrome

mielodisplásico, infiltración medular o déficits de factores hematopoyéticos. Otra posible
causa es el síndrome de Pearson, una rara enfermedad mitocondrial que se presenta con
anemia asociada a otras citopenias, insuficiencia pancreática, acidosis láctica y gran
variabilidad en su presentación clínica condicionada por la heteroplasmia. Es característico
encontrar en el aspirado/biopsia de médula ósea vacuolización de los precursores de serie
roja y sideroblastos en anillo.

El diagnóstico de certeza se establece mediante el estudio genético del ácido

desoxirribonucleico mitocondrial con Southern blot (amplificación completa de ácido
desoxirribonucleico mitocondrial mediante reacción en cadena de la polimerasa-largo), que
obtiene deleción del 70%-80% de 4977 pb (DNAm 8343-13459). No existe tratamiento
curativo y las medidas son de soporte. Es frecuente el fallecimiento en los primeros años
de vida.

El síndrome de Pearson es una enfermedad rara que se presenta en <1/2.000 de los recién
nacidos, y una prevalencia de 100 casos descritos a nivel mundial. En cuanto a su
distribución por razas o sexo, no se ha apreciado predilección por ninguno de los dos
supuestos, tampoco se ha establecido relación entre padres consanguíneos, ya que la
mayoría de los casos están producidos por deleción de novo.

El síndrome de Pearson está causado por grandes deleciones únicas del mtDNA. En la
mayoría de los casos se observa una deleción de 4977 bp, también llamada “deleción
común”. Afecta a los genes situados desde el nucleótido 8483 hasta el 13459, y está
flanqueada por una secuencia de repetición de 13 pares de bases.
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SECUENCIA DE 4,977 KB DE LA DELECIÓN COMÚN. ENTRE CORCHETES

SECUENCIA DELECIONADA. LOS PARES DE BASES SUBRAYADOS CON
ASTERISCOS SON LAS SECUENCIAS DE REPETICIÓN DIRECTAS Y PERFECTAS
QUE FLANQUEAN LA DELECIÓN
A nivel histológico, las fibras rojo rasgadas son un hallazgo anatomopatológico
característico de enfermedad mitocondrial, aunque no son patognomónicas. Se tiñen con
la tinción tricrómico modificado de Gomori, y pueden verse en diversas situaciones, como
distrofias musculares, miopatías inflamatorias e incluso en ancianos. Algunas
enfermedades mitocondriales cursan también con fibras COX negativas, como el síndrome
de MERF (o epilepsia mioclónica con fibras rojo rasgadas), KSS, CPEO y PS. Sin embrago,
la ausencia de fibras rojo rasgadas o de fibras COX negativas en la biopsia muscular no
descarta patología mitocondrial, debiendo continuarse el estudio genético 26 . Se ha
encontrado una mayor proporción de deficiencia de COX en fibras rojo rasgadas en
pacientes con PS con deleciones que abarcan los tres genes de mtDNA codificantes de 18
COX (peor pronóstico, mayor severidad clínica), mientras que la deficiencia del Complejo I
se ha descrito en pacientes con pequeñas deleciones que afectan solo a los genes del
mtDNA codificantes del Complejo I.

La supervivencia a los 3 años de vida es del 80%. Esta alta tasa de mortalidad es debida
principalmente a infecciones (en menores de 3 años, sobre todo), complicaciones de la
pancitopenia y a acidosis metabólica (intratable en la mayoría de los casos). A partir de los
3 IMAGEN 8. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE KAPLAN MEIER EN PACIENTES CON
SÍNDROME DE PEARSON 43 30 años la clínica hematológica mejora, pero desarrollan
otras complicaciones como el síndrome de Kearns Sayre.
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CASO 1

Lactante varón de 8 meses sin antecedentes de interés, hospitalizado por presentar anemia
arregenerativa en la analítica sanguínea realizada en el contexto de cuadro febril,
secundario a una infección respiratoria (hemograma, en la Tabla 1). Se obtuvo una muestra
de secreciones respiratorias mediante aspirado nasofaríngeo y se realizó
inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales específicos, que fue positiva
para metapneumovirus humano. Se realizó un estudio etiológico de la anemia (bioquímica
con deshidrogenasa láctica.

En el estudio de médula ósea realizado durante su ingreso, se observó dishemopoyesis de

las 3 series: vacuolización en serie roja con sideroblastos “en anillo” en tinción de Pearls y
discreta dismorfia megacariocítica y granulocítica sin cumplir criterios de síndrome
mielodisplásico. Durante el seguimiento, presentó progresión hematológica a pancitopenia,
con requerimientos transfusionales de hematíes periódicos y repetidas infecciones que
motivaron múltiples ingresos hospitalarios. La ganancia ponderoestatural fue estable
durante el seguimiento con longitud en P25 y peso en P50. Se realizó el estudio genético
de anemia de Blackfan-Diamond y de hemoglobinuria paroxística nocturna, que fueron
negativos. Con 2 años y 3 meses, ante la persistencia de la sintomatología, se decidió
realizar un estudio genético del ácido desoxirribonucleico (ADN) mitocondrial con Southern
blot, a través de la amplificación completa de ADN mitocondrial mediante PCR-largo, que
obtuvo deleción en torno al 70%-80% de 4977pb (DNAm 8343-13 459) y confirmó el
diagnóstico de síndrome de Pearson. No se han encontrado alteraciones en otros órganos
hasta el momento.

CASO 2
Lactante varón de 8 meses sin antecedentes de interés, que ingresó por fiebre sin foco
aparente, palidez, taquicardia y petequias pretibiales. En la analítica inicial, presentaba
anemia arregenerativa, trombopenia y neutropenia moderada. En el estudio microbiológico
realizado, se encontró un resultado serológico positivo para inmunoglobulina M.
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A continuación, se presenta una tabla comparativa con los datos hematológicos iniciales de
ambos pacientes:

PROCESO DE ESTUDIO

Estudio analitico para determinar la

etiologia de la
Estudio de médula ósea presentó
pancitopenia(bioquimica,
marcada hipolasia de serie roja, no se
metabolismo del hierro, vitamina
realizó tinción de Pearls.
B12, ácido fólico, Coombs directa,
anticuerpos antigranulocito.

Se observaron desposiciones
Ecografía abdominal presentó
dispépticas con restos alimenticios
hiperocogenicidad pancreática
sugestivos de insuficiencia
inspespecífica.
pancreática.
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MÉTODOS
Con el fin de extraer ADN total del tejido se tomaron 100 mg de tejido fresco o congelado y
se trituró de forma mecánica con una cuchilla estéril. El homogenado se recogió en un tubo
eppendorf con tampón 1XRSB (Tris-HCl 10 mM pH 7,4; NaCl 10 mM; EDTA 25 mM) y se
añadió proteinasa K a una concentración de 100 µg/ml y SDS al 1%. La mezcla se incubó
a 37º C durante toda la noche en agitación.

Al día siguiente, los ácidos nucleicos se extrajeron realizando dos extracciones con fenol-
IAC y una con cloroformo-alcohol Isoamílico (24:1). Seguidamente se precipitó el DNA
añadiendo dos volúmenes de etanol frío y recogiendo el ovillo o bien dejando las muestras
a -20º C durante toda la noche y centrifugando después durante media hora a 13000 rpm.
A continuación se eliminó completamente el etanol y el pellet se resuspendió en agua
destilada libre de DNasas (volumen determinado en función del tamaño del ovillo de DNA).

La reacción de PCR se llevó a cabo a partir de las muestras de ADN total disuelto .en agua
destilada.

Proceso de Amplificación.

Cada una de las zonas del ADN a amplificar tiene unas características peculiares, lo que
obliga a adecuar las condiciones de PCR en cada uno de los casos.

Como norma general, y si no se especifica otra cosa, la reacción se llevó a cabo en tubos
de 0,6 ml en un volumen final de 50 μl que contenía:

- 0,3- 0,5 μg de ADN total

- 5 μl del tampón 10X (500 mM KCl, 100 mM TRIS pH 9 y 1% TRITON X-100).

- 0,4 mM dNTPs (2 μl de una mezcla de dNTP, 10 mM de cada uno)

- 1 mM MgCl2 (2μl de MgCl2 25 mM) - 0,25 μM de cada uno de los oligonucleótidos (0,5 μl
de oligonucleótidos disueltos a una concentración 25 μM)

- 1 unidad de la enzima Taq DNA Polimerasa (1μl de la enzima suministrada a 1U/μl)

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Para la obtención de mejores resultados, y facilitar el trabajo, se realizó una mezcla previa
que contenía todos los reactivos necesarios para todas las muestras excepto el ADN. En el
tubo de reacción se puso el agua necesaria para llevar el volumen a 50 μl, se añadió la
parte proporcional de la mezcla previa y a continuación se puso el ADN. Los tubos con la
mezcla final se mantuvieron en hielo, y se pusieron en el termociclador cuando éste alcanzó
la temperatura del primer ciclo de desnaturalización. En todas las reacciones se preparó,
en paralelo, un tubo blanco, que no contenía ADN y que se utilizó como control de
contaminación del proceso.

Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron tomando 5 μl de producto amplificado y

llevándolo hasta un volumen final de 10 μl que contenía el tampón de incubación
correspondiente al enzima y 5U del enzima de restricción. Las incubaciones se realizaron
a a la temperatura optima y el tiempo necesario siguiendo las instrucciones de la casa
comercial para cada caso.

En la siguiente tabla se detallan las enzimas de restricción usadas, las condiciones de

trabajo y el uso de cada una de ellas.

Las enzimas de restricción reconocen ciertas secuencias en el ADNmt, y es ahí donde

cortan la molécula. De esta forma, como conocemos la secuencia de ADNmt completa,
podemos conocer los fragmentos que nos vamos encontrar una vez digerido el ADN.
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Separación electroforética de los ácidos nucleicos: Electroforesis horizontales en geles de

agarosa con bromuro de etidio.

La agarosa se fundió en un horno microondas en el tampón TBE (50 mM Tris, 50 mM Ácido

Bórico, 1mM EDTA-Na, pH 8,3), después se añadió el Bromuro de Etidio (1μg/ml) y se dejó
que la solución gelificara en una bandeja cuyas dimensiones eran 10x7,6 cm.

Para comprobar las amplificaciones del ADN y analizar los diferentes fragmentos obtenidos
al digerir los fragmentos de PCR con enzimas de restricción se prepararon geles entre 0.7
y 2 % de agarosa (según el tamaño de las bandas y la resolución necesaria),.

La electroforesis se desarrolló a 80 voltios durante 1 hora, utilizando como marcadores de

peso molecular el patrón de 1Kb de Roche. Las muestras se mezclaron con 2 μl de mezcla
colorante (Ficoll 400 15%, Azul de Bromofenol 0´2%).

ANÁLISIS DE DELECIONES POR SOUTHERN BLOT.

Para realizar el análisis del ADNmt mediante la técnica de Southern blot se necesita tener
el ADN total linearizado. El enzima de restricción utilizado fue Pvu II, que produce un único
corte en el ADNmt linearizándolo en la posición 2652. Las digestiones de ADN total se
llevaron a cabo en un volumen final de 50 μl que contenían 5 μg de ADN, 1 μg de RNAsa
libre de DNAsa, 5 μl del tampón de incubación 10x correspondiente al enzima, 2 μl de
espermidina 50 mM y el enzima de restricción. La cantidad de enzima adicionada fue de 4
unidades/μg ADN. Se incubó a 37ºC durante 6 horas. Una vez acabada la digestión se
precipitó el ADN con 0,2M de NaCl y 100 μl de etanol frío. Se deja a –20ºC toda la noche,
o a -70ºC durante 1 hora.
A continuación, se centrífuga a 13000 rpm en microfuga durante 30 minutos a 4ºC y se
resuspende en 10 μl de agua destilada. A continuación se prepararon geles de Agarosa al
0,7% en tampón de electroforesis TBE con Bromuro de Etidio (0,5 μg/ml). Las muestras de
ADN total contenían 5 μg de ADN total digerido con PvuII en un volumen de 10 μl a los que
se añadió 2 μl de mezcla colorante (Ficoll 400 15%, Azul de Bromofenol 0,2%).
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Paralelamente se utilizó un patrón del fago λ digerido con Hind III y marcado con
digoxigenina (Roche) como marcador de peso molecular. La electroforesis se desarrolló a
50 voltios durante 15 minutos para facilitar la entrada de las muestras. Seguidamente el
voltaje se aumentó a 100 voltios hasta que transcurrió un tiempo total de 3-4 horas. En
todos los casos, una vez concluida la electroforesis, se procedió a la visualización del ADN,
bajo una fuente de radiación UV y posterior escaneado de los geles.

Hibridación Southern.

Transferencia y fijación de ADN a membranas de Nylon.

La transferencia del ADN previamente digerido con el enzima de restricción PvuII, que
lineariza el ADN mitocondrial y separado electroforeticamente por tamaño, a membranas
de nylon se realizó siguiendo la técnica de Southern, utilizando un aparato de transferencia
al vacío.

Antes de comenzar la transferencia se procedió a la preparación del aparato. Para ello, se

humedeció en agua destilada el soporte poroso y la membrana de nylon. A continuación,
se colocó la membrana entre el soporte del aparato y la máscara, en la ventana preparada
para ello, asegurándose que no hubiera burbujas entre la membrana y la pantalla porosa
(soporte). Después se colocó el gel sobre la ventana, encima de la membrana, y se conectó
la bomba de vacío, hasta obtener 50 mbar. En este momento comenzó el tratamiento del
gel y la transferencia del ADN. En primer lugar, se añadió sobre el gel la solución de
despurinización (0,25 M HCl), hasta que se cubrió totalmente, durante 7 minutos. Una vez
transcurrido ese tiempo se inclinó la unidad para eliminar el líquido residual. Seguidamente
se añadió la solución de desnaturalización (1,5 M NaCl, 0,5M NaOH) hasta cubrir de nuevo
el gel. Se dejó otros 7 minutos y se eliminó el líquido de la forma indicada anteriormente. A
continuación, se añadió la solución de neutralización (1M TRIS, 1,5 M NaCl, pH=7´5) y se
dejó otros 7 minutos.

Después, se realizó la transferencia por vacío. Para ello se añadió solución de transferencia
20xSSC (3 M NaCl, 0,3 M Citrato Trisódico, pH=7-7,2) sobre el gel hasta cubrir toda la
unidad para asegurarnos la completa transferencia a la membrana. Se dejó durante 30
minutos y se procedió a la eliminación del líquido de la misma forma que antes.
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Concluida la transferencia, levantamos una esquina del gel y apagamos el vacío. La

trasferencia de los fragmentos de ADN del gel se comprobó mediante la visualización de
éste bajo una fuente de radiación UV.

La membrana de nylon con los ácidos nucleicos trasferidos se lavó en 2xSSC durante 5
minutos para eliminar posibles restos de agarosa. Se colocó en papel de filtro y se dejó
secar al aire a temperatura ambiente. Finalmente, los ácidos nucleicos se fijaron a la
membrana mediante radiación ultravioleta en un UV Crosslinker con una energía de
120.000 μJ/cm2 .

Amplificacion Deleción de ADN

Estudio mitocondrial completa de ADN mitocondrial de,
con SOUTHERN BLOT mitocondrial aproximadamente
mediante PCR-largo. 70% - 80%.

No existe relación Localizacion del

entre el número de genoma con el tipo
pares de bases de afectacion clínica
afectados y la evolución.

CONCLUSION

Como conclusión, el síndrome de Pearson es una patología muy desconocida por los
facultativos, probablemente debido a su escasa prevalencia. Esto lo convierte en una
entidad infradiagnosticada, ya que su presentación clínica es muy variada y, en el estudio
etiológico, es fácilmente confundible con otras patologías. Debe tenerse siempre en cuenta
la sospecha en aquellos lactantes que presenten una anemia arregenerativa,
especialmente con signos de vacuolización en el estudio de médula ósea.
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Bibliografía

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Madrid: Ergon; 2014. p. 773-790.

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https://archivos.fapap.es/files/639-1437-RUTA/02_Anemia_pediatrica.pdf

VIDEO

https://youtu.be/Nbjn7iQ0Ojk
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