CONTROL MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES, UTENSILIOS Y AMBIENTE.

1. CONTROL DE SUPERFICIES.
1.1. Necesidad de la limpieza y desinfección de superficies.
En las industrias alimentarias las materias primas y alimentos elaborados entran en contacto con
multitud de superficies de conducciones, recipientes, cintas transportadoras, paletas y cuchillas
de homogeneizadores y otros utensilios. Estas superficies son focos potenciales de
contaminación microbiológica. También lo son las paredes, techo y suelo. Entre las medidas de
un programa de garantía de calidad microbiológica debe incluirse un plan de limpieza y
desinfección frecuente de todas las superficies mencionadas. Hay que prestar especial atención a
la limpieza y descontaminación de los lugares menos accesibles; los restos de alimentos
acumulados en estos lugares constituyen un microambiente ideal para la supervivencia y
multiplicación de los microorganismos debido a que:
a) Las proteínas de los alimentos proporcionan nutrientes e inactivan muchos desinfectantes que
consiguen penetrar en estas partes poco accesibles.
b) Las grasas de los alimentos forman una barrera protectora frente a detergentes y
desinfectantes.
Además de llevar a cabo el plan de limpieza y desinfección, es necesario evaluar
periódicamente la eficacia de dicho plan. Esto es necesario para descubrir las deficiencias en el
procedimiento de limpieza y desinfección con el objeto de tomar las medidas correctoras
adecuadas.
La flora más importante a controlar en superficies son aerobios totales y por supuesto otros
patógenos posibles.
1.2. Técnicas de recuento
Hay que tener en cuenta en primer lugar que muchos de los microorganismos viables presentes
en estas superficies se encuentran dañados de modo subletal debido a tratamientos térmicos, a
daños mecánicos o por contacto con antimicrobianos químicos. Las técnicas analíticas
empleadas deberían seguir estas normas:
a) Evitar el empleo inicial de medios selectivos, pues en ellos incluso los microorganismos que
en condiciones normales crecerían con normalidad, lo harán con dificultad o no lo harán en
absoluto en caso de estar dañados. Deben usarse medios generales o enriquecidos para los
recuentos y recuperaciones, posponiendo el empleo de medios selectivos para etapas más
avanzadas de la identificación.
b) En las técnicas denominadas "de lavado" (que se estudiarán a continuación) el diluyente
empleado debe ser agua de peptona tamponada, que a 25 °C y durante dos horas como máximo
permite una revivificación adecuada para casi todos los fines. No debe permitirse una
prolongación del tiempo de revivificación porque las bacterias comenzarían a reproducirse y se
obtendrían recuentos falsamente elevados.

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Podemos establecer tres grandes grupos de técnicas:
• Técnicas de impresión,
• Técnicas de frotado.
• Técnicas de lavado.
A continuación estudiaremos de modo muy somero el fundamento de estas técnicas y algunos
de los materiales empleados.
a) Técnicas de impresión.
Se basan en el empleo de un agar de contacto o placas de contacto: es un medio de cultivo
sólido que se oprime sobre la superficie (plana o casi plana) a estudiar y después se retira.
Debido a la humedad de la superficie del agar, una parte notable de las bacterias, esporas y otra
flora presente quedará adherida al mismo al retirarlo de la superficie estudiada. A continuación
se incuba el agar de contacto y se procede a un recuento de colonias.

Los resultados pueden expresarse como número de ufc/cm². Entre los métodos de impresión
más utilizados podemos mencionar las placas Rodac. Estas técnicas pueden criticarse porque
sólo recuperan una parte de los microorganismos presentes, ya que una parte de ellos continúa
adherido a la superficie estudiada tras retirar el agar de impresión. En este sentido, las técnicas
destructivas (técnicas que destruyen la muestra, como la homogeneización de un alimento) son
más exactas. Sin embargo, los resultados de las técnicas de impresión deben evaluarse de modo
semicuantitativo y relativo. De este modo, sí informan del estado higiénico de las superficies
estudiadas. De hecho, son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria. A continuación se
incuban a 31º±1ºC durante 3 días.
Hay que conocer los límites de aceptabilidad:

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 Clasificación
Nº de colonias
Evaluación del desarrollo
en 16 cm2
microbiano
0 - Ausencia
1-9 +- Mínimo
10-20 + Ligero
21-100 ++ Moderado
>100 +++ Considerable
incontables +++ Considerable

También se usan laminocultivos easycult que se pueden utilizar por el método de inmersión o
por el de impresión.
b) Técnicas de frotado.
Consiste en el frotado sistemático de una porción medida de la superficie a estudiar (suelen ser
25 cm², 5 cm2, etc.) con hisopo de algodón. Después el hisopo se deja reposar sumergido en un
volumen conocido de agua de peptona y se agita a intervalos para que vaya desprendiendo los
microorganismos que se le hayan adherido al frotar. Después se siembran en superficie (0,1 ml)
o en masa (1 ml) volumenes de la suspensión en placas de agar estándar de recuento en placa.
Se incuba, se realiza el recuento y se hacen los cálculos pertinentes.

Los recuentos obtenidos generalmente son unas 10 veces más altos que los proporcionados por
las técnicas de impresión sobre una superficie plana. Por otra parte, esta técnica es útil también
para superficies de formas caprichosas.
c) Técnicas de lavado.
Suelen usarse para recuento en superficies interiores de recipientes (botellas que se usarán para
envasar leche o refrescos, batidoras, utensilios, etc.). Se introduce un volumen grande de agua
de peptona en el recipiente a estudiar, se agita para lavar bien su interior y se extrae el agua de
peptona. Se siembran alícuotas de 0'1 y 1 ml de este agua de peptona en placas de PCA y se
incuban para recuento de aerobios mesófilos. Si es necesario, se hacen las diluciones adecuadas.
Los recuentos obtenidos pueden expresarse como número de ufc por recipiente.

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Por supuesto, puede decirse que los valores obtenidos siempre serán inferiores a los reales
porque los microorganismos bien adheridos a la superficie del recipiente no se desprenderán al
agitar con el agua de peptona. Sin embargo, concediendo un valor relativo a los recuentos
obtenidos, la técnica permite controlar el estado higiénico de los recipientes.
Un recuento elevado de colonias por las diferentes técnicas conducirá a una clasificación pésima
del ambiente de trabajo.
PROCEDIMIENTO 1
Nosotros vamos a llevar a cabo la técnica de impresión. Para ello y por grupo se tendrán dos
placas RODAC, una para aerobios (con agar APHA, agar nutritivo o PCA cromogénico) y otra
para levaduras o mohos con agar Sabouraud Cloranfenicol. Con cuidado se presionarán sobre la
superficie elegida unos 10 segundos y una vez retirada se tapará y se llevará a incubar. La placa
de microorganismos aerobios a 31º±1ºC durante 48-72 h y la de mohos y levaduras a 25º
durante 5 días. Una vez finalizada la incubación se procederá al recuento.
PROCEDIMIENTO 2.
Seleccionaremos la superficie que nos interese muestrear. Extraeremos la lengüeta de su envase
estéril y haciendo presión durante unos segundos tomaremos muestra de la superficie. Después
se gira y se toma muestra por el otro lado.
Se introducen a incubar a la temperatura requerida. El recuento se realiza por comparación con
las imágenes.

PROCEDIMIENTO 3.
En agar nutritivo o APHA o PCA plaqueado previamente se realiza una siembra de un líquido
(agua de peptona al 0,1% 100 ml por grupo) donde previamente hemos lavado por inmersión un
utensilio de cocina (tenedor, cuchara, trozo de bayeta, cuchillo de sierra, etc.) Esta siembra la
realizaremos en superficie para recuento posterior y por duplicado. Se incubará a 31º±1ºC 48-
72h.

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PROCEDIMIENTO 4.
Se va a preparar una máscara de cartulina de 10×10 de forma que en el centro quede un
cuadrado de 5×5 cm2.
Se envolverá completamente en papel aluminio y se esterilizará envolviéndola en papel de
aluminio en estufa a 140º durante 3 horas.
Por otro lado se va a preparar un tubo de ensayo con suero salino estéril.
1. Colocar la plantilla (10cm x 10cm) o 5×5 sobre la superficie a muestrear.
2. Humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar ligeramente en la pared del
tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de solución.
3. Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30º, frotar 4 veces la superficie delimitada por
la plantilla, cada una en dirección opuesta a la anterior. Asegurar el hisopado en toda la
superficie.
4. En el caso de utilizar la plantilla de 5cm x 5cm, repetir esta operación 3 veces más, en
lugares diferentes de la misma superficie, para obtener 100 cm2.
5. Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la parte del hisopo
que estuvo en contacto con los dedos del muestreador la cual debe ser eliminada. Se
incuba durante media hora y luego se inocula 0,1 ml sobre agar APHA en superficie.
6. Se incubará 31º±1ºC 48-72h.
7. Para superficies irregulares, en el caso de utensilios, se repetirá la operación con 3
utensilios más (total 4 como máximo), con el mismo hisopo, considerando el área que
está en contacto con el alimento o con la boca.
8. Si no se toman las 4 muestras, se debe anotar en la Ficha de Toma de Muestra.
Conservación y Transporte de la muestra
Las muestras se colocarán en un contenedor isotérmico con gel refrigerante, el cual se
distribuirá uniformemente en la base y en los laterales, para asegurar que la temperatura del
contenedor no sea mayor de 10°C, a fi n de asegurar la vida útil de la muestra hasta su llegada al
laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de muestra y la recepción en el laboratorio
estará en función estricta de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y
excepcionalmente las 36 horas.
Se deberá registrar la temperatura del contenedor al colocar las muestras y a la llegada al
laboratorio con la finalidad de asegurar que las mismas hayan sido transportadas a la
temperatura indicada. Las temperaturas superiores a 10°C invalidan la muestra para su análisis.

2. AMBIENTE
El control medioambiental microbiológico se realiza para verificar las condiciones de higiene
del aire ambiental en laboratorios, industrias, etc.
La flora que se controla habitualmente son los microorganismos aerobios mesófilos.

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Los factores que afectan a la calidad del aire en los ambientes cerrados suelen ser los siguientes:
a) Una ventilación inadecuada.
b) Contaminación interior.
c) Contaminación exterior.
d) Contaminación biológica.
e) Contaminación debida a materiales usados en la construcción.
Se utilizan métodos de control de la calidad del aire en los que el protocolo de actuación es:
Identificación del problema → Medición → Valoración
Se pueden usar varias técnicas:

1.1 Sedimentación en placa.

Se expone una placa con agar a temperatura ambiente durante un tiempo establecido (15’, 30’,
60’) en el lugar escogido para valorar el nivel de microorganismos medioambientales, se tapan
luego y se incuban.
Se realiza el recuento que será cualitativo. Si se realiza en distintos puntos de un recinto se
puede valorar la zona con mayor o menor contaminación.
Los límites de aceptabilidad dependen del lugar y la toma de muestras en que se realiza el
control. No existen límites prefijados por una ley determinada, dependerá del sitio a evaluar. No
será igual el límite en un recinto hospitalario que en unas oficinas o en una planta de producción
farmacéutica.

1.2 Filtración-Impactación. S.A.S. (surface air system)

El recuento se realiza en el mismo sitio donde se toma la muestra.
Se necesita tener un sistema de filtración por aspiración, es decir se conecta a una bomba de
vacío durante un tiempo determinado. El aire pasa por uno a más tamices de diámetro de poro
variable donde los microorganismos quedan atrapados en la superficie de una o más placas de
contacto con el medio deseado.
Posteriormente se extraen las placas y se incuban para contar las placas expresando los
resultados como ufc/m3 de aire. Este impactador opera generalmente a 28 l/min durante 60 a
300 segundos.
También hay sistemas de colocación de filtros de tamaño de poro adecuados por los que al pasar
el aire, los microorganismos se quedan atrapados. Después se saca el filtro y se introduce en una
placa con el medio adecuado.

1.3 Recogida en medio acuoso.

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Se hace borbotear el aire a través de una solución isotónica donde los microorganismos quedan
suspendidos procediendo después a su incubación por los métodos habituales, diluciones
decimales, etc. Los resultados se suelen dar como u.f.c/m3 o u.f.c/h.

PROCEDIMIENTO 5.
Se va a realizar una exposición para controlar la salud ambiental de los espacios por
sedimentación durante 30 minutos.
Se repartirán unas placas que se dejarán abiertas durante 30 min.
Se van a preparar en placa petri dos medios por ambiente a estudiar. Una con agar APHA y otra
con agar Sabouraud Cloranfenicol.
La placa con agar APHA se incubará 72 h a 31º±1ºC y la de Sabouraud a 25º durante 3-5 días
sin invertir.

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