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HEMATOLOGIA ARGENTINA

ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LA
SOCIEDAD ARGENTINA DE HEMATOLOGÍA
Esta revista está indizada en la Base de Datos LILACS, BIREME, BRASIL
ISSN: 0329-0379

Presidente: Jorge Milone Vice-Presidente: Moira Lluesma Goñalons

Secretaria: María Gabriela Flores Tesorero: Luis Palmer

Carlos Ponzinibbio
Director

Gustavo Kusminsky, Buenos Aires

Secretario de Redacción

Comité de Redacción

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Dorotea Fantl, Buenos Aires Carlos Ponzinibbio, Buenos Aires

CONSEJO CIENTÍFICO ASESOR

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Pedro Bustelo, Bs. As.
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Fernando Cavagnaro, Bs. As.
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Valentín Labanca, Mendoza
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Jorge Milone, Bs. As.
Arturo Musso, Bs. As.
Elsa Nucifora, Bs. As.
Emilio Palazzo, Córdoba
Santiago Pavlovsky, Bs. As.
Raúl Pérez Bianco, Bs. As.
Lorenzo Pérez Polo, Mendoza
Marco Pizzolato, Bs. As.
Julio C. Sánchez Avalos Bs. As.
Norma Tartas, Bs. As.
Miguel Tezanos Pinto, Bs. As.

VOLUMEN 14 Nº 1 ● ENERO-MARZO ● 2010

Edición: Sociedad Argentina de Hematología: Julián Alvarez 146 - C1414 DRD - TEL/FAX: 4855-2452
e-mail: sah@sah.org.ar
Hematología se distribuye cuatrimestralmente en forma gratuita a los miembros de la Sociedad Argentina de Hematología
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El contenido de los artículos y de los avisos publicitarios no reflejan necesariamente la opinión del Editor
2 HEMATOLOGIA ● Volumen 1 - Nº 1, 1996

HEMATOLOGIA ARGENTINA

VOLUMEN 14 Nº 1 ● ENERO-MARZO DE 2010

CONTENIDO

IMÁGENES EN HEMATOLOGÍA
Alteraciones morfológicas plaquetarias en microscopía electrónica. Luego de buceos simulados en
cámara hiperbárica
E. Paoletti, C. Espinosa, R Laguens, G. Mauvecin, Diana García, M.E. Paoletti, C.W. García ............................. 1

EDITORIAL
Homenaje al Maestro
Comité Editor ............................................................................................................................................................. 3

ARTÍCULOS ORIGINALES
Resultados del tratamiento de leucemias linfoblásticas agudas recaídas en pediatría. Experiencia en
una institución
Myriam R. Guitter, Elizabeth M. Alfaro, Jorge Rossi, Marta Gallego, Cristina Alonso, María S. Felice .............. 4

Señales de sobrevida inducidas por el complejo IL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico. Influencia de

la mutación JAK2-V617F
Carlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim, Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta .............. 11

INFORMACIÓN GENERAL .................................................................................................................... 18

REGLAMENTO DE PUBLICACIONES ................................................................................................... 20

Edición realizada por Estudio Sigma S.R.L. - J. E. Uriburu 1252 - 8º F - Buenos Aires - Tel.: 4824-9431 / 4821-2702
E-mail: estsigma@gmail.com - www.estudiosigma.com.ar
Impreso en el mes de Marzo de 2010
 Alteraciones morfológicas plaquetarias
en microscopía electrónica. Luego de buceos
simulados en cámara hiperbárica
E. Paoletti***, C. Espinosa****, R Laguens**, G. Mauvecin****,
Diana García*, M.E. Paoletti*, C.W. García IMAGEN
*Clínica 25 de mayo, **Fundación Favaloro,
***Universidad FASTA,****Escuela de Buceo ARA.
Mar del Plata

Fecha de recepción: 8/10/09 HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 1

Fecha de aprobación: 15/11/09 Enero-Marzo, 2010

Evaluamos desde 1982 la función

plaquetaria en grupos de alumnos de la
Escuela de Buceo de la Armada Argen-
tina luego de buceos simulados en cáma-
ra hiperbárica y con tiempos de inmer-
sión y emersión normales y observamos
un aumento de la agregación plaquetaria.
Comprobamos In Vivo, por micros-
copía electrónica cambios en la morfolo-
gía plaquetaria con desaparición de mi-
crovellosidades y adopción de forma
cóncavo-convexa, que les confiere aspec-
to falciforme y pérdida de granulaciones
α y densas. La degranulación podría ser
atribuida a activación plaquetaria, por la
aparición de microburbujas del gas iner-
te (N2) de la mezcla respiratoria en la Fig. 1. Plaquetas normales, previas a inmersión simulada.
sangre, que fue previamente disuelto en
los tejidos.
Se obtuvo PRP centrifugando 30 mi-
nutos a 1000 g. El sedimento puesto en
2.5% glutaraldehido en 0.1 M buffer
fosfato, pH 7.2, post-fijado en tetraóxido
de osmio 1% e incluido en resina epoxy.
Se obtuvieron cortes ultra finos, colorea-
dos con nitrato de plomo y estudiado en
microscopio electrónico de transmisión.
Esa activación de la función plaque-
taria en buceos con descompresiones
controladas podría ser el factor desen-
cadenante de la formación de micro-
trombos que, de alguna manera, afectan
ciertas zonas de la microcirculación pro-
vocando entre otras cosas la osteone-
crosis disbárica.
1. Undersea Biomed Res 1987 Jan; 14 (1): 45-58 Fig. 2. Plaquetas post inmersión
 Homenaje Al Maestro

Es bueno que los testimonios permanezcan asentados en pluma y pa-

pel para generaciones futuras.
Es bueno que quienes comienzan a recorrer el camino de la especiali-
dad que amamos, sepan que ha habido personas que lo han hecho en pro-
longada trayectoria y lo siguen haciendo con entusiasmo y dedicación. EDITORIAL
Es bueno que se reconozca públicamente a esas personas, aquellas que
sin proponerse la alabanza propia como meta u objetivo particular, reci-
ban el justo homenaje de la confraternidad profesional.
Es por ello que desde estas páginas deseamos resaltar el otorgamien-
to de la distinción por parte de la Academia Nacional de Medicina «Pre-
mio Hipócrates» a nuestro colega, el Profesor Julio César Sánchez Avalos
como público reconocimiento a su trayectoria en la Hematología.
Nada más justo.
Sánchez Avalos, como habitualmente le llamamos, supo abrazar con una
pasión singular su carrera profesional y ha sobresalido en ella desde su
mismo inicio. Y no porque haya buscado que errantes haces de luz se po-
sen sobre su figura, sino, por el contrario, porque ha sido y es -en sí mis-
mo- una fuente de luz, un faro permanente que ha sabido conducir a buen
puerto a un gran número de hematólogos. Su inteligencia y clarividencia
para percibir lo esencial de la especialidad, su conocimiento adquirido con
el estudio constante, su capacidad de observación y gran sensibilidad siem-
pre han estado a disposición de quien lo quisiera tomar. Su generosidad
sin límites, su trato llano y amable y su experiencia lo han ido modelando
como el verdadero maestro de varias generaciones de hematólogos.
Su compromiso con la Sociedad Argentina de Hematología nació jun-
to a ella y ha sabido mantenerse con una fidelidad infatigable, completa-
mente despojada de desencuentros personales o animadversiones. Su an-
helo por formar orgánicamente a los jóvenes hematólogos lo llevó junto a
entusiastas colegas a fundar el Curso para la formación de Hematólogos,
curso de más de 30 años de continuidad y hoy, Carrera universitaria, cuna
que arrulló a una buena parte de los que hoy integramos esta Sociedad.
Justamente, la amable presentación hecha por el Académico Miguel de
Tezanos Pinto, enfatizó la prolongada y fecunda trayectoria del Dr. Sánchez
Avalos fruto de su sensible personalidad, amor por la medicina e infati-
gable capacidad de trabajo. Muchos pacientes han sabido beneficiarse de
sus talentos, pero también muchos colegas lo han hecho, y que bueno!
Al tiempo de pronunciar sus palabras de agradecimiento, el Dr.
Sánchez Avalos intentó destacar que si algún mérito le cabía, debía ser en
buena medida por el apoyo perseverante de sus colaboradores y el soste-
nido impulso de la comunidad hematológica. Como de costumbre, con su
característica humildad quiso que ésta fuera una distinción para todos los
hematólogos.
Su ejemplo honra y distingue a la Sociedad Argentina de Hematología.
La perseverancia, la construcción constante y el sucesivo aporte que
cada uno añade para el bien común, construyen los peldaños de la escale-
ra por la que sube y progresa una Institución.
Que quede escrito.
HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 3
Comité Editor Enero-Marzo, 2010
Señales de sobrevida inducidas por el complejo
IL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico.
Influencia de la mutación JAK2-V617F
Carlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim,
Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta ARTÍCULOS
ORIGINALES
Hematología Investigación, UE IDIM-CONICET, Instituto Lanari, UBA.
Combatientes de Malvinas 3150 C.A.B.A. CP 1427. Tel 011-4523-8947
Correspondencia a: Dra. Rosana F. Marta. rfmarta2005@gmail.com

Fecha de recepción: 10/10/09 HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 11-17

Fecha de aprobación: 30/10/09 Enero-Marzo, 2010

RESUMEN favorece la sobrevida de los progenitores megacariocí-

La IL-6 actúa a través del receptor de membrana y del
soluble (IL-6sR) que confiere sensibilidad a células sin
receptor de membrana. Previamente reportamos aumen-
to de IL-6sR en trombocitemia esencial (TE), una neo-
plasia mieloproliferativa (NM). En este trabajo se evaluó
la acción del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) comparado
con la IL-6 en su capacidad de protección de la apoptosis
de progenitores CD34+ normales y de NM y de activa-
ción de JAK/STAT en plaquetas normales y de NM. Se
evaluó expresión de fosfatidilserina por marcación con
anexina V y de caspasa 3 activada en células CD34+ de
sangre periférica de NM y de cordón umbilical como con-
trol, y activación de JAK2 y STAT3 por western-blot con
anticuerpos contra las proteínas fosforiladas y sin fosfo-
rilar. En conjunto, los progenitores CD34+ de pacientes
y controles tuvieron menos apoptosis con COMP que con
IL-6 (activación de caspasa 3 p=0.001, 7 normales, 4 pa-
cientes; expresión de anexina V p=0.029, 6 normales, 5 pa-
cientes; Rangos señalados Wilcoxon) La activación de
JAK2 y STAT3 en plaquetas se evaluó calculando la re-
lación (Rel) de intensidad de la banda de la proteína
fosforilada respecto del total estimulada por COMP (Rel
COMP) y por TPO (RelTPO), obteniéndose el cociente
(Rel COMP/TPO). Los pacientes JAK2V617F + tuvieron
aumento de Rel COMP/TPO del STAT3, 2.03 (0.45-3.03)
(mediana y rango) (n=4), respecto de controles 0.63 (0.014-
0.8) (n=5) y pacientes no mutados, 0.75 (0.005-1.12) (n=5)
(ANOVA p=0.018). La activación de JAK2 siguió una ten-
dencia similar a STAT3 aunque no alcanzó diferencias
significativas.
Los resultados sugieren que el COMP es más efecti-
vo que la IL-6 en la protección de la apoptosis de los pro-
genitores CD34+. Esto junto al hallazgo de aumento de
IL-6sR en TE, sugerirían que un mayor nivel de IL-6sR
ticos en NM. La protección ocurriría a través de JAK2 y
STAT3 siendo más eficiente en pacientes JAK2V617F+.
Palabras clave: Receptor de interleuquina 6, Plaquetas,
JAK2-V617F, Progenitores hematopoyéticos, Apoptosis.
INTRODUCCIÓN
La trombopoyetina (TPO) es la principal citoquina
estimulante de la megacariopoyesis. Sin embargo, se
han descrito algunos otros factores “TPO indepen-
dientes” capaces de inducir el desarrollo megacario-
cítico, entre ellos la interleuquina 6 (IL-6)1.
La IL-6 actúa a través de su receptor específico
(IL-6Rα) en la membrana de las células blanco que
se asocia con una glicoproteína llamada gp130, en-
cargada de la transducción de la señal intracelular.
La activación y homodimerización de la gp130 indu-
ce fosforilación de Janus quinasas (JAKs), favorecien-
do la activación de signal transducers and activators of
transcription (STATs). Esta ruta de señalización es ac-
tivada también por TPO y por otras citoquinas que
utilizan la gp130 para la transducción de la señal
intracelular. Existe además una forma soluble del
receptor (IL-6sR) que al unirse a la IL-6 es capaz de
desencadenar la transducción de la señal en células
que no poseen IL-6Rα, como las células endoteliales,
y ampliar así el espectro celular sobre el que la IL-6
ejerce su acción. Este mecanismo se denomina trans-
señalización2. El IL-6sR se une a su ligando con afi-
12
nidad similar al IL-6Rα, actuando de manera
agonista y siendo capaz de prolongar la vida media
de la IL-6. El mecanismo de trans-señalización a tra-
vés del IL6-sR se encuentra implicado en numerosas
patologías en donde actúa facilitando la acción
antiapoptótica de la IL-6. La activación de las seña-
les intracelulares inducida por IL-6 es de importan-
cia en la producción de progenitores hematopoyéticos
inmaduros y comprometidos con el linaje mega-
cariocítico3.
Las neoplasias mioloproliferativas crónicas (NM)
son un grupo de enfermedades que se caracterizan
por un aumento de la proliferación de alguno de los
linajes mieloides. Así, la policitemia vera (PV) se
identifica por una exacerbación de la serie eritroide,
la trombocitemia esencial (TE) por un aumento de la
serie megacariocítica y la mielofibrosis primaria (MP)
por fibrosis medular y desarrollo mieloide extrame-
dular4. En los últimos años, el descubrimiento de la
mutación V617F en la tirosinquinasa JAK2, con dife-
rentes frecuencias en cada una de estas tres entida-
des, ha puesto en evidencia que son patologías con
diferencias fenotípicas pero que comparten ciertas
características genéticas. Los factores que determinan
el desarrollo de cada uno de estos tres desórdenes no
están totalmente dilucidados. La mutación V617F en
el dominio autoinhibitorio de la quinasa, induce un
aumento de la actividad de la misma, provocando
activación constitutiva en líneas celulares5 y creci-
miento independiente de citoquinas in vitro6.
En un trabajo previo7 describimos el aumento
plasmático del IL-6sR en pacientes con TE. Dada la ca-
racterística agonista del IL-6sR y la amplia participación
de su ligando en la megacariocitopoyesis, en el presen-
te trabajo se evaluó la actividad del complejo IL-6/IL-
6sR (COMP) y de la IL-6 por sí sola en la protección de
la apoptosis de células progenitoras CD34+ normales
y de pacientes con NM, así como la activación de las
rutas de señalización JAK/STAT en plaquetas norma-
les y de pacientes con NM portadores de la mutación
JAK2V617F y negativos para la misma (JAK2WT).
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes y controles
Los pacientes se diagnosticaron de acuerdo a los
criterios del PVSG, utilizándose únicamente muestras
de pacientes libres de tratamiento. Se estudiaron 15
pacientes, 12 con TE, 2 con PV y uno con MP. Los
progenitores hematopoyéticos CD34+ normales se
obtuvieron de sangre de cordón umbilical humano de
partos a término de embarazadas sin antecedentes de
enfermedad hematológica. La recolección de estas
muestras se realizó en el Hospital Materno Infantil
HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010
de San Isidro. Las muestras de plaquetas normales
se obtuvieron de individuos sanos que no habían
ingerido medicación alguna en los últimos 8 días.
Este proyecto cuenta con la aprobación del comi-
té de ética del Instituto de Investigaciones Médicas
A. Lanari, y del Hospital Materno Infantil de San Isi-
dro. Tanto pacientes como controles normales firma-
ron el consentimiento informado correspondiente.
Muestras biológicas
Progenitores hematopoyéticos CD34 positivos: los
progenitores hematopoyéticos CD34+ normales se
obtuvieron recogiendo la sangre de cordón umbilical
en tubos estériles conteniendo buffer anticoagulante
BAC (PBS, 1mM EDTA, 50 U/ml heparina). Los pro-
genitores CD34+ de pacientes con NM se obtuvieron
a partir de sangre periférica utilizando el mismo
anticoagulante.
Plaquetas: las plaquetas de pacientes y controles
normales se obtuvieron de sangre periférica anticoa-
gulada con BAC suplementado con inhibidores de la
activación plaquetaria y se aislaron por método con-
vencional. El plasma rico en plaquetas fue filtrado
por filtros desleucocitantes (Purecell PL, Pall Biome-
dical Products, East Hills, NY, USA) para descartar
la presencia de glóbulos blancos.
Purificación de progenitores CD34+
Los progenitores se purificaron por método inmu-
nomagnético de selección positiva miniMACS utili-
zando un anticuerpo directo anti-CD34 unido a es-
feras metálicas (Myltenyi Biotec GMBH Alemania).
Estudios de apoptosis en células progenitoras CD34+
Activación de caspasa 3 por citometría de flujo:
Para este ensayo se hizo proliferar a las células
CD34+ cultivándolas por un periodo de 48 hs en me-
dio IMDM suplementado con suero fetal bovino 2%,
BSA 1.5%, transferrina saturada de hierro 200 µg/ml,
Stem Cell Factor 25 ng/ml, lípidos sonicados, en pre-
sencia de penicilina y estreptomicina. Después de la
proliferación las células fueron lavadas con PBS/
BSA/EDTA y cultivadas durante 12 hs en medio con-
dicionado IMDM, deprivado de nutrientes, como
base para inducir apoptosis, o bien el mismo medio
con el agregado de 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/ml
de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR (citoquinas provenien-
tes de R&D Systems, Minneapolis, USA). Después de
este periodo se realizó la marcación de las células
progenitoras con CD34 FITC y CD45 PerCP por 30
min. a temperatura ambiente para la selección de la
población. Luego las células marcadas fueron lava-
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO
das y se procedió a la fijación y permeabilización
utilizando un kit comercial (PharMingen TM), para la
posterior marcación intracitoplasmatica de caspasa 3
activada con un anticuerpo monoclonal unido a PE
(Becton Dickinson, San José, CA, USA). Los resultados
se expresaron como porcentaje de marcación de caspasa
3 activada en las células expuestas a los distintos trata-
mientos (IL-6 sola o complejo IL-6 + IL-6sR) respecto a
la marcación obtenida en las células cultivadas en
IMDM sin el agregado de citoquinas, que fue conside-
rada como el 100% de activación de caspasa 3.
Expresión de fosfatidilserina: las células CD34+
purificadas se cultivaron en medio deprivado de
nutrientes como metodología para inducir apoptosis.
Los cultivos se realizaron durante 16 hs a 37 °C en
medio IMDM sólo y con el agregado de 100 ng/ml
de IL-6 o 100 ng/ml de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR.
La concentración celular sembrada fue de 50000 cé-
lulas/well/ml. Pasado el tiempo de incubación las
células fueron cosechadas, lavadas e incubadas con
Anexina V unida al fluorocromo FITC e ioduro de
propidio. La Anexina V se une a la fosfatidilserina que
se expone en la cara externa de la membrana plas-
mática cuando la célula entra en apoptosis, mientras
que el ioduro de propidio penetra en las células en las
que la integridad de su membrana ha sido alterada,
como es el caso de las células necróticas y apoptóticas
tardías. Para este estudio se utilizó un kit comercial
(Becton-Dickinson) según las recomendaciones del fa-
bricante. Los resultados se expresaron como porcen-
taje de células apoptóticas totales (apoptosis tempra-
na representada por eventos anexina V positivos,
ioduro de propidio negativos, más apop-tosis tardía,
representada por eventos anexina V positivos, ioduro
de propidio positivos).
Estudio de fosforilación de proteínas plaquetarias
Para el estudio de fosforilación de proteínas, las
plaquetas filtradas se ajustaron a 1.106/ul. Se estimu-
laron 200 ul de esta suspensión plaquetaria con a) 100
ng/ml IL-6, b) 100 ng/ml IL-6 + 200 ng/ml IL-6sR,
c) 100 ng/ml TPO. Las muestras se incubaron 10
minutos a 37° C, se lisaron con buffer de lisis M-Per
(Pierce Biotechnology, Rockford, USA) y se agrega-
ron inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las mues-
tras fueron centrifugadas a 4 °C 10 min a 14000 rpm.
Las proteínas plaquetarias se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida y se realizaron
western-blots utilizando anticuerpos específicos con-
tra las proteínas JAK2 y STAT3 fosforiladas y sin
fosforilar (Cell Signalling, Beverly, MA y Santa Cruz
Biotechnology).
Para evaluar el grado de activación de JAK2 y
STAT3 en plaquetas, se calculó la relación (Rel) divi-
13
diendo la intensidad de la banda correspondiente al
JAK2 o STAT3 fosforilados por la del JAK2 o STAT3
total, tanto en la muestra estimulada con el comple-
jo (RelCOMP) como en la estimulada por TPO
(RelTPO) y luego se obtuvo el cociente entre ambas
relaciones con el fin de relativizar el grado de fosfo-
rilación del complejo respecto a TPO (RelCOM/TPO).
Estadística
Los resultados se expresaron como mediana y
rango. Para la comparación de la expresión de
caspasa 3 activada y anexina V con los distintos tra-
tamientos se utilizó el test de rangos señalados de
Wilcoxon que compara muestras apareadas. Para
analizar si la protección frente a la apoptosis era dis-
tinta entre pacientes y controles se utilizó el test de
suma de rangos de Wilcoxon. La comparación del
grado de activación de JAK2 y STAT3 entre pacien-
tes JAK2V617F, JAK2WT y controles normales se rea-
lizó mediante el análisis de varianza.
RESULTADOS
Evaluación de la apoptosis de progenitores CD34+
Activación de caspasa 3
En conjunto, los progenitores hematopoyéticos de
pacientes y controles mostraron una menor activación
de caspasa 3 al ser estimulados con el COMP, media-
na 82.9%, rango 47.7-103.8%, respecto a la IL-6,
100.0% (76.1-142.0) (p=0.001; 7 normales, 4 pacientes).
Al compararse los resultados entre pacientes y con-
troles, se observó que no había diferencias en el gra-
do de protección del COMP respecto de la IL-6 entre
ambos grupos. En la Fig. 1A se muestran los resulta-
dos en el grupo de pacientes y controles normales por
separado. En la Fig. 1B se muestra un ejemplo repre-
sentativo de la activación de caspasa 3 obtenida en
presencia del COMP y de IL-6.
Expresión de Anexina V
De forma similar a lo observado para caspasa 3
activada, la expresión de anexina V fue menor en las
muestras estimuladas con COMP, 40.3% (12.9-83.7),
que en aquellas estimuladas con IL-6 sola, 51.4%
(22.4-77.3), p=0.029; (6 normales y 5 pacientes). Tam-
poco se observaron diferencias en la respuesta de los
pacientes respeto a los controles normales. En la Fig.
2A se muestran los resultados de los pacientes y con-
troles y en el Fig. 2B un ejemplo de la distribución
de los eventos anexina V positivos por citometría de
flujo.
14
Fig. 1.– Caspasa 3 activada en progenitores hematopoyéticos CD34+. (A) Porcentaje de activación de caspasa 3 inducido por IL6 o complejo IL6/
IL6sR (COMP) en pacientes (P) y controles normales (N) tomando como 100% de inducción de muerte la expresión de caspasa 3 activada en las
células cultivadas sin citoquinas. (B) Histograma representativo de la expresión de caspasa 3 activada en una muestra tratada con IL6 (histograma
de la derecha) y COMP (histograma de la izquierda).
De los 8 pacientes estudiados para apoptosis de
progenitores, solo uno fue portador de la mutación
JAK2V617F. Esto imposibilitó la realización del análi-
sis comparativo entre pacientes con y sin la mutación.
Activación de JAK2 y STAT3 en plaquetas
La activación de la ruta de señalización JAK2 y
STAT3 se estudió en muestras de plaquetas evaluan-
do las bandas de las proteínas fosforiladas en ausen-
cia de citoquinas y en presencia de a) IL-6, b) Com-
plejo IL-6/IL-6sR, c) TPO, citoquina estimulante de
la vía JAK2/STAT3. Tanto las plaquetas enfrentadas
con vehículo carente de citoquina como aquellas in-
cubadas en presencia de IL-6 no presentaron activa-
ción de JAK2 ni STAT3, demostrando la incapacidad
de la IL-6 por sí sola de transducir la señal en
plaquetas. En cambio, la estimulación con TPO y
COMP dió lugar a la aparición de bandas de proteí-
na fosforilada tanto para JAK2 como para STAT3.
La fosforilación de JAK2 inducida por TPO fue
semejante en los pacientes portadores de la mutación,
0.39 (0.20-0.80), en los pacientes no mutados, 0.59 (0.05-
1.86), y en los controles normales, 0.38 (0.01-0.75), Fig.
3A. En cambio, se observó mayor activación de JAK2
inducida por COMP en los pacientes JAK2V617F, 0.33
(0.008-2.25) respecto de los no mutados, 0.007 (0.005-
0.014) y los normales, 0.038 (0.004-0.07) aunque la
diferencia no fue estadística-mente significativa, Fig. 3B.
Cuando se analizó el nivel de fosforilación de
STAT3 se observaron las siguientes tendencias: al
inducir la activación con TPO los pacientes con la
mutación presentaron menor grado de fosforilación,
0.72 (0.009-2.10), que los no mutados, 1.08 (0.35-7.79)
y que los controles normales, 11.52 (0.18-21.80), Fig.
HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010
3C. Por el contrario, la fosforilación inducida por el
COMP fue mayor en pacientes JAK2V617F, 1.34 (0.69-
4.61), que en los JAK2WT, 0.39 (0.005-2.80) y que los
sujetos normales, 0.27 (0.11-1.84), Fig. 3D.
Al relativizar la activación inducida por el COMP
respecto a la TPO observamos mayor Rel COMP/
TPO para STAT3 en los pacientes JAK2V617F, 2.03
(0.45-3.03) (n=4), que en los pacientes negativos para
la mutación, 0.75 (0.005-1.12) (n=5) y en los contro-
les normales 0.63 (0.014-0.8) (n=5) (p=0.018), demos-
trando en el grupo mutado un aumento del nivel de
fosforilación de STAT3 inducida por el COMP. Los
niveles de fosforilación de JAK2 siguieron la misma
tendencia: pacientes JAK2V617F 1.16 (0.02-2.81), pa-
cientes JAK2WT 0.01 (0.01-0.14), normales 0.22 (0.1-
0.34), Fig. 3E. En la figura 3F se muestra un ejemplo
representativo de la activación de STAT3 en un pa-
ciente JAK2V617F y en uno JAK2WT.
DISCUSIÓN
Los resultados del presente trabajo indican que el
complejo IL-6/IL-6sR es más efectivo que la IL-6 por
sí sola en la protección de la apoptosis de los proge-
nitores hematopoyéticos tanto normales como de
pacientes con NM. Esta diferencia podría basarse en
el hecho de que la IL-6 requiere del receptor especí-
fico de membrana IL-6Rα, que, en los progenitores
CD34+ de las muestras estudiadas en este trabajo,
tuvo una expresión baja, no superando el 12% (da-
tos no mostrados). En cambio, la expresión ubicua de
la gp130 encargada de transducir la señal intrace-
lular, posibilita la respuesta frente al complejo IL6/
IL6sR. Las rutas de señalización involucradas en este
efecto serían JAK/STAT y PI3K/AKT.
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO 15

Fig. 2.– (A) Porcentaje de expresión de anexina V (apoptosis temprana y tardía) inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) y
controles normales (N). (B) Marcación para anexina V en el eje X y la incorporación de ioduro de propidio en el eje Y. Los eventos comprendidos en
el cuadrante inferior derecho son AV+IP-, y representan las células en apoptosis temprana. Los eventos en el cuadrante superior derecho AV+IP+
corresponden a las células en apoptosis tardía.

El aumento del IL-6sR plasmático que describi-
mos previamente en pacientes con TE (7) nos indujo
a estudiar su repercusión en las vías de señalización
de IL-6. Debido a la dificultad en la obtención de la
cantidad suficiente de progenitores CD34+ necesarios
para realizar los estudios de activación de JAK/STAT
utilizando esta metodología, se buscó otro tipo celu-
lar que perteneciera a la estirpe afectada y que fuera
de fácil obtención. Las plaquetas presentan la venta-
ja de poder obtenerse fácilmente, en cantidad sufi-
ciente y podrían tomarse como reflejo de la trans-
ducción de la señal corriente abajo de la IL-6 en el
linaje megacariocítico.
La fosforilación de STAT3 inducida por el comple-
jo IL-6/IL-6sR fue mayor en las plaquetas de los pa-
cientes JAK2V617F que en los no mutados y en los
controles sanos, demostrando un aumento de la ca-
pacidad de activación de esta vía por el complejo.
Contrariamente, la TPO indujo menor activación de
STAT3 en los pacientes positivos para la mutación.
Moliterno y colaboradores han demostrado que los
pacientes con TE JAK2V617F+ tienen menor expre-
sión del receptor Mpl en plaquetas que aquellos ne-
gativos para la misma, existiendo una correlación
inversa entre la carga alélica de JAK2V617F y la ex-
presión del receptor Mpl en NM8. Esto podría suge-
rir que el aumento relativo de la fosforilación de
STAT3 inducida por el COMP respecto de TPO en
pacientes con la mutación de JAK2 se deba también
a una menor actividad de TPO por la disminución de
su receptor Mpl. La evaluación de los niveles de Mpl
plaquetario en todos los pacientes incluidos en el
estudio está en curso para aclarar este punto. En con-
junto, estos resultados sugieren que la señalización
16 HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010

Fig. 3.– Fosforilación de JAK2 y STAT3 en plaquetas. (A-D) Mediana y rango de la relación de intensidad de las bandas fosforilada y total para cada
proteína (JAK2 y STAT3) inducida por TPO y COMP en los pacientes portadores de la mutación JAK2V617F, no mutados (JAK2WT) y controles
normales (NORM). (E) Mediana y rango de la relación de fosforilación inducida por COMP respecto a TPO ( Rel COMP/TPO) para el STAT3 y el
JAK2 en los distintos grupos. (*) diferencia estadística entre el grupo JAK2V617F y los grupos JAK2WT y controles, p=0.018. (F) Western blot
representativo de la fosforilación de STAT3 en una muestra incubada con medio carente de citoquinas (línea 1), IL6 (línea 2), complejo IL6/IL6sR
(línea 3), TPO (línea 4), receptor soluble de IL6 solo (IL6sR, línea 6). En la línea 5 se muestra un control positivo de fosforilación.
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO
por JAK2/STAT3 en plaquetas de pacientes portado-
res de la mutación de JAK2 estaría más estimulada
por el complejo IL-6/IL-6sR que por trombopoyetina.
Majka y colaboradores9 describieron que la TPO y
la IL-6 protegen de la apoptosis a los progenitores
CD34+. En este trabajo demostramos que la presencia
de IL-6sR junto a la IL-6 es más efectiva que la IL-6
sola en su capacidad antiapoptótica. Si el patrón de
fosforilación que observamos en plaquetas fuera reflejo
de lo que ocurre en los progenitores, los pacientes
portadores de la mutación JAK2V617F podrían tener
un aumento de STAT3 fosforilado mediado por el com-
plejo IL-6/IL-6sR, lo que contribuiría, al menos en
parte, a la disminución de la apoptosis que caracteri-
za al clon hematopoyético en estos pacientes.
Majka demuestra, además, la capacidad de IL-6 de
inducir activación de STAT1, 3 y 5 en progenitores
CD34+ y megacarioblastos pero no en plaquetas. Del
mismo modo, nosotros tampoco obtuvimos fosforila-
ción de JAK2 ni STAT3 inducida por IL-6 sola en nin-
guna de las muestras estudiadas. Este resultado con-
cuerda con la ausencia de receptor de IL-6 (IL-6α) en
la membrana plaquetaria descrita por nuestro grupo
con anterioridad10. En cambio, el agregado de concen-
traciones equimolares de IL-6sR produjo una activa-
ción de JAK2 y STAT3 en las muestras de controles
normales y pacientes, revelando que la transducción
de la señal inducida por IL-6 en plaquetas ocurre
exclusivamente a través del complejo IL-6/IL-6sR. En
este contexto, el aumento de IL-6sR en TE cobra ma-
yor importancia fisiopatológica, ya que podría aumen-
tar la señalización intraplaquetaria mediada por IL-6,
potenciando así la activación plaquetaria inducida por
otros agonistas.
En conclusión, el complejo IL-6/IL-6sR es más efec-
tivo que la IL-6 en la protección frente a estímulos
apoptóticos, por lo que el aumento del nivel de IL-6sR
en trombocitemia esencial favorecería la sobrevida de
los progenitores hematopoyéticos CD34+ que dan
origen a los megacariocitos, contribuyendo al cuadro
característico de la enfermedad. Por otra parte, estimu-
laría señales de activación intraplaquetaria con mayor
eficiencia en pacientes JAK2V617F.
ABSTRACT
IL-6 acts through its membrane bound and soluble (IL-
6sR) receptors. The latter confers IL-6 sensitivity to cells
that lack the anchored receptor. Previously, we have
reported IL-6sR increase in essential thrombocythemia (ET),
a myeloproliferative neoplasm (MN). In the present work,
we evaluated the effect of IL-6/IL-6sR complex (COMP)
compared to that of IL-6, regarding its ability to protect
CD34+ progenitors form apoptosis and to activate JAK/
STAT in platelets, from both, MN patient and normal
samples. Altogether, progenitors from patients and controls
underwent less apoptosis in the presence of COMP than
with IL-6 (activated caspase 3 p=0.001; anexin V expression
17
p=0.029). JAK2 and STAT3 activation was evaluated by
western-blot comparing the phosphorylated and the total
protein induced by COMP (RelCOMP) and thrombopoietin
(RelTPO) and calculating the ratio (R COMP/TPO).
Patients harbouring JAK2-V617F had increased STAT3 R
COMP/TPO, 2.03 (0.45-3.03) (median, range) than controls,
0.63 (0.014-0.8) and patients without the mutation, 0.75
(0.005-1.12) ANOVA p=0.018. JAK2 activation showed the
same pattern but did not reach statistical significance.
These results suggest that COMP is more effective than
IL-6 in protecting hematopoietic progenitors from
apoptosis. These findings together with the increased IL-
6sR levels previously found in ET, suggest that high IL-6sR
levels could favour megakaryocytic progenitors survival in
MN. This protection would occur through JAK2/STAT3,
being more efficient in patients carrying the JAK2-V617F
mutation.
Key words: Interleukin 6 receptor, Platelets, JAK2-
V617F, Hematopoietic progenitors, Apoptosis.
Agradecimientos: Los autores de este trabajo agradecen
al Servicio de Obstetricia y Quirófano de Obstetricia del
Hospital Materno Infantil de San Isidro y especialmente a
Sara Labat por la recolección de las muestras de sangre de
cordón umbilical. Este trabajo ha sido realizado con los
subsidios PIP 2004 número 5711 de CONICET, PICT 2002
número 11229 y PICT 2005 número 32075 de la Agencia
Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
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2008; 65: 212-22.
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is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role
in inflammation and cancer. J Leukoc Biol 2006; 80: 227-36.
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Hematopoietic abnormalities in mice deficient in gp130-
mediated STAT signaling. Exp Hematol 2002; 30: 1248-56.
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in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential
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cytokines binding to gp130 protein-coupled receptors, activates
MAPKp42/44, AKT, and STAT proteins in normal human
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mal platelets possess soluble interleukin 6 receptor. Cytokine
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4 HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010

Resultados del tratamiento de leucemias

linfoblásticas agudas recaídas en pediatría.
Experiencia en una institución
Myriam R. Guitter1, Elizabeth M. Alfaro1, Jorge Rossi2,
Marta Gallego3, Cristina Alonso1 y María S. Felice1 ARTÍCULOS
ORIGINALES
1
Servicio de Hematología y Oncología
2
Servicio de Inmunología y Reumatología
3
Servicio de Genética
Hospital Nacional de Pediatría “Juan P. Garrahan”
Combate de los Pozos 1881, Buenos Aires, Argentina
Tel/Fax 54-11-43084300 / 43085325, CPa1245
Correo electrónico: myriamguitter@yahoo.com

Trabajo premiado en categoría investigación clínica en el

XIX Congreso Argentino de Hematología

Fecha de recepción: 10/10/09 HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 4-10

Fecha de aprobación: 30/10/09 Enero-Marzo, 2010

INTRODUCCIÓN En el presente trabajo reportamos los resultados

ra
Las enfermedades malignas son la 1 causa de
muerte asociada a enfermedades en los pacientes
pediátricos en la Ciudad de Buenos Aires 1. Las
leucemias agudas constituyen un tercio de las
mismas, siendo la neoplasia más frecuente en la
población de pacientes menores de 15 años. El 75%
de las leucemias agudas son Leucemias Linfo-
blásticas Agudas (LLA); actualmente el 80% de los
niños con esta patología (en nuestro medio aproxi-
madamente el 70%3) logra curarse con quimioterapia
convencional, con mínimas secuelas2. El tratamiento
de elección para las LLA pediátricas es la quimio-
terapia, cuya intensidad se determina teniendo en
cuenta el riesgo de que los pacientes no respondan
al tratamiento, o respondan y luego la enfermedad
recaiga. Si bien aproximadamente el 97% de las LLA
de diagnóstico inicial alcanza la Remisión Completa
(RC) luego de la fase de inducción del tratamiento,
entre 25-30% de las mismas presenta una reaparición
de la enfermedad. Por lo tanto, la principal causa de
fracaso del tratamiento quimioterápico sigue siendo
en nuestros días la recaída de la enfermedad, y de
los niños que recaen no más del 30% podrá curarse
con un 2 do tratamiento. Tanto por su frecuencia,
relacionada con la incidencia general de las LLA en
pediatría, como por su respuesta al tratamiento y
pronóstico, las recaídas de LLA constituyen una
entidad diferente a las LLA de novo4.
del tratamiento de 172 pacientes evaluables ingre-
sados al Hospital Nacional de Pediatría “Juan P.
Garrahan” (HPG) que fueron tratados de acuerdo al
Protocolo LLA-REC 97, basado en la estrategia de
tratamiento del grupo BFM. Los objetivos principales
fueron evaluar los resultados de dicho tratamiento de
acuerdo a la respuesta al mismo, las características
de los pacientes, la duración de la 1ra RC, el inmuno-
fenotipo de la LLA y el sitio de la recaída5, 6.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó un análisis retrospectivo de los resul-
tados del Protocolo LLA–REC 97. Se revisaron las
historias clínicas y las bases de datos correspondien-
tes de 245 pacientes con recaída de LLA diagnosti-
cados y tratados en el HPG, desde Setiembre de 1994
hasta Agosto de 2009. Para el presente análisis no
fueron evaluables 73 (29%) pacientes debido a: haber
recibido diferentes tratamientos quimioterápicos (n:
36), administración de cuidados paliativos por tratar-
se de recaídas sin opciones terapéuticas (n: 26) y a no
contar con datos suficientes para su evaluación (n:
11). El diagnóstico de recaída se confirmó a través de
citomorfología de sangre periférica, médula ósea
(PAMO), LCR (PL) y, en los casos correspondientes
a infiltración testicular u otro sitio extramedular, a
través de material obtenido por punción con aguja
RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA
fina o biopsia del sitio comprometido. Se realizaron
además estudios citoquímicos, de citometría de flu-
jo para determinar el inmunofenotipo de los blastos
y estudios cito-genéticos/moleculares.
Los pacientes fueron estratificados en grupos de
riesgo de acuerdo al momento de la presentación de
la recaída, su localización y el inmunofenotipo de la
LLA inicial, definiéndose 3 grupos de riesgo basados
en la estrategia de los protocolos de tratamiento del
grupo BFM (Tabla 1).
El tratamiento quimioterápico (Grafico 1 y Tabla
2) incluía una prefase con prednisona como mono-
droga y un bloque de quimioterapia de alta inten-
sidad (como inducción de la RC), seguido por 5
bloques de intensidad similar, seguidos de radiote-
rapia de SNC preventiva (1200 cGy en todos los
pacientes), terapéutica (2500 cGy en los pacientes con
recaídas de SNC) y/o testicular terapéutica (2500-
3000 cGy en todos los pacientes con recaídas testi-
culares). Luego los pacientes recibían una fase de
mantenimiento rotacional semanal con 4 pares de
drogas quimioterápicas, hasta cumplir 2 años de
tratamiento desde el momento del diagnóstico de la
recaída. Todos los pacientes recibieron 1 dosis de
triple quimioterapia intratecal (TIT) al diagnóstico, y
1 dosis con cada uno de los bloques de quimio-
terapia (total 6 dosis). En caso de tratarse de recaídas
que comprometían el SNC, se administraban dosis
semanales de TIT hasta observarse al menos 2
determinaciones citológicas del LCR con menos de 5
células por ml, libres de blastos.
Los pacientes con recaídas de alto riesgo (grupos
REC2 y REC3) con donante idéntico familiar re-
cibían transplante de células precursoras hema-
topoyéticas (TCPH) como consolidación del trata-
miento.
La RC se determinaba por la ausencia de mani-
festaciones clínicas de la enfermedad, y de blastos
en sangre periférica, en LCR y en MO luego del blo-
que R1, al momento de la recuperación hemopo-
yética.
TABLA 1.– Estratificación en grupos de riesgo
Inmunofenotipo NO “T”
Localización Extra-MO MO y MOc
Tiempo
Muy tempranas
(hasta 18 m de la RC) REC 2
Tempranas
(18-30 m de la RC) REC 1
Tardías
(30-48 m de la RC) REC 1
Muy tardías
(+48 m de la RC) REC 1
5
Análisis estadístico
La respuesta a la fase de inducción se evaluó con-
siderando las siguientes tasas: pacientes que
alcanzaron la RC, pacientes que fallecieron durante
dicha fase, y pacientes que no respondieron a la
quimioterapia.
En el grupo de pacientes que alcanzaron la RC se
analizaron los eventos que presentaron (conside-
rándose eventos a las 2das recaídas de la enfermedad),
las muertes en RC y las 2das enfermedades malignas.
Los cálculos de las probabilidades de Sobrevida
Libre de Eventos (pSLE) y de Sobrevida Libre de
Leucemia (pSLL) según sitio y duración de la 1ra RC
se realizaron a través del análisis de Kaplan-Meier7
y se calculó el Error Estándar (EE) por el método de
Peto8. Las curvas de sobrevida se compararon a
través del test de log-rank9. La significación esta-
dística se calculó usando chi-cuadrado o test de
Fisher para las variables nominales, y test de Student
o test de Wilcoxon para las variables numéricas. La
significación estadística será expresada como valores
de p e intervalos de confianza del 95% (CI 95%).
RESULTADOS
Las características clínicas y de laboratorio de los
pacientes evaluables al momento de presentar una 1ra
recaída de su LLA se observan en la Tabla 3.
La respuesta a la fase de inducción fue: RC en 134
pacientes (78%), muerte durante la fase de inducción
en 20 pacientes (12%) y respuesta parcial/nula en 18
pacientes (10%). De los 134 pacientes que alcanzaron
la RC, 69 (52%) presentaron una 2da recaída de su
LLA, con una duración media de la 2da RC de 18,8
(rango: 0,7-88,8) m, 10 (7%) fallecieron en RC y 1
paciente presentó una 2da enfermedad maligna (PNET
en SNC). Las 2 das recaídas fueron en MO en 50
pacientes, extra-MO 14 (6 en SNC, 5 en testículo, 1
en ojo, 1 en mama y 1 en intestino) y MO combinada
(MOc) en 5 casos.
“T”
Extra-MO MO y MOc
REC 3 REC 3 REC 3
REC 2 REC 2 REC 3
REC 2 REC 1 REC 2
REC 1 REC 1 REC 2
6 HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010

TABLA 2.– Tratamiento

Drogas Dosis Días administración

Prefase
Prednisona (VO) 100 mg/m2 1 al 10
TITa adecuada por edad 1

Bloque R1
Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 5
6-Mercaptopurina (VO) 100 mg/m2 1 al 5
Vincristina (EV) 1.5 mg/m2 1y6
Metotrexato (EV infusión 24hs)b 1 g/m2 1
Citarabina (EV infusión 3hs) 2 g/m2 c/12hs 5
L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI/m2 6
TITa adecuada por edad

Bloque R2
Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 5
6-Mercaptopurina (VO) 100 mg/m2 1 al 5
Vincristina (EV) 1.5 mg/m2 1
Metotrexato (EV infusión 24hs)b 1 g/m2 1
Ifosfamida (EV infusión 1h)c 400 mg/m2 c/12hs 1 al 5
L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI 6
Daunoblastina (EV infusión 24hs) 50 mg/m2 5
TITa adecuada por edad

Bloque R3
Dexametasona (EV) 20 mg/m2 1 al 5
Citarabina (EV infusión 3hs) 2 g/m2 c/12hs 1y2
Etopósido (EV infusión 1 h) 150 mg/m2 3 al 5
L-Asparaginasa (IM) 25.000 UI/m2 6
TITa adecuada por edad

Mantenimiento rotacionald
Ciclofosfamida (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 1
Etopósido (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 3
6-Mercaptopurina (VO) 45 mg/m2/día x 7 semana 2
Metotrexato (VO) 1 g/m2 45 mg/m2/día x 1 semana 2
Citarabina (EV infusión 1h) 300 mg/m2/día x 1 semana 3
Tenipósido (EV infusión 1h) 150 mg/m2/día x 1 semana 3
Vincristina (EV) 1.5 mg/m2/día x 1 semana 4
Dexametasona (VO) 6 mg/m2/día x 7 semana 4
a
TIT: terapia intratecal
b
Rescates con leucovorina, 15 mg/m2 a las horas 48 y 54 del inicio de
la infusión de MTX
c
Mesna 300 mg/m2 en las horas 0, 4 y 8 de la infusión de Ifosfamida
d
Mantenimiento Rotacional, se repiten los 4 pares de drogas
rotándose por semana, todos los meses hasta cumplir 2 años de
tratamiento desde la fecha del diagnóstico de la recaída

Con una media de seguimiento de 49 (rango: 4-
155) m, continúan en RC 54 pacientes, encontrándose
37 de ellos actualmente fuera de tratamiento.
Recibieron un TCPH 26 pacientes: 1 de ellos fue
un TCPH idéntico no relacionado; y los restantes 25,
familiares idénticos. De estos 26 pacientes, 12
presentaron 2das recaídas de su LLA a los 10,1 (r 0-
37,9) m de la 2da RC, 9 de ellas en MO. Una de ellas
presentó cambio significativo interlinaje al momento
de la recaída posterior al TCPH, de LLA precursor B
(Bcp) a LMA. Además en 3 casos la 2da recaída fue
extra-MO (testículo, intestino y ojo), y 3 pacientes
fallecieron en RC debido a complicaciones re-
lacionadas con el TCPH.
La pSLE (EE) fue de 25 (3)%, y la pSLL (EE) de
33 (4)% para el grupo total de recaídas. La pSLE de
las LLA recaídas de inmunofenotipo Bcp fue de 28%,
y las LLA recaídas de inmunofenotipo T de 6%
(p:0,0025); para las LLA recaídas en MO+MOc la
pSLE fue de 21% y para las LLA con recaídas extra-
RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA 7

Gráfico 1.– Esquema de tratamiento del Protocolo LLA–REC 97

TABLA 3.– Características de los pacientes evaluables diátrica. Debido a su incidencia y a que presentan
una respuesta al tratamiento muy diferente a las LLA
Características Pacientes (n=172)
en su 1er diagnóstico, las recaídas de las LLA deben
Sexo ser consideradas como entidades absolutamente
Masculino 118 diferentes. La reaparición de la enfermedad leucé-
Femenino 54 mica continúa siendo el principal obstáculo para
Edad media al diagnóstico 9,8 r (1,8-20,8) años lograr la curación de las LLA a pesar de la inten-
sificación de los esquemas de tratamiento4.
Inmunofenotipo
Precursor B 153 (89%) Los factores pronósticos más importantes que
T 19 (11%) definen las probabilidades de mantener una 2da RC
son: 1- la duración de la 1ra RC, 2- el inmunofenotipo
Duración 1ra RC
<18 m 41 (24%) y 3- el sitio de recaída6. En cuanto a la duración de
18-36 m 79 (46%) la 1ra RC, no todas las publicaciones definen de igual
>36 m 52 (30%) manera una duración de RC que corresponda a una
Sitio de REC categoría de pronóstico intermedio, pero la mayoría
MO 106 (61%) de los reportes coinciden en incluir como recaídas
MOc 27 (17%) muy tempranas y tempranas a aquéllas que ocurren
Extra-MO 39 (22%) dentro de los primeros 18 meses desde el diagnóstico
- Testículo 12 y, generalmente, durante los 2 primeros años de
- SNC 19
- Otras localizaciones 8 tratamiento (ya sea durante el tratamiento o luego de
6 meses de finalizado el mismo)4. Hay acuerdo en la
literatura sobre las escasas posibilidades de curación
de estas recaídas, que no superan el 15% de pSLL.
Por otro lado, en la mayoría de los reportes las re-
MO de 40% (p:0,0061). La pSLE de las recaídas caídas que se presentan entre los 30 y 36 meses desde
testiculares aisladas fue de 80%, y para las otras LLA el diagnóstico presentan pSLL que, si bien es superior
recaídas extra-MO no testiculares fue de 12% a la de las recaídas más tempranas, no alcanza el
(p:0,0004). La pSLE de las LLA recaídas a <18m de 50%4, 5. Sin embargo, en las recaídas con una duración
la 1ra RC fue de 5%, entre 18-36 m de 25% y >36 m de la 1ra RC mayor de 36 meses, se han reportado
de 41% (p:0,0001) (Gráfico 2). pSLE a los 5 años >50%6, 10, 11, 12, 13, 14. Los resultados
observados en nuestro análisis coinciden con la
literatura, ya que la pSLE para los niños que reca-
DISCUSIÓN yeron antes de los 18 meses fue de 5% vs 41% para
Las recaídas de LLA constituyen aproximada- los que recayeron dentro de los 36 meses del
mente un 25% de las LLA de diagnóstico inicial; este diagnóstico15. En un estudio realizado por Chessells
porcentaje indica que son tan frecuentes como la et al.15, el 74% de los pacientes recayó dentro de los
mayoría de los tumores sólidos y las Leucemias 3 primeros años del diagnóstico; resultados simila-
Mieloblásticas Agudas (LMA) en la población pe- res se observaron en nuestra población de pacientes,
8 HEMATOLOGIA
Gráfico 2.– Curvas de sobrevida
ya que un 70% recayó dentro de ese período de
tiempo.
En cuanto al inmunofenotipo, se encuentra
claramente definido que las recaídas de las LLA de
inmunofenotipo T tienen un pronóstico más pobre
que las recaídas de LLA Bcp11, 16. En nuestro análisis
la pSLL de las LLA-T fue significativamente menor
que la de las LLA recaídas Bcp.
Con respecto a la localización de la recaída,
diversos estudios han demostrado que las recaídas
extramedulares aisladas, principalmente las
testiculares, presentaban mejor pronóstico que las
recaídas en MO aisladas6, 16. También se ha sugerido
● Volumen 14 - Nº 1, 2010
que las recaídas medulares combinadas tenían mejor
pronóstico que las medulares aisladas17. En nuestra
serie las recaídas medulares aisladas tuvieron un
pronóstico similar a las combinadas, mientras que
para las recaídas extramedulares observamos una
pSLE significativamente superior a las recaídas en las
cuales había compromiso de la MO, ya sea en forma
aislada o combinada (40% vs 21%, respectivamente).
Cuando analizamos por separado las recaídas
testiculares del resto de las recaídas extramedulares
aisladas con otras localizaciones diferentes a la
testicular, encontramos que la pSLE de las recaídas
testiculares fue significativamente superior (80% vs
RESULTADOS DEL TRATAMIENTO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS RECAÍDAS EN PEDIATRÍA
12%), al igual que lo descripto en la literatura. Pro-
bablemente, la pobre pSLE obtenida para las recaídas
MOc y en extramedulares no testiculares (en nuestro
estudio la mayoría en SNC) pueda explicarse por el
momento de recaída y/o por la persistencia de
Enfermedad Mínima Residual (EMR), aún en recaí-
das aparentemente extramedulares puras 18, 19. La
medición de EMR realizada por técnicas moleculares
o inmunológicas durante el tratamiento de la enfer-
medad ha demostrado tener significado pronóstico,
pero la mayoría de estos estudios se ha realizado en
pacientes con LLA de reciente diagnóstico20.
Con respecto a la elección del mejor tratamiento
para estos pacientes, ha habido controversias acerca
de quiénes se beneficiarían del TCPH. En la 1ra com-
paración sistemática del Bone Marrow Transplant
Registry se sugirió que el TCPH es superior a la
quimioterapia en las recaídas a menos de 18 meses
desde el diagnóstico21, al igual que para el estudio
Alemán22 y que para la serie reportada por el grupo
Italiano23. En nuestra población de pacientes no es
posible hacer una comparación de la utilización de
poliquimioterapia vs. transplante, ya que al tratarse
de una randomización biológica solamente el 15% de
los pacientes contó con donante relacionado his-
toidéntico. Otra opción terapéutica sería el TCPH con
donante no relacionado, pero el tiempo para la ob-
tención de un donante apropiado es muy prolongado
–además de costoso– en nuestro medio, y en general
los pacientes presentan nuevas recaídas antes de
acceder a este tipo de tratamiento.
Finalmente, si consideramos que los resultados
globales de pSLL de las recaídas en general, y de
algunos grupos en particular, deben ser mejorados,
actualmente es necesario no sólo el desarrollo de
nuevas herramientas terapéuticas para este grupo de
pacientes, sino también la incorporación de métodos
de estudio de seguimiento de la EMR en LLA re-
caídas con la finalidad de redefinir los grupos de
riesgo de esta patología (por Citometría de Flujo o
PCR). Esta estratificación de acuerdo a la deter-
minación de EMR y de estudios farmacogenéticos
hará necesaria a su vez la aplicación de nuevos
agentes quimioterápicos (Clofarabina, Nelarabina,
Forodesina, etc.)24, 25, 26 y terapias target, que permi-
tirán la realización de tratamientos de mayor inten-
sidad y/o individualizados.
En lo referente a la consolidación de los trata-
mientos con TCPH, debido a las escasas posibi-
lidades de contar con un donante familiar idéntico y
a la demora para la obtención de un donante no
relacionado, es necesario el desarrollo y la evaluación
de nuevas estrategias TCPH, como son el TCPH
haploidéntico27, 28, 29 y diversas estrategias de terapia
celular, actualmente en estudio.
9
CONCLUSIONES
En nuestro trabajo podemos concluir que el in-
munofenotipo, la duración de la 1ra RC y el sitio de
la recaída influyeron significativamente la pSLE,
datos que se encuentran en concordancia con lo
reportado en la literatura. Los mejores resultados
fueron los de las recaídas testiculares.
El TCPH es una opción para un pequeño grupo
de pacientes, por lo cual actualmente es necesario el
desarrollo de nuevas terapéuticas que permitan
mejorar la pSLE de estos pacientes.
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Señales de sobrevida inducidas por el complejo
IL-6/IL-6sR en el linaje megacariocítico.
Influencia de la mutación JAK2-V617F
Carlos D. Chazarreta, Nora P. Goette, Paola R. Lev, Juan P. Salim,
Felisa C. Molinas, Rosana F. Marta ARTÍCULOS
ORIGINALES
Hematología Investigación, UE IDIM-CONICET, Instituto Lanari, UBA.
Combatientes de Malvinas 3150 C.A.B.A. CP 1427. Tel 011-4523-8947
Correspondencia a: Dra. Rosana F. Marta. rfmarta2005@gmail.com

Fecha de recepción: 10/10/09 HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 11-17

Fecha de aprobación: 30/10/09 Enero-Marzo, 2010

RESUMEN favorece la sobrevida de los progenitores megacariocí-

La IL-6 actúa a través del receptor de membrana y del
soluble (IL-6sR) que confiere sensibilidad a células sin
receptor de membrana. Previamente reportamos aumen-
to de IL-6sR en trombocitemia esencial (TE), una neo-
plasia mieloproliferativa (NM). En este trabajo se evaluó
la acción del complejo IL-6/IL-6sR (COMP) comparado
con la IL-6 en su capacidad de protección de la apoptosis
de progenitores CD34+ normales y de NM y de activa-
ción de JAK/STAT en plaquetas normales y de NM. Se
evaluó expresión de fosfatidilserina por marcación con
anexina V y de caspasa 3 activada en células CD34+ de
sangre periférica de NM y de cordón umbilical como con-
trol, y activación de JAK2 y STAT3 por western-blot con
anticuerpos contra las proteínas fosforiladas y sin fosfo-
rilar. En conjunto, los progenitores CD34+ de pacientes
y controles tuvieron menos apoptosis con COMP que con
IL-6 (activación de caspasa 3 p=0.001, 7 normales, 4 pa-
cientes; expresión de anexina V p=0.029, 6 normales, 5 pa-
cientes; Rangos señalados Wilcoxon) La activación de
JAK2 y STAT3 en plaquetas se evaluó calculando la re-
lación (Rel) de intensidad de la banda de la proteína
fosforilada respecto del total estimulada por COMP (Rel
COMP) y por TPO (RelTPO), obteniéndose el cociente
(Rel COMP/TPO). Los pacientes JAK2V617F + tuvieron
aumento de Rel COMP/TPO del STAT3, 2.03 (0.45-3.03)
(mediana y rango) (n=4), respecto de controles 0.63 (0.014-
0.8) (n=5) y pacientes no mutados, 0.75 (0.005-1.12) (n=5)
(ANOVA p=0.018). La activación de JAK2 siguió una ten-
dencia similar a STAT3 aunque no alcanzó diferencias
significativas.
Los resultados sugieren que el COMP es más efecti-
vo que la IL-6 en la protección de la apoptosis de los pro-
genitores CD34+. Esto junto al hallazgo de aumento de
IL-6sR en TE, sugerirían que un mayor nivel de IL-6sR
ticos en NM. La protección ocurriría a través de JAK2 y
STAT3 siendo más eficiente en pacientes JAK2V617F+.
Palabras clave: Receptor de interleuquina 6, Plaquetas,
JAK2-V617F, Progenitores hematopoyéticos, Apoptosis.
INTRODUCCIÓN
La trombopoyetina (TPO) es la principal citoquina
estimulante de la megacariopoyesis. Sin embargo, se
han descrito algunos otros factores “TPO indepen-
dientes” capaces de inducir el desarrollo megacario-
cítico, entre ellos la interleuquina 6 (IL-6)1.
La IL-6 actúa a través de su receptor específico
(IL-6Rα) en la membrana de las células blanco que
se asocia con una glicoproteína llamada gp130, en-
cargada de la transducción de la señal intracelular.
La activación y homodimerización de la gp130 indu-
ce fosforilación de Janus quinasas (JAKs), favorecien-
do la activación de signal transducers and activators of
transcription (STATs). Esta ruta de señalización es ac-
tivada también por TPO y por otras citoquinas que
utilizan la gp130 para la transducción de la señal
intracelular. Existe además una forma soluble del
receptor (IL-6sR) que al unirse a la IL-6 es capaz de
desencadenar la transducción de la señal en células
que no poseen IL-6Rα, como las células endoteliales,
y ampliar así el espectro celular sobre el que la IL-6
ejerce su acción. Este mecanismo se denomina trans-
señalización2. El IL-6sR se une a su ligando con afi-
12
nidad similar al IL-6Rα, actuando de manera
agonista y siendo capaz de prolongar la vida media
de la IL-6. El mecanismo de trans-señalización a tra-
vés del IL6-sR se encuentra implicado en numerosas
patologías en donde actúa facilitando la acción
antiapoptótica de la IL-6. La activación de las seña-
les intracelulares inducida por IL-6 es de importan-
cia en la producción de progenitores hematopoyéticos
inmaduros y comprometidos con el linaje mega-
cariocítico3.
Las neoplasias mioloproliferativas crónicas (NM)
son un grupo de enfermedades que se caracterizan
por un aumento de la proliferación de alguno de los
linajes mieloides. Así, la policitemia vera (PV) se
identifica por una exacerbación de la serie eritroide,
la trombocitemia esencial (TE) por un aumento de la
serie megacariocítica y la mielofibrosis primaria (MP)
por fibrosis medular y desarrollo mieloide extrame-
dular4. En los últimos años, el descubrimiento de la
mutación V617F en la tirosinquinasa JAK2, con dife-
rentes frecuencias en cada una de estas tres entida-
des, ha puesto en evidencia que son patologías con
diferencias fenotípicas pero que comparten ciertas
características genéticas. Los factores que determinan
el desarrollo de cada uno de estos tres desórdenes no
están totalmente dilucidados. La mutación V617F en
el dominio autoinhibitorio de la quinasa, induce un
aumento de la actividad de la misma, provocando
activación constitutiva en líneas celulares5 y creci-
miento independiente de citoquinas in vitro6.
En un trabajo previo7 describimos el aumento
plasmático del IL-6sR en pacientes con TE. Dada la ca-
racterística agonista del IL-6sR y la amplia participación
de su ligando en la megacariocitopoyesis, en el presen-
te trabajo se evaluó la actividad del complejo IL-6/IL-
6sR (COMP) y de la IL-6 por sí sola en la protección de
la apoptosis de células progenitoras CD34+ normales
y de pacientes con NM, así como la activación de las
rutas de señalización JAK/STAT en plaquetas norma-
les y de pacientes con NM portadores de la mutación
JAK2V617F y negativos para la misma (JAK2WT).
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes y controles
Los pacientes se diagnosticaron de acuerdo a los
criterios del PVSG, utilizándose únicamente muestras
de pacientes libres de tratamiento. Se estudiaron 15
pacientes, 12 con TE, 2 con PV y uno con MP. Los
progenitores hematopoyéticos CD34+ normales se
obtuvieron de sangre de cordón umbilical humano de
partos a término de embarazadas sin antecedentes de
enfermedad hematológica. La recolección de estas
muestras se realizó en el Hospital Materno Infantil
HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010
de San Isidro. Las muestras de plaquetas normales
se obtuvieron de individuos sanos que no habían
ingerido medicación alguna en los últimos 8 días.
Este proyecto cuenta con la aprobación del comi-
té de ética del Instituto de Investigaciones Médicas
A. Lanari, y del Hospital Materno Infantil de San Isi-
dro. Tanto pacientes como controles normales firma-
ron el consentimiento informado correspondiente.
Muestras biológicas
Progenitores hematopoyéticos CD34 positivos: los
progenitores hematopoyéticos CD34+ normales se
obtuvieron recogiendo la sangre de cordón umbilical
en tubos estériles conteniendo buffer anticoagulante
BAC (PBS, 1mM EDTA, 50 U/ml heparina). Los pro-
genitores CD34+ de pacientes con NM se obtuvieron
a partir de sangre periférica utilizando el mismo
anticoagulante.
Plaquetas: las plaquetas de pacientes y controles
normales se obtuvieron de sangre periférica anticoa-
gulada con BAC suplementado con inhibidores de la
activación plaquetaria y se aislaron por método con-
vencional. El plasma rico en plaquetas fue filtrado
por filtros desleucocitantes (Purecell PL, Pall Biome-
dical Products, East Hills, NY, USA) para descartar
la presencia de glóbulos blancos.
Purificación de progenitores CD34+
Los progenitores se purificaron por método inmu-
nomagnético de selección positiva miniMACS utili-
zando un anticuerpo directo anti-CD34 unido a es-
feras metálicas (Myltenyi Biotec GMBH Alemania).
Estudios de apoptosis en células progenitoras CD34+
Activación de caspasa 3 por citometría de flujo:
Para este ensayo se hizo proliferar a las células
CD34+ cultivándolas por un periodo de 48 hs en me-
dio IMDM suplementado con suero fetal bovino 2%,
BSA 1.5%, transferrina saturada de hierro 200 µg/ml,
Stem Cell Factor 25 ng/ml, lípidos sonicados, en pre-
sencia de penicilina y estreptomicina. Después de la
proliferación las células fueron lavadas con PBS/
BSA/EDTA y cultivadas durante 12 hs en medio con-
dicionado IMDM, deprivado de nutrientes, como
base para inducir apoptosis, o bien el mismo medio
con el agregado de 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/ml
de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR (citoquinas provenien-
tes de R&D Systems, Minneapolis, USA). Después de
este periodo se realizó la marcación de las células
progenitoras con CD34 FITC y CD45 PerCP por 30
min. a temperatura ambiente para la selección de la
población. Luego las células marcadas fueron lava-
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO
das y se procedió a la fijación y permeabilización
utilizando un kit comercial (PharMingen TM), para la
posterior marcación intracitoplasmatica de caspasa 3
activada con un anticuerpo monoclonal unido a PE
(Becton Dickinson, San José, CA, USA). Los resultados
se expresaron como porcentaje de marcación de caspasa
3 activada en las células expuestas a los distintos trata-
mientos (IL-6 sola o complejo IL-6 + IL-6sR) respecto a
la marcación obtenida en las células cultivadas en
IMDM sin el agregado de citoquinas, que fue conside-
rada como el 100% de activación de caspasa 3.
Expresión de fosfatidilserina: las células CD34+
purificadas se cultivaron en medio deprivado de
nutrientes como metodología para inducir apoptosis.
Los cultivos se realizaron durante 16 hs a 37 °C en
medio IMDM sólo y con el agregado de 100 ng/ml
de IL-6 o 100 ng/ml de IL-6 + 200 ng/ml de IL-6sR.
La concentración celular sembrada fue de 50000 cé-
lulas/well/ml. Pasado el tiempo de incubación las
células fueron cosechadas, lavadas e incubadas con
Anexina V unida al fluorocromo FITC e ioduro de
propidio. La Anexina V se une a la fosfatidilserina que
se expone en la cara externa de la membrana plas-
mática cuando la célula entra en apoptosis, mientras
que el ioduro de propidio penetra en las células en las
que la integridad de su membrana ha sido alterada,
como es el caso de las células necróticas y apoptóticas
tardías. Para este estudio se utilizó un kit comercial
(Becton-Dickinson) según las recomendaciones del fa-
bricante. Los resultados se expresaron como porcen-
taje de células apoptóticas totales (apoptosis tempra-
na representada por eventos anexina V positivos,
ioduro de propidio negativos, más apop-tosis tardía,
representada por eventos anexina V positivos, ioduro
de propidio positivos).
Estudio de fosforilación de proteínas plaquetarias
Para el estudio de fosforilación de proteínas, las
plaquetas filtradas se ajustaron a 1.106/ul. Se estimu-
laron 200 ul de esta suspensión plaquetaria con a) 100
ng/ml IL-6, b) 100 ng/ml IL-6 + 200 ng/ml IL-6sR,
c) 100 ng/ml TPO. Las muestras se incubaron 10
minutos a 37° C, se lisaron con buffer de lisis M-Per
(Pierce Biotechnology, Rockford, USA) y se agrega-
ron inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las mues-
tras fueron centrifugadas a 4 °C 10 min a 14000 rpm.
Las proteínas plaquetarias se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida y se realizaron
western-blots utilizando anticuerpos específicos con-
tra las proteínas JAK2 y STAT3 fosforiladas y sin
fosforilar (Cell Signalling, Beverly, MA y Santa Cruz
Biotechnology).
Para evaluar el grado de activación de JAK2 y
STAT3 en plaquetas, se calculó la relación (Rel) divi-
13
diendo la intensidad de la banda correspondiente al
JAK2 o STAT3 fosforilados por la del JAK2 o STAT3
total, tanto en la muestra estimulada con el comple-
jo (RelCOMP) como en la estimulada por TPO
(RelTPO) y luego se obtuvo el cociente entre ambas
relaciones con el fin de relativizar el grado de fosfo-
rilación del complejo respecto a TPO (RelCOM/TPO).
Estadística
Los resultados se expresaron como mediana y
rango. Para la comparación de la expresión de
caspasa 3 activada y anexina V con los distintos tra-
tamientos se utilizó el test de rangos señalados de
Wilcoxon que compara muestras apareadas. Para
analizar si la protección frente a la apoptosis era dis-
tinta entre pacientes y controles se utilizó el test de
suma de rangos de Wilcoxon. La comparación del
grado de activación de JAK2 y STAT3 entre pacien-
tes JAK2V617F, JAK2WT y controles normales se rea-
lizó mediante el análisis de varianza.
RESULTADOS
Evaluación de la apoptosis de progenitores CD34+
Activación de caspasa 3
En conjunto, los progenitores hematopoyéticos de
pacientes y controles mostraron una menor activación
de caspasa 3 al ser estimulados con el COMP, media-
na 82.9%, rango 47.7-103.8%, respecto a la IL-6,
100.0% (76.1-142.0) (p=0.001; 7 normales, 4 pacientes).
Al compararse los resultados entre pacientes y con-
troles, se observó que no había diferencias en el gra-
do de protección del COMP respecto de la IL-6 entre
ambos grupos. En la Fig. 1A se muestran los resulta-
dos en el grupo de pacientes y controles normales por
separado. En la Fig. 1B se muestra un ejemplo repre-
sentativo de la activación de caspasa 3 obtenida en
presencia del COMP y de IL-6.
Expresión de Anexina V
De forma similar a lo observado para caspasa 3
activada, la expresión de anexina V fue menor en las
muestras estimuladas con COMP, 40.3% (12.9-83.7),
que en aquellas estimuladas con IL-6 sola, 51.4%
(22.4-77.3), p=0.029; (6 normales y 5 pacientes). Tam-
poco se observaron diferencias en la respuesta de los
pacientes respeto a los controles normales. En la Fig.
2A se muestran los resultados de los pacientes y con-
troles y en el Fig. 2B un ejemplo de la distribución
de los eventos anexina V positivos por citometría de
flujo.
14
Fig. 1.– Caspasa 3 activada en progenitores hematopoyéticos CD34+. (A) Porcentaje de activación de caspasa 3 inducido por IL6 o complejo IL6/
IL6sR (COMP) en pacientes (P) y controles normales (N) tomando como 100% de inducción de muerte la expresión de caspasa 3 activada en las
células cultivadas sin citoquinas. (B) Histograma representativo de la expresión de caspasa 3 activada en una muestra tratada con IL6 (histograma
de la derecha) y COMP (histograma de la izquierda).
De los 8 pacientes estudiados para apoptosis de
progenitores, solo uno fue portador de la mutación
JAK2V617F. Esto imposibilitó la realización del análi-
sis comparativo entre pacientes con y sin la mutación.
Activación de JAK2 y STAT3 en plaquetas
La activación de la ruta de señalización JAK2 y
STAT3 se estudió en muestras de plaquetas evaluan-
do las bandas de las proteínas fosforiladas en ausen-
cia de citoquinas y en presencia de a) IL-6, b) Com-
plejo IL-6/IL-6sR, c) TPO, citoquina estimulante de
la vía JAK2/STAT3. Tanto las plaquetas enfrentadas
con vehículo carente de citoquina como aquellas in-
cubadas en presencia de IL-6 no presentaron activa-
ción de JAK2 ni STAT3, demostrando la incapacidad
de la IL-6 por sí sola de transducir la señal en
plaquetas. En cambio, la estimulación con TPO y
COMP dió lugar a la aparición de bandas de proteí-
na fosforilada tanto para JAK2 como para STAT3.
La fosforilación de JAK2 inducida por TPO fue
semejante en los pacientes portadores de la mutación,
0.39 (0.20-0.80), en los pacientes no mutados, 0.59 (0.05-
1.86), y en los controles normales, 0.38 (0.01-0.75), Fig.
3A. En cambio, se observó mayor activación de JAK2
inducida por COMP en los pacientes JAK2V617F, 0.33
(0.008-2.25) respecto de los no mutados, 0.007 (0.005-
0.014) y los normales, 0.038 (0.004-0.07) aunque la
diferencia no fue estadística-mente significativa, Fig. 3B.
Cuando se analizó el nivel de fosforilación de
STAT3 se observaron las siguientes tendencias: al
inducir la activación con TPO los pacientes con la
mutación presentaron menor grado de fosforilación,
0.72 (0.009-2.10), que los no mutados, 1.08 (0.35-7.79)
y que los controles normales, 11.52 (0.18-21.80), Fig.
HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010
3C. Por el contrario, la fosforilación inducida por el
COMP fue mayor en pacientes JAK2V617F, 1.34 (0.69-
4.61), que en los JAK2WT, 0.39 (0.005-2.80) y que los
sujetos normales, 0.27 (0.11-1.84), Fig. 3D.
Al relativizar la activación inducida por el COMP
respecto a la TPO observamos mayor Rel COMP/
TPO para STAT3 en los pacientes JAK2V617F, 2.03
(0.45-3.03) (n=4), que en los pacientes negativos para
la mutación, 0.75 (0.005-1.12) (n=5) y en los contro-
les normales 0.63 (0.014-0.8) (n=5) (p=0.018), demos-
trando en el grupo mutado un aumento del nivel de
fosforilación de STAT3 inducida por el COMP. Los
niveles de fosforilación de JAK2 siguieron la misma
tendencia: pacientes JAK2V617F 1.16 (0.02-2.81), pa-
cientes JAK2WT 0.01 (0.01-0.14), normales 0.22 (0.1-
0.34), Fig. 3E. En la figura 3F se muestra un ejemplo
representativo de la activación de STAT3 en un pa-
ciente JAK2V617F y en uno JAK2WT.
DISCUSIÓN
Los resultados del presente trabajo indican que el
complejo IL-6/IL-6sR es más efectivo que la IL-6 por
sí sola en la protección de la apoptosis de los proge-
nitores hematopoyéticos tanto normales como de
pacientes con NM. Esta diferencia podría basarse en
el hecho de que la IL-6 requiere del receptor especí-
fico de membrana IL-6Rα, que, en los progenitores
CD34+ de las muestras estudiadas en este trabajo,
tuvo una expresión baja, no superando el 12% (da-
tos no mostrados). En cambio, la expresión ubicua de
la gp130 encargada de transducir la señal intrace-
lular, posibilita la respuesta frente al complejo IL6/
IL6sR. Las rutas de señalización involucradas en este
efecto serían JAK/STAT y PI3K/AKT.
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO 15

Fig. 2.– (A) Porcentaje de expresión de anexina V (apoptosis temprana y tardía) inducido por IL6 o complejo IL6/IL6sR (COMP) en pacientes (P) y
controles normales (N). (B) Marcación para anexina V en el eje X y la incorporación de ioduro de propidio en el eje Y. Los eventos comprendidos en
el cuadrante inferior derecho son AV+IP-, y representan las células en apoptosis temprana. Los eventos en el cuadrante superior derecho AV+IP+
corresponden a las células en apoptosis tardía.

El aumento del IL-6sR plasmático que describi-
mos previamente en pacientes con TE (7) nos indujo
a estudiar su repercusión en las vías de señalización
de IL-6. Debido a la dificultad en la obtención de la
cantidad suficiente de progenitores CD34+ necesarios
para realizar los estudios de activación de JAK/STAT
utilizando esta metodología, se buscó otro tipo celu-
lar que perteneciera a la estirpe afectada y que fuera
de fácil obtención. Las plaquetas presentan la venta-
ja de poder obtenerse fácilmente, en cantidad sufi-
ciente y podrían tomarse como reflejo de la trans-
ducción de la señal corriente abajo de la IL-6 en el
linaje megacariocítico.
La fosforilación de STAT3 inducida por el comple-
jo IL-6/IL-6sR fue mayor en las plaquetas de los pa-
cientes JAK2V617F que en los no mutados y en los
controles sanos, demostrando un aumento de la ca-
pacidad de activación de esta vía por el complejo.
Contrariamente, la TPO indujo menor activación de
STAT3 en los pacientes positivos para la mutación.
Moliterno y colaboradores han demostrado que los
pacientes con TE JAK2V617F+ tienen menor expre-
sión del receptor Mpl en plaquetas que aquellos ne-
gativos para la misma, existiendo una correlación
inversa entre la carga alélica de JAK2V617F y la ex-
presión del receptor Mpl en NM8. Esto podría suge-
rir que el aumento relativo de la fosforilación de
STAT3 inducida por el COMP respecto de TPO en
pacientes con la mutación de JAK2 se deba también
a una menor actividad de TPO por la disminución de
su receptor Mpl. La evaluación de los niveles de Mpl
plaquetario en todos los pacientes incluidos en el
estudio está en curso para aclarar este punto. En con-
junto, estos resultados sugieren que la señalización
16 HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010

Fig. 3.– Fosforilación de JAK2 y STAT3 en plaquetas. (A-D) Mediana y rango de la relación de intensidad de las bandas fosforilada y total para cada
proteína (JAK2 y STAT3) inducida por TPO y COMP en los pacientes portadores de la mutación JAK2V617F, no mutados (JAK2WT) y controles
normales (NORM). (E) Mediana y rango de la relación de fosforilación inducida por COMP respecto a TPO ( Rel COMP/TPO) para el STAT3 y el
JAK2 en los distintos grupos. (*) diferencia estadística entre el grupo JAK2V617F y los grupos JAK2WT y controles, p=0.018. (F) Western blot
representativo de la fosforilación de STAT3 en una muestra incubada con medio carente de citoquinas (línea 1), IL6 (línea 2), complejo IL6/IL6sR
(línea 3), TPO (línea 4), receptor soluble de IL6 solo (IL6sR, línea 6). En la línea 5 se muestra un control positivo de fosforilación.
SEÑALES DE SOBREVIDA INDUCIDAS POR EL COMPLEJO IL-6/IL-6SR EN EL LINAJE MEGACARIOCÍTICO
por JAK2/STAT3 en plaquetas de pacientes portado-
res de la mutación de JAK2 estaría más estimulada
por el complejo IL-6/IL-6sR que por trombopoyetina.
Majka y colaboradores9 describieron que la TPO y
la IL-6 protegen de la apoptosis a los progenitores
CD34+. En este trabajo demostramos que la presencia
de IL-6sR junto a la IL-6 es más efectiva que la IL-6
sola en su capacidad antiapoptótica. Si el patrón de
fosforilación que observamos en plaquetas fuera reflejo
de lo que ocurre en los progenitores, los pacientes
portadores de la mutación JAK2V617F podrían tener
un aumento de STAT3 fosforilado mediado por el com-
plejo IL-6/IL-6sR, lo que contribuiría, al menos en
parte, a la disminución de la apoptosis que caracteri-
za al clon hematopoyético en estos pacientes.
Majka demuestra, además, la capacidad de IL-6 de
inducir activación de STAT1, 3 y 5 en progenitores
CD34+ y megacarioblastos pero no en plaquetas. Del
mismo modo, nosotros tampoco obtuvimos fosforila-
ción de JAK2 ni STAT3 inducida por IL-6 sola en nin-
guna de las muestras estudiadas. Este resultado con-
cuerda con la ausencia de receptor de IL-6 (IL-6α) en
la membrana plaquetaria descrita por nuestro grupo
con anterioridad10. En cambio, el agregado de concen-
traciones equimolares de IL-6sR produjo una activa-
ción de JAK2 y STAT3 en las muestras de controles
normales y pacientes, revelando que la transducción
de la señal inducida por IL-6 en plaquetas ocurre
exclusivamente a través del complejo IL-6/IL-6sR. En
este contexto, el aumento de IL-6sR en TE cobra ma-
yor importancia fisiopatológica, ya que podría aumen-
tar la señalización intraplaquetaria mediada por IL-6,
potenciando así la activación plaquetaria inducida por
otros agonistas.
En conclusión, el complejo IL-6/IL-6sR es más efec-
tivo que la IL-6 en la protección frente a estímulos
apoptóticos, por lo que el aumento del nivel de IL-6sR
en trombocitemia esencial favorecería la sobrevida de
los progenitores hematopoyéticos CD34+ que dan
origen a los megacariocitos, contribuyendo al cuadro
característico de la enfermedad. Por otra parte, estimu-
laría señales de activación intraplaquetaria con mayor
eficiencia en pacientes JAK2V617F.
ABSTRACT
IL-6 acts through its membrane bound and soluble (IL-
6sR) receptors. The latter confers IL-6 sensitivity to cells
that lack the anchored receptor. Previously, we have
reported IL-6sR increase in essential thrombocythemia (ET),
a myeloproliferative neoplasm (MN). In the present work,
we evaluated the effect of IL-6/IL-6sR complex (COMP)
compared to that of IL-6, regarding its ability to protect
CD34+ progenitors form apoptosis and to activate JAK/
STAT in platelets, from both, MN patient and normal
samples. Altogether, progenitors from patients and controls
underwent less apoptosis in the presence of COMP than
with IL-6 (activated caspase 3 p=0.001; anexin V expression
17
p=0.029). JAK2 and STAT3 activation was evaluated by
western-blot comparing the phosphorylated and the total
protein induced by COMP (RelCOMP) and thrombopoietin
(RelTPO) and calculating the ratio (R COMP/TPO).
Patients harbouring JAK2-V617F had increased STAT3 R
COMP/TPO, 2.03 (0.45-3.03) (median, range) than controls,
0.63 (0.014-0.8) and patients without the mutation, 0.75
(0.005-1.12) ANOVA p=0.018. JAK2 activation showed the
same pattern but did not reach statistical significance.
These results suggest that COMP is more effective than
IL-6 in protecting hematopoietic progenitors from
apoptosis. These findings together with the increased IL-
6sR levels previously found in ET, suggest that high IL-6sR
levels could favour megakaryocytic progenitors survival in
MN. This protection would occur through JAK2/STAT3,
being more efficient in patients carrying the JAK2-V617F
mutation.
Key words: Interleukin 6 receptor, Platelets, JAK2-
V617F, Hematopoietic progenitors, Apoptosis.
Agradecimientos: Los autores de este trabajo agradecen
al Servicio de Obstetricia y Quirófano de Obstetricia del
Hospital Materno Infantil de San Isidro y especialmente a
Sara Labat por la recolección de las muestras de sangre de
cordón umbilical. Este trabajo ha sido realizado con los
subsidios PIP 2004 número 5711 de CONICET, PICT 2002
número 11229 y PICT 2005 número 32075 de la Agencia
Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
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independent megakaryocytopoiesis. Crit Rev Oncol Hematol
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is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role
in inflammation and cancer. J Leukoc Biol 2006; 80: 227-36.
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9. Majka M, Ratajczak J, Villaire G y col. Thrombopoietin, but not
cytokines binding to gp130 protein-coupled receptors, activates
MAPKp42/44, AKT, and STAT proteins in normal human
CD34+ cells, megakaryocytes, and platelets. Exp Hematol 2002;
30: 751-60.
10. Marta R, Goette N, Chazarreta CD, Pirola C, Molinas FC. Nor-
mal platelets possess soluble interleukin 6 receptor. Cytokine
2005; 29: 13-17.
 Por la trascendencia para la comunidad hematológica y prenda para la
Sociedad, cabe en nuestra Revista señalar la presentación del libro” Las neoplasias
linfoides” bajo la dirección de las Dras. Norma Tartas y Marta Zerga y el Dr.
Julio C. Sánchez Avalos recientemente editado y en distribución entre los colegas.
Fruto de un esfuerzo mancomunado intenso, es una clara muestra de la capacidad
intelectual de nuestra comunidad que nos alegra, satisface e impulsa a emprender
otras obras.
Se trascribe entonces el discurso pronunciado por la Dra. Norma Tartas en INFORMACIÓN
tan jubilosa ocasión. GENERAL

Presentación del Manual de Oncohematología:

LAS NEOPLASIAS LINFOIDES
Sede de la SAH, 5 de Noviembre de 2009

Estamos aquí para presentar el manual “Las Neoplasias Linfoides”,

el que tiene como destinatarios a los médicos hematólogos en formación.
La historia de la gestación de este manual empieza hace muchos años,
cuando yo era becaria de hematología de la UBA y trabajaba en complejos
solubles de monómeros de fibrina en el Instituto de Investigaciones
Médicas. El entonces director, Profesor Alfredo Lanari, al cruzarse conmigo
fortuitamente en un patio de la institución, me dijo que yo tenía que
escribir una revisión sobre linfomas. En ese momento adopté un recurso
típico de médica residente, dije: ¡Si Doctor! y me preparé para desaparecer
sistemáticamente de su vista. No tenía ni la mas remota idea de cómo
cumplir semejante orden. Ha pasado mucho tiempo y como dijo el poeta
“en la ciudad del devenir los caminos son circulares”; hoy, con la ayuda
de muchos, el mandato de Alfredo Lanari. Finalmente se cumplió.
Es difícil que muchos hematólogos estén unánimemente de acuerdo
en algo, pero eso ocurrió y así dedicamos el manual al profesor Etcheverry.
Miguel Angel Etcheverry dedicó una buena parte de su vida profesional
a la enseñanza de la Hematología y se constituyó en un modelo a seguir
para los docentes en la materia. Con este manual también trataremos de
honrar su memoria, difundiéndolo en todas las Sociedades de Hematología
del interior del país y de la América de habla hispana.
“Las neoplasias linfoides“ se editó gracias a la buena voluntad de
muchos, sus autores y mis compañeros de dirección editorial los Doctores
Marta Zerga y Julio Sánchez Ávalos, quienes con su espíritu crítico
favorecieron el intercambio creativo y esto fue fundamental para lograr
nuestro objetivo. También lo fue, el soporte financiero y técnico del
Laboratorio Bio Sidus, personalizado en Alfredo Mari y Osvaldo Nuñez
,sus gerentes, las licenciadas Analía Nuñez y Graciela Sánchez del equipo
de diseño de Sidus. Todos ellos permitieron que el primer manual
rioplatense de neoplasias linfoides fuese editado por un laboratorio
argentino que nos enorgullece y de esta manera completar otro camino
circular.
La SAH nos dio el auspicio y un mensaje cálido de su presidente Dardo
Riveros fue oportuno y muy valorado. Antes de darle la palabra al Dr.
Riveros.pido un fuerte aplauso para todos por este logro tan anhelado.
Gracias.
HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 18
Dra. Norma Tartas Enero-Marzo, 2010
20 HEMATOLOGIA ● Volumen 14 - Nº 1, 2010

La Revista Hematología es el órgano oficial de difusión de la Socie-

dad Argentina de Hematología (SAH). En ella se publicarán trabajos re-
lacionados con la especialidad, siempre que se ajusten a los requerimien-
tos científicos y técnicos establecidos por el Comité Editor quien tendrá
la facultad de aceptar o rechazar los trabajos enviados para la publica-
ción. Se admitirá la publicación de trabajos de autores de habla no his-
pana en idioma inglés.
Esta revista está constituida sobre la base de diversas secciones a de-
sarrollar: REGLAMENTO DE
1) Editorial PUBLICACIONES
2) Artículos originales
3) Actualizaciones y/o revisiones
4) Artículos especiales (compuestos por Comunicaciones breves, Ate-
neos Anatomoclínicos, Resolución de problemas clínicos, Reporte
de casos)
5) Imágenes en Hematología
6) Correo de lectores
7) Información General (Comentarios de libros, revistas o material in-
formativo, congresos, jornadas, información sobre las actividades HEMATOLOGIA, Vol. 14 Nº 1: 20-21
de interés científico de la Sociedad). Enero-Marzo, 2010

Las Editoriales serán solicitadas únicamente por el Comité Editor. Tendrán título y texto con característi-
cas de monografía, en lo posible con una extensión no mayor de 2 páginas, con un máximo de 5 citas biblio-
gráficas, figurando al final el nombre del autor, su dirección, código postal, TEL/FAX.
Los Artículos originales deberán ser presentados por triplicado, impresos en papel tamaño A4, con fuentes
tamaño 10, 70 caracteres por renglón, 25 líneas por página, numeradas en forma correlativa, incluyendo ta-
blas y bibliografía. Deben ser originales e inéditos en el país. Se podrán publicar en este ítem aquellos traba-
jos que fueron presentados en reuniones de la SAH, así como también en Reuniones Nacionales o Interna-
cionales.
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birán el trabajo, conservándose su anonimato.
Los trabajos se desarrollarán según el siguiente ordenamiento: a) Título; b) Resúmenes (en hoja aparte);
c) Introducción; d) Material y métodos; e) Resultados; f) Discusión; g) Bibliografía.
Título: Deberá ser consignado con mayúsculas y sin abreviaturas, será breve y preciso. En renglón apar-
te se detallará la nómina de autores, separados por comas, comenzando por el primer nombre, iniciales de
los segundos nombres y apellido completo. A continuación el nombre de la institución u hospital donde se
realizó el trabajo, la dirección, TEL/FAX y el código postal del autor a quien dirigir la correspondencia.
Resumen: Cada trabajo deberá presentar un resumen en castellano y otro en inglés (incluyendo título en
dicho idioma) los cuales proporcionarán por sí mismos una idea concisa de cada uno de los puntos antes
mencionados; y no deben ser más extensos de 200 palabras cada uno. Deberán consignarse 3 a 5 palabras
clave en inglés y en castellano al pie del resumen utilizando términos del Medical Subjects Headings del
Index Medicus.
Introducción: Explicará los fundamentos y objetivos del trabajo
Material y métodos: Detallará las características del material, la metodología empleada y el método esta-
dístico utilizado.
Resultados: Deberán estar expresados con claridad.
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entre éstos y el objetivo inicialmente propuesto y su confrontación con los conocimientos establecidos pre-
viamente.
Bibliografía: Sólo se incluirán las referencias que hayan sido consignadas en el artículo, ordenadas numérica-
mente en forma correlativa. Se hará figurar inicialmente la nómina de autores separados por comas, comenzando
por el apellido, seguido por las iniciales de los nombres. Cuando el número de autores sea mayor de 6, se hará
mención sólo a los primeros 3 seguidos de la sigla “y col.”; a continuación se consignará el título del trabajo se-
guido del nombre de la revista en forma abreviada, según lo establezca por el «Index Medicus»; año de publi-
cación, punto y coma, número de Volumen dos puntos, página inicial, guión, página final.
REGLAMENTO DE PUBLICACIONES 21

Ejemplo: Kaldor JM, Day EN, Clarke EA y col. Leukemia following Hodgkin’s disease. N Engl J Med
1990; 322: 7-13.
Cuando se trate de libros se harán figurar el nombre del autor/es, título del capítulo, título del libro,
editor/es, año de aparición, páginas separadas por guión, agregando el número de edición si no fuera la
primera edición, editorial, y ciudad.
Ejemplo: Hughes TP and Goldman JM. Chronic myeloid leukemia. Hematology: Basic Principles and
Practice. R. Hoffman, EI Benz, SJ Shatill, B Furie y EJ Cohen 1991, p 854-869. Churchill
Livingstone, Edinburgh
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se en forma de fotos en blanco y negro, con adecuado contraste, en tamaño de 9 x 12 cm o mayor, numeradas en
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racteres romanos y con un título. No se aceptarán tablas que ocupen un espacio mayor que el de una página
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solución de problemas clínicos y las Comunicaciones breves. Las comunicaciones de casos no deberán exce-
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