INFORME TECNICO

EMPRESA : BA SERVICIOS AMBIENTALES S.A.C.

GERENTE : SR. BORIS H. APAZA VIZCARRA.

ACTIVIDAD: BIORREMEDIACION DE SUELOS EMPETROLADOS.

UBICACIÓN: CARRETERA PANAMERICANA NORTE KM. 1085+600.

DESCRIPCION DEL TERRENO

Se trata de terreno de 3 héctareas, con relieve relativamente plano y suave

pendiente. El drenaje superficial es adecuado quebradas aledañas.

CLIMA

El clima es seco la mayor parte del año, a excepción de lluvias estacionales

durante los meses de Enero-Abril cuya intensidad es variable.
La dirección de los vientos predominantes es Sur-Oeste a Nor-Este.

DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD

 La empresa BA Servicios Ambientales, brindará tratamiento de suelos

empetrolados a diversas empresas petroleras de la localidad.

 Consiste en utilizar microorganismos (bacterias) para resolver o mitigar el

problema, y es especialmente efectiva en el tratamiento de contaminantes
orgánicos, incluido el petróleo. Para que las bacterias puedan eliminar las
sustancias químicas dañinas, el suelo y las aguas subterráneas deben tener
la temperatura, los nutrientes y la cantidad de oxígeno apropiados. Esas
condiciones permiten que las bacterias crezcan y se multipliquen, y
asimilen más sustancias químicas.
 La biorremediación es muy segura, ya que depende de microbios que
existen normalmente en los suelos. Esos microbios son útiles y no
representan un peligro para las personas en el sitio o la comunidad.
Además, no se emplean sustancias químicas peligrosas.
 Es una técnica biológica que en el detalle se puede subdividir en varios
aspectos, que corresponden a distintas posibilidades de aplicación de las
plantas a la remediación de problemas producidos por la contaminación.
 Fitorremediación es la descontaminación de suelos contaminados por
hidrocarburos biodegradables. En este caso, determinadas plantas, en
especial algunas arbóreas, son capaces de alimentarse de este tipo de
 compuestos presentes en el suelo, e incorporarlos a su metabolismo,
transformándolos en materia vegetal así como en productos gaseosos
simples (CO2, agua) que se emiten durante la respiración vegetal.
 También se aplican las plantas a la extracción de contaminantes de tipo
metal pesado presentes en el suelo (fitoextracción)

Base conceptual de la fitoextracción: el metal (Ni) contenido en el suelo es

captado por la planta e incorporado a sus tejidos.

 Principales Ventajas y Desventajas

 Evita la liberación de gases dañinos al aire y se generan muy pocos

residuos.
 Generalmente esta técnica no requiere tanto equipamiento ni trabajo como
la mayoría de los métodos alternativos. Por lo tanto, suele resultar más
económica.
 Como inconvenientes, se pueden citar los siguientes:
 No es de aplicación más que para la descontaminación de hidrocarburos
biodegradables.
 No suele ser efectiva más que en condiciones relativamente superficiales.
 Presenta factores intrínsecos que la hacen completamente inviable en
determinados casos.
ETAPAS PRINCIPALES DE LA BIORREMEDIACION

EL SUELO Y SUS ACTIVIDADES DE CAMPO

a. LEVANTAMIENTO TOPOGRAFICO Y TRABAJO DE GABINETE
El estado de referencia de las zonas a remediar debe plasmarse en un plano
topográfico para poder definir el materia de corte y relleno que se debe mover
para la construcción de las celdas de tratamiento. En gabinete se planifica la
nivelación del terreno conjuntamente con las pendiente y los drenajes que debe
tener el área a trabajar. Asimismo se define el número de celdas que ocupará el
proyecto.
Cada celda de tratamiento debe ser diseñada con medidas adecuadas para cumplir
con la funcionalidad de las técnicas de tratamiento a utilizar en el proyecto y con
la capacidad para poder disponer en su totalidad el material contaminado a un
espesor de 60 cm como máximo, procurando obtener un diseño estético. Las
celdas suelen tener entre 3,000 a 5,000 m3.
b. MOVILIZACION DE EQUIPOS
Para poder realizar los trabajos de preparar las celdas se requiere la movilización
del pool de maquinarias propuestas según la necesidad del proyecto y en función
al terreno excavado y a la saturación con hidrocarburos de éste. Entre los equipos
facilidades adicionales a movilizar también se necesita de baño químico,
adecuación de área para reuniones de campo, y caseta para coordinaciones de
obra.
Las maquinarias típicas que se pueden utilizar se encuentran en la tabla No. 2:
TIPO DE MAQUINARIA
VOLQUETE
TRACTORES
CARGADOR FRONTAL
RETROEXCAVADORA
MOTONIVELADORA
RODILLO
CISTERNA

Tabla 2. Relación de maquinaria utilizada en el movimiento de tierras

c. HABILITACION DE ACCESOS PRINCIPALES
En el área del proyecto se pueden encontrar accesos construidos pero ademas de
deben construir los adicionales y necesarios los cuales seran ajustados a los
niveles, cotas de topografía, y del diseño de los accesos del proyecto.

d. PREPARACION DE ARCILLA Y ANALISIS DE LABORATORIO

Para poder preparar las celdas se necesita retirar el material contaminado, nivelar
el fondo e impermeabilizar las celdas con una barrera natural como es la arcilla
especial. Para este propósito se buscan las canteras, se toman muestras de las
canteras de arcilla de la zona para ser utilizadas como fuente del material para la
impermeabilización del fondo de las celdas de tratamiento. Estas muestras se
analizan en los Laboratorios de Suelos, donde se realizan los ensayos de: Proctor
Modificado, Permeabilidad Compactada, Límites de Attemberg y posteriormente
pruebas de campo en cada una de las celdas para comprobar la compactación de
la capa arcilla al 95%.
e. CONSTRUCCION DE LA CELDAS
Las celdas son construidas con medidas de aproximadamente 70 x 80 m (no es
fijo) y con una pendiente en el fondo del 1% aproximadamente que descargará
las aguas pluviales a una canaleta de 40 x 40 cm en eventos como el fenómeno El
Niño.
Entre las actividades desarrolladas se encuentran:
 EXCAVACION DE MATERIAL CONTAMINADO Y MATERIAL
LIMPIO
En las celdas, según el levantamiento topográfico inicial, toda el material
contaminado se retira y apila. Este se transporta a una zona aledaña a la
celda con la finalidad de poder llegar a la cota de sub - rasante de la celda.
El volumen de arena fina cortado y transportado que no esta contaminado
se dispone adecuadamente. El nivel de excavación se puede verificar con
un instrumento de campo denominado PetroFlag y es del orden de 0,5
PPM.
 LASTRADO Y NIVELACIÓN DE ARCILLA
La arcilla a utilizar en el fondo de las celdas debe cumplir con un índice
de permeabilidad igual o menor a 10-7 cm/seg. de tal manera que al
compactar debería llegarse hasta el 95% o más de compactación. Los
valores indicados deben ser sustentados con las pruebas de compactación
(Densidad de Campo) realizados por un laboratorio de prestigio.

En el proceso de nivelación y con los datos de lo niveles topográficos colocados

en campo se completa la capa de arcilla de 30 cm de espesor y con una pendiente
de 1% aproximadamente para recuperar el agua pluvial que será drenada a una
canaleta de 40 x 40 cm.
Luego se procede a la nivelación, humectación y compactación de la capa de
arcilla.
Finalmente, se realiza la reubicación del material contaminado a la celda (ver
foto), la cual se acumula en pilas para luego ser removida y cubicada.

Volteos de suelos (Landfarming)

Durante el Landfarming, operación conocida también como tratamiento
con tierra ó patio de cultivo, el terreno contaminado es sometido a una
serie de volteos y mezcla con material “fresco” cuyo fin es :
1. Activar, mediante la oxigenación y adición de nutrientes, los
microorganismos que naturalmente se encuentran en los suelos para
degradar sedimentos aceitosos y biológicos.
2. Establecer, mediante la adición del suelo fresco y material orgánico,
condiciones físicas (textura, permeabilidad, consistencia, porosidad,
concentración de hidrocarburos, temperatura, humedad) y químicas (pH,
concentración de nutrientes, oxígeno) óptimas para el desarrollo
microbiano.
 (EPA, United States Environmental Protection Agency- Landfarming
1998)

• Aplicación de nutrientes
Es un tarea crítica que mantiene la actividad microbiana y facilita el
proceso de biodegradación.
Básicamente se aplica al suelo luego de obtener los resultados de
laboratorio referidos a los nutrientes, tipo de suelo, densidad y humedad.
Con los datos obtenidos en laboratorio, como son las concentraciones de
nitrógeno, nitratos, fósforo, potasio y materia orgánica se calculan las
cantidades que de cada elemento que necesita el terreno y se agrega el
nutriente al voleo o en solución.

TRABAJANDO CON LOS MICROORGANISMOS

Las principales actividades desarrolladas en el laboratorio se consignan en el diagrama.

a) Determinación del Estado de Referencia a nivel microbiológico.

A nivel microbiológico, los parámetros a definir durante el proceso de
monitoreo son: Recuento Población Total Microbiana heterótrofa (ufc/g) y
Recuento de Poblaciones microbianas con posibles propiedades degradadotas
(ufc/g).

Zona 1 Zona 2 Zona

3
 Recuento Población total microbiana heterótrofa 2x 3x 2x
(ufc/g) 105 104 105
Recuento población Total con posible habilidad 3x 3x 4x
degradadota (ufc/g) 101 101 102

Tabla 3. Resultados de los análisis microbiológicos realizados a 30 muestras

compuestas de suelo provenientes de una área de tratamiento.

b) Aislamiento y selección de cepas microbianas con posible potencial

degradador
Las muestras de suelo provenientes del área deben procesarse siguiendo la
Técnica de siembra en placa en superficie, previa dilución de la muestra en
solución salina realizando un montaje de dos sistemas de selección en
paralelo.
Con base en propiedades macroscópicas se realiza la selección de cepas para
los sistemas de aislamiento empleados. Los microorganismos al crecer sobre
una superficie sólida de un medio de cultivo determinado forman
agrupaciones denominadas colonias que presentan características propias de
forma, tamaño, color, consistencia, entre otros.

Adicionalmente este sistema permite cuantificar las poblaciones microbianas

heterótrofas aerobias totales y las poblaciones microbianas potencialmente
degradadoras totales, índices que constituyen una de las principales
herramientas en la evaluación de la evolución del proceso de biodegradación

Efectivamente cuando se registra una alteración del ecosistema por la presencia

de productos contaminantes como los hidrocarburos, éstos afectan de manera
directa y en forma negativa las concentraciones de las poblaciones microbianas
allí establecidas, como consecuencia de su naturaleza química y alta
concentración. No obstante, algunas de estas poblaciones desarrollan estrategias
que les permite utilizar estos compuestos, que bajo condiciones normales actúan
como elementos inhibidores de crecimiento, conllevando a su incremento de 10 3
a 106 veces (Brock,1994; Bossert, I.G., and D.S., Kosson, 1997).
Paralelamente a este sistema, se desarrolla una segunda metodología para el
aislamiento de cepas microbianas degradadoras, basado en la inoculación de las
muestras en un medio de pre-enriquecimiento conteniendo una mezcla de sales
inorgánicas, y analizadas en medios de cultivo selectivos, enriquecidos y
diferenciales.

Este sistema permite también el asilamiento de cepas microbianas.

c) Caracterización fisiológica de cepas microbianas
Las cepas asiladas fueron purificadas mediante el repique de las células en
medios de cultivo enriquecidos, en donde se determinó su pureza definiendo sus
características microscópicas.
Identificación de cepas bacterianas: Una vez obtenidas las cepas puras se
prosiguió para el caso de las bacterias a su identificación teniendo en cuenta los
siguientes parámetros:

- Coloracion de Graham
- Presencia de oxidasa, ureasa
- Presencia de catalasa, citocromo
- Oxidación y fermentación de la glucosa, producción de gas
- Producción de pigmentos
- Tipo de respiración: anaeróbica o aeróbica
- Crecimiento a diferentes temperaturas
- Crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl
Se puede comprobar que los microorganismos aislados son principalmente
bacterias y en menor proporción levaduras. Las propiedades fisiológicas de los
aislamientos obtenidos se han establecido mediante la detección de enzimas, y de
productos metabólicos.
Los microorganismos definidos como bacterias están siendo identificados
siguiendo los parámetros reseñados en el Manual de Bergey de Bacteriología
Sistemática (Williams & Wilkins. 1984), con el fin de establecer
microorganismos tipo que reagrupe las cepas que compartan ciertas propiedades
fisiológicas.
Los microorganismos pueden dividirse en dos grandes grupos por su
distinción nutricional:
• Autótrofos: Organismos que usan dióxido de carbono solo como fuente
principal de carbono.
• Heterótrofos: Organismos que utilizan los compuestos orgánicos como su
principal fuente de carbono (obtienen energía de la oxidación de
compuestos orgánicos, como los hidrocarburos)

Los microorganismos de acuerdo a su tipo de vida simple(protistass) se clasifican

en:
• Procariotas: algas azules y verdes y bacterias
• Eucariotas: Hongos(levaduras y mohos), protozoas, otras algas
Las bacterias, organismos protagonistas de este proceso, se caracterizan por:
 • Representados por todos los tipos de clasificación nutricional
• Morfológicamente como bastones, formas de cocos y espiral
• Algunas se movilizan por medio de flagelos
• Pared rígida de la celda
• Se encuentran en cualquier sitio, en los ambientes más difíciles.

A continuación se presentan algunos tipos de bacterias:

La técnica de Biorremediación está determinada por diversos factores como: el

tipo de microorganismos presentes, las condiciones del lugar a tratar, y la
concentración y toxicidad del contaminante. Hay que tener en cuenta que
diferentes microorganismos degradan diferentes tipos de compuestos y
sobreviven bajo diferentes condiciones ambientales.
Los microorganismos nativos son aquellos que se encuentran viables en un
determinado sitio sin embargo su presencia no es indicativo que estén realizando
algún tipo de actividad. Para estimular el crecimiento de esta población
microbiana nativa es necesario proveer la temperatura del suelo adecuada, la
concentración de oxígeno y los nutrientes necesarios.
Si la actividad biológica necesaria para degradar un contaminante en particular
no se encuentra presente en el suelo a tratar, los microorganismos bioaumentados
con una efectividad evaluada pueden ser adicionados al suelo contaminado en
cuyo caso se hablaría de microorganismos exógenos. Las condiciones del suelo
necesitan ser ajustadas para asegurar la actividad de los exógenos.
La biorremediación puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas y
anaeróbicas. Bajo condiciones aeróbicas, los microorganismos utilizan el oxígeno
atmosférico disponible; con las concentraciones de oxígeno suficientes los
microorganismos convierten a los hidrocarburos en CO 2 y H2O. Bajo condiciones
anaeróbicas, hay descomposición de los hidrocarburos pero no significa que se
eliminen completamente. Adicionalmente hay que tener en cuenta que los
compuestos del petróleo no son fermentables, su descomposición se hace
mediante una ruta aeróbica.

Evaluación de biodegradación bajo condiciones in vitro

Las rutas de degradación de hidrocarburos por acción microbiana involucran el
proceso de co-metabolismo, el cual sugiere la liberación de productos
intermedios (biotransformación) mediante la actividad enzimática de algunos
microorganismos para que sean utilizados como sustrato por otros. De esta forma
los hidrocarburos se van descomponiendo poco a poco por medio de una acción
conjunta, y no por la presencia de un solo tipo de microorganismo (Brock, 1994.
Bossert, I.D., and D. Kosson. 1997)

Lo anterior sugiere que lo más conveniente era la aplicación de un caldo

heterogéneo asegurando una mejor degradación de los contaminantes presentes
en la zona de tratamiento, para lo cual se debe evaluar el proceso biodegradador
de las posibles diferentes mezclas de microorganismos.

No obstante antes de preparar las mezclas de microorganismos a evaluar se debe

asegurar que éstos tienen capacidad de desarrollarse óptimamente sin que se
generarán reacciones de competencia por espacio, nutrientes y/o de limitación de
crecimiento por síntesis de sustancias inhibitorias entre ellos reduciendo al
mínimo factores que pudieran interferir con el proceso de biodegradación
(Goldstein, R.M. et al. 1985 ).

Para poder determinar las posibles relaciones de antagonismo entre los

microorganismos seleccionados se deben montar una serie de ensayos (Jagnow,
G., and W. Dawid.1991), los cuales indicaran si se presenta o no algún tipo de
inhibición entre especies de bacterias, entre especies de levaduras y entre
bacterias y levaduras.

Para el montaje de los ensayos de biodegradación se evalúan las mezclas de

microorganismos. En la siguiente tabla 7 se presenta un cuadro referencial.

No. Ensayo Mezcla de microorganismos

1 Levadura Grupo 1
Levadura Grupo 2
2 Pseudomonas aeruginosa
3 Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens
4 Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens
Levadura Grupo 1
Levadura Grupo 2
Levadura Grupo 3
5 Pseudomonas aeruginosa
 Serratia marcescens
Bacillus spp
Bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae
6 Pseudomonas aeruginosa
Serratia marcescens
Bacillus spp
Bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae
Levadura Grupo 1
Levadura Grupo 2
Levadura Grupo 3

Tabla 7. Composición microbiana de las mezclas evaluadas para pruebas de

biodegradación bajo condiciones de laboratorio.

El esquema general para la biodegradación de compuestos hidrocarbonados es

netamente oxidativo, en donde los hidrocarburos actuando como donadores de
electrones se oxidan en presencia de oxígeno el cual se reduce actuando como
aceptor final de electrones. De esta manera el substrato hidrocarbonado se
descompone hasta CO2. En consecuencia la medición de la producción de CO2
constituye un mecanismo para la detección del proceso de mineralización
indicativo de la descomposición de los hidrocarburos.

La actividad biodegradadora se evalúa incubando en recipientes cerrados 100 g

de suelo proveniente del área de tratamiento, inoculado con la mezcla de
microorganismos correspondiente. La concentración de inóculos bacterianos
puede llegar a ser del orden de 108 ufc/ g de suelo. Estos frascos llegan a mostrar
en su parte superior un desprendimiento que hacia el extremo opuesto se
encontraba sumergido en una solución de KOH 20%. Estas pruebas son
incubadas a temperatura ambiente, y el nivel de KOH debe ser monitoreado
diariamente con el fin de detectar su reducción como consecuencia de un cambio
de presión en respuesta a la liberación de CO2.

Otra técnica para probar la capacidad de degradación de los microorganismos

consiste en medir el potencial degradador de cepas aisladas y seleccionadas en
forma individual utilizando compuestos puros de hidrocarburos. Para este caso el
crecimiento de las bacterias se realiza utilizando medios de cultivo cuya única de
fuente carbono está suministrado por hidrocarburos. Se puede evaluar el n-
hexano, fenol, n-hexadecano, xileno, benceno, fenantreno, entre otros. Estos
productos por algunos muy tóxicos, pueden ofrecer resultados muy útiles para la
selección del pool microbiano.
Preparación del caldo microbiano
El pool microbiano seleccionado debe estar constituído por las cepas bacterianas
con mayor potencial degradador del hidrocarburo: Algunos pooles típicos
incluyen a las Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Bacillus spp.
Adicionalmente a la selección del pool degradador, se debe evaluar a nivel de
laboratorio un medio de cultivo para la propagación de cepas microbianas y
posterior preparación del caldo microbiano.
Este medio, constituído básicamente por melaza, urea y sales inorgánicas
mezcladas en proporciones adecuadas, favorece el crecimiento microbiano. Bajo
ciertas condiciones se le puede adicionar agar granulado para solidificar la
mezcla y permitir así el crecimiento superficial.

El medio se puede servir en bandejas previamente esterilizadas y sembradas con

un inóculo de cada microorganismo a aplicar seguido por un tiempo de
incubación de 48-72 horas a temperatura ambiente (28- 30°C).

Finalmente se realizó una resuspensión de las cepas sembradas por extensión en

superficie conformando el inóculo semilla, el cual se envasa en tanques para
luego ser transportado y agregado al área de tratamiento.

El inóculo semilla fue adicionado al tanque de producción asegurando que la

concentración final era de 107 células/mL.

Aplicación del caldo microbiano

La aplicación del caldo se realiza sobre el terreno previamente preparado
mediante la técnica de Landfarming en donde el TPH registrado se debe
encontrar dentro del rango establecido para asegurar la optimización de la
biodegradación de hidrocarburos (Ercoli, E.C., et al. 1999).

Antes de las aplicaciones del caldo microbiano se realizaron volteos mecánicos

y/o manuales del material contaminado para asegurar:

- Mayor área de exposición del producto contaminante

- Procesos de oxigenación actuando a dos niveles

Oxidación de Hidrocarburos Disponibilidad de oxígeno para favorecer el proceso

de respiración aeróbica microbiana
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