BIO 144 – Bioquímica I Carrera Biología

Lab 1: Cromatografía Aminoácidos

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

1. INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos constituyen los bloques de construcción de péptidos y proteínas. Los
principales grupos funcionales en la estructura de los aminoácidos son: el ácido carboxílico, que
da el carácter ácido y el grupo amino, que provee de las características básicas. La estructura
general de los aminoácidos a pH fisiológico se encuentra a la derecha.
El grupo R representa la cadena lateral, un grupó único para cada uno de los 20 aminoácidos que aparecen en
las proteínas. Todos los aminoácidos tienen el grupo carboxilo y amino libres, a excepción de la prolina, que posee una
cadena lateral cíclica y un grupo amino secundario.
Las propiedades del grupo R pueden ser utilizadas para caracterizar los aminoácidos. Las diferentes cadenas
laterales y sus propiedades de solubilidad pueden ser utilizadas para identificar los diferentes aminoácidos de acuerdo a
su tasa de migración en un papel de cromatografía.
La cromatografía es una técnica experimental ampliamente utilizada para la separación de una mezcla de
compuestos en sus componentes individuales. Dos tipos de cromatografía comúnmente utilizadas son la cromatografía
en columna y la cromatografía en papel.
En la técnica de cromatografía en columna la solución que contiene la mezcla a ser separada es vertida en la
columna que tiene un relleno de adsorbente sólido. El contenido adsorbido por la columna puede ser eluído con el
mismo o un solvente diferente. Este sistema cromatográfico es denominado sólido-líquido; la fase estacionaria (el
adsorbente) es sólida, en cambio, la fase móvil (el eluyente) es líquida. En cambio, en la cromatografía en papel, el
papel adsorbe agua de la atmósfera de un cromatograma en desarrollo. (El agua está presente como vapor y puede ser
suplementada como uno de los componentes de la solución de elución.) El agua se convierte en la fase estacionaria, en
cambio, el otro componente del solvente de elución es la fase móvil y arrastra consigo los componentes de la mezcla.
Este sistema es denominado líquido-líquido.
La cromatografía en columna se usa generalmente con fines preparativos (e.g. purificación) cuando uno trabaja
con grandes volúmenes de muestras de las que quiere obtener cantidades en miligramos o gramos de compuesto. Por
otro lado, la cromatografía en papel es una técnica analítica. Pueden separase miligramos o incluso picogramos de
muestra con esta técnica que caracteríza a los compuestos de una muestra de acuerdo a su valor de Rf. Este valor es un
índice que indica cuán lejos se ha movido un determinado compuesto en el papel.

Rf = Distancia migrada por la muestra (desde el centro de la mancha) hasta el origen

Distancia migrada por el solvente desde el origen (font)

Por ejemplo, en la figura de la derecha los

valores Rf de las dos sustancias presentes en la
muestra son: Rf Sustancia 1 = 3.1cm/11.2cm =
0.28; Rf Sustancia 2 = 8.5cm/11.2cm = 0.76.
Para revelar el/los los aminoácidos
presentes en una muestra separada por
cromatografía en papel, comúnmente se utiliza una
solución de ninhidrina que es rociada sobre el papel
luego de la cromatografía.
En este laboratorio, usted realizará un cromatografía en papel de 2 aminoácidos: Glicina y Glutamto. Además
llevará a cabo el análisis de una solución de Aspartame (edulcorante artificial) y el producto de hidrólisis de una bebida
dietética.

2. MATERIALES
Solución 0.5% Aspartame (Equal o similar) HCl 3M
Solución 0.1% Glicina Solución 0.2% Ninhidrina en spray
Solución 0.1% Glutamato Mezcla solvente (butanol:ácido acético:agua)

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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Lab 1: Cromatografía Aminoácidos

Horno 100°C Guantes latex (2 pares/persona)

Incubadora 35°C Mondadientes (1 caja /curso)
Tubos de ensayo Secadora de cabello pequeña (una por grupo)
Agua destilada Frasco vidrio (largo y ancho de acuerdo al papel filtro)
Pipetas 1mL y 10 mL y propipetas Mechero (1/grupo)
Pinza para tubos Alcohol de quemar (1L/curso)
Los estudiantes deben traer: Lapiz
Coca Cola diet 500mL (1 por curso) Marcador indeleble
Edulcorante Equal (1 sobre/grupo) Alambre delgado (5 cm)
Papel Aluminio (1 rollo/curso) Atomizador (spray) vacío y pequeño. Puede ser de algun
Papel filtro (Whatman N°1 o N°2) (1 papel/grupo) perfume, lavado y seco.
Regla

3. PROCEDIMIENTO
Parte A:
1. En un tubo de ensayo disuelva 10mg del edulcorante Equal en 1mL de HCl 3M. Caliente la solución
con un mechero y lleve a ebullición por 30 segundos. Es importante que no caliente directamente la
solución en el fondo del tubo, sino que caliente el tubo justo por encima de la solución, como se muestra
en la figura derecha. Una vez que comience a ebullir, no deje que la solución se evapore. Luego de este
procedimiento, almacene el tubo que es su muestra de aspartame hidrolizado.
2. Marque 3 tubos de ensayo con las siguientes muestras: 1) Glicina; 2) Glutamato 3) Bebida dieta y coloque 0.5 mL de
cada una en el tubo correspondiente.
DESDE ESTE PUNTO UTILICE GUANTES PARA MANIPULAR EL PAPEL FILTRO.
3. Corte un pedazo de papel filtro de forma rectangular (7 x 5 cm). Con un lapiz dibuje una
linea paralela a 1cm del borde del papel filtro. Con el lápiz marque un punto que indique
dónde colocará la muestra a separar. Ver figura izquierda.
4. Con un mondadientes transfiera una pequeña cantidad de aminoácido/muestra al punto
asignado en el papel filto. Utilice una secadora de cabello para secar las muestras. Repita
este procedimiento 5 veces. Evite que el
punto de muestra que coloca se haga más
grande que 1 mm de diámetro.
5. Ensamble un sistema similar al de la figura de la derecha. Utilice un
frasco de vidrio de boca ancha bien limpio, enjuagado con agua destilada
y seco. Coloque como máximo 10 mL de la mezcla de solvente
(butanol : ácido acético: agua) en el frasco. Utilice un alambre delgado
sobre el que colgará el papel de cromatografía. Deje que el borde del
papel toque el solvente y no así la línea que dibujó y donde sembró las
muestras. Utilice un papel aluminio y tape el frasco.
6. Coloque el sistema en la incubadora a 35 °C. Controle que el solvente
suba el papel por capilaridad aproximadamente 6cm (40-50min). Evite que llegue 1 cm por debajo del alambre.
7. Retire el frasco de la incubadora. Inmediatamente y con mucho cuidado utilice un lápiz para marcar el punto hasta
donde llegó el solvente.
8. Cerca a un area ventilada (ventana) haga secar el papel de cromatografía con ayuda de una secadora de cabello.
9. Asegúrese de tener guantes puestos. Utilice el atomizador para rociar el papel de cromatografía con la solución de
ninhidrina.
10. Coloque el papel de cromatografía en una estufa a 100°C por 3 min. Inmediatamente después verifique la presencia
de puntos y márquelos con un lápiz. Calcule el valor de Rf para cada punto.
Referencias.
• Frederick A. Bettelheim, Joseph M. Landesberg. Laboratory Experiments for Introduction to General,
Organic and Biochemistry. Cengage Learning. Seventh edition. USA.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA