Microbiología General Manual 2020 Final

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Vicerrectoría de Docencia
Dirección General de Educación Superior
Faculta de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biotecnología
PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Biotecnología
ÁREA: De Ciencias Microbiológicas
ASIGNATURA: Laboratorio de Microbiología General
CÓDIGO: LBTS 020
CRÉDITOS: 7
FECHA DE ACTUALIZACIÓN: FEBRERO 2020
Laboratorio de Microbiología general

1. DATOS GENERALES
Nivel Educativo: Licenciatura
Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Biotecnología
Modalidad Académica: Presencial
Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Microbiología General
Ubicación: Básico
3. REVISIONES Y ACTUALIZACIONES
María del Rocío Bustillos Cristales
Elsa Iracena Castañeda Roldán
Autores:
Silvia María del Carmen García García
Ricardo Munguia Pérez
Fecha de diseño: 4 de agosto de 2014
Fecha de la última actualización: Febrero 2020
Fecha de aprobación por parte de
la academia de área,
departamento u otro.
Elsa Iracena Castañeda Roldán
María del Rocío Bustillos Cristales
Laura Martínez Pérez
Revisores:
Silvia María del Carmen García García
Ricardo Munguía Pérez
Luis Ramiro Caso Vargas
4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

Disciplina profesional: QFB, Biotecnólogo y disciplinas afines
Nivel académico: Maestría o Doctorado en áreas afines. 2

Experiencia docente: Mínima de 2 años
Experiencia profesional: Mínima de 2 años

OBJETIVOS:
a. General: Facilitar, a través de prácticas de laboratorio cuidadosamente seleccionadas, la

comprensión y aplicación de los aspectos básicos del análisis microbiológico general que serán
de gran utilidad para sus aplicaciones biotecnológicas prácticas en áreas como salud,
ambiente, alimentos, agropecuaria y bionegocios.
b. Específicos:
• Introducir al alumno en el manejo de las técnicas asépticas del laboratorio de

Microbiología
• Generar interés en los microorganismos como modelos de estudio de diversos procesos
biotecnológicos.

REGLAMENTO QUE RIGE EL USO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El presente Reglamento es aplicable a todos los usuarios del Laboratorio, equipos,
herramientas y materiales pertenecientes al laboratorio de Microbiología de los
Multilaboratorios de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla EMA6, su conocimiento
y ejecución es obligatorio para todos los usuarios del mismo (personal académico, alumnos).
No excluye otra reglamentación que resulte aplicable.
DISPOSICIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

✓ Podrán disponer del material y/o equipo, previa autorización del académico responsable
del Laboratorio, los alumnos que estén oficialmente inscritos en la licenciatura en
Biotecnología y/o alumnos que estén realizando proyectos bajo la supervisión de un
Profesor de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla o del responsable del
laboratorio.
✓ Para ingresar al laboratorio es indispensable contar con el equipo de seguridad

adecuado: bata, zapatos cerrados (no zapatillas ni huaraches), guantes, cabello
recogido y obligatoriamente pantalón largo.
✓ Colocar las mochilas o pertenencias en el lugar indicado por el profesor, no colocar

cosas diferentes del material a emplear en la práctica sobre las mesas.
✓ El usuario deberá comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones del

laboratorio (no jugar, no correr y acatar las medidas de seguridad indicadas), hacer uso
apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus profesores y compañeros de clase.
✓ Solo podrán hacer uso del equipo y material, los alumnos que hayan sido previamente
capacitados para el uso del mismo.
✓ Queda estrictamente prohibido para el usuario el consumo de alimentos y bebidas de

cualquier tipo dentro de las instalaciones del laboratorio.
✓ Las puertas de acceso deberán de estar siempre libres de obstáculos y accesibles para
ser utilizadas ante cualquier eventualidad.
✓ En caso de emergencias o incidentes dentro de las instalaciones del laboratorio se

deberá informar al docente, al técnico y en caso necesario al responsable de laboratorio.
4

✓ Realizar uso adecuado del equipo y material perteneciente al laboratorio de
microbiología, en caso de romper algún material este, deberá ser repuesto al
laboratorio, para lo cual se tendrá que llenar el vale de adeudo de material.
✓ Cada alumno tiene la obligación de mantener limpia el área de trabajo y respetar las
áreas asignadas a cada equipo o material, manteniendo siempre el orden en cada lugar
de trabajo e invariablemente dejar perfectamente limpio las áreas ocupadas al terminar
de usarlas.
REGLAMENTO GENERAL DEL USO DE LABORATORIO

(PERSONAL ACADÉMICO)
✓ El docente responsable de las prácticas en el laboratorio deberá elaborar una

programación de las prácticas a realizar durante el curso, el cual será entregado al
responsable del laboratorio antes de iniciar el curso, para contemplar la solicitud de los
materiales y reactivos.
✓ El docente deberá solicitar al técnico, el material y equipo correspondiente para la
realización de la práctica y/o experimento al menos 1 semana antes del día de entrada
al laboratorio.
✓ El docente deberá haber informado previamente al alumno la práctica a realizar,
comentando las medidas de seguridad, correspondientes al material y equipo a usar.
✓ Al entregar el material ó equipo, el docente y el alumno deberán reportar
inmediatamente sobre cualquier defecto observado en el equipo y/o material de
laboratorio al docente a cargo y al técnico, de lo contrario tendrá que reponerlo o
pagarlo.
✓ Los Profesores que hagan uso del laboratorio con un grupo son responsables de:
✓ Supervisar el buen uso de las instalaciones, del material y equipo del laboratorio por
parte de los alumnos.
✓ Organizar el tiempo de su práctica, supervisar que el material utilizado sea lavado, las
mesas del laboratorio se limpien adecuadamente y entregar el material 15 minutos antes
de terminar la práctica.
✓ Respetar el tiempo asignado para cada práctica.
✓ Supervisar el trabajo de los alumnos en las instalaciones del laboratorio, ningún alumno
debe quedarse solo en el laboratorio.
✓ En caso de que el alumno dañe el equipo y/o material a su cargo de manera accidental
o intencional, deberá reponerlo antes de concluir el curso, por uno de las mismas 5
características.
o Nota: El alumno llenará un vale de adeudo de material y dejará su credencial a
resguardo hasta reponer el material.

✓ Todos los residuos sólidos y líquidos generados durante la realización del trabajo
experimental, deberán colocarse en los contenedores identificados para este fin. Los
materiales punzo cortantes y biológico–infecciosos deberán desecharse de acuerdo a
lo dispuesto para el manejo de este tipo de residuos.
✓ Cualquier muestra que se guarde en los refrigeradores, y estufa de incubación, deberá
estar etiquetada con la siguiente información:
o Nombre del usuario.
o Tipo de muestra.
o Asignatura a la que pertenece.
o De lo contrario se desecharán sin excepción.
✓ En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continua, deberá solicitarlo al
técnico o responsable del laboratorio y dejarlo indicado en forma claramente visible y
legible en el equipo. Quedará bajo la responsabilidad del Docente a cargo, la vigilancia
del término de su experimento.
✓ No se permitirá el desarrollo de ninguna práctica o experimento que no cuente con la
autorización del personal Docente y del responsable del laboratorio.
✓ Si el personal Docente requiere trabajar en el laboratorio y/o equipo fuera del horario
asignado, deberá solicitar una fecha en horario que esté disponible el laboratorio, al
responsable de laboratorio. En caso de tesistas adicionalmente deberán tener la
autorización del su asesor.

NORMAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD
Las prácticas del laboratorio deben estudiarse previamente y conocer el fundamento de cada
experimento.
2. Es indispensable el uso de una BATA BLANCA LIMPIA para realizar cada práctica.
3. Bajo ninguna circunstancia se debe fumar, comer, masticar chicle o beber agua o refresco
dentro del laboratorio.
4. La barba crecida, el cabello abundante y suelto y las uñas largas, constituyen fuentes de
contaminación durante el manejo de las muestras y de los medios de cultivo.
5. Mantenga la mesa libre de todo lo que no sea esencial.
6. Limpiar y desinfectar la superficie de las mesas antes y después del trabajo del día.
7. Lave sus manos con agua y jabón antes y después de cada práctica. Luego asegure de
frotarse las manos con alcohol.
8. Llevar registro de sus análisis indicando: Tipo de muestra, procedencia, fecha, tipo de
siembra o método, cultivos empleados y resultados obtenidos.
9. Identificar las muestras antes de comenzar el análisis, no desechar hasta obtener el
resultado.
10. El material a examinar debe tocarse exclusivamente con instrumentos estériles.
11. En caso de regarse un cultivo sobre la mesa o el piso o cualquier accidente como
cortadura, quemaduras, caída del material infectado en la conjuntiva ocular, ruptura de una
lámina montada al microscopio de aviso inmediato al profesor. Tome todas las precauciones
posibles para evitar estos accidentes.
12. Cuando tenga el asa bacteriológica cargada con algún cultivo de microorganismos no se
desplace de un área a otra ya que puede crear aerosoles, trabaje solo en su puesto.
13. Flamee el asa antes y después de usarla.
14. Descarte todo el material usado en recipientes destinados para tal fin por ningún motivo
en los desagües o lavatorios.
15. Tenga cuidado con las preparaciones teñidas ya que puede salpicar colorantes a las
mesas y pisos.
16. Al final de la práctica dejar el lugar limpio y ordenado.
17. Es muy importante la asistencia a la práctica a la hora indicada, ya que las explicaciones
se darán en los primeros minutos.
18. Antes de comenzar la práctica, léase la guía de laboratorio. Esto le ayudará a entender
mejor y a realizar un trabajo ordenado y eficiente de laboratorio.
19. Anote todos los resultados y las explicaciones pertinentes.
20. Cada sesión de laboratorio deberá iniciarse con una corta explicación. No empiece a
trabajar hasta que haya recibido todas las instrucciones
21. Cada práctica deberá reportarse ocho días después de haberla realizado, debe estar
escrita en computadora, en orden e incluir discusión de los resultados.
PREPARACIÓN Y MANEJO DEL MATERIAL 7

a) Antes de iniciar el trabajo práctico definir las técnicas, el volumen de muestra, la cantidad
de material y medios de cultivo que se van a emplear para no producir desperdicios de
reactivos y falta de material estéril.

b) El material necesario debe esterilizarse con anticipación por los integrantes de cada equipo
c) El material estéril debe estar bien etiquetado y ubicado en un lugar específico dentro del
laboratorio.
d) Para la utilización de las pipetas de volumen variable, consulte al Profesor. Estas son muy
sensibles y se descalibran además de contaminarse si se hace mal uso de ellas.
e) Es indispensable que después de interpretar los resultados de la práctica se esterilice el
material de desecho. Los equipos que no esterilicen el material, automáticamente perderán el
derecho de re-ingresar al laboratorio.

PRÁCTICA NÚMERO 1
PREPARACIÓN ESTERILIZACIÓN Y DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS:
• Reconocer cuales son los agentes de control más empleados para combatir los microorganismos.
• Conocer el efecto que causa cada uno de los agentes de control microbiano sobre la célula.
• Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo existentes para el crecimiento de
microorganismos en el laboratorio.
• Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de cultivo.
MATERIAL Y REACTIVOS:
3 Erlenmeyer de 100 ml Balanza
6 cajas de petri Autoclave, estufa y horno
2 tubos de ensayo Agar Cuenta estándar (estándar para conteo en
1 pipeta de 10 ml placa), Agar rojo de fenol, y caldo nutritivo.
1 probeta de 100 ml
Espátula
INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos pueden ser aislados y propagados por diferentes métodos: su utilización
varía según el propósito y tipo de microorganismo que se deseen aislar. Para su identificación se utilizan
diferentes métodos como son el estudio de su morfología que también incluye sus reacciones frente a
diferentes colorantes y el tipo de estructura que pueden poseer como endosporas, cápsula, etc. Así
mismos son de gran utilidad sus productos metabólicos ya que muchos de estos son típicos para cada
especie y pueden ser utilizados para su identificación; estas sustancias metabólicas pueden ser detectadas
por medio de una serie de pruebas que se conocen como reacciones bioquímicas.
Para cualquiera de los casos anteriores (morfología, coloración o reacción bioquímica) se necesitan
medios de cultivo adecuadamente seleccionados, preparados y almacenados.
Independientemente de los medios de cultivo y métodos utilizados, el éxito del trabajo en el laboratorio
de microbiología depende de la adecuada elección y buen uso de los métodos de esterilización y técnicas
asépticas. 9
Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas, animales y plantas y
cuya gravedad oscila entre una infección débil, intoxicación e incluso la muerte. Pueden contaminar los
alimentos y producir cambios físicos y químicos en ellos, haciéndolos en algunos casos incomibles e
incluso venenosos. Los microorganismos son responsables también de la alteración de muchos otros
materiales, generando graves pérdidas económicas. Por ello es indispensable disponer de procedimientos
para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano. Las principales razones para controlar la
contaminación y el crecimiento microbiano. Las principales razones para controlar a los
microorganismos pueden resumirse de la siguiente forma:
• Para evitar la transmisión de las enfermedades y las infecciones.
• Para eliminar los microorganismos de un hospedador que está infectado.
• Para eliminar microorganismos de diferentes materiales y así evitar su deterioro y alteración.
Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos, agentes químicos,
o por procesos físicos y agentes quimioterapéuticos.
El estudio de los microorganismos lleva consigo la utilización de una amplia gama de medios de cultivo
tanto líquidos como sólidos, pero previamente es necesario obtener cultivos puros de aquellos.
DESARROLLO EXPERIMENTAL:
1. Realizar los cálculos respectivos para agar y caldo teniendo en cuenta que para cada caja deben
servir 15-18 ml de agar y para cada tubo entre 7-10 ml de caldo. Ejemplo: Para preparar 6 cajas
con agar Cuenta estándar, multiplique 6 por 15 ml = 90 ml.
2. Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos.
3. Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, haga la relación de polvo de agar que debe
pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio.
4. Pese la cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos.
5. Mezcle el polvo con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, agite y adicione el
restante de agua.
6. - Lleve a hervir si es necesario (en caso de los Agares).
7. - Esterilizar en la autoclave a 15 lb de presión a 121ºC por 15 minutos.
8. - Sirva 15-18 ml aproximadamente de agar en cada caja cuando la temperatura este a 50-55ºC,
tápelas y deje solidificar. Lo mismo con los caldos sirva 7-10 ml en cada tubo y tápelos.
9. - Déjelos enfriar y guárdelos en el refrigerador hasta su utilización.
Resultados:
1. Reportar los cálculos obtenidos de los medios que utilizó teniendo en cuenta el de los caldos y los
agares.
2. Reportar las observaciones sobre el crecimiento microbiano en las placas de los diferentes agares
3. Si utilizó cultivos líquidos, reportar lo observado cómo crecimiento microbiano
4. Entregar bitácora con el reporte de laboratorio para evaluación. 10

CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se deben esterilizar los medios de cultivo?
2. ¿Si no se realizan los cálculos adecuadamente para la preparación de los medios qué puede ocurrir
en el momento de sembrar?
3. ¿Por qué se deben esterilizar los medios de cultivo?
BIBLIOGRAFÍA:
P. W., editors: Bacterial physiology, New York, Academic Press, Inc. BioQuest, 2003. Division of
Becton, Dickinson & Co.
Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory
procedures, 2003, Detroit, Difco Laboratories.
Porter, J. R.: Bacterial chemistry and physiology, 2002. New York, John Wiley & Sons, Inc.
Snell, E. E.: Bacterial nutrition-chemical factors. In Werkman, C. H., and Wilson, P. W., editors:
Bacterial physiology, New York, 2002, Academic Press, Inc.
11

PRÁCTICA NÚMERO 2
AISLAMIENTO EN CULTIVO PURO O AXÉNICO Y MÉTODOS DE
CULTIVO
OBJETIVO:
• Capacitar al estudiante a obtener cultivos puros a partir de las siembras realizadas en la clase
anterior para llegar a la identificación de uno o más microorganismos.
Caldo-tripticasa-soya
Medios de cultivo sólidos
Asa bacteriológica
INTRODUCCIÓN:
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. Por
ello, una técnica esencial en Microbiología es la obtención de cultivos puros (axénicos), a partir de los
cuales son posibles estudios sobre las propiedades del microorganismo.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para obtenerlo es necesario
recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean
un medio de cultivo sólido, en el que el microorganismo genera colonias separadas. Se puede demostrar
que prácticamente cada colonia procede de una misma célula o de un grupo de células del mismo tipo si
el microorganismo forma agregados. Por ello, lo más correcto es hablar de UFC al referirnos al origen
de una colonia.
Para proceder a la identificación bacteriana, así como para su utilización en algún proceso de producción
industrial o de investigación se deben asegurar que estos estén en cultivos puros ó axénicos. Lo cual
significa que en el cultivo solo se encuentra una cepa bacteriana como regla general procedente de la
multiplicación de una sola bacteriana, para este fin se pueden utilizar varios métodos que van desde el
aislamiento de una solo bacteria utilizando micropipetas, aislamiento por agotamiento, diluciones,
utilización de medios selectivos entre otros.
Los usados comúnmente son los de siembra en medios de cultivo selectivo para lo cual es indispensable
conocer las características fisiológicas del organismo que se desea asilar.
DESARROLLO EXPERIMENTAL: 12
Método de estrías o estría| cruzada (Figura 1)
1. Preparar el sitio de siembra en condiciones asépticas

2. Prender el mechero
3. Tomar en una mano la caja y en otra el asa, (Si el sitio asegura una buena asepsia) la caja fuente
puede permanecer en la mesa de trabajo.
4. Se esteriliza (rojo incandescente) y enfría el asa.
5. Se abre la caja fuente y con un movimiento suave se toma una pequeña muestra de la colonia.
6. Se cierra la caja fuente y se abre la caja receptora con medio fresco y estéril pasando el asa sobre
el medio de cultivo marcando una primera zona de siembra en un extremo de la caja haciendo
pases paralelos.
7. Se cierra la caja, se esteriliza y enfría el asa nuevamente.
8. Esta vez sin tomar más muestra de la caja original (fuente) se pasa el asa estéril tocando una sola
vez la zona demarcada anteriormente marcando líneas perpendiculares a esta.
9. Se repite el procedimiento hasta marcar cuatro zonas.
10. Se espera que en la última zona sean arrastradas pocas bacterias. Esto se ha logrado a partir de
una sola bacteria y se encuentren suficientemente aisladas las unas de las otras. Para lograr el
resultado se repite todo el procedimiento con una de las colonias aisladas obtenidas. Cuando todas
las colonias presentes en una caja son iguales en tamaño, color, aspecto y demás características
podemos asumir que tenemos un cultivo puro.
11. En general, los cultivos puros se obtienen mejor con el empleo de medios sólidos, ya sea en placas
o por estrías. Ambos métodos resultan útiles y cada uno de ellos presenta sus ventajas.
Cultivo en estrías:
Si se han efectuado correctamente, constituyen quizás el método más práctico y útil para la obtención de
cultivos puros en discretas colonias. Los métodos de estriación pueden variar de un laboratorio a otro,
pero se pueden utilizar las siguientes técnicas para inocular cualquier tipo de placa de agar. Estas placas
se preparan por anticipado, en la cantidad que se desee, y se conservan a temperatura ambiente o en
refrigerador hasta el momento de la inoculación. La superficie de agar debe hallarse libre de gotas de
líquido de condensación antes de efectuar la estriación. Las placas se dejarán secar invirtiéndolas y
apoyándolas sobre la tapa (Fig. 2-1 A).
El método 1 (Fig. 2 B) aun cuando está destinado a cultivo en caldo, se puede utilizar también para
cultivos en placas de agar o en cultivos inclinados (en "pico de flauta") de agar. En cualquier caso, se
recomienda el empleo de un inóculo reducido y una moderada superposición.
1. Recoger el inóculo con un asa de platino y colocarlo cerca de la periferia de la placa, tal como se
indica en la figura.
2. Con el asa, extenderlo sobre la parte superior de la placa.
3. Con el asa, efectuar incisiones o picaduras en el agar, repetidas veces, y continuar la estriación,
13
superponiendo una estría a la otra, como puede verse, en el dibujo.
4. Volver a efectuar picaduras con el asa y continuar la estriación.
5. Pasar el asa por la llama, dejar enfriar, pasar por sobre la estría anterior y completar la estriación.

6. Levantar el asa y efectuar estrías en zigzag en el centro de la placa.
Estría en pico de flauta: El segundo método de, estriación (Fig. 1 C) se puede utilizar para el crecimiento
de cultivos en medios sólidos (colonias o cultivo "en pico de flauta") o para cultivos en caldo espeso.
1. Seleccionar de una placa la colonia deseada, o recoger de un cultivo en pico de flauta, con un asa,
una porción de crecimiento. Estriar cuidadosamente en una parte reducida de la placa, como se
indica en la figura 1C. Pasar el asa por la flama y dejarla aparte.
2. Con el asa de platino estéril y fría, pasarla por la región inoculada previamente y estriar la cuarta
parte superior de la superficie de la placa, con pasajes paralelos y próximos. Pasar el asa por la
llama y dejarla enfriar.
1. 3.Girar la placa en ángulo recto, hacer un pasaje con el asa por la parte inferior de la región
estriada en segundo término y efectuar estrías en la mitad, aproximadamente, de la superficie
restante. No superponer las partes ya sembradas.
3. Girar la placa 180 grados y estriar el resto de la caja con la misma asa, evitando cubrir las partes
ya inoculadas.
4. En las partes inferiores de la placa aparecerán colonias discretas.
14

Figura 1. Técnicas para la estriación de placas. A) Secado de una placa de agar en el laboratorio, B)
Método 1, C) Método 2, D) Método 3.
Siembra en cultivo líquido:

1. Siembre las mismas bacterias, en tubos con caldo-tripticasa-soya inoculando una asada de la
bacteria. Deje un tubo testigo sin inocular.
2. Incube todos los tubos sembrados a 37° C por 24 hrs.
3. Saque de la incubadora sin agitar los tubos. Note una turbidez, un sedimento, una película
superficial, o combinados.
4. Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio líquido y por qué no se aíslan las
bacterias. Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos. Compare sus
resultados personales con los de los otros equipos.
5. Reporte los datos obtenidos de sus siembras de acuerdo a las especificaciones dadas
anteriormente.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué deben realizarse varios pases de una colonia antes de su identificación?
2. ¿Por qué los microorganismos presentan diferencias morfológicas al ser sembradas en diferentes
medios, teniendo en cuenta los medios que sembró cada grupo?
BIBLIOGRAFÍA:
Committee on Bacteriological technique, Society of American Bacteriologists: Manual of
microbiological methods. New York. 2002. Mc-Graw-Hill. Co; also ASM: Manual of clinical
microbiology, 2003.
15

PRÁCTICA No 3
TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE, DIFERENCIAL Y SELECTIVA
OBJETIVOS:
• Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más comunes para
el estudio microscópico de cultivos microbianos y realice descripción inicial de la morfología de
los microorganismos.
Por Equipo
1 probeta de 100 mL 1 frasco gotero con aceite de inmersión
1 vaso de precipitado de 100 mL 1 piseta con alcohol al 70%
2 mecheros Fisher papel estraza, algodón y gasa
2 asas de inoculación tira de papel filtro Wathman # 1
10 portaobjetos Medios y reactivos
1parrilla de calentamiento con agitación 1 juegos de colorantes de Gram
1 gradilla 1frascos gotero con verde de malaquita 5% en
1 piseta con agua destilada agua
2 microscopios ópticos Etanol absoluto
INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos vivos son por lo general son incoloros a excepción de algunos como algas
y cianobacterias, lo que impide que sean observados con facilidad en un microscopio óptico de campo
claro ya que dejan pasar una gran cantidad de luz, existe entonces una falta de contraste entre las células
y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis. Los colorantes pueden
emplearse para crear contraste y distinguir entre diferentes tipos de células o determinados constituyentes
celulares, esporas, cápsulas, paredes celulares, etc.
Los frotis los podemos preparar colocando una pequeña cantidad de la suspensión de microorganismos
sobre una superficie transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes
orgánicos.
Se conocen diferentes tipos de tinciones: simple, diferencial y selectiva, de acuerdo con el número y tipo
de colorantes utilizados y de los objetivos de estudio. 16
La tinción simple es aquella que hace uso de un solo colorante.
Las tinciones que permiten diferenciar microorganismos con características superficiales distintas son
las diferenciales, y necesitan de más de un colorante. Una de las más populares en bacteriología es la
propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, que clasifica los cultivos bacterianos de menos
de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.
Con las tinciones selectivas podemos observar estructuras especializadas que son usadas para la
clasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar bacterias
de tipo Bacillus y Clostridium y otras bacterias capaces de esporular.
El profesor proporcionará cultivos líquidos y sólidos de cada una de las cepas de estudio y un cultivo
problema. El equipo de trabajo preparará frotis de los dos tipos de cultivos y hará tinción simple de
Sacaromices cerevisae; tinción de Gram de Micrococcus sp., Escherichia coli., Bacillus sp., así como la
tinción selectiva de endosporas en cultivos de Bacillus sp. También aplicarán estas técnicas en el cultivo
problema.
PREPARACIÓN DEL FROTIS

1. Etiquetar los portaobjetos, esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo
vivo, dejar enfriar el asa para evitar dañar a los microorganismos. Si partimos de un cultivo sólido,
colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
2. Tomar la muestra, colocarla en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular
de más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.
3. Para los cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza el mismo
procedimiento antes descrito.
4. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor, pasando el portaobjetos rápidamente 2-3 veces
por la flama del mechero. Los frotis de medios líquidos se fijarán colocando dos gotas de etanol
absoluto, que se dejarán secar al aire (precaución: hacer esto en zona alejada del mechero).
Figura 2. Preparación del frotis o extendido bacteriano. A y B, Cultivos en caldo y en agar en pico de
flauta, C: Colonias en placa de agar. D, Extendido de un cultivo líquido. E, Colocación con el asa de
platino de una pequeña cantidad de agua para la suspensión de microorganismos. F, Extendido 17
múltiple.

Método de tinción simple
1. Cubrir el frotis de S. cerevisiae y de la muestra problema con 1 gota de azul de metileno durante
60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.
Tinción diferencial (método de tinción de Gram)

1. Cubrir el frotis de Micrococcus sp., E. coli, Bacillus sp. y de la muestra problema con 2 gotas de
cristal violeta durante 60 segundos. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para
eliminar el exceso de colorante.
2. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con
precaución el frotis con agua.
3. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más colorante.
Lavar de inmediato con agua.
4. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. Lavar de nuevo con agua, quitar el exceso de
agua y dejar secar al aire.
Figura 2.1. Pasos en la tinción de Gram
Tinción selectiva
1. Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre un frotis de Bacillus sp.
2. Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición.
4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más, si es necesario).
5. Eliminar el colorante con agua destilada y cubrir con safranina durante 30 segundos.
6. Lavar nuevamente, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.
18
Observación al microscopio.
1. Limpiar con precaución los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación (iluminación Köhler), siguiendo las
indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, después
pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña
gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Resultados
1. Reportar las observaciones microscópicas en los cuadros correspondientes
2. Comparar sus observaciones con la información reportada en la literatura.
Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple

Levadura Problema
Cultivo líquido
Aumento total:
Forma: (esféricas, ovales)
Agrupación (solos, par, cadenas, racimos)
Densidad
Cultivo sólido
Aumento total:
Forma: (esféricas, ovales)
Agrupación (solos, par, cadenas o
racimos)
Densidad
Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram

Cepa 1 Cepa 2
Cultivo líquido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, espirilo)
Agrupación (solos, par, cadenas, racimos)
Cultivo sólido
Aumento total: Forma: (cocos, bacilos,
espirilo)
Agrupación (solos, par, cadenas o
racimos)
19
Cultivo líquido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos,spirilo)

Cepa 3 Problema
Agrupación (solos, par)
Descripción microscópica de endosporas

Bacillus sp Problema
Descripción del cultivo: (líquido
o sólido, edad del cultivo)
Forma y localización de la
endospora (central o lateral)
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación y fijación de frotis?
2. ¿Cuál es la descripción general de un microorganismo que puede reportar en un estudio microscópico
aplicando las técnicas de la práctica?
3. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la tinción de Gram?
4. Si se aplica la tinción de Gram de Bacillus sp con endosporas ¿Cómo se observarían la célula
vegetativa y la endospora? ¿Por qué?
BIBLIOGRAFÍA:
Introducción a la Microbiología. Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Ed. Médica
Panamericana, 2007 - 959 páginas 9ª edición
Brock Biologia de los Microorganismos 10a Ed. Michael Madigan; John Martinko; Jack Parker. Pearson
Educacion, 2009. ISBN 9788420536798
Prescott - Microbiologia, 7 Edc. Autor: Willey, Joanne. McGraw-Hill. ISBN: 9788448168278. EAN:
9788448168278. Edición: 07. F. publicación: 01-JAN-09
20

PRÁCTICA No 4
PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA
OBJETIVOS:
• El alumno reconocerá las diferentes propiedades metabólicas bacterianas mediante su capacidad
para utilizar diferentes sustratos, y utilizadas para su identificación.
1 gradilla Medio TSI (triple azúcar hierro)
2 parrillas de agitación Medio de citrato de Simmons
2 probetas de 100 mL Caldo urea
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL Leche tornasolada
2 agitadores magnéticos Agar gelatina nutritiva
2 mecheros Fisher 1 caja de Petri con Agar Almidón
1 asa de siembra 12 tubos (campanas) de Durham
3 tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca 2 portaobjetos
y 7 mL de cada medio). 2 pipetas Pasteur
Caldo glucosa-rojo de fenol 1 piseta con agua destilada
Caldo lactosa-rojo de fenol Papel para envolver
Caldo sacarosa-rojo de fenol Algodón y gasa
Caldo manitol-rojo de fenol
Medio SIM (Sulfuro, Indol, Movilidad)
INTRODUCCIÓN:
Las bacterias en muchas ocasiones no muestran suficiente variedad de aspectos morfológicos para
su identificación por lo que se requiere de información adicional además de la obtenida en el estudio
morfológico, como son sus características metabólicas, fisiológicas, etc.).
El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de
obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos
(catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo, se encuentran las de síntesis
de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).
Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son intracelulares,
aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas por la célula para catalizar
reacciones fuera de esta. 21
Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su inoculación en medios
de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energía, carbono, donadores
de electrones, así como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento.

Las pruebas bioquímicas consisten medios de cultivo adicionados con indicadores de pH para detectar la
producción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros,
etc. que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas. Las actividades que se evalúan
con mayor frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para
catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas hidrolíticas específicas de tipo endo o exo
como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etcétera.
Por la importancia que tienen estas pruebas bioquímicas para la identificación de especies bacterianas
en áreas de alimentos, clínica y ambiental, se han desarrollado sistemas bioquímicos miniaturizados
(Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma más rápida y segura pero que mantienen los
criterios de evaluación de las pruebas bioquímicas convencionales.
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens
y Klebsiella sp. Cada equipo trabajará con un cultivo puro y un cultivo problema, que inocularán en
diferentes medios de cultivo para evaluar diferentes actividades metabólicas. Compartirán sus cuadros
de resultados con los otros equipos.
Nota: Los tubos con medio TSI y medio de citrato de Simmons se dejan solidificar en forma inclinada;
los tubos con agargelatina nutritiva y medio SIM en forma recta. Uno de los tubos de cada medio se
etiqueta como control y no se inoculará, pero se incubarán de la misma forma que los tubos inoculados.
• Fermentación de carbohidratos:
1. Inocular cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa, lactosa, sacarosa y
manitol.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios
en el color del indicador y producción de gas en la campana de Durham (medios de glucosa,
lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol).
Criterios de evaluación:
• Producción de ácido
Prueba positiva (+): color amarillo
Prueba negativa (-): color rojo
• Producción de gas
Prueba positiva (+): Burbujas en campana de Durham
Prueba negativa (-): Sin burbujas
22
• Utilización de urea, azúcares, proteínas y producción de sulfuros:
1. Inocular cada cepa en tubos de caldo urea, leche tornasolada.

2. Los tubos con TSI Agar se inoculan primero por picadura en el fondo del tubo y terminar con
estría simple en la superficie.
4. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación.
• Caldo urea
Prueba positiva (+): rojo cereza
Prueba negativa (-): rosa
• TSI
Para la producción de H2S
Prueba positiva (+): ennegrecimiento del medio
Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento
• Fermentación de azúcares:
Sin fermentación de azúcares: Medio alcalino, color rojo en pico de flauta sin cambio en profundidad
Fermentación de los azúcares: Medio ácido, color amarillo en pico de flauta y profundidad
Fermentación de glucosa: Alcalino/ácido, color rojo en pico de flauta y amarillo en profundidad
• Producción de gas
Prueba positiva (+): Separación ruptura del agar
Prueba negativa (-): Sin cambio
• Leche tornasolada
Cambio de color:
Fermentación de la lactosa: ácido color rosa
Formación de CO2 e H2: gas
Liberación de amoníaco: alcalino color azul púrpura
Reducción del tornasol: Incoloro (blanco)
Formación de coagulo
Peptonización (digestión): licuefacción
• Producción de sulfuros, indol y movilidad:
1. Inocular por picadura hasta el fondo del tubo cada uno de los tubos con agar SIM.
3. Realizar observaciones a las 24 horas.
• Producción de H2S
Prueba positiva (+): ennegrecimiento del medio
Prueba negativa (-): no hay ennegrecimiento
23
• Movilidad
Prueba positiva: hay una turbidez difusa del medio, Prueba negativa: sólo hay crecimiento a lo largo
de la picadura.

• Producción de indol
Prueba positiva: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Kovacs,
Prueba negativa: no hay aparición de color.
• Asimilación de citrato como fuente de carbono:
1. Inocular primero por picadura en el fondo del tubo y terminar con estría simple en la superficie.
3. Realizar observaciones a las 24 y 48 horas.
Prueba positiva (+) viraje del medio a azul
Prueba negativa (-) sin cambio
• Actividades hidrolíticas
1. Inocular cada cepa por picadura (con el asa recta) en los tubos con gelatina nutritiva y por estría
simple en la mitad de una caja de Petri con agar almidón.
2. Incubar los tubos y la caja a 35°C durante 24 a 48 horas.
3. En los tubos de agar gelatina, observar si hubo licuefacción del medio y después agregar
cuidadosamente 1-2 gotas de solución de ácido tricloroacético al 5%, observar la aparición de
zonas claras o turbidez en el medio.
4. Observar la actividad de amilasas en la caja de agar almidón por el crecimiento de colonias y
aparición de zonas claras alrededor de la misma. Para mejor observación, agregar unas gotas de
lugol y localizar zonas claras cerca de las colonias y el color azul en la parte no inoculada del
medio como indicativo de prueba (+).
• Actividad de catalasa
1. Preparar en una gota de agua sobre un portaobjetos una suspensión de una colonia obtenida
en medio de agar almidón.
2. Agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que
indican una prueba de catalasa (+).
RESULTADOS:
1. Reportar los resultados en el cuadro con la notación siguiente:
Crecimiento: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), crecimiento medio (++), crecimiento abundante
(+++).
Actividad metabólica: Positiva (+), Negativa (-)
2. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en
la práctica.
3. Con base en sus resultados y la información bibliográfica, identifique la especie bacteriana que
corresponde a su cultivo problema 24

Medio de cultivo
Cepa Cultivo Problema
Caldo rojo de fenol Glu Lac Sac Man Glu Lac Sac Man
Crecimiento
Ácido (amarillo)
Alcalino (rojo
Gas
Leche tornasolada:
Ácido (rojo a rosa)
Álcali (azul a púrpura)
Sin cambio (azul)
Reducción (blanco)
Peptonización(licuefacción)
Coagulación (cuajada)
Gas (burbujas)
Caldo Urea:
Crecimiento
Sin cambio (rosa)
Hidrólisis de urea (rojo cereza)
Medio TSI:
Crecimiento
Producción de H2S
Producción de gas
Fermentación de glucosa
Sin fermentación de azúcar
Medio SIM:
Producción de H2S
Producción de indol
Movilidad:
Crecimiento: superficial, en la
parte media, en el fondo
Crecimiento en la picadura
Gelatina nutritiva
(Actividad proteolítica):
Licuefacción del medio 25
Formación de turbidez al
agregar TCA al 5%
Hidrólisis de gelatina

Crecimiento: superficial, en la
parte media, en el fondo
Crecimiento en la picadura
Movilidad
Agar almidón (actividad amilolítica):
Color del medio con el lugol
Descripción de colonias
Movilidad
Agar almidón (actividad amilolítica):
Color del medio con el lugol
Descripción de colonias
Medio de Citrato de Simmons:
Cambio de color
Utilización de citrato
Prueba de catalasa:
Burbujeo
CUESTIONARIO:
1. Describa las actividades enzimáticas que se evalúan en cada uno de los medios de cultivo utilizados
en la práctica, indicando la reacción bioquímica general.
2. ¿Por qué se recomienda evaluar las pruebas bioquímicas primero a las 24 horas y después de 48
horas?
3. ¿Qué pruebas bioquímicas le permitieron comprobar la capacidad de oxidación completa de la
glucosa? ¿Por qué?
4. ¿Por qué se busca la precipitación de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la superficie?
BIBLIOGRAFÍA:
Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Jean F. MacFaddin.
Ed. Médica Panamericana.3a ed. 2003
Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas en color. Elmer W.
Koneman, Stephen Allen. Ed. Médica Panamericana. 6a ed. 2006
26

PRÁCTICA NÚMERO 5
TÉCNICAS DE SEMBRADO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR

EL MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA
OBJETIVOS:
• Aplicar diferentes estrategias para el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra
desconocida, según sus requerimientos metabólicos y nutricionales
• Estimar la biomasa de un cultivo por recuento de células viables en placa.
Agar cuenta estándar Equipo:
Agar rojo bilis verde brillante Contador de colonias tipo Québec
Agar Papa dextrosa Micropipetas
Agua destilada estéril Incubadora
Tubos de vidrio Autoclave
Probeta
INTRODUCCIÓN:
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de colonias (semi-
indirectos), la técnica por vaciado en placa es la más ampliamente utilizada.
La muestra (o diluciones de ella) en volúmenes conocidos se deposita en una caja Petri estéril, se adiciona
el medio de cultivo fundido y convenientemente enfriado y se mezcla con el inóculo. Después de la
incubación se cuentan las colonias desarrolladas, las que multiplicadas por la inversa de la dilución que
corresponda a la placa contada, permite estimar el número de microorganismos viables por gramo o mI
de muestra. Obviamente de acuerdo con las condiciones de la prueba (composición del medio de cultivo,
condiciones de la incubación y el tipo de colonias contadas) el recuento obtenido se referirá a
determinado grupo de microorganismos.
El principio de esta técnica se basa en una presunción cuya validez no es absoluta: cada colonia proviene
de una célula viable. Por una parte, muchos microorganismos se desarrollan en los alimentos y en los
medios de cultivo utilizados en el laboratorio formando grupos de mayor o menor consistencia, los que
a su vez se dispersan en sus unidades en grado variable durante la homogenización de la muestra y la
preparación de las diluciones. De esta suerte la colonia observada puede provenir lo mismo de una unidad 27
que de cualquier otro número de ellas en la muestra original. Por esta razón algunos prefieren sustituir
los términos "recuento de colonias" por los de "recuento de unidades formadoras de colonias" (UFC),
que reflejaría mejor el trasfondo del proceso escenificado en las placas. Por otra parte, células viables

aisladas o agrupadas, eventualmente no se desarrollan en la placa debido a las más diversas causas, entre
otras: el efecto antagónico o antibiótico de otros microorganismos, la presencia de sustancias inhibitorias
en los alimentos o en los medios de cultivo, una desvitalización de las células como consecuencia de
tratamientos subletales que el alimento haya recibido, tales como desecación, calentamiento,
congelación, radiaciones, etc., o la existencia de variantes fisiológicas dentro de un grupo microbiano
particular que requieren nutrientes especiales o son de lento crecimiento en el medio de cultivo y bajo
las condiciones de incubación de la prueba.
1. Verificar antes del análisis la cantidad de cajas, pipetas, tubos y frascos con diluyente que se
van a necesitar, así como el recipiente con desinfectante donde se irán colocando las pipetas
usadas.
2. Distribuir el material en la mesa de trabajo de manera que el análisis pueda efectuarse cómoda y
libremente.
3. Marcar en la tapa de la caja los datos pertinentes para identificarla (clave, fecha, dilución, etc)
4. Transferir 1 ml de la muestra directa o dilución según sea el caso, en la caja abriendo solo lo
suficiente para introducir la pipeta con una inclinación de 45°C, aplicando la punta de ésta en el
fondo de la caja mientras escurre el líquido, golpeando 3 veces en una zona de la caja libre de
líquido. No soplar. (Ver figura 3 A).
5. A cada caja inoculada adicionar de 12 a 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado en baño
María de 44 a 45º C. Ver figura 3 B).
6. Homogeneizar con la muestra mediante movimientos circulares (7 a la derecha y 7 a la
izquierda) y rectos (7 hacia arriba y 7 hacia abajo) evitar el contacto del medio con la tapa de la 28
caja Petri. Dejar solidificar. Ver figura 3 C).
7. Incluir una caja testigo por cada frasco de medio de cultivo y anotar su resultado.
8. Incubar las placas en posición invertida a 35-37º C durante 24 horas.

9. Al término de la incubación realizar el recuento de colonias, el recuento se efectúa con ayuda de
un contador de colonias tipo Québec.
Resultados
1. Bacterias Mesófilas aerobias (BMA): Contar todas las colonias desarrolladas en la placa
excepto los hongos, no confundir con burbujas de aire, partículas de alimento, impurezas, etc.
2. Coliformes Totales (CT): Contar todas las colonias de color guinda desarrollados en el seno del
agar, no contar los de la superficie.
3. Hongos y levadura (H y L): Contar todas las colonias desarrolladas en la placa.
4. El tiempo transcurrido desde la preparación de la muestra hasta la agregación del medio de cultivo
no debe exceder de 20 minutos.
5. En caso de CT agregar una sobrecapa del mismo medio.
6. Se considera una caja contable cuando el número de unidades formadoras de colonias (UFC) es
de 30 a 300. Si el número de colonias es muy elevado contar 10 cuadros grandes de la cuadrícula
del contador, sacar la media y multiplicarlo por 65.
7. Si el número de colonias aún en el cuadro grande es muy elevado contar 10 cuadros pequeños de
la cuadrícula, sacar la media, multiplicar por 9 y posteriormente por 65. El resultado será el
número de colonias de esa dilución.
Figura 3: Procedimiento para el método de vertido en placa.3 A) Depósito del inóculo, 3 B) Mezcla del
inóculo con el agar y 3 C) Homogeneización de la mezcla.
29

Figura 3.1. Diagrama de Vertido en Placa

CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el fundamento de las diferentes pruebas que se han realizado?
2. ¿Cuáles son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y por qué se utilizan?
BIBLIOGRAFÍA:
Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory
procedures, 2003, Detroit, Difco Laboratories.
Porter, J. R.: Bacterial chemistry and physiology, 2002. New York, John Wiley & Sons, Inc.
Snell, E. E.: Bacterial nutrition-chemical factors. In Werkman, C. H., and Wilson, P. W., editors:
Bacterial physiology, New York, 2002, Academic Press, Inc.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D.H., Stahl D.A. 2015. Brock. Biología de los
microorganismos, 14ª ed. Ed. Pearson, USA.
30

PRÁCTICA NÚMERO 6
CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS FILAMENTOSOS
OBJETIVOS:
• Que el alumno aprenda las técnicas de cultivo y manipulación de diferentes tipos de hongos y
conozca las principales características morfológicas (macroscópica y microscópica) de los
hongos.
• Conocer los medios habituales y técnicas de cultivo de hongos filamentosos.
Portaobjetos
Cubreobjetos Agujas de disección
Colorante azul de algodón Cepas tipo de:
Tinta china negra Trichophyton rubrum, Geotrichum sp.,
Asas micológicas Cryptococcus sp., Candida sp., Aspergillus sp.,
Agar Sabouraud Fonseacea pedrosoi, Penicillum sp., Rhizopus
Parafilm sp.
Equipo:
Microscopio
INTRODUCCIÓN.
Los hongos presentan diversas estructuras que nos permiten identificarlos fenotípicamente; la
hifa (unidad funcional del hongo), al conjunto de hifas se le denomina micelio este puede ser septado o
cenocitico; por el diámetro que presenta puede ser macrocifonado (> 1μ), y microsifonado (<1μ), por su
coloración será hialino si no presenta color y carotenoide (color naranja) o fugilaginoso (color negro).
Los hongos presentan reproducción sexual (esporas) y asexual (conidio) y a través de estas estructuras
se lleva a cabo la identificación.
Medios de cultivo:
Los medios de cultivo se pueden utilizar en diversos contenedores como los tubos con tapón de
rosca/algodón o en placas de petri.
Medios de uso común:
• Agar Dextrosa Sabouraud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e 31
identificación de muestras clínicas.
• Agar Dextrosa Sabouraud: se utiliza para el aislamiento e identificación de patógenos ambientales

y oportunistas.
A) Técnica de siembra y procesamiento
Siembra con concentración: Se realizan siempre que la muestra es líquida y se hace por centrifugación a
1500-2000 r.p.m. durante 10 minutos. El sedimento se utiliza para un examen directo o bien para cultivo.
Siembra de macerado: Se realizan con el fin de aumentar la superficie de la muestra
B) Examen microscópico directo
Es el método más simple y rápido para establecer un diagnóstico presuntivo de micosis.
Tinciones para el examen directo
• Examen con Solución Salina: colocamos una gota de la muestra líquida en un portaobjetos y
añadimos una gota de solución salina.
• Hidróxido de potasio (10%): colocamos la muestra en pequeñas porciones sobre un portaobjetos
y añadimos varias gotas de KOH y ponemos el cubre.
• Azul de Algodón: añadimos una gota de la muestra o una porción del hongo en un portaobjetos.
C) Identificación de hongos filamentosos
La identificación se hace en base a su morfología, que puede ser macroscópica y microscópica y que
varía en función del medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubación.
Características macroscópicas
• Textura de la colonia
• Algodonosa: micelio denso y largo
• Glabra: consistencia cérea. No micelio aéreo
• Aterciopelada: micelio aéreo corto
• Pulverulenta: gran cantidad de esporas y conidias
• Coloración
D) Técnicas para la observación de las características microscópicas
1. Técnica con cinta adhesiva: tomamos un trozo de cinta tocamos suavemente la parte superior del hongo
del que queremos observar sus características microscópicas y lo colocamos sobre un portaobjetos al que
anteriormente habíamos añadido una gota de colorante azul algodón de lactofenol
E) Microcultivo
1. Se utiliza un medio Saboraud que se vierte sobre una placa de petri (capa delgada). Una vez
solidificado cortamos cuadrados con un bisturí estéril de 1 cm y los colocamos en un portaobjetos
estéril o flameado. El portaobjetos estará colocado en una placa de petri estéril, sobre un soporte.
32
En el fondo de la placa añadiremos unas gotas de agua para evitar la desecación durante la
incubación.

2. Inoculamos, los bordes del agar con el hongo a estudiar. Tomamos la muestra con un asa estéril
humedecida con agua. Sellamos las placas con parafilm y llevamos a incubar.
Registrar las características macroscópicas de las cepas proporcionadas en el siguiente formato:
Hongo Color Forma Consistencia Aspecto Bordes

Trichophyton rubrum
Geotrichum sp
Cryptococcus sp
Candida sp
Aspergillus sp
Fonseacea pedrosoi
Penicillum sp
Rhizopus sp.
Hongo Tipo de Aparato Característi Conidias

micelio conidial cas de las Forma y
hifas tamaño
Trichophyton rubrum
Geotrichum sp
Cryptococcus sp
Candida sp
Aspergillus sp
Fonseacea pedrosoi
Penicillum sp
Rhizopus sp.
CUESTIONARIO:
1. Dibuja y menciona 3 hongos que presenten macroconidias
2. Dibuja y menciona 3 hongos que presenten microconidias
3. ¿Qué son los artroconidios y que hongos los presentan?
4. Dibuja el aparato conidial de Aspergillus sp. y Penicillium sp.
5. ¿Qué es un esporangio y que hongos los presentan? Dibújalos.
33

Figura 4. Colonias de hongos, levaduras y bacterias de un cultivo mixto. Tomado de:

http://www.healthproo2.com/test-results.html.
BIBLIOGRAFÍA:
López M., Méndez, T., Hernández H., Castañón O. (2004) Procedimientos para el diagnóstico de
laboratorio; segunda edición. Editorial Trillas. México.
Rippon, J.W. (1990). Micología Médica. Hongos y Actinomicetos patógenos. Editorial Interamericana-
McGrawHill. Tercera edición.
Arenas, R. Micología Médica. 2ª Ed; Ed. Interamericana. (1993)
Bonifaz, A. Micología Médica Básica. 4ª Ed; Ed. Méndez Cervantes. (1997)
34

PRÁCTICA NÚMERO 7
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS
OBJETIVOS:
• Cuantificar el número de bacterias a partir de muestras de suelo por el método de goteo en placa
(drop plate).
• Interpretar adecuadamente los resultados de la cuantificación de microorganismos.
4 Muestras de suelo de diversos ambientes 10 ml de agua estéril
1 Encendedor Balanza granataria
4 Frascos estériles (tipo gerber) Vortex
4 Tubos Falcon de 15 ml estériles (1 por Campana de flujo laminar (opcional)
muestra) Mechero de Bunsen
28 Tubos eppendorf de 1.5 ml estériles (7 por Composición del medio LB
muestra) Peptona de caseína 10g
Puntas amarillas estériles Extracto de levadura 5 g
Puntas azules estériles NaCl 10 g
Micropipeta con capacidad de 20-200 ul Agar 18 g
Micropipeta con capacidad de 1000 ul Agua destilada cbp 1 l
4 Placas con medio de cultivo LB
INTRODUCCIÓN:
La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología
microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto benéfico
o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino también es importante
conocer el número de microorganismos implicados, para establecer si el microorganismo en cuestión
será capaz de desarrollar una función benéfica o perjudicial. Por ejemplo, se requieren alrededor de 109
unidades formadoras de colonia (UFC)/g de nódulo, de la bacteria del género Rhizobium para que se
lleve a cabo una fijación biológica de nitrógeno efectiva en leguminosas. También se sabe que, para 35
obtener una promoción de crecimiento de plantas efectiva, se requiere una población de Azospirillum en
un rango de 106 a 108 UFC/g de suelo. El agua destinada para consumo humano debe cumplir con ciertas
normas, por esta razón la Organización Mundial de la Salud estipula que el agua potable que se destina

para uso doméstico no debe contener más de 200 UFC/ml de coliformes totales, ni más de 20 UFC/ml
de coliformes fecales.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en una muestra, se utiliza
comúnmente la técnica de conteo en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos
presentes, pero las condiciones de crecimiento que utilicemos nos van a permitir seleccionar grupos de
bacterias como, por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, que son un indicador general de la
población que pueden estar presente en una muestra.
Se han descrito varios métodos que nos permiten realizar el conteo de bacterias: Conteo en caja de Petri,
Conteo por filtración, Método del número más probable (NMP), Determinación directa por microscopio,
Método de turbiedad, Determinación del peso seco en las células, Método de goteo en placa.
La metodología de recuento en placa por plateo es una de las más extendidas y consiste en realizar
diluciones seriadas 1:10, y extender 100μl de cada dilución en una placa con un asa de vidrio, las placas
se incuban hasta que las colonias son apreciables para su recuento, esta última ha sufrido modificaciones
al paso del tiempo y en la actualidad se usan perlas de vidrio para extender las muestras. La estimación
del número más probable (NMP) se basa en la presunción de que las bacterias se hallan uniformemente
distribuidas en un medio líquido, o sea que las muestras del mismo tamaño de un mismo producto
tendrían el mismo número de microorganismos. Entonces la cifra media es el número más probable.
Una de las técnicas cuyo uso se ha intensificado en nuestros días para el recuento bacteriano, es la técnica
de goteo en placa, debido a que ésta es fácil, rápida y económica. El método de recuento de goteo en
placa consiste en realizar diluciones seriadas 1:10 de la muestra original y colocar por triplicado gotas
de 20 μl de cada una de las diluciones, en placas con medio gelificado. Las placas son incubadas en las
condiciones de crecimiento “optimas” para la bacteria en cuestión y después del crecimiento se cuenta
el número de colonias en la dilución contable y se realizan los cálculos requeridos.
1. Las muestras de suelo, deben de colocarse en agua estéril en proporción 1:10 p/v en los tubos
falcón. Las muestras deben agitarse vigorosamente y se realizan diluciones seriadas en factor
1:10 en tubos eppendorf. Para ello, se toman 100 μl de la suspensión original con ayuda de una
micropipeta “capacidad 20-200 μl” y se colocan en un tubo que contiene 900 μl de agua
destilada estéril; que es agitada vigorosamente con ayuda de un vortex (dilución 1:10). Con una
punta nueva se toman 100 μl de esta nueva suspensión y se colocan en 900 μl de agua destilada
estéril; voltear nuevamente (dilución 1:100). Este procedimiento se repite hasta llegar a realizar
la dilución 1:10,000,000 (figura 1).
2. Tres réplicas de 20 μl de cada dilución son tomadas con ayuda de la micropipeta y usando
puntas estériles. Las gotas son colocadas en placas de agar con el medio que se desea explorar y
36
bajo condiciones de esterilidad. Una vez colocadas las placas son llevadas a incubación bajo las
condiciones de crecimiento deseadas.

3. Después de la incubación, el número de colonias bacterianas es contabilizado en la dilución
contable (figura 2) y el número de bacterias es determinado multiplicando el número de
colonias por 50 y por el factor de dilución (figura 2). Para muestras de consistencia sólida, el
número debe multiplicarse nuevamente por 10 (debido a la dilución inicial p/v) y reportarse
como UFC/g de muestra.
4. El número de bacterias determinado en cada muestra es anotado en la tabla 1.
37

CUESTIONARIO:
1. De manera concreta describe el fundamento de al menos tres de los métodos de conteo bacteriano
descritos anteriormente e indica ventajas y desventajas de ellos.
2. Qué ventajas le encuentras al método de goteo en placa con respecto a otros métodos.
3. Por qué el resultado se da en UFC/ml?
BIBLIOGRAFÍA:
Corral-Lugo A., Rodríguez-Andrade O., González-Vázquez A., de la O Morales A., Muñoz- Rojas J.
Cuantificación de bacterias por goteo en placa. Procesos Celulares Fundamentales. Manual de Prácticas
de Laboratorio. Pérez-y-Terrón et al., 2010. México. Color 2000 SA de CV. 197-199. ISBN: 978-607-
9108-00-7
Herigstad, B., Hamilton M., and Heersink J., “How optimize the drop plate method for enumerating
bacteria”. 2001. J. Microbiol. Methods 44:121-129.
Hoben, H. J., and Somasegaran, P., “Comparison of the pour, spread, and drop Plate methods for
enumeration of Rhizobium spp. in inoculants made from presterilized peatt” .1982. Appl. Environ.
Microbiol. 44: 1246-1247.
38

PRÁCTICA NÚMERO 8
CUENTA DE BACTERIAS (UFC/ML) POR EL MÉTODO DE VACIADO EN

PLACA
OBJETIVOS:
• Cuantificar bacterias viables en una muestra mediante el método de vaciado en placa
Micropipeta de 1 ml y 200 µl Vaso de precipitado (para desecho de puntas)
Agua destilada Pipeta de 10 mL
Cultivo de E. coli incubado de 18 a 24 hrs en Puntas para Micropipeta de 1 ml (azules)
caldo LB Puntas para Micropipeta de 200 µl (amarillas)
Cloruro de sodio Agar bacteriológico
4 tubos con tapadera o matraz Erlenmeyer de 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
100 mL 1 asa de siembra
4 cajas de Petri estériles Equipo:
6 tubos de ensayo con 4.5 ml de solución salina Balanza analítica
al 0.9% estéril 2 Parrillas de agitación
Caldo LB (Luria-Bertani) Autoclave
Cinta testigo Campana de flujo laminar
Papel aluminio Contador de colonias Quebec
Gradilla Agitador magnético
Mechero
2 Probetas de 100 mL
INTRODUCCIÓN:
La metodología de recuento en placa por plaqueo es una metodología ampliamente utilizada
(Hoben y Somasegaran, 1982), que consiste en realizar diluciones seriadas 1:10 y extender 100µl de cada
dilución en una placa; las placas se incuban hasta que las colonias son apreciables para su recuento. Esta
metodología tiene la ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo, consume mucho tiempo
durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento de bacterias a partir de muestras cuya población
39
se desconoce se requiere realizar el extendido de 7 diluciones y la muestra original (para cada conteo) lo
que significa consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para los plaqueos, sin tomar en
consideración repeticiones. Para disminuir el tiempo de procesamiento de muestra, la metodología ha

sufrido modificaciones al paso del tiempo y en la actualidad se usan bolitas de acrílico en lugar de un asa
de vidrio para extender las muestras. Otra técnica recuento de bacterias utilizada es la de vaciado en
placa, que consiste en colocar 1 ml de muestra de cada una de las diluciones seriadas en las placas, donde
se vacía posteriormente el medio de cultivo a punto de gelificar (agar aproximadamente a 45°C); ésta se
usa ampliamente para determinar el número de coliformes presentes en muestras de agua y alimentos,
sin embargo el método podría ocasionar la muerte selectiva de algunas cepas sensibles a calor (Clarck,
1967), en este método se evita el plaqueo de las diluciones pero el número de placas y medio de cultivo
requerido es equivalente.
Día 1. Preparación del material
1. Preparar y esterilizar 1 tubo con 3 mL caldo LB.
2. Preparar 45 mL de agar LB y distribuir 10 mL en 4 tubos con tapadera (opcional: matraz de 100
ml o tubos falcon de 15 mL)
3. Agregar 15 gramos del agar bacteriológico por litro de caldo LB, autoclavear y repartir en los
tubos.
4. Preparar 30 mL de solución salina al 0.9%, distribuir en 5 tubos de ensayo y autoclavear
5. Esterilizar puntillas para Micropipeta y esterilizar placas de petri
Día 2. Inoculación de E. coli
1. Inocular la cepa de E. coli. Tomar una pequeña porción con el asa bacteriológica y adicionar a
un tubo con 3 mL de cultivo LB estéril.
2. Incubar a 37 0C por 18-24 hrs.
Día 3. Parte 1.
1. Marcar los tubos con solución salina con las diluciones 10-1, 10-2, 10-3,
2. 10-4, 10-5 y 10-6
3. Transferir asépticamente 0.5 ml del cultivo de E. coli al primer tubo de solución salina estéril
(dilución 10-1). Retirar la punta y depositarla en el contenedor.
4. Mezclar la suspensión
5. Con otra punta estéril, transferir 0.5 mL al siguiente tubo de la dilución (dilución 10-2). Retirar
la punta y depositarla en el contenedor.
6. Mezclar la suspensión y repetir hasta obtener la dilución 10-6
Día 3. Parte 2.
1. Usar una placa de calentamiento o baño maría para derretir los tubos (o matraz) con el agar
2. Enfriar a 45 o 50 °C
3. Marcar las placas de Petri con las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6. 40
4. Con una punta estéril, transferir 1 mL de cada dilución etiquetada en la placa de Petri.
5. Después de inocular la dilución, vaciar 10 o 12 mL del medio preparado, mezclarlo mediante 6
movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido

contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
6. Dejar solidificar
7. Incubar las placas en posición invertida a 37 0C por 24-48 hrs.
Día 4
Nota:
1. Si no es posible hacer el conteo de colonias bacterianas después del tiempo de incubación,
refrigerar las placas para detener el crecimiento
2. Observar la distribución y cantidad de colonias bacterianas.
3. Cada colonia corresponde a una unidad formadora de colonia (UFC).
4. Contar el número de colonias presentes (30-300).
5. Las placas con un número de colonias mayor a 300 serán designadas como incontables o TNTC
(por sus siglas en inglés too numerous to count). Si hubiera menos de 30 colonias serán muy
pocas para contar o TFTC (por sus siglas en ingles too few to count).
Resultados y observaciones:
Calculo del número de colonias por mL:
Formula:
41
Número de bacterias/mL = Número de colonias en la placa x factor de la dilución de la muestra/ ml de
la muestra sembrada

Datos:
Muestra: 3 x 10-5 Muestra: 4 x 10-6
Colonias por placa= 559 Colonias por placa= 449
Factor de dilución = 10-5 Factor de dilución = 10-6
Volumen de la siembra= 1 ml UFC/mL Volumen de la siembra= 1 ml UFC/mL
Muestra 3:
Número de bacterias/mL= 559 X 1 x 10-5 / 1ml = 5.59x10-3 UFC/ml
Número de bacterias/mL= 449 X 1 x 10-6 / 1ml = 4.49x10-4 UFC/ml
CUESTIONARIO:
1. Menciona algunas razones por las que es necesario cuantificar el crecimiento bacteriano en las
diferentes áreas de la microbiología (n clínica, ecología microbiana, alimentos)
2. Menciona y describe brevemente al menos cuatro métodos de cuantificación de microorganismos
3. Menciona ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de cuantificación de microorganismos
BIBLIOGRAFÍA
Jesús Muñoz-Rojas, Yolanda Elizabeth Morales-García, Antonino Báez-Rogelio , Verónica Quintero-
Hernández , América Paulina Rivera-Urbalejo y Rocío Pérez-yTerrrón. 2016. Métodos económicos para
la cuantificación de microorganismos. Capítulo de Libro: Instituciones de Educación superior. La labor
investigadora e Innovadora en México. Science Associated Editors L.L.C pp. 67-81.
ISBN-10: 1-944162-16-X ISBN-13: 978-1-944162-16-0
Josephine A Morello; Helen Eckel Mizer; Marion E Wilson. 2003 Laboratory manual and workbook in
microbiology: applications to patient care. McGraw-Hill, ©2003.
42

PRACTICA NÚMERO 9
MÉTODO DIRECTO E INDIRECTO DE CUANTIFICACIÓN BACTERIANA
ESCALA DE MC FARLAND Y DETERMINACIÓN DE UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIA (UFC) POR LA TÉCNICA DE DILUCIÓN Y
SIEMBRA EN PLACA.
OBJETIVOS:
• Conocer una técnica de cuantificación indirecta de microorganismos
• Comparar las ventajas o desventajas de cada una en función de la información que se obtiene, del
tiempo invertido y de los recursos necesarios.
1 Gradilla 1 Micropipeta de volumen variable
11 tubos con tapón de rosca del mismo tamaño 20 Puntas azules y amarillas
de volumen de 15 mL 1 Litro de agua destilada
2 pipetas de 10 mL 1 gramo de Cl2Ba
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL 5 mL de H2SO4 concentrado
1 matraz Erlenmeyer de 100 mL 100 mL de alcohol de 96°C para flamear
1Vaso de precipitados de 500 mL 2 Celdas
3 Placas de Petri con agar nutritivo o cuenta Equipo:
estándar 2 Espectrofotómetros
1Varilla de vidrio en forma de L o triangulo
INTRODUCCIÓN:
Entre los métodos indirectos, uno de los mas utilizados es la medición de la turbidez de los
cultivos en un espectrofotómetro, que es relativamente rápida y que se basa en la capacidad de las células
microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el tamaño de las células en una población
es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes, pero no
se puede diferenciar la turbidez dada por células viables o no viables.
La utilidad de la escala de McFarland es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón.
La medición nefelométrica de turbidez es causada por la luz reflejada en ángulo de 90°C con respecto a
la luz incidente de partículas suspendidas en un líquido. 43
El grado de dispersión de la luz (o turbidez de la solución) es proporcional al número de partículas que
se encuentran a su paso, lo cual depende de la cantidad de microorganismos presentes en la muestra.

Figura 1. Medida de turbidez

La finalidad, es establecer una relación entre la precipitación química y una suspensión bacteriana.
Creamos 10 estándares (en la tabla que aparece la composición de éstos) y por espectrofotometría,
creamos una recta patrón, de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras diluciones
bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la
formación de agregados, …etc.). La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario
en presencia de ácido sulfúrico. Tabla 1.
Tabla 1. ESCALA DE MC FARLAND
Parte 1
1. Preparar las soluciones de la tabla 1.
2. Numerar los tubos del 0.5 al 10 y agregar las proporciones de las sustancias de la tabla 1.
3. Encender el espectrofotómetro y dejar prendido el equipo
44
4. Ajustar el equipo a 600 nm de D.O.
5. Calibrar el instrumento a 0%

6. Colocar la celda con cada una de las soluciones de los tubos, usando agua destilada como
testigo.
7. Medir la turbidez de cada muestra iniciando por el tubo 0.5 hasta el 10.
8. Anote la absorbancia obtenida en cada muestra utilizando la tabla 2.
Parte 2. Método directo de cuantificación bacteriana.

1. Preparar un cultivo de toda la noche (O/N) de E. coli. Dejar el cultivo en agitación a 150 rpm a
37ºC en una incubadora orbital.
2. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-5 a 10-9 en condiciones estériles. Se colocarán
cajas Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 ml de las ultimas 3 diluciones.
3. Distribuir cuidadosamente el inóculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada
en “L” previamente esterilizada a la flama con alcohol y enfriada.
4. Incubar las cajas en forma invertida a 37°C durante 24-48 horas
5. Hacer la cuenta de colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de
colonias sea entre 30 y 300.
Resultados:
Parte 1. Tabla 2. Completa la tabla escribiendo los valores de D.O. a 600 nm de cada tubo del estándar 45
de McFarland

Grafica y ajusta por mínimos cuadrados los resultados para obtener una curva similar a la figura 1.
46

CUESTIONARIO:
1.- Mencione 2 aplicaciones de cada una de las técnicas de cuantificación realizadas en esta práctica.
2.- Cuales son las ventajas y desventajas de ambas técnicas de cuantificación.
BIBLIOGRAFÍA
Madigan M.T. and J.M. Martinko, J.Parker. 1998. Brock. Biología de los Microorganismos. 8va
edición. Prentice Hall. España.
Wistreich, G. A. and M.D. Lechtman. 2000. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa
México.
47

PRÁCTICA NÚMERO 10
EFECTO DEL pH Y TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVOS:
• Que el estudiante conozca el efecto de factores como el pH y temperatura como parámetros de
control de crecimiento microbiano.
• Que el alumno comprenda la importancia de estos factores fisicoquímicos en la selección de
poblaciones microbianas en los diferentes ambientes en que se encuentran y los mecanismos de
adaptación a nivel celular y metabólicos que han desarrollado.
2 Cajas Petri con agar papa dextrosa (PDA) 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación
ajustado a pH=7.0 (Bioxon) ajustado a pH=7.0 con amortiguador
22 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación 1 Asa de inoculación
(Bioxon) ajustado a pH=7.0 sin amortiguar Puntas azules estériles
4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación 3 Mechero de alcohol o Fisher
(Bioxon) ajustado a pH=5.0 sin amortiguar 1 Solución amortiguadora de pH= 4,7 y 10
4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación Equipo:
(Bioxon) ajustado a pH=9.0 sin amortiguar Espectrofotómetro
Microscopio estereoscópico
INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya que éste ejerce una
influencia profunda en su desarrollo al igual que sobre las demás formas de vida. Los factores del
medio se pueden clasificar en tres grupos:
a) Físicos. - Temperatura, presiones externas, humedad
b) Químicos. – pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos tóxicos
c) Biológicos. - Las interacciones microbianas entre especies coexistentes.
Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los hábitats extremos, donde otros no pueden 48
sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales sitios. En
otros hábitats menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren
mayor importancia en la selección de las poblaciones que se encontrarán. Los factores ambientales que

se controlan en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los
fisicoquímicos como: la temperatura y el pH. Todos los organismos tienen una temperatura óptima de
crecimiento que los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de crecimiento. También hay
límites de temperatura, la temperatura mínima en las que son metabólicamente inactivos y una
temperatura arriba de la cual el crecimiento ya no es posible llamarla máxima.
El profesor proporcionará cultivos líquidos de: E. coli, Pseudomonas fluorescens y Lactobacillus sp, una
suspensión de esporas de Aspegillus niger y Penicillum roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará.
Efecto de la temperatura:
1. En tres cajas de Petri de PDA divididas en 2 secciones, inocular 0.1 mL de la suspensión de
esporas de hongos en cada sección.
2. Incubar la caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72
horas y hacer las observaciones macroscópicas.
3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después
de una semana.
4. En seis tubos de caldo microinoculación a pH=7, inocular dos con cada una de las cepas
bacterianas.
5. Incubar dos tubos en la estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48
horas. Medir la D.O. a 600 nm.
Efecto del pH
1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes
valores de pH (5.0, 7.0 Y 9.0) con solución de HCl 1.0 M o NaOH 1.0M.
2. Preparar otra serie de 4 tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior, pero
utilizando soluciones amortiguadoras tal como se indica en la tabla 1.
3. Inocular 1.0 mL de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo
microinoculación ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno
sin inocular como testigo.
4. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas y medir la D.O. a 600 nm
5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las
cepas de hongos
6. Inocular las cajas de Petri a 30°C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas.
7. Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico
Tabla 1. Soluciones amortiguadas para controlar el pH de medios de cultivo. 49

Resultados
A.- Reportar los resultados en los cuadros que se muestran a continuación de acuerdo a: No hay
crecimiento (-), crece muy poco (-), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B.- Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas.
CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su
temperatura óptima de crecimiento?
2.- ¿Cómo influyó el pH en el crecimiento de hongos y bacterias? ¿Qué diferencias se observaron en los
medios de cultivo amortiguados y sin amortiguar?
3.- Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos
extremos y psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
4.- Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y
las condiciones del hábitat de origen de las poblaciones microbianas.
50

51

BIBLIOGRAFÍA:
Holt, J. G., N.R. Krieg. PHA. Sneath J.T. Stanley and S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of 52
Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

PRÁCTICA NÚMERO 11
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVOS:
• Que el estudiante conozca las fases de una curva de crecimiento en un cultivo en lote de
Escherichia coli.
• Que el alumno aprenda a calcular parámetros cinéticos (µ, td) característicos de las especies
bacterianas.
1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de 16 tubos de 9ml de solución salina isotónica
medio líquido estéril
2 Matraces Erlenmeyer de 125 ml con 99 ml de 1 Varilla de vidrio doblada en L o triángulo
solución salina isotónica estéril 12 Placas Petri con agar nutritivo
6 pipetas de 10 ml estériles 2 Celdas para espectrofotómetro
Puntas de 1 mL para micropipeta de volumen Equipo:
variable 1 Espectrofotómetro
1 gradilla
INTRODUCCIÓN:
El crecimiento y viabilidad de los microorganismos está determinada por factores nutricionales y
ambientales, y en condiciones de laboratorio óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento
característica de casa especie microbiana.
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo de
adaptación al medio y condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dando
lugar a una curva tipo sigmoidal que se acostumbra dividir en 4 partes:
53

La Fase de Adaptación o fase lag (A), la fase de crecimiento exponencial o fase log (B), la fase
estacionaria (C) y (D) la fase de declinación o muerte. La forma de cada porción de la curva y el tiempo
de duración de cada fase dependerá de: la especie de microorganismo, la preparación del inóculo, la
composición química del medio de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.
Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sintetizando nuevos componentes,
durante la fase exponencial los microorganismos que se dividen por fisión binaria, lo hacen a intervalos
regulares, finalmente el crecimiento de la población disminuye y la curva se vuelve horizontal debido al
agotamiento de nutrimentos o la acumulación de productos residuales tóxicos hasta que la población
disminuye.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucarióticos y los
eucarióticos pequeños se desarrollan más rápidamente que los grandes.
El metabolísmo energético también influye sobre la velocidad de crecimiento, debido a la ganancia
energética que se obtiene de cada vía catabólica de obtención de energía. Así los microorganismos
fermentadores crecerán más lentamente que los respiradores.
El profesor inoculará E. coli en un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes de
iniciar la práctica, que se utilizará como inóculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente
concentración de glucosa.
Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de inoculación. Se aplicarán
los métodos turbidimétricos y el de diluciones y siembra en placa para cuantificar el crecimiento
microbiano.
Inoculación e incubación del cultivo 54

1. Inocular en condiciones estériles un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio de
cultivo complejo con 10 ml de un cultivo de E. coli.

2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5
ml con una pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra
corresponderá al tiempo cero (t=0). De la misma forma se tomarán muestras a los 0, 0.5, 1, 2,
3 ,4 horas. Para el tiempo de 6 horas de incubación se tomarán 6 ml.
3. Colocar el cultivo en una incubadora de agitación (150 rpm) a 35°C
Tratamiento de las muestras

1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm. Leer el valor
de la densidad óptica a 600 nm
2. En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 ml del cultivo
en un matraz Erlenmeyer con 99 ml de solución salina isotónica (SSI) estéril. Del matraz
con la muestra diluida, hacer una serie de diluciones (base 10) en tubos con 9 ml de SSI
estéril, hasta 10-6. Cuidando de homogeneizar las muestras cada vez que se haga una
nueva dilución.
3. Enseguida inocular 0.1 ml de las {ultimas 3 diluciones en dos cajas Petri con agar nutritivo
y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en L o en triangulo .
4. Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida
durante 24-48 horas
5. Cuantificar el número de UFC/ml de E. coli
55

Figura 1. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una
curva de crecimiento.
Resultados:
1.- Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de E. coli en el cuadro inferior.
2.- El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente
será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa
a.-Una gráfica de D.O. contra el tiempo
b.- En la gráfica a) identificar las fases de crecimiento y duración
c.-Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k= (log N- log N0)/log 2(t),
donde N0 ≠ # de UFC al tiempo “0” y N≠ de UFC al final del experimento
d.- Calcular la tasa de crecimiento especifica (µ) de la fórmula:
µ= ln2(k) con este valor determinar el tiempo de generación de E. coli con la relación td=ln2/µ
56

57

CUESTIONARIO:
1. Como se define el crecimiento microbiano y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en
cada una de las etapas de crecimiento.
2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag
en la curva de crecimiento?
3. ¿Qué condiciones la incrementaría?
4. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación?
5. ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica (µ)?
58

CRITERIOS DE EVALUACIÓN
CRITERIOS PORCENTAJE
Prácticas de laboratorio 100%

Total 100%
REQUISITOS DE ACREDITACIÓN
Estar inscrito oficialmente como alumno del PE en la BUAP

Aparecer en el acta
El promedio de las calificaciones de las prácticas aplicadas deberá ser igual o mayor
que 6
Cumplir con las actividades propuestas por el profesor al inicio del curso
Contar con el 100% de asistencia y en caso de faltar, es posible llevar un justificante
Dos retardos cuentan como una falta y no puede ser justificada.
Una falta no justificada, implica reprobar el laboratorio y por consecuencia reprobar la
materia.
59

Microbiología General Manual 2020 Final

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Microbiología General Manual 2020 Final

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Biotecnología

ÁREA: De Ciencias Microbiológicas

ASIGNATURA: Laboratorio de Microbiología General

CÓDIGO: LBTS 020

FECHA DE ACTUALIZACIÓN: FEBRERO 2020

Laboratorio de Microbiología general

Nivel Educativo: Licenciatura

Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Biotecnología

Modalidad Académica: Presencial

Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Microbiología General

4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

Nivel académico: Maestría o Doctorado en áreas afines. 2

Laboratorio de Microbiología general

a. General: Facilitar, a través de prácticas de laboratorio cuidadosamente seleccionadas, la

• Introducir al alumno en el manejo de las técnicas asépticas del laboratorio de

Laboratorio de Microbiología general

DISPOSICIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

✓ Para ingresar al laboratorio es indispensable contar con el equipo de seguridad

✓ Colocar las mochilas o pertenencias en el lugar indicado por el profesor, no colocar

✓ El usuario deberá comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones del

✓ Queda estrictamente prohibido para el usuario el consumo de alimentos y bebidas de

✓ En caso de emergencias o incidentes dentro de las instalaciones del laboratorio se

Laboratorio de Microbiología general

REGLAMENTO GENERAL DEL USO DE LABORATORIO

✓ El docente responsable de las prácticas en el laboratorio deberá elaborar una

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

PREPARACIÓN Y MANEJO DEL MATERIAL 7

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

PREPARACIÓN ESTERILIZACIÓN Y DE MEDIOS DE CULTIVO

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Siembra en cultivo líquido:

Laboratorio de Microbiología general

TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE, DIFERENCIAL Y SELECTIVA

PREPARACIÓN DEL FROTIS

Laboratorio de Microbiología general

Tinción diferencial (método de tinción de Gram)

Figura 2.1. Pasos en la tinción de Gram

Laboratorio de Microbiología general

Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple

Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram

Laboratorio de Microbiología general

Descripción microscópica de endosporas

Laboratorio de Microbiología general

PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

TÉCNICAS DE SEMBRADO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Laboratorio de Microbiología general

Figura 3.1. Diagrama de Vertido en Placa

Laboratorio de Microbiología general