SMRT: Single Molecule Real Time

INTRODUCCIÓN (2 min)
Secuenciación: qué es, nombrar técnicas 2G
Inconvenientes técnicas 2G

FUNDAMENTO TÉCNICAS SECUENCIACIÓN 3G → SMRT (5 min)

Técnica 3G → Beneficios
Esquemas, videos

APLICACIONES (3 min)

CONCLUSIÓN (1 min)

En la presentación, dar paso ‘’ahora mi compañera … os va a explicar…’’

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COLORINCHIS
Rojo: Cosas por poner en word
Naranja: Cosas por poner en presentación
Azul: Info extra
Lila: Cosas que quizá se pueden quitar
INTRODUCCIÓN
diap 1 - título y nombres - Presentación

diap 2 - INTRODUCCIÓN. ¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN?

Antes que nada, ¿qué es la secuenciación?
La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad
es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) de una muestra de ADN de
interés.

En 1977, el científico Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN

conocido como método de Sanger que se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra
de ADN complementaria a la hebra de cadena simple de ADN que se quiere secuenciar
utilizando didesoxinucleótidos (ddNTPs). Estos nucleótidos han sido modificados de manera
que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', así cuando uno de estos nucleótidos se
incorpora de forma aleatoria a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede
continuar elongándose porque la ADN polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para
añadir el siguiente nucleótido.

En este procedimiento, se preparan cuatro tubos de reacción diferentes, cada uno con el ADN
molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, ADN polimerasa, un “primer” marcado
radiactivamente y con los cuatro nucleótidos trifosfatados. Por último, se le añade a cada uno
una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, se cargan en un gel de
acrilamida y se someten a electroforesis. Finalmente, tras separar en función del tamaño, y
gracias al cebador marcado radiactivamente, se van a poder contemplar diferentes bandas
que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos y deducir la secuencia del ADN
introducido.

Esta técnica se fue mejorando, llegando a la secuenciación Sanger automatizado que marcó
el inico de las tecnologías de secuenciación de primera generación a través del uso de
ddNTPs marcados con fluoróforos distintos, utilización de PCR para la polimerización y la
incorporación de la electroforesis capilar en un gel de poliacrilamida que permitió automatizar
el proceso.

A principios del siglo XXI llegaron las técnicas de 2ª generación, o Next Generation
Sequencing (NGS), un grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de
segmentos de ADN de forma masiva y en paralelo. De todos los métodos de secuenciación
de 2.ª generación es el de Illumina el que se sitúa como referente o estándar actual en cuanto
a secuenciación masiva de ácidos nucleicos. Para realizar esta técnica:
1. Se construyen las librerías a partir de la segmentación del ADN que queremos
secuenciar en varios fragmentos cortos, menores de 600pb (pares de bases) y la
unión de primers, en ambos extremos.
2. Se añade la librería a las celdas, y se produce la amplificación por PCR formando
los clusters, que son una agrupación de secuencias idénticas inmovilizadas sobre
una superficie sólida. En la PCR puente (B), la secuenciación tiene lugar sobre una placa
de vidrio, sobre la que están dispuestos adaptadores complementarios a los
adaptadores anclados en las secuencias desnaturalizadas a secuenciar. Así, cada
fragmento de ADN monocatenario se unirá por uno de sus extremos a uno de los
oligonucleótidos complementarios presentes en la placa. Tras la acción de la
polimerasa, que utiliza estos adaptadores como cebador, se sintetiza la cadena
complementaria, quedando inmovilizada. Seguidamente, tendrá un nuevo ciclo de
desnaturalización, provocando que las hebras desnaturalizadas formen puentes gracias
a la unión de su extremo libre con otro de los adaptadores inmovilizados en la placa.
Este proceso se repite varias veces, hasta formar lo que se conoce como clusters, una
agrupación de secuencias idénticas inmovilizadas sobre una superficie sólida.
 3. Una vez amplificado el fragmento, se produce la secuenciación por síntesis: se
añaden nucleótidos fluorescentes que, conforme se añaden a la cadena, son
estimulados por un láser que los excita y podemos identificar qué nucleótido se está
uniendo. De esta manera, potentes herramientas de bioinformática recogen la
información y reconstruyen la secuencia mediante la complementariedad de los
fragmentos y utilizando una secuencia estándar.

Estas técnicas permitían una secuenciación de ADN mucho más económica y rápida,
permitiendo la realización del proyecto del Genoma Humano, determinando la secuencia de
pares de bases del ADN humano y permitiendo cartografiar todos los genes del genoma
humano, un gran avance en la investigación.
Sin embargo, esta técnica presenta una serie de debilidades:

• principalmente su incapacidad para generar lecturas mayores de 300 pb, lo que,

aparte de la limitación en sí, supone también un mayor riesgo de producir errores en
el ensamblaje para determinar la secuencia.
• la necesidad de amplificación previa de las muestras, lo cual hace que se pierdan
modificaciones químicas, marcas epigenéticas

FUNDAMENTO TÉCNICAS SECUENCIACIÓN 3G → SMRT

En los últimos años se han desarrollado las denominadas como técnicas de secuenciación
de tercera generación, las cuales han venido a paliar algunos de los defectos de las
tecnologías precedentes.
Estas técnicas:
• permiten obtener tamaños de lecturas con máximos de 2 Mb (millón de pares de
bases)
• no necesitan amplificación previa de las muestras de ácidos nucleicos, por lo que no
se pierden las marcas epigenéticas que puedan presentar

Esta técnica fue desarrollada durante la primera década del siglo XXI por la empresa Pacific
Biosciences (PacBio), por eso, también podéis encontrarla como técnica de PacBio.

FUNDAMENTO
Esta técnica tiene 2 particularidades:
La primera diferencia es la preparación de las librerías de ADN. Como con cualquier otra
técnica de secuenciación de ADN, antes de empezar es necesario preparar la muestra de
ADN, y en este caso fragmentamos el ADN y unimos adaptadores de horquilla en ambos
extremos de esos fragmentos. Este paso convierte el fragmento de ADN en una construcción
cerrada que permite que la ADN polimerasa la abra durante la secuenciación, haciendo una
forma de círculo, y permitiendo que la polimerasa circule varias veces, haciendo una
secuenciación continua.

Una vez que los adaptadores están unidos, enlazamos los primers, que serán
oligonucleótidos complementarios con los adaptadores de horquilla que hemos unido
previamente. Necesitamos estos primers para ubicar un punto en el que la polimerasa se
pueda unir e iniciar la síntesis de la nueva hebra. Por último, unimos la polimerasa.

Tras esto, la polimerasa, junto con nuestro fragmento de interés, se unen al fondo de unas
estructuras que utilizan la tecnología ‘’Zero Mode Waveguide’’ (ZMW) o «guía de onda
de modo cero» en español. Y ésta es la segunda y más importante diferencia: el uso de
ZMW. Cada célula inteligente del secuenciador contiene miles y miles de ZMW, y son la clave
de esta técnica de secuenciación.

Las «guías de onda de modo cero» son agujeros cilíndricos con un vidrio transparente en el
fondo, donde se une y se inmoviliza la polimerasa con nuestro fragmento de ADN de interés.
Estas estructuras están iluminadas por el fondo por una luz láser, cuya longitud de onda es
demasiado grande y sólo penetra hasta los 20-30 nm inferiores de la cámara, es decir, el haz
de luz no capta nada más allá de la marca de los 30nm inferiores del pocillo, lo que
llamaremos la zona de detección, creando un volumen de detección de 20 zeptolitros (10^-
21L), un volumen increíblemente pequeño de detección y preciso. Esto es importante porque
los nucleótidos que vamos a añadir para la reacción de la polimerasa serán nucleótidos
fluorescentes, es decir, llevarán unidos fluoróforos a la cadena de fosfatos, y cada nucleótido
llevará un color diferente.

Por tanto, la polimerasa comenzará a añadir estos nucleótidos para sintetizar la nueva hebra
de ADN, complementaria a nuestro fragmento de ADN de interés. Al incorporar un nucleótido,
ese nucleótido pasa por la polimerasa una fracción de segundo, y en ese tiempo la señal del
fluoróforo será percibida con más intensidad al estar más cerca del haz de luz. Luego, la
cadena de fosfatos se libera, y con ella el fluoróforo, dejándolo libre alejándose de la zona de
detección.

Por tanto, en el detector podemos observar esta gráfica: Cuando una señal lumínica de un
determinado color es captada con más intensidad, el detector lo interpreta como la unión de
un nucleótido, mientras que el resto, que está flotando por la celda, es ruido de fondo. Esto
nos permite ver la adición de nucleótidos a tiempo real de cada fragmento de la muestra sin
necesidad de amplificarlo.
Una vez que se ha hecho la secuenciación, lo que obtenemos son múltiples lecturas de un
fragmento junto con los cebadores. El programa elimina los cebadores, obtiene una secuencia
consenso a partir de las múltiples lecturas, y las ordena, obteniendo así toda la información a
un precio muy económico y en menos de 1h.

PUNTOS MALOS
• El primero es que la cantidad de lecturas que puede generar sigue siendo muy
reducida en comparación con las que producen las tecnologías de secuenciación de
segunda generación como Illumina. (foto grafica)
• El segundo y principal problema de esta tecnología es su menor fidelidad, siendo las
tasas de acierto de hasta un 99,8% (Q27) para PacBio las cuales son menores en
comparación con las de tecnologías de segunda generación, cuyas tasas de fidelidad
son cercanas al 99.99% (>Q35). (tabla)
APLICACIONES
La secuenciación SMRT ofrece ventajas importantes sobre las tecnologías actuales de
secuenciación de ADN de lectura corta y la capacidad de secuenciar moléculas de ADN
nativas, no amplificadas. Estas características de secuenciación permiten la caracterización
de variaciones estructurales complejas, la caracterización directa de modificaciones de bases
de nucleótidos y la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Estudios epigenéticos: La epigenética es el estudio de los cambios que activan o inactivan

los genes sin cambiar la secuencia del ADN, a causa de la edad y la exposición a factores
ambientales. Ya que la técnica SMRT permite secuenciar el ADN sin necesidad de amplificar
la muestra, no se pierden las marcas epigenéticas que puedan presentar, por lo que la
convierten en la herramienta perfecta para estudios epigenéticos.

Estudios metagenómicos: Son aquellos en los que se analiza el ADN/ARN de todos los
organismos de una muestra biológica, como suelo, medio marino, entre otros, para identificar
generalmente microorganismos. Los tamaños de las lecturas hacen posible que la
identificación de los organismos sea más precisa.

La más interesante, al menos para la clínica, es su aplicación para pruebas genéticas

constitucionales, cáncer o microbianas y virales.

• En el caso de pruebas genéticas, las repeticiones en tándem causan más de 40

enfermedades neurológicas, neurodegenerativas o neuromusculares cuando mutan.
Desafortunadamente, la secuenciación de esos elementos de ADN es difícil con
plataformas de lectura corta porque las lecturas son demasiado cortas para abarcar
la mayoría de las repeticiones en tándem.
o La primera repetición en tándem estudiada por secuenciación SMRT fue la
repetición FMR1 CGG. Una ampliación de la repetición a más de 200 unidades
provoca el Síndrome X Frágil (SXF), que es una de las causas más frecuentes
de discapacidad intelectual hereditaria y autismo. La información generada por
la secuenciación SMRT se usa clínicamente para mejorar el asesoramiento
genético de las mujeres que sopesan el riesgo de tener un hijo con SXF.

• En enfermedades infecciosas, la secuenciación SMRT se ha utilizado para analizar

los virus de la influenza, los virus de la hepatitis B (VHB), los virus de la hepatitis C
(VHC) y los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además, esta técnica puede
ayudar en el caso del diagnóstico microbiológico de humanos en circunstancias en las
que las técnicas de diagnóstico clásicas quedan rebasadas.

• Durante el tratamiento de pacientes con cáncer, es fundamental controlar las

mutaciones de baja frecuencia que pueden dar lugar a una ventaja proliferativa de las
células malignas.
o Por ejemplo, los pacientes que sufren leucemia mieloide crónica (LMC)
normalmente se tratan con inhibidores de la tirosina quinasa (TKI), pero la
terapia puede inducir mutaciones puntuales que conducen a la resistencia a
los medicamentos. Por lo tanto, es importante evaluar el gen BCR-ABL1 en
pacientes con leucemia mieloide crónica que responden mal al tratamiento con
inhibidores de la tirosina quinasa y estudiar el panorama mutacional. En un
estudio de Cavelier et al.,la secuenciación SMRT permitió la detección de
mutaciones puntuales de resistencia a TKI que proporcionaron información
realmente importante para el asesoramiento y tratamiento del paciente.
CONCLUSIONES