Comparación entre un método espectrofotométrico y un método de cromatografía liquida de

alta presión para determinar triptófano en productos de alimentos.

Objetivo:

Buscar un método para complementar el método de intercambio iónico y cuantificar el triptófano

eficientemente y con exactitud.

Metodología:

1. Preparación de la muestra.
1.1. secar las muestras.
1.2. Pulverizar pasando por un tamiz con malla de 40.

2. Hidrolisis.
2.1. En un tubo volumétrico de 10 ml pesar una porción de la muestra (25 mg de
proteína).
Nota: para el método espectrofotométrico se utilizan soluciones estándar de 200, 100
y 20 µg/ml.
2.2. Tomar 1 ml de la solución de pronasa y dispensarla en cada uno de los tubos que
tienen la proteína y estándar; utilizar un tubo vacío que solo contenga pronasa.
2.3. Agregar 2 gotas de tolueno
2.4. Ubicar los tubos en un baño de ultrasonido e incubar 40 °C por 24 horas.
2.5. Enfriar a temperatura ambiente (muestras, blanco y estándares).
2.6. Completar el volumen (10 ml) con búfer fosfato.

3. Método espectrofotométrico.
3.1. Medir en un tubo de ensayo 15 ml de solución DAB.
3.2. Tomar un alícuota de 2 ml de la hidrolisis y dispensarla en un tubo del test, agitar con
un agitador tipo vortex.
3.3. Sellar los tubos y ubicarlos en la oscuridad por 6 horas.
3.4. Adicionar 0,1 ml de la solución de nitrito de sodio y mezclar nuevamente. (si es
necesario filtre la solución por un filtro Whatman.
3.5. Tarar el espectrofotómetro a cero con una solución de ácido sulfúrico, bofer fosfato y
nitrito de sodio.
3.6. Medir la absorbancia de las muestras, estándares y blanco, (mezclando 2 ml del
hidrolizado con 8 ml de ácido sulfúrico).
4. Cálculos.
La absorbancia del blanco se resta de la absorbancia de los analitos (absorbancia
corregida).
4.1. Elaboración de la curva estándar en donde se grafica la absorbancia de los estándares
con respecto a la cantidad de aminoácido presente en cada na ( 400, 200 y 4 µg).
4.2. Calcular a partir de la curva estándar la cantidad de triptófano en l amuestra.
4.3. Calcular el % de triptófano utilizando la siguiente formula = 0,1 x T/S donde:
T= µg presentes de triptófano.
S= mg presentes en la muestra.
 0,1= % factor de conversión de µg a mg.

5. Método cromatografía liquida.

5.1. La separación y cuantificación se llevaron a cabo en un cromatógrafo con un flujo de
1,5 ml/ minuto.
5.2. Se inyectaron 20 µl de cada uno de los estándares, 20 µl de pronasa en blanco y cada
uno de los hidrolizados de la muestra.
5.3. El triptófano se cuantificó como

Dónde: C = concentración del estándar en µg/ml.

W = peso muestra en gr.

PX= Altura del pico de la muestra.

PB = Altura del pico del blanco.

PS= Altura del pico del estándar.

Fundamentación teórica del método utilizado en el artículo

Entre los principales desafíos que enfrenta el químico de alimentos hoy es la necesidad de una
mayor precisión y rentabilidad métodos para el análisis de nutrientes. Espectrofotometría y / o
Cromatografía líquida de alta presión (LC) cuando está acoplado con la preparación adecuada de la
muestra y procedimientos de las costumbres cumplen estos criterios. Uno de los aminoácidos
nutricionalmente esenciales, el phan, ha sido analizado por una variedad de métodos en el
pasado. Estos métodos han sido revisados por Friedman y Finley (1971). Uno de estos métodos,
estudiado a fondo por Spies (1967), que utiliza la hidrólisis de Pronasa, derivatizacion con p-
(dimetilamino) benzaldehído, y medición espectrofotométrica parece ser muy adecuado para
productos alimenticios. El triptófano también se ha medido por LC en muestras biológicas por una
variedad de métodos. Estas incluir separación en empaques de copolímeros (Lefebvre et al.,1977,
1978; Kroeff y Pitrzyk, 1978), derivatizacion y detección colorimétrica y / o fluorométrica (La Page
et al.,1979; Hsu y Currie, 1978; Margolies y Bauer, 1978; Lammens y Verzele, 1978; Van Beeumen
y otros, 1978; Jornvall y otros, 1978; Furukawa et al., 19771, fluo directo detección rometric
(Anderson y Purdy, 1977, 1979; Geeraerts y otros, 1978; Krstulovic y otros, 1977a, b; Meek y
Neckers, 1977; Graffeo y Karger, 19761, y otros (Rustun, 1978, Hancock et al., 1979, Riley et al.,
1979;
Krstulovic y otros, 1978; Molnar y Horvath, 1978; Knudson et al., 1978; Grushka et al., 1977).
De estos métodos, cromatografía de fase inversa junto con la detección fluorométrica directa
parecía ser la más método viable para productos alimenticios.
Los aminoácidos distintos del triptófano se analizan rutinariamente analizados mediante
cromatografía de intercambio iónico después de ácido hidrólisis (Wall y Gehrke, 1976). Bajo estas
condiciones el triptófano es lábil y generalmente debe analizarse por separado. Esto generalmente
se hace usando hidrólisis básica o hidrólisis ácida mientras protege el triptófano con un
antioxidante seguido de análisis de intercambio iónico básico en un analizador de aminoácidos,
espectrofotometría ultravioleta, o fluorometría (Peters y Berridge, 1970; Berridge et al., 1971;
Wapnir y Stevenson, 1969; Wilinson y otros, 1976; Eftnik y Ghiron, 1976; Hassan, 1975; Lewis et
al., 1976, Spackman et al., 1958). Lo que se buscaba, por lo tanto, era un método para
complementar el analizador de aminoácidos ion-ex- cambiar el método y cuantificar el triptófano
con precisión y eficientemente. El método espectrofotométrico fue una modificación de la de
Spies (1967). El método LC desarrollado utilizó la hidrólisis desarrollada por Spies y la separación y
cuantificación similar a los utilizados por Krstulovic et al. (1977a) para muestras de suero.

Resultados obtenidos

Por el método espectrofotométrico fueron analizadas una variedad de muestras por duplicado
(10) en la Tabla I se evidencia que el método es muy reproducible, el coeficiente de variación
mancomunado es de 2.53% .
De igual manera se realizó una comparación entre el método espectrofotométrico y el método LC;
los resultados se muestran en la Tabla II donde se puede ver que los resultados obtenidos de los
dos métodos están en concordancia; es decir, la diferencia éntrelas medidas fue solo de 0.03%,
las muestras 4 y 5 fueron muy coloreadas, este color puede haber afectado el valor final obtenido
espectrofotométricamente; Si las muestras no. 4 y 5 se omiten de los datos la media del método
espectrofotométrico es 0.28790 y que por el método LC es 0.283% o una diferencia de
0.004% con una correlación de 0.988.
Asimismo se analizaron varias muestras por duplicado por el método LC, También se muestra en la
Tabla III es el resultado de un estudio de recuperación donde se agregó la misma cantidad de
triptófano en la misma magnitud de la que se encuentra presente en la muestra y fue agregada
antes de la etapa de la hidrolisis de la pronasa. la reproducibilidad del método es muy buena con
un coeficiente de variación de 2,03% , los resultados de la recuperación para las muestras
analizadas fueron buenos 95,5± 2,4 % .

Conclusiones

Los resultados indican que el método LC se compara favorablemente con el método colorimétrico
publicado.

El método LC es considerable más fácil y se lleva a cabo durante menos tiempo.

La cuantificación es directa, ya que los cromatogramas generalmente contienen solo un pico

adicional del pico de triptófano.