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Enero 2022 - Relación Patogénica Entre Diabetes Mellitus Tipo 2, Tuberculosis y Cáncer de Pulmón.
Enero 2022 - Relación Patogénica Entre Diabetes Mellitus Tipo 2, Tuberculosis y Cáncer de Pulmón.
PROTOCOLOS DE INVESTIGACIÓN
I. DATOS GENERALES
1. INVESTIGADOR PRINCIPAL
Nombre: Oscar Gerardo Arrieta Rodriguez
RFC: AIRO7310306R2
Nacionalidad: Mexicana
Cargo: Jefe del departamento de oncología torácica
Teléfono particular: 56280400
Teléfono de oficina 56280400
e-mail: ogar@unam.mx
Nivel máximo de estudios Maestría
Disciplina: Oncología
Especialidad: Oncología Médica
Categoría y nivel: Investigador en Ciencias Medicas F
Adscripción Investigación clínica
2. PROYECTO
Tipo de investigación
Origen
1
3. COLABORADORES
(Se deberá anexar una carta de apoyo de cada colaborador en las que describa las actividades que
realizara)
Colaborador I
Nombre: Rogelio E. Hernandez Pando
RFC: HEPR560304AWA
Cargo: Jefe de la seccion de Patología Experimental
Nivel máximo de Doctorado
estudios:
Disciplina:
Especialidad: Anatomía Patológica
Categoría y nivel: Investigador en ciencias medicas F
Adscripción Patologia Experimental
Colaborador II
Nombre: Mario Orozco Morales
RFC: OOMM8202082V9
Cargo: Investigador
Nivel máximo de estudios: Doctorado
Disciplina: Inmunología
Especialidad: Inmunología
Categoría y nivel: Investigador en ciencias Medicas C
Adscripción Unidad funcional de Oncología
Toracica/Laboratorio de Medicina Personalizad
Colaborador III
Nombre: Ana Laura Colín Gonzalez
RFC: COGA860125SW4
Cargo:
Nivel máximo de estudios: Doctorado
Disciplina: Ciencias biomedicas
Especialidad:
Categoría y nivel:
Adscripción Instituto Nacional de Cancerología
Colaborador IV
Nombre: Norma Yaneth Hernandez Pedro
RFC:
Cargo:
Nivel máximo de Doctorado
estudios:
Disciplina: Ciencias biomedicas
Especialidad:
Categoría y nivel: Investigador en ciencias Medicas C
Adscripción Subdireccion de Investigación Clínica
Colaborador V
Nombre:
RFC:
Cargo:
Nivel máximo de
estudios:
2
Disciplina:
Especialidad:
Categoría y nivel:
Adscripción
4. OTRAS INSTITUCIONES PARTICIPANTES
(Se deberá anexar una carta de apoyo firmada por el director de cada institución
participante)
Tipo de apoyo
Tipo de ayuda
Nombre Institución
Infraestructura Personal Material Equipo
I.Instituto Nacional de Cancerología ✘ ✘ ✘ ✘
IV.
V.
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Antecedentes. La hiperglicemia genera una disfunción inmunológica que favorece
las enfermedades infecciosas por lo que una persona diabética es tres veces más
susceptible a desarrollar tuberculosis que una persona no diabética.
Mundialmente, hay 9.6 millones de casos nuevos de tuberculosis, de esta cifra
un millón de personas tienen diabetes mellitus. Estas dos condiciones son
asociadas con una respuesta inmune e inflamatoria alterada que podrían genera
un microambiente favorable para la carcinogénesis. Además, estudios
epidemiológicos indican que podrían estar asociadas con el desarrollo de cáncer
de pulmón. En un estudio previo, nuestro equipo de trabajo encontró que 9 de
10 ratones diabéticos infectados con Mtb generan lesiones pulmonares con
morfología tumoral, lo que sugiere una relación causal entre estas dos
comorbilidades y el cáncer de pulmón.
4
persona con diabetes mellitus tiene aproximadamente 3 veces mas probabilidades
de desarrollar Tb que una no diabética. La tuberculosis es causada por la
Micobacteria tuberculosis (Mtb) y constituye la principal causa de muerte por un
único agente infeccioso, después del VIH. Cada año, mas de 1.4 millones de
muertes se atribuyen a la tuberculosis, lo que constituye un importante problema
de salud publica en todo el mundo. Se ha estimado que casi una cuarta parte
(26%) de la población mundial es portadora asintomática de Mtb, de la cual
aproximadamente el 10% eventualmente desarrollará la enfermedad activa. La
diabetes mellitus es un factor de riesgo para la conversión de Tb latente a activa.
A nivel mundial, hay 9.6 millones de nuevos pacientes con tuberculosis activa
cada año; de ellos, un millón de personas tienen diabetes mellitus y tuberculosis.
En México, la DT2 es el principal problema de salud y la causa mas frecuente de
discapacidad prematura, ceguera, insuficiencia renal y amputaciones; y del 30 al
40% de la población mexicana está afectada por Mtb.
Por otra parte, el cáncer de pulmón (CP)es una de las principales causas de
muerte en el mundo, por cáncer. Solo por debajo del cáncer de mama en mujeres
y próstata en hombres. La mayoría de los pacientes con CP son diagnosticados en
estadios avanzados de la enfermedad. La supervivencia a 5 años oscila entre el 5
y el 16%. De acuerdo con su patrón histológico, el CP puede dividirse en cáncer
de pulmón de células pequeñas (CPCP) y cáncer de pulmón de células no
pequeñas (CPCNP). El mas frecuente es el CPCNP, representa el 85% de los casos
de CP. El tabaquismo es uno de los principales factores de riesgo, y representa el
85% en todos los pacientes en estados unidos y Europa. En México solo del 50 al
60% de los casos con CP están relacionados con el tabaco. Otros factores de
riesgo bien descritos incluyen la exposición crónica al humo de leña, asbestos y
arsénico. La tuberculosis también se ha asociado con el desarrollo de CP, en
particular al adenocarcinoma del CPCNP, el subtipo mas común. La relación
exacta entre Tb y cáncer de pulmón no es aun del todo claro. Se han postulado
hipótesis que hablan de una posible inserción del genoma de la micobacteria a la
célula huésped. Mientras que otras postulan a la inflamación generada por la
Mtb, un desencadenante de la carcinogénesis pulmonar. En este proyecto
nosotros pretendemos evaluar, si un estado inflamatorio crónico promueve un
microambiente favorable para el desarrollo tumoral. Por lo que la inflamación
crónica e inmunosupresión inducida por Mtb en animales diabéticos podría
participar en la transformación celular y la generación del cáncer de pulmón.
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IV. CONTRIBUCIÓN AL PROYCTO EN EL AVANCE DEL CONOCIMIENTO EN SU
PROPIA TEMATICA Y EN SU AREA DEL CONOCIMIENTO
Describa de manera concreta el impacto que tendrá este proyecto en el
conocimiento actual del tema y área.
V. OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar si la presencia de Mtb en animales diabéticos genera efectos
sinérgicos que participan en el desarrollo de lesiones premalignas pulmonares o
cáncer de pulmón.
Objetivos Particulares
- Caracterizar y clasificar las lesiones premalignas pulmonares presentes en
ratones diabéticos infectados con Mtb.
- Evaluar la respuesta inmune y/o inflamatoria de la patogénesis a nivel
sistémico en ratones diabéticos infectados con Mtb
6
- Determinar los mecanismos potenciales que contribuyen a la transformación
neoplásica en ratones diabéticos infectados con Mtb, en el microambiente
tumoral (alteraciones oncogénicas y/o en genes supresores de tumores, niveles de
citocinas o factores de crecimiento, poblaciones celulares, alteraciones en las vías
de señalización, etc).
-Trazar un mapa del proteoma de la Mtb que nos ayude a comprender las
interacciones inmunes entre el huésped y el patógeno, cuantificar los cambios en
la expresión génica y rastrear la progresión de la enfermedad
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VIII. ESTRATEGIAS O METODOLOGÍAS DE LA INVESTIGACIÓN
Describa detalladamente el diseño de investigación; universo de estudio; tamaño de
muestra; criterios de inclusión, exclusión; proceso de aleatorización; los
procedimientos; métodos y técnicas que se utilizaran para el análisis e
interpretación de los datos.
Establecimiento experimental de un modelo murino de cáncer de pulmón con
DT2 y tuberculosis pulmonar.
Para inducir la DT2, usaremos un modelo de ratón no genético con resistencia a
la insulina, inducida por dieta hipercalórico e insuficiencia de células beta
pancreáticas. Brevemente, ratones macho de tres semanas de edad serán
alimentados durante todo el curso del experimento con una dieta alta en grasas
con un contenido de 45% de calorías. Los animales del grupo control, serán
alimentados con pienso para roedores. A la semana 5 los ratones recibirán una
única dosis de streptozotocina (100mg/kg) de forma intraperitoneal. Los niveles
de glucosa, colesterol y triglicéridos serán medidos un mes después con ayuda de
tiras reactivas para corroborar la inducción de DT2. Durante este tiempo y para
evitar el deterioro, los roedores podrían ser administrados con metformina
(250mg/kg) o glibenclamida (15mg/kg) de manera intragástrica, los niveles de
glucosa serán evaluados a las 8 y 24 h después de la administración.
Los ratones confirmados con DT2 serán inoculados de forma intratraqueal con
altas dosis de Mycobacterium tuberculosis (2.5 x105 bacilos) sepa H37Rv, y serán
mantenidos en grupos de 5 en un bioterio de bioseguridad nivel III. Los grupos
formados será; CTL, DT2, Mtb y DT2/Mtb. Los ratones serán monitoreados por
120 días. Si presentan cambios como; fatiga, pérdida de apetito, pelo erizado,
falta de movilidad, se sacrificarán con una dosis letal de pentobarbital de sodio
(100mg/kg). Se obtendrán muestras por lavado branqueoalveolar, tejido
pulmonar y sangre por punción cardiaca. Tres ratones de cada grupo serán
mantenidos sin manipular con el objetivo de obtener curvas de sobrevida.
Muestras del tumor podrían ser mantenidas en condiciones de cultivo celular en
medio RPMI, SFB10% con antibiótico.
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Se analizará el perfil de citocinas a partir de las muestras obtenidas por punción
cardiaca. Los niveles séricos de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias
serán cuantificadas y analizadas por citometría de flujo mediante el uso de
LEGENDplexTM multi-analyte Flow assay kit (BioLegend Cat. No. 740446; Mouse
inflammation panel). Este panel permite la cuantificación simultánea de 13
citocinas y quimiocinas inflamatorias de ratón (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70,
IL-17A, IL-23, IL-27, MCP-1 (CCL2), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, GM-CSF). Brevemente,
sangre periférica de pacientes será obtenida en tubos BD vacutainerR SSTTM
para suero con gel separador y centrifugadas a 3000 rpm. La fracción de suero
obtenida se mantendrá a -80 para su análisis posterior de acuerdo a indicaciones
del LEGENDplexTM multi-analyte Flow assay kit. El principio de la técnica es
basado en un inmunoensayo con perlas de diferente tamaño y fluorescencia
interna. Cada perla conjugada a un anticuerpo permite la captura de un analito
en particular, después de lavados intensos, un anticuerpo biotinilado es
adicionado para su detección. De esta forma se captura el complejo perla-analito-
anticuerpo biotinilado. Subsecuentemente Estreptoavidina-ficoeritrina (AS-PE) es
adicionada, el cual podrá unirse a la biotina y proveer señales de diferentes
intensidades de fluorescencia. Las muestras serán adquiridas en el citómetro de
flujo Attune NxT Flow Cytometer (Thermo Fisher Scientific, CA, USA) y el análisis
se llevará a cabo con el software LEGENDplexTM Data Analysis.
Obtención de muestras de tejido pulmonar y caracterización tumoral.
Las muestras de pulmón serán obtenidas de los diferentes grupos y una porción
será congelada a -70 para análisis posteriores. El resto del tejido pulmonar será
fijado y embebido en parafina. Los tumores obtenidos en pulmón serán
clasificadas por un patólogo de acuerdo a las diferentes formas histológicas;
adenocarcinoma, epidermoide o neuroendocrino. Los marcadores a usar por
inmunohistoquímica serán; napsina A, factor de transcripción tiroideo 1 (TTF-1),
citoqueratina 5/6/7, P63, P40, CD56, cromogranina, sinaptofisina y Ki67.
Trasplante tumoral
Para soportar la hipótesis del estado transformante de las células tumorales.
2x106- 5x106 células serán inoculadas subcutáneamente en ratones SCID. Se
analizarán la formación de tumores palpables a través del tiempo, se medirá el
tamaño y volumen tumoral.
Extracción de DNA/RNA
El material genético será extraído de las muestras congeladas y muestras
embebidas en parafina. Para las muestras embebidas en parafina se obtendrán 5
cortes de 10um, posterior serán desparafinados con xilol. La purificación del
material genético será de acuerdo a las especificaciones del kit AllPrepR
DNA/RNA FFPE (QIAGEN) utilizando columnas MiniSpin. La integridad y
cantidad se evaluará mediante el kit QuantiFluor®Double stranded DNA y se
medirá en el equipo Quantus™ Fluorometer (Quantus). Mediante un sistema de
electroforesis automatizado Bioanalizer (2100 Bioanalizer system, Agilent) se
evaluará la calidad del ADN obtenido.
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Para la secuenciación del exoma de ratón se utilizará el panel Twist Mouse Exome
(Twist, bioscience) el cual se basa en hibridación mediante captura de sondas de
oligonucleótidos diseñada para dirigirse a las regiones exónicas del genoma.
Brevemente, del tejido pulmonar obtenido de los diferentes grupos y de los
tumores formados, se extraerá el material genético anteriormente mencionado. Se
realizará una fragmentación enzimática para homogenizar el tamaño del ADN y se
realizará la preparación de librerías. Las muestras se correrán en el secuenciador
NextSeq (illumina). Los análisis de las secuencias se realizarán con el programa
de análisis de Twist, bioscience. De esta manera se pretende obtener información
de las características inflamatorias (citocinas, quimiocinas, factores de
crecimiento) existentes en los diferentes grupos, mutaciones oncogénicas y/o en
genes supresores de tumores, poblaciones celulares predominantes en el
microambiente tumoral (marcadores Cluster designation), alteraciones en las vías
de señalización y rutas metabólicas.
Pruebas estadísticas
Todos los análisis estadísticos se realizarán con el software GraphPad Prism
(versión 6.0, La Jolla, EE.UU.) los datos se analizarán mediante la prueba t
pareada, ANOVA de una o dos colas con corrección Bonferroni para
comparaciones múltiples. Los valores de p<0.05 se considerarán significativos.
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IX. CONSIDERACIONES ÉTICAS
Describa de manera explícita las consideraciones éticas del estudio:
11
N/A
N/A
Si No No aplica
Declaración de Helsinki
12
6. ANEXE CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
13
X. CURRICULA
Anexe EL RESUMEN SURRICULAR de cada investigador participante. MAXIMO 1
PAGINA por cada investigador
Investigador I
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DATOS GENERALES
Nombre: Oscar Gerardo Arrieta Rodríguez
Lugar de nacimiento: Ciudad de México
Domicilio: Atizapán No. 52
Col. Vergel de Coyoacán
C.P. 14340, Coyoacán, México, D.F.
Teléfono: 56-77-35-07
Correo electrónico: ogar@unam.mx, ogarrieta@gmail.com
Curp: AIRO731030HDFRDSO6
RFC AIRO7310306R2
ACTIVIDADES LABORALES Y DE INVESTIGACIÓN
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
Artículos Indexados: mas de 274
Numero de citas: mas de 11,000
Promedio de factor de impacto de las revistas en ingles: 5.5
Indice H 40
Indice i10: 114
15
Investigador II
16
DATOS GENERALES
Nombre: Rogelio Hernández Pando
fecha de nacimiento: 4 de Marzo de 1956
Nacionalidad: Mexicana
RFC:HEPR560304AWA
CURP:HEPR560304HDFRNG06
E-MAIL: rhdezpando@hotmail.com
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
Artículos indexados: mas de 361
17
Investigador III
18
Apellidos: Orozco Morales Nombre: Mario
Fecha de nacimiento: 8 febrero 1982
CURP: OOMM820208HMSRRR19
RFC: OOMM8202082V9
Domicilio: Av las torres Lt13 C.P 14500 San Miguel Topilejo, CDMX
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
S.N.I. : Nivel I
Artículos indexados: mas de 12
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Investigador IV
20
Datos personales
Fecha y lugar de Nacimiento: 25 de enero de 1986 en la Ciudad de México
CURP: COGA860125MDFLNN04 RFC: COGA860125SW4
Correo: laura_coling@yahoo.com.mx
Desempeño profesional
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores nivel II desde el 2020.
Químico “A” adscrita al Biobanco del Instituto Nacional de Cancerología desde el 2016.
Profesor Ordinario de Asignatura A en la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional Autónoma de México desde el 2012
Formación académica
Doctorado en Ciencias Biomédicas. Titulada con Mención Honorífica. Universidad
Nacional Autónoma de México. Graduada en el 2017.
Maestría en Ciencias Biológicas. Titulada con Mención Honorífica. Universidad
Nacional Autónoma de México. Graduada en el 2012.
Químico Farmacéutico Biólogo. Universidad Nacional Autónoma de México. Graduada
en el 2009.
Producción científica
Artículos en revistas internacionales: 40
Artículos en revistas nacionales: 1
Capítulos de libros: 3
Citas Internacionales hasta el 30 de mayo del 2018: 551
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Investigador V
22
DATOS PERSONALES
Norma Yanet Hernández Pedro
22, San Fernando
Ciudad de Mexico, 14080
Contacto: 5628-0400 Ext 34035
nhernandezp@incan.edu.mx
Cel: 5539006662
Categoría de investigación
Sistema Nacional de Investigadores (SNI) Nivel I, 2014
Campo de Investigación
Genómica del cáncer y la biología molecular del cáncer de pulmón.
Experiencia Laboral
Posición: Investigador en Ciencias Médicas
Instituto Nacional de Cancerología (INCan)
Laboratorio de Medicina Personalizada
Área: Cáncer de pulmón, Genómica, Biología Molecular.
2015 – actualmente
S.N.I. I
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA:
Artículos indexados: mas de 34
23
24
25