D XTRA

EDITORIAL
 Consulte la página www.dextraeditorial.com

Diseño de cubierta: ©TheIdeas · www.ideasjc.net

Edición al cuidado de Lettera63. Diseño editorial

© Guillermo Bodega Magro

Imágen de (coord..),
portada: Julio Bodega
sección Magro, Julia
de cerebelo Carracedo
de rata. DobleAñón, Sergio
marcaje Ciordia Higuera, Elsa
inmuno�luorescente. LosCisneros
núcleosNiño,
de José Luis Copa
las González-Triguero,
Patiño, Juan Manuel neuronas granulares aparecen
Raquel marcados
R. Gragera en rojo
Martínez, conLoarce
Yolanda un anticuerpo anti-neuN
Tejada, Luis y la alfa-sinucleína
Andrés López Fernández, José Antonio López
marcada
García, Alberto Paradela Elizalde, Joaquínen verde.Ortega,
Plumet Cortesía de la
Lilian Dra. Jiménez,
Puebla I. Suárez,Manuel
Universidad de Alcalá.
Rafael Ramírez Chamond, Iván Rivera Arconada,
Carolina Roza Fernández de Caleya

© Dextra
© Guillermo Bodega Magro (coord.), Julio Bodega Editorial
Magro, S. Carracedo
Julia L. Añón, Sergio Ciordia Higuera, Elsa
Cisneros Niño, José Luis Copa Patiño, Juan Manuel
c/ Arroyo González-Triguero,
de Fontarrón, Raquel R. Gragera Martínez, Yolanda
271, 28030 Madrid
Loarce Tejada, Luis Andrés López Fernández, José Antonio
Teléfono: López
91 773 37 10 García, Alberto Paradela Elizalde, Joaquín
Plumet Ortega, Lilian Puebla Jiménez, Manuel Rafael Ramírez Chamond, Iván Rivera Arconada, Carolina Roza
Fernández de Caleya
Reservados todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previstos en las leyes, reproducir, registrar o
transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico,
magnético, electroóptico, por fotocopia o por cualquier otro,Editorial
© Dextra sin la autorización
S. L. expresa por escrito de Dextra Editorial, S. L.
c/ Arroyo de Fontarrón, 271, 28030 Madrid
Teléfono: 91 773 37 10
info@dextraeditorial.com
ISBN 978-84-16277-45-2
Depósito legal: M-12984-2015
Impreso en España–Printed in Spain
Reservados todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil
previstos en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por
cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético,
electroóptico, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización expresa por escrito de Dextra
Editorial, S. L.

ISBN 978-84-16277-46-9
Depósito legal: M-12984-2015
Impreso en España-Printed in Spain
 Autores

Guillermo Bodega Magro (coord.) Elsa Cisneros Niño

Doctor en Biología Doctora en Biología.
Departamento de Biomedicina y Biotecnología Departamento de Biología de Sistemas
Universidad de Alcalá Universidad de Alcalá
guillermo.bodega@uah.es elsa.cisneros@uah.es

Julio Bodega Magro José Luis Copa Patiño

Doctor en Ciencias Físicas Doctor en Biología
Departamento de Física de Materiales Departamento de Biomedicina y Biotecnología
Universidad Autónoma de Madrid Universidad de Alcalá
julio.bodega@uam.es josel.copa@uah.es

Julia Carracedo Añón Juan Manuel González-Triguero

Doctor en Medicina Doctor en Biología
Instituto Maimónides de Investigación Departamento de Biomedicina y Biotecnología
Biomédica Universidad de Alcalá
Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba juanm.gonzalez@uah.es
julia.carracedo.exts@juntadeandalucia.es
Raquel R. Gragera Martínez
Sergio Ciordia Higuera Doctora en Biología Celular y Neurobiología
Licenciado en Biología Departamento Medicina y Especialidades
Servicio de Proteómica Médicas
Centro Nacional de Biotecnología Universidad de Alcalá
sciordia@cnb.csic.es raquel.gragera@uah.es
Métodos en biociencias

Yolanda Loarce Tejada Lilian Puebla Jiménez

Doctora en Biología Doctor en Biología
Departamento de Biomedicina y Biotecnología Departamento de Biología de Sistemas
Universidad de Alcalá Universidad de Alcalá
yolanda.loarce@uah.es lilian.puebla@uah.es

Luis Andrés López Fernández Manuel Rafael Ramírez Chamond

Doctor en Biología Doctor en Medicina
Servicio de Farmacia, Instituto de Investigación Departamento de Biología de Sistemas
Sanitaria Gregorio Marañón Universidad de Alcalá
Hospital General Universitario Gregorio manuel.ramirez@uah.es
Marañón
luis.Lopez@iisgm.com Iván Rivera Arconada
Doctor en Biología
José Antonio López García Departamento de Biología de Sistemas
Doctor en Psicología Universidad de Alcalá
Departamento de Biología de Sistemas ivan.rivera@uah.es
Universidad de Alcalá
josea.lopez@uah.es Carolina Roza Fernández de Caleya
Doctor en Biología
Alberto Paradela Elizalde Departamento de Biología de Sistemas
Doctor en Biología Universidad de Alcalá
Servicio de Proteómica carolina.roza@uah.es
Centro Nacional de Biotecnología
alberto.paradela@cnb.csic.es

Joaquín Plumet Ortega

Doctor en Química
Departamento Química Orgánica
Universidad Complutense
plumety@quim.ucm.es

6
 Índice interactivo*
Interactivo*
* Hacer click sobre los títulos de los capítulos para ir a destino
* Hacer click sobre los títulos de capítulos y epígrafes de primer nivel para ir al destino.

Prólogo .............................................................................................................................................................. 21

1. Fraccionamiento celular ....................................................................................................................... 23

(Sergio Ciordia)

1.1. Introducción ........................................................................................................................................ 23

1.2. Homogeneización (rotura celular) ...................................................................................................... 23
1.2.1. Medio de homogeneización ...................................................................................................... 24
1.2.2. Métodos de homogeneización .................................................................................................. 24
Métodos de homogeneización mecánicos ................................................................................... 25
Métodos de homogeneización químicos y bioquímicos ................................................................ 28
1.3. Filtración .............................................................................................................................................. 30
1.4. Fraccionamiento celular: centrifugación ........................................................................................... 31
1.4.1. Centrifugación: principios básicos ............................................................................................ 32
Coeficiente de sedimentación ..................................................................................................... 32
Instrumentación .........................................................................................................................
33
Tipos de rotores .........................................................................................................................
34
Tubos .........................................................................................................................................
34
1.4.2. Tipos de centrifugación ............................................................................................................. 34
Centrifugación preparativa .........................................................................................................
34
Centrifugación analítica ..............................................................................................................
38
1.5. Caracterización bioquímica y morfológica ......................................................................................... 39
Bibliografía ................................................................................................................................................. 40
Métodos en biociencias

2. Análisis de proteínas ............................................................................................................................... 41

(Sergio Ciordia, Alberto Paradela)

2.1. Proteómica .......................................................................................................................................... 42

2.2. Preparación de la muestra .................................................................................................................. 43
2.3. Técnicas de separación y purificación de proteínas ........................................................................... 46
2.3.1. Subfraccionamiento celular ..................................................................................................... 46
2.3.2. Técnicas electroforéticas .......................................................................................................... 46
Fundamentos de la electroforesis ............................................................................................... 47
Métodos electroforéticos zonales ............................................................................................... 48
2.3.3. Técnicas cromatográficas ......................................................................................................... 54
Cromatografía líquida de alta eficacia .......................................................................................... 54
Clasificación de los métodos cromatográficos .............................................................................. 56
2.4. Identificación de proteínas por espectrometría de masas ................................................................ 59
2.4.1. Aspectos instrumentales .......................................................................................................... 59
Sistemas de entrada de la muestra .............................................................................................. 59
Fuentes de ionización ................................................................................................................. 60
Analizadores de masa ................................................................................................................. 62
Detectores ................................................................................................................................. 64
Espectrometría de masas en tándem MS/MS ............................................................................... 65
2.4.2. Aspectos metodológicos ........................................................................................................... 65
Métodos «bottom-up» o de abajo hacia arriba .............................................................................. 65
Métodos «top-down» o de arriba hacia abajo ............................................................................... 68
2.5. Técnicas de cuantificación de proteínas ............................................................................................. 68
2.5.1. Cuantificación de proteínas basada en la electroforesis ......................................................... 69
Electroforesis bidimensional diferencial (2D-DIGE) .......................................................................... 69
2.5.2. Cuantificación de proteínas basada en la MS .......................................................................... 70
Cuantificación de proteínas por MS con isótopos estables ............................................................ 70
2.5.3. Cuantificación de proteínas por MS sin marcaje («label-free») ................................................ 74
2.6. Interacción de proteínas ..................................................................................................................... 76
2.6.1. Micromatrices de proteínas ...................................................................................................... 76
2.6.2. Captura por afinidad ................................................................................................................ 77
2.7. Análisis estructural .............................................................................................................................. 77
2.7.1. Cristalografía de rayos X .......................................................................................................... 77
2.7.2. Resonancia magnética nuclear ................................................................................................ 78
Bibliografía ................................................................................................................................................. 79

3. Análisis de ácidos nucleicos .................................................................................................................. 81

(Luis Andrés López, Yolanda Loarce)

3.1. Ácido desoxirribonucleico .................................................................................................................. 81

3.1.1. Tipos de DNA ............................................................................................................................. 82
3.1.2. Manejo del DNA ........................................................................................................................ 82
3.1.3. Aislamiento del DNA ................................................................................................................ 82
3.1.4. Cuantificación e integridad ....................................................................................................... 83
3.2. Ácido ribonucleico ............................................................................................................................... 84

8
 Índice

3.2.1. Tipos de RNA ............................................................................................................................. 84

3.2.2. Manejo de RNA ......................................................................................................................... 84
3.2.3. Aislamiento de RNA .................................................................................................................. 85
3.2.4. Cuantificación e integridad ...................................................................................................... 86
3.3. Técnicas con ácidos nucleicos ............................................................................................................. 86
3.3.1. Secuenciación ........................................................................................................................... 86
3.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa ...................................................................................... 89
Curvas de desnaturalización ........................................................................................................ 90
Sondas FRET .............................................................................................................................. 91
PCR alelo específica .................................................................................................................... 92
SNaPshot ................................................................................................................................... 93
Técnicas para detectar variación en el número de copias (CNVs) ................................................... 93
Técnicas para detectar pequeñas inserciones o deleciones ........................................................... 93
3.3.3. PCR a tiempo real y expresión génica ....................................................................................... 94
3.3.4. Microarrays .............................................................................................................................. 96
3.4. Aplicaciones ........................................................................................................................................ 97
Bibliografía ................................................................................................................................................. 99

4. Cultivos celulares .................................................................................................................................... 101

(Guillermo Bodega, Juan Manuel González-Triguero, José Luis Copa)

4.1. Cultivo de células animales ................................................................................................................ 102

4.1.1. El laboratorio de cultivo .......................................................................................................... 102
4.1.2. Técnica aséptica ....................................................................................................................... 105
4.1.3. El medio de cultivo ................................................................................................................... 105
Composición y clasificación ........................................................................................................ 105
Medios condicionados, selectivos y diferenciales ........................................................................ 107
4.1.4. Tipos de cultivos ....................................................................................................................... 107
Cultivo celular primario .............................................................................................................. 108
Líneas celulares establecidas ..................................................................................................... 108
4.1.5. Contaminación ........................................................................................................................ 109
4.1.6. Aislamiento de un tipo celular ................................................................................................. 109
4.1.7. Técnicas de clonación celular ................................................................................................... 111
Clonación por dilución límite ...................................................................................................... 111
Clonación en agar ...................................................................................................................... 111
Clonación en anillos ................................................................................................................... 111
4.1.8. Crecimiento del cultivo ............................................................................................................ 112
4.1.9. Recuento de células ................................................................................................................. 112
Recuento al microscopio óptico .................................................................................................. 113
Recuento eléctrico ..................................................................................................................... 113
Recuento en citómetro de flujo .................................................................................................. 114
4.1.10. Sincronización ....................................................................................................................... 114
4.2. Cultivos vegetales .............................................................................................................................. 115
4.2.1. Componentes del cultivo in vitro vegetal ................................................................................ 115
Material vegetal ........................................................................................................................ 115
Equipo de laboratorio ................................................................................................................ 116

9
Métodos en biociencias

Medios de cultivo ...................................................................................................................... 116

4.2.2. Desarrollo del explante ........................................................................................................... 118
4.2.3. Aplicaciones del cultivo in vitro vegetal .................................................................................. 122
Micropropagación ..................................................................................................................... 122
Semillas artificiales .................................................................................................................... 122
Saneamiento vegetal ................................................................................................................. 122
Obtención de plantas doblehaploides ......................................................................................... 123
4.3. Cultivo de microorganismos .............................................................................................................. 124
4.3.1. Tipos nutricionales de microorganismos .................................................................................. 124
4.3.2. Medios de cultivo ..................................................................................................................... 125
4.3.3. Preparación de los medios de cultivo ...................................................................................... 127
4.3.4. Cultivo de microorganismos .................................................................................................... 128
Cultivo en medio líquido ............................................................................................................ 128
Cultivo en medio sólido .............................................................................................................. 129
4.3.5. Técnicas de aislamiento de microorganismos en cultivos sólidos ........................................... 130
Siembra por extensión ............................................................................................................... 130
Siembra por agotamiento .......................................................................................................... 131
Siembra en profundidad o en masa ............................................................................................ 131
4.3.6. Factores físicos y químicos que afectan al cultivo de microorganismos ................................. 132
Temperatura .............................................................................................................................. 132
pH ............................................................................................................................................. 132
Actividad de agua ...................................................................................................................... 132
Concentración de oxígeno ......................................................................................................... 132
4.3.7. Cultivo de microorganismos a nivel industrial ........................................................................ 133
Cultivo discontinuo (en lote o batch) ........................................................................................... 133
Cultivo discontinuo alimentado (Fed-batch) ............................................................................... 134
Cultivo continuo ......................................................................................................................... 134
4.3.8. Cultivo de virus ........................................................................................................................ 136
Cultivo de bacteriófagos (fagos) ................................................................................................. 136
Cultivo de virus animales ............................................................................................................ 136
Cultivo de virus vegetales ........................................................................................................... 137
Bibliografía ................................................................................................................................................ 137

5. Inmunotécnicas ....................................................................................................................................... 139

(Guillermo Bodega)

5.1. Concepto de antígeno y anticuerpo .................................................................................................. 139

5.1.1. Antígeno ................................................................................................................................... 139
5.1.2. Anticuerpo ................................................................................................................................ 140
Afinidad .................................................................................................................................... 140
Avidez ....................................................................................................................................... 141
Especificidad ............................................................................................................................. 141
5.2. El anticuerpo en la inmunotécnica .................................................................................................... 142
5.2.1. Anticuerpos monoclonales y policlonales ................................................................................ 142
5.2.2. Anticuerpos primarios y secundarios ....................................................................................... 144
5.3. Marcaje ............................................................................................................................................... 145
5.3.1. Marcaje enzimático .................................................................................................................. 146

10
 Índice

5.3.2. Marcaje luminiscente .............................................................................................................. 146

5.3.3. Marcaje fluorescente ............................................................................................................... 146
5.3.4. Marcaje radiactivo ................................................................................................................... 147
5.3.5. Marcaje con oro ........................................................................................................................ 147
5.3.6. Marcaje por sonda enzimática ................................................................................................ 148
5.4. Arquitectura molecular ...................................................................................................................... 148
5.4.1. Clasificación de las inmunotécnicas ........................................................................................ 149
5.4.2. El método PAP ......................................................................................................................... 149
5.4.3. El método ABC ......................................................................................................................... 150
5.5. La señal: intensificación y amplificación ........................................................................................... 151
5.6. Control de la especificidad ................................................................................................................. 152
5.6.1. Bloqueo .................................................................................................................................... 152
Bloqueo de la unión inespecífica de los anticuerpos ..................................................................... 152
Bloqueo de la señal endógena .................................................................................................... 153
5.6.2 Especificidad ............................................................................................................................. 153
Especificidad de la unión de los anticuerpos ............................................................................... 153
Especificidad de la señal ............................................................................................................. 153
5.6.3. Curvas dosis-respuesta ............................................................................................................ 154
5.6.4. Controles negativos ................................................................................................................. 154
5.6.5. Controles positivos ................................................................................................................... 154
5.7. Descripción de las inmunotécnicas de más uso ................................................................................ 154
5.7.1. Inmunohistoquímica ................................................................................................................ 155
5.7.2. Inmunocitoquímica ................................................................................................................. 155
5.7.3. Inmunoprecipitación ................................................................................................................ 156
5.7.4. Immunoblotting ....................................................................................................................... 158
5.7.5. ELISA ........................................................................................................................................ 159
5.7.6. FRAP, FLIP, FLAP, FRET y FLIM ............................................................................................... 161
5.7.7. Radioinmunoanálisis ............................................................................................................... 162
Bibliografía ................................................................................................................................................ 162

6. Citometría de flujo ................................................................................................................................. 163

(Julia Carracedo, José Antonio López García, Rafael Ramírez)

6.1. Principios de la citometría de flujo: sistemas de fluidos,

detección de la muestra y procesamiento de la señal ...................................................................... 163
6.2. Fluorescencia y fluorocromos, absorbancia y emisión .................................................................... 164
6.2.1. Sondas fluorescentes .............................................................................................................. 164
6.2.2. Fluorocromos útiles para citometría de flujo .......................................................................... 164
6.3. Procesamiento de las muestras ........................................................................................................ 165
6.3.1. Preparación de la muestra ...................................................................................................... 165
6.3.2. Tinción de la muestra ............................................................................................................... 166
6.3.3. Marcaje de estructuras de membrana ..................................................................................... 166
6.3.4. Marcaje intracelular ................................................................................................................ 167
6.4. Preparación del protocolo para citometría de flujo ......................................................................... 167
6.5. Adquisición de muestras en el citómetro de flujo ............................................................................ 167

11
Métodos en biociencias

6.5.1. Alineamiento ........................................................................................................................... 168

6.5.2. Calibración (ajuste de escalas) ................................................................................................ 168
6.5.3. Patrones de normalidad: uso de estándares .......................................................................... 168
6.5.4. Compensación de color ............................................................................................................ 168
6.6. Análisis de datos en el citómetro de flujo: histogramas y ventanas .............................................. 168
6.6.1. Dispersión de la luz ................................................................................................................. 168
6.6.2. Canales de fluorescencia (light scatter intensity, FL1, FL2, FL3…) ....................................... 170
6.6.3. Histogramas y dot-plot ........................................................................................................... 170
6.6.4. Ventanas y regiones ................................................................................................................ 170
6.7. Aplicaciones de la citometría de flujo ............................................................................................... 171
6.8. Ejemplos de aplicaciones de la citometría de flujo en biología celular y biomedicina ................... 173
6.8.1. Determinación de la morfología celular ................................................................................. 173
6.8.2. Determinación de proteínas de superficie ............................................................................... 173
6.8.3. Análisis de ciclo celular y aneuploidías ................................................................................... 173
6.8.4. Determinación de citoquinas intracelulares ........................................................................... 175
6.8.5. Determinación de citoquinas y otras moléculas solubles ....................................................... 175
Bibliografía ................................................................................................................................................ 175

7. Microscopía óptica .................................................................................................................................. 177

(Guillermo Bodega)

7.1. La luz ................................................................................................................................................... 177

7.2. Tipos de microscopios ópticos ............................................................................................................ 178
7.2.1. Microscopio de campo claro ................................................................................................... 178
Partes de un microscopio .......................................................................................................... 179
Resolución ............................................................................................................................... 183
7.2.2. Microscopio de campo oscuro ................................................................................................ 184
Iluminación diferencial de Rheinberg ........................................................................................ 184
7.2.3. Microscopio de polarización ................................................................................................... 185
7.2.4. Microscopio de contraste de fases ........................................................................................ 185
7.2.5. Microscopio de contraste por interferencia diferencial ......................................................... 187
7.2.6. Microscopio de fluorescencia ................................................................................................. 187
7.2.7. Microscopio confocal láser de barrido .................................................................................... 189
7.2.8. Microscopio de excitación multifotónica ............................................................................... 189
7.2.9. Microscopio de deconvolución digital .................................................................................... 189
7.2.10. Microscopio vídeo digital ....................................................................................................... 190
7.2.11. Microscopios ópticos de super-resolución .............................................................................. 191
7.2.12. Microscopio de captura láser ................................................................................................. 192
7.3. Preparación de muestras para microscopía óptica .......................................................................... 193
7.3.1. Fijación ..................................................................................................................................... 194
Velocidad de penetración y velocidad de fijación ........................................................................ 194
Coeficiente de endurecimiento .................................................................................................. 194
Variaciones de volumen y presión osmótica ............................................................................... 194
Temperatura, pH y concentración del fijador .............................................................................. 195
Efecto de mordiente ................................................................................................................. 195

12
 Índice

Tipos de fijación ........................................................................................................................ 195

La fijación en la práctica ............................................................................................................. 196
7.3.2. Inclusión ................................................................................................................................... 196
7.3.3. Corte ......................................................................................................................................... 198
7.3.4. Tinción ...................................................................................................................................... 201
7.3.5. Montaje .................................................................................................................................... 202
Bibliografía ................................................................................................................................................ 205

8. Microscopía electrónica ........................................................................................................................ 205

(Guillermo Bodega, Julio Bodega)

8.1. Electrones y materia ......................................................................................................................... 206

8.2. Tipos de microscopios: fundamentos y aspectos constructivos ..................................................... 206
8.2.1. El microscopio electrónico de transmisión .............................................................................. 207
Sistemas de emisión de electrones ............................................................................................ 208
Lentes electromagnéticas ......................................................................................................... 209
Portamuestras .......................................................................................................................... 210
Pantalla de observación y sistema de recogida de imágenes ....................................................... 210
Equipo auxiliar de vacío ............................................................................................................. 210
8.2.2. El microscopio electrónico de barrido ..................................................................................... 210
8.2.3. El microscopio electrónico de transmisión y barrido .............................................................. 213
8.2.4. El microscopio electrónico de barrido ambiental ................................................................... 214
8.2.5. Microscopios electrónicos de bajo y alto voltaje .................................................................... 214
8.3. Procesamiento del material para su estudio al microscopio electrónico ........................................ 215
8.3.1. Técnica de rutina para TEM ...................................................................................................... 215
8.3.2. Técnica de rutina en SEM ......................................................................................................... 218
8.3.3. Sombreado ............................................................................................................................... 219
8.3.4. Criofractura ............................................................................................................................. 220
8.3.5. Criograbado ............................................................................................................................. 221
8.3.6. Tinción negativa ...................................................................................................................... 222
8.3.7. Criomicroscopía electrónica .................................................................................................... 222
8.4. Microscopía electrónica tridimensional ............................................................................................ 223
8.4. Microscopía electrónica de muestras no biológicas ................................................................... 224
8.4.1. Microscopía electrónica de barrido ......................................................................................... 224
8.4.2. Microscopía electrónica de transmisión .................................................................................. 224
Bibliografía ................................................................................................................................................ 225

9. Microscopía de barrido por sonda ....................................................................................................... 227

(Guillermo Bodega)

9.1. Microscopio de barrido de efecto túnel ............................................................................................ 228

9.1.1. Estructura y funcionamiento .................................................................................................. 228
9.1.2. Sistemas de control posicional y de movimiento de sonda y muestra .................................... 229
9.2. Microscopio de fuerza atómica ......................................................................................................... 231
9.2.1. Estructura y funcionamiento ................................................................................................... 231
9.2.2. Aplicación del AFM en el campo de las biociencias ................................................................. 232

13
Métodos en biociencias

9.3. Microscopio óptico de barrido de campo cercano ............................................................................ 235

9.4. Microscopio acústico de barrido ....................................................................................................... 236
Bibliografía ................................................................................................................................................ 238

10. Histoquímica e histoenzimología ....................................................................................................... 239

(Joaquín Plumet, Raquel Gragera)

10.1. Histoquímica .................................................................................................................................... 239

10.1.1. Determinación de radicales alifáticos: aldehídos y cetonas .............................................. 240
10.1.2. Determinación de alcoholes ............................................................................................... 241
10.1.3. Determinación de grupos carboxilo .................................................................................... 241
10.1.4. Determinación de alquenos ................................................................................................ 241
10.1.5. Determinación de compuestos aromáticos ........................................................................ 242
Reacción de Millon ................................................................................................................ 242
Copulación con una sal de diazonio (azorreacción) ................................................................. 243
Reacción argentafín de oxidación .......................................................................................... 244
10.1.6. Determinación de grupos reductores ................................................................................. 244
Reacción con ferricianuro férrico ........................................................................................... 244
Reacción con ferricianuro potásico en presencia de sulfato de cobre ....................................... 244
Reacción con sales de plata ................................................................................................... 244
Reacción con sales de tetrazolio ............................................................................................ 245
10.1.7. Determinación de hidratos de carbono .............................................................................. 245
Reacción del PAS o del ácido peryódico de Schiff .................................................................... 245
Reacción con hidracinas ........................................................................................................ 245
Reacción con p-fenilendiamina .............................................................................................. 245
10.1.8. Determinación de mucosustancias ácidas (glicosaminoglicanos) ...................................... 246
Estudio de la basofilia ........................................................................................................... 246
Estudio de la metacromasia .................................................................................................. 246
Reacción con azul Alcián ....................................................................................................... 246
Reacción de captura de hierro o del hierro coloidal ................................................................. 247
Método de la diamina ........................................................................................................... 247
10.1.9. Determinación de glucógeno ............................................................................................. 247
10.1.10. Determinación del amiloide ............................................................................................... 248
10.1.11. Determinación de glicoproteínas ....................................................................................... 248
10.1.12. Determinación histoquímica de lípidos .............................................................................. 248
Método del nitrato de mercurio ............................................................................................. 249
Método OTAN (tetróxido de osmio-naftilamina) .................................................................... 249
Método NaOH-OTAN ........................................................................................................... 249
Método del hidroxamato ...................................................................................................... 249
Método del cloruro de mercurio ............................................................................................ 249
10.1.13. Determinación de glicolípidos ............................................................................................ 250
Técnica del PAS ..................................................................................................................... 250
Técnica del resorcinol (1,3-dihidroxibenceno) ......................................................................... 250
10.1.14. Determinación del colesterol y sus derivados ................................................................... 250
Técnica del ácido perclórico-naftoquinona (PAN) ................................................................... 250
Reacción de Lieberman-Schultz ............................................................................................. 250
Reacción de la digitonina ....................................................................................................... 250

14
 Índice

10.1.15. Determinación de lípidos no saturados .............................................................................. 250

10.1.16. Determinación de proteínas ............................................................................................... 251
Reacción con sales de diazonio .............................................................................................. 251
Método OTA ......................................................................................................................... 251
Método OTO ......................................................................................................................... 251
Método de la acroleína-Schiff ................................................................................................ 251
Identificación de proteínas por su contenido en grupos amino ................................................ 251
10.1.17. Determinación de aminas biógenas ................................................................................... 252
Estudio histoquímico de la histamina ..................................................................................... 253
Determinación de catecolaminas ........................................................................................... 253
Determinación de indolaminas .............................................................................................. 253
10.1.18. Determinación de ácidos nucleicos .................................................................................... 253
Reacciones de residuos púricos y pirimídicos .......................................................................... 253
Reacciones que evidencian residuos de carbohidrato .............................................................. 253
Reacción diferencial con verde de metilo-pironina .................................................................. 253
10.2. Histoenzimología ............................................................................................................................. 254
10.2.1. Hidrolasas ........................................................................................................................... 255
Carboxilesterasas .................................................................................................................. 255
Lipasas ................................................................................................................................. 256
Lisofosfolipasas .................................................................................................................... 256
Colinesterasas ...................................................................................................................... 256
Fosfatasas ............................................................................................................................. 257
Fosfoamidasa o creatina fosfatasa ........................................................................................ 260
Sulfatasas ............................................................................................................................ 260
Glicosilasas .......................................................................................................................... 260
Glucuronidasas .................................................................................................................... 260
Disacaridasas ....................................................................................................................... 260
Peptidasas ........................................................................................................................... 260
cis-Aconitasa o citrato (isocitrato) hidroliasa .......................................................................... 260
Fumarasa o (S)-malato hidroliasa .......................................................................................... 261
10.2.2. Oxidorreductasas ............................................................................................................... 261
Oxidasas .............................................................................................................................. 261
Monofenol monooxigenasa .................................................................................................. 262
Monoamino oxidasa (MAO) .................................................................................................. 262
Diamino oxidasa o histaminasa ............................................................................................. 263
Urato oxidasa o uricasa ......................................................................................................... 264
D-aminoácido oxidasa .......................................................................................................... 264
Xantina oxidasa .................................................................................................................... 264
Peroxidasas .......................................................................................................................... 264
Deshidrogenasas anaerobias ................................................................................................. 265
10.2.3. Histoenzimología de las principales rutas metabólicas ..................................................... 265
Enzimas implicadas en el ciclo de Krebs ................................................................................. 265
Enzimas implicadas en la glicolisis o ciclo de Embden-Meyerhof ............................................. 266
Enzimas implicadas en el destino anaeróbico del piruvato ...................................................... 267
Enzimas implicadas en la vía de las pentosas .......................................................................... 267
Enzimas del metabolismo del glucógeno y otros hidratos de carbono ..................................... 267
Enzimas implicadas en la síntesis y degradación de ácidos grasos ........................................... 268
Enzimas de la cetogénesis .................................................................................................... 268

15
Métodos en biociencias

Enzimas de la síntesis de las hormonas esteroideas .................................................................. 270

Enzimas del ciclo de la urea ..................................................................................................... 270
Enzimas de metabolismo de la colina y la acetilcolina ............................................................... 271
Bibliografía ................................................................................................................................................ 271

11. Técnicas radiactivas ................................................................................................................................ 273

(Guillermo Bodega, Lilian Puebla)

11.1. Radioisótopos .................................................................................................................................. 274

11.1.1. Tipo de emisión radiactiva .................................................................................................... 274
11.1.2. Poder de penetración ............................................................................................................ 275
11.1.3. Periodo de semidesintegración ............................................................................................. 275
11.1.4. Radioisótopos de interés biológico ....................................................................................... 276
11.2. Detección de la emisión radiactiva .................................................................................................. 276
11.2.1. El contador Geiger-Müller ..................................................................................................... 277
11.2.2. El contador de centelleo líquido ............................................................................................ 277
11.2.3. El contador de centelleo sólido ............................................................................................. 278
11.3. Autorradiografía ............................................................................................................................... 278
11.3.1. Histoautorradiografía ........................................................................................................... 279
El procesado del tejido ............................................................................................................
279
Emulsiones .............................................................................................................................
279
Localización del marcaje .........................................................................................................
280
Resolución .............................................................................................................................
280
Marcaje de fondo ....................................................................................................................
281
Contraste ...............................................................................................................................
281
Doble marcaje ........................................................................................................................
281
11.4. Experimentos de pulso y caza ......................................................................................................... 281
11.5. Radioinmunoanálisis ....................................................................................................................... 282
11.5.1. Principio del RIA ................................................................................................................... 282
11.5.2. Procedimiento del RIA ......................................................................................................... 282
11.6. Radiometría ..................................................................................................................................... 284
Bibliografía ............................................................................................................................................... 284

12. Técnicas electrofisiológicas .................................................................................................................. 285

(Iván Rivera Arconada, José Antonio López García)

12.1. Potenciales bioeléctricos ................................................................................................................. 285

12.1.1 Potencial de reposo ............................................................................................................... 286
12.1.2. Potencial de acción .............................................................................................................. 286
12.1.3. Campos eléctricos y sincronía .............................................................................................. 287
12.2. Técnicas no invasivas ....................................................................................................................... 287
12.2.1. Electrodos ............................................................................................................................ 288
12.2.2. Equipo de registro ................................................................................................................. 288
12.2.3. Electroencefalografía .......................................................................................................... 289
Posicionamiento de electrodos y montajes de registro (derivaciones) ....................................... 290

16
 Índice

Tratamiento de las señales de EEG .......................................................................................... 290

Análisis de señales de EEG ...................................................................................................... 290
Aplicaciones del EEG ..............................................................................................................291
Potenciales evocados ............................................................................................................. 292
12.3. Técnicas invasivas ............................................................................................................................ 293
12.3.1. Fabricación de electrodos de vidrio ...................................................................................... 293
12.3.2. Elección del modelo experimental: preparaciones in vivo e in vitro .................................... 293
12.3.3. Registros extracelulares ....................................................................................................... 294
Registros de neuronas individuales en la corteza de ratas en movimiento (in vivo) ..................... 296
Registros de potenciales de campo en rodajas de tejido nervioso (in vitro) ................................ 296
12.3.4. Registros intracelulares de fijación de corriente .................................................................. 297
Obtención del registro ............................................................................................................ 298
Parámetros de estudio ........................................................................................................... 298
12.3.5. Registros de fijación de voltaje ............................................................................................ 299
Obtención del gigasello y configuraciones del patch-clamp ...................................................... 300
Registro de célula completa y aislamiento de corrientes macroscópicas ................................. 302
Registro de canal único ........................................................................................................... 305
12.3.6. Marcaje intracelular ............................................................................................................. 306
Bibliografía ....................................................................................................................................... 307

13. Técnicas de imagen funcional .............................................................................................................. 309

(José Antonio López García, Elsa Cisneros)

13.1. Tomografía de emisión de positrones (PET) ................................................................................... 310

13.1.1. Radiofármacos ...................................................................................................................... 311
13.1.2. Administración y funcionamiento del radiofármaco ............................................................ 311
13.1.3. Aplicaciones de la PET en clínica e investigación ................................................................. 312
13.1.4. Limitaciones de la PET.......................................................................................................... 312
13.2. Resonancia magnética funcional (fMRI) ......................................................................................... 312
13.2.1. Resonancia magnética nuclear ............................................................................................ 312
13.2.2. fMRI ...................................................................................................................................... 314
13.2.3. Limitaciones de la resonancia magnética ............................................................................ 315
13.3. Técnicas de imagen funcional celular .............................................................................................. 315
13.3.1. Técnicas de imagen de calcio ................................................................................................ 316
Señalización de calcio en las neuronas .....................................................................................
316
Marcadores de calcio ..............................................................................................................
316
Administración de los marcadores de calcio ............................................................................. 319
Aplicaciones y limitaciones .....................................................................................................
321
13.3.2. Técnicas de imagen de voltaje .............................................................................................. 322
Principio general ....................................................................................................................
322
Marcadores sensibles a voltaje ................................................................................................
322
Administración de los marcadores de voltaje ...........................................................................
325
Aplicaciones y limitaciones .....................................................................................................
326
13.3.3. Adquisición de imágenes funcionales celulares .................................................................... 327
Bibliografía ................................................................................................................................................ 328

17
Métodos en biociencias

14. Transferencia génica .............................................................................................................................. 329

(Yolanda Loarce, Juan Manuel González-Triguero)

14.1. El DNA recombinante ...................................................................................................................... 329

14.2. Enzimas de modificación de los ácidos nucleicos ........................................................................... 330
14.3. Clonación de DNA en bacterias ....................................................................................................... 330
14.4. Clonación de DNA en células eucariotas ......................................................................................... 333
14.4.1. Vectores virales .................................................................................................................... 335
14.4.2. Transferencia génica para la inactivación o modificación de genes endógenos ................. 335
Edición genómica .................................................................................................................. 338
14.5. Transgénesis animal ......................................................................................................................... 339
14.5.1. Métodos de transferencia génica ......................................................................................... 340
14.5.2. Proteínas farmacéuticas producidas por animales transgénicos ........................................ 342
14.6. Transformación vegetal: plantas transgénicas .............................................................................. 343
14.6.1. Elementos necesarios para la obtención de plantas transgénicas ...................................... 344
14.6.2. Métodos de transformación genética de plantas ................................................................ 345
Métodos indirectos ................................................................................................................ 345
Métodos directos ................................................................................................................... 347
14.7. Terapia génica en la especie humana .............................................................................................. 349
Bibliografía ................................................................................................................................................ 352

15. Optogenética .......................................................................................................................................... 353

(Carolina Roza Fernández de Caleya)

15.1. Origen ............................................................................................................................................... 353

15.2. Bases Moleculares ............................................................................................................................ 354
15.2.1. Canalrodopsinas ................................................................................................................... 354
15.2.2. Dominios sensibles a luz ....................................................................................................... 355
Bombas activadas por luz ....................................................................................................... 356
Canales activados por luz ....................................................................................................... 356
15.2.3. Modificaciones genéticas de las canalrodopsinas ................................................................ 358
15.3. Expresión de canalrodopsinas en células diana .............................................................................. 359
15.3.1. Sistemas de expresión víricos ............................................................................................... 360
15.3.2 Ratones transgénicos ............................................................................................................. 361
15.3.3 Electroporación ...................................................................................................................... 361
15.4. Aplicación de Luz ............................................................................................................................. 361
15.5. Lectura optogenética en diversos modelos animales .................................................................... 361
Bibliografía ................................................................................................................................................ 363

16. La imagen digital ................................................................................................................................... 365

(Guillermo Bodega, Julio Bodega)

16.1. Los mapas de bits ............................................................................................................................ 365

16.1.1. Conceptos generales. El píxel ............................................................................................... 365
16.1.2. Tamaño de imagen y la resolución ....................................................................................... 366
16.1.3. Resolución de entrada, de salida y de impresión ................................................................. 367

18
 Índice

16.1.4. Bit. Byte. Sistema binario .................................................................................................... 368

16.1.5. Profundidad de color ........................................................................................................... 369
16.1.6. Archivos: tamaños y formatos ............................................................................................. 370
16.2. Sistemas de análisis digital de imagen ........................................................................................... 371
16.2.1. Sistemas de captación .......................................................................................................... 371
16.2.2. Procesado de la imagen ....................................................................................................... 373
Operaciones píxel a píxel ........................................................................................................ 373
Operaciones con grupos de píxeles ......................................................................................... 374
16.2.3. Segmentación ....................................................................................................................... 375
16.2.4. La imagen binaria y su modificación .................................................................................... 376
16.2.5. Medida .................................................................................................................................. 377
16.3. La fotografía digital ......................................................................................................................... 378
16.3.1. Conceptos generales de la óptica y sistema de exposición de la cámara ............................. 378
Distancia focal. Tipos de objetivos ........................................................................................... 378
Apertura del diafragma .......................................................................................................... 379
Velocidad de obturación ......................................................................................................... 379
El valor de exposición ............................................................................................................. 379
16.3.2. La cámara digital ................................................................................................................. 380
Fundamentos ........................................................................................................................ 380
Captar la luz ........................................................................................................................... 380
Transformar la luz en imágenes .............................................................................................. 380
Guardar la imagen en un soporte digital .................................................................................. 381
16.3.3. Tipos de cámaras .................................................................................................................. 381
16.3.4. Modos de funcionamiento .................................................................................................... 382
16.3.5. Sistemas de medición ........................................................................................................... 383
16.3.6. Conceptos generales de la fotografía digital ....................................................................... 384
La temperatura de color ......................................................................................................... 384
Balance de blancos (WB) ........................................................................................................ 384
Tono, brillo y saturación ......................................................................................................... 385
El ruido .................................................................................................................................. 385
Sensibilidad ........................................................................................................................... 386
16.4. Fotocélulas ....................................................................................................................................... 387
16.5. Conversores A/D y D/A ..................................................................................................................... 388
16.5.1. Conversores A/D ................................................................................................................... 388
16.5.2. Conversores D/A ................................................................................................................... 389
16.5.3. Características de los conversores A/D y D/A ....................................................................... 391
Bibliografía ................................................................................................................................................ 391

Índice
Índice de
de términos
materias ........................................................................................................................................... 393
393

19

Los aspectos técnicos y metodológicos de muchas
de las disciplinas que conforman el campo de las bio-
ciencias se tratan de forma marginal en la mayoría de
los manuales de dichas disciplinas. Es bastante usual
la existencia de algún capítulo al principio o de algún
epígrafe al final del libro donde se abordan estos as-
pectos, o incluso la presencia de notas al margen en
aquellos apartados que necesitan incluir alguna ex-
plicación técnica para entender el tema tratado. Es
muy difícil encontrar manuales dedicados a ofrecer
un tratamiento integral de los muy diversos métodos
y técnicas en el campo de las biociencias. Este hecho
es especialmente sorprendente cuando en muchos de
los programas de grado incluidos en este campo exis-
ten asignaturas dedicadas al estudio de los métodos
y técnicas que les son propios. Por todo ello, nuestro
objetivo ha sido incluir, en un único libro, los méto-
dos y técnicas que consideramos fundamentales en el
campo de las biociencias. Existen manuales muy es-
pecíficos para casi cada uno de los epígrafes de los
capítulos de esta obra, por ello no hemos pretendido
hacer un estudio exhaustivo de cada aspecto tratado;
al contrario, nuestro objetivo ha sido ofrecer en cada
Prólogo
Para nuestros alumnos. A nuestros profesores
caso los fundamentos y, a la vez, los rasgos diferen-
ciales de cada método o de cada técnica.
En la medida de lo posible se han incluido explica-
ciones de tipo constructivo y operativo de numerosos
dispositivos, pues entendemos que el conocimiento
del funcionamiento de los dispositivos es esencial para
entender y valorar los resultados que de ellos se ob-
tienen. Además, en algunos capítulos se han incluido
epígrafes que, a nuestro juicio, podían ser interesan-
tes, bien por su uso rutinario, bien por su impacto
actual o por su posible aplicación futura; entre otros,
los epígrafes dedicados a la fotografía digital, la genó-
mica forense, la farmacogenómica o la optogenética
son buen ejemplo de todo ello.
Este es nuestro primer intento de escribir un
libro que aborde de forma integral los aspectos téc-
nicos y metodológicos en el campo de las biociencias;
es, por ello, susceptible de mejora. Nada nos agrada-
ría más que recibir comentarios y críticas de nuestros
lectores, que seguro nos servirán para ir mejorando
esta obra en futuras ediciones.
Los autores

Fraccionamiento celular
1.1. Introducción
La mayoría de las moléculas de interés en biolo-
gía molecular y celular son intracelulares y para su
estudio se requiere la ruptura de la célula y la libe-
ración de su contenido al medio. Así, por ejemplo,
para la producción y puri�icación de una proteína re-
combinante es necesaria la ruptura de la membrana
celular –para recuperar los productos biosinteti-
zados– y la separación de la molécula deseada del
resto de partículas intracelulares. Por consiguiente,
para aislar y caracterizar los componentes de un sis-
tema biológico determinado se requerirán distintos
métodos o técnicas de fraccionamiento celular.
El término fraccionamiento celular hace re-
ferencia al conjunto de técnicas que tienen como
objetivo la rotura de la membrana celular y el pos-
terior aislamiento de un determinado componente
celular, ya sea este un orgánulo (núcleos, mitocon-
drias, cloroplastos, peroxisomas, etc.), una fracción
de membrana (total, plasmática, apical, basolateral,
etc.) o un complejo multiproteico (�ilamentos de ac-
tina, microtúbulos, etc.) permitiendo estudiar las
funciones particulares de este.
El proceso de fraccionamiento consta de tres
etapas:
1.
Sergio Ciordia
— La homogeneización o proceso donde se
destruye el orden del sistema biológico.
Engloba las técnicas que permiten rom-
per la membrana celular y/o tisular (de
células o tejidos) y verter al medio todo
su contenido. En este homogeneizado se
encuentra la fracción de interés en condi-
ciones adecuadas para su puri�icación.
— El fraccionamiento celular propiamente
dicho, donde se intenta separar las partí-
culas deseadas del resto de componentes
de la célula o del tejido en función de sus
propiedades bio�ísicas (forma, tamaño,
densidad, etc.) Esta etapa se suele reali-
zar mediante la aplicación de técnicas de
centrifugación diferencial y en gradiente
de densidad.
— La caracterización de las fracciones ais-
ladas desde el punto de vista funcional,
mediante el análisis de parámetros bio-
químicos y morfológicos.
1.2. Homogeneización (rotura celular)
La homogeneización es un procedimiento muy co-
mún en la preparación de muestras biológicas antes
Métodos en biociencias
Figura 1.1: Estructura molecular de la pared celular bacteriana. En las bacterias Gram(+) la pared celular contiene una capa gruesa de
peptidoglicano además de ácidos teicoicos, que se unen al peptidoglicano y a la membrana citoplasmática. En las bacterias Gram(-) la
capa de peptidoglicano es relativamente �ina y se encuentra rodeada por una segunda membrana lípida exterior que contiene lipopolisa-
cáridos y lipoproteínas.
del análisis de sus componentes intracelulares (áci-
dos nucleicos, proteínas, etc.). Este primer paso
conlleva la ruptura de las células o tejidos para ob-
tener un lisado celular donde el componente de
interés se encuentre en condiciones que permitan
su aislamiento.
1.2.1. Medio de homogeneización
Para preparar las células o tejidos para el fracciona-
miento celular, primero se deben suspender en un
medio controlado. Este medio suele estar compues-
to de una solución isotónica –de sales o azúcares–,
con el pH regulado y a baja temperatura (general-
mente a 4 ºC) que previene de la ruptura de las
membranas celulares por ósmosis y mantiene la in-
tegridad de los orgánulos y enzimas intracelulares
durante el proceso. Habitualmente se emplea una
solución isotónica de sacarosa 0.25 M tamponada a
un pH de 7.4-7.8.
Además de ser termolábil, este material bioló-
gico puede ser degradable por las propias proteasas
de degradación intracelular por lo que, para pre-
servar las propiedades funcionales y estructurales
de las fracciones celulares de interés, suele ser ne-
cesaria la presencia de aditivos en el medio de
homogeneización. Normalmente, para evitar dicha
degradación se suele añadir al medio algún inhibi-
dor de proteasas (por ejemplo, el reactivo PMSF o
�luoruro de fenilmetilsulfonilo). También, depen-
diendo del sistema biológico, puede ser necesaria la
presencia de algún aditivo particular, por ejemplo,
para el aislamiento de mitocondrias o ácidos nu-
cleicos, suele añadirse algún agente quelante como
24
el EDTA, que atrapa los iones metálicos divalentes
(Ca2+ y Mg2+) que se requieren para la actividad de
algunas de estas enzimas; o la presencia de iones
magnesio, en el caso del retículo endoplasmáti-
co, que ayudan a estabilizar la interacción entre las
membranas y los ribosomas.
Por estos motivos, el medio y la técnica de ho-
mogeneización deben elegirse siempre en función
del sistema biológico de interés.
1.2.2. Métodos de homogeneización
Una vez que las células o tejidos se encuentran sus-
pendidos en la solución isotónica, el proceso de
homogeneización propiamente dicho se inicia con
la ruptura de la pared celular, de la membrana plas-
mática o de ambas. La di�icultad de esta ruptura
depende principalmente de la naturaleza del mate-
rial biológico. Así, de mayor a menor di�icultad de
rotura se tiene:
Esporas > Gram(-) > Levaduras > Células
vegetales > Gram(+) > Hongos > Células animales
La presencia de pared celular en ciertos organismos
(plantas, hongos, bacterias, algas, arqueas y levadu-
ras) les con�iere una mayor resistencia a la rotura
y se requerirán métodos de homogeneización más
agresivos para romper la estructura de su pared ce-
lular (Figura 1.1).
En general, esto se consigue empleando pro-
cedimientos mecánicos o químicos (generalmente
suaves o moderados), denominados de homogenei-
zación (Cuadro 1.1).
 Fraccionamiento celular

Cuadro 1.1: Métodos de homogeneización. Principales métodos de homogeneización atendiendo al mecanismo de acción. Estos métodos
pueden ser mecánicos, químicos o enzimáticos. Los métodos mecánicos se caracterizan porque son más agresivos que los no mecánicos.

Tipo Técnica Mecanismo Stress Aplicación

Mortero con mazo Molienda con abrasivos Moderado Células vegetales

Homogeneizador Potter Fricción con un émbolo y un Suave Tejidos blandos

tubo

Homogeneizador de esferas Trituración con bolas de acero Fuerte Células animales y vegetales
o vidrio

Mecánicos Homogenizador de aspas Mezclador con cuchillas Moderado Tejidos duros y blandos

Homogenizador de alta Fuerzas de cizalladura al pasar Fuerte Bacterias

presión a través de un pequeño orificio

Sonicador Cavitación gaseosa que produ- Fuerte Levaduras y bacterias.

ce ondas de ultrasonidos

Congelación-descongelación Ciclos repetidos y formación Moderado Tejidos animales, vegetales y

de cristales bacterias

Choque osmótico Suspensión en medio hipo- Suave Células animales (eritrocitos)

tónico

Tratamiento alcalino Saponificación de los lípidos Fuerte Enzimas resistentes a pH básicos

Químicos
Disolventes orgánicos Solubilización de los asociados Moderado Levaduras con tolueno
a membrana

Detergentes Solubilización de las mem- Suave Bacterias con SDS

branas

Permeabilización enzimática Permeabilización de la pared Suave Gram(+) con lisozima

Enzimáticos
celular

Estos métodos rompen las paredes y mem-
branas celulares de forma controlada –lo menos
posible– pero lo su�iciente para conseguir el tras-
vase al medio de todo el material contenido en las
mismas.
Estas técnicas de homogeneización pueden di-
vidirse en dos grupos atendiendo al fundamento del
proceso de rotura celular, que puede ser producido
por:
— Métodos mecánicos: molienda, picadura,
trituración, por presión, ciclos de conge-
lación-descongelación, sonicación, etc.
— Métodos químicos y bioquímicos: choque
osmótico, permeabilización con disolven-
tes o detergentes, digestión enzimática,
etc.
La elección de la técnica de homogeneización de-
penderá de la naturaleza del material biológico
(tejido duro o blando, cultivo celular, suspensión de
bacterias, organismo vegetal, etc.), su resistencia a
la rotura, la fragilidad de sus componentes y del ob-
jetivo del experimento.
Métodos de homogeneización mecánicos
Estos métodos implican someter el material bioló-
gico a una deformación por acción mecánica tipo:
fricción, colisión o presión; tanto en fase sólida
como líquida (Cuadro 1.1). Se pueden emplear a pe-
queña o gran escala (industrial). Estos métodos son
más agresivos que los no mecánicos debido princi-
palmente a la generación de calor, que puede afectar
a los componente celulares de interés.
Entre estos destacan:
— Mortero con mazo. Es el método de rup-
tura celular más convencional. Se basa
en la deformación de las células por fric-
ción (Figura 1.2a). Puede emplearse con
materiales abrasivos como cuarzo, vidrio
molido, arena o materiales silíceos. La
molienda puede realizarse en fase sólida

25
Métodos en biociencias
Figura. 1.2: Mortero con mazo (A) y homogeneizador Potter-Elvehjem (B). En (A), las células se rom-
pen por la fricción debida a la molienda con el mazo del mortero. En el caso de (B), el movimiento de
vaivén del émbolo rotatorio obliga al material biológico a penetrar en el espacio entre la pared del
tubo y el émbolo donde se producen las fuerzas de cizalladura que producen la ruptura celular.
–sobre el material previamente congela-
do en nitrógeno líquido–, o bien en fase
líquida –sobre la masa celular suspendi-
da en un volumen de tampón y mezclada
con medio moledor (en ratio 1:1 v/v). La
fricción sobre las células termina rom-
piéndolas pero además genera calor que
puede afectar a los componentes ce-
lulares de interés como las proteínas.
Actualmente existen homogeneizadores
más so�isticados que emplean el mismo
principio, pero que permiten controlar el
nivel de fricción y la temperatura del pro-
ceso, son conocidos como potters.
— Homogeneizador de émbolo y tubo. Tam-
bién llamado Potter o Potter-Elvehjem. En
este caso, las células se rompen con la
ayuda de un émbolo rotatorio de te�lón
que se ajusta perfectamente a las paredes
de un tubo de cristal (Figura 1.2b). El te-
jido debe estar previamente disociado y
suspendido en un volumen de medio en
exceso (4-10 veces). El émbolo, además
de rotar, realiza simultáneamente un mo-
vimiento de vaivén de arriba-abajo que
obliga al material biológico a penetrar
en el espacio entre el tubo y el émbolo
donde se producen las turbulencias del lí-
quido y las fricciones sobre el tejido que
producen la ruptura celular. La separa-
ción entre el émbolo y la pared de cristal
está calibrada (0.1-0.15 mm) para pro-
ducir homogeneizados con un tamaño de
partícula determinado. Se suele emplear
para el fraccionamiento de tejidos blan-
26
dos como cerebro e hígado (por su acción
suave).
— Homogeneizador de esferas. Las células
se rompen por la acción de choque de las
esferas de vidrio o acero con el material
biológico (Figura 1.3a).
Las esferas pueden ser de distinto diá-
metro dependiendo de la naturaleza del
material:
• 0.1 mm, para bacterias y esporas;
• 0.5 mm, para hongos, levaduras, al-
gas y células animales; y
• 1-2.5 mm, para tejido (cerebro, mús-
culo, hojas, etc.).
La cantidad de esferas debe ser al menos el
50% del volumen total (biomasa: líquido).
— Homogeneizador de aspas. También lla-
mado Polytron. Dispone de un sistema
de cuchillas que giran a un número ele-
vado de revoluciones por minuto (rpm)
creando las fuerzas de cizalladura en un
volumen reducido (Figura 1.3b). Este mé-
todo es más agresivo que los anteriores y
se suele emplear con tejidos duros.
— Homogeneizador de alta presión. El más
habitual es la Prensa de French. En este
caso, el material biológico se introduce
en una cámara y se somete a altas pre-
siones (~ 500 atm) con la ayuda de un
émbolo (Figura 1.4a). La presión produci-
da obliga a la suspensión a pasar primero
a través de un cilindro de diámetro gran-
 Fraccionamiento celular

Figura 1.3: Homogeneizador de esferas (A) y homogeneizador Polytron. Las células se

rompen por la acción de choque de esferas de vidrio o acero con el material biológico (A);
o mediante un sistema de cuchillas que giran a un número elevado de revoluciones (B).

de y, a continuación, por un ori�icio de (solenoide), este la convierte en vibra-

diámetro muy reducido (0.25 mm). En
esta zona de reducción drástica del diá-
metro es donde se producen las fuerzas
de cizalladura que son capaces de romper
la pared y la membrana celular. Se suele
emplear para el fraccionamiento de bac-
terias.
— Homogeneizador ultrasónico. También lla-
mado Sonicador. Este método permite
romper las células por la aplicación de on-
das de ultrasonidos dentro de la suspensión
celular (Figura 1.4b). Al transmitir una co-
rriente eléctrica a un sistema mecánico
ciones de alta intensidad, generándose
ondas de ultrasonidos. Estas ondas, cuan-
do atraviesan un medio líquido, generan
millones de burbujas microscópicas, las
cuales se expanden y colapsan contra las
células causando la ruptura de sus mem-
branas celulares. Este fenómeno, llamado
cavitación gaseosa, puede incrementar-
se adicionando al medio pequeñísimas
esferas de vidrio. El sonicador puede
operar por pulsos (de 0.1-0.9 pulsos/s)
o de forma continua (varios minutos).
Dependiendo de la frecuencia, intensidad

Figura 1.4: Homogeneizador de alta presión (A) y homogeneizador ultrasónico (B). El material biológico se
somete a altas presiones y al atravesar una zona de reducción drástica del diámetro, se producen las fuerzas de
cizalladura que terminan rompiendo la célula (A). En (B), la aplicación de ondas de ultrasonidos dentro de la
suspensión celular produce en el medio un fenómeno de «cavitación gaseosa» que permite la ruptura celular.

27
Métodos en biociencias

Figura 1.5: Flujo osmótico en medio hipotónico (A), efecto osmótico sobre las células (B) y reacción de saponi�icación
debido al tratamiento alcalino (C). En una solución hipotónica (A), la concentración molar de solutos es menor que en
el interior de la célula, las células se hinchan por la entrada de agua y algunas terminan estallando como los eritrocitos.
En las células vegetales, debido a la pared celular, aumenta su turgencia pero no revientan (B). En un medio alcalino, los
lípidos de la bicapa lipídica se saponi�ican descomponiéndose en jabón y glicerina (C) que produce la ruptura de la mem-
brana celular.

y energía aplicadas se pueden llegar a Métodos de homogeneización químicos

destruir estructuras intracelulares, afec-
tar a la estabilidad enzimática y además
generar mucho calor por lo que se suele
aplicar en frío para evitar el sobrecalenta-
miento del material biológico que podría
provocar la desnaturalización de las pro-
teínas. Esta técnica se suele aplicar a
pequeños volúmenes y habitualmente
se emplea para la ruptura de levaduras y
bacterias.
— Temperaturas extremas. Esta técnica utili-
za ciclos de congelación y descongelación
continuos (de hasta 36 horas). La conge-
lación del material biológico a -70 ºC (en
hielo seco) o a -196 ºC (con nitrógeno
líquido) induce la formación de crista-
les intra- y extracelulares muy �inos que
dañan las células cuando estas se des-
congelan rápidamente a 25 o 37 ºC. Se
emplea para tejidos animales, vegetales y
microorganismos que pueden congelarse
en nitrógeno líquido. Pueden producir la
pérdida de la actividad enzimática.
y bioquímicos
Estos métodos «no mecánicos» utilizan reacti-
vos, que pueden ser químicos o enzimáticos, para
romper o lisar la célula. Se suelen utilizar más a pe-
queña escala (en el laboratorio) aunque son fáciles
de escalar. Entre estos métodos destacan:
— Choque osmótico en medio hipotónico. Es
el método más simple y suave. Consiste
en suspender las células en una solución
hipotónica (Figura 1.5a), esto es, una so-
lución en la que la concentración molar
total de solutos es menor que la hallada
en el interior de la célula (por ejemplo,
en agua destilada). Bajo estas condicio-
nes las células se hinchan por el simple
�lujo osmótico que se produce debido a
la diferencia de solutos entre el medio in-
tra- y extracelular. Las células se hinchan
y algunas terminan estallando. La suscep-
tibilidad de las células a este fenómeno
es relativa y depende principalmente de
su tipo (Figura 1.5b). Se suele utilizar con

28

células animales (eritrocitos) pero no es
efectivo en células provistas de pared ce-
lular (bacterias o células vegetales).
— Tratamiento alcalino o Alcalis. Esta téc-
nica consigue la lisis celular mediante el
tratamiento de las células con solucio-
nes alcalinas (Figura 1.5a) como KOH o
NaOH, a un pH entre 11.5 y 12.5 y duran-
te un tiempo controlado (20-30 min). En
estas condiciones, la mayoría de las mem-
branas celulares se desintegra debido a la
saponi�icación de los lípidos liberándose
su contenido intracelular. Es uno de los
métodos más baratos y fáciles de aplicar a
gran escala pero tiene como principal in-
conveniente que es un tratamiento fuerte
y no selectivo por lo que solo se puede
utilizar si el componente celular de inte-
rés es estable a este pH, como ocurre en
la puri�icación de ciertas enzimas.
— Disolución lipídica con disolventes orgáni-
cos. Es uno de los métodos químicos más
utilizados, sobre todo a nivel de labora-
torio; consiste en el uso de disolventes
orgánicos capaces de interaccionar y so-
lubilizar los lípidos de las membranas
celulares. Habitualmente se suele em-
plear el tolueno, benceno, xileno o hexano.
Estos disolventes son absorbidos por los
lípidos de las membranas celulares, lo que
produce la expansión de la células y �inal-
mente el estallido de estas, liberándose
su contenido intracelular (igual que con
el medio hipotónico, Fig. 1.5a). A bajas
concentraciones de disolvente (1-10%)
se consigue la permeabilización de la cé-
lula –pero esta sigue metabólicamente
activa– mientras que a altas concentracio-
nes tiene lugar la ruptura celular (Figura
1.6a). Este método no se suele utilizar a
gran escala debido a sus principales in-
convenientes: el precio de los disolventes,
la alta toxicidad e in�lamabilidad de los
reactivos y porque produce la desnatura-
lización de las proteínas.
— Solubilización con detergentes. Es otro de
los métodos químicos más empleados para
la ruptura de las células. Los detergentes
tienen una zona hidro�ílica y otra hidro-
fóbica que les permite interactuar tanto
con el agua como con los lípidos. Estos
tensioactivos son capaces de romper la bi-
capa lipídica solubilizando las proteínas
e interrumpiendo la interacción lípido-lí-
29
Fraccionamiento celular
pido, lípido-proteína y proteína-proteína.
Al igual que los disolventes orgánicos, a
bajas concentraciones permiten la per-
meabilización de la célula (solubilización
lipídica) mientras que a altas concentracio-
nes producen la lisis celular y los lípidos
son degradados y encapsulados en el inte-
rior de micelas (Figura 1.6a). La mayoría
de las células se pueden romper con el
uso de detergentes a un determinado pH,
fuerza iónica y temperatura. Estos deter-
gentes pueden ser iónicos o no iónicos en
función del grupo químico presente en la
parte hidro�ílica del detergente (Figura
1.6b).
• Detergentes aniónicos. Básicamente
son jabones (sales de ácidos gra-
sos) a los que se les reemplazan los
grupos carboxílicos por sulfatos
(SO3-). El detergente aniónico más
ampliamente utilizado es el SDS
(Dodecil sulfato de sodio: CH3(CH2)
-O-SO3- Na+).
n
• Detergentes catiónicos. Son deter-
gentes más suaves, con grupos
tetraalquilamonio (NR4+) en la
región hidro�ílica. A este grupo
pertenece por ejemplo el CTAB
(Bromuro de cetiltrimetril amonio:
CH3(CH2)15N+(CH3)3Br-).
• Detergentes no-iónicos. Son tam-
bién detergentes suaves. Suelen
ser surfactantes o polímeros so-
lubles en agua con un grupo
alcohol (-OH) en el extremo hi-
dro�ílico. Es el caso por ejemplo
del Triton X-100 (C8H17-Phenyl-
(OCH2CH2)9.5OH) o el Tween-20
(C18H34O6 . (C2H4O)n), ampliamen-
te utilizados.
El principal inconveniente de su uso es
que producen la desnaturalización de las
proteínas y son di�íciles de eliminar (efec-
tos medioambientales).
— Permeabilización enzimática. En este
caso, se emplean enzimas que pueden
hidrolizar y permeabilizar de forma se-
lectiva la pared celular de ciertas células y
microorganismos permitiendo la difusión
al medio de sus componentes intracelula-
res o incluso la ruptura de la célula. Estas
enzimas suelen atacar a los componen-
tes mayoritarios de la pared celular como
Métodos en biociencias

Figura 1.6: Proceso de permeabilización y ruptura celular por disolventes y detergentes (A); principales detergentes
empleados para lisar las células (B); digestión enzimática del peptidoglicano con lisozima (C). Los disolventes orgánicos
y detergentes a bajas concentraciones producen la permeabilización de la célula (esta sigue metabólicamente activa)
mientras que a altas concentraciones tiene lugar la ruptura celular por la disolución lipídica (A). Los principales de-
tergentes utilizados pueden ser iónicos (aniónicos y catiónicos) o no-iónicos (B). La lisozima degrada la pared celular
bacteriana al hidrolizar los enlaces -1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina del
peptidoglicano (C).

los peptidoglicanos (en bacterias), la ce-
lulosa (en células vegetales) o la quitina
(en hongos y levaduras), que se hidroli-
zan con enzimas tales como la lisozima
(Figura 1.6c), celulasa o la combinación
de quitinasa, glucanasas y mananasas res-
pectivamente. La susceptibilidad a esta
técnica es relativa y depende principal-
mente del tipo celular. Así, por ejemplo,
son más susceptibles a la acción de la li-
sozima las bacterias Gram(+) mientras
que las Gram(-) requieren además –de li-
sozima– EDTA como agente quelante que
ayuda a desestabilizar la membrana celu-
lar. Es un método suave, a la vez que muy
selectivo, pero de alto coste económico
debido a las enzimas, lo que di�iculta su
uso a gran escala.
En la actualidad, para facilitar el lisado celular y la
extracción del contenido intracelular durante la ho-
mogeneización, se suele emplear una combinación
de agentes caotrópicos (urea, tiurea y/o cloruro
de guanidinio), detergentes (SDS o Triton X-100),
agentes reductores (DTT o TCEP) e inhibidores de
proteasas. La utilización de estos agentes, junto con
los métodos mecánicos descritos, permite garanti-
zar la correcta extracción del componente de inte-
rés y las condiciones más idóneas que permitan su
aislamiento posterior.
1.3. Filtración
Como resultado de la homogeneización, queda una
pasta �ina constituida de los restos celulares, orgá-
nulos y demás componentes intracelulares por se-
parado denominada homogeneizado.
Habitualmente después de la homogeneización
se suele realizar un paso de �iltración «gruesa» para
eliminar los restos del tejido (principalmente tejido
conjuntivo) de las paredes celulares, fragmentos de
membranas y células parcialmente rotas o intactas
que no hayan sido desintegradas. Generalmente se
suele aplicar a grandes volúmenes.
La �iltración es una técnica que permite se-
parar los sólidos presentes en una fase líquida en
función de su tamaño de partícula, haciendo pasar
esta a través de un medio poroso (denominado me-
dio �iltrante) que permite separar dichos sólidos, y
que se dispone sobre un dispositivo conocido como

30

Figura 1.7: Sistema de �iltración con embudo Büchner (A); tipos de embudos y �iltros de papel utilizados (B).
El homogeneizado atraviesa el �iltro favorecido por la succión. Las partículas demasiado grandes quedan re-
tenidas en la parte superior del �iltro mientras que las más pequeñas pasan con el solvente (A). Tipos de �iltros:
Hirsch (arriba) y Büchner (abajo) (B).
soporte de �iltración, siendo el más elemental un
embudo de �iltración (Figura 1.7a).
La separación se realiza gracias a que los poros
del medio �iltrante son más pequeños que las partí-
culas a separar, de forma que en el medio �iltrante
queda retenido el sólido que se desea separar del
líquido que lo atraviesa, que se denomina �iltrado.
En la práctica habitual de un laboratorio se em-
plean tres medios porosos: papel de �iltro (cónico
o plano), placas �iltrantes de material cerámico, y
membranas de �iltración. La elección de uno u otro
dependerá de la aplicación.
El paso del líquido a través del medio �iltran-
te se puede conseguir de dos modos distintos:
�iltración por gravedad y �iltración por vacío o por
succión.
La �iltración por gravedad es la técnica más sen-
cilla de �iltrado, consiste en dejar escurrir el líquido
por gravedad a través de un papel de �iltro colocado
apropiadamente en un embudo que retiene los sóli-
dos. Si el volumen a �iltrar es relativamente grande
(10 mL o más) se emplea un embudo con papel de
�iltro. Para pequeños volúmenes es más adecuado
usar una pipeta Pasteur con un poco de algodón o
de lana de vidrio taponando la salida.
La �iltración por vacío o por succión es la más
habitual. Permite acelerar el �iltrado por gravedad
aplicando vacío mediante una bomba por debajo
del �iltro, de forma que se favorece el paso del �luido
a través del medio �iltrante. En este tipo de �iltra-
ción, el medio �iltrante se coloca sobre un embudo
de polipropileno o porcelana agujereada que puede
ser de fondo plano (embudo de Büchner) o cónico
31
Fraccionamiento celular
(embudo de Hirsch) (Figura 1.7b). Normalmente
en este tipo de �iltración, y antes de pasar el homo-
geneizado, se suele preparar una «cama especial»
de �iltrado (de 2-3 mm de espesor) para retener las
partículas más �inas que comúnmente escapan o
tupen el papel de �iltro. Este lecho está compuesto
por una sustancia conocida como diatomita o tierra
de diatomeas que es un material inerte �inamen-
te dividido de esqueletos silícicos de ciertas algas
unicelulares marinas. Esta técnica es útil para eli-
minar impurezas sólidas de una solución de interés
aunque sean muy �inas, pero no permite recolec-
tar el sólido �iltrado, el cual evidentemente resulta
mezclado con la diatomita imposibilitando su ex-
tracción.
1.4. Fraccionamiento celular:
centrifugación
El objetivo �inal de todo fraccionamiento subcelular
es aislar en fracciones puras o enriquecidas los dife-
rentes componentes celulares con sus propiedades
funcionales y sus características morfológicas intac-
tas. Dado que no hay una célula prototipo, tampoco
existe un método de fraccionamiento general.
Tras la etapa de homogeneización, en el medio
hay una mezcla de restos de tejido no homoge-
neizado, de las paredes celulares, fragmentos de
membranas y células parcialmente rotas o intac-
tas que en parte son eliminados con el paso previo
de �iltración. Pero además contiene partículas sub-
celulares como núcleos, mitocondrias, lisosomas,
peroxisomas, retículo endoplasmático liso (REL) y
 Donde f0 y f representan la fricción de una esfera perfecta y una partícula
Métodos en biociencias
biológica, respectivamente; η la viscosidad; y ρp y ρm la densidad de la partícula y
del medio respectivamente. Del análisis de la ecuación anterior es fácil observar
El objetivo final de todo (RER),
fraccionamiento
ribosomas subcelular esque la velocidad
aislar en fraccionesde sedimentación
(radio, puras
densidado y forma); depende de tres tipos de parámetros: (1) las
rugoso
enriquecidas losEn diferentes componentes
y material no particulado.
propiedades
celulares con susintrínsecas
propiedades de partícula (2) las características
(radio, densidad ydel forma); (2) las
esta etapa se obtienen las distintas fracciones medio (densidad y viscosidad); y (3) las condiciones
funcionales y sus características morfológicas características
intactas. Dado que del no haymedio una(densidad y viscosidad); y (3) las condiciones
subcelulares, reagrupando las partículas en función experimentales de velocidad angular y radio de giro.
célula prototipo, tampoco existe un de
de sus coe�icientes método experimentales
de fraccionamiento
sedimentación y mediante general.
las de velocidad angular y radio de giro.
En un medio de experimentación determina-
técnicas de centrifugación. un do,
En mezcla la velocidad
medio de sedimentacióndeterminado,
de experimentación de una partículala velocidad de
Tras la etapa de homogeneización, en el medio hay una de restos
sedimentación debiológica
una es el producto
partícula biológica dees laelaceleración
producto deangular
la aceleración angular
de tejido no homogeneizado, de las paredes celulares, fragmentos depor membranas
una constante que se designa como coe�iciente
1.4.1. Centrifugación:
y células parcialmente rotas o intactas principios
que en parte por
sonuna
básicos constante
eliminados conqueel se
paso designa como coeficiente de sedimentación (S), que
de sedimentación (S), que depende de sus propie-
depende
previo de filtración. Pero además contiene partículas subcelulares como de sus propiedades
núcleos, moleculares. De tal forma que,
La centrifugación es una técnica de separación de dades moleculares. De tal forma que,
mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, retículo endoplasmático
muestras que consiste en la utilización de las fuer- liso (REL) y
rugoso (RER), ribosomas y material
zas centrífugas no particulado.
generadas En esta
en un rotor que etapa
gira, se obtienen las 2𝑟𝑟 ! (𝜌𝜌! − 𝜌𝜌! )
distintas fracciones 𝑆𝑆 =   [1.2]
parasubcelulares, reagrupando
separar las partículas las partículas
en función de sus pro- en función de sus 9𝜂𝜂  (𝑓𝑓 𝑓𝑓! )
coeficientes de sedimentación y mediante las técnicas
piedades de sedimentación. de centrifugación.
Dichas propiedades
dependen de distintos factores entre los que se in- El coe�iciente de sedimentación es una constante
cluyen:principios
1.4.1. Centrifugación: tamaño, densidad
básicos y forma. Sin embargo, El coeficiente de sedimentación
característica de cada orgánulo es una oconstante
macromoléculacaracterística de cada
-1
tanto la forma como la densidad dependen en gran
orgánulo o macromolécula
(Cuadro 1.2)(Tabla 1.2) y sus
y sus unidades son unidades
segundos son
-1
, perosegundos
se , pero se
La centrifugaciónmedida
es unadetécnica de separación
la composición de muestras
de la solución en la
la queque consiste en la -13 -13
utiliza unidad utiliza
Svedberg (S) que
la unidad equivale
Svedberg (S) aque10equivale
segundos (1S = 10 s). De
a 10-13
utilización de las están
fuerzas centrífugaslas
suspendidas generadas en Las
partículas. un rotor que gira, segundos
partículas para separar -12
esta manera, una partícula(1S cuyo= 10 s). De esta
coeficiente
-13
de manera, una partí-
sedimentación es medido en 10 s
las partículas en función fundamentalmente
se separan de sus propiedades según ladevelocidad
sedimentación.
-13 Dichas
cula cuyo coe�iciente de sedimentación es medido
= 10x10 s.
de sedimentación
propiedades dependen de distintos(centrifugación
factores entrediferencial),
los que se el incluyen:
en 10tamaño,
-12
s = 10x10-13s.
tamaño (centrifugación zonal) o la densidad
densidad y forma. Sin embargo, tanto la forma como la densidad dependen en (cen-
gran medida de trifugación
la composiciónisopícnica).
de la solución en la que están suspendidas Grupo las Biomolécula S (Svedberg)
partículas. Las partículas se separan fundamentalmente según la velocidad de
Cuadro 1.2: Coe�icientes de sedimentación de algunas bio-
Coeficiente de diferencial),
sedimentación Proteínas Mioglobina 1.82
sedimentación (centrifugación el tamaño (centrifugaciónmoléculas. zonal) oCoe�icientes
la de sedimentación estandarizados a 20 ºC
y en medio acuoso de algunasHemoglobina
biomoléculas y orgánulos subcelula-4.1
densidad (centrifugación
El término isopícnica).
sedimentación designa el transporte y res en unidades de sedimentación (S). 1S = 10-13s.
agrupación de las partículas en solución bajo la ac- Ferritina Hasta 63
Coeficiente de sedimentación
ción de un campo centrífugo. Ácidos nucleicos RNAt 4
El término sedimentación designa el
Los principios transporte
básicos y agrupación
de la teoría de sedimen-de las partículas
Grupo en Biomolécula S (Svedberg)
Virus Bacteriofago-T7 30
solución bajo la acción
tación de un campo
derivan de la centrífugo.
ley de Stokes, que fue creada Proteínas Mioglobina 1.82
para medir la sedimentación de una esfera en un Orgánulo-célula Virus mosaico del tabaco 180
Los principios básicos de la teoría de sedimentación derivan de la ley de Hemoglobina 4.1
campo gravitacional, para así mostrar que la velo-
Stokes, que fue cidad
creadadepara mediralcanza
la esfera la sedimentación de una esfera
un valor constante y la en un campo Subunidad ribosomal eucariota
Ferritina Hasta 63
40, 60

gravitacional, para así neta

fuerza mostrar queeslaigual
en esta velocidad de de
a la fuerza la resisten-
esfera alcanza un valor Ribosomas eucariotas 80
Ácidos RNAt 4
constante y la fuerza netamovimiento
cia de este en ésta esa través
igual adellalíquido.
fuerza de resistencia de este
nucleicos Membrana plasmática Hasta 10
5

movimiento a través delSealíquido.

una partícula esférica de masa m y radio 3
Virus Retículo endoplasmático
Bacteriofago-T7 30 10
r en solución que gira con un movimiento circu-
Sea una partícula esférica de masa m y radio r en solución que gira conVirus mosaicoLisosomas 3 4
lar uniforme y velocidad angular  con respecto a Orgánulo- del tabaco 180 4 x 10 – 2 x 10
un movimiento circular uniforme y velocidad angular
un eje situado a una distancia x. A partir de dicha
� con respecto a un
célula eje 3
Peroxisomas 4 x 10
situado a una distancia x. Aestablecer
ley, se puede partir de que
dicha ley, se puede
la velocidad de sedi-establecer que la Subunidad ribosomal 40, 60 4 4
velocidad de sedimentación
mentación VVdedeuna una partícula
partícula sometida
sometida a un
a un campocampo gravitacional Mitocondrias
eucariota 1 x 10 – 7 x 10
gravitacional
puede ser definida de acuerdopuede ser de�inida
a la siguiente de acuerdo
expresión a la si-
matemática: Ribosomas Cloroplastos
eucariotas 80
5
10 – 10
6

guiente expresión matemática: 6 7

Núcleos
Membrana plasmáti ca Hasta 105 10 – 10
!
𝑑𝑑! 2𝑟𝑟 (𝜌𝜌! − 𝜌𝜌! )
𝑉𝑉 =   =  𝜔𝜔   ! 𝑥𝑥 [1.1] Retículo endoplasmático 103 14
𝑑𝑑! 9𝜂𝜂  (𝑓𝑓 𝑓𝑓! )
Lisosomas 4 x 103 – 2 x 104

Peroxisomas 4 x 103
Donde f0 y f representan la fricción de una esfera
  perfecta y una partícula biológica, respectivamente; 13 Mitocondrias 1 x 104 – 7 x 104
 la viscosidad; y p y m la densidad de la partícu-
Cloroplastos 105 – 106
la y del medio respectivamente. Del análisis de la
ecuación anterior es fácil observar que la velocidad Núcleos 106 – 107
de sedimentación depende de tres tipos de paráme- Células 107 – 108
tros: (1) las propiedades intrínsecas de partícula

32
 Fraccionamiento celular

La fuerza centrífuga que se aplica sobre la En las ultracentrífugas, debido a la velocidad extre-
suspensión de partículas es una fuerza relativa, ya ma (hasta 100.000 rpm), es necesario un alto vacío
que está referida a la fuerza del campo gravitato- en la cámara de la centrífuga para evitar el calenta-
rio que también actúa. Por ello se utiliza el término miento del rotor y de la muestra.
de fuerza centrífuga relativa (FCR o g). La FCR está
relacionada directamente con la velocidad de cen-
trifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la
distancia de las partículas al eje de rotación (r, en Cuadro 1.3: Tipos de centrífugas. Principales tipos de centrifugas
cm) de acuerdo a la ecuación: en función de la velocidad de rotación y su aplicación para el ais-
lamiento y puri�icación de un determinado componente subcelular.
FCR= 1.118 x 10-5 x r x rpm2 [1.3]
Baja Alta Ultra
Así, la fuerza centrífuga aumenta a medida que velocidad velocidad
las partículas bajan por el tubo de centrifugado.
Normalmente, a mayor fuerza centrífuga menor Velocidad máxima 13 28 100/150
rpm x103
tiempo de separación, sin embargo, la centrifu-
gación genera fuerzas hidrostáticas dentro de la Materiales
solución, que a velocidades extremadamente altas
Bacteria Si Si Si*
pueden destruir algunos componentes subcelulares
como por ejemplo, los ribosomas. Células animal/ Si Si Si*
vegetal
Los parámetros a tener presentes en cualquier
centrifugación, que determinarán las condiciones Núcleos Si Si Si*
de la misma son:
Precipitados Parcial Total Si*
— Volumen de solución a centrifugar, que Fracciones de Parcial Total Si
determinará el tipo de tubos y rotores a membrana
emplear.
Ribosomas/Polisomas - - Si
— Naturaleza química de la solución, que
determinará la naturaleza del tubo a em- Macromoléculas - - Si
plear (generalmente de vidrio o plástico). Virus - Total Si
— Diferencial de densidad entre la partícu-
* No utilizado
la a sedimentar y la densidad del medio * No utilizado frecuentemente
frecuentemente
en el que se encuentra. En general cuan-
to mayor sea esa diferencia antes (menor
tiempo y menor fuerza de aceleración)
sedimentará. Cuando el diferencial es
Los diferentes tipos de centrífugas desarrollados se
muy pequeño se pueden aplicar centrifu-
utilizan en diferentes aplicaciones (Cuadro 1.3):
gaciones de cientos de miles de g durante
horas. — Centrífugas de mesa o baja velocidad: se
utilizan para separar partículas grandes
Instrumentación como células o precipitados de sales in-
solubles.
Las centrífugas son instrumentos que permiten — Centrífugas de alta velocidad: se emplean
someter las muestras a intensas fuerzas que pro- en la separación de fracciones celulares
ducen la sedimentación rápida de las partículas que aunque no a su�iciente velocidad para ais-
tienen una densidad mayor que la del medio en el lar ribosomas, proteínas o virus.
que se encuentran. En general se clasi�ican en fun- — Ultra-centrífugas: capaces de separar par-
ción de los rangos de aceleración a que se someten tículas de pequeño tamaño. Hay dos tipos:
las muestras: centrífugas de mesa (de pocas g a
aproximadamente. 3.000 g), centrífugas de alta ve- a) Analíticas con las que obtener
locidad (de 2.000 g a 20.000 g) y ultracentrífugas datos precisos de propiedades de
(de 15.000 g a 600.000 g). sedimentación.
En las centrífugas se suele controlar la b) Preparativas para puri�icar
temperatura de la cámara para evitar el sobrecalen- partículas de bajo coe�iciente de
tamiento del homogeneizado debido a la fricción. sedimentación.

33
Métodos en biociencias
Tipos de rotores
En una centrífuga el elemento determinante es el
rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los
tubos. Existen varios tipos (Figura 1.8):
— Rotor basculante. Los tubos se colocan en
unos dispositivos (cestillas) que se en-
cuentran en posición vertical cuando el
rotor se encuentra parado, pero con ca-
pacidad de bascular, de forma que al
empezar a girar el rotor, se disponen de
forma horizontal por acción de la fuer-
za centrífuga formando un ángulo de 90º
con el eje de giro. En este tipo de roto-
res el campo centrífugo que actúa sobre
las diferentes moléculas no es unifor-
me, cambia a medida que las moléculas
van desplazándose a lo largo del tubo.
Permite la separación de pequeños volú-
menes de muestra (hasta 200 mL).
— Rotor angular. Los tubos se mantienen en
ori�icios dentro del cuerpo del rotor ma-
cizo formando un ángulo �ijo con el eje
de rotación (normalmente de 20-35º).
Al igual que en los basculantes, el campo
centrífugo es variable según la posición
de la molécula en el tubo, pero en menor
medida, dado que el radio efectivo es más
corto (Figura 1.8a). Permite la separación
de volúmenes más grandes (hasta 5 L).
— Rotor vertical. En este caso los tubos de
muestra se sitúan en paralelo al eje de
giro, de forma que el campo centrífugo
es más uniforme. Permiten la separación
de volúmenes aún mayores pero el sedi-
mento es menos compacto. Este tipo de
rotores es típico de ultra-centrífugas y se
emplea en separaciones de moléculas en
Figura 1.8: Distancia del radio efectivo (reff) según el rotor (A). Tipos de rotores (B). Cuanto mayor es el radio efectivo mayor es la
velocidad de sedimentación de la partícula. Existen tres tipos de rotores: de ángulo �ijo, basculantes y verticales (B).
34
gradientes de densidad auto-generados
(por ejemplo, de cloruro de cesio).
Todo rotor tiene unas propiedades que determinan
las condiciones en las que se podrá centrifugar la
muestra. Son especialmente importantes el ángulo
de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velo-
cidad máxima de giro.
Tubos
Los tubos suelen ser de vidrio o plástico. Deben
ser resistentes químicamente (a los disolventes y
reactivos) y �ísicamente (debido a la tensión a las
velocidades elevadas que se emplean). Pueden ser
de diversas formas y tamaños (cónicos, de fondo
redondo, etc.) y en el caso de los que se emplean a
altas velocidades son de plásticos especiales.
1.4.2. Tipos de centrifugación
La centrifugación se puede utilizar para alcanzar
distintos �ines. Dependiendo de la �inalidad del
estudio, se habla de centrifugación preparativa,
cuando se utiliza para la separación y puri�icación
de biomoléculas. Cuando se emplea para esti-
mar propiedades �ísico-químicas de biomoléculas
concretas y obtener información sobre sus carac-
terísticas (coe�iciente de sedimentación o masa
molecular), se habla de centrifugación analítica. La
instrumentación utilizada en ambos tipos es simi-
lar, aunque los �ines son distintos.
Centrifugación preparativa
La �inalidad de este tipo de centrifugación es la sepa-
ración de grupos de biomoléculas o de los diferentes
componentes de la célula para su análisis o utiliza-
 Fraccionamiento celular

Figura 1.9: Esquema de la centrifugación diferencial. A partir de un homogeneizado,

se realizan sucesivas centrifugaciones, incrementando cada vez el campo centrífugo
aplicado y el tiempo de centrifugación, que permiten separar de manera diferencial los
distintos orgánulos de las células. Al �inalizar cada etapa de centrifugación, se obtiene
un sedimento enriquecido con las partículas de mayor coe�iciente de sedimentación y
un sobrenadante con los solutos más pequeños y menos densos que permanecen en sus-
pensión.

ción posterior. Por consiguiente, suele utilizarse
para aislar y puri�icar células enteras, orgánulos
celulares, macromoléculas, etc. Habitualmente, en
este tipo de técnicas se dispone de grandes cantida-
des de muestra.
Dentro de las técnicas de centrifugación pre-
parativa, en función del criterio de separación de
las partículas, pueden diferenciarse: (1) la cen-
trifugación diferencial, según la velocidad de
sedimentación; (2) la centrifugación zonal, en fun-
ción del tamaño; y (3) la centrifugación isopícnica,
de acuerdo a su densidad.
En el caso de la centrifugación diferencial se
obtiene un líquido «sobrenadante» y un material
sedimentado («sedimento»). En los otros dos ca-
sos, las partículas se distribuyen en fracciones de
diferentes densidades de un �luido líquido («centri-
fugación en gradiente de densidad»).
Centrifugación diferencial
Para este tipo de centrifugación se suelen emplear
los rotores de ángulo �ijo. El principio de separación
se basa en la diferente velocidad de sedimentación
de las partículas en suspensión en función de su ta-
maño y su densidad. Inicialmente, en un tubo, los
diferentes tipos de partículas se encuentran distri-
buidos uniformemente. Al someterlas a un campo
centrífugo durante un tiempo determinado, las mo-
léculas de mayor tamaño y de densidad más elevada
experimentan la mayor fuerza centrífuga y se mue-
ven con mayor rapidez hacia el fondo del tubo de tal
manera que las diferentes partículas sedimentan a
distintas velocidades y pueden separarse a lo largo
del proceso de centrifugación (Figura 1.9).
La centrifugación diferencial suele utilizar-
se en sedimentaciones sencillas y en la obtención
parcialmente pura de orgánulos subcelulares y ma-
cromoléculas. A partir de un homogeneizado, se
realizan sucesivas centrifugaciones, incrementando
cada vez el campo centrífugo aplicado y el tiempo
de centrifugación, que permiten separar de mane-
ra diferencial los distintos orgánulos de las células.
Al �inalizar cada etapa de centrifugación, se
habrá formado en la base del tubo un sedimento en-
riquecido con las partículas de mayor coe�iciente de
sedimentación –que está contaminado por cualquier
soluto que haya podido llegar al fondo– y un sobre-
nadante con los solutos más pequeños y menos
densos que permanecen en suspensión. Cada se-
dimento obtenido de esta manera se separa del
sobrenadante y se lava y centrifuga varias veces

35
Métodos en biociencias
con un solvente isotónico para eliminar los posi-
bles restos de partículas de menor coe�iciente de
sedimentación. Cuando el sobrenadante se centri-
fuga nuevamente en condiciones de mayor tiempo
y campo centrífugo, las partículas más densas se-
dimentan nuevamente. Así, mediante la aplicación
al sobrenadante de condiciones crecientes de
centrifugación, se van separando los distintos com-
ponentes del homogeneizado inicial en fracciones
relativamente puras.
La fuerza centrífuga a aplicar en cada una de
estas etapas se determina de tal manera que en
cada etapa se consiga la sedimentación de un com-
ponente especí�ico de la célula. Dependiendo de la
fuerza centrífuga aplicada, normalmente este tipo
de fraccionamiento subcelular permite separar el
homogeneizado en cuatro fracciones:
— Nuclear (a 600 g/10’): sedimentan nú-
cleos, células intactas o parcialmente rotas
y restos de tejido no homogeneizado.
— Mitocondrial (a 15.000 g/15’): se obtienen
mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y
cloroplastos.
— Microsomal (a 100.000 g/60’): permite
aislar la membrana plasmática, el retículo
endoplasmático, aparato de Golgi y pe-
queñas vesículas.
— Soluble (a 600.000 g/120’): �inalmente
sedimentan ribosomas y polisomas, ma-
cromoléculas (proteínas, lípidos, etc.) y
material no particulado en general.
Cada una de estas fracciones no es homogénea y
está contaminada no solo por los componentes de
menor coe�iciente de sedimentación sino también
por aquellos orgánulos cuyos valores de coe�iciente
de sedimentación solapan (por ejemplo mitocon-
drias y lisosomas) y que determina que las distintas
fracciones siempre estarán compuestas por varios
tipos de partículas.
Esta heterogeneidad constituye el punto de
partida para continuar el proceso de puri�icación
de un orgánulo subcelular mediante otras técnicas
de separación, como la ultracentrifugación prepara-
tiva en gradiente de densidad en sus modalidades
zonal e isopícnica.
Centrifugación en gradiente de densidad
En este caso se suele emplean rotores basculan-
tes. Es el método más utilizado para la puri�icación
de orgánulos subcelulares y macromoléculas. Las
partículas del homogeneizado previamente enri-
36
quecidas son sometidas a un campo centrífugo en
un medio que presenta un gradiente de densidad
cuya concentración aumenta desde la super�icie del
tubo de ensayo hasta el fondo. Estos gradientes de
densidad evitan corrientes de convección y la difu-
sión que pueden interferir en la separación de las
partículas.
Además de utilizarse como método de sepa-
ración, la centrifugación en gradiente de densidad
también puede emplearse para hacer medicio-
nes analíticas como el análisis de los coe�icientes
de sedimentación de partículas, medición de las
densidades de �lotación aparentes, para estimar el
tamaño o el efecto de tratamientos �ísicos o quími-
cos aplicados sobre la muestra, etc.
Hay dos tipos de centrifugación en gradiente
de densidad: la centrifugación zonal (en función del
tamaño) y la centrifugación isopícnica (en función
de la densidad).
En ambos casos se emplea un elemento de su-
jeción de �luidos sobre el que se agrega la muestra.
Este �luido consiste en un soluto inerte, generalmen-
te de bajo peso molecular, disuelto en un solvente
en el que también son solubles las partículas a se-
parar.
Materiales utilizados para gradientes
Las principales propiedades que debe tener un so-
luto para ser utilizado en la formación de gradientes
en centrifugación zonal o isopícnica son:
— El soluto debe ser estable en solución y su
rango de densidad su�iciente para cubrir
el rango de densidades de �lotación de to-
das las partículas a separar.
— Tiene que ser hiperosmótico o hipoosmó-
tico, causando mínimas variaciones en la
viscosidad, fuerza iónica y pH.
— Debe ser totalmente inerte con respec-
to al material biológico. Tampoco deberá
agregar o disgregar partículas biológicas
o alterar actividades dependientes de su
conformación o composición.
— No puede absorber en el UV o en el ran-
go visible.
— Debe ser fácilmente eliminable de la solu-
ción de partículas puri�icadas.
— Tiene que ser esterilizable.
— No debe ser agresivo con el rotor u otros
elementos del equipo, ni in�lamable o tó-
xico.
— Debe ser barato y fácilmente accesible.

Figura 1.10: Esquema de la centrifugación en gradiente de densidad zonal. La muestra se deposita en forma de
capa en la parte superior del medio, el cual presenta un gradiente de densidad (continuo o discontinuo). En estas
condiciones y bajo la fuerza centrífuga, todas las partículas sedimentan a través del gradiente concentrándose
en zonas o bandas discretas que pueden recolectarse perforando la base del tubo de centrífuga.
En líneas generales, no existe un material de gra-
diente que sirva para todos los tipos de ensayos. Son
muy variados y pueden ser de distinta naturaleza:
(1) azúcares simples y polisacáridos como sacaro-
sa, glucógeno, dextranos o Ficoll, (2) polialcoholes
como sorbitol o glicerol, (3) proteínas como albú-
mina, (4) compuestos iodados como metrizamida
o nicodenz, (5) coloides derivados de sílice como
Percoll y (6) sales de metales alcalinos como el clo-
ruro de cesio (CsCl) o el sulfato de cesio (Cs2SO4).
Formación del gradiente
Mientras que el intervalo de densidades de un gra-
diente se determina exclusivamente según el tipo
de centrifugación (zonal o isopícnica), su forma
–determinada por su per�il de densidad a lo largo
del tubo de centrifugación– puede ser modi�icada y
adaptada a las condiciones requeridas.
Dependiendo de cómo se formen los gradien-
tes, estos pueden ser autogenerados, como es el
caso de los basados en sales de metales alcalinos
(CsCl) en los que la solución presenta una densidad
uniforme de partículas relativamente pequeñas y el
gradiente se va formando a la vez que se separan los
componentes de la muestra durante la centrifuga-
ción; o preformados, como es el caso de la sacarosa
o del percoll en los que el gradiente de densidad se
realiza antes de la centrifugación mediante un for-
mador de gradientes.
Independientemente del proceso de forma-
ción, la densidad de un gradiente puede aumentar
de forma continua o discontinua desde la super�icie
al fondo del tubo de centrifugación. En este sentido,
los gradientes discontinuos se consiguen apilando
sucesivamente volúmenes homogéneos de solucio-
37
Fraccionamiento celular
nes de diferente densidad por lo que la densidad
aumenta de forma escalonada desde la parte supe-
rior del tubo hasta el fondo del mismo (son siempre
preformados). Los gradientes continuos pueden
ser autogenerados o preformados mediante un
mezclador. Se crean incrementando linealmente
la concentración del soluto inerte empleado en el
gradiente a lo largo del volumen del tubo de cen-
trifugación. Este último tipo de gradientes se utiliza
para establecer las condiciones óptimas de la cen-
trifugación isopícnica.
Centrifugación zonal
La separación zonal o «de velocidad de sedimenta-
ción» aprovecha el tamaño y la masa de las partículas
en lugar de su densidad para la sedimentación. La
muestra que se desea separar se deposita en forma
de capa en la parte superior del medio donde se va a
realizar la separación (Figura 1.10), el cual presenta
un gradiente de densidad (continuo o discontinuo).
Este gradiente de densidad se diseña para que la
densidad de las partículas sea mayor que la del me-
dio de sedimentación. En estas condiciones y bajo
la fuerza centrífuga, todas las partículas sedimen-
tan a través del gradiente concentrándose en zonas
o bandas discretas.
Los componentes subcelulares tienen valo-
res de densidad relativamente pequeños y muy
similares (Cuadro 1.4), por lo que los gradientes de
densidad que se pueden formar son muy suaves.
Por este motivo, la velocidad de sedimentación (y,
por tanto, el mecanismo de la separación) depen-
derá principalmente del tamaño y de la masa de la
partícula. Típicamente se suele utilizar un gradien-
te continuo de sacarosa (5-20%).
Métodos en biociencias
Cuadro 1.4: Rango de densidades de las partículas biológicas.
Rango de densidades de diferentes orgánulos celulares y macro-
moléculas.
Orgánulo Densidad (g/mL)
Membranas 1.1
Mitocondrias 1.2
Lisosomas 1.2
Microsomas 1.2
Proteínas 1.3
Núcleo 1.3
DNA 1.6
Polisacáridos 1.7
Ribosomas 1.7
RNA 2.0
El gradiente debe tener una longitud su�icien-
te para separar los componentes de interés de la
muestra pero la centrifugación debe terminar antes
de que alguna de las partículas separadas llegue al
fondo del tubo. Los componentes separados se reco-
gen individualmente aspirando con mucho cuidado
las diferentes bandas o bien perforando el fondo del
tubo y recolectando las diferentes fracciones sepa-
radas por goteo de la solución.
La separación zonal es ideal para separar
partículas de tamaño de�inido –proteínas, RNA, ri-
bosomas, anticuerpos, etc.– cuyas densidades son
muy similares pero sus masas son muy distintas lo
que permite la separación. Sin embargo, cuando las
partículas son del mismo tipo pero heterogéneas, la
separación por centrifugación zonal no es e�iciente
y es más apropiado separar las partículas en fun-
ción de otro parámetro como la densidad; por lo
tanto se recurre a la separación isopícnica.
Centrifugación isopícnica
En la separación isopícnica o «de equilibrio de se-
dimentación», las partículas son separadas en
función de su densidad de �lotación (Figura 1.11);
y el tamaño solo afecta a su velocidad de migración.
Estas separaciones se llevan a cabo en un gradiente
de densidad más pronunciado que el de la centri-
fugación zonal, y que cubre todo el intervalo de
densidades de los componentes de la muestra: en el
38
fondo del tubo la densidad del medio ha de ser ma-
yor que la del componente más denso.
En esta centrifugación lo más frecuente es
mezclar la muestra con el material que formará el
gradiente y generar un gradiente autoformado a
la vez que se hace la separación. Esto requiere ve-
locidades muy altas (nivel de ultracentrifugación)
para que se forme el gradiente y tiempos de cen-
trifugación lo su�icientemente largos (hasta 1 o 2
días). Al iniciar la centrifugación, cada componen-
te subcelular se desplaza hacia arriba o hacia abajo
hasta alcanzar una posición en la que su densidad
es igual a la de su entorno, es lo que se conoce como
situación de �lotabilidad neutra, isopícnica o de equi-
librio de sedimentación; y ya no se desplazará más.
En este tipo de centrifugación, las partículas nun-
ca sedimentan en el fondo, sino que alcanzan una
posición estable intermedia en el gradiente, donde
se concentran en bandas discretas muy estrechas
(permite una mayor resolución), siendo las más
próximas al fondo del tubo las que contendrán las
partículas con mayor densidad.
Una vez que se alcanza este cuasi equilibrio, la
longitud de la centrifugación ya no in�luye en la mi-
gración de las partículas. Un ejemplo común para
este método es la separación de ácidos nucleicos en
un gradiente de CsCl.
Por consiguiente, los criterios necesarios para
el éxito de la separación isopícnica son: (1) la den-
sidad de las partículas de interés debe estar dentro
de los límites del intervalo de densidades de los
gradientes; y (2) el tiempo de ejecución debe ser
su�iciente para que las partículas alcancen su pun-
to isopícnico.
Con respecto a sus aplicaciones, la centrifu-
gación isopícnica se suele utilizar para separar
partículas similares en tamaño pero de diferente
densidad como por ejemplo ácidos nucleicos (DNA,
RNA), proteínas, orgánulos celulares o tipos de cé-
lulas. En la actualidad se emplea para separar todos
los tipos celulares sanguíneos en la estimación del
hematocrito, ayuda a puri�icar espermatozoides
viables, separar células viables y no viables, etc.
Centrifugación analítica
Este tipo de centrifugación, y especialmente la va-
riante ultra-centrifugación analítica, permite medir
las propiedades �ísico-químicas de biomoléculas pre-
viamente puri�icadas y obtener información sobre
sus características hidrodinámicas, tales como su co-
e�iciente de sedimentación o su masa molecular.
Normalmente en esta técnica se dispone de
pequeñas cantidades de muestra y suelen utilizar-
 Fraccionamiento celular

Figura 1.11: Esquema de la centrifugación en gradiente de densidad isopícnica. Las partículas son separadas
en función de su densidad de �lotación. Estas separaciones se llevan a cabo en un gradiente de densidad más pro-
nunciado que el de la centrifugación zonal, y que cubre todo el intervalo de densidades de los componentes de la
muestra. Cada componente subcelular se desplaza hasta alcanzar una posición en la que su densidad es igual a la
de su entorno (equilibrio de sedimentación o �lotabilidad isopícnica).

se elevadas fuerzas centrífugas. La instrumentación
que se utiliza no di�iere mucho de la empleada en
las separaciones preparativas, pero requiere que se
utilicen sistemas de detección y observación de los
resultados.
Para su utilización deben cumplirse unos re-
quisitos:
— Las partículas de interés deben estar lo
más puras posibles.
— Se deben emplear ultracentrífugas que
presentan una mayor capacidad de giro
(hasta 100.000 rpm).
— En cuanto al rotor, se necesita que las
paredes del tubo se encuentren alinea-
das con el eje de rotación por lo que se
emplean rotores verticales provistos de
sistemas ópticos de observación y de re-
gistro del desplazamiento capaces de
detectar la sedimentación de la partícula
en cada momento durante la centrifuga-
ción.
— Los tubos de centrífuga deben ser de
cuarzo para dejar pasar la luz visible y ul-
travioleta.
El rotor consta de dos compartimentos o células
donde se coloca la solución problema y el disolven-
te para equilibrar el sistema. Cada célula situada en
un cilindro está formada por una pieza central y dos
ventanas que permiten el paso de la luz. A medida
que el rotor gira, las imágenes de cada ventana son
digitalizadas y almacenadas en un ordenador.
Los sistemas ópticos de análisis pueden ser de
tres tipos: (1) absorción, que mide la absorbancia de
la muestra que sedimenta a una determinada longi-
tud de onda (); (2) Schlieren; y (3) interferencia.
En estos dos últimos la lectura experimental se basa
en el índice de refracción. Cuando actúa el campo
centrífugo se forma un frente de sedimentación que
avanza hacia el fondo del tubo y deja detrás una re-
gión de disolvente. El método óptico de absorción
registra un incremento de absorbancia relacionado
con el cambio de concentración, cuando el rayo óp-
tico pasa a través del frente de sedimentación. En el
método de Schlieren, el haz de rayos se desvía debi-
do al cambio del índice de refracción que varía con
la concentración. En ambos casos, el sistema óptico
convierte estas desviaciones en una curva de varia-
ción del gradiente de concentración.
Esta técnica se suele emplear para detectar y
cuanti�icar interacciones macromoleculares (pro-
teína-proteína, DNA-proteína, receptor-ligando,
etc.) así como la estructura cuaternaria y estados de
agregación de las proteínas.
1.5. Caracterización bioquímica y
morfológica
La con�irmación del aislamiento de un orgánulo y
la determinación del grado de pureza del puri�ica-
do se realiza mediante un doble criterio bioquímico
y morfológico. Habitualmente el estudio de la mor-
fología se realiza por microscopía electrónica (ver
capítulo 8).
Para la caracterización bioquímica se utilizan
enzimas y marcadores bioquímicos que están liga-
dos especí�icamente a un orgánulo intracelular y se
evalúa su actividad (Cuadro 1.5).

39
Métodos en biociencias

Cuadro 1.5: Marcadores bioquímicos de las fracciones subcelu- — Fracción nuclear: se mide la concentra-
lares. Principales enzimas y marcadores bioquímicos especí�icos de
las distintas fracciones subcelulares obtenidas por centrifugación.
ción de DNA de las distintas fracciones.
La mayor concentración de DNA debe es-
tar en la fracción nuclear.
Orgánulo Marcador enzimático — Fracción mitocondrial: se mide la activi-
Membrana plasmática 5’-nucleotidasa
dad de la glutamato deshidrogenasa en
Fosfodiesterasa I
todas las fracciones, una mayor actividad
corresponde a la fracción mitocondrial.
Retículo endoplasmático Glucosa-6-fosfatasa — Fracción lisosomal: mayor actividad de la
NADPH diaforasa fosfatasa ácida o alcalina.
Mitocondrias Succinato deshidrogenasa — Fracción microsomal: mayor actividad de
Citocromo oxidasa la glucosa-6 fosfatasa.
— Fracción soluble: mayor actividad de la
Aparato de Golgi Galactosil-transferasa
lactato deshidrogenasa. No debe haber
Fucosil-transferasa
gran cantidad de actividad de las otras
Lisosomas -N-acetil-hexosaminidasa enzimas porque supondría que algunos
-galactosidasa orgánulos se han roto.
Peroxisomas Catalasa La presencia de actividad enzimática en una fracción
Urato oxidasa distinta de aquella en la que está localizada es una
Cloroplastos Clorofilas prueba que indica contaminación por otros orgá-
nulos. Cuando se utiliza un enzima como marcador
Ribosomas RNA
bioquímico se asume una distribución unimodal
Núcleo DNA de cada actividad enzimática, es decir, cada enzi-
Nucleósido-trifosfatasas ma está asociado a un determinado componente
intracelular pero en la práctica pueden darse distri-
Fracción citosoluble Lactato deshidrogenasa
buciones multimodales.

Para evaluar globalmente la e�icacia del pro-

ceso de puri�icación se suelen determinar varios
parámetros como la actividad de cada enzima mar-
cador (unidades/mL), la concentración de proteína
total (mg/mL) y el contenido en ácidos nucleicos
(unidades de absorbancia a 260 nm por mL) en
cada una de las fracciones aisladas. Cada fracción se
caracteriza e identi�ica de acuerdo con los datos del
porcentaje de DNA/proteína, la actividad especí�ica
de cada enzima (unidades/mg proteína) y el por-
centaje de actividad enzimática recuperado.
A partir de la determinación enzimática se
pueden diferenciar cada una de las fracciones obte-
nidas de la centrifugación diferencial:
Bibliografía
Bioquímica: técnicas y métodos. 2003.
Roca P, Oliver J, Rodríguez AM. Editorial Hélice. ISBN 978-
8492112487.
Bioquímica: texto y atlas. 2005.
Koolman J, Röhm KH. Editorial Médica Panamericana.
ISBN 978-8479037246.
Introducción a la biología celular. 2011.
Alberts B et al. Editorial Médica Panamericana. ISBN 978-
6077743187.
Técnicas instrumentales en bioquímica y biología. 2003.
Barceló F. Edicions UIB. ISBN 8476328087.

40
 2.
Análisis de proteínas
Sergio Ciordia
Alberto Paradela

Las proteínas desempeñan un papel fundamental

para la vida, puesto que son imprescindibles para
el desarrollo del organismo y realizan una gran can-
tidad de funciones a distintos niveles (estructural,
inmunológico, enzimático, homeostático, de pro-
tección, regulación, transporte, etc.). Prácticamente
todos los procesos biológicos requieren la presen-
cia o la actividad de este tipo de moléculas. Desde
el punto de vista bioquímico, las proteínas son muy
heterogéneas en tamaño, carga, hidrofobicidad, etc.
Las proteínas están formadas por largas ca-
denas de aminoácidos (polipéptidos) unidas por
enlaces peptídicos y una cadena lateral (-R) que es
la que determina los distintos aminoácidos (Figura
Figura 2.1: Formación del enlace peptídico por
2.1). La secuencia de aminoácidos es clave para de- condensación de dos aminoácidos. Las proteínas
terminar su estructura tridimensional y su función. están formadas por largas cadenas de aminoácidos
Las proteínas presentan, en condiciones �i- unidas por enlaces amida entre el grupo carboxilo
(-COOH) y el grupo amino (-NH2) unidos al átomo
siológicas o nativas, una disposición estructural de carbono alfa de aminoácidos adyacentes.
característica, pero si se cambian estas condicio-
nes, como la temperatura o el pH, pueden perder
la conformación y, eventualmente, su función (des-
naturalización). Por tanto, la estructura de una La estructura primaria es la secuencia de ami-
proteína es muy importante para su función. Para noácidos que constituyen la proteína. La estructura
el estudio de la estructura es frecuente conside- secundaria es la forma que adquiere la cadena poli-
rar una división en cuatro niveles de organización peptídica. Hay dos tipos de estructuras secundarias
(Figura 2.2), aunque el cuarto nivel no siempre está básicas, las hélices-alfa y las hojas plegadas-be-
presente. ta. En la estructura hélice-alfa, la forma helicoidal
Métodos en biociencias

Figura 2.2: Niveles de organización de las proteínas. Las proteínas pueden presentar: una estructura primaria, for-
mada por la secuencia de aminoácidos; una estructura secundaria de la cadena polipeptídica, cuando los aminoácidos
interactúan a través de puentes de hidrógeno; una estructura terciaria por atracciones entre hélices-alfa y hojas ple-
gadas-beta; y, ocasionalmente, una estructura cuaternaria formada por varias cadenas polipeptídicas; por ejemplo, la
hemoglobina.

en torno al carbono beta se estabiliza mediante los
puentes de hidrógeno intracatenarios formados
entre el grupo -C=O del aminoácido n y el -NH del
n+4. En la estructura hoja plegada-beta, la cadena
peptídica se encuentra casi totalmente extendida
y los puentes de hidrógeno se forman en secciones
paralelas de las cadenas polipeptídicas (intercate-
narios), y no entre residuos cercanos como en las
hélice-alfa.
La estructura terciaria es la forma tridimen-
sional general donde las hélices-alfa o las hojas
plegadas-beta se pliegan como resultado de las
interacciones entre residuos alejados en la estruc-
tura primaria; pueden, además, existir regiones
de la proteína con una conformación desordena-
da. La estructura terciaria suele estabilizarse por
la formación de interacciones hidrofóbicas, puen-
tes de hidrógeno y puentes salinos, principalmente.
Finalmente, en algunos casos, las proteínas pueden
agruparse en multímeros para crear una unidad
funcional. La estructura global adoptada por varias
proteínas para formar dicho multímero es lo que se
denomina estructura cuaternaria..
Las proteínas se sintetizan de manera estricta-
mente regulada en los ribosomas a partir de los RNA
mensajeros (mRNA) transcritos a partir de los genes
que las codi�ican. Habitualmente su síntesis respon-
de a la presencia de señales o factores externos.
2.1. Proteómica
El conjunto de las proteínas expresadas en un
determinado contexto espacial y temporal se de-
nomina proteoma. La proteómica es la ciencia que
estudia, a gran escala, el proteoma; en particular la
estructura y función de las proteínas que lo compo-
nen. El término proteoma fue de�inido por Wilkins
(ver bibliogra�ía) por primera vez en 1994 como
una analogía con el término genoma –el conjunto de
genes de una célula–, y deriva de la fusión de «pro-
teína» y «genoma».
Las técnicas proteómicas permiten obtener
una imagen dinámica de las proteínas expresadas
por una célula en un momento dado y bajo unas de-
terminadas condiciones temporales y ambientales.
Pero el estudio del proteoma de un organismo es
más complicado que el del genoma porque, mien-
tras que la información contenida en el genoma
es esencialmente constante, el proteoma es enor-
memente dinámico y di�iere entre células y de un
momento a otro. Esto se debe a que cada tipo celu-
lar expresa genes distintos, y por tanto el conjunto
básico de proteínas de cada célula también es dife-
rente. Un factor adicional de complejidad son las
modi�icaciones o alteraciones que puede sufrir la
estructura o secuencia básica de la proteína. Dichas
modi�icaciones provienen básicamente de: el recor-
te o splicing alternativo de los mRNA que codi�ican
la proteína (Figura 2.3) y de las modi�icaciones
postraduccionales (fosforilación, glicosilación, ace-
tilación, etc.) que modi�ican o modulan la actividad,
función o localización de la proteína en diferentes
contextos �isiológicos o metabólicos.
Todas estas fuentes de complejidad incre-
mentan sustancialmente el número de proteínas
diferentes que pueden formarse a partir de los
genes presentes en el genoma: se estima que a par-
tir de los 20.000-25.000 genes codi�icantes en el
genoma humano pueden generarse entre 500.000-
1.000.000 de proteínas diferentes.
La gran variedad de estructuras y funciones de
las proteínas ha estimulado el desarrollo de multi-
tud de técnicas para su estudio, englobándose en su

42
 Análisis de proteínas

Figura 2.3: Efecto de los procesos de splicing aternativo y las modi�icaciones postraduccio-
nales en el número de proteínas sintetizadas por una célula. Los procesos de corte y empalme
(splicing alternativo) durante la maduración del mRNA pueden generar diferentes combina-
ciones de exones. Esto, unido a las modi�icaciones químicas covalentes que sufren las proteínas
después de la traducción a nivel de los ribosomas, puede dar lugar a un número muy superior
de proteínas diferentes.

mayoría dentro de la proteómica. Esta ciencia es re-
lativamente reciente y para su despegue de�initivo
ha sido necesaria (i) la consolidación en los últimos
veinticinco años de la espectrometría de masas (MS,
mass spectrometry) como técnica aplicada al análisis
de biomoléculas y (ii) el crecimiento exponencial en
el número de entradas de genes y/o proteínas de-
positados en las bases de datos, fundamentalmente
como consecuencia del desarrollo tecnológico aso-
ciado al proyecto internacional Genoma Humano.
Estos hechos, combinados con el empleo de po-
tentes métodos de fraccionamiento y separación
de péptidos y proteínas como la electroforesis bi-
dimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE,
polyacrylamide gel electrophoresis) y la cromatogra-
�ía líquida de alta e�icacia (HPLC, high-performance
liquid chromatography), han permitido consolidar
la proteómica, desde mediados de los años 90 del
siglo pasado, como ciencia para el análisis masivo
de proteínas.
Las principales áreas de estudio de la proteó-
mica son:
— Identi�icación de proteínas.
— Caracterización de modi�icaciones, prin-
cipalmente postraduccionales.
— Cuanti�icación de los niveles de expresión
absolutos o relativos de las proteínas en
diferentes condiciones: proteómica de ex-
presión diferencial.
— Estudios de interacción (proteína-proteí-
na o con otros ligandos).
2.2. Preparación de la muestra
La preparación de la muestra es un paso esencial
en proteómica, y de ella depende la calidad y rele-
vancia de los datos obtenidos en el experimento. La
recogida de la muestra, su transporte, manipulación
y almacenamiento, así como la extracción de pro-
teínas, son procedimientos tan importantes como el
posterior análisis mediante MS.
Como se describe en el capítulo 1, el origen de
la muestra utilizada en cualquier estudio de biolo-
gía celular o molecular puede ser muy diverso y las
fuentes desde las que extraer las proteínas celula-
res muy diferentes. Los más utilizados suelen ser
los cultivos celulares, tejidos o �luidos biológicos.
Dada la gran variedad de fuentes biológicas
y de estructuras proteicas existentes es muy com-
plicado el desarrollo de un método que permita la
extracción y posterior análisis de todas las proteínas
con igual e�icacia pero, en general, la preparación de
la muestra puede resumirse en los siguientes pasos
(Figura 2.4):

43
Métodos en biociencias
Figura 2.4: Flujo típico de preparación de la muestra en cualquier estudio proteómico. La muestra es so-
metida a distintos procesos: (i) extracción-solubilización de las proteínas; (ii) una vez desnaturalizadas, las
proteínas se reducen y bloquean los puentes disulfuro; (iii) precipitación y concentración de las sustancias
interferentes; y (iv) digestión enzimática con proteasas especí�icas hasta sus péptidos resultantes.
Extracción-solubilización. Este primer paso implica
la homogeneización de tejidos, lisis celular y rup-
tura de las interacciones que se producen inter- e
intra-proteínas, tales como puentes de hidrógeno,
fuerzas de Van der Waals e interacciones iónicas
e hidrofóbicas. Las proteínas extraídas son des-
naturalizadas y modi�icadas químicamente para
Figura 2.5: Proceso de extracción-solubilización de proteínas.
La muestra es homogeneizada por la combinación de métodos
mecánicos y químicos (agentes caotrópicos, detergentes e inhi-
bidores de proteasas).
44
solubilizarlas y evitar así la agregación y la activi-
dad proteolítica que pueda presentar la muestra
(Figura 2.5).
Este proceso requiere la utilización combinada
de agentes caotrópicos (por ejemplo, urea, tiourea o
cloruro de guanidinio a concentraciones entre 2 y 9
M), detergentes (por ejemplo, SDS, CHAPS o Triton
X-100; a concentraciones que varían entre 1 y 4%)
e inhibidores de proteasas de amplio espectro como
el �luoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) o el �luoru-
ro de bencenosulfonilo (AEBSF).
La utilización de estos agentes se suele combinar
con métodos �ísicos de homogeneización mecánica,
como el homogeneizador Potter-Elvehjem, sonicación
y procesos de congelación/descongelación.
Reducción-alquilación. Una vez desnaturalizadas,
las proteínas son tratadas con agentes reductores y
alquilantes para mantener su solubilidad y evitar la
formación de enlaces o puentes disulfuro entre los
grupos tiol de las cisteínas (Figura 2.6). Los agen-
tes reductores más comúnmente utilizados son
el beta-mercaptoetanol y el ditiotreitol (DTT) –en
concentraciones entre 10 y 100 mM– y los deriva-
dos de fos�inas, como la tributilfos�ina (TBP) y la
tris(2-carboxietil)fos�ina (TCEP) a concentraciones
en torno a 2 mM.
Tras el proceso de reducción, los grupos sul-
�idrilo reducidos deben ser protegidos frente a
nuevos procesos de oxidación. Para ello existen
diferentes agentes alquilantes, como la iodoaceta-
mida (IAA), el (metiltio)dimetil sulfóxido (MMTS) o
la 4-vinilpiridina.
Precipitación-concentración. Este paso de «limpie-
za» se puede realizar antes o después del proceso
de reducción-alquilación y permite eliminar com-
ponentes de la muestra biológica, como el DNA, y
algunos reactivos utilizados en la solubilización de
las proteínas como los detergentes, que pueden
interferir en los siguientes pasos. El método más
empleado es la precipitación selectiva de proteí-
nas con disolventes orgánicos como acetona, ácido
 Análisis de proteínas

Figura 2.6: Proceso de reducción-alquilación de proteínas. Habitualmente los puentes disulfuro entre cisteínas se rompen con la combina-
ción de un agente reductor (por ejemplo, ditiothreitol) seguido de un agente alquilante (por ejemplo, iodoacetamida).

tricloroacético, cloroformo/metanol, etanol, iso-
propanol, etc. Los solventes orgánicos favorecen
la precipitación porque disminuyen la constante
dieléctrica de la solución, lo que resulta en interac-
ciones más fuertes entre las cadenas polipeptídicas
y, además, reemplazan parte del agua que hidrata
las moléculas de proteína. El precipitado proteico
puede ser solubilizado nuevamente en el tampón
más apropiado para los siguientes pasos y en un vo-
lumen menor, lo que permite, además, concentrar la
muestra. Como desventaja, estos métodos pueden
causar una pérdida parcial de muestra (de hasta un
20%, en función del tipo de muestra y el método
empleado).
Digestión enzimática. El análisis de proteínas me-
diante MS requiere, en su formato más habitual
(shotgun proteomics), la digestión o proteólisis
controlada de las proteínas hasta sus péptidos resul-
tantes. Aunque existen diversos métodos químicos
para la hidrólisis de proteínas se ha generalizado
el empleo de enzimas proteolíticas altamente es-
pecí�icas (Cuadro 2.1). La tripsina es la enzima más
comúnmente utilizada dada su alta especi�icidad
para cortar en el extremo C terminal de residuos de
arginina y lisina. Tras la digestión, los péptidos tríp-
ticos resultantes presentan típicamente dos cargas
positivas, lo cual favorece su ionización en el poste-
rior análisis de MS. Además, la tripsina es rentable
por bajo coste y alta e�iciencia.
La elección del método de preparación de
muestra depende del tipo y cantidad de muestra
inicial y de los procedimientos analíticos que se
emplearán en el estudio: electroforesis, métodos
cromatográ�icos y espectrometría de masas.

Cuadro 2.1: Principales proteasas utilizadas en experimentos de proteómica. En la columna de especi�icidad las letras mayúsculas repre-
sentan aminoácidos (código de una letra).

Tipo Especificidad Rango pH

Tripsina Serín R, K 7.5 – 9.0

Quimotripsina Serín Y, F, W, L 1.5 – 8.5

Glu C Serin D, E 7.5 – 8.5

Lys C Serín K 7.5 – 8.5

Proteinase K Serín Aminoácidos hidrofóbicos 7.0

Arg C Cisteín R 7.5 – 8.5

Pepsina Ácida F, M, L, W 2.0 – 4.0

45
Métodos en biociencias
2.3. Técnicas de separación
y purificación de proteínas
A pesar de las constantes mejoras en la instrumen-
tación analítica utilizada en el análisis de proteínas,
el conjunto total de proteínas que constituye un
proteoma celular típico resulta demasiado com-
plejo para ser analizado directamente. Por ello, es
habitual recurrir al fraccionamiento de la muestra
para:
— Reducir su complejidad e incrementar el
número de proteínas identi�icadas.
— Enriquecer o favorecer la detección de
aquellas proteínas de interés o presentes
en menor cantidad.
Los métodos de fraccionamiento permiten subdi-
vidir la complejidad del proteoma que se pretende
analizar con el objetivo de alcanzar una mayor co-
bertura mediante el estudio de las fracciones
obtenidas. Los procesos de fraccionamiento pueden
realizarse a nivel de proteínas o péptidos, o combi-
narse (fraccionamiento multidimensional).
Las muestras pueden ser fraccionadas usando
diferentes métodos de fraccionamiento a diferentes
niveles y/o basándose en diferentes propiedades:
(i) su localización en el material biológico de partida
(subfraccionamiento celular); (ii) las propiedades
�ísico-químicas de sus componentes proteicos (so-
lubilidad, �iltración, ultracentrifugación); (iii) sus
propiedades electroforéticas (SDS-PAGE, 2D-PAGE,
etc.); o (iv) sus propiedades cromatográ�icas (ex-
clusión molecular, cromatogra�ía de a�inidad,
cromatogra�ía líquida…)
2.3.1. Subfraccionamiento celular
Uno de los métodos clásicos de fraccionamiento a
partir de extractos celulares es el fraccionamien-
to subcelular (ver epígrafe 1.4). Este consiste en el
aislamiento y caracterización de los diferentes orgá-
nulos que componen la célula. Este método tiene dos
grandes ventajas: por un lado, la complejidad del pro-
teoma de un orgánulo es considerablemente inferior
al de la célula completa y, por otro, la caracterización
del proteoma del orgánulo permite determinar la lo-
calización subcelular de las proteínas.
El fraccionamiento de orgánulos implica la
utilización de un protocolo de lisis celular que per-
mita mantener la integridad �ísica de los diferentes
componentes subcelulares de interés y su posterior
separación mediante aproximaciones «clásicas»,
como pueden ser (Figura 2.7):
46
La centrifugación diferencial (ver apartado 1.4.2),
basada en la aplicación de centrifugaciones se-
cuenciales a partir de un homogeneizado celular
o tisular, permite obtener diferentes orgánulos en
distintas fracciones subcelulares: nuclear, mito-
condrial, microsomal y soluble (Figura 2.7a). La
separación de los diferentes orgánulos depende de
la diferente velocidad de sedimentación de las par-
tículas en suspensión en función de su tamaño y su
densidad. La principal desventaja de este método es
su baja resolución, dando lugar al solapamiento de
fracciones y generando mezclas de diferentes orgá-
nulos con velocidades de sedimentación parecidas.
La centrifugación en gradiente de densidad isopícnica
(ver apartado 1.4.2.) es el método más e�iciente en la
separación de componentes subcelulares. Se basa en
la separación de orgánulos en función de su densidad
de �lotación (Figura 2.7b). La muestra se dispone en
un gradiente de densidad que contiene una concen-
tración muy elevada de sacarosa o de CsCl. Durante la
centrifugación cada orgánulo se desplaza hasta que
su densidad iguala la del medio circundante (punto
de �lotabilidad neutra o isopícnica).
El fraccionamiento diferencial mediante detergentes
es una alternativa a los métodos de fraccionamien-
to basados en centrifugaciones seriadas. Consiste
en el empleo de tampones con diferentes detergen-
tes cuyas ventajas son reducir las contaminaciones
de otros orgánulos y el tiempo de fraccionamien-
to empleado en las centrifugaciones seriadas. Es un
método sencillo, capaz de fraccionar proteínas de
acuerdo a cuatro localizaciones subcelulares: cito-
sol, membrana celular/orgánulos, soluble-nuclear,
y citoesqueleto (Figura. 2.7c). Este método está
disponible en formato comercial (ProteoExtract
subcellular proteome extraction kit, CalbioChem).
La puri�icación de orgánulos por métodos de inmu-
noa�inidad permite la obtención de fracciones de
manera muy especí�ica. Este método se basa en la
unión entre anticuerpos especí�icos inmoviliza-
dos en un soporte sólido y los orgánulos de interés
(Figura 2.7d). Existen modi�icaciones para el tipo
de ligando, y se han utilizado también ligandos quí-
micos, péptidos, aptámeros, etc. Sus principales
limitaciones están relacionadas con el alto coste
de los anticuerpos empleados y el incremento del
tiempo de puri�icación.
2.3.2. Técnicas electroforéticas
Las técnicas electroforéticas son herramientas am-
pliamente utilizadas para la separación, aislamiento,
 Análisis de proteínas

El fraccionamiento diferencial mediante detergentes es una alternativa a

los métodos de fraccionamiento basados en centrifugaciones seriadas. Consiste
El fraccionamiento
en el empleo de tampones diferencial mediante
con diferentes detergentes
detergentes cuyas es una alternativa
ventajas son reducir a
los
las métodos de fraccionamiento
contaminaciones basadosy el
de otros orgánulos entiempo
centrifugaciones seriadas.empleado
de fraccionamiento Consiste
en ellasempleo de tampones
centrifugaciones con diferentes
seriadas. Es un detergentes cuyas capaz
método sencillo, ventajas deson reducir
fraccionar
las contaminaciones
proteínas de acuerdo de aotros orgánulos
cuatro y el tiempo
localizaciones de fraccionamiento
subcelulares: empleado
citosol, membrana
en las centrifugaciones
celular/orgánulos, seriadas. yEs
soluble-nuclear, un método(Figura.
citoesqueleto sencillo, capaz
2.7c). Estedemétodo
fraccionar
está
proteínas de acuerdo a cuatro localizaciones subcelulares: citosol,
disponible en formato comercial (ProteoExtract subcellular proteome extraction kit, membrana
celular/orgánulos,
CalbioChem). soluble-nuclear, y citoesqueleto (Figura. 2.7c). Este método está
disponibleLa en formato comercial
purificación (ProteoExtract
de orgánulos por métodossubcellular proteome extraction
de inmunoafinidad permitekit, la
CalbioChem).
obtención de fracciones de manera muy específica. Este método se basa en la
La purificación
unión entre anticuerpos deespecíficos
orgánulos por métodos de
inmovilizados eninmunoafinidad
un soporte sólidopermite la
y los
obtención
orgánulos de interés
fracciones de manera
(Figura muy específica.
2.7d). Existen Este para
modificaciones método se basa
el tipo en la
de ligando,
unión
y se hanentreutilizado
anticuerpos
tambiénespecíficos
ligandos inmovilizados en un soporte
químicos, péptidos, aptámeros, sólido
etc.y Sus
los
orgánulos de interés (Figura 2.7d). Existen modificaciones para el
principales limitaciones están relacionadas con el alto coste de los anticuerpostipo de ligando,
yempleados
se han utilizado tambiéndelligandos
y el incremento tiempo de químicos, péptidos, aptámeros, etc. Sus
purificación.
principales limitaciones están relacionadas con el alto coste de los anticuerpos
empleados y el incremento
2.3.2. Técnicas del tiempo de purificación.
electroforéticas

Las técnicas
2.3.2. Técnicas electroforéticas son herramientas ampliamente utilizadas para la
electroforéticas
separación, aislamiento, caracterización e identificación de biomoléculas. La
Las técnicas se
electroforesis electroforéticas son herramientas
basa en el movimiento ampliamente
de partículas cargadasutilizadas para la
bajo la influencia
separación,
de un campo aislamiento, caracterización
eléctrico controlado. e identificación
Las biomoléculas de biomoléculas.
cargadas se separan La en
electroforesis se basa en el movimiento de partículas cargadas bajo la influencia
función de su velocidad de migración, que depende a su vez de la carga eléctrica,
de un campo
el tamaño eléctrico controlado.
y la estructura Las biomoléculas cargadas se separan en
de cada partícula.
función de su velocidad de migración, que depende a su vez de la carga eléctrica,
el tamaño y la estructura
Fundamentos de cada partícula.
de la electroforesis
De acuerdo
Figura 2.7: Métodos de subfraccionamientoFundamentos a lasElleyes de la electrostática, la velocidad
implica lade migración (𝑣𝑣) de
una
celular de la
en proteómica. electroforesis
fraccionamiento de orgánulos subcelulares utilización de
alguna de las aproximaciones clásicas como:partícula es directamente
la centrifugación proporcional
diferencial (A), la centrifugación al producto
en gradiente de su
de densidad carga(B),
isopícnica efectiva
el (𝑞𝑞)
y al
fraccionamiento De
diferencial con detergentes (C) y de
métodos de inmunoa�inidadla(D).
gradiente de potencial eléctrico aplicado ( 𝐸𝐸 ); e inversamente proporcionaluna
acuerdo a las leyes la electrostática, velocidad de migración (𝑣𝑣) de al
partícula
coeficiente esde directamente
fricción (𝑓𝑓),proporcional
es decir, a la al resistencia
producto deque su opone
carga efectiva
el medio,(𝑞𝑞)y yque
al
gradiente de potencialdel
depende directamente eléctrico
tamaño aplicado
y forma de ( 𝐸𝐸la); molécula.
e inversamente proporcional al
coeficiente de fricción (𝑓𝑓), es decir, a la resistencia que opone el medio, y que
caracterización e identi�icación de biomoléculas. 𝑞𝑞𝑞𝑞
depende directamente del tamaño y forma 𝑣𝑣 = de la molécula.
La electroforesis se basa en el movimiento de par- 𝑓𝑓
tículas cargadas bajo la in�luencia de un campo 𝑞𝑞𝑞𝑞
eléctrico controlado. Las biomoléculas cargadas A partirsede esta ecuación
A partir 𝑣𝑣 =
de estaseecuación
establece que la movilidad
se establece electroforética (𝜇𝜇)
que la movi-
𝑓𝑓
separan en función de su velocidad es deun migración, lidad electroforética () es un
caso particular de la velocidad de migración de un ión cuandocaso particular de la se aplica un
Aelpartir
tama-de
campo eléctrico
que depende a su vez de la carga eléctrica, velocidad
de esta
1 V/cm de
ecuación migración
se establece
y su signo de
es igual alque un ión cuando
la carga
de la se
movilidad aplica
de laelectroforética
partícula. (𝜇𝜇)
ño y la estructura de cada partícula.es un caso particularunde campo eléctricode
la velocidad demigración
1 V/cm y su
𝑞𝑞 designo
un es cuando
ión igual al se aplica un
campo eléctrico de 1de la carga
V/cm y sude la partícula.
signo es𝜇𝜇 =
igual al de la carga de la partícula.
𝑓𝑓
Fundamentos de la electroforesis 𝑞𝑞
Así pues, la velocidad de 𝜇𝜇migración = electroforética depende de la
𝑓𝑓
densidad de
De acuerdo a las leyes de la electrostática, la carga
ve- de la molécula (relación carga/peso), del voltaje aplicado y de
la Así
porosidad pues,
del la velocidad
soporte de la de migración voltaje
electroforesis. electroforética depende de la
locidad de migración (v) de una partícula es Así pues, velocidad de El migración no se puede
electroforéti- incrementar
directamente proporcional al productodensidad
  de carga
de su car- de la molécula (relación carga/peso),
ca depende de la densidad de carga de la molécula del voltaje aplicado y de10
la porosidad
ga efectiva (q) y al gradiente de potencial eléctrico del soporte de electroforesis. El voltaje
(relación carga/peso), del voltaje aplicado y de lano se puede incrementar
aplicado (E); e inversamente proporcional
  al coe�i- porosidad del soporte de electroforesis. El volta- 10
ciente de fricción (f), es decir, a la resistencia que je no se puede incrementar indiscriminadamente
opone el medio, y que depende directamente del ta- porque genera un calor excesivo. En caso contrario,
maño y forma de la molécula. al aplicar un voltaje demasiado bajo, se puede cau-

47
Métodos en biociencias

sar una separación pobre debido a la difusión de las

moléculas por exposición muy prolongada al cam-
po eléctrico.
La mayoría de las biomoléculas (proteínas, áci-
dos nucleicos y polisacáridos), debido a su carácter
anfótero, poseen una determinada carga eléctrica
debido a la presencia de grupos aniónicos y catióni-
cos. Durante la electroforesis el pH del medio ejerce
dos funciones, por un lado lleva la carga eléctrica y,
por otro, determina la carga neta de las moléculas
que se separan y, por ende, la dirección y velocidad
de la migración electroforética. Cuando una biomo-
lécula alcanza su punto isoeléctrico, pH al cual su
carga neta es 0, deja de migrar. Por debajo del punto
isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia
el cátodo (-), y por encima del punto isoeléctrico tie-
ne carga neta negativa y migra hacia el ánodo (+).
Esta técnica se usa para separar compues-
tos con carga neta, como aminoácidos, péptidos, Figura 2.8: Esquema de la electroforesis en papel. La muestra
proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos. Pero ade- se coloca en el punto medio sobre una tira de papel de �iltro
o de acetato de celulosa embebida en tampón. Al aplicar una
más permite determinar otros parámetros como corriente eléctrica los iones migran hacia los electrodos de
las características ácido-básicas de las proteínas polaridad opuesta a velocidades características para formar
presentes en la muestra, su peso molecular, punto bandas discretas.
isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas.
se aplica una cantidad pequeña de proteína en una
Métodos electroforéticos zonales zona estrecha, siendo la longitud del trayecto reco-
rrido mucho mayor que la zona de aplicación. Esto
El uso de la electroforesis para separar proteínas fue permite separar los componentes de la muestra en
descrito por primera vez por el bioquímico sueco bandas discretas o zonas.
Tiselius en 1937 al introducir la técnica de «electro-
El equipamiento requerido es muy simple: una
foresis de entorno móvil» en la cual la separación fuente de alimentación, cubeta vertical u horizontal
de las proteínas se producía por completo en solu- donde se coloca el soporte y dos electrodos. Los mé-
ción, lo que requería un gran volumen de muestra. todos más utilizados son:
No fue hasta los años cincuenta cuando aumentó
su relevancia al ser reemplazada por la técnica de
«electroforesis zonal», en la que el desplazamiento (1) Electroforesis en papel
de las proteínas está limitado a un soporte sólido, lo
En esta técnica la muestra se coloca en el punto me-
que mejora la resolución de la electroforesis. Estos
dio sobre una tira de papel de �iltro o de acetato
últimos métodos son, a día de hoy, los más comunes
de celulosa embebida en tampón (Figura 2.8). Los
dada su gran aplicabilidad en diferentes campos. extremos de la tira se sumergen en reservorios se-
Además, son útiles para lograr la separación de parados de tampón donde se colocan los electrodos.
mezclas complejas y solo necesitan la aplicación de Al aplicar una corriente eléctrica (aproximadamen-
pequeñas cantidades de la disolución de proteínas te 20 V/cm1) los iones de la muestra migran hacia
a un soporte sólido, que se impregna con una solu- los electrodos de polaridad opuesta a velocidades
ción tampón. características para formar eventualmente bandas
Los soportes son, en general, polímeros que discretas. En este caso la velocidad de migración
forman un gel poroso que restringe el movimiento de cada ión está condicionada principalmente por
de las moléculas a través del medio durante la elec- su carga. Una vez terminado el electroforetograma
troforesis y disminuye simultáneamente los �lujos (lo que suele durar varias horas), se seca la tira y
de convección del solvente. Como soporte han sido se localizan las proteínas separadas mediante tin-
utilizados papel, membranas de acetato de celulo- ción o revelado con ciertos colorantes como el rojo
sa, almidón, agarosa y poliacrilamida, entre otros. Ponceau y el negro amido. Por último, las bandas se
Este método tiene un gran poder resolutivo porque pueden cuanti�icar por densitometría.

48

Esta técnica se suele emplear en los labo-
ratorios clínicos para separar las proteínas del
suero: albúmina, inmunoglobulinas, lipoproteínas,
isoenzimas de la lactato-deshidrogenasa o la crea-
tinquinasa.
(2) Electroforesis en gel
Este tipo de electroforesis ha sustituido en gran
medida a la electroforesis en papel. Los geles, prin-
cipalmente de agarosa y poliacrilamida, actúan
como soportes inertes que, además de evitar la di-
fusión, permiten obtener diferentes porosidades
modi�icando la concentración de los componentes
que los forman. Por lo tanto, la separación, además
de por diferencias de carga, se produce también por
diferencias de tamaño: el gel retarda el movimiento
electroforético de las moléculas grandes en compa-
ración con las más pequeñas.
Dentro de este tipo de electroforesis se pueden
distinguir:
— Electroforesis en gel de agarosa. Se emplea
para separar por electroforesis moléculas
grandes (>200 kDa); por ejemplo, áci-
dos nucleicos o complejos proteicos. Para
separar estos compuestos se requieren
geles con un tamaño de poro muy grande
que, en el caso de geles de poliacrilamida,
requiere emplear concentraciones muy
bajas (<2.5%), haciendo los geles muy
blandos y di�íciles de manipular. Esta di-
�icultad se soluciona reemplazando la
acrilamida por un polisacárido, la agaro-
Figura 2.9: Esquema de la electroforesis PAGE. Se emplea como soporte inerte un gel de poliacrilamida (A). La separación se produce
por diferencias de carga y por diferencias de tamaño (B). Adaptada de Berg y Freeman (ver bibliogra�ía).
49
Análisis de proteínas
sa, que se usa a concentraciones entre el
1 y el 3%.
— Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE). Es el método de separación más
ampliamente utilizado en química de pro-
teínas. Los geles de poliacrilamida se forman
por polimerización del monómero acrila-
mida (CH2=CH–CO–NH2) y el comonómero
entrecruzante N,N’-metilen-bisacrilamida
(CH2=CH–CO–NH–CH2–NH–CO–CH=CH2),
inducida por la presencia de radicales
libres. El persulfato amónico y la N,N,N’,N’-
tetrametiletilendiamina (TEMED) son los
responsables de catalizar la reacción de poli-
merización al actuar como agentes oxidante
y reductor respectivamente (Figura 2.9).
Las principales ventajas del uso de
poliacrilamida son: la alta resolución o ca-
pacidad de separación, la posibilidad de
analizar moléculas relativamente gran-
des (1x106 Da), la mínima interacción con
la muestra y la gran estabilidad. Su princi-
pal inconveniente es que el monómero de
acrilamida es altamente neurotóxico, por
lo que debe manejarse con precaución.
Variando las concentraciones del mo-
nómero (A) y del comonómero (B) de
entrecruzamiento se consiguen geles de
poliacrilamida con poros de tamaño de-
terminado, cuya amplitud puede ajustarse
para optimizar la separación de los com-
ponentes de la muestra. Generalmente,
las proporciones de A y B utilizadas son
del 5-15 % y del 2-4 % respectivamente,
Métodos en biociencias
Figura 2.10: Esquema de la electroforesis MZE. En esta electroforesis se emplea un gel de poliacrilamida con dos zo-
nas: gel concentrador (superior) y gel separador (inferior). Adaptada de Voet (ver bibliogra�ía). En el carril izquierdo
de la imagen de la electroforesis se han incluido los marcadores moleculares.
para generar un tamiz que permite un ni-
vel de resolución adecuado para proteínas
entre 10 y 200 kDa. En términos genera-
les la disminución del %A mejorará la
resolución de proteínas de elevado peso
molecular y viceversa, el aumento del %A
proporcionará mayor resolución en el ran-
go de bajo peso molecular (Figura 2.9b).
Una variante de esta técnica, los geles en
gradiente de acrilamida, proporciona un
intervalo de separación y de estimación
de masa molecular más amplio, así como
un nivel mayor de resolución debido a que
el tamaño del poro decrece progresiva-
mente; por ejemplo, 4-20% de acrilamida
en geles NuPAGE de Invitrogen.
Como resultado de la polimerización, el
gel forma una lámina rectangular delgada
en la que pueden analizarse y compa-
rarse simultáneamente varias muestras,
dispuestas en calles paralelas. El tampón
de los reservorios y del gel es el mismo,
y tiene un pH en torno a 9 para asegu-
rar que la mayoría de las proteínas, con
puntos isoeléctricos comprendidos entre
pH 4 y 7.5, tengan carga neta negativa y
migren hacia el ánodo situado en el reser-
vorio inferior. La muestra se disuelve en
una solución densa de glicerol o sacaro-
sa y se coloca en pocillos preformados en
la parte superior del gel. La aplicación de
una corriente continua (150-300 V) por
50
un tiempo su�iciente (30-90 min.) obliga
a las proteínas a migrar a través del en-
tramado del gel, separándose en forma
de bandas discretas en función de su peso
molecular. Estos sistemas de electrofore-
sis emplean un gel uniforme y un tampón
homogéneo lo que reduce la capacidad de
resolución electroforética.
— Electroforesis de múltiples zonas (MZE)
o de pH discontinuo. En la actualidad es
habitual utilizar este tipo de electrofore-
sis discontinuas en vez de las anteriores
u homogéneas. En este sistema se utili-
zan dos tipos de geles (Figura 2.10). En la
parte superior un gel concentrador, o es-
paciador, generalmente de menor altura,
de menor porcentaje de poliacrilamida
(por tanto de mayor tamaño de poro), en
el que se aplicará la muestra; y en la parte
inferior un gel separador o de resolución,
con mayor porcentaje de acrilamida y
menor tamaño de poro, donde ocurre la
separación de las proteínas en función de
su carga y tamaño molecular.
Esta técnica se fundamenta en que
los constituyentes iónicos de los tampo-
nes utilizados en ambos geles son iguales
(Tris-HCl), pero su pH es distinto (2 unida-
des inferior en el concentrador); además
el tampón de corrida empleado en los elec-
trodos es diferente (Tris-Glicina). Cuando
comienza la electroforesis, en el gel espa-

ciador, las movilidades de los componentes
de la muestra son intermedias por lo que
se concentran en una zona muy estrecha
–unos pocos micrones de grosor– situada
entre las de los iones conductores (Cl-) y
los rezagados (glicina). Cuando la mues-
tra concentrada llega al límite entre el
gel concentrador y separador ocurren
cambios en la movilidad de los constitu-
yentes por causa del pH, la fuerza iónica
y el efecto de tamiz del gel, lo que favo-
rece la separación en bandas discretas en
el gel separador y un mayor poder de re-
solución.
— Electroforesis en geles de poliacrilamida
con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).
La electroforesis de proteínas en geles
de poliacrialimida puede realizarse en
condiciones nativas, donde las proteínas
mantienen su conformación nativa, o en
condiciones desnaturalizantes, donde se
emplea un detergente (habitualmente
SDS, dodecil sulfato de sodio, CH3(CH2)
n
-O-SO3- Na+) y un agente reductor (be-
ta-mercaptoetanol, DTT, etc.) que rompe
los puentes disulfuro.
El SDS a una concentración del 1%
desnaturaliza por completo las proteínas
y rompe las interacciones no covalentes
implicadas en el plegamiento que forma
su estructura secundaria, terciaria y cua-
ternaria. El anión se une a las proteínas
por absorción no especí�ica a una propor-
ción aproximada de una molécula de SDS
por cada dos residuos de aminoácidos
Figura 2.11: Esquema del isoelectroenfoque. Se establece un gradiente de pH antes de cargar la muestra,
se somete a un campo eléctrico y las moléculas se mueven hasta la zona en la que el pH es igual a su pun-
to isoeléctrico. En ese punto, la carga neta de la proteína es cero y detiene su migración.
51
Análisis de proteínas
(con una relación SDS/proteína máxima
de 1.4 g/g). La cadena alifática (dode-
cil) se sitúa en el interior de la proteína,
mientras que los grupos sulfato se ubican
en la super�icie. La elevada carga negativa
que con�iere el SDS a las proteínas en-
mascara la carga intrínseca de la proteína
(suma de las cargas asociadas a las cade-
nas de aminoácidos que la forman) por
lo que todos los complejos SDS-proteína
presentan relaciones carga/masa idénti-
cas y formas similares. En consecuencia,
el factor determinante de la separación
es el peso molecular, siendo la migra-
ción de los derivados SDS-proteína hacia
al ánodo inversamente proporcional al
logaritmo de su peso molecular. Esta últi-
ma característica permite estimar el peso
molecular de las proteínas presentes en
la muestra, para lo cual es necesaria la
presencia, normalmente en un carril pa-
ralelo, de un patrón o mezcla de proteínas
de peso molecular conocido (marcadores de
peso molecular) (Figura 2.10).
(3) Isoelectroenfoque
El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica de separa-
ción electroforética que hace migrar los compuestos
anfotéricos, como las proteínas, en un medio con
un gradiente estable de pH que se incrementa de
forma paulatina desde el ánodo hacia el cátodo en
presencia de un campo eléctrico (Figura 2.11). Las
moléculas se mueven hasta la zona en la que el pH
es igual a su punto isoeléctrico. En ese punto la car-
Métodos en biociencias
ga neta de la proteína es cero y la molécula detiene
su migración. De esta manera cada proteína se «en-
foca» en una banda estrecha alrededor de su punto
isoeléctrico.
El gradiente de pH se crea por medio de unas
sustancias denominadas anfolitos, que son ácidos
poliaminocarboxílicos con pesos moleculares com-
prendidos entre 300 y 1.000 Da. Estos anfolitos
móviles pueden cubrir diferentes intervalos de pH,
bien amplios (pH 3-10) o más estrechos (pH 7-8). El
intervalo se elige de acuerdo con los puntos isoeléc-
tricos de las moléculas que quieran separarse.
Bajo la in�luencia del campo eléctrico en
solución estos anfolitos migrarán cada uno a su co-
rrespondiente punto isoeléctrico de manera que el
gradiente de pH se genera por la acción amortigua-
dora de estos anfolitos y es mantenido por el campo
eléctrico.
El enfoque isoeléctrico puede realizarse en gel
de poliacrilamida, gel de agarosa o en membranas
de acetato de celulosa. Los sistemas más utilizados
para el enfoque isoeléctrico emplean geles hori-
zontales sobre placas de vidrio, tiras de plástico o
cilindros.
(4) Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional en gel de poliacri-
lamida (2D-PAGE) fue descrita por O’Farrell en los
Figura 2.12: Esquema de la electroforesis 2D-PAGE. Separación de
un extracto de Escherichia coli por 2D-electroforesis. En la prime-
ra dimensión las proteínas se separan según su punto isoeléctrico
y en la segunda dimensión en función de la masa molecular apa-
rente de las proteínas.
52
años 70 y, dentro de las técnicas electroforéticas,
es la más empleada en estudios proteómicos para
separar mezclas complejas de proteínas utilizan-
do dos dimensiones. En la primera dimensión se
emplea el enfoque isoeléctrico (IEF), donde las pro-
teínas se separan según su punto isoeléctrico, y en
la segunda dimensión la SDS-PAGE, donde la sepa-
ración tiene lugar de acuerdo a la masa molecular
aparente de las proteínas (Figura 2.12). La alta re-
solución de la técnica se debe a que los dos tipos de
separación se basan en principios �isicoquímicos di-
ferentes.
Una importante innovación para la prime-
ra dimensión de la 2D-PAGE fue la introducción de
gradientes de pH inmovilizados (IPG), generados
mediante los llamados anfolitos inmovilizados o
inmovilinas. Estos son derivados de acrilamida quí-
micamente bien de�inidos unidos covalentemente
a anfolitos amortiguadores con diferentes valores
de pH (entre 1 y 13). Estos reactivos bifuncionales
copolimerizan con la matriz de acrilamida del gel
generando gradientes de pH muy estables, lo que
permite llevar a cabo enfoques isoeléctricos con
mayor reproducibilidad. Las tiras IPG abarcan in-
tervalos de pH lineales y no lineales: amplios (pH
3-12), medios (pH 4-7) o estrechos (pH 4.5-5.5); y
de diferentes longitudes (7, 18, 24 cm).
La electroforesis bidimensional permite obte-
ner «mapas proteicos» en los que las coordenadas
de cada proteína vienen dadas por su punto isoeléc-
trico y su masa molecular. Según el tamaño del gel
y el gradiente de pH utilizado en la primera dimen-
sión, la 2D-PAGE puede resolver entre cientos y
miles de proteínas simultáneamente en un solo gel.
Las proteínas separadas pueden ser posteriormen-
te identi�icadas y caracterizadas sus modi�icaciones
postraduccionales mediante el análisis por espec-
trometría de masas. Finalmente, la comparación de
mapas proteicos correspondientes a diferentes si-
tuaciones �isiológicas o metabólicas puede facilitar
la detección e identi�icación de proteínas asociadas
a los procesos estudiados (proteómica diferencial o
comparativa).
Después de la electroforesis bidimensional las
proteínas separadas pueden detectarse median-
te distintos métodos de tinción. Entre estos están
la tinción con colorantes aniónicos como el azul
Coomassie; la tinción negativa con cationes metáli-
cos, como el zinc; la tinción con nitrato de plata; o
el marcaje �luorescente con SYPRO Ruby o los co-
lorantes de cianina (Cy2, Cy3, Cy5). El empleo de
colorantes �luorescentes aumenta la sensibilidad,
ofrece un intervalo dinámico lineal y permite la com-
paración cuantitativa de los patrones en los geles.

Figura 2.13: Representación esquemática de un aparato de electroforesis capilar.
(5) Electroforesis capilar
La electroforesis capilar (EC) surgió en los años 80
en respuesta a las limitaciones de la electroforesis
en gel, concretamente a los largos tiempos nece-
sarios para separar las moléculas cargadas y a la
di�icultad para su automatización. La electrofore-
sis capilar es una técnica en la que la electroforesis
se realiza en capilares muy delgados (de 10-100 μm
de diámetro interno) y de 20-100 cm de longitud,
en presencia de un campo eléctrico. Estos capilares
se rellenan previamente con solución amortiguado-
ra, geles de poliacrilamida o geles de inmovilina. El
capilar se conecta a un detector en un extremo y a
una fuente de corriente a través de recipientes con
un amortiguador (Figura 2.13).
Las principales ventajas asociadas al peque-
ño diámetro de los capilares son: una disipación del
calor más e�iciente, lo que permite aplicar grandes
voltajes (entre 5 y 30 kV); una disminución del vo-
lumen de muestra utilizado; una mayor e�icacia de
la separación y una reducción del tiempo de esta.
La aplicación de la muestra puede realizarse
de dos formas: por inyección de alto voltaje (AV) o
por inyección de presión (IP). En ambos casos, con
el voltaje desconectado, se cambia el recipiente del
amortiguador en el electrodo positivo por otro que
contiene la muestra. En la inyección AV, la muestra
se introduce aplicando momentáneamente voltaje,
53
Análisis de proteínas
mientras que en inyección IP se introduce en el ca-
pilar aplicando presión (por ejemplo, por vacío). A
continuación se vuelve a sustituir el recipiente del
amortiguador, se aplica de nuevo el voltaje y co-
mienza la separación.
Los detectores habitualmente utilizados en
electroforesis capilar son los mismos que en HPLC:
de absorción en el ultravioleta/visible (UV/vis), de
�luorescencia, conductividad, amperométricos y de
espectrometría de masas. El detector UV/vis es el
más utilizado, pudiendo llegar a detectar cantidades
de material en el entorno de attomoles (10-18 M).
Hay varios sistemas de electroforesis capilar
con diferentes características. El sistema más simple
es la electroforesis capilar de zona (CZE, capillary
zone electrophoresis). En la electroforesis capilar en
gel (CGE) se llena el capilar con un gel polimérico.
Dado que este es poroso, los solutos migran a tra-
vés del gel a una velocidad que depende tanto de la
movilidad electroforética como de su tamaño. Este
método es útil para solutos con movilidades simila-
res, como fragmentos de DNA.
Aunque la electroforesis 2D-PAGE ha sido la
técnica electroforética más empleada en la sepa-
ración de proteínas para estudios proteómicos, en
la actualidad la tendencia se dirige a emplear cada
vez más técnicas de separación en fase líquida que
combinan diversas técnicas cromatográ�icas o elec-
troforesis capilar acopladas a la espectrometría de
masas.
Métodos en biociencias
2.3.3. Técnicas cromatográficas
En el análisis de muestras complejas es esencial ob-
tener una adecuada separación de los analitos de
interés de las posibles interferencias. Para alcan-
zar este objetivo, una de las técnicas más poderosas
y versátiles es la cromatogra�ía. Actualmente, es el
método analítico más utilizado para separar, iden-
ti�icar y cuanti�icar los compuestos presentes en
muestras líquidas o gaseosas.
Con el nombre de cromatogra�ía se agrupan
varias técnicas que pueden ser clasi�icadas aten-
diendo a diferentes criterios. Entre estas se tienen:
cromatogra�ía en papel, cromatogra�ía en colum-
na, cromatogra�ía de capa �ina, cromatogra�ía ga-
seosa, cromatogra�ía de �luidos supercríticos, etc.
En todos los casos los componentes de una mezcla
se separan por su distinta capacidad de interaccio-
nar con una fase estacionaria y una fase móvil.
De manera general, la muestra se disuel-
ve en un líquido o �luido gaseoso, conocido como
fase móvil que se hace pasar a través de una ma-
triz sólida porosa, denominada fase estacionaria
(inmiscible con la móvil), que se mantiene �ija en
un soporte en forma de columna o super�icie pla-
na. Las dos fases, móvil y estacionaria, se eligen
para que los componentes de la muestra se distri-
buyan de modo distinto entre las dos fases. Así, los
compuestos fuertemente retenidos por la fase esta-
cionaria se moverán lentamente con el �lujo de fase
móvil, mientras que los que se retengan débilmente
avanzarán con más rapidez.
La cromatogra�ía se puede emplear para ob-
tener información cualitativa y cuantitativa de las
especies separadas.
— Análisis cualitativo. El parámetro más
utilizado con �ines cualitativos es el tiem-
po de retención, y es característico de
cada componente en cada sistema cro-
matográ�ico. Este parámetro por sí solo
no con�irma la presencia de un compo-
nente en una mezcla, aunque sí puede
con�irmar su ausencia. La identi�icación
requiere siempre el uso de patrones en
las mismas condiciones cromatográ�icas.
— Análisis cuantitativo. Se basa en la com-
paración del área (más usado) o la altura
(menos exacto) de pico del componente
de interés con la de los estándares de esa
sustancia en cantidades conocidas, admi-
tiendo que existe una relación lineal entre
el área o altura de pico y la concentración
en un determinado intervalo de concen-
traciones.
54
En el caso de las proteínas, el método cromatográ�i-
co de separación más utilizado es la cromatogra�ía
líquida, donde la fase estacionaria (empaquetada
en una columna) es un sólido o un líquido �ijado en
un sólido, y la fase móvil es un líquido.
La cromatogra�ía líquida «clásica» o a «baja
presión» se lleva a cabo en una columna, general-
mente de vidrio, rellena con la fase estacionaria.
La muestra se introduce por la parte superior y la
fase móvil �luye a través de la columna por grave-
dad. La principal limitación de esta separación es
que requiere mucho tiempo y presenta una baja e�i-
cacia de separación. Con el objeto de aumentar la
e�icacia se fue disminuyendo el tamaño de partícula
que forma la fase estacionaria, lo que a su vez gene-
ró la necesidad de utilizar sistemas de bombeo de
la fase móvil a alta presión para conseguir un �lu-
jo razonable. De esta manera, nació la técnica de
«cromatogra�ía líquida de alta e�icacia» (HPLC, high
performance liquid chromatography), que es la téc-
nica cromatográ�ica más empleada en la actualidad.
Cromatografía líquida de alta eficacia
La cromatogra�ía líquida de alta e�icacia (HPLC) es
el resultado de la optimización de los parámetros
que determinan la e�iciencia de la separación cro-
matográ�ica, especialmente los relacionados con la
matriz, o gel cromatográ�ico, y la columna.
En el sistema de HPLC se emplean fases estacio-
narias con tamaños de partícula que normalmente
oscilan entre 1.7 y 10 μm de diámetro, lo que au-
menta enormemente la super�icie de intercambio,
incrementando a su vez la e�icacia de la separación
y la resolución. La resistencia que opone este tipo
de fase estacionaria obliga a impulsar la fase móvil
con un sistema de bombas de alta presión y, en ge-
neral, al empleo de instrumentación muy especí�ica.
Un sistema HPLC está formado por (Figura
2.14): reservorios de las fases móviles, sistema
de bombeo de la fase móvil a alta presión, sistema
de inyección de muestras, columna cromatográ�i-
ca situada en un horno termostatizado, detector y
sistema de adquisición de datos. La columna croma-
tográ�ica a veces va precedida de una «pre-columna»
para impedir que lleguen a la columna componentes
de la muestra que puedan dañar la fase estacionaria.
Sistema de suministro de fase móvil. Todos los equipos
de HPLC incluyen un sistema de bombeo de fase mó-
vil de alta presión para forzar el paso de la fase móvil
a través de la columna, cuyo relleno extremadamente
compacto causa una elevada sobrepresión. Existen di-

Figura 2.14: Representación esquemática de un equipo de HPLC.
ferentes tipos de bombas de alta presión siendo las
más comunes las bombas de pistón. En HPLC, para
una fase estacionaria concreta, la naturaleza de la
fase móvil es un elemento clave en la separación.
Existen dos modalidades:
— Isocrática: la composición de la fase móvil
permanece constante durante la separa-
ción.
— En gradiente: la composición se va mo-
di�icando durante la separación. En este
caso, el cromatógrafo debe disponer de
un sistema de programación de gradien-
te, que permita la mezcla reproducible de
disolventes en distintas proporciones.
Para evitar la formación de burbujas en las bombas
y/o el detector, que ocasionarían �lujos inestables
y �luctuaciones en la línea base, los disolventes
empleados deben carecer de gases disueltos. La
desgasi�icación se suele realizar por vacío, ultraso-
nidos o desplazando el aire disuelto en la fase móvil
haciendo burbujear un gas inerte (He o N2) en ella.
Para evitar la presencia de impurezas se emplean
disolventes de máxima pureza («grado» HPLC).
Sistema de inyección de muestra. La inyección de la
muestra debe hacerse en un corto período de tiem-
po para perturbar lo menos posible el régimen de
circulación de fase móvil establecido en la columna
y el detector. Idealmente, los volúmenes empleados
deben ser pequeños (unos pocos μL). El sistema
más utilizado en la inyección hace uso de válvulas
rotatorias de alta presión de varias vías, que tra-
bajan en formato manual o automatizado. Estas
55
Análisis de proteínas
válvulas poseen dos posiciones: una de llenado o
carga y otra de inyección.
Columna cromatográ�ica. Las columnas de HPLC
son tubos rectos de acero de entre 3 y 30 cm de lon-
gitud. Su diámetro típicamente oscila entre 1 y 10
mm. La fase estacionaria está formada por micro-
partículas porosas de sílica de forma irregular o más
habitualmente esférica, altamente empaquetadas y
con tamaños que oscilan entre 3 y 10 μm. Estas co-
lumnas resisten altas presiones y son compatibles
con la mayor parte de las fases móviles acuosas u
orgánicas. Sobre su super�icie se unen covalente-
mente diferentes grupos químicos que de�inen las
propiedades de retención de la fase estacionaria.
La inclusión de un compartimento termostatizado
para la columna permite optimizar la separación y
obtener resultados reproducibles.
Detector. El detector ideal debe ser sensible a peque-
ñas concentraciones de analito, tener una respuesta
lineal en un intervalo amplio de concentraciones,
generar poco ruido de fondo, ser estable en el tiem-
po, reproducible y con un tiempo de respuesta
corto. Además, debe ser insensible a los cambios de
composición de la fase móvil. La celda de �lujo del
detector debe tener un volumen mínimo para no
provocar ensanchamiento de las bandas o pérdida
de resolución del equipo.
Existen diversos tipos de detectores. Los más
usados son:
— Detectores espectrofotométricos. Miden
la absorbancia a una o varias longitudes
de onda en el ultravioleta o en el visible
(por ejemplo, 210 nm y 280 nm para pép-
tidos y proteínas).
— Detectores de �luorescencia. Miden la
emisión �luorescente por parte de los
analitos. Es muy sensible, pero limitado
solo a compuestos �luorescentes.
— Detectores electroquímicos. Detectan
compuestos electroactivos, es decir,
susceptibles de sufrir reacciones de oxi-
dación o reducción. También pueden
emplearse medidas de conductividad
eléctrica.
— Detectores refractométricos. Se basan
en los cambios del índice de refracción
de la fase móvil por la presencia de un
soluto. Es un detector universal pero
menos sensible que los detectores es-
pectrofotométricos. Muy afectado por los
cambios de temperatura y no puede utili-
zarse en gradiente.
Métodos en biociencias
Clasificación de los métodos cromatográficos
Las técnicas cromatográ�icas de alta resolución pue-
den clasi�icarse de acuerdo a diferentes criterios,
siendo uno de los más habituales el que atiende
al fundamento del proceso de separación, es decir,
de la naturaleza de las fases móvil y estacionaria;
y del tipo de interacciones que tienen lugar entre
los solutos y las fases utilizadas. En función de estos
criterios, se pueden distinguir:
Cromatografía de partición o de reparto
Se trata probablemente del tipo de HPLC más usado.
La separación de los solutos se basa en la diferente
solubilidad entre las fases móvil y estacionaria. En
función de la polaridad relativa de la fase móvil y es-
tacionaria, se distinguen dos tipos de cromatogra�ía
de partición:
— Cromatogra�ía en fase normal (NP-HPLC).
La fase estacionaria es polar, mientras que
la elución se lleva a cabo con disolventes
no polares, como etiléter, cloroformo o
n-hexano.
— Cromatogra�ía en fase inversa (RP-HPLC).
La fase estacionaria es apolar, tratándo-
se normalmente de cadenas alifáticas
con un número variable de átomos de
carbono tales como C4 (n-butilo), C8
(n-octilo) o C18 (n-octadecilo), y la elu-
ción se lleva a cabo con una fase móvil
de polaridad elevada, como disoluciones
acuosas conteniendo metanol, acetonitri-
lo o tetrahidrofurano (Figura 2.15).
En la modalidad de fase inversa, el tiempo de re-
tención es mayor para las moléculas de naturaleza
apolar, mientras que las moléculas de carácter polar
eluyen más rápidamente (al revés que en NP-HPLC).
Figura 2.15: Representación de la cromatogra�ía de fase inversa. Los péptidos y las proteínas se unen a esta fase en condiciones acuosas y
eluyen de la columna a medida que la fase se vuelve más hidrofóbica (aumenta el % de disolvente polar como el acetonitrilo). Primero elu-
yen los compuestos más hidro�ílicos (A). Cromatograma característico de un digerido tríptico separado por RP-HPLC (B).
56
La cromatogra�ía de reparto es una de las
más usadas en la actualidad para el análisis y pu-
ri�icación de compuestos orgánicos de naturaleza
hidro�ílica; por ejemplo, las proteínas o los pépti-
dos. En la industria farmacéutica se emplea para
el control de calidad de los ingredientes activos y
de las formas terminadas de los medicamentos.
En medio ambiente son especialmente destaca-
bles las determinaciones de residuos de plaguicidas
(herbicidas, fungicidas e insecticidas), fenoles, e
hidrocarburos (PCBs, PAHs, etc.) En el ámbito bio-
médico se emplea para la separación de péptidos,
hormonas, ácidos grasos, etc.
Su auge se debe a su elevada capacidad de se-
paración (factor de selectividad), que se mani�iesta
incluso en el análisis de moléculas estructuralmen-
te muy similares. Probablemente no exista ningún
otro método con semejante capacidad de separación
y que no implique la necesidad de modi�icar quími-
camente los componentes de una mezcla compleja.
Cromatografía de adsorción
En la cromatogra�ía de adsorción el propio relleno
sólido de la columna actúa como fase estacionaria.
Las fases estacionarias típicas son sílice y alúmina,
ambas polares, que permiten establecer asociacio-
nes del tipo fuerzas de van der Waals y puentes de
hidrógeno con el analito. Como la fase estacionaria
es polar suelen emplearse fases móviles apolares
o moderadamente polares. Las fases típicas son
hexano, isooctano y diclorometano. La selección es
empírica y es frecuente el empleo de mezclas. Esta
cromatogra�ía es menos usada que la de partición.
Cromatografía iónica
En este tipo de cromatogra�ía se emplean inter-
cambiadores de iones como fases estacionarias.

Figura 2.16: Representación de la cromatogra�ía de intercambio iónico.
Los intercambiadores de iones son redes tridi-
mensionales de polímeros activados de resinas de
poliestireno, celulosa o poliacrilamida que contie-
nen en su estructura grupos funcionales cargados,
generalmente ácidos o básicos.
La separación tiene lugar por la interacción de
los componentes de la muestra con carga opuesta.
La elución ocurre por la adición de sales a la fase
móvil, donde el contraión de la sal compite con
los analitos por los sitios activos de la fase esta-
cionaria y desplaza al analito. El incremento de la
concentración iónica desplaza progresivamente a
los componentes de la mezcla en función de la car-
ga de cada uno de ellos (Figura 2.16). Cuanto mayor
es la a�inidad de unión de una proteína por el inter-
cambiador iónico, tanto mayor será el retraso que
experimente (incremento en el tiempo de elución).
Existen dos tipos de cromatogra�ía de in-
tercambio iónico, de acuerdo a la carga de la fase
estacionaria:
— Intercambio catiónico. La matriz cromato-
grá�ica se encuentra cargada negativamente
y, por tanto, intercambia cationes.
— Intercambio aniónico. La matriz está car-
gada positivamente e intercambia aniones.
Los grupos químicos funcionales en las matrices
intercambiadoras catiónicas son ácidos sulfónicos
o carboxílicos mientras que en las aniónicas son
57
Análisis de proteínas
sales de amonio cuaternarias o aminas. Estas matri-
ces intercambiadoras de cationes o aniones pueden
tener carácter fuerte o débil dependiendo del rango
de pH en que se mantengan cargadas.
La e�iciencia de la separación dependerá del
pH, la concentración de sal (generalmente NaCl) y
del tipo de intercambiador iónico escogido. La fase
móvil en este tipo de cromatogra�ía suele ser una
disolución acuosa (con cantidades moderadas de
metanol u otro disolvente orgánico miscible con
agua) que contiene especies iónicas en forma, gene-
ralmente, de disolución reguladora del pH (variable
clave en la elución). La proteína de interés podrá
ser separada del intercambiador iónico con un tam-
pón de un pH y concentración de sal que reduzca la
a�inidad de la proteína por la fase estacionaria. La
cromatogra�ía de intercambio iónico es muy versátil
y poderosa para la separación de péptidos y pro-
teínas y además, tiene la ventaja adicional de que
mantiene la conformación nativa de estas últimas.
Cromatografía de afinidad
Este tipo de cromatogra�ía aprovecha la elevada es-
peci�icidad de la interacción entre la proteína que se
desea separar y el ligando inmovilizado covalente-
mente en la fase estacionaria.
Este factor de selectividad es el mayor que se
puede esperar en cualquier tipo de cromatogra-
�ía, ya que a partir de una mezcla compleja solo se
Métodos en biociencias
Figura 2.17: Representación de la cromatogra�ía de a�inidad. Cromatogra�ía de a�inidad de la concanavalina A por los
residuos de glucosa del soporte. La elución se logra con un tampón que contiene glucosa.
unirá a la matriz un único componente o grupo de
moléculas estructuralmente similares. El resto de
los componentes no son retenidos y son eliminados
con la fase móvil o después de un paso de lavado (en
el caso de uniones inespecí�icas). La elución de los
componentes unidos se logra con un tampón capaz
de romper la interacción, por variación del pH o de
la fuerza iónica o pasando por la columna un ligando
diferente por el que la proteína tenga mayor a�ini-
dad. No se emplean gradientes y se pueden llegar a
obtener altos porcentajes de pureza (Figura 2.17).
La más representativa y especí�ica de estas in-
teracciones es la que ocurre entre un anticuerpo y
su antígeno correspondiente, conocida como cro-
matogra�ía de inmunoa�inidad. Otras interacciones
muy especí�icas que se utilizan en la cromatogra-
�ía de a�inidad son las existentes entre una enzima
y su sustrato y la de una proteína con su receptor.
Adicionalmente, existen varias matrices comercia-
les para cromatogra�ía de a�inidad que permiten la
puri�icación de distintos tipos de proteínas, como
por ejemplo:
— Proteína A, para puri�icar inmunoglobu-
linas.
— Lectinas, para el aislamiento de glicopro-
teínas y otros glicoconjugados.
— Matriz con glutatión como ligando, para
la puri�icación de proteínas recombinan-
tes expresadas y unidas a la glutatión
S-transferasa (GST).
— Matriz IMAC (immobilized metal af�inity
chromatography) activada con iones me-
tálicos divalentes (Fe2+, Ni2+, Co2+, Cu2+,
etc.), para la puri�icación de proteínas re-
combinantes expresadas con una cola de
histidinas; o de fosfoproteínas, por su a�i-
nidad a los grupos fosfato.
58
Cromatografía de exclusión por tamaño
(o de filtración en gel)
En esta cromatogra�ía la separación ocurre de
acuerdo al tamaño y la forma de las moléculas en la
mezcla. El relleno (gel) está constituido por partí-
culas poliméricas porosas. La base de la separación
consiste en la capacidad del soluto para penetrar
en los poros de la fase estacionaria. Las moléculas
de mayor tamaño atraviesan y eluyen rápidamente
de la columna sin apenas ser retenidas. En cam-
bio, las moléculas más pequeñas pueden penetrar
en los poros y separarse en función de su tamaño
(Figura 2.18).
Este es el único mecanismo de separación cro-
matográ�ico en el que no ocurre interacción de la
muestra con la fase estacionaria. Por este motivo,
las columnas suelen ser más largas y se usan �lu-
jos más pequeños. Las separaciones transcurren en
un formato isocrático (sin gradiente) y, para evitar
posibles interacciones electrostáticas entre las pro-
teínas y la fase estacionaria, se suele añadir a la fase
móvil pequeñas concentraciones de cloruro sódico
(0.2-0.3 M). Este tipo de cromatogra�ía conserva la
estructura nativa de las proteínas.
El volumen y el rango de pesos moleculares de
la muestra tienen una gran in�luencia sobre la se-
paración y deben mantenerse dentro de valores
limitados, de acuerdo a las dimensiones de la co-
lumna. Otra característica de esta técnica es que
causa la dilución de la muestra.
Este tipo de cromatogra�ía tiene una resolu-
ción relativamente baja, por lo que la separación
completa de dos componentes solo se puede lograr
si existe una diferencia de tamaño su�icientemen-
te grande. De ahí que sus principales aplicaciones
sean la identi�icación y separación de oligómeros

Figura 2.18: Representación de la cromatogra�ía de exclusión por
tamaño.
y agregados de una proteína, el desalado o cambio
de tampón de una preparación de proteínas y la de-
terminación del peso molecular aproximado de una
proteína a partir de su volumen de elución (debido
a la relación lineal entre este y el logaritmo del peso
molecular en un rango conocido de pesos molecula-
res para una determinada matriz).
2.4. Identificación de proteínas
por espectrometría de masas
La espectrometría de masas (MS) es el método
analítico más utilizado para caracterizar y de-
terminar la secuencia de péptidos y proteínas,
proporcionando información tanto sobre la estruc-
tura de una determinada molécula como sobre la
composición cualitativa y cuantitativa de una mez-
cla compleja de moléculas. La MS permite medir
con gran precisión la relación de la masa frente a la
carga de las moléculas (m/z). Esta medida se lleva
a cabo mediante la ionización de las moléculas (con
mayor frecuencia positivamente), la separación de
los iones resultantes de acuerdo con su relación
m/z y la detección de las abundancias de los mis-
mos. Gran parte del éxito de la MS como técnica
analítica se debe al desarrollo paralelo de diferen-
tes metodologías, especialmente técnicas analíticas
de separación, como los métodos cromatográ�icos o
la electroforesis, que pueden combinarse de modo
rápido y efectivo con la MS en sus diferentes moda-
lidades.
59
Análisis de proteínas
El primer espectrómetro de masas fue desa-
rrollado a principios del siglo �� gracias al trabajo
pionero de Thompson y sus colaboradores, pero no
fue hasta la década de los 80 cuando la aparición de
técnicas de ionización «suave» como el electroes-
pray (ESI, electrospray ionization) o la ionización
por desorción con láser asistida por matriz (MALDI,
matrix-assisted laser desorption ionization), per-
mitieron la aplicación de la MS en el estudio de
moléculas orgánicas, particularmente al análisis de
biomoléculas grandes, polares y no volátiles, como
las proteínas.
2.4.1. Aspectos instrumentales
En paralelo a la introducción de las técnicas de io-
nización suave se han desarrollado distintos tipos
de espectrómetros de masas para el análisis de pro-
teínas y péptidos. Esquemáticamente, todos los
espectrómetros de masas constan de (Figura 2.19):
un sistema de entrada o introducción de la muestra,
una fuente de iones, un analizador de masas y un
detector. Estos componentes pueden combinarse
en distintas con�iguraciones creando espectróme-
tros con distintas especi�icidades y prestaciones
en términos de velocidad, resolución, sensibilidad,
exactitud o precisión y rango de masas.
Otro requisito común a todos los espectró-
metros de masas es la necesidad de contar con un
sistema de alto vacío adecuado (de 10-8 a 10-4 torr),
para evitar que las partículas cargadas puedan
colisionar con los componentes del aire y ser des-
truidas.
Sistemas de entrada de la muestra
En la mayor parte de los equipos comerciales el sis-
tema de entrada de la muestra y la fuente de iones
están combinados, formando un único componen-
te. Estos sistemas de entrada están diseñados para
introducir una pequeña cantidad de muestra en el
espectrómetro con una mínima pérdida de vacío y
disponen en general de sistemas para volatilizar las
muestras sólidas y líquidas. Pueden ser:
— Sistemas de entrada indirectos, en los
cuales la muestra se volatiliza externa-
mente y se introduce en la región de
ionización.
— Sistemas por sonda directa, utilizados
para la introducción directa de líquidos
y sólidos no volátiles. Permiten trabajar
con pequeñas cantidades de muestras.
Métodos en biociencias
Figura 2.19: Representación de un espectrómetro de masas.
— Sistemas especialmente diseñados para
hacer posible el acoplamiento de la sali-
da de las columnas cromatográ�icas o de
electroforesis capilar al espectrómetro de
masas.
Fuentes de ionización
La ionización del analito es una etapa esencial en el
análisis por MS. Existe una amplia variedad de méto-
dos, pero ninguno de ellos es de aplicación universal.
La elección del tipo de ionización está normalmente
determinada por la naturaleza de la muestra y el tipo
de información que se desea obtener. Dependiendo
del fundamento de la ionización estos sistemas o
fuentes de ionización se clasi�ican en:
— Ionización en fase gaseosa. En este caso la
muestra se volatiliza primero y posterior-
mente se ioniza. Estas fuentes se utilizan
para compuestos térmicamente estables
y de pesos moleculares inferiores a 1.000
Da. Dentro de ellas están las fuentes de
impacto de electrones (EI), las de ioniza-
ción química (CI) y las de ionización por
campo.
— Ionización por desorción. En este tipo
de ionización la muestra se transforma
directamente en iones gaseosos. Estos
sistemas son aplicables a muestras no vo-
látiles y térmicamente inestables. A este
grupo pertenecen las fuentes de desor-
ción por campo, las de ionización por
electronebulización (ESI), las de ioniza-
60
ción por desorción con láser (LDI), las de
desorción por plasma, las de bombardeo
con átomos rápidos o las de ionización
por termonebulización.
Debido a que péptidos y proteínas pertenecen al
grupo de moléculas no volátiles y térmicamente
inestables, el método habitualmente utilizado en
proteómica es la ionización por desorción, sobre
todo mediante ionización ESI y MALDI. Ambos tipos
de ionización se consideran «blandas» o «suaves»
debido a que preservan intactas las moléculas, sin
causar fragmentación incontrolada de las mismas.
Ionización por electroespray
En la ionización por electroespray (ESI, electrospray
ionization) la muestra es transportada en disolu-
ción por una fase móvil e introducida en la fuente
de ionización mediante una bomba inyectora o un
sistema de cromatogra�ía líquida. Las velocidades
del �lujo suelen ser variables, dependiendo de la
con�iguración adoptada, estando los valores más
habituales en el rango 150-500 nL×min-1 (con�i-
guración nano) o 10-300 μL×min-1 (con�iguración
micro) La fase móvil, conteniendo el analito disuel-
to, pasa a través de un capilar metálico de acero
inoxidable o de cuarzo sílice con un revestimiento
metálico al que se le aplica una elevada diferencia
de potencial, habitualmente de 2.5 a 5 kV. Esto fuer-
za la nebulización de las gotas cargadas en el capilar,
con una carga super�icial de la misma polaridad que
el propio capilar, formando una nube o espray que
se orienta hacia la entrada del analizador (MS). Con

la ayuda de una elevada temperatura (150-250 ºC)
en la fuente ESI y de un �lujo de gas inerte (nitró-
geno) enfrentado al espray, las gotas que forman
el mismo reducen su tamaño de manera constante,
por evaporación del solvente (desolvatación). Esto
origina un incremento de la densidad de carga su-
per�icial conforme disminuye el radio de las gotas,
hasta llegar a un punto crítico en el cual es cinéti-
ca y energéticamente posible el paso a fase gaseosa
de los iones cargados transportados por la fase mó-
vil (Figura 2.20).
Esta técnica tiende a generar iones con múl-
tiples cargas del tipo [M+nH]n+ dependiendo del
número de residuos ionizables, lo que permite
que compuestos de peso molecular muy alto que-
den registrados con cargas múltiples en un rango
m/z mucho menor. Se pueden determinar masas
moleculares de macromoléculas con una gran
precisión (± 0.005%). La ESI constituye la mejor
interfaz para el acoplamiento en línea de la MS con
la cromatogra�ía de líquidos (LC) o la electrofore-
sis capilar (EC).
En proteómica se suele utilizar la ionización
por nanoelectroespray (nanoESI), versión miniatu-
rizada del sistema de ionización por electroespray
convencional que permite operar a �lujos más ba-
jos (rango típico: 150 nL×min-1 a 1 μL×min-1). Esta
variante utiliza un capilar con un recubrimien-
to metálico y con diámetros muy inferiores a los
Figura 2.20: Esquema de la ionización por electroespray. Representación esquemática del proceso de ionización y nebulización en la
fuente ESI. Figura adaptada de LamondLab.
61
Análisis de proteínas
utilizados en ionización ESI; asimismo, el voltaje
aplicado para la ionización es inferior (1-2 kV). La
gran ventaja de la ionización nanoESI es que la des-
orción-ionización es mucho más e�iciente, lo que
incrementa la sensibilidad en varios órdenes de
magnitud.
Ionización por desorción con láser
La ionización por desorción con láser (LDI, laser
desortion/ionization) es un modo de ionización di-
recto que permite obtener iones cargados en estado
gaseoso utilizando radiación láser. Los dos proble-
mas principales asociados a esta técnica son: la
di�icultad de controlar la cantidad de energía trans-
ferida pudiendo provocar una degradación de la
muestra por un exceso de calentamiento, y el hecho
de que algunos compuestos no son capaces de ab-
sorber a la longitud de onda del láser, impidiendo
su ionización.
Para solventar estos problemas se desarrolló
la ionización MALDI (matrix-assisted laser desorp-
tion ionization), en la que la absorción de la energía
asociada a la radiación del láser está controlada y
asistida por una matriz que absorbe la radiación y
favorece la ionización sin que se produzca la frag-
mentación del analito. Normalmente la matriz está
formada por un ácido aromático de bajo peso mo-
lecular como el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico
Métodos en biociencias
Figura 2.21: Representación esquemática del proceso de ionización asistido por matriz. El tiempo tardado en recorrer el tubo del anali-
zador (tiempo de vuelo) dependerá de la masa de la molécula.
(para péptidos) o el ácido sinapínico (para pro-
teínas), que se mezcla con una disolución de la
muestra en mayor proporción (10.000:1). La mez-
cla se deposita sobre una placa metálica de acero
inoxidable. Tras la evaporación del disolvente, la
mezcla muestra-matriz forma unos microcristales
que a continuación se irradian durante algunos na-
nosegundos con un haz láser de elevada potencia y
de pulsos cortos. La matriz absorbe gran cantidad
de energía del láser y la trans�iere de forma con-
trolada a las moléculas de analito, permitiendo la
desorción de las moléculas que pasan a la fase ga-
seosa como iones intactos (Figura 2.21).
Una de las principales ventajas de esta técnica
es que el proceso de ionización genera principal-
mente iones con una sola carga (M+H)+. El sistema
MALDI se suele utilizar con un analizador de tiem-
po de vuelo (TOF, time of �light), y los equipos que
utilizan esta combinación particular se denominan
espectrómetros de masas MALDI-TOF.
Otra variante de LDI es la ionización/desor-
ción con láser inducida en super�icie (SELDI, surface
enhanced laser desorption ionization). La diferencia
principal con respecto a la ionización MALDI está
en que la muestra se añade sobre unos pocillos si-
tuados en un chip en los que se ha dispuesto una
fase sólida activa que puede presentar diferentes
selectividades: adsorción, reparto, interacciones
electrostáticas o a�inidad; entre estos últimos pue-
den inmovilizarse anticuerpos, receptores de DNA
u otras moléculas con a�inidad para determinadas
proteínas o péptidos. Posteriormente la super�i-
cie sólida se cubre con la matriz (habitualmente
62
ácido sinapínico) y se somete a un proceso de des-
orción-ionización semejante a la ionización MALDI.
En general ambos tipos de LDI permiten el
análisis de péptidos, proteínas y otras biomoléculas
cuyas masas pueden llegar en ocasiones a exceder
los 200 kDa, con una elevada sensibilidad (fentomo-
les–picomoles).
Analizadores de masa
La función de los analizadores de masa es separar
los iones de acuerdo a su relación m/z. Estos anali-
zadores pueden detectar diferencias de masa muy
pequeñas y permitir el paso de un número de iones
su�iciente que produzca en el detector una señal de-
tectable. Existen diversos tipos de analizadores de
masa siendo los más utilizados: sector magnético,
cuadrupolo, tiempo de vuelo y trampa iónica.
El analizador de sector magnético utiliza un
imán permanente o un electroimán para obligar a
que el haz de partículas cargadas procedente de la
fuente de iones se desplace con una trayectoria cir-
cular a través de un tubo metálico. La intensidad del
campo magnético se puede variar haciendo posible
la separación de los distintos iones en función de
su diferente energía cinética y su m/z (Figura 2.22).
El analizador de cuadrupolo o analizador Q
(Q, quadrupole) consta de cuatro barras cilíndri-
cas paralelas a las que se les aplican potenciales
opuestos y variables de corriente continua y de
radiofrecuencia (Figura 2.23). Esto induce un movi-
miento ondulatorio en el haz de iones que atraviesa
el analizador sincronizado en cada momento con el
 Análisis de proteínas

Figura 2.22: Esquema del analizador de sector magnético. Adaptada de Skoog (ver bibliogra�ía).

voltaje aplicado. Este analizador actúa como un �il-
tro de iones ya que solo aquellos que presenten una
determinada relación m/z oscilan de una manera
moderada y son capaces de atravesar completa-
mente el canal central del analizador hasta llegar al
detector. El resto de iones ve desestabilizada su tra-
yectoria lo su�iciente como para no poder atravesar
el analizador hasta llegar al detector.
En los analizadores de masas TOF los iones se
producen de manera periódica mediante el bombar-

Figura 2.23: Esquema del analizador cuadrupolo. Adaptada de Skoog (ver biblio-
gra�ía).

63
Métodos en biociencias
deo de la muestra con pulsos cortos de electrones,
iones secundarios o fotones generados mediante
láser. Los iones así formados se aceleran median-
te un pulso de campo eléctrico y pasan a un tubo
analizador que no está sometido a ningún campo
(eléctrico o magnético), con una longitud de entre
1 y 2 m. A igualdad de carga, la velocidad que pre-
sentan los iones dentro del tubo dependerá de su
masa, llegando antes («tiempo de vuelo») al detec-
tor los iones más ligeros (Figura 2.21). Muchos de
estos analizadores incorporan un sistema de espe-
jos electrostáticos tipo «re�lectrón» que permiten
aumentar la resolución y mejorar la separación de
los haces de iones.
El analizador de trampa iónica (IT, ion trap)
consta de una cavidad central, formada por tres
electrodos: uno anular y dos electrodos colectores
(de entrada y salida de los iones), donde los iones
procedentes de la fuente se concentran, quedando
atrapados. Este espacio central está sometido a un
campo magnético y/o a un campo eléctrico tridi-
mensional que varía dependiendo de los diferentes
voltajes y radiofrecuencias aplicados. Dependiendo
de la m/z de los iones con�inados y del campo apli-
cado estos iones circularán en órbitas estables o
inestables, siendo expulsados mediante cambios
graduales en los potenciales en la dirección axial del
detector en orden creciente de m/z.
Los analizadores IT se caracterizan por tener
una elevada sensibilidad pero una resolución limi-
tada y una capacidad relativamente baja de atrapar
iones. Para minimizar estas limitaciones se han
Figura 2.24: Esquema del analizador de trampa iónica.
64
desarrollado los analizadores de trampa de iones li-
neal (LIT).
En los últimos años, se ha comercializado un
nuevo tipo de analizador denominado Orbitrap.
Está basado en un principio �ísico nuevo: la se-
paración de los iones en un campo electrostático
oscilante equilibrado con fuerzas centrífugas. Este
instrumento presenta unas prestaciones simila-
res a los espectrómetros de masas de resonancia
ciclotrónica de iones con transformada de Fourier
(FT-ICR, Fourier transform ion cyclotron resonance)
en términos de resolución y exactitud de la masa,
pero sin necesidad de incorporar un magneto su-
perconductor de elevado coste.
Estos analizadores de masas pueden emplear-
se tanto de manera individual como en tándem
(MS/MS). Aunque son posibles las más variadas
combinaciones de fuentes de ionización y de ana-
lizadores de masas, la fuente de ionización MALDI
se suele acoplar a un analizador tipo TOF o TOF/
TOF mientras que la ionización ESI normalmente se
combina con analizadores tipo Q, IT o instrumentos
híbridos cuadrupolo-trampa iónica (Q-IT), cuadru-
polo-tiempo de vuelo (Q-TOF) y triple cuadrupolo
(QQQ).
Detectores
Estos dispositivos transforman el impacto elec-
trónico de los iones procedentes del analizador
de masas en una señal eléctrica proporcional a la
abundancia de cada ión con una relación m/z espe-
cí�ica. Esta señal puede ser procesada, almacenada

y mostrada de diferentes maneras con la ayuda de
equipos informáticos y de tratamiento de datos. Los
más habituales son los canales multiplicadores de
electrones, la copa de Faraday y los detectores tipo
centelleo.
Los actuales espectrómetros de masas pueden
detectar de manera rutinaria cantidades del orden
de femtomoles (10-15 mol) o incluso de attomoles
(10-18 mol) de péptido, llegando a alcanzar resolu-
ciones superiores a 1.000.000, en el caso del equipo
de FT-ICR más exacto. Esto signi�ica que estos equi-
pos son capaces de distinguir una diferencia en la
relación m/z de entre 1.000,001 Da y 1.000,000 Da.
Espectrometría de masas en tándem MS/MS
La espectrometría de masas en tándem MS/MS se
basa en el acoplamiento en serie de dos o más anali-
zadores de masas para llevar a cabo múltiples pasos
de análisis. Lo más habitual es que uno de los pasos
de análisis implique el aislamiento selectivo de uno
o varios de los iones detectados, seguido de su frag-
mentación o rotura controlada y del análisis de las
relaciones m/z de los fragmentos resultantes. Estos
analizadores pueden estar acoplados en el tiempo o
en el espacio.
Los analizadores acoplados en el tiempo uti-
lizan los iones atrapados en una misma cámara
o espacio �ísico para realizar múltiples etapas de
análisis a lo largo del tiempo. Este tipo de proce-
sos se pueden llevar a cabo con analizadores tipo
IT, FT-ICR u Orbitrap. Los analizadores acoplados
en el espacio están físicamente separados, pero
estrechamente conectados entre sí por un espacio
donde se produce la fragmentación de las molé-
culas. Este tipo de con�iguraciones se observa en
instrumentos como el Q-TOF, TOF-TOF, o QQQ, en-
tre otros.
Entre los métodos de fragmentación que exis-
ten el más utilizado en proteómica es el denominado
de disociación inducida por colisión (CID, collision
induced dissociation). En este método el primer
analizador sirve para generar el espectro de masas
correspondiente a los iones presentes en la mues-
tra y los generados en el sistema de ionización, y
para seleccionar una serie de «iones determinados»
que presentan ciertos requerimientos en lo que
a intensidad y carga se re�iere. De todos los iones,
el analizador va seleccionando secuencialmente el
ión correspondiente a un valor de m/z dado, que se
denomina «ion precursor». Seguidamente este es
acelerado por un potencial eléctrico para incremen-
tar su energía cinética. Al entrar el ión acelerado en
la cámara de colisión choca con las moléculas de un
65
Análisis de proteínas
gas inerte (helio, nitrógeno o argón) presentes en
aquella. En la colisión, parte de la energía cinética
se transforma en energía interna formándose pe-
queños fragmentos característicos denominados
«iones producto». Estos entran en el segundo ana-
lizador de masas donde son separados y detectados
en base a su relación m/z, generando un nuevo
espectro de masas llamado espectro de fragmen-
tación. Este proceso se repite para cada uno de los
«iones determinados» detectados en el primer ana-
lizador (Figura 2.25a).
Al igual que otras moléculas orgánicas, los
péptidos se pueden fragmentar por múltiples sitios
por lo que se ha creado una nomenclatura especí-
�ica para indicar el tipo de fragmentos generados
(Figura 2.25b). En el caso de la fragmentación que
tiene lugar a nivel de enlace peptídico se generan
principalmente dos tipos de iones cargados posi-
tivamente, denominados serie «b» y serie «y». Los
iones tipo «b» son aquellos que contienen el extre-
mo amino del péptido, mientras que los iones tipo
«y» contienen el extremo carboxilo.
Los espectros de fragmentación MS/MS
(Figura 2.25c) proporcionan información sobre la
identidad y posición de los aminoácidos en el pép-
tido. Por tanto es posible determinar la secuencia
completa del péptido si el espectro de fragmenta-
ción es de buena calidad; en otras ocasiones solo
se obtiene una secuenciación parcial del péptido.
Sin embargo, en ocasiones incluso esta informa-
ción parcial, acompañada por la masa del péptido,
es su�iciente para identi�icar la proteína mediante
búsqueda en bases de datos.
2.4.2. Aspectos metodológicos
Habitualmente, en proteómica, se utilizan dos estrate-
gias distintas para la identi�icación y caracterización
de las proteínas presentes en una muestra: los mé-
todos «bottom-up», o de abajo hacia arriba; y los
métodos «top-down», o de arriba hacia abajo.
Métodos «bottom-up» o de abajo hacia arriba
Estos métodos se basan en la información obteni-
da a nivel de péptido, bien de masa y/o secuencia,
para identi�icar una proteína. Esta metodología está
muy consolidada y se utiliza de forma habitual, es-
pecialmente en investigación. Se puede aplicar a
proteínas puri�icadas o mezclas de proteínas. Su
principal limitación es que solo permite identi�i-
car un porcentaje más o menos alto del total de los
péptidos de una proteína, alcanzándose raramente
Métodos en biociencias

Figura 2.25: Flujo de trabajo «product ion scanning», espectros MS/MS y series de fragmentación. En el �lujo tándem MS/MS, el primer
analizador sirve para generar el espectro de masas correspondiente a los iones presentes en la muestra y seleccionar el «ión precursor».
Seguidamente este ión es acelerado por un potencial eléctrico para incrementar su energía cinética y entra en la cámara de colisión, don-
de choca con las moléculas de un gas inerte. En la colisión se forman pequeños fragmentos característicos denominados «iones producto»,
que entran en el segundo analizador de masas donde son separados y detectados en base a su relación m/z (A). Se genera así un nuevo es-
pectro de masas, llamado espectro de fragmentación (C). Nomenclatura de fragmentación de péptidos (B).

porcentajes cercanos al 90-100% de cobertura de proteínas aisladas, se digiere enzimáticamente con

secuencia.
Como se describe en el apartado de «prepara-
ción de la muestra» (epígrafe 2.2), estos métodos
requieren la digestión o proteólisis controlada de
las proteínas de la muestra, habitualmente median-
te enzimas proteolíticas altamente especí�icas; por
ejemplo, tripsina. Los péptidos resultantes tras la
digestión son separados y analizados por espectro-
metría de masas en tándem MS/MS.
Huella peptídica
Si las proteínas han sido separadas previamente en
un gel de poliacrilamida, en formato mono o bidi-
mensional, es posible identi�icarlas a partir de su
huella peptídica (PMF, peptide mass �ingerprinting)
obtenida por espectrometría de masas MALDI-TOF
(Figura 2.26). En este proceso la banda o mancha
(spot) de gel, que idealmente contiene una o pocas
una proteasa especí�ica para obtener una mezcla de
péptidos que a continuación es analizada en el es-
pectrómetro de masas. El resultado es un espectro
de masas que es característico de la proteína estu-
diada, y en el que los valores m/z obtenidos para
cada péptido son utilizados para realizar una bús-
queda frente a las bases de datos de proteínas y así
obtener su identi�icación.
Frecuentemente, el espectro de masas así
obtenido (huella peptídica) no es su�iciente para
obtener una identi�icación �iable o estadísticamen-
te signi�icativa, por lo que es necesario utilizar un
espectrómetro de masas en tándem MALDI-TOF/
TOF, que además de obtener la huella peptídica, es
capaz de fragmentar algunos de los péptidos o io-
nes precursores más intensos proporcionando de
manera directa su secuencia. La combinación de la
información presente en el espectro PMF y en los
espectros de fragmentación MS/MS permite identi-
�icar de manera inequívoca a la proteína.

66

Figura 2.26: Flujo de trabajo empleado para obtener la huella peptídica (PMF).
Cromatografía líquida acoplada a espectrometría
de masas
Para separar e identi�icar mezclas complejas de pro-
teínas es habitual recurrir a la separación mediante
cromatogra�ía líquida acoplada a la espectrometría
de masas (LC-MS) o masas en tándem LC-MS/MS.
La combinación de cromatogra�ía líquida
(LC, liquid chromatography) y espectrometría MS/
MS permite la identi�icación de las proteínas que
componen un proteoma complejo, aumentando la
profundidad del análisis y el rango dinámico y pre-
cisión en las cuanti�icaciones realizadas respecto a
los resultados obtenidos cuando se utilizan técnicas
de MS unidimensional, por ejemplo PMF.
Típicamente, en este tipo de aproximaciones,
una mezcla compleja de proteínas se digiere con
tripsina u otra proteasa y la mezcla de péptidos
obtenida se fracciona mediante HPLC antes de ser
analizada en el espectrómetro de masas en tándem.
Estos dos sistemas suelen estar conectados en línea
de manera que la muestra fraccionada que eluye
del capilar del HPLC entra directamente en la fuen-
te de ionización ESI. El espectrómetro de masas en
tándem (MS/MS) adquiere el espectro de masas co-
rrespondiente a la mezcla de péptidos que eluye en
un momento dado, seleccionándose a continuación,
y normalmente de manera automática, algunos can-
didatos para su fragmentación. Se genera así una
colección de espectros de fragmentación (o espec-
67
Análisis de proteínas
tros MS/MS); esta colección de espectros MS/MS
así obtenida es utilizada para identi�icar a las pro-
teínas presentes en la mezcla.
Herramientas bioinformáticas
para la identificación de proteínas
La identi�icación de proteínas a partir de la huella
peptídica (PMF) obtenida por MS y/o los espectros
de fragmentación son las aproximaciones basadas
en espectrometría de masas más utilizadas para la
identi�icación de proteínas. Actualmente es posible
obtener cientos o miles de espectros de masas en
lapsos de tiempo relativamente cortos cuya inter-
pretación manual no es una opción viable. Por ello,
se han desarrollado un gran número de aplicaciones
y herramientas bioinformáticas, denominadas gené-
ricamente «motores de búsqueda», que asisten en la
identi�icación de proteínas y permiten la interpreta-
ción automatizada de los espectros MS y MS/MS.
En el mercado están disponibles diversos mo-
tores de búsqueda, unos de código libre y otros de
pago, que pueden utilizarse para la interpretación
de los espectros de masas, como: Mascot, Sequest,
Paragon, X!Tandem, etc., los cuales trabajan con dis-
tintos repositorios públicos de bases de datos de
proteínas como Uniprot/SwissProt o el NCBI.
Todas estas herramientas comparan el va-
lor m/z experimental de cada péptido (PMF) o de
Métodos en biociencias
los iones producto (MS/MS) del espectro de masas
con los valores m/z teóricos calculados mediante el
procesado in-silico de las proteínas contenidas en
las bases de datos. Todos estos programas asignan
una puntuación, valor probabilístico o score esta-
dístico, que indica el grado de correlación existente
entre los valores experimentales y los teóricos.
A la hora de asignar un score a la identi�ica-
ción realizada mediante esta comparación se tienen
en cuenta diversos factores, entre los que se in-
cluye la precisión con la que se corresponden los
valores experimentales a los teóricos, la intensi-
dad de estos picos, la presencia de aminoácidos
modi�icados, la aparición de errores o puntos de
corte obviados o inespecí�icos durante la digestión
proteica, la exactitud de la calibración del instru-
mento y otros parámetros. Debido a las diferencias
existentes entre los algoritmos de búsqueda, los re-
sultados obtenidos pueden diferir ligeramente (son
complementarios) haciendo aconsejable validar los
resultados obtenidos mediante distintos algoritmos
y/o usar métodos estadísticos que estimen la vali-
dez o signi�icado de las identi�icaciones realizadas.
Si no hay posibilidad de acceder al genoma
del organismo que se desea estudiar, el análisis me-
diante secuenciación de novo de los espectros de
fragmentación permite la identi�icación de pépti-
dos cuya secuencia exacta no está́ disponible en las
bases de datos.
Métodos «top-down» o de arriba hacia abajo
Por contraposición a la arriba mencionada es-
trategia «bottom-up», en el caso de la estrategia
experimental «top-down» el análisis de MS se efec-
túa sobre la proteína intacta, sin la etapa previa de
digestión proteolítica y, por tanto, su fragmenta-
ción se realiza en el espectrómetro de masas. Esta
técnica permite la identi�icación y caracterización
de modi�icaciones postraduccionales en proteí-
nas altamente puri�icadas y generalmente de bajo
peso molecular así como la determinación de la
masa molecular de una proteína intacta con una
exactitud de ± 2 Da. La identidad de la proteína
puede ser posteriormente con�irmada mediante
la obtención de un espectro MS/MS formado por
iones de los fragmentos obtenidos a partir de la
proteína intacta. Para estos análisis se requiere
un espectrómetro de masas de gran exactitud de
masa y alta resolución.
En MS/MS la cámara de fragmentación CID
es ine�iciente para proteínas de alto peso molecu-
lar, siendo di�ícil determinar los iones producidos
68
cuando se desconocen simultáneamente la carga
y la masa, especialmente en el caso de iones con
múltiples cargas. Los estudios top-down requieren
instrumentación del tipo ESI-FT-ICR con excitación
mediante ECD (electron capture dissociation) y ETD
(electron transfer dissociation). Este tipo de tecno-
logía proporciona unas medidas exactas de masa
combinada con alta resolución y, simultáneamente,
preservando las modi�icaciones postraduccionales.
También se ha descrito el uso de espectrómetros
con analizador Orbitrap, con prestaciones similares.
Aunque se ha documentado el análisis de proteínas
con pesos moleculares que superan los 50.000 Da,
el análisis en línea resulta aún bastante complica-
do debido a la baja e�iciencia de ECD y ETD y a la
pobre capacidad de fraccionamiento a nivel de pro-
teína de muestras complejas. Adicionalmente, la
instrumentación es muy cara y son necesarios pa-
sos adicionales en el desarrollo de la bioinformática
asociada para que la metodología top-down pueda
generalizarse.
2.5. Técnicas de cuantificación
de proteínas
El análisis cuantitativo a gran escala de proteomas
constituye uno de los retos más importantes de la
«proteómica de expresión diferencial». La determi-
nación de los niveles de expresión de las proteínas,
en diferentes tipos celulares y condiciones �isioló-
gicas, es un paso esencial para la comprensión de
los mecanismos implicados en la función celular, y
es fundamental en el desarrollo de campos como la
biología de sistemas.
En los estudios de proteómica cuantitativa se
puede distinguir entre cuanti�icación absoluta y
cuanti�icación relativa, siendo normalmente esta
última la opción más utilizada. En la cuanti�icación
relativa, la abundancia relativa de las proteínas se
estima por comparación entre las distintas condi-
ciones experimentales estudiadas. Sin embargo,
también es posible determinar cantidades absolutas
de proteínas mediante la utilización de concen-
traciones conocidas de un estándar de péptidos o
proteínas, habitualmente marcados con isótopos
estables (13C, 15N). Este formato «pesado» permite
añadir directamente los péptidos estándar sobre la
muestra que se quiere estudiar y comparar la señal
obtenida frente a los péptidos endógenos o «lige-
ros». Los métodos de cuanti�icación relativa usados
en los estudios de proteómica pueden ser dividi-
dos en dos categorías: cuanti�icaciones basadas en
la electroforesis y cuanti�icaciones basadas en MS.

Cuadro 2.2: Características de las técnicas de tinción. Las proteínas separadas en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (tanto SDS-
PAGE o 2D-PAGE), pueden ser teñidas para su cuanti�icación. En este cuadro se resumen las principales características de los métodos de
tinción más utilizados.
Método Detección Tinción
Coomassie Colorimetría Después electroforesis
Plata Colorimetría Después electroforesis
SYPRO Ruby Fluorescencia Después electroforesis
CyDyes Fluorescencia Antes electroforesis
2.5.1. Cuantificación de proteínas basada
en la electroforesis
Las cuanti�icaciones basadas en la electroforesis se
fundamentan en las diferentes densidades ópticas
e intensidades de tinción de proteínas fraccionadas
y separadas empleando geles de electroforesis en
diferentes formatos. En proteómica, debido al am-
plio uso de la electroforesis en gel de poliacrilamida
en formato bidimensional (2D-PAGE), se han de-
sarrollado un gran número de métodos de tinción
y marcaje de proteínas para detectar y cuanti�icar
cantidades relativas de proteínas.
Actualmente, las más utilizadas son las tincio-
nes que emplean marcadores �luorescentes. Entre
sus ventajas destacan la alta sensibilidad (similar
a la tinción de plata), amplio rango dinámico li-
neal, facilidad de uso, compatibilidad con MS y alta
reproducibilidad, mostrándose superiores a méto-
dos colorimétricos convencionales como el azul de
Coomassie o el nitrato de plata (Cuadro 2.2).
Las proteínas se marcan con la señal �luores-
cente, bien antes o después de la electroforesis, y se
detectan tras ser excitadas mediante el uso de luz
ultravioleta o láser con la longitud de onda adecua-
da. Las dos más empleadas son:
— La tinción de SYPRO Ruby. La tinción de las
proteínas tiene lugar una vez �inalizada
la separación de las proteínas median-
te electroforesis. Este tipo de tinción está
basada en compuestos organometálicos
capaces de quelar rutenio y que se unen a
los aminoácidos de tipo básico presentes
en las proteínas.
— La tinción con �luorocromos derivados
de la cianina o «CyDyes», utilizados en
el método conocido como electrofore-
sis bidimensional diferencial (2D-DIGE,
2D-difference gel electrophoresis).
69
Análisis de proteínas
Límite de Rango diná- Muestras
Compatible MS
detección mico por gel
8-10 ng ++ 1 ++
~ 1 ng + 1 (+)
~ 1 ng ++++ 1 +++
~ 2 ng ++++ 3 ++
La tinción con �luorocromos «CyDyes» se efectúa
previamente a la separación electroforética de las
proteínas. Se pueden utilizar hasta 3 �luorocromos
distintos, denominados Cy2, Cy3 y Cy5, que por-
tan un grupo éster reactivo que les permite unirse
covalentemente al grupo ε-amino de las lisinas pre-
sentes en las proteínas.
Electroforesis bidimensional diferencial
(2D-DIGE)
Esta técnica permite, por tanto, analizar simultánea-
mente tres muestras (Figura 2.27). Habitualmente
una de estas muestras suele ser un estándar in-
terno constituido por cantidades equimolares de
todas las muestras que se quieren comparar. El es-
tándar interno suele marcarse con el �luorocromo
Cy2 y proporciona un patrón con el que comparar
la intensidad del marcaje de las proteínas presentes
en las distintas muestras (y en los distintos geles).
Tras el marcaje, dos de las muestras a analizar y
el estándar interno son combinadas y sometidas a
electroforesis 2D-PAGE utilizando el mismo gel bidi-
mensional. La gran ventaja de esta aproximación es
que, al utilizar un mismo gel para separar diferentes
muestras, las variaciones artefactuales observadas
cuando se corren muestras similares en diferentes
geles (aproximación clásica) disminuyen drástica-
mente. Gracias a las distintas longitudes de onda
de excitación y emisión que presentan los CyDyes
se puede adquirir un mapa proteico bidimensional
único para cada muestra. Para esto se emplea un es-
cáner de �luorescencia que, simultáneamente, lleva
a cabo la excitación de cada �luorocromo y realiza la
captura de la imagen resultante tras la emisión de la
�luorescencia inducida.
De cada gel se obtienen, por tanto, tres imá-
genes: la derivada de la señal Cy2 para el estándar
interno y las derivadas de las señales Cy3 y Cy5
Métodos en biociencias

Figura 2.27: Flujo de trabajo utilizado en 2D-DIGE. Tras el marcaje, dos de las muestras a analizar y el estándar inter-
no son combinados y sometidos a electroforesis 2D-PAGE utilizando el mismo gel bidimensional. Gracias a las distintas
longitudes de onda de excitación y emisión que presentan los CyDyes se puede adquirir un mapa proteico bidimensio-
nal único para cada muestra.

para las muestras individuales analizadas. El están-
dar interno presente en cada gel permite realizar el
análisis de correlación (superposición) de spots en-
tre los distintos geles. En función de la intensidad
de la tinción de cada spot se determinan las abun-
dancias o ratios relativos de los spots individuales
frente a la de sus estándares internos. Esto permite
comparar de manera precisa la abundancia proteica
entre las muestras presentes en los diferentes ge-
les. El resultado �inal del análisis de imagen es una
lista de spots correspondientes a proteínas diferen-
cialmente expresadas en las distintas muestras. Los
spots de interés se extraen del gel para su digestión
enzimática y posterior identi�icación por MS.
El principal inconveniente de esta técnica
viene dado por el alto coste de adquisición de los
marcadores, del escáner necesario para la detección
y del paquete informático asociado (DeCyderTM) con
el que se realiza el análisis de imagen.
2.5.2. Cuantificación de proteínas basada
en la MS
La medida de la abundancia de péptidos y proteí-
nas en mezclas biológicas complejas no es una tarea
fácil, ya que la espectrometría de masas per se no
es una técnica cuantitativa. Esto se debe a que dis-
tintos péptidos presentan distintas propiedades
�ísico-químicas que afectan a su fraccionamiento,
así como a su capacidad de ionización y volatiliza-
ción durante el análisis de MS.
Los procedimientos para el análisis cuantita-
tivo de proteomas por MS pueden dividirse en dos
grandes grupos en función de si son utilizados o no
isótopos estables.
Cuantificación de proteínas por MS con isótopos
estables
Estas técnicas utilizan algún tipo de marcaje isotó-
pico diferencial de los componentes presentes en
muestras diferentes que posteriormente permite su
cuanti�icación relativa en un único análisis LC-MS/MS.
En el caso del llamado marcaje isotópico no
isobárico, una de las muestras se marca con un com-
puesto en su versión ligera, mientras que la otra
se marca con la versión pesada correspondiente.
Ambos compuestos son idénticos en todas sus pro-
piedades �ísico-químicas excepto en la diferencia de
masa asociada a la presencia de isótopos pesados
o ligeros de determinados elementos constituyen-
tes (13C, 15N). Los péptidos así marcados producen,
en el análisis de MS, parejas de picos con una dife-
rencia de masa característica a la de los isótopos

70

Figura 2.28: Principales vías de incorporación isotópica utilizadas en proteómica cuantitativa basada en MS.
usados. La abundancia relativa de los péptidos pue-
de medirse por comparación de las intensidades o
áreas descritas de estos picos. Por tanto, la cuanti-
�icación se lleva a cabo a nivel de los espectros de
masas (MS1). Alternativamente, los péptidos pue-
den marcarse mediante marcadores isobáricos, en
cuyo caso, los péptidos marcados tendrán la misma
masa tras su marcaje pero, tras su fragmentación
CID, estos marcadores producen iones producto
distinguibles a nivel de los espectros MS/MS (MS2)
que pueden ser usados para la cuanti�icación.
Las técnicas de marcaje (ICPL, ICAT o SILAC),
cuya cuanti�icación tiene lugar a nivel del espectro
MS1, permiten el análisis simultáneo de un número
limitado de muestras (generalmente 2 o 4); mien-
tras que las técnicas de marcaje isobárico (iTRAQ,
TMT) ofrecen un número mayor de posibles cana-
les de cuanti�icación (de 4 a 10 análisis simultáneos,
dependiendo del reactivo).
Dependiendo de la vía de incorporación del
marcaje isotópico (Figura 2.28) se pueden distin-
71
Análisis de proteínas
guir: marcaje metabólico a nivel del cultivo celular
(por ejemplo SILAC); marcaje a nivel de la digestión
enzimática (por ejemplo el marcaje 16O/18O); o mar-
caje a nivel de péptido por derivatización química
(por ejemplo ICPL, iTRAQ o TMT).
Marcaje metabólico con isótopos estables
En la estrategia SILAC (stable isotope labeling by
amino acids in cell culture) las dos líneas celulares
(A y B) cuyos proteomas se quieren comparar se cul-
tivan bien en medios normales o enriquecidos con
aminoácidos «pesados», marcados con isótopos es-
tables (Figura 2.29). Tras varias divisiones celulares
(normalmente entre 8-10), los isótopos distintivos
se habrán incorporado prácticamente en el 100%
de las proteínas celulares y, una vez extraídas, pue-
den ser combinadas, digeridas enzimáticamente y
analizadas como una sola muestra. El hecho de po-
der combinar las muestras en un estadio temprano
del análisis experimental causa una mejora sustan-
Métodos en biociencias
Figura 2.29.: Esquema del marcaje metabólico SILAC.
cial en la precisión de la cuanti�icación realizada, al
reducir la variabilidad artefactual que resultaría del
tratamiento de las muestras por separado.
Los aminoácidos pesados pueden contener
los isótopos estables 2H, 13C o 15N, siendo frecuen-
temente utilizados 2H-Leu, 13C-Lys y 13C/15N-Arg.
La incorporación de estos aminoácidos proporcio-
na un incremento conocido en la masa del péptido
frente a la versión ligera: 6 Da en el caso de usar
13
C6-Lys, por ejemplo. En el análisis por MS cada
péptido aparece como un doblete en el espectro de
masas, correspondiendo el de menor masa (péptido
ligero) a la población A, mientras que el de mayor
masa (pesado) corresponde a la población B. Al ser
ambos péptidos químicamente idénticos, di�irien-
do únicamente en la masa, se comportan de forma
igual en todos los pasos del proceso analítico, in-
cluyendo la etapa de separación cromatográ�ica.
Por tanto, ambos péptidos eluirán y serán analiza-
dos por el espectrómetro simultáneamente. De esta
manera se pueden relacionar directamente las in-
tensidades de pico observadas en el espectro con
las abundancias relativas de las proteínas a las cua-
les pertenecen dichos péptidos en las poblaciones
celulares originales.
Sus principales limitaciones radican en el ele-
vado coste de los aminoácidos pesados y a que, en
la práctica, su aplicabilidad se reduce a estudios de
muestras provenientes de células en cultivo, siendo
imposible el análisis de proteínas procedentes de
fluidos corporales o tejidos celulares.
Marcaje químico con isótopos estables
El marcaje químico de proteínas o péptidos se puede
realizar con distintos marcadores isotópicos co-
merciales que presentan distintas especi�icidades.
Estos reactivos pueden reaccionan con: el grupo
amino (-NH2) presente en el extremo N-terminal
de las cadenas polipeptídicas y de la cadena lateral
de las lisinas, con el grupo sul�hidrilo (-SH) de las
72
cisteínas, o también tienen a�inidad por los grupos
carboxílicos (-COOH), entre otros.
Entre todos los reactivos disponibles existe
una predilección por las técnicas de marcaje con
reactivos isobáricos. Esta estrategia de marcaje
supone un gran avance ya que el marcaje se suele
realizar a nivel de péptido, la e�iciencia de marcaje
es muy alta (casi del 100%) y tanto la identi�icación
como la cuanti�icación se efectúan a partir de los
espectros MS/MS. Además esta metodología per-
mite comparar simultáneamente un mayor número
de muestras (de 4 a 10, dependiendo del reactivo).
De todos los reactivos isobáricos en el mercado,
los dos más empleados son el reactivo iTRAQ (is-
obaric tags for relative and absolute quanti�ication,
de Sciex); y el reactivo TMT (tandem mass tags, de
Thermo Fisher Scienti�ic). Ambos se basan en el
mismo principio y químicamente son muy simila-
res, por lo que solo se tratará en este capítulo el
reactivo iTRAQ.
El reactivo de marcaje iTRAQ existe en dos ver-
siones: 4-plex y 8-plex, para el marcaje simultáneo
de 4 y 8 muestras, respectivamente. Este marcaje
emplea moléculas isobáricas (de igual masa no-
minal) constituidas por tres partes funcionales
denominadas: grupo reactivo, grupo de balanceo y
grupo reportero (Figura 2.30).
El grupo reactivo es un derivado de la
N-hidroxisuccimida y reacciona con el grupo ami-
no terminal de los péptidos y el ε-amino de la
cadena lateral de las lisinas. El grupo de balanceo
compensa las masas de los distintos reactivos, de
manera que la masa total de cada reactivo sea in-
variable. El grupo reportero es un derivado de la
N-metilpiperacina que no afecta ni a la carga ni a
la e�iciencia de ionización del péptido marcado.
Durante la fragmentación CID de estos péptidos, es-
tos grupos se liberan de los mismos y aparecen en
el espectro MS/MS con una relación m/z de 113.1-
121.1 Da (en la versión 8-plex) y de 114.1-117.1 Da
(en la 4-plex). A partir de su intensidad relativa se
 Análisis de proteínas

Figura 2.30: Estructura del reactivo iTRAQ en la versión 4-plex. El reactivo iTRAQ es un marcador
isobárico que presenta un grupo reportero, un grupo reactivo y una porción compensadora. El grupo
reportero presenta una relación m/z que varía de 114.1 a 117.1 Da en la 4-plex. Así, el grupo de ba-
lanceo compensa la diferencia que presentan entre sí los diferentes marcadores, por lo que su masa
va de 28-31 Da en la 4-plex. De esta manera, la masa de la región isobárica de todos los reactivos se
mantiene constante, siendo de 145 Da en la de cuatro.

estima la abundancia relativa de la proteína asocia-
da en las distintas muestras.
Dado que la suma de los pesos moleculares de
las tres partes de cada reactivo es constante, cuando
un mismo péptido es marcado en todas las muestras
y posteriormente estas se combinan, dicho pépti-
do es detectado como un pico único en el espectro
MS1. Sin embargo, como cada grupo reportero di�ie-
re en su peso molecular, los fragmentos originados a
partir de cada marcador tras la fragmentación se ob-
servan como picos distintos en el espectro MS/MS. A
partir de la intensidad de estos grupos reporteros,
se estima la abundancia relativa de los péptidos aso-
ciados a una proteína y, por ende, la abundancia de
esta en las distintas muestras.
En un experimento iTRAQ (Figura 2.31) están-
dar las diferentes muestras proteicas son digeridas
con tripsina y los péptidos resultantes en cada
caso se marcan por separado con los distintos re-
activos iTRAQ. Una vez marcadas, las muestras se
combinan y, opcionalmente, se fraccionan (por cro-
matogra�ía de intercambio catiónico o fase reversa
a pH básico, por ejemplo); las fracciones resultan-
tes se analizan por LC-MS/MS. El espectro MS/MS
se usa tanto para la identi�icación de las proteínas
presentes mediante la búsqueda en bases de da-
tos, como para el análisis cuantitativo relativo de las
mismas por comparación de las intensidades rela-
tivas de los iones reportero, que son detectables en
el rango bajo de m/z del espectro de fragmentación
de cada péptido.
La mayor di�icultad de los experimentos iTRAQ
radica en el manejo, almacenamiento y análisis de
las grandes cantidades de datos generados. Esto
hace necesario el desarrollo de programas informá-
ticos que realicen los cálculos de las abundancias
relativas de los péptidos marcados isotópicamente
y, a partir de ellas, de la abundancia relativa de las
proteínas de las que proceden.
Marcaje enzimático con isótopos estables
(marcaje 16O/18O)
En este caso, el marcaje con isótopos esta-
bles se realiza durante la digestión enzimática.
Habitualmente, en el caso de la digestión con tripsi-
na, se utiliza 18O, aunque también se puede utilizar
con otras proteasas. Típicamente, las proteínas ex-
traídas de dos condiciones distintas se digieren con
tripsina empleando un tampón que incluye «agua li-
gera», H216O, en un caso; y la forma pesada, H218O,
en el otro (Figura 2.32). Los átomos de 18O del agua
se trans�ieren al extremo carboxilo C-terminal de
los péptidos durante la reacción de digestión incre-
mentando su masa en 4 Da (2 Da por cada oxígeno).
Finalizada la digestión tríptica los péptidos de am-
bas muestras se combinan, fraccionan y analizan
por MS/MS tal como se hace con los péptidos mar-

73
Métodos en biociencias
Figura 2.31: Esquema de un experimento iTRAQ 4-plex estándar.
cados en experimentos SILAC o iTRAQ. Al igual que
en el marcaje SILAC, cada par de péptidos prove-
nientes de cada una de las muestras se detecta como
un doblete en el espectro MS1. Por tanto, la medida
de la intensidad relativa de los pares de péptidos in-
dica la abundancia de la proteína en las muestras.
Los inconvenientes de esta técnica radican
en que, al igual que en el marcaje SILAC, se dupli-
ca la complejidad de la muestra; es por tanto más
necesario que nunca un fraccionamiento metódico
de la misma. Adicionalmente, la reacción de incor-
poración del 18O durante la digestión no suele ser
completa en ocasiones, lo que complica la cuanti�i-
cación. Finalmente, la pequeña diferencia de masa
(4 Da) entre los péptidos ligeros y pesados obliga, al
menos para los pares de péptidos multicargados (3
y 4 cargas), a emplear instrumentación de alta re-
solución.
74
2.5.3. Cuantificación de proteínas por MS
sin marcaje («label-free»)
Se trata de una metodología muy utilizada actual-
mente debido a que no requiere ningún tipo de
marcaje y evita el elevado coste de los reactivos
y/o la síntesis de péptidos estándar marcados iso-
tópicamente. Permite determinar directamente la
abundancia de las proteínas a partir de la intensidad
de las señales iónicas de los péptidos de la muestra.
Al no haber modo de distinguir entre las muestras
que se desea comparar, estas han de ser analizadas
por LC-MS separada e independientemente.
Dentro de esta estrategia se han desarrolla-
do distintos métodos de cuanti�icación; uno de los
primeros fue el «recuento de espectros adquiridos»
(spectral counting), que se basa en la correlación
directa existente entre la frecuencia con la que el

Figura 2.32: Esquema de un experimento de marcaje enzimático 18O.
espectrómetro de masas en tándem MS/MS frag-
menta un ión y la abundancia de la proteína de la
que procede dicho ión. Cuanto mayor es la abundan-
cia de la proteína en la muestra, mayor es el número
de péptidos únicos fragmentados e identificados.
Sin embargo, dentro de este conjunto de métodos
tienen más predicamento otros métodos de cuanti-
�icación basados en el valor del área o intensidad de
los picos de los iones en el espectro de masas, asu-
miendo que la comparación de las áreas obtenidas
a partir de pares de péptidos equivalentes (misma
relación m/z y mismo tiempo de retención) equi-
vale a la abundancia relativa de ambos péptidos en
las muestras comparadas. Este conjunto de méto-
dos son conocidos genéricamente como métodos
label-free.
Las principales limitaciones de esta metodolo-
gía son tres: (i) el aumento del tiempo de análisis
al requerir analizar individualmente cada una de
las condiciones a comparar; (ii) es imprescindible
la utilización de equipos de cromatogra�ía líqui-
da que garanticen la máxima reproducibilidad en
la cromatogra�ía y la mínima variación posible en
los tiempos de retención de los péptidos entre las
distintas muestras, así como la disponibilidad de
equipos de espectrometría de masas de alta reso-
lución y exactitud de masa; y (iii) la necesidad de
herramientas bioinformáticas para estandarizar,
alinear y normalizar los resultados obtenidos.
75
Análisis de proteínas
Monitorización por reacción seleccionada
La metodología de cuanti�icación sin mar-
caje SRM (selected reaction monitoring) se
emplea principalmente como una estrategia de va-
lidación y cuanti�icación complementaria de las
proteínas de interés, o diferencialmente expre-
sadas, detectadas por cualquiera de las técnicas
de proteómica diferencial descritas anteriormen-
te («fase de descubrimiento»). Se caracteriza por
su elevada sensibilidad y su alta velocidad de pro-
cesamiento de muestras, lo que la hace ideal como
técnica de validación de biomarcadores.
Este método permite cuanti�icar una o unas
pocas proteínas de interés en distintas muestras
mediante (i) la selección –en el tiempo– de varios
iones precursores, que permiten inequívocamente
identi�icar dicha proteína (péptidos proteotípicos)
y (ii) la medida del área de diversos iones produc-
to característicos de dichos péptidos (transiciones),
elegidos preferentemente por su intensidad des-
tacada. Diferentes herramientas bioinformáticas
disponibles (por ejemplo Skyline, Universidad de
Washington) permiten determinar fácilmente los
péptidos proteotípicos y las transiciones más pro-
bables a partir de ellos. Típicamente se suelen
elegir tres péptidos proteotípicos por cada una de
las proteínas que se quiere estudiar, aunque este
número puede variar en función del número total
de proteínas y de las características del espectró-
metro de masas que se va a emplear. Mediante MS/
MS del precursor se con�irma la identi�icación de la
proteína y, a partir del área de las transiciones, se
estima la abundancia del péptido y, por consiguien-
te, de la proteína.
Desde un punto de vista instrumental, la SRM
requiere el empleo de espectrómetros de masas
QQQ, que combinan tres analizadores cuadrupo-
lo dispuestos en línea. En un experimento SRM
típico: Q1 transmite a Q2 una sola masa (m1), co-
rrespondiente al péptido proteotípico, Q2 actúa de
célula de colisión (CID) donde se optimiza la frag-
mentación del precursor para que se produzcan
fragmentos diagnóstico del mismo y Q3 se encarga
de transmitir solo algunos de dichos fragmentos
(m2 o m3). Dicho de otro modo, Q1 y Q3 actúan
como �iltros de masa, el primero a nivel de pépti-
do precursor y el segundo a nivel de fragmentos.
Así, seleccionando las transiciones más sensibles
(m1 a m2 y m1 a m3), se obtiene un valor de área
para cada una de ellas y, en función de su intensi-
dad relativa, se podrán cuanti�icar cambios a nivel
de abundancia proteica.
Métodos en biociencias
2.6. Interacción de proteínas
Las técnicas proteómicas también pueden aplicar-
se en el análisis de la interacción entre proteínas: el
llamado interactoma. En este sentido se han desa-
rrollado varias técnicas que permiten identi�icar y
caracterizar estas interacciones. Entre ellas se pue-
den destacar: las micromatrices de proteínas y la
captura por a�inidad.
2.6.1. Micromatrices de proteínas
También llamadas microarrays o chips de proteí-
nas debido a su similitud con las micromatrices
utilizadas para examinar la expresión génica. Se
desarrollaron en los años 80 en respuesta a las limi-
taciones de uso de los microarrays de DNA debido
a la escasa correlación entre los niveles de mRNA y
los niveles de expresión de las proteínas en la célula;
también con el objetivo de detectar las modi�icacio-
nes postraduccionales, que a menudo determinan
la función de las proteínas.
Esta metodología surgió como un método de
alto rendimiento utilizado para el seguimiento de
las interacciones y la actividad de las proteínas, y
para determinar su función a gran escala, permi-
tiendo cuanti�icar dichas interacciones en muy poco
tiempo.
Los microarrays de proteínas son matrices for-
madas por cientos o miles de proteínas diferentes
inmovilizadas y colocadas ordenadamente (dis-
puestas en �ilas y columnas) sobre un soporte (un
portaobjetos de vidrio, una membrana de nitrocelu-
losa o una placa de microtitulación), en forma de una
serie de «manchas», cada una de las cuales contiene
normalmente una proteína diferente. La incubación
con la muestra problema, previamente etiquetada
Figura 2.33: Tipos principales de microarrays de proteínas. Pueden ser funcionales (por ejemplo de captura con anticuerpos), de fase
reversa (RPPA) o de proteínas in situ. Para detectar la interacción se puede emplear un anticuerpo con una sonda �luorescente o dos anti-
cuerpos (el secundario sería el marcado) (POI, protein of interest).
76
con una sonda �luorescente, permite detectar las
interacciones entre la muestra problema y las pro-
teínas del microarray analizando directamente el
microarray con un escáner de �luorescencia.
La función de la super�icie es proporcionar un
soporte de máxima unión sobre el cual queden inmo-
vilizadas las proteínas, idealmente manteniendo su
conformación nativa, integridad y actividad, orien-
tando sus sitios de unión en la dirección apropiada
de modo que sean accesibles y proporcionando un
entorno hidró�ilico en el que la reacción de unión
puede ocurrir.
La detección se puede realizar de dos for-
mas distintas: mediante el marcaje directo de las
muestras con uno o dos �luorocromos (Cy3-Cy5 o
AlexaFluor 555-647) o mediante la técnica de sand-
wich con doble anticuerpo, uno de ellos marcado
para aumentar la especi�icidad y sensibilidad y dis-
minuir el ruido de fondo.
En términos generales, los microarrays de pro-
teínas pueden clasi�icarse (Figura 2.33) en:
— Microarrays de proteínas funcionales o
proteínas diana. En este caso los agen-
tes de captura pueden ser de distinta
naturaleza (anticuerpos o proteínas re-
combinantes de especi�icidad conocida,
por ejemplo) que se inmovilizan sobre
la super�icie del chip para luego incubar-
se con la muestra de interés. Estos arrays
se emplean comúnmente para el estudio
de patrones diferenciales de expresión
proteica, de acuerdo a su a�inidad, es-
peci�icidad u otras características. No
obstante, pueden presentar algunas limi-
taciones tales como reactividad cruzada
y/o pérdida de actividad de las proteínas
inmovilizadas.

— Microarrays de fase reversa (RPPA). Se
generan mediante la inmovilización de
lisados celulares o provenientes de teji-
dos o �luidos corporales, para la posterior
detección de proteínas de interés me-
diante anticuerpos especí�icos contra
las proteínas diana. Esta interacción an-
tígeno-anticuerpo se visualiza mediante
el empleo de un anticuerpo secundario
conjugado con una etiqueta que permita
ampli�icar la señal de detección. En este
caso, la intensidad de la señal será direc-
tamente proporcional a la especi�icidad,
a�inidad y accesibilidad espacial entre
la proteína diana y el anticuerpo. Estos
arrays se emplean para el análisis de mo-
di�icaciones postraduccionales o para el
estudio de rutas de señalización.
— Microarrays de proteínas in situ. Se basan
en la síntesis in situ de proteínas (em-
pleando sistemas de expresión libres de
células) a partir de bibliotecas de cDNA.
La proteína naciente, marcada con GST, es
capturada por un anticuerpo impreso ad-
yacente anti-GST, de manera que quede
retenida sobre la super�icie. En ocasiones
pueden sintetizarse diferentes versio-
nes de una misma proteína (por ejemplo
proteínas truncadas) con el objeto de es-
tudiar las diferentes regiones funcionales
de la misma. Esta estrategia es prome-
tedora en cuanto a que reúne en un solo
soporte la expresión, puri�icación y alma-
cenamiento de las proteínas. A este grupo
pertenecen: los PISA arrays (protein in
situ arrays), DAPA arrays (printing pro-
tein arrays from DNA arrays) y NAPPA
arrays (nucleic acids programmable pro-
tein arrays).
2.6.2. Captura por afinidad
En esta técnica se utiliza un anticuerpo para cap-
turar la proteína de interés a partir de una mezcla
compleja. La proteína capturada «arrastrará», en
principio, cualquier otra proteína que interactúe,
fuerte o débilmente, con ella. Posteriormente, la
mezcla así obtenida (el interactoma) se analiza por
MS para identi�icar las proteínas asociadas.
2.7. Análisis estructural
La estructura en alta resolución de una proteína
aporta gran cantidad de información útil. A menudo
77
Análisis de proteínas
aporta indicios sobre las funciones de una proteína
cuya actividad es desconocida; también puede suge-
rir la ubicación de posibles sitios activos y aportar
información sobre el modo por el que determinadas
moléculas interactúan con la proteína.
El conocimiento de la estructura de una proteí-
na a menudo sugiere sitios diana para potenciales
medicamentos que pudieran interactuar con ella.
Como la estructura aporta información funcional,
uno de los objetivos de la proteómica es determinar
la estructura de cada una de las proteínas que se en-
cuentran en la célula.
Actualmente determinar la estructura de una
sola proteína puede llegar a ser una tarea ingen-
te que requiere años de trabajo. Habitualmente se
utilizan dos procedimientos para resolver la estruc-
tura de las proteínas: (i) cristalogra�ía de rayos X, en
la cual los cristales obtenidos a partir de la proteí-
na son bombardeados con rayos X, utilizándose los
patrones de difracción obtenidos para determinar
su estructura; y (ii) resonancia magnética nuclear
(NMR) que, basándose en las propiedades magné-
ticas de los núcleos, aporta información sobre la
posición de átomos especí�icos dentro de la molé-
cula.
2.7.1. Cristalografía de rayos X
Los rayos X son una forma de radiación electro-
magnética de una longitud de onda alrededor de
0.1 nm (diámetro de un átomo de hidrógeno). Si se
dirige un haz estrecho y paralelo de rayos X sobre
una muestra de una proteína pura, la mayoría de
los rayos X pasarán a su través. Sin embargo, una
pequeña fracción de ellos será dispersada por los
átomos de la muestra. Si las proteínas de la muestra
están dispuestas de manera que forman un cristal
bien ordenado, las ondas dispersadas se reforza-
rán entre sí en ciertos puntos y aparecerán como
un patrón de manchas de difracción cuando los ra-
yos X sean recogidos por un detector. La posición
e intensidad de cada mancha en el patrón contie-
ne información sobre las posiciones de los distintos
átomos en el cristal.
La deducción de la estructura tridimensional
de una gran molécula a partir del patrón de difrac-
ción de su cristal es una tarea compleja, aunque en
los últimos años esta tarea se ha automatizado signi-
�icativamente. El paso limitante es la producción de
cristales de proteína adecuados. Este proceso requie-
re grandes cantidades de proteína muy pura y una
optimización puramente experimental de las condi-
ciones de cristalización adecuadas (Figura 2.34).
Métodos en biociencias
Figura 2.34: Flujo de trabajo utilizado en un ensayo de difracción de rayos X.
El resultado del análisis del patrón de
difracción resultante produce un complejo mapa tri-
dimensional de densidades electrónicas. Interpretar
este mapa, es decir, convertir los contornos en una
estructura tridimensional resulta una tarea compli-
cada y requiere conocer la secuencia de aminoácidos
de la proteína. Fundamentalmente, mediante una
aproximación ensayo-error se consigue correlacio-
nar, con la ayuda de software especí�ico, la secuencia
y el mapa de densidades electrónicas. La �iabilidad
del modelo atómico �inal depende del grado de reso-
lución de los datos cristalográ�icos: una resolución
de 0.15 nm permite situar todos los átomos en la
molécula excepto los de hidrógeno. A menudo un
modelo atómico completo resulta demasiado com-
plejo para poderlo observar directamente, pero a
partir del mismo se pueden derivar versiones sim-
pli�icadas que resumen las características esenciales
de la estructura.
La cristalogra�ía de rayos X también puede uti-
lizarse para estudiar complejos macromoleculares
(los ribosomas por ejemplo) mediante la utilización
de un acelerador de partículas denominado sincro-
trón.
2.7.2. Resonancia magnética nuclear
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(NMR, nuclear magnetic resonance) se utiliza para
analizar la estructura de pequeñas moléculas como
proteínas pequeñas (habitualmente de 20 kDa o me-
nos) o dominios proteicos en solución. A diferencia
de la cristalogra�ía de rayos X, la NMR no requiere
que la muestra esté cristalizada: solo se necesita un
pequeño volumen de una solución proteica concen-
trada que se coloca en un campo magnético intenso.
78
Algunos núcleos atómicos, particularmente
los de hidrógeno, tienen un momento magnético o
espín, que en presencia de un campo magnético in-
tenso se alinean. Esta alineación puede variar al ser
excitado por la aplicación de pulsos de radiofre-
cuencia de radiación electromagnética. Cuando los
núcleos de hidrógeno excitados se relajan a su es-
tado alineado emiten radiación de radiofrecuencia,
que se puede medir y expresar en forma de espectro.
La naturaleza de la radiación emitida depende del
entorno de cada núcleo de hidrógeno, de forma que
la excitación de un núcleo in�luye en la absorción y
la emisión de radiación de otro núcleo que esté su�i-
cientemente cerca de él.
La técnica básica de NMR, conocida como
NMR bidimensional, permite distinguir las señales
procedentes del núcleo de hidrógeno de diferen-
tes residuos de aminoácidos e identi�icar y medir
los pequeños cambios que ocurren en estas seña-
les cuando los núcleos de hidrógeno se acercan
su�icientemente como para interaccionar entre
sí. La magnitud del cambio revela la distancia en-
tre el par de átomos de hidrógeno que interactúan.
De esta forma, la NMR aporta información sobre
las distancias entre distintas zonas de la proteína.
Combinando esta información con la secuencia de
aminoácidos es posible, en principio, identi�icar la
estructura tridimensional de la proteína.
La técnica pierde resolución a medida que se
incrementa el tamaño de la macromolécula, aun-
que avances técnicos recientes han elevado el límite
de tamaño hasta los 100 kDa, haciendo posible en
análisis estructural de la mayor parte de las pro-
teínas. Puesto que los estudios de NMR se realizan
en solución, esta técnica presenta la ventaja de po-
der seguir cambios en la estructura de la proteína;
por ejemplo, durante su plegamiento o durante el

proceso de unión a un sustrato. La principal limita-
ción de técnicas como la cristalogra�ía de rayos X o
la NMR es que son técnicas demasiado lentas para
determinar simultáneamente la estructura de las
miles de proteínas que pueden coexistir dentro de
la célula. Como en los estudios del proteoma es ne-
cesario conocer las estructuras de cientos de miles
de proteínas, se espera que en un futuro se pueda
modelar o predecir la estructura a partir de las se-
cuencias de aminoácidos solamente con la ayuda
de métodos automatizados y nuevas herramientas
bioinformáticas que aceleren la determinación de
estas estructuras.
Bibliografía
Aebersold R, Mann M. 2003. Mass Spectrometry-based
Proteomics. Nature 422:198-207.
Biochemistry. 2015.
Berg JM, Tymoczko JL, Gatto GJ, Stryer L. McMillan
Education. ISBN 978-1464126109.
Bioquímica. 2006.
Voet D, Voeth JG. Editorial Médica Panamericana. ISBN
978-9500623018.
79
Análisis de proteínas
Domon B, Aebersold R. 2006. Mass Spectrometry and
Protein Analysis. Science 312:212-217.
Essentials of Chemical Biology. Structure and Dynamics of
Biological Macromolecules. 2007.
Miller A, Tanner J. John Wiley & Sons. ISBN 978-
0470845301.
Fundamentos de química analítica. 1996.
Skoog DA, West DM, Holler J. Editorial Reverte. ISBN
8429175563.
Manual de Proteómica. 2014.
Sociedad Española de Proteómica. https://payhip.com/b/
FNt7.
Principios de análisis instrumental. 2000.
Skoog D, Holler J, Nieman TA. McGraw-Hill-
Interamericana. ISBN 978-8448127756.
Protein and Proteomics. A Laboratory Manual. 2003.
Simpson RJ. Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0879695544.
Protein Microarrays. 2005.
Schena M (ed). Jones & Bartlett Publishers. ISBN
0763731277.
Técnicas analíticas de separación. 1988.
Valcárcel M, Gómez A. Editorial Reverte. ISBN 8429179844
Técnicas de separación en Química Analítica. 2003.

Análisis de ácidos
nucleicos
Los ácidos nucleicos son biopolímeros forma-
dos por nucleótidos y fueron descubiertos por vez
primera en 1869 por Meischer. En la naturaleza
se conocen dos tipos de ácidos nucleicos, el ácido
desoxirribonucleico o DNA y el ácido ribonuclei-
co o RNA. Sin embargo, no se tomó conciencia de la
importancia de los mismos hasta que la estructura
tridimensional del DNA fue descubierta en 1953 por
Watson y Crick. Desde entonces, el conocimiento
de los ácidos nucleicos ha avanzado enormemente
revolucionando por completo la medicina y la bio-
logía, de tal manera que a la Medicina del siglo ���
se la conoce también por Medicina Genómica. Así,
hoy en día se sabe que las pequeñas variaciones
que se encuentran en el DNA de cada uno de noso-
tros son responsables, no solamente de gran parte
de las enfermedades que sufrimos durante nuestra
vida, sino también de la variabilidad en la respues-
ta a los fármacos que se administran para curar
dichas enfermedades. Todo esto ha generado el
concepto de Medicina personalizada, según el cual
no hay enfermedades sino enfermos. La genómi-
ca está permitiendo ya de�inir subclases de cáncer,
con peor o mejor pronóstico, donde antes se con-
sideraba un solo tipo de cáncer, mejorando de esta
manera el tratamiento para cada subgrupo. Ya hace
más de 100 años William Osler fue capaz de decir
3.
Luis Andrés López
Yolanda Loarce
«Si no fuera por la variabilidad entre los individuos,
la medicina podría considerarse una ciencia y no
un arte». Según esta frase y guardando las distan-
cias en el tiempo se podría decir que la genómica ha
venido para hacer de la medicina más ciencia y me-
nos arte. En este capítulo se mostrará cómo aislar,
cuanti�icar, almacenar y trabajar con DNA y RNA, y
también las aplicaciones fundamentales y técnicas
de laboratorio de cada una de estas moléculas en el
trabajo cientí�ico, centradas fundamentalmente en
Biomedicina, aunque sin olvidar otras disciplinas.
Existen, obviamente, muchas más técnicas y mu-
chas más aplicaciones con ácidos nucleicos, pero el
propósito de este capítulo es ofrecer una visión ge-
neral que sirva de orientación y ayuda a personas
que se inician en el mundo de la genética molecular.
3.1. Ácido desoxirribonucleico
El genoma es el conjunto de la información gené-
tica de un organismo que se encuentra en cada
una de las células que lo componen y está formado
por moléculas de DNA (Figura 3.1). El DNA es una
molécula polimérica formada por la unión de múl-
tiples desoxirribonucleótidos mediante puentes
fosfodiéster. Hay cuatro diferentes desoxirribonu-
Métodos en biociencias
Figura 3.1: Representación del DNA desde su
estructura primaria al cromosoma. Fuente:
http://openclipart.org/detail/157357/cro-
mossomo-descondensando-by-js.
cleótidos: desoxiadenina (dA), desoxiguanina (dG),
desoxicitosina (dC) y desoxitimina (dT). Mayorita-
riamente, las moléculas de DNA están formadas por
dos cadenas complementarias con orientación anti-
paralela unidas entre sí por puentes de hidrógeno,
de tal manera que las adeninas están unidas a timi-
nas y las citosinas a guaninas.
3.1.1. Tipos de DNA
El DNA se puede clasi�icar de múltiples formas. Por
ejemplo, en función de su origen se puede tener DNA
genómico, que es aquel que proviene del núcleo de
una célula y que de�ine el genoma de un organis-
mo. Por otro lado, se puede tener DNA mitocondrial,
que es el material genético de las mitocondrias, o
DNA plasmídico, que es un DNA circular no cromo-
sómico que se encuentra normalmente en bacterias
y a veces en levaduras y que no está unido a proteí-
nas.
3.1.2. Manejo del DNA
En el manejo del DNA los dos aspectos funda-
mentales a evitar son, por un lado, la degradación
de la muestra y, por otro, la contaminación con
otras moléculas de DNA. Las enzimas que rom-
pen el DNA se denominan desoxirribonucleasas,
82
y más comúnmente DNasas. La principal DNa-
sa es la DNasa I, que genera roturas inespecí�icas y
que actúa sobre hebras tanto simples como dobles,
cromatina e híbridos DNA/RNA. Otras desoxirri-
bonucleasas, denominadas enzimas de restricción,
son capaces de cortar secuencias especí�icas y son
utilizadas en múltiples aplicaciones de biología mo-
lecular. No obstante, el DNA es una molécula muy
estable, como demuestra la secuenciación lograda
de DNA proveniente de momias y de restos de nues-
tros ancestros homínidos.
3.1.3. Aislamiento del DNA
El aislamiento de DNA genómico es una técnica
muy sencilla que no requiere de instrumental com-
plejo. En los laboratorios la extracción de DNA es
una técnica rutinaria que se ha perfeccionado para
obtener grandes cantidades de DNA, de manera
sencilla, con un excelente grado de pureza y listo
para ser usado en múltiples aplicaciones. Este aisla-
miento puede ser manual o automatizado, pero en
cualquiera de los casos la técnica es similar. Por lo
general se utilizan kits que contienen todos los re-
activos que se van a necesitar. Dependiendo del tipo
y origen de DNA que se quiera aislar se selecciona-
rá un kit u otro. El procedimiento más común está
representado en la �igura 3.2. En un primer paso, la
muestra que contiene el DNA que se quiere extraer
se pone en contacto con una solución de lisis que
va a romper las membranas celulares por la acción
de detergentes. Esta fase suele acompañarse con
la presencia de proteinasa K, que va a ayudar a li-
berar el DNA de las histonas que están unidas a él.
Dependiendo de la fuente de DNA, y sobre todo de
la resistencia de las membranas celulares de distin-
tos organismos y tejidos, se necesitará un mayor o
menor tiempo de lisis. Una vez las células se han li-
sado y las histonas separado del DNA, este puede
ser puri�icado por:
a) precipitación con etanol,
b) extracción con fenol/cloroformo,
c) por �iltración en una membrana de si-
lica-gel que va a retener ácidos nucleicos,
d) por la adición de partículas paramag-
néticas que se unen al DNA mediante
moléculas que interaccionan, normalmen-
te estreptavidina-biotina, y la posterior
aplicación de un campo magnético.
Dependiendo de la aplicación en la que se vaya a
utilizar el DNA y de las características propias de
cada kit puede ser necesario eliminar las pequeñas

Figura 3.2: Esquema de un sistema de extracción
comercial típico de DNA mediante columnas de si-
lica.
trazas de RNA. Para ello se puede incubar el DNA en
presencia de ribonucleasas (RNasas), que son en-
zimas que degradan el RNA. Finalmente, el DNA es
resuspendido o eluido en una solución de agua libre
de nucleasas o de tris-EDTA 10mM.
Dependiendo de las aplicaciones, podría no
ser necesaria una puri�icación del DNA, sino una
simple lisis. Así, por ejemplo, hay Taq DNA polime-
rasas, las enzimas que van a realizar la copia del
DNA, que son capaces de funcionar tras una sim-
ple lisis de las células. Esto hace los procedimientos
más rápidos y baratos.
3.1.4. Cuantificación e integridad
Una vez que se ha aislado el DNA se debe compro-
bar su concentración, pureza e integridad. Para
medir la cantidad y concentración del DNA extraído
se utiliza espectrofotometría. El DNA tiene un pico
o máximo de absorbancia a 260 nm, por lo que la
absorbancia a esta longitud de onda nos permiti-
rá medir la concentración del DNA eluido. Para ello
hay que tener en cuenta que 1 U de absorbancia a
260 nm corresponde a una concentración de 50 ng/
µL. Respecto a la pureza, dado que en origen el DNA
está unido a proteínas y que estas tienen un pico de
absorbancia a 280 nm, el ratio de las absorbancias
a 260/280 nm nos indicará el grado de contamina-
ción del DNA con proteínas. Una ratio de entre 1.7
a 2.1 indicará un DNA puro en cuanto a proteínas
se re�iere. Además, se suele utilizar secundariamen-
te la ratio de absorbancia 260/230 nm debido a
83
Análisis de ácidos nucleicos
que muchas sustancias utilizadas en el aislamiento
de DNA absorben a 230 nm y pueden interferir en
los posteriores usos que se hagan del DNA. Así, sus-
tancias como EDTA, carbohidratos, fenol, o cloruro
guanidinio, utilizadas frecuentemente en el aisla-
miento de ácidos nucleicos, pueden permanecer en
el eluído �inal e inhibir reacciones posteriores en las
que se emplee el DNA extraído. Para considerar una
muestra como pura esta ratio debe situarse entre
1.5 y 2.
Debido a que estos «contaminantes» pueden
hacer que se infra- o sobre-estime la concentración
de DNA, en aplicaciones en las que conocer exacta-
mente la cantidad de DNA es esencial o en aquellas
ocasiones en las que la concentración de DNA es tan
baja que la medida espectrofotométrica está cerca
o por debajo de la sensibilidad del espectrofotóme-
tro se puede utilizar �lourometría para cuanti�icar el
DNA. El método más extendido utiliza un compues-
to, denominado PicoGreen, que es un �luoróforo que
se une selectivamente a DNA de doble cadena. Este
compuesto tiene un máximo de excitación a 480 nm
y tiene la propiedad de que su intensidad es muy
elevada si está unido a DNA, pero es excepcional-
mente baja si no lo está.
Aunque el DNA es bastante estable, depen-
diendo de la aplicación puede ser necesario medir
la integridad del mismo, si se trata de DNA genómi-
co, o medir el tamaño de un fragmento de DNA o
plásmido. Para ello, la técnica utilizada es la elec-
troforesis. Esta técnica consiste en la separación de
moléculas por tamaño al atravesar una matriz. El
desplazamiento de las moléculas se realiza median-
te la aplicación de un campo eléctrico y basándose
en que la mayoría de los ácidos nucleicos tiene car-
ga eléctrica. El DNA está cargado negativamente
por lo que se desplazará hacia el polo positivo. Las
moléculas más pequeñas se desplazarán más rápi-
damente que las más voluminosas, que se moverán
más lentamente por la matriz. De esta manera se
detectará si un DNA está íntegro o fragmentado en
distintas moléculas. Incluso existen algoritmos que
ofrecen un valor numérico de la degradación de un
DNA genómico como el DNA integrity number (DIN)
(Figura 3.3).
El DNA, como se ha comentado previamente,
es bastante estable. Se recomienda mantener a 4 ºC
durante semanas/meses, y a -20 ºC durante años.
Es desaconsejable someter al DNA a repetidos ci-
clos de congelación/descongelación puesto que se
puede fragmentar. Por ello, para muestras que se
usen frecuentemente y se quieran conservar duran-
te largos periodos de tiempo se recomienda hacer
alícuotas y mantenerlas a -20 ºC.
Métodos en biociencias
Figura 3.3: Imagen virtual de electroforesis de DNAs con distintos grados de degradación.
Fuente: página web de Agilent Technologies, http://www.genomics.agilent.com/campaign.
jsp?id=5300004.
3.2. Ácido ribonucleico
El RNA es una molécula polimérica formada por
la unión de múltiples ribonucleótidos mediante
puentes fosfodiéster. Hay cuatro diferentes ribonu-
cleótidos: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y
uracilo (U). Mayoritariamente las moléculas de RNA
están formadas por una cadena sencilla de nucleóti-
dos y no presentan cadena complementaria.
3.2.1. Tipos de RNA
Tradicionalmente se conocen desde hace décadas
tres tipos de RNA, todos ellos implicados en la sín-
tesis de proteínas: el RNA mensajero (mRNA), que
porta la información genética que va a convertir-
se en una proteína, el RNA de transferencia (tRNA),
que es el traductor que asocia de manera especí�ica
un triplete de nucleótidos con un aminoácido, y el
RNA ribosómico (rRNA), que se encuentra forman-
do parte de los ribosomas donde se va a producir la
traducción del mRNA a proteína. Además, es cono-
cido cómo las mitocondrias sintetizan sus propios
RNAs a partir del DNA mitocondrial. Estos son cono-
cidos como RNA mitocondriales y son sintetizados
por una RNA polimerasa especí�ica de mitocon-
drias.
Sin embargo en los últimos 20 años se han des-
cubierto otros muchos tipos de RNA (Figura 3.4)
que no participan en la síntesis de proteínas, sino
que tienen funciones tales como:
84
1) regular la expresión génica (miRNA,
siRNA, piRNA, asRNA, lncRNA),
2) participar en actividades catalíticas,
bien unidos a otras proteínas forman-
do ribozimas o bien regulando su propio
procesamiento, o
3) modi�icar nucleótidos de otros RNAs
(snRNA o snoRNA).
3.2.2. Manejo de RNA
Obtener un RNA de alta calidad es probablemente
el paso más importante para cualquier técnica de
biología molecular en la que se vaya a utilizar esta
molécula. Las ribonucleasas, también conocidas
como RNasas, son enzimas que catalizan la hidró-
lisis de RNA y constituyen el mayor peligro para la
integridad del mismo. Estas enzimas son muy fre-
cuentes y altamente termoestables. Para trabajar en
un laboratorio con RNA hay que tener una serie de
precauciones que permitirán manejarlo con seguri-
dad:
— Las manos son un importante foco de
ribonucleasas, por lo que evitar tocar di-
rectamente el material que va a estar en
contacto con el RNA es esencial. No es
necesario llevar doble guante, pero sí que
estos estén en todo momento limpios.
— Si en el laboratorio se trabaja con otras
moléculas, además de RNA, se puede
 Análisis de ácidos nucleicos

Figura 3.4: Tipos de RNA. Abreviaturas: mRNA, RNA mensajero; rRNA, RNA ribosómico; tRNA, RNA de transfe-
rencia; srpRNA, RNA de partícula de reconocimiento de señal; asRNA, RNA antisentido; lncRNA, RNA largo no
codi�icante; miRNA, micro RNA; piRNA, RNA de interacción con piwi; siRNA, RNA de interferencia pequeño; sn-
RNA, RNA pequeño nuclear; snoRNA, RNA pequeño nucleolar; RNasaP, ribonucleasa P; scRNAA, RNA pequeño
especi�ico de cuerpo de Cajal; TERC, RNA componente de la telomerasa.

acondicionar una zona para trabajar ex-
clusivamente con RNA o bien trabajar con
todas las moléculas como si se estuviera
trabajando con RNA.
— Las soluciones que se empleen en el ais-
lamiento de RNA tienen que estar libres
de nucleasas.
— Emplear preferentemente material de
plástico libre de nucleasas (tubos, pun-
tas) y, si es necesario, material de vidrio
previamente horneado a 200 ºC durante
2 horas.
3.2.3. Aislamiento de RNA
Existen múltiples alternativas para el aislamien-
to de RNA de muestras biológicas. La elección del
método dependerá del material biológico original y
de la aplicación en la que se quiera emplear el RNA.
Durante el proceso de extracción el RNA va a estar
protegido de la acción de ribonucleasas mediante
compuestos que inhiben su acción o desnaturalizan
las proteínas, como por ejemplo isotiocianato gua-
nidinio, dodecilsulfato sódico (SDS) o fenol. Lo ideal
es aislar el RNA en cuanto la muestra es recolectada
para evitar la acción de las ribonucleasas. Sin em-
bargo, si esto no es posible, se pueden almacenar
las muestras a -80 ºC y/o mantener la muestra en
soluciones que inhiban la acción de las ribonuclea-
sas, como por ejemplo RNAlater.
De manera similar al DNA hay varios métodos
para aislar RNA. Básicamente todos los métodos
deben primero liberar el material citoplasmáti-
co mediante una lisis celular. Esta lisis es química,
aunque si se trata de membranas resistentes (como
por ejemplo la de las células vegetales) o tejidos se
puede acompañar con una disgregación �ísica por
ultrasonidos, presión o cuchillas. A partir de aquí se
pueden diferenciar 4 métodos:
— Extracción orgánica. Es el más tradicional
y fue descrito por Chomczynski en 1987.
Utiliza una solución fenólica que al com-
binarse con cloroformo y centrifugarse se
separa en tres fases (Figura 3.4): una fase
fenólica en el fondo del tubo donde se van
a localizar las proteínas, una interfase

85
Métodos en biociencias
que queda como una nube blanca donde
se encuentra el DNA, y una fase acuosa en
la parte superior donde se encuentra el
RNA. Tras recolectar la fase acuosa el RNA
es precipitado con isopropanol y recogi-
do por centrifugación. Tras varios lavados
en etanol 70% se tendrá un RNA de cali-
dad para la mayoría de aplicaciones.
— Retención en membrana. Una vez realiza-
da la lisis en una solución que no contiene
fenol, el RNA es aislado por unión a una
membrana de sílica que tras varios la-
vados con etanol será eluído en un agua
libre de ribonucleasas o un tampón con
Tris. Para aplicaciones como microarrays
(a veces llamadas micromatrices) de
expresión o secuenciación masiva se re-
quiere un RNA de la máxima calidad por
lo que se suele hacer una primera extrac-
ción con una solución fenólica y el RNA es
posteriormente puri�icado mediante la
unión a una membrana de sílica. De he-
cho, hay kits comerciales que combinan
ambos métodos para obtener un RNA de
excelente calidad en menos tiempo.
— Separación magnética. Este método se
basa en el uso de partículas paramagné-
ticas, normalmente esféricas, que en su
super�icie presentan modi�icaciones ca-
paces de unirse a RNA, como por ejemplo,
sistemas de unión estreptavidina/bioti-
na. Con la simple aplicación de un campo
magnético tras la unión de las partículas
al RNA, este se puede aislar fácilmente
tras unos cuantos lavados. Para puri�i-
car mRNA es frecuente usar partículas
paramagnéticas cubiertas de un oligonu-
cleótido dT18-20 dado que las moléculas de
mRNA poseen una cola de adeninas en el
extremo 3’.
— Lisis y estabilización. Este método se uti-
liza cuando la aplicación no requiere un
RNA de mucha pureza o el número de cé-
lulas es muy bajo. Simplemente se lisa la
muestra y posteriormente se estabiliza
con una solución que va a inhibir la ac-
ción de las RNasas.
3.2.4. Cuantificación e integridad
Una vez que se ha aislado el RNA se debe compro-
bar su concentración, pureza e integridad.
Al igual que para el DNA, para medir la can-
tidad y concentración del RNA extraído se utiliza
86
usualmente espectrofotometría. El RNA absorbe a
la misma longitud de onda que el DNA. La diferen-
cia para el RNA es que 1 U de absorbancia a 260 nm
corresponde a una concentración de 40 ng/µL. Las
condiciones de pureza son idénticas a las comenta-
das en el caso de DNA.
Debido a la inestabilidad del RNA por acción
de las RNasas es imprescindible medir la integri-
dad del mismo. Para ello la técnica utilizada, al igual
que para el DNA, es la electroforesis. En una célula
eucariota más del 95% del RNA es RNA ribosómi-
co 28S y 18S y en menor medida 5S, por lo que en
una electroforesis de un RNA íntegro lo que se va a
observar son las bandas correspondientes a estos
RNA ribosomales (Figura 3.5). Debido a la facilidad
de degradación del RNA durante la electroforesis en
geles de agarosa y a que en muchos casos la can-
tidad de material de partida es muy escasa, en los
laboratorios donde se trabaja con RNA se va impo-
niendo la electroforesis en chip, ya que por escaso
tiempo que la muestra está migrando (1-1.5 minu-
tos) no hay problemas de degradación. Además, la
sensibilidad es muchísimo mayor que en una elec-
troforesis convencional, pudiéndose detectar y
cuanti�icar concentraciones de pg/µL. Incluso exis-
ten algoritmos que ofrecen un valor numérico de la
degradación de un RNA genómico como el RNA in-
tegrity number (RIN), que se ha convertido en un
estándar de calidad del RNA y es requerido un mí-
nimo para garantizar resultados concluyentes en
determinados procedimientos, como por ejemplo
microarrays de expresión.
El RNA se conserva en agua o en tampón TE
(Tris-EDTA) libres de nucleasas a -20 ºC durante se-
manas, y años a -80 ºC. Sin embargo, dependiendo
del grado de integridad inicial, del tejido de parti-
da o del método de extracción se pueden encontrar
muestras que tras un año a -80 ºC están altamente
degradadas. Otras vías de conservación más esta-
bles, pero menos frecuentes, son la resuspensión en
formaldehido, o la precipitación en etanol/NH4OAc
o en citrato sódico 1mM pH 6.4.
3.3. Técnicas con ácidos nucleicos
3.3.1. Secuenciación
La secuenciación es la técnica que permite leer el
orden de los nucleótidos en un ácido nucleico. El
proyecto Genoma Humano permitió en la década
de los 90 avanzar enormemente en la tecnología
de secuenciación. Así, el primer genoma huma-
no fue secuenciado por más de 20 grupos durante
 Análisis de ácidos nucleicos

Figura 3.5: Electroforesis en chip de muestras de RNA con distinto grado de degradación. A la izquierda
imagen virtual de la electroforesis de varios RNAs totales extraídos de linfocitos CD4+ humanos, dónde se
aprecian fundamentalmente dos bandas, correspondientes al RNA ribosómico 28S (superior) y 18S (infe-
rior). A la derecha, electroferograma de una de las muestras, dónde se representa el per�il electroforético de
un RNA, de�inido por la intensidad de la �luorescencia [FU], en el tiempo transcurrido de electroforesis ex-
presado en segundos [s].

13 años y costó más de 3.000 millones de dólares.
En los últimos 10 años la tecnología de secuencia-
ción masiva se ha incrementado a un ritmo mucho
mayor, de tal manera que en la actualidad un geno-
ma se puede secuenciar en unos días y a un precio
algo superior a los 4.000 dólares (http://www.ge-
nome.gov/sequencingcosts/). La ingente cantidad
de datos generada por esta tecnología ha permiti-
do identi�icar millones de variantes genéticas que
deben explicar por qué cada persona es distinta,
por qué se sufre una enfermedad, cuál es nuestra
predisposición a sufrir una determinada enferme-
dad o por qué se responde de manera diferente a
medicamentos. No obstante, debido a su precio y
complejidad la secuenciación masiva sigue asociada
a grandes laboratorios y consorcios de genómica.
Las variaciones genéticas más frecuentes son
los polimor�ismos de un único nucleótido (del in-
glés, SNPs). A esto hay que sumar deleciones,
inserciones, traslocaciones, inversiones, duplicacio-
nes, etc. La mayoría se pueden detectar mediante la
tradicional secuenciación por el método de Sanger,
que sigue muy vigente. En él, básicamente, se parte
de una cantidad determinada del fragmento de DNA
a secuenciar (plásmido, producto de PCR, etc.), de
un oligonucleótido complementario a una región en
la zona 3’ de la secuencia que nos interesa conocer
y que va a actuar como cebador, una DNA polimera-
sa que va a leer la secuencia e incorporar nucleótidos
complementarios por el extremo 3’OH y, �inalmen-
te, de una mezcla de desoxinucleótidos (dNTPs) y
didesoxinucleótidos (ddNTPs) (Figura 3.6). Estos
ddNTPs son la clave en la secuenciación por el mé-
todo de Sanger. Por un lado, no tienen el grupo OH
en 3’, lo que impide que tras su incorporación a la
cadena de DNA naciente se incorpore ningún nu-
cleótido más. Por otro lado, estos ddNTPs están
marcados de alguna manera para poder visuali-
zarlos. Antiguamente venían marcados con algún
elemento radioactivo; sin embargo, en la actualidad,
cada ddNTP va marcado con una molécula �luores-
cente diferente. Al �inal de esta reacción se tendrán
fragmentos de todos los tamaños con un nucleó-
tido �inal distinto. Esto permite que mediante un
láser, y tras una electroforesis se pueda conocer la
secuencia del fragmento mediante la lectura de un
electroferograma (Figura 3.7).
La secuenciación masiva o NGS (por next ge-
neration sequencing) se puede realizar por muchas
tecnologías diferentes y resultaría imposible re-
sumirlas en un solo apartado. Las aplicaciones en
DNA de esta técnica van desde la secuenciación
de un panel de genes seleccionados hasta la se-
cuenciación del genoma entero de un individuo, o
la secuenciación de todas las regiones codi�ican-
tes de un genoma, es decir, el exoma. En cualquiera

87
Métodos en biociencias
Tema 3, página 11

Anillamiento

72ºC Elongación

Taq$

Fluorocromos

Figura 3.6. Representación de una reacción de secuenciación por una TaqDNA polimerasa con
Figura 3.6: Representación
didesoxinucleótidos marcadosde una reacción de secuenciación
fluorescentemente. poren
Disponible una TaqDNA polimerasa con didesoxinucleótidos
color.
marcados �luorescentemente.

Figura 3.7. Resultados de una secuenciación automática. Electroferograma de resultados obtenidos.

Polimorfismo identificado en posición 311 dónde se pueden observar dos picos diferentes: verde (Adenina)
y negro (Guanina). Disponible en color.

Figura 3.7: Resultados de una secuenciación automática. Electroferograma de resultados obtenidos. Polimor�ismo iden-
ti�icado en posición 311 dónde se pueden observar dos picos diferentes: verde (Adenina) y negro (Guanina). Disponible en
color.

88
 imposible tratarlas todas en un único capítulo, pero sí que se ha
estuvieran reflejadas las más utilizadas tanto en genotipado de
estudios de expresión génica.Análisis de ácidos nucleicos

de los casos, lo primero que hay que hacer es ge-

nerar la librería de fragmentos a secuenciar. Para
ello, se ampli�ican todas las regiones cuya secuen-
cia se quiera conocer, mediante sistemas de captura
95ºC Desnaturalización
apropiados. Estos sistemas de captura no son más
que oligonucleótidos que van a permitir la ampli-
�icación de millones de fragmentos en unas pocas
reacciones de PCR. Estos fragmentos se digieren
de manera controlada para que tengan un tamaño 55-65ºC Anillamiento
homogéneo y acorde a la técnica de secuenciación
empleada y se les ligan unos adaptadores. Tras va-
rios pasos intermedios que van a depender de la
tecnología empleada se consigue la librería de frag- 72ºC Extensión
mentos a secuenciar. Estas librerías se secuencian
Taq$
en secuenciadores masivos cuya tecnología varía
enormemente dependiendo de la casa comercial Taq$

que lo desarrolla.
Una vez obtenidas las secuencias, estas deben
ser alineadas para generar la secuencia consenso.
Esta se compara con un genoma de referencia y se
anotan las variantes entre ambas. El paso más com-
plicado suele ser asociar las variantes con un efecto
biológico. Así, por ejemplo, en un exoma es fácil que Figura 3.8. Esquema representando un ciclo de PCR. Triángulos y cuadrados represen
se tengan más de 50.000 variantes. Para ello se re- Figura 3.8: Esquema representando un ciclo de PCR. Triángulos y cuadra-
dos representan nucleótidos.
quiere el uso de herramientas bioinformáticas y, Curvas de desnaturalización
normalmente, personal especializado.
Al igual que para el DNA, también se puede se- Otro concepto importante en PCR son las curvas de desnaturalizació
cuenciar masivamente las moléculas de RNA de una no
entreson masºC,que
94-96 la va
lo que representación
a proporcionar dela la cantidad de molécula
energía
determinada muestra. El �in de la secuenciación necesaria para
permanecen en romper
forma de losdoble
enlaces por puente
cadena de
en un rango de temperatur
masiva de RNA no es tanto conocer las secuencias, hidrógeno establecidos entre los nucleótidos com-
aquella temperatura en la que el 100% de moléculas está forman
sino identi�icar qué genes se están expresando en plementarios. La unión
un tipo celular o tejido y cuanti�icar el nivel de ex- hasta aquella en la quede elA100%
con Testá
se realiza a través
en forma de cadena sencilla. L
presión de los mismos. Para ello, el número de veces la que el 50% de las moléculas están en Cforma
de 2 puentes de hidrógeno mientras que la de con de hebra sencil
G es a través de 3 puentes de hidrógeno. Esto hace
que se secuencia una misma región de un transcrito temperatura de desnaturalización (Tm), o también temperatura de m
que la energía necesaria para romper un enlace A-T
es directamente proporcional al número de molécu- una molécula
sea menor de DNA
que para romper esundependiente
enlace G-C. Una delvez tamaño y de la c
las de RNA de ese transcrito que había en la muestra nucleótidos.
separadas las cadenas complementarias del DNA (G) o citosinas (C
Una elevada proporción de guaninas
original y, por lo tanto, una representación del nivel Tm
molde mayor ya que que
es necesario la interacción entre estos
los oligonucleótidos ceba-dos nucleótidos e
de expresión de ese gen. Técnicamente,
dores (comúnmente se puede detectar
conocidos la Tm
como mediante
primers, del agentes intercalan
doble
inglés)hebra, como
hibriden con por ejemplo homóloga.
la secuencia el SYBRGreen, Esta esque cuando está u
3.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa hebra de anillamiento
la faseemite una intensa y suele darse a unas
fluorescencia, tempe-
mientras que cuando el DNA
raturas que oscilan entre 55 ºC y 65 ºC. Esta fase
se despega del mismo y emite una fluorescencia muy baja. De esta
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR de es crítica puesto que una temperatura demasiado
sus siglas en inglés, consiste en la ampli�icación de elevada podría hacer que no se obtuviera ampli�i-
un fragmento especí�ico de DNA mediante la suce- cación, y una temperatura demasiado baja podría
sión de ciclos de temperatura y tiempo variables. hacer que se consiguiera una ampli�icación ines-
Para ello se emplean dos oligonucleótidos de se- pecí�ica. La composición de bases y el tamaño de
cuencia idéntica al DNA molde que actúan como la pareja de oligonucleótidos determinará la tem-
cebadores y que de�inen los límites de la secuen- peratura de anillamiento óptima. Una vez que se
cia ampli�icada. La enzima capaz de leer la cadena produce el anillamiento, la Taq DNA polimerasa es
de DNA molde e incorporar los nucleótidos comple- capaz de reconocerlo y comienza a leer la secuen-
mentarios se denomina Taq DNA polimerasa. cia molde y sintetizar la cadena complementaria
En general, cada ciclo de la PCR tiene tres fases incorporando nucleótidos libres y uniéndolos a la
diferenciadas (Figura 3.8). La primera fase, deno- molécula naciente. Esta fase de extensión se produce
minada de desnaturalización, se va a llevar a cabo normalmente a 72 ºC, que es la temperatura óptima

89
 Métodos en biociencias
Figura 3.9: Curva de desnaturalización. Se representa en el eje X la
temperatura y en el eje Y la derivada negativa de la �luorescencia con
respecto a la temperatura (-Rn’). El pico de cada muestra indica la Tm
del producto ampli�icado. Los dos picos de la derecha corresponden a
dos muestras con dos productos de ampli�icación diferentes. La línea
irregular de la izquierda corresponde a un control negativo (sin DNA)
dónde no hay ampli�icación especí�ica.
de funcionamiento de la Taq DNA polimerasa. Estas
tres fases se repiten un número de veces su�iciente
para obtener la cantidad de DNA ampli�icado su�i-
ciente para la aplicación deseada, aunque más de
40-45 ciclos no suele ser habitual dado que tanto la
enzima como el resto de reactivos se agotan tras su-
cesivos ciclos a tan elevadas temperaturas. También
se suele introducir un ciclo de desnaturalización
previo, más extenso, para asegurarse de que el DNA
molde se separa correctamente, y un ciclo de exten-
sión �inal largo para favorecer que el producto �inal
tenga el tamaño correcto.
Dado que la Taq DNA polimerasa es capaz de
actuar en un rango variable de temperatura, a veces
se puede optimizar la PCR de tal manera que la fase
90
de anillamiento y la de extensión se fusionen. Esto
reduce los tiempos de realización de la PCR.
La reacción de PCR se realiza en una máqui-
na llamada termociclador, o comúnmente PCR,
y esta puede ser de dos tipos: sin y con lector de
�luorescencia. Esta última, denominada PCR a tiem-
po real, permite monitorizar la reacción durante la
PCR y proporcionar información del producto �i-
nal. Es decir, va a permitir analizar la muestra sin
necesidad de ninguna técnica adicional. La prime-
ra, sin �luorescencia, va a ampli�icar el fragmento
de DNA deseado, pero una vez ampli�icado reque-
rirá otra técnica (electroforesis, secuenciación, otra
PCR, etc.) para que se pueda obtener un resultado
del análisis genético que se esté realizando. Ade-
más, el termociclador puede tener un gradiente
de temperatura, lo que va a permitir en un mismo
experimento tener temperaturas de anillamien-
to variables a lo largo de un rango de�inido. Esto
es tremendamente útil para poner a punto de una
manera rápida una ampli�icación por vez primera
e identi�icar la mejor temperatura de anillamiento
posible.
La PCR se ha convertido en la técnica con ácidos
nucleicos por excelencia y la mayoría de aplicacio-
nes va a contener, en al menos una parte, una PCR.
A continuación serán descritas una serie de técni-
cas que emplean ácidos nucleicos, bien DNA, RNA o
ambos. Evidentemente, no son la únicas técnicas ya
que sería imposible tratarlas todas en un único ca-
pítulo, pero sí que se ha intentado que estuvieran
re�lejadas las más utilizadas tanto en genotipado de
DNA como en estudios de expresión génica.
Curvas de desnaturalización
Otro concepto importante en PCR son las curvas de
desnaturalización. Estas curvas no son mas que la
representación de la cantidad de moléculas de DNA
que permanecen en forma de doble cadena en un
rango de temperatura que va desde aquella tempe-
ratura en la que el 100% de moléculas está formando
doble hebra hasta aquella en la que el 100% está en
forma de cadena sencilla. La temperatura a la que el
50% de las moléculas están en forma de hebra sen-
cilla se denomina temperatura de desnaturalización
(Tm), o también temperatura de melting. La Tm de
una molécula de DNA es dependiente del tamaño y
de la composición de nucleótidos. Una elevada pro-
porción de guaninas (G) o citosinas (C) favorece
una Tm mayor ya que la interacción entre estos dos
nucleótidos es mas intensa. Técnicamente, se pue-
de detectar la Tm mediante agentes intercalantes
del DNA de doble hebra, como por ejemplo el SYBR
 Análisis de ácidos nucleicos

Green, que cuando está unido a la doble hebra emi-

te una intensa �luorescencia, mientras que cuando
el DNA se desnaturaliza se despega del mismo y
emite una �luorescencia muy baja. De esta manera
la señal �luorescente es proporcional a la cantidad
de DNA en forma de doble hebra. La curva de des-
naturalización se obtiene sometiendo al producto
de la PCR a un incremento gradual de la tempera-
tura desde la más baja, en la que todas la moléculas
están en forma de doble hebra, hasta 95 ºC, donde
todas las moléculas están desnaturalizadas (Figura
3.9). El proceso de desnaturalización no es gradual,
de tal manera que en un intervalo de apenas 1 ºC
la molécula pasa de estar completamente en doble
hebra a estar completamente desnaturalizada. En el
caso de un SNP, como hay un cambio en la secuen-
cia de bases nitrogenadas, la Tm de las dos posibles
moléculas es ligeramente diferente. En estos casos
donde la diferencia de Tm es muy pequeña se em-
plea lo que se denomina curva de desnaturalización
de alta resolución o HRM (del inglés high resolu- Figura 3.10: Sondas TaqMan. Esquema que muestra el fundamento de
tion melting) en la cual la lectura de �luorescencia es la sonda TaqMan. F, molécula �luorescente «donante», Q, molécula «re-
continua durante la fase de desnaturalización y ade- ceptora» o quencher.
más este incremento de temperatura se hace más
lentamente. Esto permite obtener mayor cantidad
de datos en la curva y mayor grado de resolución
íntegra la emisión de la molécula «donan-
para detectar variaciones muy pequeñas. Los equi-
te» es absorbida por la «receptora» y no
pos LightCycler (Roche Applied Science) son los
se puede detectar (Figura 3.10). Cuan-
más usados para genotipado usando esta técnica.
do el oligonucleótido durante el proceso
En estudios de expresión génica con molécu- de extensión se rompe las dos molécu-
las �luorescentes inespecí�icas, como el SYBR Green las �luorescentes se distancian y entonces
que se une a DNA de doble cadena, las curvas de la emisión de la molécula «donante» se
desnaturalización permiten medir la especi�icidad detecta. Estas sondas tienen múltiples
detectando si hay una sola ampli�icación o se tienen aplicaciones, entre otras genotipado, ex-
varios productos. presión génica, o la detección del número
de copias de un gen. En el caso de genoti-
Sondas FRET pado se utilizan dos sondas TaqMan, cada
una con una de las dos posibles secuen-
Las sondas FRET (del inglés, �luorescence resonant cias del SNP y cada una marcada con un
energy transfer) se basan en la existencia de una �luoróforo diferente para poder diferen-
molécula �luorescente «donante» que al ser excita- ciarlas. Así, primeramente se ampli�ica
da emite energía a una longitud de onda X y otra por PCR la región que contiene el SNP
molécula «receptora» capaz de excitarse con la lon- con dos cebadores en los extremos. Du-
gitud de onda X y emitir a otra longitud de onda rante el anillamiento en la PCR se unirán
diferente Y (ver capítulo 5, 5.7.6). Hay varios tipos la o las sondas TaqMan con la secuencia
de sondas FRET que se emplean en PCR: homóloga al DNA molde. Durante la fase
de extensión la actividad 5’-exonucleasa
— TaqMan. Las sondas TaqMan son oligo- de la TaqDNA polimerasa rompe el oligo-
nucleótidos de cadena sencilla con un nucleótido que se ha unido al DNA molde
�luoróforo en el extremo 5’ (donante) y liberando la molécula �luorescente y el
otro en el extremo 3’ (receptor), también quencher. Así, solo se podrá detectar la
conocido como quencher. En este caso, �luorescencia correspondiente al oligonu-
lo que se va a detectar es la �luorescen- cleótido complementario a la secuencia
cia «donante». Así, mientras la sonda está del DNA molde. En el caso de un homo-

91
Métodos en biociencias
Figura 3.11: Discriminación alélica. Diagrama de discrimina-
ción alélica utilizando sondas TaqMan, o KASP. Representación
cartesiana de las intensidades de las �luorescencias detectadas y
asociadas a cada una de las dos posibles secuencias del polimor-
�ismo A/C.
cigoto se detectará solo una de las dos
�luorescencias posibles, y en el caso de
un heterocigoto se detectarán las dos (Fi-
gura 3.11). Supóngase un SNP que puede
ser C o T y un individuo con la secuencia
C en ambos alelos. En este caso solo se
unirá en la PCR el oligonucleótido con la
variante C y solo se liberará el �luorocro-
mo asociado a este oligonucleótido. En el
caso de sondas TaqMan el producto am-
pli�icado normalmente es pequeño, entre
60-100 nucleótidos.
— KASP. Las sondas KASP son oligonucleó-
tidos de doble cadena que contienen una
molécula �luorescente «donadora» en una
cadena y un quencher en la otra. En esta
técnica se realiza una PCR alelo especí�ica
con 3 oligonucleótidos no marcados, dos
de ellos que son alelo especí�icos y uno
común. La particularidad de estas sondas
es que cada uno de los dos oligonucleóti-
dos alelo especí�icos tiene una secuencia
92
homóloga al DNA molde y una región o
cola adicional que se corresponde con
una sonda FRET especí�ica. Durante la
PCR se van a incorporar únicamente
aquellas sondas FRET cuyo oligonucleó-
tido sea complementario al DNA molde,
separándose la molécula �luorescente
«donadora» y el quencher. Así, de manera
análoga a las sondas TaqMan, se podrán
diferenciar los diferentes genotipos me-
diante la lectura de las �luorescencias
correspondientes a los dos alelos diferen-
tes (Figura 3.11).
— LightCycler. Las sondas LightCycler se
comportan de manera contraria a las dos
anteriores. Se componen de dos oligonu-
cleótidos complementarios a secuencias
próximas, pero no entre ellos. Uno está
marcado con la molécula �luorescente
«donante» y el otro marcado con la «re-
ceptora», de tal manera que cuando hay
ampli�icación están muy próximas emi-
tiendo la receptora una intensa señal
�luorescente, mientras que cuando no hay
ampli�icación están alejadas y no se emi-
te señal �luorescente. A diferencia de los
dos casos anteriores, la �luorescencia que
se detecta es la emisión de la molécula
receptora. Estas sondas se utilizan para
genotipar mediante curvas de desnatura-
lización.
PCR alelo específica
Aunque hoy en día acceso a termocicladores a tiem-
po real es relativamente fácil en laboratorios de
diagnóstico e investigación, todavía en muchos de
ellos no es posible utilizar esta tecnología. No obs-
tante, existen otras formas de obtener lo mismos
resultados sin el uso de estos aparatos. De mane-
ra similar a la técnica de las sondas KASP, se pueden
determinar genotipos mediante PCR alelo especí-
�ica y posterior separación electroforética de los
productos de la ampli�icación. Para ello, se necesi-
tan tres oligonucleótidos, dos especí�icos con cada
una de las posibles secuencias alternativas (F1, F2)
y uno común (R). En este caso, en el termociclador
se pondrán dos reacciones diferentes. Una PCR se
hará con los oligonucleótidos F1 y R y la otra con
F2 y R. Una vez realizada la reacción de PCR, el pro-
ducto se someterá a una electroforesis en gel y se
determinará si ha habido ampli�icación y el tamaño
del fragmento ampli�icado. Si el individuo es ho-
mocigoto para la secuencia representada en F1 se
 Análisis de ácidos nucleicos

obtendrá una ampli�icación en el primer tubo del

tamaño esperado, pero no en el segundo. Si el in- A
dividuo es heterocigoto se tendrá ampli�icación en
ambos tubos. Y si el individuo es homocigoto para la
secuencia representada en F2 solo se observará am-
pli�icación en el segundo tubo.

SNaPshot
Con las técnicas descritas hasta ahora se puede de-
tectar un único SNP cada vez y en cada reacción. La
técnica de SNaPshot fue desarrollada para poder
identi�icar varios polimor�ismos (2-20) en una úni-
ca reacción a partir de nanogramos de DNA y con
un bajo coste. Uno de los kits desarrollado por Life
Technologies que cumple con los requisitos para su
aplicación en la investigación forense es el SNaPs-
hot® multiplex system for SNP genotyping, basado
en la técnica de extensión del cebador (primer ex-
tension) en una única base (Figura 3.12a). En primer
lugar, se realiza una PCR de las regiones del genoma B
donde se localizan los SNPs que se pretende iden-
ti�icar. Una vez obtenido el DNA molde, el usuario
diseñará oligonucleótidos en la región 5’ adyacente
a la posición cuya secuencia se analizará de tal ma-
nera que el siguiente nucleótido sea el que se quiere  
conocer. Posteriormente, se realiza una PCR con el Figura 3.12: (A) Esquema de concepto de SNaPshot para
DNA ampli�icado, los oligonucleótidos, DNA poli- un único cebador. (B) Caso real de SNaPshot para deter-
minar el genotipo de 13 polimor�ismos distintos en el gen
merasa y didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) CYP2D6. Disponible en color.
marcados cada uno de ellos con un �lurocromo dife-
rente. Durante la reacción el oligonucleótido se une
a la cadena homóloga y a continuación la enzima
añade el ddNTP complementario a la primera base. dependiendo del tamaño total que origina la repe-
Al carecer este del grupo 3’-OH imprescindible para tición: DNA satélite (100 kb a varias megabases),
la formación del enlace fosfodiéster, la polimera- DNA minisatélite (repeticiones de 6 a 25 nucleóti-
sa no puede seguir añadiendo más nucleótidos y dos que originan regiones de 100 nucleótidos a 20
la reacción termina. Los fragmentos extendidos kb) y DNA microsatélite (repeticiones de 2, 3 o 4 nu-
marcados con el �luorocromo de la base recién cleótidos de tamaño no superior a los 150 pb). Las
incorporada se separan por electroforesis, revelán- técnicas empleadas en detectar estas variaciones
dose en forma de diferentes picos de color en un son múltiples.
electroferograma (Figura 3.12a). El DNA minisatélite o repeticiones en tándem
de número variable (VNTR), fue el primer mar-
Técnicas para detectar variación en el número de cador que se utilizó con �ines de identi�icación en
copias (CNVs) genética forense en la década de los 80. Para su de-
terminación se empleaba la técnica de Southern. La
Se estima que la diferencia entre la secuencia de unidad de repetición se utiliza como sonda fren-
nucleótidos del genoma de dos individuos varía en- te al DNA de las muestras digerido con enzimas de
tre el 0.1 y 0.4%, lo que supone más de 3 millones restricción. Tras la digestión enzimática los frag-
de nucleótidos diferentes. Esta diferencias se de- mentos de DNA se separan mediante electroforesis
ben principalmente a 2 tipos de variaciones: SNPs en geles de agarosa para posteriormente ser trans-
y CNVs (variaciones en el número de copias). A esta feridos por capilaridad a una membrana de nylon,
última clase pertenece el DNA repetido en tándem soporte estable al que se �ija el DNA, y al que se aña-
que consiste en bloques de DNA que se repiten de de el fragmento de DNA minisatélite marcado con
forma consecutiva, y que recibe distintos nombres P32, o digoxigenina. El revelado de la señal de hibri-

93
 Métodos en biociencias
Figura 3.13: Electroferograma de STRs. Se muestran 3 muestras diferen-
tes (A, B y C) y un marcador de peso molecular (D).
dación muestra un patrón de bandas complejo muy
variable entre las muestras analizadas pero especí�i-
co de individuo, de ahí que se le denominara huella
molecular del DNA. A pesar de ser una técnica muy
resolutiva, tiene inconvenientes importantes en su
aplicación, como la necesidad de disponer de micro-
gramos de DNA, la laboriosidad y el coste. Por todo
ello, es una técnica que se emplea cada vez menos.
La detección de DNA microsatélite o STRs
(repeticiones cortas en tándem) se basa en la ampli-
�icación por PCR de la región variable que contiene
la repetición microsatélite, utilizando oligonucleóti-
dos diseñados a partir de las regiones �lanqueantes
con secuencias conservadas. Una vez terminada la
reacción de PCR, los fragmentos son ordenados por
tamaño mediante una electroforesis capilar. La dis-
tribución de los marcadores STR se observa en un
electroferograma gracias al marcado �luorescente de
uno de los miembros de la pareja de cebadores (Fi-
gura 3.13). En un mismo tubo de reacción se realizan
las PCRs múltiples de diferentes regiones microsaté-
lite del genoma, combinando fragmentos de diferente
tamaño y cebadores marcados con �luorocromos dis-
tintos. Este mismo método se puede emplear para
identi�icar pequeñas deleciones o inserciones.
También se han descrito CNVs que correspon-
dan a regiones del genoma que contienen uno o más
genes por completo. Para medir el número de co-
pias de un gen se pueden utilizar sondas TaqMan.
Para ello, se compara la ampli�icación obtenida con
una sonda TaqMan que ampli�ica el gen o región
cuyo número de repeticiones se quiere conocer y
otra que ampli�ica una región altamente conserva-
da en cuanto a número de copias, que se utilizará
como referencia.
94
Técnicas para detectar pequeñas inserciones o
deleciones
Si el fragmento insertado o delecionado es medio
(desde 10 a 1000 nucleótidos), este se puede de-
tectar mediante una PCR y un análisis del tamaño
de la ampli�icación mediante electroforesis, bien en
gel de agarosa o en electroforesis en chip. Para ello
se hace una PCR utilizando dos oligonucleótidos
que �lanqueen a la región insertada o deleciona-
da. La diferencia de tamaño entre los dos posibles
fragmentos ampli�icados será igual al tamaño de la
inserción/deleción. Por último, si se tiene una in-
serción/deleción de menos de 10 nucleótidos, el
método electroforético elegido será aquel que per-
mita resolver diferencias tan pequeñas, es decir un
gel de acrilamida (Figura 3.14). Si uno de los oli-
gonucleótidos empleado en la PCR se marca con
una molécula �luorescente se pueden detectar fá-
cilmente los productos de la ampli�icación en un
secuenciador automático.
3.3.3. PCR a tiempo real y expresión génica
El RNA mensajero (mRNA) es la molécula indicado-
ra de la expresión de un gen. Desde hace décadas los
investigadores han tratado de conocer qué genes se
expresan en los distintos tejidos y tipos celulares,
qué genes cambian su expresión como consecuen-
cia de un fenómeno biológico o de la exposición a
un agente externo o a un fármaco, o qué genes se
pueden utilizar como biomarcadores pronósticos
de una enfermedad o predictivos de respuesta a una
determinada terapia. En general, para el estudio de
la expresión de genes existen dos abordajes. Por un
lado, si se sabe qué genes pueden participar en un
proceso determinado, solo se cuanti�ican esos ge-
nes. Sin embargo, a menudo no hay una idea clara
de qué genes pueden estar participando en el pro-
ceso en estudio e interesa tener una vista global de
los genes que se están expresando. Así, el número
de RNAs distintos a estudiar va a condicionar por
completo la técnica a emplear. Antiguamente se es-
tudiaba gen a gen en un laborioso proceso, como
por ejemplo el northern blot, que podía llevar algu-
nos días e incluso semanas. Sin embargo, hoy en día
se dispone técnicas que permiten conocer la expre-
sión de gran número de genes en unas horas.
La PCR a tiempo real tras una retrotrans-
cripción es una técnica que permite estudiar la
expresión de unos pocos a centenares de genes de
una manera sencilla, rápida y económica. Para em-
pezar, se necesita convertir la molécula de RNA
en una molécula de DNA. Este proceso se deno-

Figura 3.14: Genotipado por tamaño de fragmentos. Estudio de inserción de 2 nucleótidos en
gen UGT1A1. Se distinguen los tres posibles genotipos: (A) Homocigoto salvaje (ampli�icación
185 nucleótidos), (B) Heterocigoto (ampli�icaciones de 185 y 187 nucleótidos), (C) Homoci-
mina retrotranscripción y es llevado a cabo por
retrotranscriptasas en presencia del RNA, desoxi-
nucleótidos y un oligonucleótido que actúa como
cebador. En una retrotranscripción se pueden
utilizar varios tipos de cebadores: oligo dT, que
aprovecha que los mRNA en su extremo 3’ tienen
una cola de adeninas; una mezcla de hexámeros o
decámeros degenerados, que como tienen múlti-
ples secuencias van a reconocer distintas zonas
de las moléculas de RNA, u oligonucleótidos espe-
cí�icos, si se quiere ampli�icar solo una secuencia
especí�ica. Como se trata de una PCR a tiempo real,
se necesita una molécula �luorescente que permi-
ta la cuanti�icación del RNA de los genes de interés.
Tras la retrotranscripción, se obtendrá DNA, por
lo que los métodos de detección serán idénticos a
los mencionados anteriormente. Los más usuales
son el uso de �luoróforos inéspecí�icos, como SYBR
Green, o el uso de sondas especí�icas, tipo TaqMan.
La expresión de RNA por PCR a tiempo real se
puede realizar de dos maneras, cuantitativa y se-
micuantitativa. En la cuantitativa se determina el
número absoluto de moléculas de un determinado
RNA. Para ello, hay que crear una curva estándar
con diluciones de un RNA de concentración cono-
cida y extrapolar el dato obtenido con la muestra
problema en la curva. En la semicuantitativa se tra-
95
Análisis de ácidos nucleicos
ta de comparar la expresión del gen problema con
la de otro que se utilizará como referencia. En este
sentido, hay un grupo de genes, denominados de
expresión constitutiva o housekeeping, cuya expre-
sión permanece con muy poca variación a lo largo
de diferentes condiciones, que son frecuentemen-
te utilizados como gen de referencia. En este grupo
se encuentran genes como GAPDH, RP18S, HPRT1 y
ACTB, entre otros.
El método clásico de análisis es el 2-Ct. Para
entender este método de análisis hay que tener pre-
viamente claros una serie de conceptos (Figura
3.15). Threshold o umbral es el punto en el que la
ampli�icación es exponencial y por lo tanto los datos
comparables entre distintas muestras. Ct es el nu-
mero o fracción de ciclo que para una ampli�icación
determinada corta con la línea del threshold. Ct es
la diferencia de Ct para una misma muestra entre
el gen de estudio y el gen de referencia. Ct es
la diferencia en dos muestras diferentes entre dos
Ct para el mismo gen usando el mismo gen de re-
ferencia. Así, una diferencia de Ct de 1 signi�ica
que para el gen X en dos muestras diferentes (con-
trol y problema) hay una diferencia normalizada
de 1 ciclo, lo cual asumiendo que en cada ciclo de
ampli�icación se tiene el doble de producto ampli-
�icado, supone que en la muestra problema el gen
 Métodos en biociencias
diseñados para el estudio de la expresión de genes,
hoy en día se utilizan para múltiples aplicaciones:
Figura 3.15: Esquema ilustrando el método Ct en un ejemplo imagina-
rio de un gen X 8 veces más expresado en un tejido enfermo (enfer) que en un
tejido sano utilizando un gen como normalizador (norm).
X se expresa el doble que en la muestra control. La
conversión a 2-Ct se suele hacer para conocer el
ratio o número de veces que un gen está expresado
en una muestra con respecto a otra.
3.3.4. Microarrays
Los microarrays o micromatrices surgen como tal
en el año 1995 a medida que la robótica y la quí-
mica permiten la miniaturización de soportes para
el anclaje de ácidos nucleicos, y los sistema digita-
les de imágenes permiten una resolución de unas
pocas micras. Se denomina microarray a cualquier
super�icie que contiene inmovilizados desde unos
pocos a millones de ácidos nucleicos o proteínas di-
ferentes de manera ordenada. Los más extendidos
son los de ácidos nucleicos, concretamente de oli-
gonucleótidos, aunque inicialmente fueron de DNA
complementario. Los microarrays se pueden fabri-
car en el laboratorio con el uso de un robot o bien
adquirir comerciales. En la actualidad tanto la cali-
dad de los microarrays comerciales como el precio
hacen que sea esta última la elección mayoritaria.
El segundo elemento en un microarray es la
muestra que se pretende analizar: RNAs tanto men-
sajeros como no codi�icantes, DNA genómico o
proteínas. Estas muestras deben ser procesadas y
marcadas de manera que permitan cuanti�icar la se-
ñal que se produce en cada punto del microarray.
96
Aunque inicialmente los microarrays fueron
— Microarrays de mRNA. La aplicación prin-
cipal es cuanti�icar la expresión de genes.
Con este tipo de microarrays se pueden
obtener per�iles de expresión génica glo-
bales para una muestra determinada. Se
pueden comparar per�iles de expresión
entre dos o mas muestras que represen-
ten condiciones diferentes, como por
ejemplo, células tumorales y sanas, mues-
tras antes o después de un tratamiento, o
muestras de pacientes que han respondi-
do o no a un tratamiento determinado.
También se puede clasi�icar un tumor y
dar un pronóstico de evolución en fun-
ción del per�il de expresión del mismo.
Una variación de estos microarrays son
los que representan secuencias exónicas.
Estos permiten obtener información so-
bre transcritos alternativos por utilización
de diferentes sitios de splicing.
— Microarrays de RNAs no codi�icantes. Con
las mismas utilidades que los microarrays
de RNA codi�icantes, pero que proporcio-
nan información acerca de estos RNAs
reguladores.
— Microarrays ChIP-on-chip. Combinan la in-
munoprecipitación de cromatina (ChIP)
con un microarray de DNA. De esta mane-
ra se puede conseguir información sobre
las regiones del DNA a las que se une una
determinada proteína y qué genes son
regulados por ella o identi�icar regiones
hipermetiladas en estudios epigenéticos.
— Microarrays de SNPs. Si lo que se tiene
impreso en los microarrays es DNA con
las dos posibles secuencias de un SNP
se puede determinar el genotipo de esa
muestra para un SNP determinado. De
la misma manera, se pueden determi-
nar pequeñas inserciones o deleciones y
número de copias de un gen. De hecho,
todos estos tipos de variaciones se deter-
minan en un mismo microarray.
— Microarrays de CGH: en el microarray, se
tienen cientos de miles e incluso millones
de oligonucleótidos complementarios a
secuencias repartidas a lo largo del ge-
noma. Por otro lado, marcando un DNA
referencia con un �luorocromo y otro DNA
con otro �luorocromo se pueden identi�i-

Figura 3.16: Imagen de un microarray
de oligonucleótidos marcado con dos son-
das �luorescentes (rojo y verde). Se pueden
observar puntos correspondientes a genes
expresados de manera similar (amarillo), o
en una u otra condición (rojo y verde).Dis-
ponible en color.
car regiones sobre- o infra-representadas
en el DNA problema con respecto al de re-
ferencia, mapeando regiones con pérdida
o ganancia de material genético.
— Microarrays de proteínas. En realidad
lo que hay impreso en los microarrays
son péptidos que son hibridados con las
proteínas extraídas y marcadas de una
muestra y comparadas con la de otra (ver
con más detalle en capítulo 2).
El procesamiento de los microarrays es variable en
función de la aplicación y de la casa comercial que los
ha fabricado. En general, tiene los siguientes pasos:
— Marcaje y, en caso de ser necesario, am-
pli�icación de la muestra.
— Hibridación de la muestra con el mi-
croarray.
— Lavado y obtención de la imagen.
— Procesado de la imagen y cuanti�icación
de las señales.
— Normalización y análisis bioinformático.
97
Análisis de ácidos nucleicos
Existen multitud de métodos de marcaje de las son-
das (Figura 3.16), de ampli�icación de la muestra,
y es que cada casa comercial tiene tecnologías di-
ferentes. Algunas plataformas son completamente
cerradas y hacen todo el procesamiento de mane-
ra automática (Affymetrix, Illumina), mientras que
otras son más abiertas y permiten el uso de kits de
otras marcas (Agilent Technologies). En de�initiva,
antes de hacer un experimento con microarrays,
se tendrá que valorar qué pregunta se quiere res-
ponder, de qué presupuesto e infraestructura se
dispone y si se tienen los conocimientos necesarios
para el procesado del microarray y el análisis de da-
tos. En el caso de que no se dispusiera de los medios
técnicos y humanos para realizar este tipo de expe-
rimentos, afortunadamente, en muchos centros de
investigación y empresas hay unidades de genómi-
ca que pueden realizar todo el proceso.
3.4. Aplicaciones
La aplicación más extendida del análisis de ácidos
nucleicos es el diagnóstico. Gracias a las técnicas
en ácidos nucleicos se pueden diagnosticar hoy en
día multitud de enfermedades, antes incluso de que
aparezcan o del nacimiento de un individuo. En lo
concerniente al diagnóstico genético, la hibrida-
ción genómica comparativa o CGH está llamada a
ser la técnica principal para detectar alteraciones
estructurales cromosómicas en sustitución de los
tradicionales cariotipos, ya que, y a pesar de que
esta última técnica está implantada desde hace mu-
chos años, tiene un poder de resolución insu�iciente
para identi�icar el origen de muchas enfermeda-
des de origen genético. Aún así, un microarray de
CGH no es capaz de detectar translocaciones ba-
lanceadas, por lo que ambas técnicas tendrán que
coexistir. Las técnicas de microarrays han permitido
en los últimos años tener una herramienta reprodu-
cible y con mayor precisión para detectar zonas del
genoma en las que se ha producido una pérdida o
ganancia de material genético.
Sin embargo, las variaciones genéticas más
frecuentes son los SNPs, así como pequeñas inser-
ciones o deleciones. En la mayoría de los hospitales
hay laboratorios de biología molecular donde se
hace genotipado con diversas técnicas para identi-
�icar la causa de in�inidad de enfermedades. Estas
técnicas se realizan tanto en laboratorios de genéti-
ca como de microbiología, inmunología, bioquímica
o análisis clínicos.
Los per�iles de expresión de genes, bien me-
diante microarrays o mediante qRT-PCR, están
Métodos en biociencias
utilizándose para diagnóstico molecular de tumo-
res y complementar el diagnóstico microscópico
realizado por patólogos, alcanzándose un grado de
diagnóstico impensable hace solo unos pocos años.
Así, por ejemplo, midiendo la expresión de un pe-
queño grupo de genes en una muestra tumoral se
puede calcular el riesgo de recaída de una manera
mucho más precisa que únicamente con el análi-
sis del corte histológico. De esta manera, se puede
conocer mejor el pronóstico de pacientes con algu-
nos tipos de cáncer y elegir el mejor tratamiento
posible. Esta mejor caracterización del tumor está
cambiando el tratamiento que reciben muchos pa-
cientes evitando dar quimioterapia a quien antes se
le daba y no lo necesitaba, y dándosela a quien tiene
un alto riesgo de recaída y antes no se le trataba. A
nivel de investigación hay miles de estudios identi�i-
cando marcadores de expresión génica para de�inir
tanto el pronóstico de la enfermedad como la pre-
dicción de la respuesta al tratamiento, pero solo
unos pocos han llegado en la actualidad a la prác-
tica clínica.
El análisis genético también permite la iden-
ti�icación de microorganismos. Esto cobra especial
relevancia en medicina ya que se puede establecer
qué cepa está infectando a un paciente concreto y
seleccionar el mejor tratamiento posible. Además
los análisis genéticos pueden ser más precisos y di-
ferenciar cepas que de otra manera sería imposible
o muy laborioso.
En los últimos años se empieza a hablar de
farmacogenómica que es la parte de la genética
que estudia las variaciones, tanto en la secuencia
de DNA como en la expresión de los genes, en re-
lación en la respuesta a los fármacos. Se sabe que
la mayor parte de los fármacos no son efectivos en
el 100% de los pacientes. De hecho, hay grupos de
fármacos, como los utilizados en oncología, cuya
efectividad media está por debajo del 30%. Además,
la toma de medicamentos, que no dejan de ser un
elemento ajeno al organismo, provoca muy frecuen-
temente efectos adversos que pueden llegar incluso
a la muerte. Hoy se sabe que la genética del indi-
viduo y la enfermedad son factores fundamentales
en la respuesta a los fármacos. La farmacogenética
está cambiando el tradicional modelo empleado en
la medicina durante siglos de «ensayo-error» por
el de una medicina personalizada. Así, el análisis
de ácidos nucleicos en los laboratorios de farma-
cogenómica está permitiendo seleccionar el mejor
fármaco, a la mejor dosis para el paciente adecua-
do. Por ejemplo, en cáncer de colon, se utiliza un
fármaco, cetuximab, el cual se ha visto que única-
mente bene�icia a aquellos pacientes cuyo tumor
98
no tiene la vía del gen KRAS dañada por variaciones
de un único nucleótido. Esta asociación es tan clara
que es obligatorio determinar el genotipo de KRAS
previamente a la administración del fármaco, de
modo que solo se autoriza a los pacientes sin KRAS
mutado. Igualmente, en otros campos como enfer-
medades infecciosas, hay marcadores genéticos que
permiten, por ejemplo, identi�icar pacientes porta-
dores del virus de la inmunode�iciencia humana
(VIH) que pueden tomar el antirretroviral abaca-
vir sin ningún temor a desarrollar una reacción de
hipersensibilidad al fármaco, hecho que se da en el
4-8% de los pacientes y puede llegar a ser mortal.
En hepatitis C existe un SNP (rs12979860) que de-
�ine a una población de pacientes con una mayor
probabilidad de resolver la enfermedad de mane-
ra espontánea, así como de responder a la terapia
con interferón/ribavirina. Estos ejemplos no hacen
más que crecer en todos los campos de la medicina
y en todos ellos las técnicas de genotipado que se
han tratado aquí son de gran utilidad.
Una de las aplicaciones más relevantes deriva-
das del análisis del genoma es el de la identi�icación
de individuos llevada a cabo en Genética Forense. El
genoma humano consta de unos 3x109 pb, de los
que únicamente alrededor del 1-2% codi�ica para
proteínas funcionales. Por lo tanto, el genoma está
formado en su mayor parte por secuencias no co-
di�icantes o no informativas en cuanto a la síntesis
de RNA. Este DNA no codi�icante tiene una menor
presión selectiva y un número de copias por geno-
ma que es muy variable entre los individuos, lo que
hace que sea una fuente de polimor�ismo de gran
utilidad en las pruebas de identi�icación forense.
La determinación de microsatélites o STRs se
ha convertido en el método más empleado para la
identi�icación genética generándose cada año millo-
nes de per�iles de STRs con diversos objetivos, que
incluyen casos criminales, búsqueda de personas
desaparecidas, desastres masivos, test de paterni-
dad, etc… A pesar del elevado número de regiones
STR en el genoma, solo es necesario el análisis de
10 a 15 gracias a la alta heterocigosidad de este tipo
de marcador (>70%), con una alta proporción de
alelos posibles para cada una de las regiones y por
tanto con un gran poder de discriminación. Actual-
mente hay disponibles en el mercado numerosos
kits de identi�icación de STRs siendo el más co-
nocido el desarrollado por el FBI estadounidense
basado en 13 STRs tetraméricos y que ha genera-
do una base de datos denominada CODIS (combined
DNA index system). Cuando se obtiene el per�il gené-
tico de un individuo para los 13 loci STR del CODIS
(26 alelos en total), la probabilidad de que alguien

tenga la misma combinación es de 1 en 100 billo-
nes. El CODIS almacena per�iles obtenidos mediante
el método descrito anteriormente en dos bases de
datos diferenciadas; una con per�iles STR de indi-
viduos condenados por casos criminales y otra con
per�iles STR de casos sin resolver. Cuando se reali-
za un per�il STR con el método CODIS, el resultado
se compara automáticamente con los per�iles alma-
cenados en esta base de datos, de tal manera que en
caso de coincidencia se podría con�irmar la autoría
de un crimen.
El abaratamiento y la rapidez de las nuevas
técnicas de secuenciación genómica también han
abierto la posibilidad de su uso en pruebas de iden-
ti�icación, ya que el conocimiento de la secuencia
del genoma completo no ofrecería ninguna duda
sobre la identidad de la muestra analizada. Sin em-
bargo la gestión y almacenamiento de la cantidad
ingente de datos generados es un problema todavía
sin resolver, aunque es un buen sistema para buscar
nuevos SNPs informativos para análisis de identi�i-
cación forense futuros.
Los estudios genéticos se están extendien-
do a otros ámbitos, como la seguridad y control de
calidad de alimentos. Así, por ejemplo, se puede
identi�icar si hay trazas contaminantes de caballo
en carne picada vendida como de ternera. Para ello
solo se tiene que hacer una PCR con oligonucleóti-
dos que reconozcan una secuencia especí�ica en el
DNA de caballo. También se utilizan test genéticos
para determinar trazas de alimentos transgénicos
en productos que supuestamente no lo son.
99
Análisis de ácidos nucleicos
Estas son solo algunas de las múltiples apli-
caciones de las técnicas experimentales con ácidos
nucleicos que son ya hoy una realidad y una muy
pequeña muestra de las que habrá en un futuro cer-
cano.
Bibliografía
DNA Microarrays. 2008.
Schena M (ed). Scion Publishing. ISBN 978-1904842156.
Forensic DNA Applications: An Interdiciplinary Perspec-
tive 2014.
Primorac D, Schanfield M (eds). CRC Press. ISBN 978-
1466580220.
Lewin Genes. Fundamentos. 2012.
Krebs JE, Goldstein ES, Kilpatrick ST. Editorial Médica Pa-
namericana. ISBN 978-6077743385.
Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2012.
Green MR, Sambrook J. Cold Spring Harbor Laboratory
Press. ISBN 978-1936113422.
Next-Generation Sequencing: Current Technologies and
Applications. 2014.
Jianping X (ed). Caister Academic Press. ISBN 978-
1908230331.
PCR. Methods Express. 2007.
Hughes S, Moody A. Scion Publishing. ISBN 978-
1904842286.
Pharmacogenetics and Pharmacogenomics. 2012.
Altman RB, Flockhart D, Goldstein DB (eds). Cambridge
University Press. ISBN 978-0521885379.

Cultivos celulares
Los estudios desarrollados con material biológi-
co vivo fuera del propio organismo se denominan
estudios in vitro; por el contrario, aquellos que se
desarrollan sobre animales o plantas enteros se con-
sideran estudios in vivo. Los estudios in silico son
los que se realizan de forma simulada en un com-
putador, sin emplear material vivo o seres vivos. El
término cultivo hace referencia a la técnica o proce-
so que permite el mantenimiento y/o crecimiento
del material biológico. En el momento actual se pue-
den de�inir cinco tipos de cultivos in vitro: cultivo de
embriones, cultivo de órganos, cultivo de explantes,
cultivo organotípico/histotípico y cultivo de células.
El cultivo de embriones tiene como objetivo per-
mitir el desarrollo de embriones, ya sea con �ines
reproductivos, como suele ser usual en las técnicas
de fertilización in vitro, o para estudiar desarrollo
embriológico. En el cultivo de órganos se mantie-
ne vivo, fuera del cuerpo, un determinado órgano
ya formado, por ello no se produce propagación ce-
lular, y el crecimiento suele ser pequeño. El cultivo
de explantes consiste en colocar, en el dispositivo
de cultivo, un pequeño fragmento de un órgano a
partir del cual pueden crecer, migrar y expandirse
algunas de las células que forman parte de dicho ór-
gano. Los cultivos organotípicos son aquellos que
contienen diferentes tipos celulares que pueden in-
4.
Guillermo Bodega
Juan Manuel González-Triguero
José Luis Copa Patiño
teraccionar entre sí y acabar generando un órgano
funcional lo más parecido posible al original; en el
cultivo histotípico el objetivo es generar un tejido.
En ambos casos se persigue la creación in vitro de
órganos o tejidos para utilizar en injertos o trans-
plantes; la disciplina que se ocupa de ello recibe el
nombre de ingeniería de tejidos. Por cultivo de cé-
lulas se entiende el crecimiento y expansión in vitro
de células obtenidas de un determinado tejido por
disgregación espontánea, mecánica o enzimática. Es
el modo más habitual de cultivo, por lo que será el
tipo de cultivo al que se dedicará mayoritariamente
este capítulo. Los métodos y condiciones de cultivo
de células animales, vegetales y microorganismos
son diferentes; por ello en los últimos epígrafes de
este capítulo se analizarán las peculiaridades que
conlleva el cultivo de material biológico de origen
vegetal y el de microorganismos.
Los estudios in vitro se diseñaron como una
herramienta que habría de permitir la reproduc-
ción total o parcial de las condiciones existentes
in vivo. El primer intento fue realizado por Roux
en 1885 con células de embrión de pollo. Los tra-
bajos de Harrison (1907), utilizando explantes de
médula espinal de an�ibios, Carrel (premio Nobel de
Medicina y Fisiología en 1912) y Burrows (1913),
y Rous y Jones (1916) fueron el cimiento que per-
Métodos en biociencias
mitió el despegue y desarrollo del cultivo celular en
las décadas de los 50 y 60, donde destacan los tra-
bajos de Eagle (1955), Dulbecco (premio Nobel de
Medicina y Fisiología en 1975), Ham (1963) y Sato
(�inales de los años 60), dedicados principalmente
al establecimiento de las condiciones de cultivo y la
formulación de medios de cultivo.
El aporte de las técnicas de cultivo celular
en el campo de las biociencias ha sido capital en
el desarrollo de muchas disciplinas; por ejemplo,
el conocimiento actual sobre el ciclo celular o las
vías de señalización intracelulares en el campo de
la Biología Celular hubiese sido impensable sin la
ayuda de los cultivos celulares. La Embriología es
otra de las disciplinas donde las técnicas de culti-
vo celular han tenido un gran impacto. Por último,
la aplicación de las técnicas de cultivo celular tam-
bién ha sido esencial en el desarrollo del campo de
la reproducción asistida, de la terapia celular, o de la
biotecnología, ejemplo de este último campo son
la obtención de anticuerpos monoclonales y el
aislamiento y expansión de células madre.
4.1. Cultivo de células animales
4.1.1. El laboratorio de cultivo
La peculiaridad de las técnicas de cultivo aconse-
ja, siempre que se pueda, disponer de laboratorio
y personal destinado exclusivamente a tal �in. Esto
deja de ser aconsejable y pasa a ser obligatorio
cuando se cultivan seres vivos o células con peligro
potencial o real. En este apartado solo se considera-
rán las condiciones idóneas de trabajo para el caso
de cultivos con una peligrosidad baja o nula, pues el
cultivo de células peligrosas está regulado por una
normativa muy estricta que exige dar cumplimien-
to a unos requerimientos que no se atenderán en
este capítulo.
Si se dispone de un laboratorio dedicado exclu-
sivamente al cultivo de células, este debería –como
mínimo– disponer de un sistema de ventilación
propio, con presión positiva de aire para evitar su
entrada desde el exterior, una zona intermedia para
cambiar de batas y evitar contacto directo entre el
exterior y el interior del laboratorio, y un sistema
de iluminación especial con lámparas germicidas;
además, el equipo necesario debería estar incluido
al completo en el laboratorio para evitar continuas
salidas y entradas de la sala, que incrementan el
riesgo de contaminación y conllevan errores de ma-
nipulación y pérdidas de tiempo.
El equipamiento básico de un laboratorio de
cultivos debe incluir: incubador de CO2, cabinas de
102
�lujo laminar, sistemas de esterilización, micros-
copio, dispositivos de enfriamiento (frigorí�icos y
congeladores), centrífuga y almacén de material
fungible de diseño exclusivo (altamente ergonómi-
co) que comprende material de disección, pipetas,
botellas de vidrio con tapón, placas de cultivo Petri
y multipocillo (también llamadas de microtitula-
ción, multiwell plates), frascos (�lasks), tubos tipo
Falcon, �iltros, jeringas...
— Incubador de CO2. Es una cámara estan-
ca que permite la regulación exacta de la
temperatura y de la concentración de ga-
ses con un dispositivo que moviliza estos
para conseguir una mezcla homogénea.
La mayoría de los incubadores regulan
únicamente la concentración de CO2, aun-
que hay algunos que regulan CO2 y O2. La
humedad necesaria se consigue intro-
duciendo agua en la parte inferior de la
cámara con lo que la atmósfera está satu-
rada de humedad. Esta agua ha de incluir
algún producto para impedir el crecimien-
to de microorganismos. La temperatura
para células de mamífero suele ser de
37° C y un 5% de CO2. La concentración
de CO2 debe controlarse cuidadosamen-
te puesto que, además de corresponder a
la que están expuestas las células in vivo,
determina la estabilidad del tampón del
medio donde crecen las células. De acuer-
do con la ecuación inferior, un aumento
de protones causado por el metabolismo
de las células sería amortiguado por el bi-
carbonato del medio de cultivo.
CO2 + H20 ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-
Un aumento brusco de CO2 provocaría
una bajada de pH pues desplazaría el
equilibrio hacia la derecha y, al contrario,
una brusca bajada de CO2 determinaría la
basi�icación del medio. Este último es un
hecho fácil de comprobar, basta con sa-
car un recipiente de cultivo del incubador
(5% CO2) y dejarlo al aire (0.5% CO2) e in-
mediatamente el color del indicador de
pH que lleva el medio de cultivo adquiere
tonos bermellones y violetas que indican
un pH básico.
También existen estufas secas y sin
gas para otros tipos de cultivos, que no
son sino dispositivos en los que solo se
controla la temperatura. En este caso el
recipiente donde se cultivan las células
 Cultivos celulares

Figura 4.1: Esquema de diferentes tipos de cabinas: �lujo horizontal (A), clase I (B), cla-
se II (C) y clase III (D).

ha de estar herméticamente cerrado por rador y del medio ambiente, y al revés,

lo que se ha de vigilar y cambiar más fre-
cuentemente el medio.
— Cabinas de �lujo. También llamadas cá-
maras de �lujo. Son aparatos dotados de
un sistema de propulsión y esterilización
del aire por �iltrado para conseguir una
zona de trabajo donde el aire es estéril.
Su función es proteger al cultivo del ope-
al operador y al medio ambiente del cul-
tivo. Existen varios tipos de cámaras que
abordan esta función de manera diferen-
te (Figura 4.1).
• Flujo laminar horizontal. Estas
cabinas no ofrecen protección al
operario ni al medio, sí al cultivo.

103
Métodos en biociencias
El aire sale por el frente de la cam-
pana y �luye hacia fuera. No han de
usarse en caso de que el cultivo ten-
ga un riesgo potencial o efectivo.
• Clase I. Estas cabinas protegen
principalmente al operario y se
usan en áreas totalmente estériles.
El aire �luye desde el frontal, pasa
el operario y sale por la parte alta
de la cabina, una vez �iltrado.
• Clase II. Estas cabinas son las más
ampliamente utilizadas. Como se
puede observar en la �igura 4.1, el
aire �luye desde la parte superior y
es absorbido por la rejilla de la su-
per�icie de trabajo.
• Clase III. Estas cabinas están
diseñadas para el cultivo de
microorganismos altamente peli-
grosos. El operario está totalmente
separado del cultivo por una
barrera completa. El frontal posee
unas zonas, por donde el operario
introduce las manos, que terminan
en forma de guante. El aire es
�iltrado antes de entrar y salir de
la cabina.
Uno de los componentes más importan-
tes de las cabinas son los �iltros HEPA
(high ef�iciency particulate air) y ULPA
(ultra low penetration air) basados en
el empleo de micro�ibras de vidrio. Los
HEPA son altamente e�icientes (99.95%)
para partículas cuyo tamaño es de 0.3 μm
o superior, y los ULPA tienen e�iciencias
del 99.99% para partículas de 0.1 μm o
superior por lo que sirven para retener
virus. Considérese que el tamaño de la
mayoría de las bacterias oscila entre 1 y
3 μm, y el de la mayoría de los virus entre
0.1 y 0.4 μm.
— Sistemas de esterilización. Son absolu-
tamente esenciales en un laboratorio
dedicado al cultivo celular, y muy varia-
dos en función de la naturaleza y tamaño
y/o cantidad del material a esterilizar. El
sistema más ampliamente utilizado es
el autoclave, que esteriliza por calor hú-
medo: 20 min a 120 °C y 2.5 bares de
presión. El horno Pasteur, calor seco,
mantiene los objetos a 160 °C durante 1
hora. La comprobación de que el proce-
so de esterilización ha sido correcto se
hace colocando unas cintas adhesivas
104
que cambian de color. La esterilización
por �iltración se hace utilizando �iltros de
acetato o nitrato de celulosa de 0.20 μm y
se puede llevar a cabo mediante presión
positiva (empujando el �luido a �iltrar) o
negativa (succionándolo por bomba de
vacío), y es útil para líquidos que llevan
componentes termolábiles –los medios de
cultivo por ejemplo– que impiden su es-
terilización en autoclave u horno Pasteur.
Otros medios alternativos son la radia-
ción γ, la UV o la llama. La radiación γ es
muy útil para el material plástico que no
resiste calor, y la luz UV, por su escaso po-
der de penetración, se emplea más como
un sistema de prevención para evitar que
proliferen bacterias en las super�icies que
son expuestas a ella; por ello, este tipo de
lámparas suele ir en el techo de las cabi-
nas de �lujo y en el laboratorio de cultivo.
Estas lámparas UVGI (ultraviolet germici-
de irradiation) emiten en torno a los 253
nm (UV-C) con una irradiación próxi-
ma a los 0.4 μw/cm2 a 1 m de distancia.
Suaves pases por llama se dan habitual-
mente a algunos de los materiales que se
usan rutinariamente en el proceso de cul-
tivo (bocas de botellas y de tubos Falcon,
tapones, agujas de jeringas, puntas de pi-
petas, material de disección...), por ello en
la cabina de �lujo siempre hay un meche-
ro de gas.
— Microscopio. Es una herramienta funda-
mental en un laboratorio de cultivo pues
permite observar la evolución del culti-
vo, el estado de las células, su adherencia,
grado de recubrimiento, recuento u otras
características morfológicas como tama-
ño, prolongaciones... Es imprescindible
que sea de tipo invertido y con contras-
te de fase (ver capítulo 7, epígrafe 7.2.5).
La inversión es necesaria pues el espesor
de los recipientes donde se cultivan las
células es bastante grande y no permite
acercar el objetivo a la célula a la distan-
cia focal correcta. El contraste de fases
también es necesario pues se han de ob-
servar células vivas y no están teñidas.
Además de este tipo de microscopio, tam-
bién suele ser necesaria la presencia de
un microscopio estereoscópico para ayu-
darse en los casos en que sea necesario
llevar a cabo procesos de disección.
— Dispositivos de enfriamiento. Incluyen fri-
gorí�icos y congeladores, y son necesarios

Figura 4.2: Placas Petri y multipocillo (multiwell) de 6, 12, 24 y 96 pocillos (A). Flasks (B) y tubos Falcon (C) de
diferentes tamaños.
pues multitud de reactivos empleados en
los cultivos han de almacenarse o guar-
darse a 4 °C o congelados (-25 y -80 °C).
Además, en el caso de preservar cultivos
por congelación, también es imprescindi-
ble el uso de sistemas de congelación por
nitrógeno líquido (-196 °C) o en atmósfe-
ra de nitrógeno líquido (-170 °C).
— Centrífugas. Normalmente se usan de
baja velocidad, no más de 300g, pues no
es bueno centrifugar suspensiones celu-
lares a más de 200g porque las células
corren el riesgo de dañarse al chocar con-
tra el plástico o vidrio a gran velocidad, o
de reventarse al comprimirse en el fondo
del tubo. Es importante que sean refrige-
radas y que dispongan de un sistema de
rotores o adaptadores que permitan cen-
trifugar los distintos tipos de recipientes
–y de distintos tamaños– donde se cul-
tivan y/o trans�ieren las células (tubos,
placas Petri y multipocillo, �lask…).
— Material. Hace algunos años el mate-
rial que se usaba era de vidrio y tenía
que ser lavado cuidadosamente y este-
rilizado; hoy día, sin embargo, la mayor
parte del material es desechable (placas
Petri, placas multipocillo de 6, 12, 24 o 96
pocillos, pipetas, puntas para micropipe-
tas, �lasks, jeringas, �iltros... (Figura 4.2).
Normalmente todo ello es de plástico es-
terilizado por radiación γ. El material
reutilizable más usual suele ser el de di-
sección y algunos recipientes de vidrio
como las clásicas botellas con tapón.
4.1.2. Técnica aséptica
Consiste en un conjunto de reglas y modos de ope-
rar que tiene como �in evitar la contaminación del
105
Cultivos celulares
cultivo y la contaminación del operario. Entre todas
ellas se citan solo las más básicas:
— Limpieza previa de manos con jabón o
etanol de 70°.
— Uso de bata, guantes y mascarilla (si es
necesario). Bata y mascarilla deben estar
limpias y los guantes estériles.
— Tener la certeza de que se usa material
estéril; ante la duda se ha de considerar
no estéril y desechar.
— Revisión y limpieza de los aparatos, espe-
cialmente cabinas de �lujo e incubador. En
relación con la cabina es necesario com-
probar periódicamente que el �iltro es
efectivo y no está contaminado, y que el
valor del �lujo de aire oscila entre 0.3 y 0.5
m/s. En relación con la estufa conviene
comprobar que los valores de temperatu-
ra y concentración de CO2 indicados son
correctos. La limpieza del interior de la
cabina y del incubador se puede hacer
con alcohol de 70° o, mejor aún, con pro-
ductos especí�icos destinados a tal �in.
— Depuración en la técnica de rutina, es
decir, la manipulación del material o su
colocación y distribución en la cabina de
�lujo.
4.1.3. El medio de cultivo
Composición y clasificación
El medio en el que crecen las células, llamado por
ello medio de cultivo, va a tener una importancia
crucial por su triple objetivo: reproducir un am-
biente lo más parecido posible al que las células
tienen in vivo, permitirles crecer (aumentar en ta-
maño) y proliferar (aumentar en número). Desde
un punto de vista �ísico existen medíos líquidos
Métodos en biociencias
y medios sólidos (geles), estos últimos son más
utilizados en cultivos vegetales y de microorganis-
mos por lo que se estudiarán al �inal del capítulo.
Desde un punto de vista químico, el medio de cul-
tivo se puede de�inir como una disolución acuosa
que incluye material inorgánico (sales) y orgánico
(nutrientes fundamentalmente) a la que se puede
y/o debe añadir diferentes suplementos. Por ello, la
composición de los medios de cultivo es muy com-
pleja y abrumador el número de medios de cultivo
distintos debido a diferencias cualitativas y cuanti-
tativas en su formulación; sin embargo, todos ellos
poseen una serie de requerimientos básicos:
— El medio de cultivo ha de actuar como
tampón (pH 7.2-7.6). Para ello suelen
llevar un tampón fosfato al que se aña-
de bicarbonato (2.2 g/L) y/o HEPES (20
mM), este último sobre todo cuando no se
usa CO2.
— El medio ha de ser isotónico (310 mOsm
en humanos). El compuesto más usa-
do para corregir la presión osmótica es
el NaCl, aunque también se suelen usar
el Ca2Cl y el KCl. Además, algunos de es-
tos iones también sirven para facilitar la
unión de las células al sustrato o actúan
como cofactores.
— El medio de cultivo ha de ser fuente de
(1) energía, (2) aminoácidos y (3) lípidos.
Como fuente de energía se suele añadir
glucosa o derivados como el pirúvico; ga-
lactosa y fructosa también pueden ser
incluidas. Aminoácidos se añaden casi
todos y de forma más abundante glutami-
na (o algún derivado como el glutamax),
pues actúa como fuente principal de C y
N. Los lípidos más usuales son ácidos gra-
sos y colesterol.
— El medio de cultivo actúa como indicador
de pH. Para ello se le suele añadir rojo fe-
nol que torna hacia tonos anaranjados y
amarillos al irse acidi�icando y hacia ber-
mellón y violeta si se basi�ica.
Los suplementos, en sentido estricto, son aquellos
compuestos que han de ser añadidos al medio de
cultivo para que este alcance su composición de-
�initiva. Según este criterio no todos los medios
necesitan ser igualmente suplementados; ello de-
pende de la composición del medio de partida. Por
ejemplo, algunas de las vitaminas del grupo B (tia-
mina (B1), ribo�lavina (B2), niacina (B3), ácido
pantoténico (B5), piridoxina (B6), biotina (B7/B8),
ácido fólico (B9) o cobalamina (B12)) son constitu-
106
yentes usuales e importantes del medio de cultivo,
y en algunos casos hay que añadirlas como suple-
mento, pero en otros ya están incluidas en el medio
de cultivo, por lo que no deberían ser consideradas
como tal.
Los dos suplementos más importantes y ha-
bituales de un medio de cultivo son el suero fetal
bovino (FBS, fetal bovine serum) y los antibióticos.
El empleo o no del suero provoca la aparición de dos
grandes tipos de medios de cultivos: los no de�ini-
dos (con suero) y los de�inidos (serum-free media).
A los medios de cultivo con suero o no de�inidos se
les suele añadir 10-15% de FBS, pues aporta los nu-
trientes y factores que ayudan a las células a crecer
y, sobre todo, a proliferar. El término «no de�inido»
se aplica porque el FBS incluye multitud de produc-
tos, no todos bien conocidos y de concentración no
determinada. A veces es usual utilizar el 10-15% de
FBS al inicio del cultivo, para ayudar a su expansión,
y luego pasar a condiciones de baja concentración
de suero, 0.5-1.5% de FBS (serum reduced media).
El FBS suele ser descomplementado para inactivar
factores del complemento que pudiesen afectar
a las células; esto se consigue calentándolo en un
baño a 56° C durante 30 min.
Los medios de�inidos, también llamados li-
bres de suero, son aquellos que no contienen FBS,
y existen distintos tipos: (a) los libres de suero pro-
piamente dichos, que no incluyen FBS pero pueden
tener extractos proteicos o lisados de origen ani-
mal; (b) los medios libres de proteína (protein free
media), que no incluyen ni FBS ni proteínas de ori-
gen animal, aunque pueden contener hidrolizados
de plantas y hongos, y (c) los medios químicamente
de�inidos (chemically de�ined media), que no contie-
nen ningún producto de naturaleza y concentración
desconocida. Los medios de�inidos suelen necesitar
suplementos, en mayor o menor número depen-
diendo del tipo de medio de cultivo, y entre ellos
destacan las proteínas transportadoras (albúmina,
transferrina…), hormonas (insulina, glucagón, hi-
drocortisona…), factores de crecimiento (GF, growth
factors), lípidos y/o aminas biogénicas como pu-
trescina.
Los antibióticos se añaden con un �in pre-
ventivo pues el objetivo es evitar la infección del
cultivo por microorganismos. Lo usual es utilizar
una mezcla de penicilina, estreptomicina y algún
antifúngico; gentamicina también es ampliamente
utilizado pues afecta a micoplasmas.
Clasi�icar los medios de cultivo no es fácil
por su enorme diversidad, pero una clasi�icación
muy general puede hacerse considerando su ori-
gen como criterio inicial. Por su origen los medios

Figura 4.3: Cultivo subcon�luente y con�luente (A1 y A2), y desarrollo de un clon (B1 y B2). A2 es un cultivo en masa, a
diferencia de B2, que lo es clonal.
de cultivo pueden ser naturales (extractos de �lui-
dos, tejidos u órganos) y arti�iciales. Estos últimos,
por su complejidad, se pueden clasi�icar en (a) so-
luciones balanceadas de sales (medio de Hank),
(b) medios basales (MEM, DMEM) y (c) medios
complejos; y por el empleo o no de suero –ya vis-
to anteriormente– en (a) medios no de�inidos) y (b)
medios de�inidos.
Los medios de uso más habituales son los no
de�inidos y entre ellos los más comunes son el BEM
(medio basal de Eagle), DMEM (medio de Eagle
modi�icado por Dulbecco), el MEM (medio esen-
cial mínimo) o el RPMI (Roswell Park Memorial
Institute), este último para células en suspensión.
Sin embargo, el uso de medios de�inidos va en au-
mento, y otro tanto ocurre con el empleo de medios
de cultivo especí�icamente diseñados para determi-
nadas estirpes celulares.
Medios condicionados, selectivos y diferenciales
Los medios condicionados reciben este nombre
porque han sido modi�icados por la actividad de
las células que han crecido en ellos. Básicamente
se obtienen del modo siguiente: una vez estableci-
do el cultivo se le cambia el medio y tras un periodo
de tiempo no muy largo con el �in de no agotar-
lo, ese medio se considera un medio condicionado
pues incorpora productos secretados por las cé-
lulas, y puede ser utilizado como medio de cultivo
para otras células. Los medios selectivos son aque-
llos que incluyen algún fármaco que permite el
desarrollo de unas estirpes o tipos celulares pero
no de otros. Aunque son distintos, es usual confun-
dir los medios selectivos con los diferenciales; estos
últimos permiten distinguir los diferentes tipos ce-
lulares que hay en el cultivo y son muy usados en
microbiología (ver epígrafe 4.3.2).
107
Cultivos celulares
4.1.4. Tipos de cultivos
En este epígrafe se van a considerar cultivos pri-
marios y líneas celulares establecidas, pero antes
es necesario de�inir un conjunto de términos
–estructurados como binomios antagónicos– que se
utilizan para diferenciar y cali�icar diferentes tipos
de cultivos: adherentes y en suspensión, primarios y
secundarios, en masa y clonales, con�luentes y sub-
con�luentes (Figura 4.3), monocapa y esferoides.
En los cultivos adherentes las células se �ijan
a un sustrato sobre el que crecen. No todas las cé-
lulas presentan la misma adhesividad al sustrato,
algunas son muy adhesivas (astrocitos, �ibroblas-
tos…), pero otras tienen una escasa adhesividad. En
este último caso se suele potenciar su capacidad de
adhesión recubriendo el material del recipiente de
cultivo con moléculas que hacen de puente entre el
sustrato y la célula; las más usadas son gelatina, co-
lágena, laminina, poli-L-Lis o poli-L-ornitina. Las
células en suspensión crecen �lotando en el medio y
suelen estar relacionadas con la respuesta inmune
o ser progenitores hemáticos.
Un cultivo con�luente es un cultivo adherente
en que todas las células están contactando unas con
otras sin dejar espacio entre ellas; en los cultivos
subcon�luentes, aunque hay contacto entre las célu-
las, todavía queda super�icie del sustrato sin ocupar.
Cultivo primario es aquel cuyas células derivan
directamente de las células de un órgano/tejido de
un ser vivo; las células de un cultivo secundario se
obtienen por resiembra a partir de un cultivo pri-
mario y, obviamente, un cultivo terciario se obtiene
a partir de un cultivo secundario. Los subcultivos se
deben obtener siempre antes de que las células al-
cancen la con�luencia, pues una vez con�luentes las
células salen de ciclo y el cultivo secundario es más
di�ícil de establecer.
Métodos en biociencias
Un cultivo en masa se obtiene cuando en el
recipiente de cultivo las células crecen sin que sea
posible establecer líneas de progenie entre ellas; sin
embargo, en el cultivo clonal las células crecen en
pequeños grupos de modo que cada grupo deriva
de una única célula progenitora.
El cultivo en monocapa (2D) indica que las cé-
lulas solo se extienden por el sustrato formando una
única capa y no crecen unas sobre otras. Los esfe-
roides son masas de células de formas redondeadas
y �lotantes; este modo de crecimiento es típico de
células tumorales. Los hemiesferoides –también lla-
mados islas multicapa– son estructuras intermedias
formadas por masas de células adheridas al sustra-
to donde las células pueden crecer unas encima de
otras. En los últimos años se han desarrollado estra-
tegias de optimización de cultivos en el campo de la
biotecnología que se denominan cultivos multicapa
o cultivos 3D, en este caso las células no crecen unas
encima de otras pues, en realidad, son dispositivos
formados por monocapas paralelas.
Cultivo celular primario
Es un cultivo originado directamente a partir de
células de un órgano o tejido del individuo. Para
obtener las células se usan dos procedimientos bá-
sicos: la técnica de explantes y la de disgregación.
En el primer procedimiento se trocea el tejido en
pequeños fragmentos que se siembran sobre la su-
per�icie del recipiente de cultivo. Es usual que en
este caso el medio de cultivo sea bastante rico y
la concentración de suero bastante alta (40-50%).
Con el tiempo las células van saliendo del fragmen-
to (explante) y migran y se expanden. En el segundo
procedimiento se trata de despegar y separar unas
de otras todas las células de pequeños fragmentos
obtenidos de un órgano o un tejido hasta obtener
una suspensión de células –aisladas unas de otras–
que se empleará para generar el cultivo primario.
Existen dos maneras básicas de obtener la suspen-
sión: por disgregación mecánica y por disgregación
enzimática, aunque también es posible diseñar pro-
cedimientos de disgregación mixtos e incluso existe
la posibilidad de disgregación espontánea, como
ocurre en las biopsias de médula ósea. En la dis-
gregación mecánica se trocea �inamente el tejido
(habitualmente con tijeras) y mediante pases por
pipeta (absorciones y expulsiones repetidas) y el
empleo de �iltros se acaba obteniendo la suspen-
sión celular. La disgregación enzimática requiere
una primera fragmentación suave y el tratamien-
to posterior con soluciones en las que se utilizan
enzimas como tripsina, colagenasa, elastasa, hia-
luronidasa, proteasas... que ayudan a deshacer la
108
matriz extracelular y cortan las proteínas implica-
das en mecanismos de adhesión celular. La mayor
abundancia de unas u otras enzimas depende del
tipo de tejido escogido para obtener el cultivo pri-
mario. El procedimiento ha de continuar con los
pases por pipeta y el �iltrado.
Una vez obtenida la suspensión inicial es ne-
cesario saber el número de células viables que hay
en dicha suspensión y determinar su concentración,
lo que permitirá sembrar un número determinado
de células en cada recipiente de cultivo. La viabili-
dad se analiza tomando una pequeña alícuota de
la suspensión y añadiéndole idéntica cantidad de
azul tripán al 0.1%. De esta mezcla se toma una pe-
queña fracción que se usa para recuento y permite
averiguar la concentración de células en la suspen-
sión. El procedimiento se detalla más adelante en
un apartado especí�icamente dedicado a recuento
(ver epígrafe 4.1.9).
Para establecer cultivos secundarios a partir
del primario es necesario, en el caso de cultivos ad-
herentes, despegar las células del sustrato. Para ello
se suele usar un procedimiento enzimático que, bá-
sicamente, consiste en retirar el medio, lavar con
PBS y añadir una solución que incluye tripsina y
EDTA, agente quelante que secuestra Ca2+ del me-
dio, lo que conlleva la desestabilización de uniones
intercelulares Ca-dependientes. Tras unos minutos
en el incubador de CO2 las células se despegan, se
añade entonces suero para bloquear la tripsina y
se centrifuga la solución. Se elimina el sobrenadan-
te, se lava (con PBS, o medio Hanks, por ejemplo) y
se vuelve a centrifugar. Finalmente se añade el me-
dio de cultivo, se dispersa el precipitado celular por
medios mecánicos (pipeta) y se resiembra el núme-
ro de recipientes a la concentración celular que se
desee tras hacer un nuevo ensayo de viabilidad y
recuento. Obviamente el establecimiento de culti-
vos secundarios a partir de cultivos en suspensión
es mucho más sencillo, basta con agitar, tomar una
alícuota, contar y resembrar a la dilución escogida.
Líneas celulares establecidas
Existen algunos miles de líneas celulares derivadas
de humanos y otros metazoos que pueden adqui-
rirse y se denominan líneas celulares establecidas.
La mayoría de ellas no son inmortales y tienen un
potencial de duplicación limitado, aunque las de
mayor interés son las que poseen un potencial de
duplicación alto; pero existen otras que son capaces
de reproducirse continuamente. Estas últimas se
han desarrollado a partir de células normales por
modi�icación genética u obtenidas a partir de célu-
las tumorales. Existen instituciones que adquieren,

preservan, autenti�ican y distribuyen estas líneas
celulares, por ejemplo, la ATCC (American Type
Culture Collection) y la ECACC (European Collection
of Cell Cultures). Para evitar errores conceptuales
conviene aclarar que una línea inmortal no tiene
por qué ser cancerosa; la inmortalidad solo es una
de las muchas características que presentan las cé-
lulas cancerosas.
Cuando se solicitan células de estas líneas, las
células vienen congeladas en un medio que incluye
un criopreservador. Para congelarlas se suele tomar
1 mL que contenga de 1 a 5 millones de células, se
le añade 5-10% DMSO y/o 10% de glicerol y se va
congelando hasta –50° C a una velocidad de –1°C
por minuto, después se pasa a nitrógeno líquido.
Si no se dispone del dispositivo de bajada gradual
de temperatura, suele bastar tenerlas 2 horas a 4
°C seguidas de 2 horas a –20 °C, 24 horas a –70 °C
y �inalmente en nitrógeno líquido. El descongelado
solo consiste en poner los viales en un baño a 37°
C y resuspender las células en el medio de cultivo.
El desarrollo de estas líneas o estirpes celula-
res tiene como objetivo su empleo en determinados
tipos de estudios; por ejemplo, la línea CHO-K1
(CRL 61) (CHO, chinese hamster ovary) es especial-
mente idónea para trabajos de ingeniería genética y
la MDCK (CCL 34) (MDCK, Madin-Darby canine kid-
hey) para estudios de transporte de membrana. El
código entre paréntesis es la nomenclatura o�icial
estándar. La primera línea celular fue estableci-
da por Gey en 1952 a partir de un cáncer de cuello
de útero, y lleva el nombre de HeLa (CCL 2) en ho-
nor a la persona de la que se tomaron las células,
Henrietta Lacks.
4.1.5. Contaminación
La extraordinaria riqueza nutritiva de los medios de
cultivo les hace muy susceptibles a que otros seres
vivos de ciclo de vida más corto que la célula que se
cultiva se instalen en ellos y acaben siendo el ele-
mento predominante. Cuando esto ocurre se dice
que el cultivo está contaminado, situación que lo
inhabilita para su estudio. Considérese que, en con-
diciones de cultivo, una duración razonable del ciclo
de vida de una bacteria es de 20 min y de una célula
eucariota de 20 horas.
Los agentes contaminantes más habituales son
bacterias, hongos pluricelulares y unicelulares (le-
vaduras), y micoplasmas. Las bacterias se ven bien
en el microscopio de contraste de fases y, además,
enturbian y viran el color del medio a amarillo al
acidi�icarlo. Suelen aparecer por errores en la ma-
nipulación o mal funcionamiento de las cabinas de
109
Cultivos celulares
�lujo. Los hongos pluricelulares se reconocen bien
por presentar hifas alargadas y aspecto algodonoso
detectable a simple vista. Suelen diseminarse por el
aire por lo que cuando aparecen es necesaria una
limpieza especí�ica a fondo de la cabina y el incu-
bador. La contaminación por levaduras también es
frecuente y las más comunes suelen ser las del pan
o la cerveza por lo que parece claro que derivan de
mala manipulación por parte del operador. Los mi-
coplasmas infectan a las células interiormente y son
di�íciles de detectar pues no afectan de modo ma-
ni�iestamente claro al cultivo, pero alteran algunas
funciones de la célula por lo que pueden falsear re-
sultados. Es di�ícil detectar su origen, se cree que
pueden derivar de otras líneas contaminadas traí-
das al laboratorio o del suero. Para su detección
existen kits especí�icos.
El tratamiento de la contaminación por bacte-
rias, hongos y levaduras es sencillo y depende del
grado de contaminación. Por ejemplo, si solo algu-
nas placas aparecen contaminadas y esto ocurre de
forma esporádica se eliminan estas y no suele haber
mayores problemas. Si la contaminación es amplia
conviene revisar material, comprobar medios y
limpiar incubador y cabina de �lujo. Si el problema
persiste se deben fumigar los aparatos y el labora-
torio. En general ante una contaminación es mejor
eliminar el cultivo y no tratar de arreglarlo usan-
do antibióticos, pues su uso es preferentemente de
tipo pro�iláctico.
Los virus también pueden provocar la conta-
minación del cultivo y, salvo algunos que producen
alteraciones morfológicas peculiares en las células,
su existencia no se puede detectar con los micros-
copios ópticos que habitualmente se utilizan en los
laboratorios de cultivo pues su tamaño es inferior al
poder de resolución de estos. En caso de ser nece-
saria, la con�irmación de la contaminación se suele
hacer por técnicas de biología molecular como la
PCR, o usando técnicas de microscopía electrónica.
La causa de contaminación más habitual es debida
al uso de animales infectados como origen de las cé-
lulas del cultivo o al uso de sueros contaminados.
En general hay que desechar los cultivos contami-
nados por virus porque no existe posibilidad de
tratamiento.
4.1.6. Aislamiento de un tipo celular
Un cultivo primario recién establecido suele incluir
diferentes tipos celulares, re�lejo de la variedad ce-
lular del tejido u órgano a partir del que se obtuvo la
suspensión de siembra. Sin embargo, en la mayoría
de los estudios es necesario utilizar cultivos puros,
Métodos en biociencias

que solo incluyan un único tipo celular. Existen di-

ferentes estrategias de aislamiento de un único tipo
celular que se basan en aprovechar las propiedades
diferenciales, morfológicas o moleculares de unas
células con respecto a otras.

— Propiedades �ísicas. Si las células son

grandes o pequeñas, o si presentan ma-
yor o menor densidad, pueden separarse
por centrifugación en gradiente diferen-
cial antes de realizar la siembra.
— Propiedades de adherencia. Determinadas
células de un tejido se adhieren mucho
más potentemente al sustrato que otras.
Por ello, un tratamiento de agitación poco
tiempo después de la siembra es un méto-
do sencillo y e�icaz para eliminar o aislar
las que se adhieren mejor o peor según se
seleccionen las que permanecen unidas al
sustrato o las que se sueltan.
— Separación por microesferas magné-
ticas. En este procedimiento (Figura
4.4) se marca a las células mediante un
anticuerpo asociado a microesferas mag-
néticas (en el epígrafe 5.7.3 del capítulo
5, dedicado a la inmunoprecipitación, se
estudian con más detalle este tipo de es-
feras) . El proceso de separación se puede
realizar en columna o directamente so-
bre tubos eppendorf, este último es un
procedimiento aún más sencillo. En el
procedimiento en columna en primer lu-
gar se incuba la suspensión celular con
el anticuerpo unido a las microesferas y
después se hace pasar la mezcla por una
columna sometida a un campo magnético
que retiene a las células marcadas contra
las paredes de la columna. Una vez que
ha pasado la suspensión celular se apar-
ta el campo magnético de la columna y
las células marcadas eluyen libremente.
Para retirar el marcaje de la célula solo
hay que resuspender las células marca-
das en un medio de pH ligeramente ácido
y volver a repetir el paso por la columna
con la aplicación del campo magnético.
Las microesferas unidas al anticuerpo
quedarán en la columna y las células pu-
ri�icadas pasarán libremente a través de
ella. Mediante este procedimiento siem-
pre se consiguen purezas mayores del
90%, y en muchos casos próximas al 99%.
Además es una técnica muy rápida (se
pueden separar 109 células en menos de
15 minutos) y barata (el dispositivo para
aplicar el campo magnético es muy senci-
Figura 4.4: Método de separación con esferas paramag-
néticas. A un tubo de ensayo con dos estirpes celulares
distintas (A) se le añaden esferas paramagnéticas mar-
cadas que llevan unidos anticuerpos especí�icos para una
de ellas (B). Al aplicar un campo magnético las células re-
conocidas por los anticuerpos se separan del resto (C), se
elimina el sobrenadante con las células no unidas, se retira
el campo magnético y se añade un medio que separa célu-
las y anticuerpos (D). Se aplica un nuevo campo magnético,
que agrupa los anticuerpos (E), y el sobrenadante, que
contiene un único tipo celular, se pasa a un nuevo tubo (F).
llo y de precio tan bajo que suele incluirse
al adquirir las microesferas magnéticas).
— Separador activado por �luorescencia
(FACS, �luorescence-activated cell sort-
ing). Este procedimiento, de uso común
hace algunas décadas, ha caído en desuso
debido al gran coste del aparato de sepa-
ración y a la aparición del método basado
en las esferas paramagnéticas. Para lle-
var a cabo la separación es necesario
disponer de un anticuerpo con marcaje
�luorescente que reconozca alguna mo-
lécula especí�ica del tipo celular a aislar.
El dispositivo, mediante un sistema de
vibración, genera un �ino hilo de microgo-
tas que, como máximo, solo incluyen una
célula en su interior. Esta microgota es
iluminada con luz láser y queda cargada
positivamente si no contiene moléculas
�luorescentes y negativamente si las po-
see. Finalmente, las microgotas, con las
células en su interior, son separadas por
su carga y colectadas separadamente al
hacerlas pasar por un campo electromag-
nético.

110

4.1.7. Técnicas de clonación celular
En la metodología del cultivo celular, como ya se
vio, la palabra clonación hace referencia a la obten-
ción de un cultivo o un grupo de células derivado
de una única célula parental. Es importante tener
en cuenta que si este tipo de cultivo se subcultiva
repetidamente acaba perdiendo esta característica
porque, paulatinamente, se van produciendo y acu-
mulando cambios genéticos en las células. Existen
varios modos de obtener el clon:
Clonación por dilución límite
Las células a sembrar en las placas de 96 pocillos se
han de diluir de modo que tras la siembra en el po-
cillo solo haya, como máximo, una célula. Por ello
cada pocillo se va sembrar con 200 μL de medio con
una concentración de 1.5 céls/mL, lo que rinde una
concentración de 0.3 céls/pocillo. Esto hace que la
mayoría de los pocillos estén vacíos tras la siembra
pues solo algo menos de 1/3 de los pocillos contiene
célula. Es cierto que parece un bajo rendimiento; sin
embargo, dota de mayor �iabilidad al proceso. Las
células sembradas, al ser solo una por pocillo, cre-
cen muy mal, y es necesario suministrar toda una
serie de suplementos especializados o bien acom-
pañarlas con células nodrizas (macrófagos, células
esplénicas irradiadas...) que no proliferan en cultivo
y son fáciles de aislar de las que se quieren clonar.
La e�iciencia de clonado (Ec) es un parámetro que
mide el número de células de un cultivo que tienen
la capacidad de formar colonias a partir de una sola
célula aislada, y su valor puede ser de 0.1% hasta
90%. La dilución teórica inicial es necesario modi�i-
carla en función de la Ec; por ejemplo, si la dilución
teórica (Dt) es de 1.5 céls/mL y la Ec es del 50%, la
dilución real (Dr) habrá de ser 3 céls/mL (Dr = Dt
/ Ec).
Clonación en agar
Es un método efectivo y sencillo, pero limitado,
pues numerosos tipos celulares no crecen en agar;
además, este método suele ir bien para células que
crecen en suspensión pero no para células adheren-
tes. La �iabilidad del clonado es mayor que la del
medio anterior, y permite sembrar a una densidad
celular más alta, lo que favorece el desarrollo de clo-
nes. Básicamente, se diluyen células, se mezclan con
una solución de agar, se deja enfriar (30 min a tem-
peratura ambiente) para que solidi�ique el agar, y
después se pasan a la estufa a 37° C. Entre 1 y 3 se-
111
Cultivos celulares
manas después se deben observar colonias/clones.
El medio de cultivo se añade por encima del agar
pues puede difundir a través de él. Se recomienda
expandir el clon cuando la colonia posee alrededor
de 1 mm de diámetro, y se suele hacer por pica-
do, introduciendo una pipeta Pasteur y succionado
suavemente hasta retirar el agar y la colonia. El
pequeño trozo de agar se resuspende en otro reci-
piente donde se diseminan las células.
Clonación en anillos
Es un método especialmente diseñado para células
adherentes, y muy utilizado para seleccionar célu-
las transfectadas. El desarrollo de un experimento
de clonación de células transfectadas puede ser útil
para ilustrarlo. En primer lugar se transfectan las
células de un cultivo subcon�luente y 24 horas des-
pués se despegan y resiembran; dilución 1:5 es un
valor razonable. Se aplica después un medio selecti-
vo de modo que las células no transfectadas mueren
y sus restos van siendo eliminados en los sucesivos
cambios de medio. En la placa van creciendo pe-
queñas masas clónicas de células transfectadas. Se
utiliza entonces un pequeño cilindro hueco de po-
lietileno que se adhiere al sustrato y en su interior
se hace tripsinización, se absorben las células y se
pasan a un nuevo recipiente para expansionar el
clon (Figura 4.5).
Figura 4.5: Clonación en anillos. Imagen de una placa Petri con los
cilindros (anillos) de clonación (esquina superior izquierda). Una
vez establecidas las colonias (A), se aíslan unas de otras mediante
los anillos de clonación (B y C). C es la vista cenital de la imagen B.
Las células del clon escogido se despegan mediante tripsina y se ex-
panden en otra placa (D).
Métodos en biociencias
Figura 4.6: Curva de crecimiento de un
cultivo. N0 representa el número de célu-
las sembradas en el momento de inicio del
cultivo.
4.1.8. Crecimiento del cultivo
Para estudiar el crecimiento de un cultivo es nece-
sario hacer una curva de crecimiento en la que se
representa la variación del número de células en
función del tiempo. El grá�ico que se obtiene es una
curva sigmoide con cuatro fases: fase de retraso,
fase exponencial, fase estacionaria y fase de deca-
dencia (Figura 4.6).
La fase de retraso va desde el momento de
la siembra al inicio de la fase exponencial y su ex-
tensión puede venir determinada por diferentes
factores; por ejemplo, el número de células sembra-
das, pues cuanto mayor es la población de partida
menor es la duración de la fase de retraso. La fase
exponencial es el periodo de tiempo en que todas
las células del cultivo se hallan inmersas en pro-
cesos de duplicación. En la fase estacionaria el
número de células de la población deja de aumen-
tar y permanece casi constante pues las células
dejan de dividirse. Esto puede ser debido a escasez
de nutrientes en el medio, acumulación de produc-
tos de deshecho y/o inhibición por contacto al no
disponer de más espacio. En la fase de decadencia o
muerte se produce una disminución del número de
células porque muchas de ellas comienzan a morir
debido a la carencia de nutrientes, presencia de tó-
xicos o por haber alcanzado el número máximo de
divisiones que una célula puede llevar a cabo. Este
número se conoce como el límite de Hay�lick, y en
humanos está en torno a 50 divisiones.
La fase exponencial permite inferir algunos
datos sobre el cultivo. Teóricamente, un cultivo en
esta fase crece exponencialmente en base 2 pues
cada célula que se divide genera dos células hijas.
Por ello, después de un determinado tiempo (t),
el número �inal (N) de células vendrá dado por la
112
ecuación N = No 2t/g, donde No representa el número
inicial de células y g la duración del ciclo de división
celular. Esta ecuación corresponde a lo que se llama
un cultivo sincrónico, en el que todas las células es-
tán en la misma fase del ciclo, pero en condiciones
normales las células se encuentran en diferentes
etapas de su ciclo: cultivo asincrónico. Por ello, en
cualquier momento, la velocidad a la que el núme-
ro de células del cultivo aumenta es proporcional
al número de células que hay en ese momento, y
la ecuación que describe ese tipo de crecimiento
es 2.3 log (N2 /N1)=k (t2 – t1), donde t representa el
tiempo, N el número de células y los subíndices 1 y
2 indican dos instantes determinados. La constante
de crecimiento especí�ica para cada tipo de cultivo
es k. Las diferencias de velocidad de crecimiento en-
tre diferentes tipos celulares o entre células de una
misma población sometidas a diferentes condicio-
nes de cultivo son re�lejadas por el valor de k.
Un dato de interés que describe la velocidad
especí�ica de crecimiento de un tipo celular bajo
unas determinadas condiciones es el tiempo de ge-
neración (T), que es el tiempo requerido para que
una población duplique su número de células. T y
k son especí�icos para cada tipo celular y condición
de cultivo. Si N2 es el doble de N1, la ecuación an-
terior puede quedar como 2.3 log 2=kT y, tomando
logaritmos, como 0.693=kT. La representación se-
milogarítmica de la curva de crecimiento permite
obtener fácilmente los valores de T y k: T median-
te una simple interpolación y k es la pendiente de la
recta (Figura 4.7).
4.1.9. Recuento de células
Para saber el número de células que hay en una
población en un instante dado existen diversos mé-
Figura 4.7: Representación semilo-
garítmica de la fase exponencial de
una curva de crecimiento. N repre-
senta el número de células, y T1,N1,
y T2,N2 el número de células en dos
tiempos diferentes.
 Cultivos celulares

Figura 4.8: Esquema de la cuadrícula de la cámara Fuchs-Rosenthal (izquierda) y de un contador Coulter

(derecha). La unidad de control integra, al menos, una fuente de alimentación (F), un ampli�icador (A) y un
osciloscopio (O). La �lecha discontinua indica la abertura que permite el paso de las células al ser arrastra-
das por el efecto de succión de la bomba.

todos. Obviando las estimaciones de masa celular,
el número de células de un cultivo se suele determi-
nar por la observación al microscopio óptico de una
alícuota de suspensión celular, o bien de su recuen-
to mediante un dispositivo eléctrico o por medio de
un citómetro de �lujo.
Recuento al microscopio óptico
El recuento se suele llevar a cabo en cámaras de re-
cuento, también llamadas hemocitómetros (su uso
tradicional fue para contar células sanguíneas) o
vulgarmente cámaras cuenta glóbulos. Las cáma-
ras de Neubauer o Fuchs-Rosenthal son de las más
usadas, aunque actualmente existen cámaras dese-
chables cuyo recuento está automatizado. Una gota
de una alícuota de la suspensión celular con azul tri-
pán (1:1 v:v) se coloca entre un cubre y un porta
que tiene una pequeña depresión y permite dife-
renciar las células muertas (teñidas de azul) de las
vivas (refringentes). En la cámara Fuchs-Rosenthal
(Figura 4.8) la depresión es de 0.2 mm de altura y
en ella se traza una cuadrícula donde cada mm2 está
delimitado por tres líneas y subdividido en 16 pe-
queños cuadrados, delimitados ahora por una única
línea. La concentración de células C (en céls/mL)
viene dada por la siguiente expresión C=(n/cg) x 2
x 5000, donde n es el número de células contadas
y cg el número de cuadrados grandes (de 1 mm de
lado) utilizados para contarlas. La multiplicación
por 2 se hace para corregir la dilución del azul tri-
pán, y por 5000 para referir la concentración a mL.
El volumen de un cuadro de 1 mm2 es de 0.2 mm3 (1
mm de base x 0.2 mm de altura), lo que representa
1/5000avo de 1 mL; nótese que 0.2 mm3 multipli-
cados por 5000 son 1000 mm3, que equivalen a 1
cm3 (1 mL). Si la suspensión estuviese muy concen-
trada y solo se utilizasen cuadrados pequeños es
necesario modi�icar la expresión anterior para ob-
tener la siguiente: C=(n/cp) x 2 x 80000, donde cp es
el número de cuadrados pequeños y 80000 el factor
de conversión a mL pues cada cuadro pequeño es
1/80000avo de 1 mL.
Recuento eléctrico
El más característico es el contador Coulter. El paso
de una célula por una pequeña abertura determina
una caída en el potencial del sistema y esa caída es
proporcional al tamaño de la célula por lo que per-
mite no solo contar sino indicar el tipo celular por
tamaño (Figura 4.8).
Recuento con el citómetro de flujo
El funcionamiento del citómetro de �lujo se estudia-
rá en el capítulo 6, dedicado completamente a tal
dispositivo.

113
Métodos en biociencias
4.1.10. Sincronización
En un cultivo normal, las células suelen encontrarse
en diferentes fases del ciclo celular por lo que de-
terminados estudios; por ejemplo, el análisis de los
acontecimientos que tienen lugar en cada fase del
ciclo o su regulación son imposibles de llevar a cabo.
Esto se puede corregir estudiando una sola célula o
bien haciendo que el cultivo se comporte como una
única célula; es decir, sincronizándolo. Por tanto, un
cultivo sincronizado es aquel en el todas sus células
se encuentran en la misma fase del ciclo. El grado
de sincronía de un cultivo se puede saber analizan-
do su índice mitótico (Im), Im = Nm / N, donde Nm es
el número de células en mitosis y N el número total
de células. En un cultivo asincrónico Im permanece
constante en la fase exponencial; sin embargo, en
un cultivo sincrónico debe sufrir continuas oscila-
ciones entre valores próximos a 0 y próximos a 1.
Los modos de inducir sincronización pueden
ser bastante variados, y se suelen clasi�icar de dos
maneras: por el modo de llevar a cabo la sincroni-
zación y por la fase del ciclo sobre la que se actúa.
En relación con el modo existen mecanismos de in-
ducción y de selección. La inducción consiste en
someter el cultivo a diferentes tratamientos que de-
terminan la detención (bloqueo) del ciclo celular en
alguna fase. Los ciclos de choques térmicos frío-ca-
lor, los ciclos de luz-oscuridad si la célula cultivada
es fotosintética o, más usualmente, el tratamiento
con fármacos (colchicina, vinblastina, nocodazol…)
suelen ser los mecanismos inductivos más emplea-
dos. La selección se lleva a cabo por procedimientos
mecánicos: despegado, �iltrado, centrifugado... y se
basa en aislar, dentro del cultivo, un subtipo celular
que presente alguna característica como tamaño,
densidad o adherencia diferente debido a la fase del
ciclo en la que se encuentra. Recuérdese que una cé-
lula fuera de ciclo está en fase G0, y que al entrar en
ciclo recorre las siguientes fases: G1 (gap 1), S (sínte-
sis de DNA), G2 (gap 2) y M (mitosis). El término gap
hace referencia a los vacíos o huecos que hay antes
y después de la fase S. Se describirán a continuación
los sistemas de sincronización más habituales.
— Sincronización por salida a la fase G0.
Normalmente las células salen de ciclo y
se quedan en G0 (fuera de ciclo) cuando
al medio se le retira el suero o los facto-
res de crecimiento encargados de inducir
proliferación. Si al cabo de unos días se
añade suero o los factores de crecimien-
to las células inician ciclo de modo más o
menos sincronizado.
— Sincronización por liberación del bloqueo
de la fase M. En general el tratamiento del
114
cultivo con agentes (colchicina, vinblasti-
na o nocodazol, entre otros) que afectan
a los microtúbulos conduce al bloqueo
de las células en fase M. El tratamiento
no debe de ser prolongado (2-8 horas)
pues de lo contrario puede provocar da-
ños irreparables. La incubación con óxido
nitroso a presión durante 2 a 6 horas tam-
bién es un método bastante usado.
— Sincronización por liberación del bloqueo
de la fase S. Hidroxiurea o timidina a altas
concentraciones previenen la replicación
de DNA por inhibición de la enzima ribo-
nucleótido reductasa. A�idicolina lo hace
por unión directa y subsecuente inhibi-
ción de la DNA polimerasa. Al igual que
el método anterior, no son convenientes
bloqueos demasiado largos porque pue-
den resultar tóxicos. Como peculiaridad,
en este procedimiento es necesario llevar
a cabo una doble incubación. Al aplicar el
inhibidor de la síntesis de DNA por pri-
mera vez las células que están en fase S
quedan detenidas, pero la fase S es larga
y las células detenidas se distribuyen por
toda ella. El resto de células sigue avan-
zando en el ciclo hasta que todas ellas
quedan agrupadas y bloqueadas al ini-
cio de fase S. Es obvio que la duración de
este primer bloqueo ha de ser la su�icien-
te para permitir a una célula –que acabe
de salir de fase S– recorrer G2, M y G1, y
detenerse al inicio de la fase S. En este
instante se lleva a cabo un desbloqueo
que hace que todas las células (el gru-
po de células detenido al inicio de la fase
S y el resto detenidas por toda la fase S)
entren en ciclo. Este desbloqueo ha de du-
rar el tiempo necesario para que el grupo
de células parado al inicio de la fase S la
complete. En este instante no hay ningu-
na célula en fase S y se vuelve a producir
un nuevo bloqueo que conduce a la agru-
pación de todas las células en el punto de
inicio de la fase S.
— Sincronización por despegado mitótico
por agitación. Cuando las células del cul-
tivo entran en mitosis se redondean y
quedan débilmente adheridas al sustra-
to. Un agitado fuerte permite aislarlas
primero y transferirlas después a un nue-
vo recipiente de cultivo donde completan
mitosis y empiezan un nuevo ciclo.
— Sincronización por centrifugación (elutria-
ción). Existen centrífugas que incorporan

un sistema especial de rotores y unos dis-
positivos que permiten ir separando las
células por tamaño y densidad (paráme-
tros que varían a lo largo del ciclo) y su
extracción independiente.
4.2. Cultivos vegetales
Los primeros intentos para cultivar células vege-
tales in vitro se realizaron a principios del siglo ��,
en concreto en 1902, cuando el �isiólogo alemán
Gottlieb Haberlandt consiguió mantener vivas en
un medio nutritivo durante un mes células aisladas,
que, aunque no llegaron a dividirse, sí incremen-
taron su tamaño y acumularon almidón. Además,
Haberlandt propuso la hipótesis de que las células
vegetales son totipotentes y por tanto capaces de
regenerar plantas completas. Veinte años más tarde
Kolte y Robbins consiguieron cultivar in vitro raíces
y meristemos de tallo. A partir de este momento,
comenzó una intensa actividad de investigación re-
lacionada con el cultivo in vitro vegetal.
El cultivo de células vegetales incluye todos
los aspectos del cultivo y mantenimiento de ma-
terial vegetal in vitro en condiciones asépticas,
empleando medios nutritivos adecuados y en un
ambiente controlado. Inicialmente, los cultivos in vi-
tro se utilizaron como una herramienta en trabajos
de investigación básica relacionados con la división
de las células vegetales, su desarrollo, diferencia-
ción, �isiología y bioquímica. Sin embargo, pronto
se vio que podían tener aplicaciones prácticas, en-
tre las que se encuentran la propagación vegetal,
la sanidad vegetal para la obtención de plantas li-
bres de virus, la producción de doblehaploides,
etc., todas ellas con una importante repercusión
económica. Más recientemente, el cultivo in vitro
vegetal tiene nuevas aplicaciones. Así, se utiliza en
los procesos de obtención de plantas transgénicas
o biotecnológicas y en la selección de plantas tole-
rantes a diferentes estreses abióticos, ya sea tras
un tratamiento mutagénico (químico o mediante
radiaciones) o aprovechando la variación genética
que de forma espontánea se puede producir duran-
te el cultivo in vitro (variación somaclonal).
4.2.1. Componentes del cultivo in vitro vegetal
Material vegetal
El primer elemento del cultivo in vitro vegetal es el
explante, es decir, el fragmento o parte de la plan-
115
Cultivos celulares
ta que se va a poner en cultivo. Según los objetivos
que se persigan el explante puede ser: meristemos,
fragmentos de hojas, tallos, raíces, embriones, ór-
ganos completos, células haploides formadas tras
el proceso meiótico, etc. Un requisito importante es
que el explante debe estar libre de virus, bacterias
u hongos por lo que suele ser necesario someter-
lo a un proceso de desinfección. La desinfección del
explante es un paso crítico al iniciar un nuevo cul-
tivo in vitro ya que de no conseguirse hará inviable
el establecimiento del cultivo e impedirá cualquier
proceso posterior que se pretenda realizar. Algunos
explantes, como son las espigas cuando aún no han
salido de la vaina o los embriones de semillas inma-
duras, son muy fáciles de desinfectar. Sin embargo,
en las raíces, tallos y hojas maduras puede resultar
una tarea casi imposible, siendo escasos los traba-
jos en los que se utiliza este tipo de material vegetal.
Cuando el explante aún no ha entrado en
contacto con el exterior basta con desinfectar las
super�icies externas mediante un tratamiento quí-
mico con etanol de 70º durante 30-60 segundos, o
sumergir el material vegetal durante 10-20 minutos
en una solución entre el 0.5–5% de hipoclorito de
sodio, a la que se añaden unas gotas de detergente
o de Tween-20 (0.01-0.1%) con el �in de aumen-
tar la tensión super�icial y facilitar el contacto con
la super�icie que se desea desinfectar, seguido de 3
a 5 enjuagues con agua estéril. Si el material vege-
tal está muy contaminado se utiliza algún método
más enérgico, como es la inmersión en una solución
de cloruro de mercurio entre el 0.25-0.5 ‰ duran-
te 6 horas, aunque debido a la elevada toxicidad de
este compuesto se necesitan medidas especiales de
protección durante su uso y la eliminación de los
residuos. También se puede emplear, tras el trata-
miento con hipoclorito de sodio, la inmersión en
una solución antibiótica que contenga penicilina y
estreptomicina a una concentración de 1 mg/L du-
rante 2 horas. En algunos casos se añaden al medio
de cultivo sustancias biocidas como el PPM (plant
preservative mixture) que matan bacterias y hongos
e incluso llegan a eliminar los organismos endó�itos
que están presentes en algunos tipos de explantes.
Cuando se trata de un nuevo tipo de explante,
y como regla general, se recomienda comenzar con
un tratamiento suave y, en caso de no conseguir la
desinfección, ir empleando tratamientos cada vez
más intensos hasta que no aparezca ninguna conta-
minación, aunque este tipo de tratamiento conlleva
el daño del explante, pudiendo darse el caso de que
se dañe tanto que no se pueda iniciar el cultivo.
Métodos en biociencias
Equipo de laboratorio
Es similar al que se requiere para el cultivo de célu-
las animales, siendo en ambos casos imprescindible
mantener las máximas medidas de esterilidad para
evitar la contaminación de los cultivos. Una vez que
el material vegetal se ha desinfectado, su manipula-
ción posterior hay que realizarla en cabinas de �lujo
laminar horizontal, situadas en un espacio limpio y
sin corrientes de aire, que van a proporcionar una
zona de trabajo estéril. Tanto las paredes de la cabi-
na como la poyata se desinfectan con alcohol de 70o
al inicio de cada sesión de trabajo, al �inal y en repe-
tidas ocasiones durante el tiempo de manipulación
de los cultivos. Asimismo, es conveniente contar
con una lámpara germicida de luz ultravioleta, que
será conectada durante al menos 30 minutos antes
del inicio de cada sesión de trabajo.
El instrumental también se debe descontami-
nar. En algunos casos, como los estéreomicroscopios,
con alcohol de 70o, y el instrumental metálico (pin-
zas, bisturíes, tijeras, agujas, etc.) empleando calor,
bien sea �lameando con llama directa o con esterili-
zadores eléctricos de bolas de vidrio. El material de
vidrio, como los tubos y las pipetas, se esteriliza en
estufas de calor seco a temperaturas de 180-200 °C
durante 2-4 horas.
Actualmente, los contenedores en los que se
siembran los explantes y se mantienen los cultivos,
por ejemplo placas de Petri de diferentes diámetros,
suelen ser de plástico y se comercializan esteriliza-
dos. Cuando el material vegetal adquiere un mayor
tamaño, se emplean contenedores más grandes
como los de tipo «Magenta ®» de policarbonato o
polipropileno que son autoclavables.
El personal encargado de manipular los culti-
vos debe extremar las precauciones para no ser una
fuente de contaminación. Para ello es necesario el
lavado de manos con alcohol de 70° antes de comen-
zar a trabajar; además, la utilización de mascarillas
de boca y nariz permiten reducir considerablemen-
te la contaminación.
Los cultivos in vitro deben incubarse en unas
condiciones ambientales muy controladas. De ahí
que un elemento de gran importancia sean los cuar-
tos de cultivo y las cámaras de tipo «Conviron®». Se
trata de habitaciones o cámaras cerradas en las que
se puede controlar el fotoperiodo, la temperatura
y, en muchos casos, la humedad, por lo que nece-
sitan tener un sistema de circulación de aire que
uniformice el interior de la cámara. Para el suminis-
tro de luz se suelen emplear tubos �luorescentes del
tipo luz día con intensidades de PPF (photosynthe-
tic photon �lux) entre 20 y 200 µmol m-2s-1, aunque
116
actualmente comienzan a sustituirse por luces de
tipo LED dada su mayor durabilidad y constancia
de emisión. Respecto al control de temperatura, se
toleran bien oscilaciones entre ± 1 °C, sin que haya
repercusión en los resultados obtenidos; la hume-
dad atmosférica debe estar comprendida entre el
80 y el 90%, aunque en los contenedores (placas de
Petri, tubos, cajas Magenta®, etc.), al encontrarse
cerrados, la humedad llega a alcanzar casi el 100%.
Medios de cultivo
El cultivo de células, tejidos y órganos vegetales
requiere la utilización de medios de cultivo arti-
�iciales, que proporcionen a las células todos los
elementos que necesitan para su supervivencia y
desarrollo. En los medios se incluyen: nutrientes
minerales, una fuente de carbono, vitaminas, regu-
ladores del crecimiento (�itohormonas), un agente
geli�icante en el caso de tratarse de medios semisó-
lidos y otros compuestos.
— Nutrientes minerales
Macronutrientes. Se encuentran en una
concentración superior a 0.5 mM y son:
nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, calcio
y magnesio. Los tres primeros son consti-
tuyentes de proteínas, ácidos nucleicos…
y los tres últimos intervienen en el equili-
brio iónico de la planta.
Micronutrientes. Están a una concen-
tración inferior a 0.5 mM y en algunos
casos no superan una concentración de 1
µM. Entre los principales se encuentran:
hierro, cobre, cinc, magnesio, molibdeno,
cobalto y boro, aunque puede haber más
en cantidades aún menores que los ante-
riores. Estos elementos son esenciales en
las reacciones enzimáticas, actuando en
algunos casos como coenzimas. El hierro
es el microelemento más crítico en el cul-
tivo in vitro debido a su baja solubilidad,
pudiendo precipitar tras la preparación
del medio. Para resolver este problema
se utiliza el agente quelante, ácido etildia-
minotetraacético (EDTA) dando lugar al
FeEDTA.
— Fuente de carbono
La mayor parte de los cultivos in vitro ve-
getales son heterótrofos al no llevarse a
cabo la fotosíntesis, por lo que es necesa-
rio añadir al medio una fuente orgánica

de carbono. El hidrato de carbono más
empleado es la sacarosa a una concentra-
ción de entre el 2 y el 10%, pero también
se utilizan otros glúcidos como maltosa,
glucosa, lactosa, galactosa y almidón.
— Vitaminas
Casi todos los medios para el cultivo in
vitro vegetal incluyen una o varias vi-
taminas, aunque solamente la tiamina
(vitamina B1) a concentraciones entre
0.1 y 10 mg/L es la que se ha comproba-
do que tiene un claro efecto positivo en
el desarrollo de los cultivos. También es
frecuente incluir el ácido nicotínico (0.1
-5 mg/L) y la piridoxina (vitamina B6)
a concentraciones entre 0.1 y 10 mg/L.
En algunos medios también se añaden
biotina, ácido fólico, ácido pantoténico,
ribo�lavina etc., aunque no está total-
mente demostrada su necesidad para el
desarrollo adecuado de los cultivos. Junto
con las vitaminas, se añade mio-inositol,
que es un polialcohol cíclico, a concen-
traciones entre 50 y 5000 mg/L, lo que
estimula el desarrollo de los cultivos en
la mayoría de las especies vegetales en-
sayadas. Su papel está relacionado con la
división de la célula al estar involucrado
en la síntesis de membranas.
— Reguladores de crecimiento
En las plantas, a los reguladores de
crecimiento se les ha denominado �ito-
hormonas u hormonas de crecimiento,
aunque no son exactamente homólogas
a las hormonas de los animales. Estos
reguladores de crecimiento se pueden
clasi�icar en cinco grupos: auxinas, ci-
toquininas, giberelinas, ácido abcísico y
etileno, siendo los tres primeros los más
utilizados en el cultivo in vitro vegetal.
El tipo y la concentración de los diferen-
tes reguladores de crecimiento dependen
de los objetivos que se persigan y de di-
ferentes factores, como es el genotipo del
material que se pone en cultivo, ya que
hay una respuesta genotipo dependiente
para muchas de estas sustancias.
• Auxinas. La biosíntesis de estas
sustancias se da en los ápices cau-
linares. Las más empleadas son, el
ácido 3-indol-acético (IAA), el áci-
117
Cultivos celulares
do 3-indolbutírico (IBA), el ácido
2.4-diclorofenoxiacético (2.4-D) y
el ácido naftalen-acético (NAA). El
único natural es el IAA, siendo los
demás de síntesis química. En el
cultivo in vitro las auxinas se usan
normalmente para estimular la
formación de callos (masas indife-
renciadas de células), para inducir
la embriogénesis somática y para
inducir la formación de brotes cau-
linares. Las concentraciones en las
que se usan son muy variables, de-
bido a que la actividad �isiológica
de estas sustancias es muy dife-
rente. Los rangos oscilan entre 10-5
y 10-9 M. Un aspecto importante a
tener en cuenta en la preparación
de los medios de cultivo es la so-
lubilidad y estabilidad de estas
sustancias. Así, el IAA y en el NAA
se pueden disolver en NaOH 1N,
mientras que el 2.4-D es soluble en
etanol de 96°. La disoluciones de
NAA y 2.4-D se pueden almacenar
varias semanas a 4 °C o durante va-
rios meses a -20 °C, mientras que
la disolución de IAA es convenien-
te que se prepare de nuevo cada
vez que vaya a ser empleada.
• Citoquininas. Se producen princi-
palmente en la raíz de la planta y en
mucha menor cantidad en los ápi-
ces caulinares. Las más empleadas
en el cultivo in vitro vegetal son, la
6-bencilaminopurina (BAP), la ki-
netina (KIN), 2-isopenteniladenina
(2iP), Zeatina (ZEA) y el Tiazuron
(TDZ). La ZEA y el 2iP son cito-
quininas naturales y las demás de
síntesis química. En cultivo in vitro
estas sustancias estimulan la divi-
sión celular, la formación de brotes
caulinares e inhiben la formación
de raíces. Se emplean en un ran-
go de concentraciones entre 10-5
y 10-8 M. Para su disolución se em-
plean tanto soluciones ácidas HCl
(1N) como básicas NaOH (1N), y se
pueden almacenar a -20 °C.
• Giberelinas. Dentro de este grupo
se incluyen más de veinte com-
puestos, siendo el ácido giberélico
(GA3) el que más se utiliza a con-
Métodos en biociencias
centraciones entre 10-6 y 10-7 M.
No obstante, las giberelinas no
se emplean demasiado en el cul-
tivo in vitro ya que suelen inhibir
la organogénesis, sobre todo la ri-
zogénesis, siendo su principal
aplicación la de incrementar el de-
sarrollo de los callos.
— Sustancias geli�icantes
Gran parte de los cultivos in vitro vege-
tales se realizan en medios semisólidos,
obtenidos mediante sustancias geli�ican-
tes. Se ha podido comprobar que el tipo y
concentración de estas sustancias pueden
in�luir de manera notable en el éxito del
cultivo. Inicialmente se emplearon sus-
tancias naturales como el agar, la agarosa
o el alginato a concentraciones entre el
0.5 y el 5%. Sin embargo, algunas de estas
sustancias pueden variar su composición
según la empresa que las comercialice,
además de contener elementos que in-
hiben el crecimiento de las células. Por
ello, se están empleando otras sustancias
como el «Phytagel» o la «Gelrite» obteni-
das por fermentación microbiana de la
glucosa que dan lugar a un polisacárido
formado por glucosa, ácido glucurónico y
ramnosa. Estas sustancias se pueden uti-
lizar a concentraciones más bajas que el
agar o la agarosa y forman un gel rígido y
transparente, lo que facilita la detección
temprana de posibles contaminaciones, y
además no contienen sustancias que inhi-
ban el crecimiento del cultivo.
— Otros compuestos
En el cultivo in vitro vegetal se han
empleado compuestos muy variados, al-
gunos inde�inidos, como son los extractos
de hidrolizados de proteínas, leche de
coco, extracto de levadura, extracto de pa-
tata, etc. Aunque en algunos casos se han
obtenido buenos resultados, se intenta no
utilizarlos debido a la inde�inición de su
composición y a la falta de repetitividad
de los resultados. Hay otras sustancias
que sí se suelen añadir a los medios de
cultivo, y entre ellas destacan ciertos ami-
noácidos como L-glutamina (5-10 mM) y
glicina (2 mg/L). Estas sustancias van a
proporcionar a las células una fuente de
118
nitrógeno que es más fácil de asimilar por
las células que el nitrógeno inorgánico, lo
que va a facilitar el crecimiento de los cul-
tivos.
Una vez preparado el medio de cultivo
y antes de esterilizarlo, es necesario ajus-
tar el pH, que va a ser ligeramente ácido
y oscila entre 5.5 y 5.8. Al no contener el
medio ningún tampón, es necesario ser
muy cuidadoso en el ajuste del pH, que se
realiza empleado soluciones entre 0.01 y
1M de HCl o KOH.
Se han utilizado centenares de distin-
tas composiciones y, a modo de ejemplo,
en el cuadro 4.1 se muestran cinco de las
más habituales.
— Esterilización del medio de cultivo
El método más habitual de esterilización
de los medios de cultivo es el autoclavado
durante 15-30 min a una temperatura de
121 °C y a una presión de 15 psi. Si existen
sustancias que puedan verse alteradas
por el calor hay que utilizar temperatu-
ras más bajas; por ejemplo, si el medio
contiene glucosa en lugar de sacarosa,
la temperatura hay que bajarla hasta los
110 °C con el �in de evitar su carameliza-
ción.
Algunas sustancias (vitaminas, al-
gunos reguladores de crecimiento, etc.)
no pueden someterse a temperaturas
elevadas ya que se degradan total o par-
cialmente. En estos casos se emplea la
esterilización por �iltración, utilizando �il-
tros con un tamaño de poro de 0.20 µm,
que es lo su�icientemente pequeño para
evitar el paso de hongos y bacterias. En
estos casos, se preparan dos soluciones,
una que se autoclava y la otra se �iltra ya
que contiene las sustancias termolábiles.
Si el medio contiene agar, este se añade a
la primera solución que, una vez autocla-
vada se espera a que baje su temperatura
lo máximo posible para que al añadir la
segunda solución, no se produzca la geli�i-
cación del medio y dé tiempo a repartirlo
en los contenedores.
4.2.2. Desarrollo del explante
El cultivo in vitro se inicia con la puesta del explan-
te en un medio nutritivo. Dependiendo del tipo de
 Cultivos celulares

Cuadro 4.1: Composición de los cinco medios más empleado en el cultivo in vitro vegetal.

Componentes del medio (mg/L) Murashige & Skoog Linsmaier & Skoog Gambord B5 Chu (N6) Nitsch & Nitsch

Macronutrientes
Macronutrientes
NH4NO3 1650 1650 720
KNO3 1900 1900 2500 2830 950
CaCl2.2H2O 440 332 150 125 166
MgSO4.7H2O 370 180.5 250 90.3 185
KH2PO4 170 170 400 68
(NH4)2SO4 134 463
NaH2PO4.H2O 150

Micronutrientes
KI 0.83 0.83 0.75 0.8
H3BO3 6.20 6.20 3.0 1.6 10.0
MnSO4.4H2O 22.30 3.33 25.0
MnSO4.H2O 16.90 10.0
ZnSO4.7H2O 8.60 8.60 2.0 1.5 10.0
Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25
CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.025 0.025
CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025
Na2EDTA 37.3 37.3 37.3 37.3 37.3
FeSO4.7H2O 27.8 27.8 27.8 27.8 27.8

Vitaminas y otros componentes

Glicina 2.0 2.0 2.0
Mio-inositol 100.0 100.0 100.0 100.0
Ácido Nicotínico 0.5 1.0 0.5 5.0
Piridoxina HCl 0.5 1.0 0.5 0.5
Tiamina HCl 1.0 0.4 10.0 1.0 0.5
Biotina 0.05
Ácido fólico 0.5

explante, el medio nutritivo que se emplee y de las
condiciones ambientales en las que se incube, las
células que lo integran pueden seguir diferentes
caminos. Así, pueden comenzar a dividirse más o
menos rápidamente hasta dar lugar a una masa de
células indiferenciadas denominada callo, con un
aspecto morfológico que va de acuoso a compacto,
y de translúcido a tonalidades amarillo-parduzcas
(Figura 4.9a). En general estas estructuras no sir-
ven para regenerar plantas, pero sí que pueden ser
utilizadas como fuente para el cultivo de células ais-
ladas y de protoplastos (células vegetales a las que
se les ha eliminado enzimáticamente la pared de ce-
lulosa) que en algunos casos se han empleado como
células diana en experimentos de transformación. A
veces, los callos constituyen una etapa intermedia
en procesos posteriores de desarrollo.
Las células del explante también pueden se-
guir otras dos vías, que son las que van a permitir
la regeneración de plantas completas. Estas son la
organogénesis y la embriogénesis somática que se
basan, como ya se indicó al inicio del apartado de
cultivo in vitro vegetal, en la totipotencialidad que
poseen muchas células vegetales.

119
 forma inducida, la duplicación de los cromosomas dando lugar a una planta
diploide y fértil.
Métodos en biociencias

Figura 4.9:
Figura 4.9.(a)
a) Callo
Calloacuoso
acuosocon
con estructuras
estructuras globulares
globulares procedentes
procedentes del cultivo
del cultivo in vitroindevitro de un embrión
un embrión in-
maduro de de
inmaduro trigo. (b) b)
trigo. Organogénesis directa
Organogénesis a partir
directa de hojas
a partir de violeta
de hojas africana
de violeta (Saintpaulia
africana ionantha).
(Saintpaulia (c)
ionantha).
Embriones somáticos en la super�icie de un callo obtenido a partir de un embrión inmaduro de trigo. (d)
Embriogénesis de la microspora. Se observan dos embriones haploides en la super�icie de una antera de cebada.

La organogénesis es la producción de órga- de tejidos de reserva. Las plántulas originadas, una

nos vegetales (tallos, raíces, hojas…), y puede ser
directa cuando los órganos se forman a partir del
explante inicial (Figura 4.9b), o indirecta cuando
hay una fase previa de formación de callo, del que
posteriormente se desarrollarán los órganos. Estos
surgen a partir de regiones en las que se han forma-
do grupos de células que asemejan a meristemos y
que se les denomina meristemoides.
La embriogénesis somática es un proceso por
el que se van a desarrollar estructuras semejantes
a los embriones cigóticos, pero sin que se haya pro-
ducido la fecundación de los gametos (Figura 4.9c).
Al igual que en la organogénesis, la embriogénesis
somática puede ser directa, cuando los embriones
aparecen directamente a partir de las células del
explante, o indirecta cuando hay una fase de callo
intermedia. En este último caso los embriones apa-
recen en la super�icie del callo, de forma aislada o
bien formando «clusters» o grupos de embriones
unidos unos con otros, como consecuencia de una
embriogénesis repetitiva. Los embriones somáti-
cos pueden germinar, pero necesitan un medio de
cultivo adecuado que les proporcione los nutrien-
tes requeridos para su desarrollo ya que carecen
vez que han crecido lo su�iciente, pueden ser trans-
plantadas directamente a un sustrato, o en algunos
casos hay que hacer un transplante previo a un nue-
vo medio de cultivo para activar su enraizamiento.
Un tipo particular de embriogénesis es la
embriogénesis haploide. Una célula haploide es
aquella que contiene el número gamético de cromo-
somas y se origina tras el proceso de meiosis. En el
caso de las plantas superiores, la meiosis masculi-
na da lugar a las microsporas, que se desarrollaran
formando el microgameto�ito masculino o grano de
polen, y la meiosis femenina origina la macrospora,
cuyo desarrollo posterior da lugar al macrogame-
to�ito o saco embrionario. Durante la fecundación,
uno de los núcleos del microgameto�ito fecundará a
la ovocélula dando origen al cigoto.
El desarrollo normal de las microesporas se
puede desviar mediante diferentes estímulos �ísicos
(choque térmico u osmótico) o químicos (ayuno) y,
empleando diferentes técnicas de cultivo in vitro,
redirigirlo hacia un desarrollo esporo�ítico que des-
embocará en la producción de un embrión haploide
(Figura 4.9d), en un proceso que se ha venido en de-
nominar como embriogénesis de la microspora. A

120

Figura 4.10: Esquema de las diferentes vías de desarrollo que puede seguir un explante tras la
puesta en cultivo, según se parta de células diploides o haploides.
veces no se forma directamente un embrión haploi-
de, sino que hay una fase intermedia de callo y, a
partir del mismo, se produce un proceso posterior
de organogénesis o de embriogénesis.
Aunque con mayor di�icultad, en ciertas espe-
cies vegetales se puede inducir un desarrollo de tipo
partenogenético a partir de óvulos sin fecundar. Para
ello se cultivan in vitro ovarios completos en medios
nutritivos que contienen diferentes reguladores de
crecimiento para estimular las divisiones del óvu-
lo, lo que dará lugar a estructuras embrionarias.
En otros casos, se consigue estimular la división de
los óvulos fecundándolos con polen irradiado o con
polen de una especie diferente, dando lugar a un
embrión haploide, pues no se ha producido fecun-
dación o, si se ha dado, los cromosomas aportados
por el parental masculino se pierden. Este es uno de
los métodos de obtención de embriones haploides
en Hordeum vulgare (cebada) en el que se emplea el
121
Cultivos celulares
polen de una especie silvestre relacionada que es H.
bulbosum. Tras la fecundación se produce un cigoto
con la suma de los cromosomas de ambas especies
pero, en las primeras divisiones, los cromosomas de
H. bulbosum se pierden quedando solamente el jue-
go de cromosomas aportados por H. vulgare y por
tanto dando lugar a un embrión haploide. En este y
en otros casos similares (cruzamiento trigo x maíz
o trigo x cebada, etc.) es necesario rescatar el em-
brión haploide producido y cultivarlo in vitro para
que pueda terminar su desarrollo y germinar para
dar lugar a una planta haploide que será estéril, sal-
vo que se produzca, espontáneamente o bien de
forma inducida, la duplicación de los cromosomas
dando lugar a una planta diploide y fértil.
En la �igura 4.10 se resumen las diferentes vías
que puede seguir un explante vegetal una vez pues-
to en cultivo.
Métodos en biociencias
4.2.3. Aplicaciones del cultivo in vitro vegetal
Las técnicas de cultivo in vitro tienen numerosas
aplicaciones, entre las que se encuentran la pro-
pagación vegetativa de una variedad mediante
micropropagación o mediante semillas arti�iciales,
el saneamiento del material vegetal, la obtención de
nuevos materiales vegetales (producción de doble
haploides), etc. En los siguientes apartados se tra-
tan algunos de estos aspectos.
Micropropagación
La micropropagación, también denominada propa-
gación clonal, es un tipo de multiplicación asexual
que permite obtener un conjunto de plantas (de
unas pocas a millones) genéticamente idénticas a
la planta de la que se ha obtenido el explante ini-
cial. Prácticamente cualquier parte de la planta se
puede utilizar como explante empleando medios de
cultivo adecuados, siendo preferible que contenga
células meristemáticas que sean capaces de dividir-
se activamente y posteriormente diferenciarse en
distintos órganos.
La primera etapa de la multiplicación vege-
tativa es el establecimiento del cultivo en unas
condiciones axénicas. La segunda etapa es la fase
de multiplicación, cuyo objetivo es mantener e in-
crementar el número de propágulos con el �in de
destinar una parte a continuar con nuevos ciclos
de multiplicación y otra parte a la siguiente etapa,
que es la de regeneración de plántulas siguiendo
alguna de las vías de morfogénesis descritas ante-
riormente. No existe un protocolo general, y para
cada especie, e incluso para cada genotipo, es ne-
cesario ensayar diferentes medios de cultivo hasta
encontrar empíricamente las mejores condiciones.
Cuando la regeneración se lleva a cabo me-
diante la vía de organogénesis, en primer lugar se va
a inducir la formación de vástagos unipolares, em-
pleando medios nutritivos que contienen distintas
combinaciones y concentraciones de auxinas y cito-
quininas. La siguiente etapa es la de enraizamiento,
en la que se van a formar raíces adventicias, para lo
cual se emplean reguladores de crecimiento de tipo
auxina como el IBA a concentraciones entre 1 y 10
µM durante un breve periodo de tiempo (unas ho-
ras), o bien a concentraciones de entre 0.1 y 1 µM
durante periodos de varios días a una semana. Tras
el tratamiento con la auxina, los brotes se cultivan en
soluciones sin reguladores de crecimiento y en las
semanas posteriores se producen las raíces. Cuando
la planta alcanza un tamaño adecuado se extrae del
contenedor y del medio nutritivo y se transplanta
122
en un sustrato (arena, compost, vermiculita, etc.)
hasta que transcurre un periodo de aclimatación en
invernadero que permite que la planta se endurez-
ca y pueda tolerar un ambiente normal.
En algunas especies, la etapa de regeneración
también se puede producir mediante la inducción
de embriogénesis somática. Cuando esta opción es
posible, permite evitar la fase de enraizamiento al
ser los embriones somáticos estructuras bipolares
que germinan y dan vástagos y raíces simultánea-
mente.
Semillas artificiales
La embriogénesis somática tiene diferentes apli-
caciones, entre las que se encuentra la obtención
de semillas arti�iciales o sintéticas. Estas semillas
se pueden conseguir de distintas maneras, pero
el procedimiento más utilizado es el que da lugar
a embriones somáticos hidratados encapsulados
en una cubierta protectora de alginato de calcio. El
procedimiento consiste en sumergir a los embrio-
nes somáticos en una solución nutritiva que además
contiene alginato de sodio al 2%. A continuación
se trans�ieren a una solución acomplejante de Ca
(NO3)2, 100 mM. Ello induce la formación de esferas
que contienen el embrión junto con un endospermo
arti�icial con las sustancias incluidas en el medio
nutritivo. También se pueden recubrir las cápsu-
las con alguna sustancia como el polioxietilenglicol
para evitar la deshidratación de los embriones.
Lógicamente, para obtener semillas arti�iciales es
necesario contar con un protocolo de inducción
de embriogénesis somática muy e�icaz, que ade-
más permita la producción sincronizada de los
embriones y a una escala industrial. Actualmente
se obtienen semillas arti�iciales en especies como
alfalfa, zanahoria y algunos árboles y especies de
propagación vegetativa, como la caña de azúcar y
especies ornamentales. También resulta de gran
interés la obtención de estas semillas en la propaga-
ción de ejemplares «élite» de especies arbóreas, que
tienen una propagación normal a través de semillas
pero que son altamente heterocigóticas y, por tanto,
en su descendencia sexual se produce una segrega-
ción génica muy grande, que no permite mantener
la combinación de alelos de distintos genes que pre-
sentaba la planta madre.
Saneamiento vegetal
Es la obtención de plantas libres de virus por cultivo
in vitro de meristemos. La infección de las plantas
por distintos patógenos reduce los rendimientos de
 Cultivos celulares
Tema 4, página 34

Figura 4.11. Figura

Comparación entre el método
4.11: Comparación entretradicional de obtención
el método tradicional de líneas de
de obtención puras y la
líneas pu-obtención de
rasmediante
doblehaploides y la obtención de doblehaploides
androgénesis mediante
o ginogénesis in androgénesis o ginogénesis
vitro, que son in u
líneas puras vitro,
homocigotas al
que son
haberse duplicado líneas
los puras y homocigotas
cromosomas al haploide.
de la planta haberse duplicado los cromosomas de la plan-
ta haploide.

4.3. Cultivo de microorganismos

las cosechas y, en algunos

Muchas de las casos,
técnicaslas hacen inviables.
y materiales somete
utilizados enaella planta
cultivo infectada a una temperatura ele-
de microorganismos
Uno de lossonpatógenos de mayor importancia econó- vada (termoterapia
semejantes a los ya explicados en el epígrafe de cultivos de células entre 34 y 38 °C) durante varias
animales
mica son los virus. Las plantas que se reproducen semanas antes de la extracción de losalgo
meristemos.
de este mismo capítulo. Por ejemplo, el uso de cabinas de flujo laminar es
sexualmente no suelen tener problemas sanitarios
habitual, e incluso necesario, cuando se trabaja con microorganismos
asociados a infecciones víricas, ya que estos no se
transmiten potencialmente
a través de laspatógenos,
semillas. Sinen embargo, Obtención
este último caso, de plantas
dependiendo deldoblehaploides
grado de riesgo
las plantasdel
demicroorganismo, se usan
propagación vegetativa cabinas
pueden de clase I, II o III, además de los sistemas de
estar Una de las aplicaciones del cultivo in vitro de mayor
infectadascontención
por virus, que correspondientes.
se transmiten conAsimismo,
alta e�i- los sistemas de esterilización en el
utilidad en la Mejora Genética Vegetal es la produc-
cacia a laslaboratorio
plantas queson básicos, ahasta
se obtienen partirtalde punto
ellas. que todo el material de uso común debe
ción de plantas doblehaploides obtenidas a partir
Para eliminar la infección vírica
ser esterilizado, o si sesehaadquiere
recurrido yal es de un solo uso, debe suministrarse
del cultivo de microsporas o de óvulos. Siguiendo
cultivo in esterilizado
vitro de meristemos,
de forma yaindustrial;
que no suelenestote-es aplicable
distintostanto a los es
protocolos medios
posiblede cultivo,
obtener líneas puras
ner virus ocomo
se encuentran en muy
a cualquier baja concentración
material que se vaya a usar. Igualmente, las técnicas de trabajo
debido a diferentes causas como son: la presencia –y por tanto homocigóticas– en muy poco tiempo,
deben ir encaminadas a evitar la contaminación de medios
acortando en o materiales
varios años los durante la de mejora
programas
de un sistema vascular poco desarrollado, una ele-
manipulación
vada actividad metabólicadeque
microorganismos,
impide que los virus ya seanencaminados
bacterias, hongos o virus, es
a la obtención de decir,
nuevassevariedades
deben seguir unas normas
las invadan y elevadas concentraciones endógenas rigurosas que vegetales
contribuyan(Figura
a 4.11).
trabajar enEn general,
condiciones se parte de
de auxinasasépticas.
que inhibirían la multiplicación viral. El plantas madres donadoras de las microsporas o de
En cualquier
tamaño de los meristemos que secaso, y debido
cultivan los óvulos, que son heterocigotas
a la peculiaridad que presentan las técnicas
es crítico, para un núme-
ya que si son demasiado
de cultivo pequeños no suelen
de microorganismos, rege-
a continuaciónro elevado
se indicade de
genes.
maneraLas microsporas
más detallada o los óvulos
nerar plantas, derivados de estas plantas van a representar una
comoy deben
si son demasiado grandescultivos.
realizarse dichos ya han Dado que el cultivo de virus exige una
sido invadidos por los virus. muestra aleatoria del conjunto de gametos paren-
metodología algo La elección
diferente a del tamaño para las bacterias y hongos, se tratará de
la utilizada
óptimo se realiza empíricamente y depende de cada tales que se originan tras recombinación y meiosis.
manera individualizada posteriormente.
especie e incluso del genotipo. Por tanto, el número de gametos teóricamente
En algunos casos, es necesario recurrir a un tra- posibles será de 2n, siendo n el número de loci hete-
tamiento de quimioterapia con sustancias como la rocigóticos que tiene la planta madre.
Ribavirina o Virazone (10-100mg/L) que se añaden Tras el proceso de cultivo in vitro se generan
a los medios nutritivos en los que se han sembrado plantas haploides que, tras la duplicación espontá-
los meristemos. En otras ocasiones se puede me- nea o inducida de sus cromosomas, darán origen a
jorar la e�iciencia en la eliminación de virus, si se líneas puras y por tanto homocigotas. Para duplicar

123
Métodos en biociencias
los cromosomas se emplean distintas sustancias,
pero la más utilizada es la colchicina. El tratamien-
to se da habitualmente sumergiendo durante 4 a
12 h las raíces de las plantas haploides en una so-
lución de colchicina entre el 0.01-0.1% con DMSO
(0.5%) para facilitar la entrada de colchicina en
las células, y a continuación hacer lavados prolon-
gados de las raíces para eliminar la colchicina, que
es muy tóxica. En algunas de las células habrá ac-
tuado la colchicina duplicándose los cromosomas,
y las plantas o tejidos u órganos que se regeneren
a partir de estas células serán diploides y podrán
dar lugar a semillas normales. La probabilidad de
encontrar dos plantas genotípicamente idénticas
es prácticamente cero. Las plantas obtenidas son
de un enorme interés, y sirven para seleccionar
aquellas que muestren las características desea-
das, con la gran ventaja de que en un solo paso se ha
conseguido �ijar las combinaciones alélicas en ho-
mocigosis, siendo genéticamente estables cuando
se pasa de una generación a la siguiente a través de
autofecundación.
4.3. Cultivo de microorganismos
Muchas de las técnicas y materiales utilizados en el
cultivo de microorganismos son semejantes a los ya
explicados en el epígrafe de cultivos de células ani-
males de este mismo capítulo. Por ejemplo, el uso de
cabinas de �lujo laminar es algo habitual, e incluso
necesario, cuando se trabaja con microorganismos
potencialmente patógenos, en este último caso, de-
pendiendo del grado de riesgo del microorganismo,
se usan cabinas de clase I, II o III, además de los sis-
temas de contención correspondientes. Asimismo,
los sistemas de esterilización en el laboratorio son
básicos, hasta tal punto que todo el material de uso
común debe ser esterilizado, o si se adquiere y es de
un solo uso, debe suministrarse esterilizado de for-
ma industrial; esto es aplicable tanto a los medios
de cultivo como a cualquier material que se vaya a
usar. Igualmente, las técnicas de trabajo deben ir
encaminadas a evitar la contaminación de medios o
materiales durante la manipulación de microorga-
nismos, ya sean bacterias, hongos o virus, es decir,
se deben seguir unas normas rigurosas que contri-
buyan a trabajar en condiciones asépticas.
En cualquier caso, y debido a la peculiaridad
que presentan las técnicas de cultivo de microor-
ganismos, a continuación se indica de manera más
detallada como deben realizarse dichos cultivos.
Dado que el cultivo de virus exige una metodolo-
gía algo diferente a la utilizada para las bacterias y
124
hongos, se tratará de manera individualizada pos-
teriormente.
4.3.1. Tipos nutricionales de microorganismos
Cultivar y mantener los microorganismos en el la-
boratorio signi�ica conocer los requerimientos
nutricionales de los mismos. Los microorganismos,
y en general todos los seres vivos, se clasi�ican en
función de tres requerimientos fundamentales: (1)
la fuente de carbono, dividiendo a los microorganis-
mos en autótrofos, cuando la fuente de carbono es el
CO2 , y heterótrofos, cuando la fuente de carbono son
moléculas orgánicas; (2) la fuente de energía, divi-
diendo a los microorganismos en fotótrofos, cuando
usan la luz como fuente de energía, y quimiótrofos,
cuando usan la energía derivada de reacciones de
oxidación, y (3) la fuente de electrones, dividien-
do a los microorganismos en organótrofos, cuando
la fuente de electrones es una molécula orgánica, y
litótrofos, cuando son moléculas inorgánicas redu-
cidas (Cuadro 4.2). Cualquier microorganismo se
puede nombrar citando sus tres requerimientos,
es decir, hay microorganismos fotolitoheterótro-
fos o, por ejemplo, quimiolitótrofos autótrofos. Los
microorganismos que son quimiolitoheterótrofos
reciben el nombre especial de mixótrofos. La capa-
cidad metabólica de los microorganismos permite
encontrar cualquier tipo nutricional entre ellos, no
como en el caso del metabolismo de animales y
plantas, que queda reducido a quimioorganótrofos
heterótrofos o fotolitótrofos autótrofos, respectiva-
mente.
En un ambiente natural, la mayoría de los mi-
croorganismos se encuentran formando parte de
mezclas de diferentes tipos de individuos, excep-
tuando, por ejemplo, los ambientes extremos de
pH, temperatura o salinidad, donde puede apare-
cer, cuando las condiciones son muy extremas, un
solo tipo de microorganismo. Hoy en día se cuenta
con técnicas metodológicas que permiten estudiar
a los microorganismos en su propio ambiente, sin
importar si hay poblaciones mixtas; sin embar-
go, el gran desarrollo de la microbiología vino de
la mano de la puesta a punto de una técnica que
permitiera aislar los microorganismos y proceder a
su estudio de manera individualizada. Esta técnica
tiene su base en el desarrollo de los medios de cul-
tivo sólidos. A pesar de ello, y después de años de
estudio y perfeccionamiento de innumerables me-
dios de cultivo, solo se ha conseguido aislar un 1%
de los microorganismos presentes en los ambien-
tes naturales, por tanto, queda mucho por hacer en
este campo.

Cuadro 4.2: Tipos nutricionales de los microorganismos
FUENTE DE ENERGÍA
Luz
Oxidación de compuestos químicos
FUENTE DE ELECTRONES
Moléculas inorgánicas reducidas
Moléculas orgánicas
FUENTE DE CARBONO
CO2
Moléculas orgánicas reducidas
En cualquier caso, y como se mencionaba
anteriormente, conocer los requerimientos nutri-
cionales de un microorganismo es muy importante
para poder cultivarlo en el laboratorio. Además, hay
que tener en cuenta que el mundo microbiano
es muy �lexible metabólicamente hablando, pues
muchos microorganismos pueden cambiar sus
requerimientos nutricionales en función de las con-
diciones y nutrientes presentes en el lugar en que
medran, lo que les permite adaptarse rápidamente
a las variaciones que tienen lugar en sus ambientes
naturales. Esto puede ser de gran ayuda a la hora
de buscar las mejores condiciones y composición
del medio de cultivo para su crecimiento y mante-
nimiento.
4.3.2. Medios de cultivo
Un medio de cultivo se puede de�inir como una
mezcla de nutrientes, generalmente en agua, que
permiten el crecimiento de los microorganismos.
En general, un medio de cultivo debe contener una
fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y otros
elementos esenciales para los seres vivos como son:
fósforo, azufre y otros minerales; la naturaleza de
Cuadro 4.3: Clasi�icación de los medios de cultivo microbianos atendiendo a sus características químicas, �ísicas y funcionales.
Químicas
· Sintéticos o definidos · Líquidos
· Complejos · Sólidos
· Semisólidos
Cultivos celulares
TIPO
Fotótrofo
Quimiótrofo
TIPO
Litótrofo
Organótrofo
TIPO
Autótrofo
Heterótrofo
cada uno de los componentes y su cantidad, permi-
ten generar un gran número de medios distintos,
adaptado cada uno de ellos a un microorganismo
en particular. En algunos casos, es necesario utili-
zar medios elaborados con componentes naturales
para intentar mimetizar el medio ambiente natu-
ral y, de esta manera, favorecer el crecimiento de
microorganismos, que en otros medios, como los
sintéticos, no crecerían. Una estrategia importante
a la hora de preparar medios de cultivo, con objeto
de que crezca alguno de ese 99% de microorganis-
mos que forman la parte del mundo microbiano no
cultivable, es la de ser imaginativo con las condicio-
nes de cultivo y, sobre todo, con la composición de
los medios.
Los medios de cultivo pueden clasi�icarse en
función de sus características químicas, �ísicas o
funcionales (Cuadro 4.3).
Atendiendo a sus características químicas
se puede hablar de medios sintéticos o de�inidos
y complejos. Los primeros son medios de cultivo
donde se conoce la composición cualitativa y cuan-
titativa de los mismos, fundamentalmente por
haberlos preparado pesando o añadiendo concen-
traciones conocidas de los distintos componentes;
Físicas Funcionales
· Enriquecimiento
· Selectivos
· Diferenciales (Cromogénicos)
125
Métodos en biociencias
por tanto, la preparación de los mismos consiste en
seguir una receta de�inida. Por el contrario, un me-
dio complejo es un medio de cultivo donde no se
conoce exactamente la composición del mismo, ge-
neralmente porque alguno de los componentes es
complejo sin una composición exacta. Por ejemplo,
un medio de cultivo con la siguiente composición:
KH2PO4 (1 g), HNa2PO4.7H2O (4 g), NaCl (0.2 g), Ca
Cl2.2H2O (0.05 g), MgSO4.7H2O (0.2 g), glucosa (6
g) y agua (1 L), sería un medio de�inido o sintéti-
co; sin embargo, si al mismo medio se le añaden 2
g de extracto de levadura, el medio se consideraría
complejo, ya que la composición exacta del extracto
de levadura no es conocida e incluso, si se supiera,
podría variar según el lote de producción de di-
cho extracto o del origen comercial del mismo. Al
igual que el extracto de levadura, otros componen-
tes como el extracto de carne, las peptonas (que
son hidrolizados proteicos de diferentes fuentes),
etc., tienen una composición no de�inida y suelen
ser compuestos muy ricos que aportan nutrientes
como vitaminas, aminoácidos esenciales, ácidos or-
gánicos, etc., que permiten un buen crecimiento de
la mayoría de los microorganismos cultivables. Si
hubiera que añadir de manera individual cada uno
de los nutrientes que aportan los diferentes extrac-
tos, realizar el medio de cultivo sería un proceso
complejo y costoso. A veces se habla de medios de
cultivo enriquecidos, son medios comunes (aque-
llos que llevan los componentes mínimos para
permitir el crecimiento de microorganismos) a los
que se les añade algún componente especial que
permite el crecimiento de microorganismos muy
exigentes en sus requerimientos nutricionales. Este
tipo de componente puede ser sangre, suero, yema
de huevo… y, por lo tanto, también podrían ser con-
siderados como medios complejos.
En resumen, un medio de�inido o sintético es
un medio preparado para cultivo de un microorga-
nismo o microorganismos concretos, de los cuales
se sabe sus requerimientos nutricionales, y se usa
fundamentalmente para estudiar aspectos �isiológi-
cos de dichos organismos, añadiendo o sustituyendo
diferentes componentes del medio. Los medios
complejos, como ya se ha comentado, contienen
ingredientes cuya composición es di�ícil de estable-
cer, pero por su riqueza son utilizados cuando no
se conocen los requerimientos nutricionales de los
microorganismos a estudiar o se pretende que crez-
ca la mayor variedad posible de microorganismos.
Este último tipo de medio de cultivo sería el elegido
si, por ejemplo, se desea estudiar la diversidad mi-
crobiana presente en una muestra ambiental.
126
Atendiendo a sus características �ísicas, los
medios de cultivo pueden ser líquidos, sólidos y
semisólidos. Los medios líquidos, como su propio
nombre indica, son medios preparados en agua,
sin ningún componente que los espese o geli�ique;
suelen recibir también el nombre de caldos. Estos
caldos pueden, como ya se ha mencionado anterior-
mente, ser de�inidos o complejos. Un medio sólido
puede ser un caldo al que se le añade un compo-
nente que lo geli�ica, usualmente agar. El agar es
un polímero sin rami�icaciones, compuesto prin-
cipalmente por dos fracciones, una es la agarosa
(cadenas de D-galactosa y 3.6-anhidro-L-galacto-
sa) y otra es la agaropectina (cadenas sulfatadas
de D-glucurónico); se extrae de las paredes celu-
lares de algas rojas (Rhodophyta), principalmente
de los géneros Gelidium y Gracilaria. Su uso signif-
có el despegue de la Microbiología, ya que desde su
introducción, desarrollada por la escuela de Koch,
sistemáticamente se pudieron aislar individual-
mente microorganismos de una manera rápida, sin
necesidad de realizar diluciones y así proceder a
su estudio, cosa que en medio líquido no se podía
conseguir. Es importante destacar que cada colonia
obtenida en el medio sólido (también denominada
unidad formadora de colonia, UFC) correspondería
al crecimiento, entendido como un aumento pobla-
cional, de un solo tipo de microorganismo. El agar
es un compuesto insoluble que se solubiliza cuando
se calienta por encima de 95 °C, y una vez solubili-
zado, se solidi�ica cuando se enfría por debajo de 45
°C. El proceso se puede volver a repetir si se calienta
de nuevo por encima de 95 °C. El agar es un com-
puesto que muy pocos microorganismos pueden
degradar, convirtiéndolo en un componente ideal
para solidi�icar los caldos de cultivo. La concentra-
ción utilizada de agar en estos medios es de 15 a
20 g/L. Un medio semisólido es un medio en el que
la concentración de agar es de 5 g/L y no se obtie-
ne un medio de cultivo realmente sólido. Estos tipos
de medio de cultivo se suele utilizar para estudiar la
movilidad de los microorganismos.
Atendiendo a sus características funcionales
se distinguen diferentes tipos de medios de culti-
vo. Los medios de cultivo de enriquecimiento son
medios diseñados para permitir el crecimiento de
microorganismos que se encuentran en baja pro-
porción con respecto a otras poblaciones y que, en
el caso de usarse otro tipo de medios, serían muy di-
�íciles de detectar, pasando desapercibidos. Es decir,
se trata de enriquecer el número y proporción de un
determinado tipo de microorganismo minoritario.
Un ejemplo podría ser el aislamiento de microorga-
nismos de muestras del suelo capaces de degradar

el fenol; en este caso, al añadir fenol como única
fuente de carbono en el medio, se estaría enrique-
ciendo el número de los microorganismos capaces
de degradarlo, siendo más fácil su aislamiento. Los
medios de cultivo selectivos son aquellos medios
que debido a su composición permiten el crecimien-
to de un microorganismo en particular. Por ejemplo,
las sales biliares o colorantes como el cristal violeta,
a una determinada concentración, inhiben el creci-
miento de bacterias gram positivas, de manera que
un medio que contenga estos componentes, se pue-
de utilizar para favorecer el crecimiento de bacterias
gram negativas. Los medios de cultivo diferenciales
son medios que, debido a su composición, permiten
diferenciar entre grupos diferentes de microorga-
nismos, e incluso poder realizar una identi�icación
tentativa de los mismos. Por ejemplo existe un me-
dio de cultivo denominado agar-sangre (que podría
considerarse también un medio enriquecido) que
permite diferenciar bacterias hemolíticas (como
los estreptococos y los esta�ilococos) de bacterias
no hemolíticas, aisladas de la garganta. Además hay
que señalar que algunos medios diferenciales son
a la vez selectivos, como por ejemplo el medio de
Levine, que es selectivo al inhibir el crecimiento de
las bacterias gram positivas y luego permite dife-
renciar el crecimiento de Escherichia coli de otras
bacterias gram negativas. Existen otros muchos
medios de cultivos diferenciales, y cualquier in-
vestigador puede desarrollar uno que le permita
diferenciar tipos diferentes de microorganismos,
ya sea porque generan un color diferente o por-
que crean halos de aclaramiento (como por ejemplo
en el agar-sangre) o de precipitación (zonas alre-
dedor de las colonias que se vuelven turbias por
precipitación de sustancias debido a la acción de
los microorganismos). Hay un tipo especial de me-
dios diferenciales que son los denominados medios
de cultivo cromogénicos. Estos medios se utilizan
cada vez más en laboratorios de microbiología clí-
nica porque, gracias a su composición, permiten de
forma rápida diferenciar no solo entre dos grupos
diferentes de microorganismos, sino también a ni-
vel de género. Este tipo de medios se basan en la
composición del medio de cultivo, que permite que
cada género reaccione de manera concreta con un
determinado sustrato, generando diferentes colo-
res según el tipo de microorganismo presente. Por
ejemplo, en la �igura 4.12 se muestra un medio de
cultivo cromogénico para análisis de infecciones
del tracto urinario. Los diferentes colores de las co-
lonias que pueden aparecer se corresponden a las
especies Escherichia coli (rosa), Enterobacter ae-
rogenes y Klebsiella pneumonieae (azul oscuro),
127
Cultivos celulares
Figura 4.12: Medio de cultivo cromogénico uti-
lizado para el análisis de infecciones del tracto
urinario. Los distintos colores de las colonias
representan géneros bacterianos diferentes.
Disponible en color.
Proteus miriabilis (marrón claro), Staphylococcus
aureus (blanco-crema) y Enterococcus faecalis (azul
claro).
4.3.3. Preparación de los medios de cultivo
En un laboratorio de microbiología se utilizan me-
dios de cultivo para diferentes cometidos, por
ejemplo: para el mantenimiento de microorganis-
mos, para prácticas docentes, para investigación,
etc. Todos los medios de cultivo se pueden comprar
a casas comerciales o prepararlos en el propio labo-
ratorio. Estos últimos suelen ser los que se utilizan
en investigación, ya que se suelen preparar con
componentes especiales que permitan realizar esos
estudios. Los medios comerciales suelen vender-
se deshidratados, y la preparación de los mismos
se reduce a pesar una cantidad determinada de
producto y añadir el agua destilada que indique el
fabricante en las instrucciones.
Los medios de cultivo se preparan en matra-
ces que nunca deben llenarse por completo, para
permitir agitarlos de manera adecuada y así, al
deshacer los posibles grumos de los medios deshi-
dratados, obtener siempre una mezcla homogénea
de sus componentes.
Una vez disueltos los medios en sus matra-
ces, se tapan con algodón graso o con tapones que
se pueden comprar para este uso. Posteriormente
hay que esterilizar los medios, y para ello se pue-
den seguir dos vías, una de ellas consiste en repartir
Métodos en biociencias
el medio en los recipientes �inales y seguidamente
autoclavarlos. Este procedimiento suele realizar-
se cuando el medio de cultivo es líquido o cuando
es sólido y se reparte, por ejemplo, en tubos que se
inclinarán posteriormente para obtener tubos con
cultivos sólidos en pico de �lauta. La segunda vía se
caracteriza por repartir el medio una vez esteriliza-
do, por ejemplo, los medios de cultivo sólidos que
se reparten en placas Petri estériles. En este caso
el medio de cultivo se esteriliza también en el au-
toclave, pero en el mismo matraz donde se preparó
y, posteriormente, una vez enfriado hasta tempe-
raturas que no estén por debajo de 45 °C (si no se
solidi�icaría el medio), se agita bien para homoge-
neizarlo nuevamente y se reparte en las placas en
un ambiente estéril (campanas de �lujo laminar).
Las placas, con su contenido, se dejan parcialmen-
te abiertas, para impedir que se acumule vapor de
agua y, una vez que se solidi�ica el medio de culti-
vo, se cierran. Otra opción que realizan muchos
laboratorios cuando trabajan con medios sólidos
destinados a preparar placas Petri, es repartir pre-
viamente la cantidad adecuada de medio en tubos y
esterilizarlos. Los tubos se conservan a 4 °C y cuan-
do se necesitan placas se pone el número necesario
de tubos con medio al baño María o en el microon-
das con objeto de licuarlos y, seguidamente, se
añaden a las placas Petri.
Si hay algún componente termolábil en la com-
posición del medio de cultivo, este debe añadirse
después de haber esterilizado el medio. En este caso
hay que esperar a que se enfríe el medio a tempera-
tura ambiente (o hasta 45 °C, si contiene agar en su
composición) y añadir en condiciones estériles el
componente termolábil, previamente esterilizado
por �iltración usando el �iltro adecuado. Los medios
de cultivo tanto líquidos como sólidos, una vez este-
rilizados, se pueden conservar hasta su uso a 4 °C.
4.3.4. Cultivo de microorganismos
El resultado visual �inal del cultivo de los microor-
ganismos en un medio líquido y en un medio sólido,
independientemente de sus características quí-
micas o funcionales, es lógicamente diferente. A
continuación se comenta como se visualiza el cre-
cimiento de microorganismos en ambos tipos de
medio.
Cultivo en medio líquido
En un cultivo líquido el crecimiento de microorga-
nismos da lugar a un aumento de la turbidez, esto
128
es debido a que una gran cantidad de la biomasa
del organismo, que se genera en el transcurso de
la incubación, permanece en suspensión. En deter-
minadas condiciones los microorganismos pueden
aparecer adheridos a las paredes de los matraces,
esto es debido a un tipo particular de crecimiento
denominado biopelículas.
Durante el crecimiento de un microorganismo
en un medio líquido se reconocen 4 fases, que se
diferencian entre sí por la velocidad de crecimien-
to que poseen en dicha fase y que se traduce en un
signi�icativo aumento poblacional. Estas fases son
similares a las ya comentadas en este tema para las
células eucariotas (ver �igura 4.6).
La fase de latencia o retraso, en la que el nú-
mero de microorganismos no aumenta pues el
microorganismo está adaptando su maquinaria me-
tabólica a la composición del medio de cultivo.
La fase exponencial o logarítmica, en la que el
microorganismo está dividiéndose a la máxima ve-
locidad de crecimiento que puede desarrollar, de
acuerdo a la composición y las condiciones de cul-
tivo. La variación de las células o de biomasa en el
tiempo podría representarse usando la siguiente
ecuación: dN/dt = µN, donde N es la cantidad de cé-
lulas o de biomasa, t es el tiempo y µ es la velocidad
de crecimiento.
La fase estacionaria, en la que no se aprecia un
crecimiento poblacional de los microorganismos, y
en donde la variación del número de células o de
biomasa con el tiempo es cero (dN/dt = 0). Esto es
debido al agotamiento de los nutrientes del medio,
o a que los microorganismos se estén muriendo y
dividiendo a la misma velocidad, o bien, simplemen-
te, a que las células no se están dividiendo aunque
son metabólicamente activas. Es una fase que se
caracteriza por la producción de metabolitos se-
cundarios por parte de algunos microorganismos.
Industrialmente esta fase tiene gran interés, dado
que los metabolitos secundarios pueden tener ac-
tividades biológicas y tener importancia médica
(antibióticos, inmunomoduladores, anticanceríge-
nos, etc.). Por otro lado se puede considerar que
esta fase es la más representada en los ambientes
naturales, donde los microorganismos raramente
pueden encontrar concentraciones óptimas de nu-
trientes y las condiciones necesarias para crecer a
la máxima velocidad de crecimiento.
La fase de muerte, en la que la velocidad de
muerte es mayor que la de división, observándose
que la variación del número de células o de la can-
tidad de biomasa tiene una pendiente negativa, es
decir (dN/dt = (µ-k)N, donde k es la velocidad de
muerte y se cumple que µ<k).

En microbiología es importante conocer el
tiempo de duplicación, es decir, el tiempo que tar-
da en dividirse el microorganismo, lo que ocurre es
que este valor es diferente si se habla de células o de
biomasa. En el ámbito industrial se pre�iere hablar
de duplicación de biomasa, ya que muchas veces
se trabaja con microorganismos �ilamentosos y es
complicado hablar de duplicación de células.
El tiempo de duplicación, cuando se habla de la
duplicación de células, se calcula de la siguiente ma-
nera. Si N0 = número inicial de células, Nt = número
de células después de un tiempo t, y n = número de
generaciones en ese tiempo t, se puede decir que Nt
= N0 x 2n. Tomando logaritmos y despejando n, la an-
terior ecuación quedaría como
n = (Log Nt – Log N0)/Log 2 [4.1]
y si la velocidad de crecimiento (µ) es el número de
generaciones por unidad de tiempo se obtiene que
µ=n/t. Sustituyendo n por la ecuación [1], se obten-
dría:
µ = (Log Nt – Log N0)/Log 2 x t [4.2]
Si se denomina tiempo de duplicación o de genera-
ción (g) al tiempo necesario para que se duplique
una población, es decir: Nt = 2N0 y se sustituye el va-
lor de Nt en la ecuación [2] cuando t = g, entonces
quedaría:
µ = (Log 2N0 – Log N0)/Log 2 x g
y despejando g:
g = 1/μ
Es decir, que el tiempo de duplicación de células es
la inversa de la velocidad de crecimiento.
El tiempo de duplicación cuando se habla de
la duplicación de biomasa se calcula de la siguiente
manera. Si X = biomasa, t = tiempo y µ = velocidad
de crecimiento, se puede decir que dX/dt = µ X, que
tras integrar quedaría como Xt = X0 eµt, donde X0 es
la biomasa a tiempo cero y Xt es la biomasa después
de un tiempo t. Si se toman logaritmos neperianos,
se tiene que
Ln Xt = Ln X0 + µt [4.3]
y si se denomina tiempo de duplicación o de gene-
ración (g) al tiempo necesario para que se duplique
la biomasa, es decir: Xt = 2X0 se puede sustituir el va-
lor de Xt en la ecuación [3] cuando t = g, y entonces
quedaría:
Ln 2X0 = Ln X0 + µg
y despejando g:
129
Cultivos celulares
g = Ln2/μ
Es decir, que el tiempo de duplicación de la biomasa
es el logaritmo neperiano de dos partido por la ve-
locidad de crecimiento.
Cultivo en medio sólido
En un cultivo sólido el crecimiento de microorga-
nismos da lugar a la aparición de una «colonia» o
también denominada UFC, como ya se ha dicho an-
teriormente. Una UFC corresponde al crecimiento
de un solo microorganismo cuando se ha realiza-
do un buen aislamiento. La forma, tamaño y color
de las colonias permite distinguir diferentes mor-
fotipos, lo que en algunos casos tiene importancia
taxonómica. Las fases que se han mencionado en los
cultivos líquidos también se darían en este tipo de
cultivo, lo que ocurre es que su medición sería más
complicada.
El perfeccionamiento de los cultivos sólidos
permitió el gran desarrollo de la microbiología ya
que se pudo aislar cada tipo de microorganismo
(cultivo puro) y estudiarlo detalladamente en los
laboratorios microbiológicos. De todas formas, hay
que tener en cuenta que el microorganismo aisla-
do podría no comportarse de igual manera en los
ambientes naturales y, por lo tanto, hay que ser cui-
dadoso con las conclusiones obtenidas. Las nuevas
técnicas aplicadas en el ámbito de la ecología mi-
crobiana, que estudian a los microorganismos en
sus ambientes naturales sin necesidad de cultivar-
los, permiten tener una idea más real y global de las
funciones que desarrollan. En cualquier caso, las
técnicas de aislamiento necesarias para obtener el
crecimiento de microorganismos en medios sólidos
son de gran importancia y, por esta razón, se trata-
rán en profundidad en el siguiente punto.
Finalmente hay que incidir en que los microor-
ganismos que se pueden aislar y crecer en medios
sólidos constituyen la �lora cultivable de cualquier
ambiente natural, pero esta �lora, gracias a las
novedosas técnicas de biología molecular, se ha es-
timado que es tan solo el 1% de la �lora total, con lo
cual todavía queda mucho por descubrir. Además,
el aislamiento de determinados microorganismos
en medios sólidos no signi�ica que sean los más
abundantes o los más importantes en un ambiente
natural, sino los que están más adaptados al medio
de cultivo sólido utilizado; en este sentido seguir
ideando nuevos medios de cultivo es de gran impor-
tancia para poder aislar y estudiar el mayor número
posible de microorganismos de esa �lora todavía no
cultivable (99%).
Métodos en biociencias

Figura 4.13: (A) Siembra por extensión. UFC: unidad formadora de colonias. (B) Diluciones seriadas de una muestra con una alta concen-
tración de microorganismos; para calcular su número solo hay que multiplicar el número de colonias de una placa en la que no haya más
de 300 UFC por el valor inverso del factor de dilución de dicha placa y por el valor inverso del volumen de inóculo utilizado (N=c x 1/d x 1/i;
siendo «c» el número de colonias contadas, «d» la dilución de la que procede el inóculo y «i”»el volumen de inóculo utilizado).

4.3.5. Técnicas de aislamiento hubieran coincidido microorganismos diferentes en

de microorganismos en cultivos sólidos
Las personas dedicadas al estudio de los microor-
ganismos deben asegurarse que están trabajando
con cultivos puros, es decir, con un solo tipo de
microorganismo, por tanto, como se ha razonado
anteriormente, el aislamiento de microorganismos
en medios de cultivo sólidos es de gran importancia
en microbiología y para ello hay diferentes técnicas.
Lo normal, para lograr el objetivo de tener cultivos
puros, es repetir el aislamiento varias veces, de for-
ma consecutiva y a partir de UFCs ya aisladas, ya
que podría suceder que en el primer aislamiento
una misma UFC.
Las técnicas para aislar microorganismos en
medios sólidos son: siembra por extensión, siem-
bra por agotamiento y siembra en profundidad o en
masa.
Siembra por extensión
En esta técnica (Figura 4.13a) se trans�iere un pe-
queño volumen de muestra líquida a una placa Petri
que contiene un medio adecuado y, a continuación,
se extiende completamente mediante un asa acoda-
da estéril (asa de Digralsky). Una vez extendida la

130
 Cultivos celulares

A B

Figura 4.14: Siembra por agotamiento. (A) Distintos patrones de líneas que se pueden utilizar. (B)
Ejemplo de siembra por agotamiento.

muestra se procede a incubar la placa boca abajo a Siembra en profundidad o en masa

la temperatura adecuada. En este tipo de siembra
se suele realizar una dilución seriada de la mues-
tra (Figura 4.13b) para intentar lograr un número
de UFC por placa comprendido entre 30 y 300, ya
que si no fuera así las colonias solaparían unas con
otras.
Siembra por agotamiento
En este caso (Figura 4.14) la siembra se hace me-
diante un asa realizando líneas sobre el medio de
cultivo. La idea es arrastrar los microorganismos
por la placa realizando distintos patrones de líneas,
con el objetivo de separarlos individualmente dan-
do lugar a UFC aisladas.
Se utiliza frecuentemente para hongos y también
para bacterias que tengan necesidad de condiciones
bajas de oxígeno. En este tipo de siembra (Figura
4.15) también se pueden realizar diluciones se-
riadas de la muestra con el �in de poder obtener
colonias aisladas.
Para el aislamiento se toman, si es necesario,
alícuotas de cada dilución y se depositan en la su-
per�icie de una placa Petri; a continuación se añade
el medio de cultivo líquido atemperado a 45 °C, se
agita y se deja solidi�icar. Posteriormente se incuba
la placa boca abajo a la temperatura adecuada. Las
UFC aparecerán incluidas en el medio de cultivo.

Figura 4.15: Siembra en profundidad o en masa.

131
Métodos en biociencias
4.3.6. Factores físicos y químicos que afectan
al cultivo de microorganismos
Existen distintos factores, tanto �ísicos como
químicos, que afectan al crecimiento de los mi-
croorganismos y, por tanto, a su cultivo; por lo que
a la hora de cultivar los microorganismos deben te-
nerse en cuenta para preparar los medios de cultivo
e incubarlos en las condiciones óptimas que permi-
tan obtener un buen crecimiento. A continuación se
comentarán los más importantes.
Temperatura
Todos los microorganismos tienen una temperatura
óptima de crecimiento, así como una temperatura
mínima por debajo de la cual no crecen y una tem-
peratura máxima por encima de la cual mueren.
Esta relación con la temperatura viene motivada
por las reacciones metabólicas que tienen lugar en
el microorganismo, ya que la velocidad de reacción
va incrementándose a medida que aumenta la tem-
peratura, hasta alcanzar un valor a partir del cual
se desnaturalizan las proteínas y el microorganis-
mo muere. No todos los microorganismos muestran
el mismo rango de temperaturas de crecimiento,
en este sentido los microorganismos pueden clasi-
�icarse de acuerdo a las mismas. Así se distinguen:
psicró�ilos (pueden crecer entre 0 y 15 °C), psicró-
trofo (pueden crecer entre 0 y 35 °C), mesó�ilos
(pueden crecer entre 15 y 45 °C), termó�ilos (pueden
crecer entre 45 y 85 °C) e hipertermó�ilos (pueden
crecer entre 70 y 110 °C). Los microorganismos que
pueden crecer a temperaturas extremas, tanto muy
bajas (por debajo de 0 °C), como muy altas (por en-
cima de 100 °C), se denominan extremó�ilos para la
temperatura, presentando adaptaciones bioquími-
cas y estructurales para poder sobrevivir en dichas
condiciones.
pH
Al igual que sucede con la temperatura, existen
rangos de pH en los cuales pueden crecer los mi-
croorganismos, y por encima o por debajo de
dichos rangos mueren rápidamente. No es de ex-
trañar que esto ocurra así ya que las reacciones
metabólicas están muy in�luenciadas por el pH. Los
microorganismos atendiendo al pH que necesitan
en su entorno para poder desarrollarse, se dividen
en: acidó�ilos (crecen entre pH 3 y 5.5), neutró�ilos
(crecen entre pH 5.5 y 7.5) y alcaló�ilos o basó�i-
los (crecen entre pH 7.5 y 10). Por debajo de pH 3
y por encima de 10 crecen pocos tipos de microor-
132
ganismos y los que pueden hacerlo se denominan
extremó�ilos para el pH, presentando adaptaciones
bioquímicas y estructurales.
Actividad de agua
La actividad de agua (aw) es la relación entre la pre-
sión de vapor de la solución (Psol) y la del agua pura
(Pagua). Es decir Aw = Psol/Pagua. Es un concepto que
indica la cantidad de agua disponible, y es esen-
cial para los microorganismos puesto que todos en
mayor o menor medida necesitan agua. El valor de
aw puede variar entre 1, que sería el agua pura, y
0.6 representado por la miel o la leche deshidrata-
da. A baja aw se observa una drástica disminución
de la actividad metabólica, siendo en general más
sensibles las bacterias que los hongos (valores de
0.6 solo permiten el crecimiento de determinados
hongos). En los medios de cultivo, un valor bajo de
aw puede estar relacionado con altas concentracio-
nes salinas, con altas concentraciones de solutos no
iónicos (como azúcares) o con condiciones de des-
hidratación. Este último caso ocurre cuando, una
vez preparados los medios de cultivo, se dejan de-
secar en exceso por un mal almacenamiento. En
de�initiva, la composición del medio de cultivo pue-
de condicionar el valor de aw de dicho medio, que a
su vez condicionará el crecimiento de los microor-
ganismos.
Concentración de oxígeno
Existen diferentes tipos de microorganismos aten-
diendo a su necesidad o, visto de otra manera, a su
tolerancia al oxígeno:
— Aerobios, que a su vez pueden ser:
• Estrictos: necesitan oxígeno para
crecer.
• Facultativos: no es necesario el
oxígeno, pero crecen mejor en pre-
sencia de él.
• Microaeró�ilos: es necesario el
oxígeno, pero a bajas concentra-
ciones.
— Anaerobios, que a su vez pueden ser:
• Aerotolerantes: no es necesario el
oxígeno, y si está presente no cre-
cen mejor.
• Estrictos: el oxígeno es dañino
para ellos y crecen mejor en su au-
sencia.

Figura 4.16: Esquema de un fermentador.
Para que crezcan los microorganismos aerobios
en medios sólidos no es necesario aportar oxígeno
ya que las placas Petri no están selladas. En me-
dios líquidos, el cultivo se suele someter a agitación
continua para oxigenarlo. Los microorganismos mi-
croaeró�ilos se cultivan en estufas (medios sólidos
o líquidos) o en jarras cerradas herméticamen-
te (medios sólidos), donde se controla la cantidad
de oxígeno presente. Para cultivar los microorga-
nismos anaerobios también se emplean estufas
(medios sólidos o líquidos) o jarras de anaerobios
cerradas herméticamente (medios sólidos) donde,
por métodos químicos comercializados, el oxígeno
se transforma en hidrógeno y dióxido de carbono
(GasPak), creándose atmósferas totalmente libres
de oxígeno.
4.3.7. Cultivo de microorganismos a nivel
industrial
Para realizar el cultivo de microorganismos a nivel
industrial es necesario el uso de fermentadores o
también llamados biorreactores (Figura 4.16).
Existen muchos tipos diferentes de fermen-
tadores, tanto en tamaño (de pocos litros hasta
300.000 litros), como en forma (en torre, cónico-ci-
líndricos, cavitators, ciclonales etc.), debido a que
la mayoría de ellos se diseñan en función del mi-
croorganismo que se va a cultivar en su interior. Un
fermentador se puede de�inir como un recipiente
que permite el crecimiento controlado de microor-
ganismos al establecer, de manera óptima, diferentes
parámetros que in�luyen en el crecimiento del mis-
133
Cultivos celulares
mo. La obtención de volúmenes industriales de
microorganismos es interesante para obtener bio-
masa microbiana (por ejemplo levadura panadera),
para realizar biotransformaciones al actuar sobre
un determinado sustrato que se añade al medio
de cultivo y obtener así compuestos interesantes a
partir de dicho sustrato (por ejemplo esteroides), o
para producir metabolitos primarios o secundarios
(por ejemplo antibióticos, aminoácidos, ácidos or-
gánicos, etc.).
En la industria de la biotecnología microbia-
na los medios de cultivo no son como los que se
utilizan en el laboratorio. En la industria, como com-
ponentes de los medios de cultivo, se suelen utilizar
residuos de otras industrias, como cerveceras, azu-
careras, destilerías, etc., incluso se podría utilizar el
agua residual de mataderos dada su gran carga en
nutrientes. El objetivo es abaratar el coste de fabri-
cación del medio de cultivo, ya que si se hiciera tal
como se hace con los medios de cultivo de laborato-
rio sería prohibitivo y haría inviable la producción
de cualquier compuesto microbiano.
Debido a que en este capítulo se trata el culti-
vo de microorganismos, no se insistirá en el diseño
de los fermentadores y en el proceso de extracción
de los compuestos de interés a partir de los caldos
de fermentación. Sin embargo, sí que se tratará a
continuación el cultivo de los microorganismos en
los fermentadores. Dicho cultivo puede ser de tres
tipos: discontinuo (también denominado en lote
o batch), discontinuo alimentado (también deno-
minado Fed-batch) y continuo. Puede haber otros
tipos, pero serán una variación de los tres métodos
ya citados.
Cultivo discontinuo (en lote o batch)
El cultivo discontinuo es un sistema cerrado, es
decir, una vez añadido el medio de cultivo al fer-
mentador e inoculado con el microorganismo, el
proceso se inicia y no se vuelve a añadir ni sacar más
medio durante el proceso de fermentación; solo se
adicionan, si así se considera oportuno, compues-
tos para regular el pH, antiespumantes y aire estéril.
Este tipo de cultivo o fermentación (no confundir el
concepto de fermentación industrial con el concep-
to de fermentación metabólica) implica acabar una
fermentación y después limpiar y esterilizar el fer-
mentador; una vez hecho esto se añade el medio de
cultivo estéril y se inocula con el microorganismo
para reiniciar de nuevo el proceso de fermentación,
es decir, es una producción en lotes.
En este tipo de cultivo el microrganismo pre-
senta las fases de crecimiento antes mencionadas:
 sido optimizada para obtener la máxima producción, va experimentando las fase
de crecimiento ya conocidas: latencia (que interesará que tenga una duració
Métodos en biociencias mínima), exponencial y al entrar en estacionaria, será cuando coincida con l
salida por la parte superior del fermentador.
fase de latencia, fase exponencial de crecimiento y
fase estacionaria. En las fermentaciones industria-
les interesa que la fase de latencia dure lo menos
posible y que el microorganismo entre rápidamente
en fase exponencial. Esto se logra mediante la pre-
paración de preinóculos del microorganismo, que
cuando están en fase exponencial se utilizan para
inocular el fermentador. La fermentación se suele
dar por concluida cuando el microorganismo entra
en fase estacionaria.
En general las fermentaciones discontinuas no
suelen durar más de 96 h; sin embargo,Figuraalguna de
4.17. Esquema de un fermentador continuo de flujo de tapón.
ellas puede durar algo más, intentado alargar el pe-
ríodo de producción de metabolitos primarios que Figura 4.17: Esquema de un fermentador
En la fermentación continua
continuo dede
�lujomezcla
de tapón. completa, como su propio nombr
se produce durante el crecimiento exponencial.
indica, se
Esto se logra añadiendo dos fuentes de carbono porproduce una mezcla entre el medio fresco que se añade al fermentado
las que el microorganismo tiene diferente a�inidad,de fermentación preexistente (Figura 4.18).
y el caldo
primero utilizará la que sea más fácil de consumir, dio con glucosa. De esta forma se logra, siguiendo el
experimentando una primera fase de crecimiento protocolo señalado, que el microrganismo utilice la
exponencial. Cuando el microorganismo entre en glucosa para obtener energía, pero sin dejar de pro-
fase estacionaria, en realidad será una fase de laten- ducir metabolitos secundarios, ya que una vez que
cia o de acomodación de su maquinaria metabólica el microorganismo alcanzó la fase estacionaria no
a la segunda fuente de carbono, que al utilizarla, volverá a entrar en fase exponencial. En de�initiva,
dará lugar a una segunda fase exponencial, con el se logra que el microorganismo entre rápidamente
consiguiente aumento de producción. A este tipo de en la fase estacionaria, y luego se le mantiene con
cultivo donde se generan dos fases exponenciales, pulsos de medio con glucosa para que mantenga la
separadas por una fase corta de latencia, se le de- producción de metabolitos secundarios.
nomina Diauxia, y el objetivo �inal, como ya se ha
comentado, es aumentar la producción de metabo-
Cultivo continuo
litos primarios.
Este tipo de cultivo o fermentación es de tipo
Cultivo discontinuo alimentado (Fed-batch) abierto. Esto signi�ica que continuamente estará
entrando medio de cultivo nuevo al fermentador a
Este tipo de cultivo o fermentación también es un una determinada velocidad y, a la misma velocidad,
cultivo cerrado pues, aunque durante la fermen- se irá sacando caldo de fermentación del mismo. Es
tación se añaden volúmenes de medio de cultivo decir, la velocidad de entrada de medio (V1) es igual
con una composición diferente del medio princi- a la velocidad de salida (V2). Se distinguen dos tipos
pal, no se saca medio de cultivo del fermentador. de fermentaciones continuas: las de �lujo de tapón y
Otros autores lo denominan «cultivo semiconti- las de mezcla completa.
nuo». El objetivo al añadir volúmenes de medio de En la fermentación continua de �lujo de tapón
cultivo, por ejemplo con otra fuente de carbono di- el medio de cultivo fresco y el inoculo se introdu-
ferente a la originalmente utilizada en el inicio de la cen por la parte de abajo y se recoge por la parte de
fermentación, es controlar determinados aspectos arriba, para posteriormente proceder a separar la
del metabolismo del microorganismo y así obtener biomasa del caldo de fermentación (Figura 4.17). El
una mejor producción. Se suele utilizar este tipo de microorganismo, según va ascendiendo a la veloci-
fermentación cuando el producto de interés es un dad que ha sido optimizada para obtener la máxima
metabolito secundario. Estos se producen en la fase producción, va experimentando las fases de creci-
estacionaria de crecimiento. El procedimiento se- miento ya conocidas: latencia (que interesará que
ría el siguiente: añadir al medio de cultivo principal tenga una duración mínima), exponencial y al en-
una fuente de carbono que no sea represora del ca- trar en estacionaria será cuando coincida con la
tabolismo, por ejemplo lactosa; el microorganismo salida por la parte superior del fermentador.
la usará, pero rápidamente entrara en fase esta- En la fermentación continua de mezcla com-
cionaria; posteriormente se añaden a diferentes pleta, como su propio nombre indica, se produce
tiempos pulsos (volúmenes pequeños) de un me- una mezcla entre el medio fresco que se añade al

134
 En la fermentación continua de mezcla completa, como su propio nombre
indica, se produce una mezcla entre el medio fresco que se añade al fermentador
y el caldo de fermentación preexistente (Figura 4.18).
Figura 4.18: Esquema de un fermentador conti-
nuo de mezcla completa.
fermentador y el caldo de fermentación preexisten-
te (Figura 4.18).
El objetivo en este tipo de fermentaciones
es mantener una cantidad constante de biomasa
dentro del fermentador. Esto se puede conseguir
mediante la medición de la turbidez del caldo de
salida y, atendiendo a su valor, aumentar o dismi-
nuir el �lujo de entrada del medio al fermentador,
lo que permitirá mantener la cantidad de biomasa
constante. A este tipo de fermentadores se les deno-
mina turbidostatos. Otra manera de conseguir que
la biomasa sea constante es controlando la veloci-
dad de crecimiento del microorganismo mediante
la composición del medio de cultivo que se añade.
Este tipo de fermentadores serían los quimiostatos.
En los quimiostatos se parte de un medio de
cultivo sin un elemento nutricional, como puede ser
la fuente de carbono, y el medio que se introduce
es el mismo medio, pero con la fuente de carbo-
no incluida (se denominará medio completo). Hay
ciertos parámetros muy importantes en este tipo de
fermentadores, como la velocidad de dilución (D).
Esta velocidad sería igual a la velocidad (V) con la
que entra el medio, en relación al volumen (Vol) del
fermentador (D = V/Vol). De esta manera, el valor
de D se puede aumentar o disminuir al aumen-
tar o disminuir la velocidad de entrada del medio
de cultivo completo (que es igual a la velocidad de
salida del caldo de fermentación). Es importante
tener en cuenta que a medida que aumenta D tam-
bién aumenta la cantidad de fuente de carbono en
el fermentador, y esto conlleva un aumento de la ve-
locidad de crecimiento del microorganismo, ya que:
µ = µmáx ([S]/Ks+[S])
135
Cultivos celulares
donde µ es la velocidad de crecimiento, µmáx es la
velocidad de crecimiento máxima del microorga-
nismo, S es la concentración de sustrato (en este
caso puede ser la fuente de carbono) y Ks es la can-
tidad de sustrato a la que se alcanza la mitad de la
velocidad de crecimiento máxima. Se puede com-
probar que a medida que aumenta la concentración
de sustrato aumenta la velocidad de crecimiento del
microorganismo.
Teniendo en cuenta el valor de D y debido a
que este in�luye en la velocidad de crecimiento al
aumentar la concentración de la fuente de carbo-
no, se puede calcular la variación de la biomasa en
el interior del fermentador. Esta variación se puede
expresar matemáticamente como:
dX/dt = µX-DX, que quedaría dX/dt = (µ-D)X [4.4]
donde dX es la variación de la cantidad de bioma-
sa, dt es la variación del tiempo, µ es la velocidad de
crecimiento, D es la velocidad de dilución y X es la
cantidad de biomasa.
Tomando la ecuación [4.4] pueden ocurrir tres
casos:
1) Que µ > D; en este caso se experimenta-
rá un aumento de la biomasa en el interior
del fermentador, es decir dX/dt > 0.
2) Que µ = D; en este caso no se experi-
mentará ninguna variación de la biomasa
dentro del fermentador, es decir dX/dt = 0.
3) Que µ < D; en este caso se experimenta-
rá una disminución de la biomasa dentro
del fermentador, es decir dX/dt < 0.
Lo que interesa en la industria es mantener una
cantidad de biomasa constante, para así tener tam-
bién una producción constante, es decir un estado
en el que dX/dt sea 0. o, lo que es lo mismo, que µ =
D. A este estado se le denomina estado estacionario
y no hay que confundirlo con la fase estacionaria del
crecimiento de un microorganismo. En el estado es-
tacionario el microorganismo se encuentra en una
fase exponencial subóptima, ya que no hay una con-
centración su�iciente de fuente de carbono para que
el microorganismo crezca a la velocidad máxima.
En este tipo de fermentaciones interesa man-
tener el estado estacionario durante mucho tiempo.
Sin embargo, debido a posibles cambios en la natu-
raleza cualitativa de la fuente de carbono incluida
en el medio que se introduce o a mutaciones espon-
taneas en el microorganismo, llega un momento que
es di�ícil mantenerlo y es, en este momento, cuando
conviene �inalizar la fermentación y empezar a pre-
parar un nuevo proceso de fermentación continua.
Métodos en biociencias
4.3.8. Cultivo de virus
Para el cultivo de virus no pueden utilizarse medios
de cultivos, ya sean de�inidos o complejos, ya que
son parásitos intracelulares obligatorios y siempre
necesitan células hospedadoras. Las células hospe-
dadoras serán, obviamente, diferentes si se quieren
cultivar bacteriófagos, virus animales o virus de
plantas.
Cultivo de bacteriófagos (fagos)
El cultivo de fagos se realiza en placas Petri don-
de se cultiva una cepa bacteriana en césped, es
decir, cubriendo toda la placa, y que se ha mezcla-
do previamente con el fago. Cuando un fago inicia
una infección va a originar una placa o calva de li-
sis (si su ciclo es lítico), que se va a manifestar como
una zona más clara en el conjunto del césped bac-
teriano. Se considera que cada placa de lisis que
aparezca en la placa se ha originado a partir de una
partícula viral. Además, este método de cultivar los
fagos va a permitir realizar una cuanti�icación de los
mismos al contar el número de calvas de lisis. Un
procedimiento estándar de este tipo de cultivo im-
plica varios pasos, que son:
— Preparar un cultivo de la cepa bacteriana.
— Preparar una dilución seriada de la mues-
tra con el fago que se quiere cultivar.
— Mezclar la suspensión bacteriana con las
diluciones de fagos.
— Verter la mezcla en placas Petri conte-
niendo un medio de cultivo adecuado
para la bacteria.
Cuando un fago infecta una bacteria se produci-
rá la lisis de la misma después de un corto período
de tiempo, infectando las nuevas partículas víricas
resultantes a las bacterias que estén situadas cer-
ca de la primera; de esta manera se producen las
ya mencionadas placas o calvas de lisis. Contando
el número de calvas, y sabiendo la dilución utiliza-
da y el volumen que se mezcló con las bacterias, se
puede conocer el número de partículas víricas via-
bles presentes en la muestra que se quería analizar
y, al igual que se hablaba de UFC en bacterias, en
este caso se habla de unidades formadoras de pla-
cas (UFP). Además de cuanti�icar, este método sirve
para realizar aislamientos de cepas puras del virus,
puesto que si cada calva ha surgido de la multi-
plicación de una primera partícula viral, todas las
partículas virales dentro de una calva de lisis son
clónicas o genéticamente idénticas. Es decir, se ha-
brá obtenido una línea pura de fagos.
136
Hay que señalar que, al igual que con las bac-
terias, hay una población viral no cultivable, y con
este método solo se obtendrán calvas o placas de li-
sis si los fagos tienen especi�icidad por la bacteria
utilizada como célula hospedadora.
Cultivo de virus animales
En este caso se puede optar por diferentes sistemas
para cultivar los virus.
Utilizando animales vivos, tales como rato-
nes, conejos, cobayas, etc. Además de estudiar los
efectos del virus, también se puede estudiar la res-
puesta inmune del animal. Posteriormente, una vez
que aparece la enfermedad, se sacri�ica el animal y
se puri�ica el virus a partir de los tejidos diana del
virus.
Debido a la preocupación que suscita la utiliza-
ción de animales de laboratorio, se pueden utilizar
huevos embrionados. Es un método con menos
problemas éticos y además es más barato. En este
método, las distintas partes del interior del hue-
vo se pueden inocular con el virus adecuado, por
ejemplo, se puede inocular la membrana corioalan-
toidea, la cavidad alantoidea, la cavidad amniótica
o la bolsa de la yema. Es un método que se utilizó
mucho para la obtención de partículas víricas y pos-
terior obtención de vacunas, pero la aparición de
alergias a las proteínas del huevo ha llevado a aban-
donar este proceso o a realizar un posterior proceso
de puri�icación, lo que encarece el producto.
El uso de cultivos celulares es el método de
cultivo de virus que más se utiliza en la actualidad.
Se trata de células animales aisladas de tejidos me-
diante diferentes métodos, hasta obtener líneas
celulares inde�inidas (inmortales) y cultivarlas
como si de células bacterianas se tratara. Es de-
cir, se deben utilizar medios de cultivo adecuados,
que una vez inoculados con las células crecerán for-
mando monocapas y posteriormente se añadirá el
virus. La multiplicación de los virus en las células
producirá diferentes tipos de daños, que podrán
ser observados macroscópicamente. Estos daños
podrán ser la muerte celular, cambios morfológi-
cos o provocar la transformación de las células, es
decir, generar un efecto cancerígeno, observándo-
se que las células crecen sin tener la inhibición por
contacto característica de las células sanas. Los da-
ños producidos se denominan efectos citopáticos.
La gran ventaja de este tipo de cultivos, frente a los
anteriores, es que generalmente son homogéneos y
pueden ser fácilmente propagados y mantenidos de
manera similar a un cultivo bacteriano.

Cultivo de virus vegetales
Los virus vegetales pueden cultivarse también en
varios sistemas: en cultivos de células vegetales, en
tejidos vegetales o en plantas enteras. En los dos
últimos casos se debe tener en cuenta que los vi-
rus solo penetran por heridas o mediante vectores
como son los insectos. Al utilizar estos sistemas, se
debe aplicar la suspensión de virus con materiales
abrasivos que ocasionen lesiones y permitan la en-
trada del virus.
La acción de los virus se mani�iesta mediante
efectos citopáticos, como necrosis, amarilleamien-
tos, marchitez, etc. Una vez observado el efecto se
pueden puri�icar los virus a partir del tejido o de la
parte de la planta infectada.
Bibliografía
Basic Cell Culture (Practical Approach). 2002.
Davis JM (ed). Oxford University Press. ISBN 978-
0199638536.
137
Cultivos celulares
Biotecnología y mejoramiento vegetal. 2004.
Echenique V, Rubinstein C, Mroginski L. Ediciones INTA.
ISBN 987-5211389.
Brock. Biología de los microorganismos. 14ª ed. 2015.
Madigan M, Martinko J, Bender K, Buckley D, Stahl D.
Pearson. ISBN 978-8490352793.
Cultivo de células animales. 1995.
Morgan SJ, Darling DC. Editorial Acribia. ISBN 8420007773.
Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and
Specialized Applications. 2010.
Freshney RI. John Wiley & Sons. ISBN 978-0470528129.
Introducción a la microbiología. 2007.
Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Editorial Médica
Panamericana. ISBN 978-9500607407.
Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory and
Technique. 1998.
Mather JP, Roberts PE. Plenum Press. ISBN 0306458594.
Methods in Cell Biology. Volume 57. Animal Cell Culture
Methods. 1998.
Mather JP, Barnes D (eds). Academic Press. ISBN
0125441592.
Microbiología de Prescott. 2009.
Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ. McGraw-Hill-
Interamericana. ISBN 978-8448168278.
Plant Cell Culture Protocols. 1999.
Hall RD(ed). Humana Press. ISBN 0896035492.
Recent Advances in Plant in Vitro Culture. 2012.
Leva A, Rinaldi LMR (eds). InTech. ISBN 978-9535107873.

Inmunotécnicas
Se pueden considerar inmunotécnicas todas aque-
llas técnicas cuyo fundamento es la interacción
especí�ica entre un antígeno y un anticuerpo. De-
bido a la alta especi�icidad de esta interacción las
inmunotécnicas van a permitir la detección, dis-
tribución y cuanti�icación de aquellas moléculas
biológicas que se comporten como antígenos. Por
tanto, existe la posibilidad teórica de estudiar los
parámetros anteriores para cualquier antígeno
siempre que se disponga de un anticuerpo que lo
reconozca especí�icamente. La detección consiste
en la demostración de la existencia de la molécula
escogida en la muestra biológica, y la distribución
en el conocimiento de la posición que ocupa en
dicha muestra. Los estudios de cuanti�icación per-
miten averiguar la cantidad de molécula existente
en la muestra biológica, ya sea de modo cuantitativo
o semicuantitativo. El modo cuantitativo es absolu-
to e implica el uso de unidades �ísicas; por ejemplo,
mg de molécula por gr de tejido, o mg de molécula
por célula. El modo semicuantitativo es una razón,
y sirve para comparar una muestra con otra; por
ejemplo, una molécula determinada es 2.3 veces
más abundante en la muestra tratada que en el con-
trol, o en el individuo A que en el B.
En la literatura cientí�ica anglosajona, el térmi-
no de uso más frecuente para englobar las técnicas
basadas en la reacción de reconocimiento entre un
5.
Guillermo Bodega
antígeno y un anticuerpo es inmunoensayo (im-
munoassay). Los inmunoensayos tienen como �in
la detección y/o cuanti�icación de antígenos o an-
ticuerpos, por lo que, desde un punto de vista
estricto, estarían incluidos dentro del término in-
munotécnicas, ya que este último término también
incluye estudios de distribución de antígenos.
El hecho de que la base de las inmunotécnicas
sea la interacción especí�ica entre un antígeno y un
anticuerpo hace que a veces se estudien ambas mo-
léculas desde un punto de vista inmunológico. No es
ese el objetivo de este capítulo. Por razones obvias
será necesario de�inir ambos conceptos, pero en
ningún caso se les prestará atención desde un punto
de vista inmunológico. En este capítulo, antígenos y,
especialmente, anticuerpos solo son herramientas
que interaccionan especí�icamente; nada distinto
a lo que sucede entre cadenas de oligonucleótidos
complementarias o a la interacción especí�ica exis-
tente entre algunos hidratos de carbono y lectinas.
5.1. Concepto de antígeno y anticuerpo
5.1.1. Antígeno
En sentido estricto, un antígeno es una molécula
identi�icada por nuestro organismo como no pro-
Métodos en biociencias
pia, y un inmunógeno es aquella molécula capaz de
inducir una respuesta inmune que incluye la produc-
ción de anticuerpos. Sin embargo, es usual de�inir al
antígeno como aquella molécula capaz de provocar
la síntesis de anticuerpos, de hecho el término an-
tígeno es la contracción de antibody generator. En
cualquier caso conviene tener presente que todos
los inmunógenos son antígenos, pero no todos los
antígenos son inmunógenos; de hecho, algunas mo-
léculas, llamadas haptenos, por su pequeño tamaño,
carecen de poder inmunogénico; en este caso, para
dotarlas de él, se les une a una molécula mayor que,
por sí misma, no es capaz de inducir una respues-
ta inmune. Por el contrario, las moléculas de gran
tamaño pueden ser reconocidas por diferentes an-
ticuerpos, dependiendo de las diferentes regiones
de la molécula que pueden interaccionar con an-
ticuerpos. A estas regiones especí�icas con las que
interacciona el anticuerpo se les denomina deter-
minantes antigénicos o epítopos y pueden estar
formados por secuencias de aminoácidos contiguas
o no contiguas. Conviene diferenciar entre antíge-
nos multi- y polivalentes, pues ambos poseen varios
determinantes antigénicos: los de los primeros son
distintos y los de los segundos todos iguales, típico,
por ejemplo, de polímeros formados por un único
tipo de monómero (Figura 5.1).
5.1.2. Anticuerpo
Los anticuerpos son las moléculas que reconocen a
los antígenos, y se unen a ellos por múltiples enlaces
de tipo no covalente como puentes de hidrógeno,
fuerzas de van der Waals, interacciones coulómbi-
cas y enlaces hidrofóbicos. Puesto que, como ya se
ha explicado al inicio de este capítulo, los anticuer-
pos solo interesan como herramienta, únicamente
se estudiarán las características que son de inte-
rés desde el punto de vista de su aplicación técnica.
Figura 5.1: Antígeno multi- y polivalente. En el primero existen diferentes deter-
minantes antigénicos, en el segundo son todos iguales.
140
No obstante, previamente, con el �in de evitar cier-
to caos terminológico, se de�inirán los conceptos
de γ-globulina, inmunogloblulina (Ig) e inmunoglo-
bulina G (IgG). Las γ-globulinas son un conjunto de
globulinas que aparece en última posición cuando
se separan por electroforesis las proteínas del suero
sanguíneo (les preceden albúmina y α- y β-globuli-
nas). Dentro de las γ-globulinas el tipo mayoritario
de proteínas son las inmunoglobulinas o anticuer-
pos. A su vez, existen 5 tipos de inmunoglobulinas:
A, D, E, G y M (alfa, delta, épsilon, gamma y mu); por
tanto las inmunoglobulinas G (IgG) son un subti-
po de anticuerpo. Es importante no confundir una
γ-globulina con una inmunoglobulina γ (IgG). En la
�igura 5.2 se incluye un esquema básico de su es-
tructura.
Desde el punto de vista de su aplicación en las
inmunotécnicas, las características más importan-
tes de los anticuerpos son tres: a�inidad, avidez y
especi�icidad por el antígeno.
Afinidad
La a�inidad se puede de�inir como la tendencia a in-
teraccionar antígeno y anticuerpo. Esta interacción
es reversible y no covalente, y, una vez que alcanza
el equlibrio, viene de�inida por la expresión Ka=[AB-
AG] / [AB] [AG], donde Ka representa la constante
de a�inidad, [AB-AG] la fracción de anticuerpo (AB,
antibody) y antígeno (AG) unida, y [AB] [AG] el
producto de las concentraciones de anticuerpo y
antígeno libres. La Ka para los anticuerpos oscila
entre los 10-5-10-12 L/mol. Desde un punto de vista
práctico, esta fórmula indica la cantidad de com-
plejo AG-AB que se puede encontrar en el punto
de equilibrio. El tiempo en que se alcanza el equili-
brio no varía de un anticuerpo a otro; sin embargo,
en ese punto un anticuerpo de alta a�inidad habrá
formado más complejo AG-AB que uno de baja a�i-
 Inmunotécnicas

Figura 5.2: Estructura de un anticuerpo. Está formado por dos cadenas pesadas y dos ligeras unidas por puentes
disulfuro (líneas de puntos que unen las cadenas), también existen puentes disulfuro intracatenarios responsa-
bles de su con�iguración espacial (no incluidos en el dibujo). Cada cadena tiene una región variable y otra cons-
tante, la primera encargada de interaccionar con el antígeno. El sitio especí�ico del anticuerpo que interacciona
con el epítopo del antígeno se llama parátopo. La rotura con la proteasa papaína genera dos fragmentos: el Fab
y el Fc, el primero incluye la región variable.

nidad. Dicho de otro modo, los anticuerpos de alta
a�inidad completan su interacción con el antígeno
antes que los de baja a�inidad. Todo ello hace que
para conseguir, en un instante determinado, una
concentración de AG-AB usando un anticuerpo de
baja a�inidad sea necesario usar mayor concentra-
ción de anticuerpo que si se usase un anticuerpo de
alta a�inidad.
Avidez
La avidez indica la estabilidad general del com-
plejo AG-AB y es determinada por tres factores: la
valencia de unión entre antígeno y anticuerpo, la
ordenación geométrica de los componentes que in-
teractúan y la a�inidad. Los anticuerpos más usados
en las inmunotécnicas son IgG e IgM, los primeros
son bivalentes, pues cada anticuerpo tiene dos sitios
de unión al antígeno; los segundos son decavalen-
tes, pues se organizan como un pentámero. Estos
últimos, en caso de interacciones con antígenos po-
livalentes, pueden conducir a una estabilización tan
fuerte del complejo AG-AB que lo hacen irreversi-
ble. No obstante, la polivalencia no es fácilmente
predecible pues, como la primera unión con el an-
ticuerpo puede producir cambios estéricos en el
antígeno, los demás sitios de unión pueden verse
afectados y no tener lugar más interacciones. La or-
denación geométrica, en particular la proximidad
de los determinantes antigénicos, o su concentra-
ción, que igualmente determina la proximidad de
unos determinantes con otros, también puede pro-
vocar fuertes variaciones en la avidez (Figura 5.3).
En general, los anticuerpos de alta a�inidad poseen
una alta avidez, como demuestra el hecho de que la
vida media de un complejo AG-AB de alta a�inidad
es mucho mayor que la de un complejo formado con
un anticuerpo de baja a�inidad. En general, en una
inmunotécnica la a�inidad va a indicar la concen-
tración de anticuerpo que hay que usar (también el
tiempo de incubación para que interaccione con el
antígeno), pero la avidez va a ser la responsable del
éxito de la inmunotécnica pues una baja avidez de-
terminará la desaparición del complejo AG-AB en
los sucesivos lavados de la técnica; hecho de suma
importancia porque en la mayoría de las inmunotéc-
nicas se realizan numerosos y profundos lavados.
Especificidad
La especi�icidad hace referencia a la exclusiva in-
teracción entre un anticuerpo y un determinante
antigénico; hecho fundamental en las inmunotéc-
nicas, pues es responsable de que un determinado
anticuerpo solo reconozca a un único antígeno (de-
terminante antigénico). Cuando un anticuerpo
interacciona con más de un determinante antigénico
puede terminar uniéndose a diferentes molécu-
las, fenómeno que recibe el nombre de reactividad
cruzada, y que termina por llevar a error. Otro tan-
to ocurre cuando diferentes moléculas presentan el
mismo determinante antigénico. Siempre es nece-
sario comprobar la especi�icidad de la interacción
AG-AB y, como su importancia es capital, se dedi-

141
Métodos en biociencias
Figura 5.3: Esquema que ilustra el efecto de la disposición geométrica (izquierda) y de la concen-
tración (derecha) de los epítopos sobre la a�inidad. La proximidad de los epítopos –bien por efecto
de la estructura, bien por efecto de la concentración– permite dobles interacciones a los anticuer-
pos y provoca una mayor avidez.
cará a su estudio un epígrafe completo (5.6) dentro
de este capítulo.
5.2. El anticuerpo en la inmunotécnica
En una inmunotécnica, a los anticuerpos se les debe
prestar una doble atención. En primer lugar por su
origen (anticuerpos policlonales y monoclonales) y
después por la posición que ocupan en la estructura
molecular que se genera en la inmunotécnica (anti-
cuerpos primarios y secundarios).
5.2.1. Anticuerpos monoclonales y policlonales
Por su modo de origen existen dos tipos de anti-
cuerpos: los policlonales (PAB, policlonal antibody)
y los monoclonales (MAB, monoclonal antibody).
Para obtener PABs contra un determinado antí-
geno se suele seguir el siguiente procedimiento:
inmunización, extracción de plasma, puri�icación,
titulación y prueba de especi�icidad. Una vez aisla-
do y puri�icado el antígeno se inyecta en un animal,
normalmente conejo o cabra. Esta es la prime-
ra inmunización, a la que le sigue una segunda (3
semanas después) y más tarde (6-8 semanas) una
tercera inmunización. De este modo más del 90%
de los anticuerpos que hay en plasma van dirigidos
contra el antígeno usado. Se extrae sangre, se obtie-
ne el plasma, se hace una puri�icación para retirar
otras proteínas plasmáticas y se titula para saber
la concentración del anticuerpo. Este anticuerpo se
de�ine como policlonal pues lo que en realidad se
tiene al �inal del proceso es una mezcla de distintos
142
anticuerpos, cada tipo derivado de un clon de lin-
focitos B, de ahí el nombre de policlonal. El origen
de esta mezcla de anticuerpos es doble, por un lado
está causado por la existencia de diferentes epíto-
pos dentro de la molécula utilizada como antígeno,
y por otro por la posibilidad de que un mismo de-
terminante antigénico pueda ser reconocido por
diferentes anticuerpos. En este último caso es posi-
ble que siempre exista algún anticuerpo con mayor
avidez y a�inidad que el resto, pero la producción de
otros anticuerpos distintos capaces de interaccio-
nar con el antígeno con menor a�inidad y/o avidez
también tiene lugar. La posibilidad de que en di-
ferentes moléculas existan similares o parecidos
determinantes antigénicos obliga a testar la especi-
�icidad del PAB, para comprobar que no tienen lugar
reacciones cruzadas con otras moléculas.
El método clásico de obtención de MABs es
por fusión de linfocitos B con una célula tumoral;
se obtiene así un híbrido inmortal que produce ac-
tivamente un único tipo de anticuerpo (Figura 5.4).
Por su contribución al desarrollo de esta metodo-
logía Milstein obtuvo el premio Nobel de Medicina
y Fisiología de 1984. La primera fase del procedi-
miento es la inmunización, normalmente de un
ratón, que se hace con el �in de aumentar el núme-
ro de linfocitos B capaces de producir anticuerpos
contra el antígeno escogido; si no se realizase la
inmunización sería mucho más di�ícil localizar lin-
focitos B cuyos anticuerpos pudiesen interaccionar
con el antígeno escogido. Linfocitos B obtenidos
del bazo del ratón inmunizado se fusionan con cé-
lulas de mieloma, línea tumoral capaz de crecer en
cultivo, para dotar al híbrido de la capacidad de pro-

liferación continua. Estas células tumorales carecen
de la enzima HGPRT (hipoxantina guanina fosforri-
bosil transferasa), implicada en la síntesis de DNA.
Los procedimientos de fusión celular se estudia-
rán en el capítulo 14, pero en este procedimiento
se utiliza PEG (polietilénglicol), y, en origen, el vi-
rus Sendai. Tras la fusión se siembran las células
y se aislan los hibridomas utilizando el medio se-
lectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina).
La aminopterina bloquea la síntesis de nucleótidos
de guanina, pero hipoxantina y timidina permiten
la activación de una vía sintética de rescate si se
dispone de la enzima HGPRT. Puesto que las célu-
las tumorales carecen de ella, no proliferan si no se
fusionan. La eliminación de los linfocitos B no fu-
sionados tampoco es problemática pues no viven
mucho tiempo en cultivo. El procedimiento de se-
lección se hace por clonación a dilución límite (ver
capítulo 4) de modo que en los diferentes pocillos se
generan clones a partir de un único hibridoma. Una
vez que se forman los clones se toma el medio de
cultivo de diferentes pocillos y se testa la existencia
de anticuerpos contra el antígeno escogido. Es im-
portante tener en cuenta que puede haber diversos
pocillos con hibridomas que producen anticuerpos
Figura 5.4: Esquema del método clásico de producción de anticuerpos monoclonales.
143
Inmunotécnicas
contra el antígeno seleccionado, pero en cada poci-
llo solo habrá un único tipo de anticuerpo. Todas las
células de un pocillo derivan de un único hibridoma
por lo que son un auténtico clon; por ello todos los
anticuerpos de un pocillo son idénticos y reciben el
nombre de anticuerpos monoclonales. Una vez se-
leccionado el pocillo con el anticuerpo más idóneo
se expande el clon escogido.
Los MAB obtenidos con este modo de proce-
der se llaman MABs de primera generación pero,
posteriormente, utilizando tecnología de DNA re-
combinante, se obtuvieron MABs recombinantes,
también llamados MABs de segunda generación.
Este nuevo procedimiento (que no se detallará)
evitaba la inmunización del animal pues lo que se
conseguía era inmortalizar genes productores de
anticuerpos en vez de inmortalizar células pro-
ductoras de anticuerpos. La tecnología del DNA
recombinante permitió obtener anticuerpos com-
pletos, tanto normales como quiméricos (formados
por genes de dos especies), pero también fragmen-
tos de anticuerpos. Estos fragmentos son muy útiles
en las modernas técnicas de análisis masivo pues
suelen ser mucho más estables y mucho más a�ines.
Los tipos de fragmentos son muy variados: región
Métodos en biociencias

Fab, scFv (región variable de cadena sencilla), dí-
meros y trímeros de scFv (diabodies y triabodies),
minianticuerpos (minibodies) y proteínas de fusión,
que incorporan un fragmento del anticuerpo y otro
fragmento de otra proteína.
Una herramienta interesante son los mimé-
ticos de los anticuerpos, moléculas capaces de
interaccionar con antígenos pero estructuralmente
muy diferentes a los anticuerpos. Normalmente son
péptidos y proteínas de diseño, y entre ellos des-
tacan los af�ibodies, cuyo armazón molecular está
basado en el dominio Z de la proteína A (ver apar-
tado dedicado al marcaje con oro), cuyo dominio de
unión incorpora tres α-hélices y carecen de puen-
tes disulfuro.
5.2.2. Anticuerpos primarios y secundarios
En las inmunotécnicas se construye una estructura
molecular a base de anticuerpos (a veces, con la in-
corporación de otras moléculas) que relaciona un
antígeno determinado con una estructura capaz de
generar una señal, por lo que esta última recibe el
nombre de marcaje. En función de su posición en
esta estructura molecular se dice que existen an-
ticuerpos primarios y secundarios, pero antes de
de�inirlos conviene recordar que el fragmento Fab
es responsable de la interacción con el antígeno y el
Fc es característico de cada especie.
El anticuerpo primario es el que reconoce al
antígeno y el anticuerpo secundario el que reconoce
la región Fc del primario e incorpora el marcaje. La
estequiometría de esta interacción es de 1 a 2 pues
a la región Fc del anticuerpo primario se le pueden
unir dos anticuerpos secundarios (Figura 5.6).
El conocimiento de la terminología que sir-
ve para nombrar a estos anticuerpos es importante
pues indica dos características fundamentales para
todo anticuerpo: donde se ha sintetizado y contra
qué va dirigido. Por ejemplo, si en un conejo se sin-
tetiza un anticuerpo contra un antígeno A humano
se dice que ese es un anticuerpo primario de cone-
jo anti-A humano. El anticuerpo secundario ha de
reconocer la región Fc del primario y, obviamente,
tiene que ser obtenido en una especie animal dife-
rente de la que sintetizó el anticuerpo primario, por
ejemplo, una cabra. En este caso, habría que utili-
zar como antígeno la región Fc de anticuerpos de
conejo, e inmunizar con ellos a una cabra; por ello,
los anticuerpos obtenidos serán anticuerpos secun-
darios de cabra anti-Fc de conejo. Comercialmente
existe una gran variedad de anticuerpos secunda-

Figura 5.5: Esquema que ilustra el modo de interacción de los anticuerpos pri-
marios y secundarios. “M” representa el marcaje. La formas asociadas a la región
Fc que indican las �lechas discontinuas representan el hecho de que esta región es
característica de cada especie.

144

Figura 5. 6. Esquema que ilustra el modo de marcaje directo (izquierda) e indirecto
(derecha). “M” representa el marcaje.
rios en función de la especie en que se sintetizan,
el tipo de marcaje que incorporan y el inmunógeno
que se usa en su síntesis. En este último caso lo más
usual es que, como ya se ha visto, sea la región Fc
del anticuerpo primario, pero a veces se usa el anti-
cuerpo primario entero.
5.3. Marcaje
El marcaje consiste en unir, habitualmente a los
anticuerpos y a veces a los antígenos, una molécu-
la que sea capaz de producir una señal. En el caso
de los anticuerpos, cuando el marcaje se incorpora
en el anticuerpo primario se dice que es un méto-
do directo, y no es necesario utilizar anticuerpos
secundarios; sin embargo, cuando se incorpora en
el anticuerpo secundario, que es lo más habitual, se
dice que es un método indirecto (Figura 5.6). La in-
corporación del marcaje en el antígeno es común en
pruebas inmunológicas donde lo que se suele que-
rer detectar es la existencia de anticuerpos.
El mecanismo molecular por el que la molécu-
la que produce la señal se une al anticuerpo puede
ser muy variado, entre otros motivos porque exis-
ten muy diferentes tipos de marcaje. Esta unión
puede ser no covalente, modo muy poco usado que
no se considerará, o covalente, y en este último caso
puede tener lugar directamente o a través de hapte-
nos. Los haptenos son pequeñas moléculas que no
emiten señal, pero sirven de nexo de unión o como
puente para anclar la molécula marcadora. El más
145
Inmunotécnicas
usado es biotina (BIO), aunque también destacan
digoxigenina (DIG) y dinitrofenol (DNP). Sea di-
rectamente el marcador, o sea el hapteno, la unión
de cualquier molécula al anticuerpo puede produ-
cirse en tres lugares distintos del anticuerpo: (1)
grupos amino, normalmente de los restos de Lys,
(2) grupos sul�idrilo, en los lugares donde existen
puentes disulfuro, y (3) carbohidratos, normalmen-
te localizados en la región Fc. El modo más habitual
de utilización de los grupos amino es a través del
éster de NHS (N-OH-succinamida) (Figura 5.7),
método muy empleado para unir haptenos o �luo-
rocromos; otra posibilidad ampliamente usada es
el empleo de glutaraldehido como puente de unión,
en este caso suele utilizarse para unir enzimas. Si
la molécula a unir posee grupos hidroxilo se pue-
de unir al grupo amino del anticuerpo mediante un
proceso conocido como aminación reductiva. El in-
conveniente de usar el grupo amino es que la unión
puede tener lugar con las Lys que forman parte de
la región variable, hecho que puede afectar al meca-
nismo de interacción entre antígeno y anticuerpo.
Los grupos sul�idrilo se obtienen por reducción
de los puentes disulfuro; en este caso se requiere
añadir un grupo (maleimida o iodoacetato) a la mo-
lécula que se va a unir al radical sul�idrilo. Dado que
se puede seleccionar el puente disulfuro que se va a
utilizar es posible escoger aquellos cuya disrupción
no termina causando efectos (o al menos los me-
nores posibles) sobre la unión con el antígeno. Los
azúcares son especialmente interesantes pues se lo-
calizan en la región Fc y el impacto que provoca la
unión de moléculas en esta zona prácticamente no
Métodos en biociencias
afecta a la interacción del antígeno con el anticuer-
po. En este caso se necesita que los grupos hidroxilo
de los azúcares sean oxidados a aldehídos para re-
accionar con grupos amino de la molécula a unir;
aminación reductiva inversa a la vista anteriomen-
te (Figura 5.7).
Existen diferentes tipos de marcaje en relación
con la naturaleza de la señal, y la elección de uno
u otro depende de bastantes parámetros. En lugar
de hacer una consideración general sobre el crite-
rio de elección se irá informando sobre las ventajas
e inconvenientes de cada una de los diferentes tipos
de marcaje conforme se vayan estudiando. Se consi-
derarán los siguientes tipos de marcaje: enzimático,
luminiscente, �luorescente, con oro, radiactivo, y
por sonda enzimática.
5.3.1. Marcaje enzimático
Determinadas enzimas pueden (1) ser acopladas a
un anticuerpo o (2) ser reconocidas por él. Estas en-
zimas son puestas en contacto con un compuesto
que al reaccionar con ellas genera un producto colo-
reado, por ello se dice que es un método de detección
colorimétrica. Las enzimas usualmente empleadas
son peroxidasa (la más usada), fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa y glucosa oxidasa. La peroxida-
sa, también denominada como HRP (horseradish
peroxidase) por su origen, es capaz de interaccionar
y rendir color con diferentes productos: la diamino-
benzidina (DAB), probablemente el más usado, que
genera un precipitado marrón oscuro insoluble; el
4-cloronaftol (4-CN), que produce un precipitado
azul soluble en alcohol; el aminoetilcarbazol (AEC),
que rinde un precipitado rojo soluble en alcohol; o el
ABTS (2.2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sul-
phonic acid)), que genera un producto verde soluble,
muy usado en la técnica ELISA. Para la fosfatasa al-
calina se suele usar NABP (naftolbifosfato), que da
un producto rojo insoluble, para la beta-galactosi-
dasa se suele usar BCIG (bromocloro indolil galacto
piranósido), que genera un producto azul insoluble,
y para la glucosa oxidasa se usa el NBT (nitro blue te-
trazolium chloride) que rinde un producto insoluble
de color azul oscuro.
El marcaje enzimático es fácil de realizar (y por
ello muy de rutina), barato y permite dobles y triples
marcajes; es decir, detectar simultáneamente dos o
tres antígenos usando dos o tres anticuerpos y sis-
temas de color distintos. Uno de sus inconvenientes
es que no siempre presenta una alta sensibilidad, y
el otro deriva de la existencia de las enzimas mar-
cadoras en las células de muchos tejidos, por lo que
se puede generar señal de fondo, también llamada
146
señal endógena. Aunque, en general, la anulación
de señal endógena no es compleja; por ejemplo,
la peroxidasa se inactiva incubando con H2O2, y la
fosfatasa alcalina con EDTA. Otra posibilidad, si se
trabaja con muestras de origen animal, es utilizar la
enzima glucosa oxidasa como marcador, pues es ex-
clusiva de vegetales. El marcaje enzimático es muy
utilizado en inmunohistoquímica, immunoblotting y
ELISA.
5.3.2. Marcaje luminiscente
Existen dos tipos: quimioluminiscencia y biolumi-
niscencia, ambos variantes del método enzimático
pues el anticuerpo también va marcado con una en-
zima, pero en este caso el producto que se añade es
una molécula que emite luz al ser modi�icada por la
enzima. En el caso de la quimioluminiscencia la en-
zima empleada es la peroxidasa y el sustrato más
utilizado el luminol, que emite a 425 nm. Es un mé-
todo mucho más sensible que los colorimétricos,
pero necesita técnicas fotográ�icas. Suele ser usado
en immunoblotting, y para ello el papel que soporta
las proteínas es puesto en contacto con un negati-
vo fotográ�ico que se revela una vez impresionado.
La bioluminiscencia consiste en marcar al an-
ticuerpo con una molécula de origen biológico que
causa la emisión de luz, como es el caso de la luci-
ferasa. Para conseguir dicha emisión es necesario
añadir luciferina, ion Mg y ATP.
5.3.3. Marcaje fluorescente
El modo más usual de llevarlo a cabo es acoplar
directamente una molécula �luorescente al an-
ticuerpo, normalmente secundario. También es
posible llevar a cabo acoplamientos indirectos al
conjugarlos con otras moléculas que pueden ser re-
conocidas por anticuerpos como proteína A o con
moléculas como avidina capaces de interaccionar
con biotina, hapteno unido al anticuerpo. La diver-
sidad de moléculas �luorescentes acopladas a los
anticuerpos es tal que, para hacerse una idea, lo más
conveniente es entrar en la red y, en cualquier bus-
cador, teclear «Alexa Fluor». No obstante puede ser
oportuno nombrar a los dos �luoróforos más clási-
cos en las inmunotécnicas: �luoresceína y rodamina,
o sus derivados más estables, FITC (�luorescein iso-
thiocyanate) y TRICTC (rhodamine isothiocyanate),
cuyo uso se inicia en la década de los 40. La apari-
ción de nuevos �luoróforos, los de tipo Cy (Cy2, Cy3,
Cy5…) en los años 90, y los Q-dots (quantum dots)
(nanocristales de metales pesados) en 2003, ha per-
 moléculas en esta zona prácticamente no afecta a la interacción del antígeno con el
anticuerpo. En este caso se necesita que los grupos hidroxilo de los azúcares sean Inmunotécnicas
oxidados a aldehídos para reaccionar con grupos amino de la molécula a unir;
aminación reductiva inversa a la vista anteriomente (Figura 7).

Figura 7. Esquema
5.7: Esquemadedelala
reacción que
reacción queseseproduce
produceenenelelmétodo
métododel
deléster
ésterNHS
NHS(arriba)
(arriba) y en el
y en
el método
método de la aminación
de la aminación reductiva
reductiva (abajo).
(abajo). Tomado de la página
Tomado web de
de la página webThermo Scientific.
de Thermo Scienti�ic.

Existen diferentes tipos de marcaje en relación con la naturaleza de la señal,

y la elección de uno u otro depende de bastantes parámetros. En lugar de hacer una
mitido obtener moléculas de mejores prestaciones; pormenorizada en el capítulo 11. Los anticuer-
consideración general sobre el criterio de elección se irá informando sobre las
por ejemplo, mucho más fotoestables. Los concep- pos marcados radiactivamente pueden utilizarse
ventajas
tos básicos sobree inconvenientes
�luorescencia y eldefundamento
cada una de dellos diferentes tipos de marcaje conforme
en diferentes técnicas, aunque probablemente sea
se vayan estudiando. Se considerarán
microscopio de �luorescencia pueden encontrarse los siguientes tipos de marcaje:
el immunoblotting donde enzimático,
más se hayan usado. En
luminiscente, fluorescente, con oro,
en el capítulo 7. La ventaja del marcaje �luorescen-radiactivo, y por sonda enzimática.
este caso, el procedimiento a seguir es parecido al
te es su gran sensibilidad, y su inconveniente es que marcaje luminiscente pues requiere el empleo de
la emisión de �luorescencia
Marcaje enzimático no es estable un tiempo emulsiones fotográ�icas sensibles a la radiación,
largo; además Determinadas
se necesita emplear
enzimas un pueden
microscopio y su posterior
(1) ser acopladas a unrevelado.
anticuerpo La ogran ventaja del mar-
(2) ser
especí�ico, el de �luorescencia. También se pueden
reconocidas por él. Estas enzimas son puestas en contacto con un compuesto que sin
caje radiactivo es su sensibilidad; al embargo, su
hacer reaccionar
dobles y triples marcajes, y se puede com- peligrosidad y precio
con ellas genera un producto coloreado, por ello se dice que es un método son sus dos grandes inconve-
binar con otros sistemas de marcaje; por ejemplo, nientes.
de detección colorimétrica. Las enzimas usualmente empleadas son peroxidasa (la
con el marcaje enzimático. Es necesario recordar
más usada), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y glucosa oxidasa. La peroxidasa,
que con la utilización del marcaje �luorescente se ha
también
conseguido denominada
resolución como HRP
nanométrica en(horseradish
la micros- peroxidase) por su origen, es capaz de
5.3.5. Marcaje con oro
interaccionar y rendir color con
copía óptica de super-resolución, aspecto también diferentes productos: la diaminobenzidina (DAB),
probablemente
analizado en el capítulo el 7.
más usado, que genera un precipitado marrón oscuro insoluble; el
Este tipo de marcaje es de uso casi exclusivo para
4-cloronaftol (4-CN), que produce un precipitado azul soluble
microscopía en pues,
electrónica alcohol; el general, el ta-
por lo
aminoetilcarbazol (AEC), que rinde un precipitado rojo soluble en alcohol; o el ABTS
maño de las partículas de oro oscila entre 1 y 150
5.3.4. Marcaje radiactivo
(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic nm,acid)),
que está que
porgenera
debajo un producto
del límite de resolución de
verde
Este tipo soluble, muy
de estrategia usado
se puede en lapara
utilizar técnica ELISA.los
marcar Para la fosfatasa
microscopios alcalina
ópticos se suele
clásicos (200 nm). En ge-
usaro NABP
antígenos (naftolbifosfato),
anticuerpos. El mejor modo que da un producto
de incorpo- neral, el diámetro
rojo de laspara
insoluble, partículas más usadas va de
la beta-
rar el marcaje radiactivo es hacer que los isótopos 5 a 50 nm. El término actual para de�inir la partícula
radiactivos se incorporen como constituyentes de de oro es el de nanopartícula de oro (gold nanopar-
la propia molécula en el proceso de síntesis de la ticle, AuNPs), aunque también se suele emplear el
misma; por ejemplo, en la obtención de anticuerpos término anterior de marcaje con oro coloidal. Hay
monoclonales basta con suministrar algún aminoá- autores que diferencian uno y otro término, uti-
cido radiactivo al medio de cultivo del hibridoma lizando oro coloidal cuando las partículas de oro
para obtener anticuerpos marcados radiactiva- son mayores y se unen a los anticuerpos por me-
mente. El marcaje de antígenos en el desarrollo de canismos adsortivos. La base del marcaje consiste
inmunotécnicas tiene su mejor ejemplo en el ra- en adherir las nanopartículas de oro a un anticuer-
dioinmunoanálisis (RIA), al que se presta atención po, o al revés, anticuerpos a nanopartículas de oro

147
Métodos en biociencias
en caso de que estas sean de mayor tamaño. Puesto
que las partículas no permiten el paso de electro-
nes, en la pantalla del microscopio electrónico se
aprecian puntos negros donde el anticuerpo mar-
cado se unió. Estas nanopartículas también pueden
ser fácilmente detectadas con el AFM o con el SEM.
Son muchas las moléculas que se pueden unir
a una nanopartícula de Au y, además del mecanis-
mo adsortivo que no implica el establecimiento de
enlaces químicos, en los últimos años se han de-
sarrollado estrategias de unión covalente entre el
anticuerpo y las moléculas que recubren a la na-
noesfera. En el caso de las inmunotécnicas, uno de
los procedimientos de unión más habitual se basa
en el empleo de la proteína A o la proteína G, que
por un lado se unen a la nanopartícula y por otro in-
teraccionan con la región Fc del anticuerpo (Figura
5.9), lo que hace que este último quede perfecta-
mente orientado. La proteína A es un constituyente
de la pared celular de Staphylococcus aureus y reco-
noce la región Fc de algunos tipos de IgG. La proteína
G la presenta el grupo G de Streptococcus y es me-
nos especí�ica que la proteína A, por lo que se suele
utilizar una variante recombinante que solo interac-
ciona con la región Fc de las IgG que no reconoce la
proteína A. Las nanopartículas se pueden acoplar
al anticuerpo primario, aunque lo usual es acoplar-
las al anticuerpo secundario. Como se puede marcar
con nanoesferas de diverso diámetro, se pueden ha-
cer dobles y triples marcajes, y también se puede
combinar con otro tipo de marcajes.
Las nanopartículas de oro se forman por re-
ducción de sales de Au (AuCl3 normalmente) en el
solvente apropiado, al que se añade un estabilizante
que rodea al núcleo de oro para prevenir la agre-
gación de unas partículas con otras. Los diferentes
tamaños de las partículas se pueden obtener usan-
do diferentes agentes reductores.
Figura 5.8: Nanopartículas de oro detectadas con el microscopio electrónico de transmisión (A), el microscopio
electrónico de barrido (B) y el microscopio de fuerza atómica (C). La barra de aumentos representa 50 nm.
148
5.3.6. Marcaje por sonda enzimática
Es una técnica muy poco usual cuyo objetivo es de-
tectar la presencia de determinados anticuerpos,
hecho de interés en el diagnóstico de enfermeda-
des de tipo autoinmune. Sabiendo cuales son los
péptidos más frecuentes contra los que se produ-
ce respuesta inmune en este tipo de enfermedades,
se generan péptidos sintéticos a los que se les aña-
de una actividad enzimática, por ejemplo, del tipo
peroxidasa o galactoxidasa. Al incubar este tipo de
proteína con la muestra de sangre del paciente, si
este tiene anticuerpos contra el péptido en cues-
tión lo reconocerá y unirá, pudiendo ser fácilmente
detectado posteriormente puesto que el antígeno
unido al anticuerpo lleva el marcaje enzimático in-
corporado.
5.4. Arquitectura molecular
Es posible considerar a una inmunotécnica como
un modo de proceder que, utilizando anticuerpos,
permite asociar una señal con la molécula objeto
de estudio. En este proceso los anticuerpos y otras
moléculas conforman unas estructuras moleculares
(andamios moleculares) que hacen de puente entre
la molécula de estudio y la señal. Cada una de las
piezas de este andamio tiene una posición exacta y
debe interaccionar con otra de forma especí�ica. Por
todo ello parece lógico introducir el concepto de
arquitectura molecular en las inmunotécnicas, en-
tendiendo como tal las diferentes disposiciones que
pueden adoptar las moléculas que sirven de nexo de
unión entre la molécula de estudio y la señal.
En este epígrafe se hará una clasi�icación de
los distintos tipos de inmunotécnicas, y, además, se
estudiarán los «andamios» moleculares de las dos
 Inmunotécnicas

variantes procedimentales más usadas: el método

PAP (peroxidasa-antiperoxidasa) y el método ABC
(avidin-biotin complex).

5.4.1. Clasificación de las inmunotécnicas

En toda inmunotécnica existe una fase sólida, que
puede ser de muy distinta naturaleza (vidrio, plásti-
co, una sección de tejido, nitrocelulosa…) y una fase
líquida. En función de la molécula (antígeno o anti-
cuerpo) que se adhiere a la fase sólida existen tres
tipos de inmunotécnicas (Figura 5.10):

— Captura de anticuerpo. El antígeno se �ija

a la fase sólida. En este caso la naturaleza
de la fase sólida suele ser muy variada de-
pendiendo de la inmunotécnica concreta,
por ejemplo, nitrocelulosa, plástico o sec-
ciones histológicas. Esta es una técnica
muy versátil pues puede servir para de-
tectar y cuanti�icar tanto antígenos como Figura 5.9: Anticuerpo primario marcado con una na-
anticuerpos, y estudiar distribución de nopartícula de oro utilizando la proteína A como siste-
antígenos. ma de anclaje.
— Captura de antígeno. El anticuerpo se une
a la fase sólida, normalmente mediante
la proteína A o la G (análogas al recep-
tor Fc) pues poseen una alta adherencia pecialmente idóneo para la detección y
al vidrio o al plástico cubierto con proteí- cuanti�icación de antígenos, pero resulta
nas de matriz. Este tipo de estrategias es más caro pues necesita dos anticuerpos.
usual en estudios destinados a la detec-
ción y cuanti�icación de antígenos.
— Doble anticuerpo. Un anticuerpo se �ija 5.4.2. El método PAP
a la fase sólida, se añade el antígeno y
después un segundo anticuerpo que El método de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)
interacciona con el antígeno en algún de- es un método indirecto de marcaje enzimático
terminante antigénico libre. Es un modo que recibe este nombre pues la unión de la enzima
de proceder altamente especí�ico y es- marcadora, la peroxidasa, se realiza mediante un

Figura 5.10: Esquema que ilustra los tres tipos básicos de disposición molecular en la inmunotécni-
cas: captura de anticuerpo (A), captura de antígeno (B) y doble anticuerpo (C).

149
Métodos en biociencias
anticuerpo que la reconoce especí�icamente (Figura
5.11). A diferencia de otros métodos implica la uti-
lización de tres anticuerpos por lo que, al principio
del desarrollo de esta técnica, se hablaba de anti-
cuerpo primario, anticuerpo secundario o puente,
y anticuerpo terciario. De hecho, se suministraban
cada uno por separado; hoy en día se suministra el
secundario unido al terciario por lo que el térmi-
no anticuerpo terciario ha dejado de utilizarse. Es
importante tener en cuenta que los anticuerpos pri-
mario y «terciario» han de ser sintetizados en la
misma especie pues ambos han de ser reconocidos
por el anticuerpo secundario.
5.4.3. El método ABC
El método ABC (avidin-biotin complex) también es
un método indirecto de marcaje enzimático que im-
plica el empleo de dos moléculas que reaccionan
especí�icamente: la biotina y la avidina (estrep-
tavidina si procede de Streptomyces avidinii). Lo
más usual es marcar con biotina (biotinilar) el an-
ticuerpo secundario y la peroxidasa, y hacer que la
avidina, al interaccionar con las biotinas, haga de
puente entre ellos (Figura 5.11). La biotina (vitami-
na H) es una molécula de pequeño tamaño (244.3
D) formada por dos anillos fusionados y una molé-
cula de ácido valérico (o ácido pentanoico, 5 átomos
de C). La avidina es una glucoproteína formada por
cuatro subunidades con un Pm �inal que oscila
entre 67 y 68 kD. Cada subunidad es capaz de inte-
raccionar con una molécula de biotina. El complejo
Figura 5.11: Esquema de la estructura molecular del método PAP (A), ABC (B) y LSAB (C).
150
avidina-biotina es probablemente la interacción
más potente conocida de tipo no covalente (Ka = 10-
15
L/mol). Este complejo se forma muy rápido y es
muy estable, pues no es afectado por variaciones
bruscas de pH, temperatura, disolventes orgáni-
cos o agentes desnaturalizantes. La estreptavidina
es una molécula similar pero no está glucosilada, lo
que todavía la hace más idónea para usarla en las
inmunotécnicas, pues evita interacciones no desea-
das mediadas por carbohidratos.
Una variante del método ABC es el método
LSAB (labeled streptavidin biotin), donde la enzima
va unida directamente a estreptavidina, de modo
que el complejo enzima-estreptavidina interacciona
directamente con el anticuerpo biotinilado (Figura
5.11). El hecho de que este complejo sea mucho me-
nor que el complejo ABC, le permite penetrar mejor
en los tejidos, por lo que es más útil en técnicas in-
munohistoquímicas.
5.5. La señal: intensificación
y amplificación
A veces la intensidad de la señal obtenida es débil y
es necesario aumentarla. En las inmunotécnicas, en
función del marcaje, se obtienen señales de natu-
raleza muy diferente. La formación de un sustrato
coloreado por la actividad de una enzima es el tipo de
señal más habitual por sus muchas ventajas (entre
las que destacan sencillez, baja o nula peligrosidad
y escaso costo) pero, lamentablemente, la intensidad

Figura 5.12: Esquema de los métodos de ampli�icación MICA (A), EVS (B) y TSA (C).
de la señal obtenida suele muchas veces ser baja, lo
que conlleva una pérdida de sensibilidad.
Para aumentar la intensidad de una señal co-
loreada de origen enzimático se puede proceder
en dos sentidos: con la misma cantidad de sus-
tancia coloreada conseguir una señal mucho más
intensa (intensi�icación) o conseguir más sustan-
cia coloreada (ampli�icación). Ambos modos no son
excluyentes y cuando se combinan la ampli�icación
debe preceder a la intensi�icación. El estudio de es-
tos dos procedimientos se sustanciará sobre un
sistema de marcaje integrado por peroxidasa y DAB
(enzima y sustrato cromógeno) que es, de largo,
el procedimiento de marcaje enzimático más utili-
zado en las inmunotécnicas. No obstante, también
se incluirá el método de ampli�icación por círculo
rodante, que se utiliza para ampli�icar señales �luo-
rescentes.
Los procedimientos de intensi�icación más
usuales para el marcaje con peroxidasa y DAB se
151
Inmunotécnicas
basan en el empleo de sales de metales pesados,
normalmente cloruros de oro y cobalto o sulfatos
de níquel y cobre, que provocan un oscurecimien-
to de la señal. La intensi�icación con plata es menos
usada. Generalmente, estos tratamientos se aplican
al �inal de la inmunotécnica, una vez formado el pro-
ducto insoluble derivado de la DAB.
Los procedimientos de ampli�icación son más
complejos, y entre ellos destacan los métodos por
crecimiento (build-up), el método MICA (mirror
image complementary antibody), el método TSA
(tyramine signal ampli�ication), el método EVS (En-
Vision System) (Figura 5.12) o el método RCA (rolling
circle ampli�ication) (Figura 5.13), este último para
señales �luorescentes. Los métodos por crecimiento
se basan en ir incorporando moléculas marcado-
ras por sucesivas y alternativas incubaciones, lo que
provoca el crecimiento de la estructura molecular
(de ahí el nombre). En el método de la PAP, partien-
do del esquema de la �igura 5.11, consiste en volver
 Métodos en biociencias
a incubar con un anticuerpo puente, posteriormen-
te hacerlo con el complejo PAP y así sucesivamente.
La ampli�icación en el método ABC es teóricamente
sencilla, si la peroxidasa va doblemente biotinilada,
y una de las dos biotinas está libre, basta con incu-
bar con avidina y volver a incubar con peroxidasa
biotinilada y así sucesivamente.
El método MICA es una variante de los mé-
todos de crecimiento y consiste en, una vez unido
el anticuerpo secundario, aplicar de nuevo el anti-
cuerpo primario, que se une al sitio de unión libre
del anticuerpo secundario, y volver a aplicar el an-
ticuerpo secundario marcado y así sucesivamente.
El método TSA se aplica a inmunotécnicas basadas
en el método ABC o LSAB, y consiste en incubar con
tiramina biotinilada en presencia de H2O2, esta mo-
lécula es activada por la peroxidasa y se une a las
proteínas próximas a ella. La posterior incubación
con peroxidasa unida a avidina hace que se produz-
ca una mayor concentración de la enzima en la zona
próxima al antígeno. El método EVS, también lla-
mado marcaje polimérico, utiliza una molécula de
dextrano (polímero rami�icado de glucosa) sobre la
que se asientan anticuerpos secundarios y numero-
sas moléculas de peroxidasa.
Figura 5.13: Esquema del método de ampli�icación por círculo rodante.
La �lecha de la �igura inferior izquierda representa la dirección de avance
de la DNA polimerasa, que utiliza al plásmido como molde para alargar la
cadena de DNA del oligonucleótido. En el plásmido se incluyen diferentes
copias complementarias de la secuencia del oligonucléotido. “F” representa
el marcaje con �luoróforos.
152
La ampli�icación por círculo rodante, método
RCA, consiste en utilizar un anticuerpo (primario
o secundario) que lleva unido un oligonucleótido.
Una molécula de DNA circular hibrida con el oligo-
nucleótido pues posee repetidas veces su secuencia
complementaria. El oligonucleótido unido es am-
pliado utilizando el DNA circular como molde y, una
vez terminada esta ampliación, se produce la hibri-
dación con sondas complementarias normalmente
marcadas con �luoróforos (Figura 5.13).
5.6. Control de la especificidad
El problema principal de una inmunotécnica es
saber si la señal obtenida es correcta y no origi-
nada de forma espuria, obteniendo entonces una
falsa señal o falso positivo. Básicamente, las seña-
les falsas pueden serlo por dos motivos: porque se
generan de forma endógena; es decir, las genera
nuestra muestra y no el marcaje utilizado, o por-
que los anticuerpos no se unen de forma especí�ica.
Otro posible error, de naturaleza contraria, es la no
obtención de señal por fallos en el desarrollo de la
inmunotécnica.
En adelante se estudiarán estrategias y proce-
dimientos que sirven para garantizar la �iabilidad
del resultado obtenido en la inmunotécnica, inde-
pendientemente de que este pueda ser positivo o
negativo. Estas estrategias y procedimentos inclu-
yen: bloqueo, especi�icidad, curvas dosis-respuesta,
controles negativos y controles positivos. En gene-
ral, cuando se está poniendo a punto una técnica
es necesario llevar a cabo todos los tipos de con-
troles que aquí se describen; después, cuando se
repite la técnica, es obligatorio llevar a cabo algu-
no (control de la señal endógena y eliminación
del anticuerpo primario son los básicos), e in-
cluir alguno más si se utiliza algún reactivo nuevo.
5.6.1. Bloqueo
Existen dos tipos de bloqueo:
Bloqueo de la unión inespecífica
de los anticuerpos
Este bloqueo tiene una importancia capital pues
sirve para eliminar sitios donde se puedan unir
inespecí�icamente el anticuerpo primario o el se-
cundario. La unión inespecí�ica suele ser de tipo
adsorción y tiene lugar porque los anticuerpos,
tanto el primario como el secundario, como proteí-
nas que son, se pueden pegar a zonas del soporte

o fase sólida (cristal, tejido, plástico, nitrocelulo-
sa...), e incluso a otras moléculas. Los bloqueantes
más habituales son albúmina, gelatina, blotto-bu-
ffer o sueros pre-inmunes; es decir de animales que
no han sido inmunizados. En el caso de los sueros,
el bloqueo ideal hay que realizarlo con suero de un
animal de la misma especie donde se haya sinteti-
zado el anticuerpo secundario, también se puede
utilizar el de otras especies, pero jamás el suero de
un animal de la misma especie donde se haya sin-
tetizado el anticuerpo primario pues entonces el
anticuerpo secundario se uniría a los anticuerpos
del suero y a los anticuerpos primarios. La inten-
sidad del bloqueo debe ajustarse en cada caso de
forma empírica pues por defecto suele generar rui-
do de fondo y por exceso debilita la señal.
Bloqueo de la señal endógena
Antes de iniciar la inmunotécnica es necesario com-
probar, cualquiera que sea la naturaleza de la señal,
que la muestra a estudiar carece de señal endóge-
na, que es aquella señal producida por la muestra
biológica y no por el marcaje. Obviamente existen
diversos procedimientos de bloqueo en función
del tipo de muestra biológica y del marcador y se-
ñal usados, pero, en general, para comprobar que
el bloqueo es efectivo y no hay señal endógena hay
que testar la existencia de señal sin haber inclui-
do el marcaje. Por ejemplo, en un método indirecto
enzimático que usa la peroxidasa, lo usual es selec-
cionar unas muestras que no han sido incubadas
con el anticuerpo secundario (lleva el marcaje) y
añadir el cromógeno (DAB, por ejemplo). Si se ob-
tiene señal la responsable de su aparición sería
una peroxidasa endógena mal bloqueada. En las
técnicas con marcaje �luorescente, por poner otro
ejemplo, lo usual es iluminar la muestra con la lon-
gitud de onda de excitación del �luorocromo antes
de haberlo añadido.
5.6.2. Especificidad
En este apartado se considerarán las estrategias
que se utilizan para comprobar que la unión de los
anticuerpos es especí�ica, al igual que la aparición
de la señal.
Especificidad de la unión de los anticuerpos
Cuando se testa la especi�icidad de unión de los
anticuerpos lo que se trata de comprobar es si los
anticuerpos se unen correctamente; es decir, si el
153
Inmunotécnicas
primario se une al antígeno y el secundario al pri-
mario. Al igual que la comprobación del bloqueo de
la señal endógena, este tipo de control es obligato-
rio realizarlo siempre, en cada inmunotécnica.
La especi�icidad del anticuerpo primario se
suele comprobar de diferentes maneras, algunas
más concluyentes que otras. Una de las formas
más utilizadas es mediante bloqueo del anticuer-
po primario; para ello, antes de su uso, es necesario
incubar al anticuerpo primario con una concentra-
ción alta de antígeno puro. De este modo se saturan
los sitios de unión del anticuerpo y al añadirlo a la
muestra no puede interaccionar con el antígeno
incluido en ella, por lo que al completar la inmu-
notécnica no se obtiene señal. Otra posibilidad es
llevar a cabo la inmunotécnica en una muestra don-
de, con absoluta certeza, no se encuentra el antígeno
reconocido por el anticuerpo primario. Además, en
el immunoblot se suele añadir otro procedimiento
para el que hay que utilizar, al menos, dos carri-
les de la electroforesis, uno donde se ha inyectado
la muestra biológica y otro al que solo se le ha in-
yectado el antígeno que se quiere estudiar. Una vez
obtenida la señal se puede comprobar si en el carril
de la muestra se ha producido una sola banda y si
esta coincide con la del carril donde solo se inyec-
tó el antígeno.
La especi�icidad del anticuerpo secundario se
suele comprobar realizando la inmunotécnica sin
incluir el anticuerpo primario y comprobando si
hay señal. Puesto que el anticuerpo secundario solo
puede unirse al anticuerpo primario y este no ha
sido incluido, si hay señal es debida a la unión ines-
pecí�ica del anticuerpo secundario. Es importante
ajustar las concentraciones del anticuerpo secunda-
rio y su tiempo de incubación, pues concentraciones
elevadas de anticuerpo secundario y tiempos largos
de incubación suelen causar señales inespecí�icas
en forma de ruido de fondo (background).
Especificidad de la señal
En una inmunotécnica se entiende por señal es-
pecí�ica aquella originada única y exclusivamente
por el sistema de marcaje propio de la inmunotéc-
nica, independientemente de que el marcaje esté
localizado en los anticuerpos o en el antígeno. El
procedimiento a seguir para comprobar la especi-
�icidad de la señal es exactamente el mismo que el
seguido para comprobar que no existe señal endó-
gena, y que, básicamente, consiste en no incluir la
molécula que lleva el marcaje cuando se realiza la
inmunotécnica.
Métodos en biociencias
5.6.3. Curvas dosis-respuesta
Este tipo de curvas han de efectuarse siempre que
la inmunotécnica persigue un objetivo cuantitati-
vo o semicuantitativo. Para ello hay que realizar
una curva de modo que el eje X representa la con-
centración del antígeno o la cantidad de muestra,
y el eje Y la intensidad de la señal (inmunorreac-
tividad). Con ello se trata de averiguar donde se
produce una respuesta lineal y a partir de donde se
produce la saturación de la misma. Es fundamen-
tal trabajar siempre en rangos de respuesta lineal
pues el operar en rangos de saturación conduce a
errores (Figura 5.14). También es importante que
la respuesta, además de lineal, sea proporcional,
es decir, que a una determinada diferencia en la
concentración del antígeno le corresponda una di-
ferencia similar en la señal. No obstante, en casos
de muestras con diferencias pequeñas entre ellas
pueden ser útiles respuestas con zonas lineales de
mucha pendiente, pues son más sensibles: con poca
diferencia en la cantidad de antígeno se obtienen
grandes diferencias de señal.
5.6.4. Controles negativos
Un control negativo consiste en retirar alguno de los
elementos de la inmunotécnica de forma que impi-
da la obtención de señal o producto inmunoreactivo.
Por ejemplo, si se omite el anticuerpo primario y/o
el anticuerpo secundario no se debe obtener señal,
como ya se ha visto en los apartados anteriores. En
algunas inmunotécnicas, este tipo de controles pue-
den hacerse quitando el antígeno, caso de la técnica
ELISA, o iluminando con longitudes de onda dis-
tintas a la de excitación del �luorocromo si se usa
marcaje �luorescente.
5.6.5. Controles positivos
Este tipo de control es especialmente útil en el caso
de obtención de resultados negativos. Cuando esto
sucede existen, de partida, al menos dos posibili-
dades: que el antígeno que reconoce el anticuerpo
primario realmente no esté presente en la muestra
de estudio, o que alguno de los reactivos (anticuer-
pos, cromógenos…) pueda estar estropeado. Para
dilucidar cual de las dos razones es la causante del
resultado negativo lo más sencillo es utilizar un con-
trol positivo, es decir, una muestra donde se tiene la
certeza de que el antígeno está presente, o incluir
alguna muestra donde se han obtenido resultados
positivos. En immunoblotting, se puede incluir en un
carril únicamente el antígeno utilizado como inmu-
154
Figura 5.14: Curva dosis-respuesta. La
diferencia de la cantidad de antígeno de
las muestras 1 y 2 se ve re�lejada con una
diferencia similar de señal; sin embargo,
las muestras 3 y 4 poseen diferente con-
centración de antígeno y ofrecen una res-
puesta inmunoreactiva similar.
nógeno para obtener el anticuerpo primario, pues
a veces se suministra junto al anticuerpo primario.
Si en el control positivo no se obtiene señal lo ra-
zonable es pensar que puede haber problemas en
los reactivos o algún desajuste en el desarrollo de
la técnica. Si en el control positivo se obtiene señal
pero las muestras siguen rindiendo un resultado ne-
gativo se abren, al menos, tres nuevas posibilidades.
Puede que (1) la muestra realmente no contenga el
antígeno; o que lo contenga y entonces (2) el siste-
ma de marcaje no sea lo su�icientemente sensible
para detectarlo o (3) el antígeno esté enmascarado.
En el primer caso lo más razonable es intensi�icar
y/o ampli�icar la señal o utilizar una inmunotécni-
ca con mayor sensibilidad. En el segundo hay que
seguir procedimientos de ampli�icación o desen-
mascaramiento. Estos últimos se estudiarán en el
apartado dedicado a la inmunohistoquímica.
5.7. Descripción de las inmunotécnicas
de más uso
El objetivo de este apartado es estudiar técnicas
inmunohisto- e inmunocitoquímicas, inmunopre-
cipitación y un grupo de inmunoensayos que
comprende la electroinmunotransferencia (immu-
noblotting) y el método ELISA; además, también se
incluirá el estudio de cinco métodos relacionados
fundamentalmente con la biología de las proteí-
nas: FRAP, FLIP, FLAP, FRET y FLIM. No se pretende
aquí llevar a cabo un estudio detallado de cada pro-
cedimiento, hay libros completos dedicados a cada
uno de ellos, sino conocer la base de cada una de
las técnicas, su objetivo, y sus peculiaridades y con-

dicionantes más sobresalientes; en ningún caso se
incluirán protocolos, tal cosa escapa al objetivo de
este epígrafe y de este capítulo.
5.7.1. Inmunohistoquímica
Básicamente, una técnica inmunohistoquímica
(IHC, immunohistochemistry) consiste en realizar
la inmunotécnica en secciones de tejido para poder
ser observadas con el microscopio óptico, lo que po-
sibilita la localización del antígeno, su distribución
y hasta su semicuanti�icación. Los procedimientos
de obtención de estas secciones se estudian en el
capítulo 7.
La �ijación del tejido es uno de los procesos fun-
damentales de esta técnica ya que puede provocar
cambios conformacionales en los antígenos que mo-
di�iquen su interacción con el anticuerpo. Por ello,
las �ijaciones de tipo químico suelen ser suaves o
incluso, en algunos casos, puede ser más idónea la
crio�ijación. Dos de los �ijadores más usualmente
empleados son el paraformaldehido y el etanol de
70º. Algunas muestras, normalmente biopsias, se
suelen �ijar siguiendo protocolos cuyo objetivo no
es la realización de pruebas de tipo inmunohistoquí-
mico; esto, a veces, suele causar drásticos cambios
en la antigenicidad de muchas moléculas, efecto que
se conoce con el nombre de enmascaramiento del
antígeno. Existen diversos procedimientos de desen-
mascaramiento de antígenos (antigen retrieval) cuyo
objetivo es lograr que el antígeno pueda ser recono-
cido por el anticuerpo primario. Entre ellos destacan
dos: el tratamiento con proteasas (PIER, protea-
se-induced epitope retrieval), entre las que destacan
pepsina, tripsina o pronasa; y el tratamiento con ca-
lor (HIER, heat-induced ER), sometiendo al tejido a
90-100 ºC alrededor de 10-20 minutos. En un prin-
cipio se hacía en tampones muy básicos, después se
ha visto que algunos antígenos se desenmascaran
mejor en tampones ácidos, e incluso neutros. Proce-
dimientos menos habituales son el tratamiento por
incubación con ácido fórmico concentrado, urea (3
M), cloruro amónico (0.5 M), sacarosa, borohidruro
sódico o soluciones fuertemente alcalinas.
Otro aspecto importante en las técnicas inmu-
nohistoquímicas es la capacidad de penetración de
los anticuerpos. El grosor medio de las secciones
oscila entre 6 y 10 μm, y debido al entramado mo-
lecular de la sección y al tamaño de los anticuerpos
(especialmente el secundario que es el que suele
llevar asociado el marcaje), solo los antígenos más
externos son susceptibles de interaccionar con los
anticuerpos. Existen, al igual que en el caso ante-
rior, diversos procedimientos para permeabilizar la
155
Inmunotécnicas
muestra, entre los que destacan: el tratamiento con
detergentes como Tween20 o tritón X-100 (0.1-1%),
congelar y descongelar la sección repetidas veces,
el tratamiento con proteasas (similar al visto ante-
riormente) o el tratamiento con concentraciones
crecientes de etanol. El Tween20, a menor concen-
tración, se suele utilizar en la fase de incubación del
anticuerpo primario y del secundario pues favorece
la interacción de estas moléculas con sus respectivas
parejas moleculares, el antígeno y el anticuerpo pri-
mario respectivamente.
El bloqueo de unión inespecí�ica se suele hacer
con suero preinmune de la especie de origen del an-
ticuerpo secundario, pero se pueden utilizar otros
procedimientos. En cuanto al marcaje, lo más usual
es emplear métodos indirectos de tipo enzimático o
con marcaje �luorescente. De hecho el primer pro-
cedimiento inmunohistoquímico fue realizado por
el equipo de Coons en 1942 utilizando marcaje �luo-
rescente. Finalmente, en la inmunohistoquímica
es fácil la realización de dobles y triples marca-
jes, o incluso el contrastado de la sección, que es
la combinación de estas técnicas con procedimien-
tos de tinción estándar (hematoxilina-eosina, azul
de toluidina…) para facilitar la identi�icación de las
estructuras incluidas en la sección. La �igura 5.15
incluye microfotogra�ías de secciones inmunoteñi-
das.
5.7.2. Inmunocitoquímica
Aunque no existe un consenso de�initivo sobre la
utilización de los términos inmunohistoquímica e
inmunocitoquímica, de hecho hay autores que los
engloban y solo consideran técnicas inmunohisto-
químicas; en este capítulo se considerarán ambos:
la inmunohistoquímica en el campo de la micros-
copía óptica, y la inmunocitoquímica en el de la
microscopía electrónica. Bajo este prisma, el obje-
tivo principal de las técnicas inmunocitoquímicas
es la localización de antígenos a nivel celular y sub-
celular usando el microscopio electrónico. En la
inmunocitoquímica existen dos diferentes modos
de proceder en función del momento de realización
de la inmunotécnica: las técnicas de pre-inclusión
(pre-embedding), donde la inmunotécnica es previa
a la inclusión, y las de post-inclusión (post-embed-
ding), donde es posterior. En general, el método de
pre-inclusión rinde mejores resultados pero, si es
necesario usar muestras ya incluidas, el procedi-
miento idóneo es el método post-inclusión.
En un procedimiento habitual del método de
pre-inclusión, tras la �ijación, se obtienen, en el vi-
bratomo, secciones de 25 hasta 100 μm de espesor
Métodos en biociencias

Figura 5.15: Secciones inmunoteñidas de tejido nervioso: (A) estriado; (B) hipocampo; (C) cerebelo (CM, capa molecu-
lar; SB, sustancia blanca). En A y B se observan astrocitos inmunoteñidos utilizando un anticuerpo anti-GFAP con peroxi-
dasa y DAB como sistema de marcaje. La sección A no está contrastada, la B ha sido contrastada con azul de toluidina. En
la sección C los núcleos de las neuronas de los granos aparecen inmunoteñidos con un anticuerpo anti-neuN asociado a
un marcador �luorescente. Cortesía de la Dra I. Suárez, Universidad de Alcalá. Disponible en color.

sobre las que se hace la técnica inmune, normal-
mente en �lotación y utilizando marcaje con oro
o enzimático. Debido al grosor de la sección sue-
le ser necesario permeabilizarlas. Posteriormente,
la sección se deshidrata e incluye en resina (es-
tos procedimientos se detallan en el capítulo 8), y
con la ayuda de un estereomicroscopio se aísla un
pequeño fragmento que es pegado a un bloque ex-
clusivamente de resina. Una vez así dispuesto se
corta en el ultramicrotomo, se prepara la rejilla y se
tiñe y contrasta con las sales usuales de metales pe-
sados. Es importante no desperdiciar cortes pues
en los primeros (los más super�iciales) es donde se
consigue un marcaje más e�iciente. En el procedi-
miento post-inclusión lo que se hace es tratar las
secciones montadas en las rejillas con productos
que eliminan el plástico de inclusión, y realizar des-
pués la inmunotécnica.
El marcaje con nanopartículas de oro es
fácil de detectar pues las partículas de oro son fá-
cilmente identi�icables como círculos electrodensos
(oscuros) de diferente tamaño, en función del ta-
maño de la nanopartícula. El marcaje enzimático,
usualmente peroxidasa con DAB como cromógeno,
se presenta como manchas electrodensas (Figura
5.16a y b).
Una variante de estas técnicas llamada «deter-
gent digestion fracture-labeling technique» se emplea
para localizar antígenos especí�icos en las réplicas
metálicas que se obtienen en algunas de las técnicas
de metalizado empleadas en microscopía electróni-
ca. Para ello hay que hacer una digestión muy suave
y controlada del material biológico sobre el que se
ha realizado la réplica. Esto permite que algunas mo-
léculas de la muestra queden ancladas a la réplica
metálica y puedan servir de lugares de anclaje del an-
ticuerpo primario. El anticuerpo secundario ha de ir
marcado con nanopartículas de oro (Figura 5.16c). A
veces, pueden quedar enzimas adheridas a la réplica
metálica y entonces es posible llevar a cabo técnicas
histoquímicas (se detallan en el capítulo 10).
5.7.3. Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) también se puede con-
siderar un tipo de inmunopuri�icación pues en el
proceso se consigue el aislamiento (puri�icación)
de un antígeno especí�ico del resto de moléculas
que van incluidas en la muestra biológica. El térmi-
no precipitación hace referencia a que el anticuerpo
va asociado a una estructura que, por su peso, arras-
tra al complejo antígeno-anticuerpo unido a ella.
Clásicamente, esta estructura ha sido una bola de
agarosa (nombre comercial Sefarosa); sin embargo,
en los últimos años el empleo de estas bolas ha sido
sustituido por esferas magnéticas. Esta técnica sir-
ve para detectar (presencia/ausencia), cuanti�icar o

156
 Inmunotécnicas

Figura 5.16: (A) Marcaje con nanopartículas de oro del canal de K en una neurona. La barra indica 1μm. Tomado de Du
et al., Neuroscience 84:37-48, 1998. (B) Célula plasmática. El RER aparece lleno de anticuerpos anti-HRP revelados tras
incubación con HRP y DAB. Tomado en «The FDC Network-Comcast.net». (C). «Detergent digestion fracture-labeling
technique». El esquema muestra el inmunomarcaje de moléculas adheridas a la réplica mediante nanopartículas de oro.
Con el �in de simpli�icar se ha optado por un marcaje directo.

Figura 5.17: Esquema de un procedimiento de IP con esferas paramagnéticas. El anticuerpo unido a la esfera se
mezcla con la muestra biológica (A) y, tras un periodo de incubación (B), se produce la unión del anticuerpo con su
correspondiente antígeno (C). Se aplica un campo magnético que retiene los anticuerpos y los antígenos unidos a
ellos (D) y se elimina el sobrenadante (E). Se retira el campo magnético, se añade un medio que separa las esferas
paramagnéticas de los anticuerpos (F) y se vuelve a aplicar el campo magnético para retener las esferas (G). El
sobrenadante se pasa a un nuevo tubo (H) con un medio que separa antígeno y anticuerpo. Las esferas quedan
aisladas y pueden ser reutilizadas (I). En las imágenes D y E se ha disminuido el tamaño de los complejos antíge-
no-anticuerpo para adaptarlos a la estructura que representa al imán que genera el campo magnético.

157
Métodos en biociencias
semicuanti�icar antígenos y, a la vez, permite su pu-
ri�icación.
El modo más habitual de unir el anticuerpo a
la esfera (tanto de agarosa como magnética) suele
ser a través de la proteína A o la proteína G, aun-
que también se puede hacer directamente si se
activan las esferas con algún radical que pueda in-
teraccionar con el anticuerpo. En algunos casos es
el anticuerpo primario el que se une a la esfera (mé-
todo directo), en otros es un anticuerpo secundario
(método indirecto). La precipitación se consigue
por centrifugación en el caso de las esferas de aga-
rosa y por la aplicación de un campo magnético en
el caso de las esferas magnéticas. Tras la precipita-
ción del complejo (esfera-anticuerpo-antígeno) se
elimina el sobrenadante y el precipitado se incu-
ba en un medio que, dependiendo de su naturaleza,
permite el desenganche de las esferas, la liberación
del antígeno o de todo el complejo (Figura 5.17).
La aplicación de esferas magnéticas en la bio-
medicina es relativamente reciente; sin embargo, se
han desarrollado numerosos tipos de esferas con el
�in de optimizar su aplicación. A veces se intercam-
bia el término esfera con el de partícula, en sentido
estricto solo una partícula redonda es una esfera, lo
que ocurre es que la mayoría de las partículas son
redondeadas. Por su tamaño existen nanoesferas
(<100 nm) y microesferas (100 nm a 0.1 mm), estas
últimas más idóneas en mecanismos de aislamiento
celular (ver capítulo 4, «Aislamiento de un tipo ce-
lular»). Por su comportamiento magnético existen
esferas magnéticas y paramagnéticas, estas últimas
solo exhiben comportamiento magnético cuando es-
tán bajo la in�luencia de un campo magnético. Por su
composición química son muy variadas; pero las más
habituales son las de ferrita, óxidos de Fe con otros
metales entre los que destaca la magnetita; o las que
contienen diferentes metales, Pt o Co es lo más usual.
Por su estructura lo más habitual es que tengan un
núcleo magnético recubierto de un material, grafe-
no o polímeros plásticos, que sirve de estabilizante
y antiaglomerante, o un núcleo de algún polímero
plástico recubierto de material magnético o para-
magnético, que puede volver a recubrirse de algún
polímero para hacer la esfera más lisa.
El término coinmunoprecipitación hace re-
ferencia a un proceso de precipitación donde,
además de precipitar el antígeno reconocido por
el anticuerpo, es precipitada otra u otras molécu-
las por su interacción con el antígeno. En este caso
el complejo precipitado estaría formado por esfe-
ra-anticuerpo-antígeno-otra molécula. Obviamente,
esta es una técnica cuyo objetivo es poner en evi-
dencia interacciones entre diferentes moléculas y
158
uno de los mejores y primeros ejemplos de su apli-
cación fue el desentrañar la estructura de la red
proteica submembranosa del glóbulo rojo forma-
da, entre otras proteínas, por espectrina, anquirina
o banda III. El estudio del material precipitado me-
diante electroforesis es necesario para demostrar
la coprecipitación y ayudar a identi�icar el material
coprecipitado.
5.7.4. Immunoblotting
La terminología castellana para nombrar esta
técnica es confusa. Probablemente el término elec-
troinmunotransferencia sea el más correcto, pero
es muy poco utilizado. Lo usual es «castellanizar» a
medias, el término inglés immunoblotting y dejarlo
en inmunoblotting. Otra posibilidad es utilizar di-
rectamente el término inglés ya visto o el término
Western blot (WB), que es otra manera de nombrar
esta técnica.
La fase sólida del WB suele ser una membrana
de nitrocelulosa o PVDF (polyvinylidene di�luoride),
esta última más resistente y con mayor capacidad
de unión (150-160 μg/cm2 frente a 80 μg/cm2), su
único inconveniente es que su alta hidrofobicidad
obliga a mojarla previamente en metanol. El tama-
ño de poro habitual de estas membranas es de 0.45
μm, su�iciente para retener con garantía proteínas
mayores de 20 kD; sin embargo, conviene usar mem-
branas de 0.2 μm de poro para pesos moleculares
menores. La �ijación de las proteínas a la membra-
na se produce mediante un proceso de transferencia
que se estudia en el capítulo 2.
Una vez mojada la membrana se realiza la
inmunotécnica, en la que, probablemente, el pun-
to más peculiar sea la fase de bloqueo de unión
inespecí�ica de los anticuerpos. Debido a la alta
capacidad de unión de estas membranas es nece-
sario realizar un bloqueo muy efectivo de los sitios
de la membrana donde no se han unido las proteí-
nas provenientes de la electroforesis. El bloqueante
más universal es el tampón «blotto» (blotto buffer),
que se suele preparar con 5% de leche desnata-
da en tampón fosfato salino (PBS) o TRIS salino
(TBS). Este mismo tampón al 1% suele emplearse
para incubar el anticuerpo primario. Los modos de
marcaje más habituales son el enzimático median-
te peroxidasa utilizando como cromógeno la DAB,
la quimioluminiscencia o la �luorescencia, estas dos
últimas por su mayor sensibilidad. En el marcaje
enzimático, en caso de señales débiles, suele ser útil
seguir algún procedimiento de intensi�icación.
Debido a que las proteínas se colocan por su
peso molecular es posible analizar simultánea-

Figura 5.18. Imágenes de un Western blot (A) y de un dot-blot (B).
La imagen B es una modi�icación de la tomada de la página web
RSB (rsb.info.nih.gov).
mente diferentes proteínas, en tanto sus pesos
moleculares no sean muy parecidos (Figura 5.18a).
Otra interesante posibilidad es la de reutilizar la
membrana pues conlleva un ahorro importante de
tiempo, reactivos y muestra; para ello es necesario
separar el anticuerpo del antígeno (stripping) me-
diante un tratamiento que suele incluir un agente
reductor, detergente, calor y/o pH bajo. Uno de los
problemas del WB es la aparición, a veces, de múl-
tiples bandas cuando se estudia solo una proteína.
Esto puede deberse a fenómenos de reactividad
cruzada del anticuerpo o al fragmentado de dicha
proteína por efectos proteolíticos causados por un
mala manipulación de la muestra durante su aisla-
miento.
El dot blot es una variante simpli�icada del WB
en la que las proteínas no son separadas por electrofo-
resis sino que la muestra es directamente depositada
sobre la membrana (Figura 5.18b), lo que conlleva un
ahorro importante de tiempo y reactivos.
5.7.5. ELISA
La técnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent as-
say) es un tipo de inmunoensayo que utiliza placas
multipocillo como fase sólida y que está destinado
mayoritariamente a la detección de antígenos que
pueden ligarse a la fase sólida directa o indirecta-
mente. La unión directa del antígeno al plástico de la
placa se consigue añadiendo la muestra al pocillo en
primer lugar, la indirecta se lleva a cabo tapizando
el pocillo con el anticuerpo (u otra molécula que lo
159
Inmunotécnicas
retenga), y añadiendo después la muestra. Una vez
�ijado el antígeno el proceso siguiente es desarrollar
una inmunotécnica estándar (bloqueo, anticuer-
po primario, secundario –si es marcaje indirecto– y
obtención de señal). El marcaje más habitual es de
tipo enzimático con señal de color soluble. Es, por
tanto, un ensayo de tipo colorimétrico, cuya medi-
ción la hace un lector basado en la determinación
de la absorbancia de la muestra coloreada, ya que
la intensidad del color obtenido es proporcional al
antígeno retenido en el pocillo. Los marcadores �luo-
rescentes también son regularmente usados. En el
desarrollo de la técnica es obligatorio y fácil realizar
diferentes controles, no solo con el �in de garantizar
la especi�icidad, sino además para detectar y eli-
minar el ruido de fondo, especialmente si se hacen
estudios de tipo cuantitativo.
La fase sólida es una placa multipocillo de
plástico. Las más usuales son de 96 pocillos, pero
las hay de 384 y 1536 pocillos, empleadas sobre
todo en sistemas de análisis robotizados. El plásti-
co de las placas (normalmente poliestireno) se ha
ido mejorando con el �in de conseguir una máxima
adsorción del material biológico y una mínima in-
terferencia en el proceso de medida. ELISA es una
técnica de alta sensibilidad pues llega a permitir la
detección de cantidades en el rango del pg; lo que
unido a su especi�icidad y al fácil y breve desarro-
llo de la técnica ha hecho que se hayan desarrollado
numerosos kits para determinación de muy dife-
rentes tipos de antígenos.
In-cell ELISA y ELISPOT son dos variantes
del procedimiento estándar. En el primero la in-
munotécnica se realiza sobre las propias células
cultivadas en los pocillos de la placa, que para ello
han de ser previamente �ijadas y permeabilizadas.
A esta técnica también se le llama In-cell Western.
ELISPOT es un método que permite testar la secre-
ción de proteínas por las células existentes en el
pocillo, y ha sido especialmente útil en estudios de
activación de respuesta inmune. Muy básicamente,
la base del pocillo se cubre con el anticuerpo que re-
conoce la sustancia a testar y se añaden las células.
Estas secretan el producto de estudio, que prácti-
camente no difunde pues queda retenido por los
anticuerpos que están más próximos a las células.
Se eliminan después las células y se realiza el inmu-
nomarcaje. Este es un ensayo de doble anticuerpo
que tiene una gran sensibilidad y además permite
cuanti�icar no solo la cantidad de producto secre-
tado sino también el número de células que lo han
producido por las manchas que aparecen en la pla-
ca (Figura 5.19).
Métodos en biociencias

Figura 5.19: Esquema del método ELISPOT. Tras el anclaje de los anticuerpos y el bloqueo de la super�icie del pocillo
o placa (A) se siembran las células que secretan el producto especí�ico (rombos) para dicho anticuerpo (B), y que se
asocia a los anticuerpos más próximos a la célula. Una vez retiradas las células se incuba con un anticuerpo que lleva
asociado marcaje enzimático, representado por un cuadrado con una E en su interior (C). La molécula marcadora
añadida es modi�icada por la enzima y se transforma en un producto insoluble (círculos grises oscuros) que queda
en la zona donde estuvieron las células (D).

Figura 5.20: Esquema de las técnicas FRAP y FLIP. El cuadrado en la técnica FLIP representa la zona donde se
mide la señal inmunoreactiva. N: núcleo.

160

Figura 5.21: (A) Esquema que ilustra un proceso donde por la proximidad de las moléculas ocurre
FRET; F: �luoróforo. (B) Esquemas que ilustran la utilidad de la técnica FRET para detectar interac-
ción entre moléculas o cambios moleculares.
5.7.6. FRAP, FLIP, FLAP, FRET y FLIM
La base de estas técnicas está relacionada con la
�luorescencia, y un modo muy habitual de colocar
el marcaje �luorescente en las moléculas a estudiar
suele ser utilizando una inmunotécnica, por ello
todas estas técnicas han sido incluidas en este ca-
pítulo. No obstante, también existe la posibilidad
de hacerlo de otras maneras, por ejemplo, en estu-
dios con proteínas se puede utilizar marcaje con GFP
(green �luorescent protein) incorporado a través de
mecanismos de transformación celular.
La técnica FRAP (�luorescence recovey after
photobleaching) se diseñó para analizar la movili-
dad de proteínas de membrana y consiste en acoplar
(normalmente mediante anticuerpos) un marcaje
�luorescente a la proteína que se quiere estudiar. Se
fotoblanquea entonces una pequeña super�icie con
luz láser y se analiza el tiempo que tarda ese área
en recuperar la señal �luorescente; obviamente,
tiempos más cortos de recuperación implican una
mayor movilidad de la proteína estudiada (Figura
5.20a). La posibilidad de microinyectar moléculas
�luorescentes ha permitido analizar la movilidad de
moléculas intracelulares y estudiar, además de su
161
Inmunotécnicas
movilidad, su capacidad de recambio o saber si su
transporte es por difusión o por un proceso activo.
Existe una variante llamada iFRAP (inverse FRAP)
donde se fotoblanquea toda la célula excepto un
punto escogido, es especialmente útil en el caso de
movilidad de orgánulos.
La técnica FLIP (�luorescence loss in photoblea-
ching) puede servir para el mismo objetivo que la
técnica FRAP pero con un desarrollo diferente. Una
vez marcada la proteína se hace fotoblanqueo conti-
nuo en un punto y se analiza el tiempo que tarda en
desaparecer el marcaje en otra zona de la célula. Un
mayor tiempo de borrado del marcaje indica una me-
nor movilidad de esa molécula (Figura 5.20b). Esta
técnica también permite saber si una proteína pasa
por un determinado punto, nótese que no desapa-
recerá el marcaje si se fotoblanquea un punto por
donde nunca la pasa la molécula de estudio.
La técnica FLAP (�luorescence localization after
photopleaching) consiste en marcar a la molécula
de estudio con dos �luorocromos y escoger un área
donde se fotoblanquea uno de ellos. La posibilidad
de detectar al otro �luorocromo permite analizar di-
rectamente la movilidad de esa molécula. Nótese
Métodos en biociencias
que lo que se tiene es una pequeña porción de la
molécula escogida marcada solo con un �luorocro-
mo, y el resto con dos; lo cual permite diferenciar el
movimiento de la molécula que solo tiene activo un
�luorocromo.
La técnica FRET (Förster resonance energy
transfer) se basa en la transmisión de energía de
forma no radiactiva desde un �luorocromo excitado,
el donante, a otro no excitado, el aceptor. Pero para
que esta transferencia de energía ocurra se ha cum-
plir un requisito posicional: donante y aceptor han
de estar situados a menos de 10 nm, y otro energé-
tico: la pareja de �luorocromos ha de ser compatible
en el sentido de que la longitud de onda de emisión
del donante sea capaz de excitar al aceptor. Si no
hay FRET se visualiza la señal emitida por el donan-
te, si hay FRET se visualiza la emitida por el aceptor
(Figura 5.21).
La técnica FRET se ha utilizado con muy di-
versos propósitos, quizás los tres más usuales se
ilustran en la �igura 5.21: interacción proteica, pro-
cesados proteolíticos o cambios conformacionales.
El método FLIM (�luorescence lifetime imaging
microspy) se diseñó con el �in de solventar algunas
de las limitaciones de la técnica FRET y se basa en el
mapeo de la distribución espacial de los tiempos de
vida del �luorocromo, es decir del tiempo en el que
el �luorocromo está excitado. Estos tiempos de vida
son del orden de nanosegundos y característicos de
cada molécula �luorescente, de hecho, junto con la
longitud onda de excitación y de emisión es el otro
parámetro que permite caracterizar a un �luorocro-
mo. Estos tiempos de vida pueden ser modi�icados
por diferentes factores medioambientales como pH,
162
polaridad, índice de refracción del medio, tempe-
ratura… por lo que su análisis puede proporcionar
información sobre las condiciones ambientales que
rodean a la molécula marcada. Este tipo de método
necesita un microscopio de diseño especial capaz
de analizar los tiempos de vida media.
5.7.7. Radioinmunoanálisis
El radioinmunoanálisis (RIA), por el hecho de em-
plear marcaje radiactivo, se estudia en el capítulo
11, dedicado exclusivamente a las técnicas que uti-
lizan radioisótopos como trazadores.
Bibliografía
Antibodies. A Laboratory Manual. 1988.
Harlowe E, Lane D. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
ISBN 0879693142.
Antibody Techniques. 1994.
Malik VS, Lillehoj EP. Academic Press . ISBN 978-
0124664609.
Immunoassays. 1996.
Diamandis EP, Christopoulos TK (eds). Academic Press.
ISBN 978-0122147302.
Immunocytochemistry. 2003.
Polak JM, Van Noorden S. BIOS Scientific Publishers. ISBN
1859962084.
The Immunoassay Handbook. Theory and Applications of
Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. 2013.
Wild D (ed). Elsevier Science. ISBN 978-0080970370.

Citometría de flujo
La citometría de �lujo es una tecnología que permi-
te determinar de forma cuantitativa y cualitativa
las características �ísicas de múltiples partículas
(normalmente elementos celulares o moléculas)
suspendidas en un �luido. Entre las característi-
cas que se pueden determinar de forma simultánea
se incluyen el tamaño de las diferentes partículas,
la granulación o complejidad interna y, utilizando
marcadores �luorescentes especí�icos, la intensidad
de marcaje. Estas características son cuanti�icadas
utilizando una combinación de elementos ópticos
y electrónicos que analiza cómo cada partícula en
suspensión capta y/o re�leja un haz de luz láser.
6.1. Principios de la citometría de flujo:
sistemas de fluidos, detección
de la muestra y procesamiento
de la señal
En todos los citómetros se combinan: a) un siste-
ma de �luidos que introduce y limita el número de
partículas a analizar, b) un sistema óptico formado
por una o varias fuentes de emisión láser asocia-
das a un conjunto de fotodetectores que recogen las
señales luminosas, y c) un equipo electrónico que
convertirá las señales ópticas en señales electróni-
6.
Julia Carracedo
José Antonio López García
Rafael Ramírez
cas proporcionales y las digitalizará para su análisis
computacional (Figura 6.1). Estos sistemas se van a
revisar brevemente:
a) Sistema de �luidos. Transporta las
diferentes partículas hasta la zona óp-
tica. Estos elementos de �luido están
integrados por unas bombas que mueven
la suspensión y unos tubos de conducción
que permiten que las partículas atravie-
sen los elementos ópticos alineadas de
una en una, de forma que el haz láser in-
cide en una única partícula, por lo que el
sistema de �luidos debe disgregar las di-
ferentes partículas de la suspensión. En
función de las características de estos sis-
temas de �luidos se pueden determinar
partículas que oscilan en un rango de ta-
maño aproximado entre 0.2 y 200 μm.
b) Equipo óptico. Está formado por una
o varias fuentes de emisión láser y un
conjunto de �iltros ópticos acoplados a
espejos detectores. En función de las ca-
racterísticas de cada emisor láser se
podrán excitar diferentes �luorocromos,
capaces de proporcionar haces de luz con
diferentes características de emisión y, en
consecuencia, se pueden utilizar de forma
Métodos en biociencias
Figura 6.1: El equipo óptico está formado por una o varias fuentes de emisión láser y un conjunto de �iltros ópticos acopla-
dos a los detectores. Las partículas que pasan de una en una por el sistema de �luidos se excitan por el haz de luz, emitiendo
señales ópticas que se trasforman en señales electrónicas. Estas son procesadas y almacenadas en un ordenador.
simultánea en una misma partícula. Junto
a esto, la dispersión del haz láser gene-
rada al chocar con la partícula permitirá
cuanti�icar el tamaño de la misma. Por úl-
timo, la cantidad de luz absorbida por la
partícula informará de la densidad de la
misma indicando su granulado o comple-
jidad.
c) Equipo electrónico acoplado al siste-
ma óptico. Convierte las señales ópticas
en señales electrónicas, que son procesa-
das y almacenadas en un ordenador. En
algunos citómetros, el equipo electróni-
co permitirá separar las partículas. Estos
separadores celulares tienen las mismas
prestaciones y posibilidades que los ci-
tómetros de �lujo, pero con la capacidad
adicional de separar y recuperar partí-
culas selectivamente de la suspensión
líquida en función de sus características
de tamaño y complejidad o marcaje.
6.2. Fluorescencia y fluorocromos,
absorbancia y emisión
Como se ha indicado en capítulos anteriores (ver
epígrafes 5.3.3 y 7.2.7), las moléculas �luorescen-
tes (�luorocromos) son, esencialmente, elementos
de marcaje que captan la energía lumínica emitida
en una determinada longitud de onda (por ejem-
plo la producida por un haz de luz láser) y, como
respuesta, emiten una nueva descarga de energía
lumínica susceptible de ser capturada y analizada
por fotocaptores especí�icos. Estos dos procesos co-
nocidos como excitación y emisión, son especí�icos
para cada �luorocromo, y esto permite utilizar de
164
forma simultánea diferentes �luorocromos en una
misma muestra. Los �luorocromos ofrecen un mé-
todo sensible para obtener información acerca de la
estructura, función y viabilidad celular.
6.2.1. Sondas fluorescentes
Habitualmente en citometría de �lujo, los �luoro-
cromos se utilizan unidos o conjugados a sondas,
como un anticuerpo, que permiten identi�icar pro-
piedades biológicas y bioquímicas en las diferentes
partículas.
6.2.2. Fluorocromos útiles para citometría
de flujo
Los �luorocromos con aplicación en citometría
son muy numerosos, y continuamente se incorpo-
ran nuevas moléculas �luorescentes que permiten
mejorar la precisión en el marcaje de partículas
y moléculas. Como ocurre para otras técnicas, en
citometría de �lujo inicialmente se utilizaron �luoro-
cromos simples como el isocianato de �luoresceína
(FITC), que ya era ampliamente conocido y utili-
zado en microscopía óptica de �luorescencia, cuya
excitación y subsecuente emisión se determina-
ba de forma inmediata. Posteriormente se han
incorporado �luorocromos en tándem que son pe-
queñas moléculas �luorescentes acopladas para
producir una emisión en cadena. Esto ha permitido
incrementar el uso de los �luorocromos utilizados
y, como consecuencia, la detección simultanea de
varios parámetros en la misma muestra (detección
multiparamétrica).
Los �luorocromos ideales para ser utiliza-
dos en citometría de �lujo deben reunir una serie
 Citometría de flujo

Figura 6.2: Para detectar varias características simultáneas en una misma muestra de ci-
tometría de �lujo se requiere que los �luorocromos utilizados tengan diferente longitud de
onda de emisión. Se pueden combinar FITC, PE, y PerCP para realizar una �luorescencia tri-
ple ya que emiten respectivamente en un espectro de emisión que va desde la zona del verde,
hasta el naranja y el rojo.

de propiedades como tener un alto coe�iciente de 6.3. Procesamiento de las muestras

extinción a la longitud de onda de excitación (pro-
babilidad de absorber la luz), un alto rendimiento
cuántico (emisión de luz), una elevada fotoesta-
bilidad y un corto estado de excitación. Cuando el
�luorocromo se conjuga con alguna otra molécu-
la debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y
microambiente.
Además del FITC, otro de los �luorocromos
más utilizados es la ficoeritrina (PE) por su gran
capacidad de absorción, rendimiento y fotoestabili-
dad; además, se puede excitar a 488 nm, pero emite
más allá del espectro de la �luoresceína permitien-
do el doble análisis con un solo láser. Actualmente
se ha generalizado el estudio multiparamétrico de
antígenos celulares con el empleo simultáneo de
3, 4 o más anticuerpos conjugados cada uno con
�luorocromos con diferente longitud de emisión.
Combinados con FITC y PE, se utilizan otros �luoro-
cromos como proteína cloro�ila peridinina (PerCP)
o, alternativamente, isotiocianato de tetrametil ro-
damina (TRITC), TRICOLOR u otros �luorocromos
que pueden utilizarse como tercer color de �luores-
cencia. Todos ellos tienen en común que se excitan
a 488 nm y emiten respectivamente en un espectro
de emisión que va desde la zona del verde, hasta el
naranja y el rojo (Figura 6.2). Mediante el equipo
electrónico que acompaña al citómetro es posible
discriminar entre estas �luorescencias y corregir la
superposición de los espectros de emisión posibili-
tando su utilización simultánea.
La preparación de las muestras para citometría de
�lujo no requiere unas consideraciones especí�icas
salvo que la muestra a analizar debe encontrar-
se en forma de suspensión dispersa. Para obtener
una e�icacia óptima los elementos a analizar de-
ben estar suspendidos de forma uniforme en una
concentración comprendida en el rango de 105-106
partículas/mL, aunque estas concentraciones tie-
nen un amplio margen de �lexibilidad en función de
los equipos de citometría o las características de la
muestra. Por ello, en aquellas muestras en que los
elementos a estudiar se encuentren en suspensión
(cultivos de células en suspensión, sangre perifé-
rica, médula ósea), no se requiere un tratamiento
previo de la muestra. En el caso de tejidos, o mues-
tras para�inadas es precisa la disgregación previa
de la muestra utilizando para ello métodos de dis-
persión mecánica, enzimática, etc.
En ocasiones puede ser conveniente o ne-
cesario enriquecer la concentración celular en la
muestra antes de su procesamiento por citometría,
ya sea para obtener una concentración celular ade-
cuada para la incubación con los reactivos, o para
acelerar el proceso de separación celular (sorting).
6.3.1. Preparación de la muestra
El primer paso para la preparación de la muestra
consiste en la obtención de las células en suspensión

165
Métodos en biociencias
con el menor deterioro posible en sus caracterís-
ticas morfológicas y funcionales. Por lo tanto, es
importante considerar dos factores: la naturaleza
de la muestra y su estado de conservación.
a) Células en suspensión. En el caso de
que se utilicen células en suspensión,
habitualmente es suficiente con mantener
las células a concentraciones apropiadas
(máximo 106 células/mL) en soluciones
isotónicas y veri�icando previamente el
estado de viabilidad de la preparación en
el microscopio óptico. Simplemente, para
obtener esta información cuando se rea-
liza el recuento y ajuste del número de
células puede añadirse una solución de
un colorante vital como el azul tripán.
b) Tejidos o células adherentes. La
obtención de células en suspensión con-
tinúa siendo el mayor obstáculo, y es
absolutamente necesaria para estudiar
sus características por citometría de �lujo
y relacionar o extrapolar los resultados a
fenómenos in vivo. En especial, para dis-
gregar un tejido sólido, se ha de tener
en cuenta que la mayoría de las células
de los organismos pluricelulares están
en relación con la intrincada trama de
macromoléculas que forman la matriz ex-
tracelular. La suspensión celular obtenida
de la dispersión de un tejido sólido debe
cumplir una serie de requisitos que inclu-
yen la alta calidad y su�iciente número de
células, la existencia de pocos agregados y
restos celulares, y un bajo coe�iciente de
variación. Las muestras deben además ser
representativas del tejido original, preser-
vando las características del mismo.
Aunque no existe una técnica adecuada
y uniforme para todas las circunstancias,
y en cada muestra la elección de la téc-
nica va a depender de las características
del tejido en cuestión, suelen utilizarse
digestiones enzimáticas (tripsina, protea-
sas, colagenasas, hialuronidasas, DNasa
o mezclas de ellas, etc.), dispersiones
mecánicas (raspadores, bisturí, tijeras,
aguja), o reactivos químicos y detergen-
tes (Nonidet P-40, Triton X-100, etc.). Lo
más común es utilizar una combinación
de dispersión mecánica y enzimática.
En cualquier caso, y al igual que ocu-
rría con las células en suspensión, antes
de proseguir con el protocolo, es impor-
tante con�irmar mediante microscopía
el estado de integridad y viabilidad de
166
las células, y veri�icar que no han queda-
do agregados. Por otro lado es necesario
tener en cuenta las limitaciones de es-
tos procedimientos, ya que el uso de los
métodos enzimáticos puede producir al-
teración de las características celulares
o de la expresión de antígenos de mem-
brana y variar su efectividad según el tipo
de tejido. Si, por ejemplo, se quiere ana-
lizar un fenotipo de super�icie se deben
emplear solo métodos mecánicos o ase-
gurarse de que los antígenos celulares no
son destruidos por el procedimiento.
A partir de este punto, las células están prepara-
das para su adquisición en el citómetro de �lujo.
Una de las ventajas de la citometría de �lujo es que
puede ser utilizada tanto con células recién obteni-
das, «células frescas», como con células �ijadas. En
la actualidad existen soluciones de �ijación que per-
miten mantener las características celulares hasta
un mes después de ser procesadas.
6.3.2. Tinción de la muestra
Las técnicas de preparación de muestras para ci-
tometría de �lujo incluyen marcajes �luorescentes
directos o indirectos (véase también el epígrafe
5.2.2). En efecto, el marcaje indirecto está basado
en las técnicas de unión antígeno-anticuerpo, exis-
ten muchos reactivos (anticuerpos monoclonales
o policlonales u otras moléculas) que pueden
ser utilizados para citometría de �lujo y que pue-
den posteriormente ser determinados utilizando
un anticuerpo secundario conjugado con distin-
tos �luorocromos. En relación al marcaje directo, se
utilizan anticuerpos o moléculas conjugadas direc-
tamente con �luorocromos. Esta última modalidad
reduce considerablemente el tiempo de procesa-
miento de las muestras.
Se pueden realizar marcajes de estructuras
presentes en la membrana celular, o contenidas en
el interior de la célula.
6.3.3. Marcaje de estructuras de membrana
El marcaje de estructuras de membrana se realiza
utilizando soluciones isotónicas y únicamente hay
que tener la precaución de utilizar soluciones para
bloquear los receptores del fragmento constante
(Fc) de las inmunoglobulinas, ya que habitualmen-
te se utilizan diferentes anticuerpos y antisueros
que pueden presentar una unión inespecí�ica com-
plicando e inter�iriendo en la interpretación de los

resultados. Los protocolos de marcaje de �luorescen-
cia tienen como objetivo identi�icar subpoblaciones
celulares, partículas o moléculas, para lo que es ne-
cesario utilizar reactivos especí�icos.
6.3.4. Marcaje intracelular
Las moléculas intracelulares también pueden ser
reconocidas por anticuerpos monoclonales, pero
como estos no son capaces de atravesar la mem-
brana celular, la célula debe ser �ijada y después
permeabilizada para permitir la entrada de los an-
ticuerpos. Uno de los pasos más delicados es la
elección del �ijador que debe cumplir los siguientes
requisitos:
— Que penetre lo más rápidamente posible
en las células.
— Que acceda por igual a todos los compar-
timentos celulares.
— Que preserve la estructura celular y la an-
tigenicidad.
— Que permita la interacción de los anti-
cuerpos con los antígenos celulares.
— Que no aumente la auto�luorescencia.
Los �ijadores más utilizados son el formaldehído
al 1% y el paraformaldehído al 4%. Una vez �ija-
da la célula se procede a su permeabilización con
disolventes o detergentes como lisolecitina (liso-
fosfatidil colina) que reemplaza los fosfolípidos de
la bicapa lipídica de la membrana plasmática res-
petando la con�iguración espacial que esta posee.
Posteriormente a la permeabilización de la mem-
brana plasmática, anticuerpos y moléculas de
marcaje pueden penetrar en el interior de la célula
uniéndose a las moléculas diana.
Por otro lado, también hay moléculas �luores-
centes que se introducen en las células sin necesidad
de realizar la permeabilización celular; esto es, pe-
netran a través de membranas íntegras en ciertas
condiciones. Esta opción de marcaje puede ser utili-
zada para obtener información relativa al contenido
celular en células viables y con su actividad fun-
cional conservada. Estas moléculas �luorescentes
resultan muy útiles en estudios de cinética, en los
que se monitorizan parámetros funcionales duran-
te el tiempo de adquisición de la muestra.
6.4. Preparación del protocolo
para citometría de flujo
Previamente a la preparación de las muestras para
su tinción es conveniente realizar un diseño que
167
Citometría de flujo
garantice de forma óptima la calidad de los resul-
tados obtenidos. Para ello, además de las muestras
«problema» que se tienen que estudiar, se deben
introducir valores de referencia que permitan ex-
trapolar los resultados obtenidos; también resulta
necesario introducir controles negativos y positivos.
Los controles que se introducen para el estu-
dio por citometría de �lujo son necesarios porque
reproducen resultados esperados (conocidos). Se
usan para monitorizar las prestaciones o reproduc-
tibilidad de los reactivos y la calidad de los métodos
de preparación celular.
En el protocolo de marcaje es necesario intro-
ducir controles negativos para descartar la unión
inespecí�ica del �luorocromo y seleccionar el um-
bral de auto�luorescencia. Como se ha comentado,
producen tinción inespecí�ica los fragmentos Fc
de las inmunoglobulinas, las células muertas y los
restos celulares. En ocasiones, cuando se procesan
muestras que dan problemas para establecer el con-
trol negativo, es necesario intensi�icar el cuidado
de las muestras preservando su viabilidad, utilizar
fragmentos F(ab´)2 o bien centrifugar el anticuerpo
monoclonal para evitar agregados. Si con estas pre-
cauciones no se establece bien el patrón del control
negativo, se pueden eliminar las células muertas
utilizando un doble marcaje con ioduro de propidio
y diacetato de �luoresceína que re�lejan respecti-
vamente muerte o viabilidad celular. Si a pesar de
todo se sigue obteniendo una distribución unimo-
dal con considerable superposición entre el control
negativo y el control positivo, se puede asumir que
la tinción es especí�ica pero de baja intensidad.
Otro control necesario que permite comprobar que
la técnica se ha realizado de manera correcta es el
control positivo. Si no se introducen controles posi-
tivos en el protocolo, cuando se obtienen resultados
negativos no esperados en una muestra nunca se
sabrá si estos son por una alteración antigénica de
la molécula que se está estudiando o por un fallo en
el marcaje.
Los valores de referencia negativos y positivos
adecuados permitirán cuanti�icar e interpretar los
resultados de las muestras objeto de estudio.
6.5. Adquisición de muestras
en el citómetro de flujo
Una vez preparadas las muestras de manera ade-
cuada y con los controles necesarios para realizar
las valoraciones de las muestras, se introducen o
adquieren en el citómetro de �lujo. Para ello, el ci-
tómetro debe estar en perfectas condiciones de
Métodos en biociencias
limpieza para evitar «arrastrar» residuos de mues-
tras anteriormente adquiridas.
6.5.1. Alineamiento
En el estudio mediante citometría los resultados
se ven condicionados por la linealidad y la estabi-
lidad del haz de luz láser. Un desgaste en el mismo
o su inestabilidad provocan �luctuaciones en la po-
tencia del haz lumínico y el desalineamiento de los
sistemas de lentes. Como consecuencia, la determi-
nación de la intensidad de marcaje puede resultar
errónea, pudiendo verse afectados de forma ines-
pecí�ica únicamente algunos rangos del espectro de
excitación, lo que di�iculta aún más la identi�icación
de estos errores. Por tanto, las condiciones del equi-
po deben ser comprobadas ya que pueden sufrir
variaciones que pueden interferir en los resultados.
La utilización de estándares de alineamiento
proporciona un buen método para detectar cambios
y problemas en la con�iguración óptica y de la señal
de un día a otro. Dependiendo del citómetro, las va-
riaciones diarias pueden ser muy pequeñas pero se
debe comprobar periódicamente la calidad de to-
das las señales. El citómetro de �lujo se considera
alineado cuando se consigue una elevada �luores-
cencia o señal con un bajo coe�iciente de variación.
6.5.2. Calibración (ajuste de escalas)
Como los citómetros de �lujo ofrecen una informa-
ción relativa, no absoluta, para poder cuanti�icar
una muestra es necesario correlacionar los canales
de �luorescencia con resultados de muestras cono-
cidas. El método más sencillo consiste en ajustar el
voltaje del fotodetector (produce cambios exponen-
ciales o no-lineales de la señal) y/o las ganancias
(crecimiento lineal) para conseguir un pico de una
intensidad determinada de un estándar estable
cada día. Este ajuste equivale a una escala de inten-
sidad relativa constante. También es útil hacer una
calibración cruzada de escalas logarítmicas y linea-
les.
6.5.3. Patrones de normalidad:
uso de estándares
A la hora de determinar las características de la
muestra adquirida, es útil el uso de valores de re-
ferencia comerciales que permiten relativizar las
características de la muestra. Un estándar es un ma-
terial estable que tiene unos valores determinados
de �luorescencia o dispersión de luz. Se usan para
168
alinear o calibrar las prestaciones del citómetro de
�lujo. En general, cada citómetro, dependiendo de la
marca, utiliza sus propios patrones de normalidad,
aunque también se pueden establecer estándares
internos. Esta última opción puede ser necesaria
cuando se está desarrollando una aplicación nueva.
Los sistemas de calibración comercializados para
ajustes internos de los diferentes equipos resultan
necesarios para comprobar el buen funcionamiento
de los equipos, pero también para introducir múlti-
ples parámetros adicionales como cuanti�icación de
número de eventos, tamaño, intensidad de �luores-
cencia, etc.
6.5.4. Compensación de color
Cuando se utilizan dos o más �luorescencias para
la citometría de �lujo, nuestro objetivo es marcar
las células con �luorocromos distintos que re�le-
jen las diversas propiedades celulares diferentes
y detectar la señal proporcional a la primera �luo-
rescencia (FL1) en un detector y la de la segunda
(FL2) o progresivas �luorescencias (FL3, FL4…), sin
desviaciones producidas por interferencias de la se-
ñal. Los �luorocromos tienen espectros de emisión
que en ocasiones se superponen y los �iltros no son
perfectos, por ello los citómetros poseen un siste-
ma informático de compensación o sustracción de
señal. Además, existen sistemas de calibración au-
tomatizados de las diferentes marcas de equipos de
citometría que son especialmente útiles para �luo-
rescencias múltiples.
6.6. Análisis de datos en el citómetro
de flujo: histogramas y ventanas
Los citómetros pueden medir con alta sensibilidad
la dispersión de luz y la �luorescencia emitida por
las células o partículas presentes en una mezcla he-
terogénea. Como se ha comentado anteriormente,
la dinámica de �lujo en el citómetro permite alinear
las partículas de forma que el haz de luz láser incida
sobre una única partícula. Antes de describir cómo
detecta y procesa las diferentes señales ópticas ob-
tenidas a partir de este momento, resulta necesario
comprender que ocurre cuando el haz de luz láser
golpea las partículas.
6.6.1. Dispersión de la luz
Cuando el haz de luz incide sobre una partícula só-
lida sufre desviaciones en todas las direcciones. La
 Citometría de flujo

Figura 6.3: Cuando el haz de luz láser incide sobre una partícula sólida se desvía en todas las direcciones.
Esta desviación va a depender del tamaño de la partícula que produce una dispersión delantera (forward
scatter, FSC) y de la complejidad de la partícula cuando el haz de luz láser atraviesa la partícula y produce
dispersión angular (side scatter, SSC).

magnitud con la que esto ocurre depende de las
propiedades �ísicas de la partícula, principalmente
de su tamaño y complejidad interna. Por ejemplo, si
se están estudiando células en suspensión, los fac-
tores que afectan la dispersión del haz de luz serían
el tamaño celular y el material intracelular (comple-
jidad) (Figura 6.3).
a) Dispersión delantera (forward scatter,
FSC).
El primer fotodetector suele estar si-
tuado prácticamente enfrente del haz
emisor, de ahí su denominación FSC. Al
recoger la dispersión frontal, el grado de
dispersión proporcionará una informa-
ción relativa del tamaño de la partícula
que produce la dispersión. Además, al de-
terminar la dispersión frontal, se obtiene
información sobre la homogeneidad de
la muestra, ya que, si la muestra contie-
ne una mezcla de elementos con tamaños
diferentes, estos serán detectados con
distinta magnitud de FSC.
b) Dispersión angular (side scatter, SSC).
Al atravesar el haz láser la partícula,
el contenido de la misma hará que los fo-
tones sean dispersados hacia los lados en
ángulos muy abiertos. La luz proceden-
te de este tipo de dispersión es recogida
por otro detector especí�ico, normalmen-
te situado en un ángulo de 90 grados con
respecto a la dirección de la luz del láser
incidente. Por este motivo, a esta señal se
le denomina SSC, que puede traducirse
como dispersión lateral. El estudio de la
dispersión lateral proporciona informa-
ción sobre la complejidad de la partícula,
y es especialmente útil en el análisis de
células. El núcleo celular o el contenido
de vesículas y gránulos intracitoplasmá-
ticos varía en un mismo tipo celular en
función de su actividad metabólica, por
lo que, con el análisis del SSC, se puede
incluso diferenciar células con diferente
actividad dentro de una misma población.
El estudio simultáneo de FSC y SSC
resulta útil para hacerse una idea de la
variedad de partículas existentes en una
muestra. Por ejemplo, en el análisis de
una muestra de sangre periférica el estu-
dio de FSS y SSC va a generar una imagen
bidimensional de dispersión, que relacio-
na tamaño (FSC) con complejidad (SSC),
haciendo posible discriminar subpobla-
ciones dentro de una misma muestra que
compartan un tamaño y complejidad con-
cretos.

169
Métodos en biociencias

6.6.2. Canales de fluorescencia (light scatter

intensity, FL1, FL2, FL3…)
La utilización de �luorocromos como elementos de
marcaje de moléculas o estructuras celulares es una
herramienta habitual en las técnicas aplicadas en
biología. En la citometría, el marcaje con �luorocro-
mos ha encontrado una extensa área de aplicación.
La potencialidad del citómetro de �lujo de analizar
de forma simultánea la �luorescencia de dos, tres,
cuatro o, actualmente, hasta 16 �luorocromos que
emiten en diferentes longitudes de onda, posibilita
un estudio multiparamétrico di�ícilmente realizable
utilizando la microscopía convencional.
Figura 6.4: El histograma simple o uni-
Como se ha descrito, además del tamaño y la paramétrico muestra la distribución de
complejidad, el citómetro de �lujo mide la cantidad frecuencia de la señal de �luorescencia. La
de �luorescencia emitida por la luz dispersada en intensidad de la señal �luorescente se re-
ángulos respecto al haz de excitación. La �luorescen- presenta en el eje de abscisas. En el eje de
ordenadas se incorpora el número de partí-
cia emitida por cada �luorocromo es normalmente culas que se han cuanti�icado.
detectada por un único canal de �luorescencia. La
especi�icidad de la detección está controlada por
la selección de longitudes de onda por parte de es-
pejos y �iltros ópticos que componen el citómetro. se representa la intensidad de la señal �luorescente
Cada �iltro óptico permite absorber o re�lejar lon- en el eje de abscisas (eje X) y el número de partí-
gitudes de onda especí�icas. De esta forma, en un culas cuanti�icadas en el eje de ordenadas (eje Y)
mismo citómetro se pueden utilizar diferentes de- (Figura 6.4).
tectores con diferentes �iltros por lo que es posible Las distribuciones de frecuencia de dos pa-
determinar la expresión de múltiples marcadores rámetros, también denominadas histogramas
en una misma partícula. multiparamétricos, representan en cada eje la in-
En el análisis de la �luorescencia en el citó- tensidad de señal correspondiente a un parámetro
metro cobra especial relevancia la �luorescencia diferente. Un ejemplo de análisis biparamétrico se
celular intrínseca o auto�luorescencia, que es cau- vio anteriormente al analizar FSC frente a SSC. Las
sada, principalmente, por nucleótidos de pirimidina distribuciones multiparamétricas más comunes
y �lavina. Estas moléculas emiten �luorescencia de son las distribuciones de frecuencia de puntos (dot-
baja intensidad, que en el caso de marcajes débiles
plots) donde cada punto representa a una partícula,
pueden di�icultar el análisis de la �luorescencia. Una
y la distribución de los puntos permite visualizar la
adecuada preparación de las muestras puede evitar
distribución de la señal �luorescente en múltiples
encontrarse con di�icultades a la hora del análisis.
poblaciones.
La luz de dispersión es recogida por el detector
6.6.3. Histogramas y dot-plot especí�ico en el citómetro y es convertida en un pul-
so de voltaje. Las células pequeñas producen pulsos
En el inicio de este capítulo se destacó que una de cortos en un tiempo dado, mientras que las células
las grandes ventajas que aporta la citometría de �lu- grandes producen pulsos mayores. Los histogramas
jo es la de cuanti�icar los parámetros obtenidos a de dispersión característicos que se generan dan
partir de señales ópticas. Para ello, las diferentes una idea de la distribución de tamaños celulares en
señales captadas por los fotodetectores se trans- una muestra (Figura 6.5a).
formarán en pulsos de voltaje, cuya intensidad es
El software especí�ico para cada citómetro pro-
proporcional a la cantidad de señal recibida. Esta
porcionara en forma de porcentaje de partículas
información numérica se representa en forma de
(eventos) las diferentes medidas obtenidas.
distribuciones de frecuencia (histogramas) que
pueden corresponder a análisis de una dimensión
(uniparamétricos) o en grá�icos de dos dimensiones 6.6.4. Ventanas y regiones
(multiparamétricos o dot-plot).
El histograma de una dimensión suele utilizar- Una de las principales ventajas de la citometría de
se para el análisis de �luorescencias, y en el mismo �lujo es que a partir de una mezcla heterogénea de par-

170
 Citometría de flujo

Figura 6.5: Histogramas multiparamétricos de dispersión de partículas. (a) En una muestra

de sangre periférica humana se puede obtener una distribución en función del tamaño (FSC)
y de la complejidad (SSC) de la muestra. (b) La muestra de sangre contiene una población
heterogénea de células que pueden ser fácilmente diferenciados en granulocitos, monocitos
y linfocitos; es posible restringir el análisis solamente a los linfocitos realizando una venta-
na sobre esta población.

tículas en suspensión se puede seleccionar una
parte de las mismas para su análisis. Todas las par-
tículas en suspensión que entran en la ventana del
haz de luz láser son procesadas en el citómetro de
�lujo; pero la transformación en señales electróni-
cas permite realizar un análisis selectivo de aquellas
partículas que interesen. Esta selección se hace es-
tableciendo ventanas que de�inen características
�ísicas (tamaño o complejidad) o de marcaje de una
parte de la muestra.
Por ejemplo, en una muestra de sangre que
contenga una población heterogénea de células
–polimorfonucleares, monocitos y linfocitos– es po-
sible restringir el análisis solamente a los linfocitos.
Sobre la base de sus características en tamaño (FSC)
versus la complejidad (SSC) se establece una venta-
na que englobe esta población celular de forma que,
en el análisis posterior, el 100% de la muestra co-
rresponderá a los linfocitos, excluyéndose el resto
de las células sanguíneas (Figura 6.5b)
6.7. Aplicaciones de la citometría de flujo
La inmensa capacidad de análisis de la citometría
de �lujo es utilizada en la actualidad para realizar
multitud de pruebas en diferentes especialidades.
Si a esto se añade el que cada día surgen nuevos
�luorocromos y moléculas de ayuda diagnóstica
y la posibilidad que aporta esta técnica para valo-
rar múltiples parámetros de forma simultánea en
la misma célula, el resultado �inal hace de la cito-
metría una técnica prácticamente indispensable en
cualquier estudio biológico.
En biomedicina la citometría de �lujo se ha
utilizado en diferentes áreas. Por ejemplo, en
Hematología para contaje de células, fórmula leuco-
citaria, contaje reticulocitario y análisis de médula
ósea; en Farmacología se puede utilizar en es-
tudios de cinética celular; en Inmunología para
cuanti�icación de subpoblaciones linfocitarias, ti-
paje tisular, estimulación linfocitaria; en Oncología
para diagnóstico/pronóstico y monitorización de
tratamientos; en Microbiología en el diagnóstico
bacteriano y vírico, y sensibilidad a antibióticos; en
Genética se pueden realizar cariotipados, diagnósti-
co de portador o diagnóstico prenatal.
La citometría de �lujo se puede emplear para
estudiar características estructurales y funcionales
de células o partículas en suspensión. Las aplicacio-
nes fundamentales de esta técnica se dan en biología
y medicina y son la identi�icación de antígenos celu-
lares mediante técnicas de inmuno�luorescencia y
el estudio del contenido de DNA y fases del ciclo ce-
lular (Figura 6.6).
Algunos usos de la citometría de �lujo incluyen
el estudio de:
a) Elementos de membrana celular.
Probablemente el uso más extendido en
la citometría se asocia a su potencial para
analizar múltiples proteínas de mem-
brana, lo que ha permitido caracterizar
a las células en función de su patrón fe-

171
Métodos en biociencias
Figura 6.6: Entre las aplicaciones más comunes de la citometría de �lujo se encuentra la identi�icación de moléculas de la super�i-
cie celular. También pueden ser determinadas moléculas intracitoplasmáticas y nucleares. Además se pueden cuanti�icar moléculas
en suspensión externas a la célula.
notípico. Además, la posibilidad de
determinar de forma relativa la cantidad
de una molécula expresada por cada cé-
lula (densidad de expresión), permite por
ejemplo diferenciar estadios de activa-
ción dentro de la misma célula ya que la
intensidad de �luorescencia de una molé-
Figura 6.7: La citometría de �lujo sirve para reali-
zar la identi�icación o fenotipo de un grupo de células
por la expresión de una o varias moléculas especí�icas,
pero también permite cuanti�icar de forma relativa la
cantidad de una molécula expresada por cada célula
(densidad de expresión).
172
cula es proporcional a los sitios de unión
del �luorocromo (Figura 6.7).
Junto a los elementos celulares, la
identi�icación de proteínas de super�icie
resulta de gran utilidad en el estudio de
hongos, bacterias, etc.
b) Elementos nucleares. Con ayuda de
sondas marcadas, es posible determinar
secuencias de DNA y RNA o cromosomas
aislados. Especialmente importante en el
estudio de enfermedades hematológicas
es la posibilidad de determinar el ciclo ce-
lular utilizando marcadores especí�icos.
c) Elementos intracitoplasmáticos. Com-
ponentes intracelulares (liposomas,
orgánulos…) son identificables con las
nuevas generaciones de citómetros do-
tados de láseres con mayor potencia.
Otra característica útil de la citome-
tría de �lujo asociada a la determinación
de elementos intracelulares marcados
con �luorocromos son los estudios de di-
námica de �lujo de iones o cambios en el
potencial de membrana. La posibilidad
de analizar, en tiempo real, cómo la señal
emitida por estos elementos varía asocia-
da a cambios en el metabolismo celular
resulta especialmente útil; por ejemplo,
el estudio de �lujos de calcio asociados a
activación celular o alteraciones mitocon-
driales.

Por último, la posibilidad de estu-
diar simultáneamente en la misma célula
la expresión de marcadores de super�i-
cie y elementos intracelulares también
permite realizar análisis que resultarían
complejos con otras técnicas. Imagínese
determinar la producción de citoquinas
en una población heterogénea de lin-
focitos de sangre periférica. Sería muy
di�ícil conocer qué subtipo celular está
produciendo la citoquina, si solamente
se cuanti�ica la misma siguiendo los mé-
todos habituales; sin embargo, utilizando
la citometría se pueden fenotipar las di-
ferentes subpoblaciones de linfocitos,
e identi�icar de esta forma, no solamen-
te qué subpoblación celular esta activada
y produce citoquinas, sino que se puede
determinar que citoquina produce cada
elemento celular.
d) Aislamiento de partículas (sorting).
Algunos equipos de citometría de �lu-
jo (sorter) permiten la separación de las
partículas adquiridas cuando han pasado
por uno o más mecanismos detectores.
La separación se puede realizar en par-
tículas identi�icadas en función de unas
características determinadas mediante
una ventana o región de forma análoga
a como se ha descrito en los anteriores
apartados. Este sistema de separación
celular tiene menor potencia que las
técnicas de separación masiva (centrifu-
gación, etc.), pero permite separaciones
que estas técnicas no consiguen. El sor-
ter es capaz de separar células con alta
pureza sobre la base de diferentes pará-
metros lo cual es una ventaja ya que la
mayoría de partículas separadas recogi-
das cumplen los criterios seleccionados.
Los citómetros con sorter se caracteri-
zan por su capacidad de recuperación
de partículas o células separadas recogi-
das en el colector del total de partículas
activadas por el sorter. Dichas células son
separadas en condiciones que permiten
su posterior uso en experimentos funcio-
nales.
El procedimiento de sorter resul-
ta especialmente útil, por ejemplo, para
separar subpoblaciones celulares, para
obtener poblaciones que expresan una
proteína de interés o para realizar clo-
najes celulares; es decir, para seleccionar
una única célula.
173
Citometría de flujo
A continuación se verán con mayor detalle algunas
de estas aplicaciones con especial incidencia en el
campo de la biomedicina, ya que probablemente
esta sea el área en la que mayor número de estudios
y aplicaciones se han desarrollado.
6.8. Ejemplos de aplicaciones
de la citometría de flujo en biología
celular y biomedicina
6.8.1. Determinación de la morfología celular
Ya se ha destacado cómo las señales de dispersión
frontal (FSC) y lateral (SSC) del haz de luz incidente
dependen de la morfología celular. La mayor parte
de las células, incluidas las células hematológicas
cambian su con�iguración (cambian su tamaño, sus
características intracitoplasmáticas…) cuando se
encuentran activadas; como consecuencia, analizar
estos cambios permite realizar otros estudios. Un
ejemplo de ello sería el análisis de la activación de
las plaquetas pues, como consecuencia de su acti-
vación, el citoplasma plaquetario se reorganiza y la
célula pierde su forma discoide, para tornarse esfé-
rica y emitir pseudópodos.
6.8.2. Determinación de proteínas de superficie
Estos estudios utilizan principalmente anticuerpos
marcados para identi�icar moléculas de super�icie.
La producción de un número cada vez mayor de an-
ticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos
antigénicos ha potenciado la utilización de la cito-
metría de �lujo para la identi�icación y clasi�icación
de células tanto normales como patológicas.
En la actualidad, el uso combinado de anti-
cuerpos para la caracterización del fenotipo celular
es una herramienta habitual en el estudio de sub-
poblaciones hematológicas que se aplica en el
diagnóstico y clasi�icación de las leucemias y lin-
fomas. Asimismo, el empleo de esta tecnología ha
demostrado ser de gran utilidad en otras áreas
como la detección de oncoproteínas o de receptores
celulares para factores de crecimiento y hormonas.
6.8.3. Análisis de ciclo celular y aneuploidías
Las dos formas más utilizadas de cuanti�icar pro-
liferación y ciclo celular se basan en determinar
antígenos asociados a la proliferación o �luorocro-
mos que presentan la capacidad de unirse a ácidos
nucleicos en uniones estequiométricas. La prime-
Métodos en biociencias

ra forma no di�iere de forma signi�icativa de otros

marcajes en células permeabilizadas.
El uso de �luorocromos es probablemente la
forma más utilizada en el análisis de ciclo celular
ya que aporta información adicional sobre las ca-
racterísticas de este ciclo. Existen �luorocromos
intercalantes como el bromuro de etidio, el ioduro
de propidio o el naranja de acridina que se integran
en el DNA. Otros como DAPI o Hoechst se unen de
forma preferente al tándem AT; en tercer lugar hay
�luorocromos como mitramicina o A3 que presen-
tan mayor a�inidad por el tándem CG.
Las técnicas para medir la síntesis de DNA
se basan en el hecho de que la intensidad de �luo-
rescencia obtenida –por ejemplo utilizando
�luorocromos intercalares– será proporcional a la
cantidad de DNA de la célula.
En de�initiva, existen diversos métodos para
analizar el ciclo celular. La elección del �luorocromo
Figura 6.9: Histograma que representa un ciclo celular normal de
dependerá del tipo de estudio. células diploides. Se utiliza un marcaje completo de DNA en el que,
Dentro de las múltiples aplicaciones de la ci- además de determinar el porcentaje de células en proliferación
(suele asimilarse a células en fase S o de síntesis), se determinan
tometría, el análisis del ciclo celular cobra especial otras fases del ciclo celular como G0/G1, que representa a la fase
relevancia en la caracterización de células tumora- de reposo, y G2/M o fase de mitosis, con el doble de dotación cro-
les tanto en tumores sólidos, como hematológicos. mosómica.
Básicamente se determina:

a) Inestabilidad genómica: aneuploidía

de DNA. Una de las características aso- ciadas a la malignización celular es que
se altera el contenido celular en DNA
(aneuploidías de DNA). Estas aneuploi-
días son re�lejos de alteraciones a nivel
cromosómico como consecuencia de la
desestabilización genómica (Figura 6.8).
La existencia de aneuploidías permite
determinar el porcentaje de células anó-
malas en una muestra al comparar el
patrón de células alteradas con el porcen-
taje de células con patrón normal en DNA.
b) Expansión clonal: proliferación celular
(fase S) y pool de apoptosis. La homeosta-
sis tisular se basa en un equilibrio entre
proliferación y muerte celular por apop-
tosis. Como se comentaba anteriormente,
aunque en citometría de �lujo la prolife-
ración celular se puede determinar en
base a la expresión de antígenos como
Ki-67, habitualmente se utiliza un mar-
caje completo de DNA en el que, además
de determinar el porcentaje de células en
Figura 6.8: Esquema que representa una inestabilidad genómi- proliferación (suele asimilarse a células
ca con varias aneuploidías en el DNA, hecho que suele asociarse en fase S), se determinan otras fases del
a la malignización celular. La existencia de aneuploidías permi- ciclo celular, G0/G1 y G2/M.
te determinar el porcentaje de células anómalas en una muestra al
comparar el patrón de células alteradas con el porcentaje de célu- Además del ciclo celular, la deter-
las con patrón normal de DNA, que sería de característica diploide. minación de células apoptóticas es una

174

práctica habitual en el estudio de células
tumorales. Una característica asociada a
la apoptosis es la ruptura o escisión del
DNA. Esta ruptura se puede identi�icar en
función de la aparición de un pico de DNA
de bajo peso molecular pico «sub-G1», o
utilizando marcadores especí�icos capa-
ces de reconocer y �ijarse a los puntos de
ruptura (Figura 6.9).
6.8.4. Determinación de citoquinas
intracelulares
Como se comentaba en un párrafo anterior, la ca-
racterización de las células inmunocompetentes
implicadas en diferentes situaciones normales y
patológicas ha permitido no solamente desarrollar
nuevos elementos de ayuda diagnóstica, sino que
ha identi�icado dianas terapéuticas. Por ejemplo, en
una patología autoinmune, determinar el porcen-
taje de linfocitos activados que están produciendo
citoquinas in�lamatorias puede ser de gran utilidad
para ayudar en el diagnóstico y seguimiento de la
enfermedad. Además, identi�icar que subtipo celu-
lar es el que está activado, permite diseñar terapias
que actúen directamente sobre esta célula sin afec-
tar al resto de la respuesta inmune.
6.8.5. Determinación de citoquinas y otras
moléculas solubles
Para la determinación de moléculas solubles por
citometría se utilizan soluciones de esferas de un
material sintético. Las esferas capturan de for-
ma especí�ica las proteínas o citoquinas solubles
que se quieren estudiar y permiten determinar-
las en el citómetro. La intensidad de �luorescencia
emitida permite cuanti�icar la concentración de
proteína. Esta tecnología permite cuanti�icar una
175
Citometría de flujo
gran variedad de proteínas solubles –citoquinas,
quimioquinas, factores de crecimiento o proteí-
nas fosforiladas– usando citometría de �lujo. Otra
ventaja de esta aplicación es la cuanti�icación de
múltiples proteínas utilizando solo una mínima
cantidad de muestra (25 a 50 mL).
Bibliografía
Darzynkiewicz Z, Crissman H, Jacobberger JW. Cytometry
of the Cell Cycle: Cycling through History. Cytometry A.
58(1):21-32. 2004.
Freer G, Rindi L. Intracellular Cytokine Detection by Fluo-
rescence-activated Flow Cytometry: Basic Principles and
Recent Advances. Methods. 61(1):30-8. 2013.
Flow Cytometry. A Practical Approach. 3ª edición. 2000.
Oxford University Press. 978-0199638246.
Galbraith D. Flow Cytometry and Cell Sorting: The Next
Generation. Methods. 57(3):249-50. 2012.
Givan AL. Principles of Flow Cytometry: An Overview.
Methods Cell Biol. 63:19-50. 2001.
Green R, Wachsmann-Hogiu S. Development, History, and
Future of Automated Cell Counters. Clin Lab Med. 35(1):1-
10. 2015.
Mahnke YD, Roederer M. Optimizing a Multicolor Immuno-
phenotyping Assay. Clin Lab Med. 27(3):469-85. 2007.
McCoy JP Jr. Basic Principles of Flow Cytometry. Hematol
Oncol Clin North Am. 16(2):229-43. 2002.
Practical Flow Cytometry. 4ª edición. 2003.
Shapiro HM. Wiley-Liss. 978-0471411253.
Current Protocols in Cytometry. 1998.
Robinson J.P, Darzynkiewicz Z, Dean PN, Dressler L, Orfao
A, Rabinovitch PS, Stewart CC et al. (eds). Wiley-Liss. 978-
0471142959.
Virgo PF, Gibbs GJ. Flow Cytometry in Clinical Pathology.
Ann Clin Biochem. 49(Pt 1):17-28. 2012.

Microscopía óptica
El microscopio óptico o fotónico recibe estos nom-
bres porque, en el primer caso, emplea lentes de
vidrio, y la ciencia que estudia el comportamiento
de estas lentes es la óptica. El nombre de fotónico
es debido a que usa luz, y por tanto fotones, en su
funcionamiento. Básicamente, la función de un mi-
croscopio óptico es generar una imagen del objeto
mayor que el objeto en sí mediante un sistema de
lentes ampli�icadoras. De hecho fue la fabricación
de estas lentes y su ensamblaje lo que permitió la
aparición de los primeros microscopios ópticos a
�inales del siglo ��� y principios del ����. Nombres
como Janssen (padre e hijo), Leeuwenhoek o Hooke
están ligados a su construcción y a la aparición de
los primeros estudios realizados con ellos.
7.1. La luz
La luz se puede de�inir como la radiación electro-
magnética percibida por el ojo humano y es un
fenómeno de naturaleza dual (corpuscular-ondula-
torio) al que se le puede caracterizar por su longitud
de onda, que oscila entre 380 y 780 nm aproxima-
damente.
La base del funcionamiento del microscopio
óptico es poner de relieve las diferentes alteracio-
7.
Guillermo Bodega
nes que sufre la luz al interaccionar con la materia.
Entre las alteraciones más frecuentes destacan: ab-
sorción, re�lexión-dispersión, desfase, polarización,
refracción y difracción (Figura 7.1).
La absorción suele tener como efecto la trans-
formación de la energía absorbida; sin embargo,
desde el punto de vista de la microscopía óptica lo
que interesa es la absorción selectiva que se produce
cuando la materia absorbe alguna de las longitudes
de onda de la luz y re�leja otras dando lugar al colo-
reado de los objetos. La re�lexión se produce cuando
la luz rebota al chocar contra un objeto, ya sea por
la naturaleza del objeto y/o por el ángulo con que
incide; si el re�lejo es difuso o irregular se denomi-
na dispersión. El desfase ocurre cuando la luz que
atraviesa la materia sufre un retraso en la fase de la
longitud de onda con respecto a la luz que no pasa a
través de la misma. Una luz está polarizada cuando
la componente correspondiente al campo eléctrico
vibra en un único plano (el formado por los vectores
del campo, E, y el de propagación k), la luz no pola-
rizada, también denominada luz natural, lo hace en
todos los planos posibles; en algunos casos la ma-
teria, por su ordenación, puede polarizar la luz o
variar su plano de polarización. El cambio en la di-
rección que experimenta una onda al pasar de un
material a otro con una densidad óptica distinta
Métodos en biociencias
Figura 7.1: Efectos de la materia sobre la luz.
(distintas propiedades eléctricas y magnéticas) se
denomina refracción y se debe a la distinta veloci-
dad con que viaja la luz en cada medio; el índice de
refracción es la relación existente entre la velocidad
de propagación de la luz en el vacío y la que tiene al
atravesar la sustancia que fuere. Huygens estable-
ció un principio según el cual, cuando la luz choca
con la materia, los puntos de choque se convierten
en fuentes secundarias de ondas, emitiendo nue-
vas ondas, denominadas ondas difractadas. Estas
nuevas ondas pueden solaparse y/o entrecruzar-
se entre sí, fenómeno conocido como interferencia;
pudiendo superponerse si están en fase (coheren-
tes) o anularse total o parcialmente si no están en
fase (no coherentes).
La mayoría de los microscopios ópticos uti-
lizan luz visible; sin embargo, es cada vez más
habitual el empleo de luz ultravioleta y en las úl-
timas décadas de luz infrarroja y luz láser (light
ampli�ication by stimulated emission of radiation).
La luz láser es monocromática (una sola longitud de
onda) y coherente (toda en la misma fase), lo que
evita dispersiones y permite producir rayos lumi-
nosos de gran precisión.
7.2. Tipos de microscopios ópticos
Desde el punto de vista de la óptica existen dos
tipos básicos de microscopios: simples y compues-
tos. Los simples poseen solo una lente entre objeto
y ojo y no son otra cosa que las denominadas lu-
pas. Los compuestos poseen como mínimo dos
lentes, objetivo y ocular, y se pueden subdividir en
178
dos grandes grupos; los estereomicroscopios y los
de objetivo simple o comunes. Los estereomicros-
copios, comúnmente mal llamados lupas y a veces
microscopios de disección, son como un par de mi-
croscopios compuestos de bajo aumento montados
en paralelo pues poseen dos objetivos por los que
entra simultáneamente la luz; el hecho de que no
entre exactamente la misma luz por cada uno de
ellos permite obtener imágenes estereoscópicas, de
ahí su nombre. Este tipo de microscopio no invierte
la imagen al formarla, sirven para lograr magni-
�icaciones de 2x a 50x aumentos y su distancia de
trabajo (la distancia existente entre la primera lente
del objetivo y la muestra) es grande por lo que son
muy útiles para observar y/o manipular muestras
de gran tamaño; por ejemplo, realización de disec-
ciones (Figura 7.2). En los microscopios de objetivo
simple o comunes, la luz solo entra por un único ob-
jetivo, forman la imagen invertida, se utilizan para
magni�icaciones que oscilan entre 50x y 1000x
aumentos y la distancia de trabajo es pequeña. Mi-
croscopios de objetivo simple serán todos los tipos
que se verán a continuación.
7.2.1. Microscopio de campo claro
Es el microscopio de uso más convencional y se basa
en el aprovechamiento de fenómenos de absorción
(cuali- o cuantitativa) para dotar de visibilidad al
objeto; por ello es muy válido para especímenes
que poseen alto contraste o para aquellos a los que
se puede contrastar; por ejemplo, secciones histo-
lógicas teñidas. El fondo de la imagen o campo se
ve iluminado (de ahí su nombre), y la imagen del
 Microscopía óptica

Figura 7.2: Estereomicroscopio Nikon SMZ645; en el recuadro delimitado por la línea discontinua se aprecian los dos objetivos (izquier-
da). Microscopio óptico Nikon Labophot (derecha).

espécimen aparece contrastada contra dicho fondo puede ser giratoria. El revólver cuelga del brazo y es
luminoso pues al pasar la luz por el campo óptico se una estructura circular sobre la que se atornillan los
generan dos tipos de rayos luminosos, los rayos mo- diferentes objetivos. El tubo óptico es el cilindro en
di�icados por el espécimen y los que no pasan por el que se acoplan por un extremo el objetivo y por
él y no se modi�ican. Los primeros compondrán la el otro extremo el ocular. En los microscopios muy
imagen del objeto y serán enfocados en el ojo del antiguos era un cilindro recto con una determinada
observador, los últimos formarán el fondo de luz del longitud, normalmente 160 mm (también 170 mm);
campo (Figura 7.3).
Son los microscopios más utilizados y han ser-
vido de base para el diseño de la mayoría de los
tipos de microscopios que han ido apareciendo des-
pués; por ello se hará una descripción detallada de
sus partes y se analizará el concepto de resolución.

Partes de un microscopio
Los elementos que componen un microscopio pue-
den agruparse en dos bloques: mecánicos, o de
soporte, y ópticos. Elementos mecánicos son: base,
brazo, sistema de enfoque, platina, revólver y tubo
óptico. Elementos ópticos son: fuente de ilumina-
ción, �iltros, diafragmas de campo y condensador,
condensador, objetivo, prisma y oculares. La base y
el brazo del microscopio son las estructuras sobre
las que se apoyan el resto de elementos. El siste-
ma de enfoque suele ubicarse en la parte baja del
brazo y lo suelen formar un tornillo de enfoque ma-
crométrico y otro micrométrico para conseguir un
enfoque más �ino. La platina es la pieza donde se
apoyarán las muestras y puede variar en forma (rec-
tangular o circular) y tamaño; en los microscopios Figura 7.3: Esquema de la formación
más so�isticados, además de los clásicos despla- de imagen en un microscopio de cam-
zamientos (derecha-izquierda, delante-detrás) po claro.

179
Métodos en biociencias
Figura 7.4: (A) Esquema de un tubo óptico. Las rayas
discontinuas de puntos blancos indican el primer plano
focal del objetivo y el plano de imagen intermedio, tam-
bién llamado primario. (B) Esquema de la formación de
imagen en un tubo óptico convencional. (C) Esquema de
la formación de imagen en un tubo óptico con un objetivo
corregido a in�inito. La característica de principal de estos
objetivos es generar un haz de luz paralelo.
en los actuales no es rectilíneo y está partido por lo
que es necesario el uso de prismas para desviar la
luz. Además, en los últimos años, la utilización de
objetivos corregidos a in�inito ha obligado a colocar
una lente en el interior del tubo (Figura 7.4).
Los elementos que con�iguran la parte óptica
son el componente más importante del microscopio
y por ello se les prestará una mayor atención.
La fuente de iluminación. En los antiguos equi-
pos se localizaba fuera del microscopio, y su luz se
Figura 7.5. Diferentes tipos de bombillas usadas en los microscopios ópticos: de tungsteno (A), halógena (B), de
vapor de mercurio (C) y LED (D).
180
dirigía y concentraba sobre el condensador median-
te un espejo cóncavo. En los microscopios actuales
la fuente de iluminación es una bombilla que va in-
tegrada en el microscopio y suele localizarse en la
base. La potencia máxima de los diferentes tipos de
bombillas es muy variable –entre 10 y 200 vatios–
y su intensidad se regula con un potenciómetro. Las
bombillas de mucha potencia han de ventilarse de
forma pasiva (empleo de sistemas de rejillas) o ac-
tiva (incorporación de ventiladores) ya que suelen
generar mucho calor. Existen diferentes tipos de
bombillas dependiendo del tipo de microscopio (Fi-
gura 7.5).
Las bombillas clásicas, con �ilamento de tungs-
teno y bulbo al vacío, suelen emitir luz con longitud
de onda comprendida entre 300 y 1500 nm; son ba-
ratas pero, debido a la migración del material del
�ilamento hacia el cristal, se desgastan con el tiem-
po y su espectro de emisión no es homogéneo pues
con�ieren más energía a la zona del rojo. Es por ello
que este tipo de iluminación suele ir corregida con
un �iltro de color azul. Las bombillas halógenas son
las más comúnmente usadas pues sufren menor
desgaste y su espectro de emisión está bastante com-
pensado; como contrapartida suelen calentarse más
que las anteriores. Las bombillas de vapor de mer-
curio generan una potente iluminación con picos de
emisión muy potentes a determinadas longitudes de
onda, lo que las hace muy útiles en �luorescencia; sin
embargo, son muy caras y se calientan mucho. Las
bombillas de vapor de xenón producen un espectro
de color prácticamente continuo y con una tempera-
tura de color de día (~5500 K), desafortunadamente
son muy caras y se calientan muchísimo por lo que
suelen necesitar ventilación forzada. En los últimos
años se está imponiendo la iluminación con LED
(light emiting diode), que no es otra cosa que un se-
miconductor de estado sólido al que al aplicarle una
corriente eléctrica emite luz monocromática (efec-
to de electroluminiscencia). El color depende del
material semiconductor y de la intensidad de la co-
 Microscopía óptica

Figura 7.6: Esquema del efecto del condensador sobre un haz de luz (línea discontinua) (izquierda).
Esquema de un condensador acromático. Tomado y modi�icado de la página web de Olympus (www.
olympusmicro.com) (derecha).

rriente, pudiendo ir desde el UV hasta el infrarrojo.
Sus ventajas son múltiples pero destaca su dura-
ción (hasta 100.000 horas), la no emisión de calor,
el bajo voltaje al que trabajan y su bajo consumo:
más resistentes, más duraderos, más económicos
y más seguros. El hecho de emitir luz monocromá-
tica los hace especialmente útiles en �luorescencia.
En los microscopios de hace algunos años era muy
frecuente que asociados o próximos a la fuente de
iluminación se localizaran diversos �iltros. Los más
usuales solían ser los de color verde, para potenciar
el contraste de la fotogra�ía en blanco y negro; el de
color azul, para elevar la temperatura de color a la
de luz de día; y los de grises neutros, para bajar la in-
tensidad de luz por igual a todos los colores, efecto
de gran utilidad si en la imagen hay contrastes de in-
tensidad de luz demasiado fuertes. La captación de
imágenes en formato digital y su fácil tratamiento,
así como la incorporación de sistemas automáticos
de corrección para el ajuste del blanco en las cáma-
ras digitales ha hecho desparecer la utilidad de los
�iltros correctores, por lo que no se suelen montar
en los microscopios actuales. Asociado a la fuente de
iluminación se dispone un diafragma llamado dia-
fragma de campo, que sirve para ajustar el haz de luz
que va a incidir sobre el condensador pues permite
hacerlo de mayor o menor diámetro.
El condensador. Este dispositivo va ubica-
do debajo de la platina y su función es concentrar
(condensar) los rayos de luz que suben desde la
fuente luminosa para formar un pequeño cono de
luz de mayor intensidad que ilumina una zona más
o menos reducida del espécimen convenientemente
preparado. Es una lente convexa por abajo y plana
en la zona que da a la platina (Figura 7.6).
El área de iluminación del espécimen se
controla mediante el diafragma de campo (visto an-
teriormente) y el diafragma de condensador, que va
situado inmediatamente delante y debajo del con-
densador; ambos diafragmas generan un cilindro
luminoso cuyo diámetro debe ser lo más parecido
al área que se desea estudiar. El condensador ha de
estar ubicado a una distancia correcta de la mues-
tra, el procedimiento que permite situarlo en esta
posición es el método de Koehler (Köhler) cuyo �in
es enfocar la zona de máxima luminosidad del haz
de luz en el objeto y que el diámetro de este haz sea
lo más parecido posible al área de captura del ob-
jetivo. Es obvio que la iluminación de puntos cuya
observación no interesa puede hacer perder nitidez
a la imagen por la existencia de fenómenos de dis-
persión y difracción.

Figura 7.7: Esquema que ilustra el efecto que causan las lentes sobre las diferentes longitudes de onda de la luz: aberración cromática (iz-
quierda). Efecto de la corrección acromática (centro) y esquema que explica el mecanismo de corrección (derecha).

181
Métodos en biociencias

mismo ángulo de refracción para todos los colores.

Figura 7.8: Esquema de la formación de ima-
gen de una lente convencional con aberración
esférica: el punto de foco de los rayos de luz
marginales es anterior al de los rayos cen-
trales (paraxiales) (imagen superior). En la
imagen inferior se ilustra el sistema de co-
rrección de la aberración esférica y ambos
tipos de rayos con�luyen en el mismo punto
de foco.
El objetivo. La misión de la lente o lentes obje-
tivo es la de aumentar y resolver. Existen diversos
tipos de objetivos en función de sus aumentos o po-
tencia, su aberración cromática y esférica o el uso
de aceite de inmersión. Desde el punto de vista de
los aumentos existen objetivos desde 4x hasta 100x.
Los objetivos más potentes son los que trabajan
próximos al cubreobjetos y suelen ser telescópicos
para evitar daños tanto en la muestra como en el
objetivo. Desde el punto de vista de la corrección
de la aberración cromática existen objetivos nor-
males, acromáticos, apocromáticos y de �luorita. La
aberración cromática se produce por el diferente
efecto de doblado que las lentes del objetivo ejercen
sobre los diferentes colores que conforman la luz
(Figura 7.7). Los objetivos acromáticos y apocro-
máticos intentan paliar este efecto, es decir, dar el
El acromático une el rojo y azul y los aproxima al
verde. En los apocromáticos son corregidos los tres
colores. Los objetivos de �luorita poseen un grado
de corrección intermedia entre acromáticos y apo-
cromáticos.
La aberración esférica se produce porque la
luz que atraviesa la zona paraxial (próxima al eje
central de la lente) posee un punto distinto de foco
de la zona no paraxial (Figura 7.8). Esto hace que
el perímetro del campo de observación aparezca
desenfocado cuando se enfoca la parte central. Este
tipo de aberración es corregida con los objetivos
planos, llamados así por tener su cara externa to-
talmente plana. Finalmente, existen objetivos secos
y húmedos, los húmedos usan aceite de inmersión
para conseguir una mayor apertura numérica y, en
consecuencia, un mayor poder de resolución.
En el cilindro de metal que forma el cuerpo
del objetivo aparecen una serie de números que
indican las características vistas anteriormente y
algunos datos más como la apertura numérica, la
longitud del tubo óptico y el grosor máximo del cu-
breobjetos (Figura 7.9).
La apertura numérica está estrechamente
relacionada con la resolución y se estudiará a conti-
nuación. La longitud del tubo óptico es importante
pues determinará la posición del ocular y la capaci-
dad de enfoque sobre el ojo del observador. Hoy día
la óptica de la mayoría de los microscopios va corre-
gida «a in�inito» por lo que pueden intercambiarse
en cualquier microscopio independientemente de
la longitud de su tubo óptico; en este caso es el sím-
bolo de in�inito (∞) el que aparece grabado en el
cuerpo del objetivo. La corrección de la óptica a in-
�inito obliga al uso de objetivos corregidos para tal
�in y a la introducción de una nueva lente en el tubo

Figura 7.9: Izquierda. Especi�icaciones incluidas en el cuerpo del objetivo; tomado y modi�icado de la página
web www.microscopyu.com. Derecha. La columna de tres barras incluye los códigos de color de las letras de las
especi�icaciones en función de la óptica. DIC, óptica Nomarski; Ph, contraste de fases. La columna de 4 barras in-
cluye los códigos de color del medio de inmersión. Las columnas de cinco barras representan los códigos de color
de los aumentos. Disponible en color.

182

Figura 7.10: (A) Efecto de pérdida de resolución al
ampliar puntos luminosos cercanos. (B) Disco de Airy.
(C) Representación del disco de Airy en función de la
intensidad luminosa.
óptico situada entre el objetivo y el ocular (ver �i-
gura 7.4). El máximo grosor del cubreobjetos es
un dato importante pues está relacionado con la
distancia de trabajo, que es la distancia que ha de
existir entre la muestra y la primera lente del obje-
tivo. Por ejemplo, en un objetivo en el que este dato
fuese de 0.17 mm (grosor estándar) sería imposible
enfocar una muestra cuyo cubreobjetos tuviese un
grosor de 0.20 mm, pues la distancia de trabajo ha
de ser de 0.17 mm o menor.
El ocular. Es una lente que sirve para enfocar
la imagen sobre la retina del observador y, además,
también actúa como lente ampli�icadora, pero no
sirve para aumentar la resolución. Normalmente su
aumento es de 10x, aunque pueden ir de 8x a 20x.
En los últimos años se ha incrementado su diáme-
tro para conseguir un mayor campo de observación
y un menor cansancio visual.
Resolución
La resolución puede ser de�inida como la capacidad
para, al aumentar una imagen, ver puntos vecinos
como entidades diferentes. La incidencia de la luz
sobre un objeto altera las relaciones de fase de las
ondas luminosas que llegan a él y produce comple-
jos efectos de interferencia y difracción, de modo
que dos objetos puntuales próximos ofrecen imá-
genes superpuestas (Figura 7.10), y por perfectas
que sean las lentes algo de este efecto siempre se
183
Microscopía óptica
mantiene. La estructura luminosa generada recibe
el nombre de disco de Airy.
La resolución es un parámetro que se repre-
senta como “r” y, siguiendo el criterio de Rayleigh,
su valor se ajusta a la ecuación r = (0.61 x) / AN,
donde  es la longitud de onda de la luz empleada,
y AN la apertura numérica de las lentes del sistema
utilizado. La AN indica la cantidad de luz que, una
vez atravesado el espécimen, es captada, por la len-
te y se puede de�inir como la capacidad de la lente
de captar la luz. Su valor lo determina la ecuación
AN = n x senθ, donde “n” es el índice de refracción
del material que hay entre la muestra y el objetivo,
y el ángulo θ (apertura angular) es la mitad de la
anchura angular del cono de rayos de luz captado
por el objetivo desde un punto de la muestra (Figu-
ra 7.11).
Teóricamente, el máximo valor del ángulo es
de 90º, pero en la práctica, en el mejor de los casos,
suele ser de 70º por lo que el valor del seno suele
ser de 0.94. Para aumentar la AN, en los objetivos
húmedos el aire es sustituido por aceite (n=1.51)
consiguiendo una máxima AN de 1.42 (0.94 x 1.51).
En las mejores condiciones, luz de 450 nm y apertu-
ra numérica de 1.42, solo se consiguen alrededor de
0.2 micras de poder de resolución, obviamente, la
resolución puede ser mejorada si se emplea luz UV
(200-300 nm). El valor teórico de “r” puede variar
pues la fórmula que permite su cálculo no es igual si
se sigue el criterio de Rayleigh (ya visto), el de Abbe
(r =  / 2AN) o el de Sparrow (r = (0.47 x ) / AN).
Cuando se habla de resolución (valor de “r”) es ne-
cesario ser cuidadoso y no confundirlo con el poder
de resolución, pues cuanto más bajo es dicho valor
mayor es el poder de resolución de ese objetivo.
En los últimos años, debido a la aparición de
microscopios que permiten obtener imágenes tridi-
Figura 7.11: El uso de aceite de inmersión de-
termina que la apertura numérica sea mayor
puesto que θ2 es mayor que θ1; y una mayor aper-
tura conlleva un menor valor de “r” y un mayor
poder de resolución.
Métodos en biociencias

mensionales, además del concepto clásico de

resolución en el plano horizontal (ejes x-y), visto en
el párrafo anterior, ha aparecido el concepto de reso-
lución en el plano vertical (eje Z). En el microscopio
confocal está en torno a los 0.5 μm, los microscopios
de deconvolución alcanzan los 150-200 nm, y algu-
nos microscopios de super-resolución consiguen
valores de resolución vertical de 20 a 30 nm.
Con el �in de aclarar la diferencia entre los
conceptos de aumentar (ampli�icar) y resolver se
utilizarán los datos que aparecen en la siguiente
tabla, y que representan los valores de resolución,
aumento y AN para los distintos objetivos que pue-
den ir montados en el revólver de un hipotético
microscopio.

Resolución (μm) Aumento Apertura Numérica

1.46 10x 0.25
0.91 20x 0.40
0.56 40x 0.65
0.26 100x 1.42 (con aceite)
Supónganse ahora dos orgánulos celulares que
se encuentran separados 0.5 μm. Si se les hace una
fotogra�ía mientras son observados con el objetivo
20x aparecerán como un único punto en la imagen,
nótese que el valor de “r” para este objetivo (0.91
μm) es mayor que la distancia que separa a los dos
orgánulos (0.5 μm) y por tanto no puede resolver
entre los dos orgánulos. Si se hace lo mismo con el
objetivo de 100x, cuya “r” es inferior a la distancia
de separación de los dos orgánulos, estos aparece-
rán diferenciados como dos puntos y tendrán un
mayor tamaño (5 veces) que en la imagen obtenida
con el objetivo 20x. Si mediante algún dispositivo se
ampliase 2 veces la imagen obtenida con el objeti-
vo 100x y 10 veces la obtenida con el objetivo 20x,
en el papel, la estructura tendría idéntico tamaño
pues la ampliación �inal sería de 200 veces en am-
bos casos: 100 x 2 en un caso y 20 x 10 en el otro. Sin
embargo, con el objetivo 20x se observaría un úni-
co objeto y con el objetivo 100x se observarían dos.
Es obvio que en este caso el sistema de ampliación
es, y valga la redundancia, capaz de ampliar pero no
de resolver.
7.2.3. Microscopio de campo oscuro
Los microscopios de campo oscuro poseen un con-
densador que ilumina al espécimen con un ángulo
Figura 7.12: Microscopio de campo oscuro.
El disco opaco produce un cono de ilumina-
ción hueco cuyos rayos luminosos no son
captados por el objetivo (luz no re�lejada),
salvo que impacten con la muestra, su tra-
yectoria se desvíe y entren en el objetivo (luz
re�lejada).
muy abierto, de manera que solo los rayos que cho-
can contra el espécimen pueden ser captados por eI
objetivo. Para ello los condensadores de los micros-
copios de campo oscuro tienen un disco opaco en
su centro que bloquea los rayos luminosos que van
centrados, pero deja pasar los laterales. Estos rayos
laterales se pierden y no entran en el objetivo si no
impactan con alguna estructura. Los fenómenos de
dispersión y re�lexión que se producen al impac-
tar los rayos con el espécimen hacen que algunos
de ellos cambien su dirección y puedan entrar en el
objetivo (Figura 7.12). Por todo ello, el fondo de la
imagen no tiene luz y es negro (de ahí el nombre del
microscopio), y el objeto aparece iluminado y bien
contrastado contra el fondo oscuro.
Iluminación diferencial de Rheinberg
La iluminación diferencial de Rheinberg, bási-
camente, es una variación del microscopio de
campo oscuro que usa discos coloreados en lu-
gar del disco opaco que tapaba la zona central
del condensador para conseguir iluminación la-
teral. No mejora, por tanto, las prestaciones del

184
 Microscopía óptica

luz, a menos que la muestra desvíe el plano de pola-

rización de la luz (Figura 7.13).
Las muestras que poseen esta propiedad se
dicen anisotrópicas, ya por birrefringencia, ya por
dicroísmo, y esta propiedad reside en la organi-
zación estructural de la muestra. En el material
biológico, las estructuras paracristalinas suelen
presentar esta propiedad, por ejemplo, el huso
mitótico, debido al alto número de microtúbulos
alineados que lo componen; los �ilamentos de mio-
sina en el músculo estriado esquelético, por su gran
ordenación; los cloroplastos, por los grana; las pa-
redes celulares, por la orientación de la celulosa; los
granos de almidón y también algunas inclusiones
cristalinas.

7.2.5. Microscopio de contraste de fases

Este microscopio genera contraste en material bio-

Figura 7.13: (A) Polarizador y analizador están en lógico no teñido, transformando las diferencias
fase y la muestra no modi�ica el plano de polarización de fase generadas en la luz que atraviesa el espé-
de la luz. (B) Polarizador y analizador están desfasa-
dos y la muestra no modi�ica el plano de polarización cimen en diferencias de intensidad lumínica, y por
de la luz por lo que la luz es detenida en el analiza- tanto zonas claras y oscuras. El desfase de onda es
dor. (C) Polarizador y analizador desfasados pero la provocado por la distinta naturaleza (estructura,
muestra rota el plano de polarización de la luz, lo que
le permite pasar a través del analizador. composición, grosor) que pueden tener las diferen-
tes partes de un espécimen (Figura 7.14). De este
modo se puede diferenciar el espécimen del medio
circundante, y unas partes del espécimen con res-
microscopio de campo oscuro; sin embargo, permi- pecto a otras. Los componentes más peculiares de
te la consecución de imágenes de una gran belleza este microscopio son la placa de fase y el anillo de
por su cromatismo; y esto lo hace de un modo ba- fase. El diseñador de este sistema fue Zernike en la
rato. Los discos que se anteponen al condensador década de los 50 del pasado siglo, y por ello premio
suelen ser bicoloreados con colores de buen con-
traste, por ejemplo un disco donde la zona central
es azul oscuro y la corona circular periférica roja
generará imágenes de fondo azul y especímenes ilu-
minados en tonos rojos. El diámetro del área central
del disco debe ser ajustado en función de la apertu-
ra numérica del objetivo a usar. En la red se exhiben
abundantes imágenes de muestras biológicas gene-
radas con este tipo de microscopio.

7.2.4. Microscopio de polarización

La propiedad óptica en la que se basa este micros-
copio es la birrefringencia, es decir, la capacidad de
la materia de desviar o modi�icar el plano de pola-
rización de la luz. En estos microscopios la muestra
se sitúa entre dos �iltros polarizadores, el que está
debajo del condensador se llama �iltro polarizador
y el que está por encima del espécimen se llama �il- Figura 7.14: Esquema que ilustra el desfase
tro analizador. Si los �iltros están cruzados, es decir que el citoplasma o los orgánulos de una cé-
girados 90º uno con respecto al otro, no ha de verse lula causan cuando la luz incide sobre ellos.

185
Métodos en biociencias

Figura 7.15: Imágenes de un cultivo de células HeLa tomadas con un microscopio de contraste de fase negativo
donde se aprecia el halo de fase (izquierda), y con un microscopio de contraste por interferencia diferencial (de-
recha). Tomadas de la página web www.microscopyu.com.

Nobel de Física en 1953. En realidad, él inventó lo El microscopio de contraste de fase se emplea

que llamó contraste de fase positivo u oscuro que
luego fue sustituido por el contraste de fase nega-
tivo o brillante donde el objeto aparece brillante en
un campo más oscuro.
Este tipo de microscopio es muy útil para ob-
servar especímenes vivos no teñidos, por lo que se
usa mucho en cultivos celulares, microbiología...;
sin embargo, tiene un pequeño inconveniente pues
los objetos aparecen rodeados por lo que se llama
el halo de fase (halo luminoso si el campo es oscuro)
que añade una estructura artefactual al espécimen
y limita su resolución (Figura 7.15).
para observar células vivas y los dispositivos don-
de se cultivan estas células suelen tener grosores
próximos al cm, caso de placas Petri y placas mul-
ti-well, o de algunos cm, caso de los �lasks, lo que
hace que sea �ísicamente imposible observar las cé-
lulas con los objetivos habituales que montan los
microscopios pues sus distancias de trabajo son de
algunos mm o décimas de mm; en de�initiva, no se
puede introducir la estructura de cultivo y enfocar
las células cultivadas ya que el tamaño del disposi-
tivo de cultivo es muchísimo mayor que la distancia
de trabajo. Con el �in de paliar este problema se di-

Figura 7.16: Imagen de un microscopio invertido con contraste de fase (izquierda), en la esquina superior de-
recha se incluye la imagen del soporte de los anillos del condensador. Esquema de su sistema de formación de
imagen (derecha) Tomado y modi�icado de www.microscopyu.com.

186
 Microscopía óptica

señan los microscopios invertidos con contraste

de fase, en los que se invierte la columna luminosa
para poder acercar el objetivo a la parte inferior de
la estructura de cultivo, que es donde descansan las
células. Por ello el objetivo queda por debajo de la
muestra y la fuente de iluminación por encima (Fi-
gura 7.16).

7.2.6. Microscopio de contraste por interferencia

diferencial
El microscopio de contraste por interferencia dife-
rencial (DIC microscope) genera contraste a partir
de diferencias en los índices de refracción entre los
componentes del espécimen y, de modo análogo al
microscopio anterior, transforma estas diferencias
en el índice de refracción en diferencias en inten-
sidad lumínica; además, evita la aparición del halo
asociado al microscopio de contraste de fase. Pues- Figura 7.17: Esquema de la ópti-
to que las mayores alteraciones del haz luminoso ca de un microscopio DIC.
suelen tener lugar en los límites de las células (es
donde se producen las variaciones más fuertes en
el índice de refracción), estos límites tienen un as-
pecto tridimensional como resultado de un efecto 7.2.7. Microscopio de fluorescencia
parecido a un sombreado. Este ligero resalte tri-
dimensional es un efecto óptico y no una realidad La �luorescencia es la capacidad que poseen cier-
estructural. Al sistema óptico capaz de generar este tas moléculas, llamadas por ello �luorocromos, de
efecto también se le denomina óptica de Nomars- excitarse al ser iluminadas con una determinada
ki. Básicamente, esta óptica utiliza luz polarizada y longitud de onda (λ de excitación) y emitir una lon-
un sistema de prismas birrefringentes –los de Wo- gitud de onda mayor (λ de emisión). En un principio
llaston– que separan el haz de luz en dos haces y la λ de excitación de la mayoría de los �luorocromos
que, una vez atravesada la muestra por diferentes utilizados estaba en los rangos UV y visible; hoy en
vías, los vuelven a recombinar. En el proceso de re- día también se utiliza �luorescencia infrarroja a la
combinación los fenómenos de interferencia ponen que se hace visible mediante un cambio de fase, que
de relieve la interfaz entre zonas con diferente ín- no es otra cosa que la transformación de una longi-
dice de refracción y se genera la ilusión de una tud de onda en otra de diferente valor. La diferencia
imagen tridimensional (Figura 7.17). El efecto �i- entre el valor nominal de la frecuencia de excitación
nal es un destacable efecto sobre la resolución que
hace a esta técnica especialmente idónea para el es-
tudio de especímenes vivos y, combinada con vídeo
microscopía, ideal para analizar acontecimientos
dinámicos dentro de las células.
Un efecto similar se consigue con el micros-
copio de contraste por modulación Hoffman, que
incrementa el contraste por la detección de gra-
dientes ópticos a los que transforma en niveles
de grises más claros y oscuros que el fondo del
campo. Los gradientes de fase se producen en re-
giones donde hay un rápido cambio en el haz de
luz que suele conllevar refracción. El conjunto ge-
nera un pseudorrelieve algo más acentuado que el
generado por el microscopio de contraste por in- Figura 7.18: Esquema de los espectros de absorción y
emisión de un �luoróforo.
terferencia diferencial.

187
Métodos en biociencias
y la de emisión es lo que se denomina desplaza-
miento de Stokes (Figura 7.18).
El microscopio de �luorescencia incorpora un
sistema de tres �iltros: primer �iltro barrera, �iltro
divisor de haz y segundo �iltro barrera. Teóricamen-
te, la función del primer �iltro barrera es dejar pasar
solamente la longitud de onda de excitación, que
de�ine el valor nominal de dicho �iltro. El segundo
�iltro barrera solo deja pasar la longitud de onda de
emisión, y también de�ine su valor nominal. Entre
ellos se sitúa el �iltro divisor de haz, que en reali-
dad funciona como un espejo pues re�leja luz con
longitudes de onda por debajo de su valor nominal
y deja pasar la luz para valores superiores (Figura
7.19). Por ejemplo, suponiendo que se dispone de
un hipotético �luorocromo que se excita a 360 nm
y emite a 520 nm, los valores nominales ideales del
sistema de �iltros deberían ser: 360-440-520. El
primero correspondiente a la λ de excitación y el
último a la λ de emisión. El valor intermedio corres-
pondería al del espejo divisor de haz y ha de estar
comprendido entre los otros dos valores pues ha de
re�lejar la luz de excitación (360 es inferior a 440)
y dejar pasar la de emisión (520 es superior a 440).
El empleo de luces de emisión monocromáticas (lá-
ser o led) puede permitir la eliminación del primer
�iltro barrera. El conjunto de los tres �iltros hace que
la imagen resultante tenga un fondo negro en el que
destaca la luz emitida por la molécula �luorescente,
hecho que aumenta notablemente su visibilidad. El
Figura 7.19: Esquema del funcionamiento del sistema de �iltros
de un dispositivo de epi�luorescencia con los valores utilizados en
el ejemplo incluido en el texto. Nótese que el valor de la λ de excita-
ción (360 nm) es menor que el de la λ de emisión (520 nm).
188
Figura 7.20: Imagen de un tumor de próstata teñido con
IRDye 800CW-EGF y captado con sistema de imagen in-
frarrojo Odyssey. Tomado de LI-COR (www.licor.com).
Disponible en color.
fondo negro es debido a que la λ de excitación no
puede atravesar el �iltro barrera y por ello, en todos
aquellos puntos del campo óptico donde no se pro-
duce �luorescencia no se ve luz. Su alta sensibilidad
y estabilidad, unida a su baja toxicidad y a un precio
asequible, junto con el hecho de que la mayoría son
solubles en agua, ha convertido a los �luorocromos
en trazadores ideales en el campo de la biología.
En las moléculas biológicas es posible conside-
rar hasta tres tipos de �luorescencia: la natural, que
la molécula posee por sí misma y por ello también se
denomina auto�luorescencia; la �luorescencia indu-
cida, cuando la molécula necesita algún tratamiento
para ser �luorescente; y el marcado �luorescente,
cuando a la biomolécula se le une una molécula
�luorescente. Las estrategias de unión de la molé-
cula �luorescente son muy diversas pues dependen
de la estructura de la molécula a la que han de unir-
se. Independientemente del tipo, los �luorocromos
pueden ser de muy diferente naturaleza química y
sus λ de excitación pueden ir desde el UV hasta el in-
frarrojo. Especialmente interesante es el campo de
aplicación de la �luorescencia infrarroja pues dado
su gran poder de penetración permite el análisis de
muestras biológicas al completo, sin necesidad de
realizar cortes (Figura 7.20).
La existencia de muy diversos tipos de �luo-
rocromos ha posibilitado numerosas opciones;
por ejemplo, la inyección de �luorocromos en cé-
lulas para usarlos como indicadores de pH o de
Ca2+, ligado de �luorocromos a macromoléculas o
a anticuerpos, e incluso la utilización de proteínas
auto�luorescentes como GFP (green �luorescent pro-
tein) que al unirse a otras proteínas integrándose
en su propia estructura posibilitan estudios de mo-
vilidad, análisis de vida media, interacción con otras
proteínas…

Figura 7.21: Esquema del sistema de iluminación y en-
foque de un microscopio confocal de barrido. Las rayas
discontinuas representan luz fuera de foco que no es
captada por el detector. En la parte inferior se observa
un detalle del área de la muestra que resulta iluminada.
7.2.8. Microscopio confocal láser de barrido
Su diseño teórico fue realizado por Minsky en 1955
pero su aparición y uso en el campo de la biología
se retrasó hasta la década de los 80, posibilitado
por el desarrollo de computadoras y programas
para escaneo y análisis de imagen, entre otros avan-
ces técnicos. En palabras de su autor, lo que este
microscopio persigue es iluminar un plano de la
muestra punto por punto evitando así la luz dis-
persa (residual) originada por otros puntos cuando
estos se iluminan simultáneamente. Este micros-
copio emplea �luorescencia y en la �igura 7.21 se
incluye un esquema básico de su sistema óptico
que, como peculiaridad, utiliza dos cámaras este-
nopeicas (pinhole lenses), que no son otra cosa que
cámaras formadas por un pequeño agujero que de-
ben estar enfocadas sobre un mismo punto, de ahí
el término de confocal.
El análisis puntual de la muestra le con�iere
la posibilidad de estudio de seres vivos de peque-
ño tamaño al completo, secciones de cierto grosor,
e incluso hacer reconstrucciones tridimensionales
sin necesidad de realizar cortes pues el escaneo se
puede hacer en el plano (ejes x e y) y en altura (eje
z). Si este tipo de análisis se hace en un microscopio
de �luorescencia convencional la iluminación simul-
tánea de todo el material genera luz dispersa que
enmascara cualquier plano focal que se quiera se-
189
Microscopía óptica
leccionar de la muestra. En realidad este sistema de
iluminación consigue lo que se podría denominar
lonchas o planos ópticos del espécimen al eliminar
toda la luz dispersada que puede ser generada por
encima o por debajo del plano óptico escogido.
7.2.9. Microscopio de excitación multifotónica
En el microscopio confocal, aun consiguiendo una
imagen bien contrastada, las estructuras que hay
por encima y por debajo del punto enfocado, aun-
que con menor intensidad, también están siendo
iluminadas, lo cual puede determinar una rápida
pérdida de la �luorescencia en estas áreas. Ade-
más, cuando se están analizando células vivas, este
proceso de blanqueo �luorescente puede generar
radicales tóxicos que, a su vez, pueden provocar
daño y/o muerte celular. Para reducir este daño lu-
minoso se diseñó el microscopio que nos ocupa.
El microscopio de excitación multifotónica emplea
como sistema de iluminación un láser próximo al
infrarrojo (700 nm), que emite pulsos luminosos
muy cortos (ps o fs) y muy intensos. El uso de ra-
diación próxima al infrarrojo o infrarroja le hace
especialmente idóneo para el estudio de muestras
con cierto grosor pues este tipo de radiación tiene
un poder de penetración más alto que la radiación
visible o la UV. Cuando una molécula absorbe dos
fotones (en algunos casos hasta tres), la energía
de todos ellos se suma y la molécula se compor-
ta como si hubiese sido excitada con una λ inferior
que le suministrase el doble (o el triple) de ener-
gía. La probabilidad de la absorción simultánea de
dos fotones es muy baja excepto para las molécu-
las que están en el plano de foco; por ello no afecta
a las moléculas vecinas ubicadas por encima y por
debajo, que al no ser excitadas no emiten �luores-
cencia. Como no hay emisión de �luorescencia fuera
del punto de foco no necesita la cámara estenopeica
de emisión, por tanto no es un microscopio confo-
cal (Figura 7.22). La molécula excitada suele emitir
en el rango del visible y la propia muestra causa dis-
persión en la luz emitida. Esto, unido al grosor de
la muestra, provoca una disminución en la intensi-
dad de la señal que di�iculta su detección, por lo que
la instalación lateral de detectores de �luorescencia
suele ser frecuente en este tipo de microscopios.
7.2.10. Microscopio de deconvolución digital
En este caso se usa un microscopio �luorescen-
te normal para tomar series de imágenes digitales
por todo el grosor (altura) de un espécimen; en
Métodos en biociencias
Figura 7.22: La imagen superior ilustra la luz
residual (en forma de reloj de arena) generada
por el sistema de iluminación de un microscopio
confocal. La emisión de pulsos de luz infrarroja eli-
mina la luz residual, pues solo es capaz de excitar
a las moléculas �luorescentes que se encuentran en
la zona de la máxima intensidad de iluminación
(�igura inferior).
realidad cada imagen no es otra cosa que un pla-
no focal distinto. Posteriormente, el conjunto de
planos focales es deconvolucionado para elimi-
nar matemáticamente la contribución luminosa
de los puntos fuera de foco y aberraciones ópticas
del sistema. Deconvolucionar es modelizar mate-
máticamente una imagen que sufre degradación
por desenfoque y ruido. En realidad la traducción
del término inglés «deconvolution» puede ser la de
desenmarañar, que en el caso presente se re�iere a
limpiar imágenes.
Este tipo de microscopio suele incorporar un
detector de imagen de alta resolución (cámara digi-
tal CCD), un sistema de enfoque motorizado preciso,
una computadora potente y el software pertinente.
Las imágenes pueden obtenerse de un microscopio
confocal y el sistema genera nuevas imágenes de ca-
lidad muy superior, o también de un microscopio de
�luorescencia convencional. En este caso la calidad
de las imágenes obtenidas es similar a las del mi-
croscopio confocal.
La toma de imágenes en el eje z determina la
aparición de un nuevo concepto: el vóxel, que puede
190
entenderse como un píxel tridimensional. En estos
microscopios el número y tamaño de los píxeles
vendrá determinado por las características de la
cámara que capta la imagen; sin embargo la altura
del vóxel se determinará al introducir la separación
entre los diferentes planos focales. Entre los dife-
rentes parámetros que afectan a la deconvolución
cabe destacar dos de ellos; la función de dispersión
del punto (psf, point spread function) y la densidad
de muestreo. La «psf» hace referencia al borrón o
mancha que, por efecto de la dispersión, origina un
punto al ser iluminado, de modo que en vez de ob-
tenerse un punto luminoso lo que obtiene es una
estructura luminosa cuya forma tridimensional re-
cuerda a un elipsoide de revolución con eje mayor
en el eje Z (Figura 7.23).
La psf depende de las características del siste-
ma óptico del microscopio y es un parámetro muy
importante a determinar y corregir. Una psf mal cal-
culada no diferenciará entre la luz del punto de foco
y la dispersada, por lo que no se producirá mejo-
ra en la imagen �inal. Su correcta corrección es la
responsable de la mejora resolutiva (tanto en el pla-
no horizontal como en el eje vertical) obtenida en
este tipo de microscopio (Figura 7.23). La densidad
de muestreo hace referencia al número de vóxeles
por unidad de volumen y también es importante: si
es demasiado baja los algoritmos de deconvolución
pueden no ser e�icaces.
7.2.11. Microscopio vídeo digital
Este instrumento es un microscopio al que se ha
acoplado una vídeo cámara digital en el plano de
foco de la imagen que produce el ocular. Se intenta
con ello aprovechar la mayor sensibilidad y capaci-
dad que poseen las cámaras cuando se las compara
con el ojo humano. Además, estas imágenes pueden
ser mejoradas tras un procesamiento matemáti-
co por una computadora (video enhanced digital
microscopy) que lleva incorporado un sistema de
procesamiento de imagen.
La utilización de microscopios DIC o de con-
traste por modulación Hoffman, el empleo de las
cámaras digitales y la aplicación de programas de
mejora de imagen permiten la observación de es-
tructuras que escapan al poder de resolución del
microscopio óptico (200 nm). De hecho, con este
tipo de microscopio se pueden obtener imágenes
en vivo; condición indispensable para observar
algunos procesos celulares dinámicos como poli-
merización de microtúbulos (28 nm), movimiento
de vesículas... Además, debido a la alta sensibili-
dad de la cámara, permite hacer tomas de imágenes

Figura 7.23: (A) Esquema del modo de obtención de
imagen de un microscopio de deconvolución digital. (B)
Efecto de dispersión de un punto (psf) al ser iluminado;
a la izquierda en el plano XY y a la derecha en el pla-
no XZ. (C) Efecto de la corrección (lado derecho) del psf
en el plano XZ.
muy seguidas en �luorescencia, donde, por ser el
fondo del campo óptico negro, los tiempos de ex-
posición suelen ser más largos. Finalmente, si al
microscopio se le incorpora un motor se pueden
obtener imágenes por todo el espécimen (super-
�icie y altura) a diferentes tiempos; por ello, en su
momento, también se le llamó microscopía de 4 di-
mensiones: las tres del espacio más el tiempo.
7.2.12. Microscopios ópticos de super-resolución
Se consideran microscopios ópticos de super-re-
solución aquellos que consiguen resoluciones que
191
Microscopía óptica
rompen los límites teóricos de resolución vistos an-
teriormente (≈200 nm) y, por tanto, se adentran en
lo que se ha dado en llamar nanoscopia, pues alcan-
zan límites de resolución de unos pocos nm. Existen
cuatro tipos de microscopios de super-resolución:
uno de campo lejano y tres de campo cercano. La
microscopía óptica de campo cercano y lejano vie-
nen de�inidas por la distancia entre el objeto y el
punto de observación: se considera campo lejano
cuando esta es muy grande en comparación con la
longitud de onda empleada para iluminar, y cerca-
no cuando es inferior a dicha longitud de onda. No se
considerará aquí el microscopio óptico de campo
cercano (SNOM); se estudiará en el capítulo 9 pues
es un microscopio de barrido por sonda. Los tres ti-
pos básicos de microscopía óptica de campo lejano
son: SIM (structured ilumination microscopy), STED
(stimulated emission depletion) y PALM/STORM
(photoactivated localization microscopy/stochas-
tic optical reconstruction microscopy) (Figura 7.24).
El desarrollo de la metodología que ha permitido el
diseño de los dos últimos ha llevado a sus autores
(Betzig, Hell y Moerner) a la consecución del pre-
mio Nobel de Química de 2014.
En el SIM la muestra se somete, a través del
objetivo, a patrones de iluminación en franjas con
alta frecuencia espacial que se generan al pasar un
haz de luz láser a través de una rejilla óptica móvil.
Este tipo de iluminación genera unos patrones de
interferencia, efecto «moiré», que mediante recons-
trucción matemática permiten obtener imágenes
de mayor resolución. Un microscopio confocal tie-
ne una resolución de 180-250 nm en el plano x-y, y
de 500-700 nm en el eje z; sin embargo, el SIM al-
canza 100-130 nm y 250-350 nm respectivamente.
Los microscopios de tipo STED son microscopios de
barrido pues iluminan la muestra punto por punto
con un doble láser que persigue disminuir a reso-
lución nanométrica el tamaño del psf. El primero
sirve para excitar al �luorocromo; su intensidad es
máxima en el punto de enfoque y disminuye pro-
gresivamente al alejarse de ese punto. El otro láser
hace lo contrario pues su intensidad es mínima en
el punto de enfoque (se consigue al hacer pasar la
luz láser por una placa de fase cuyo centro es opa-
co) y va aumentando hacia el exterior de modo que
consigue borrar toda la iluminación causada por la
excitación del primer láser excepto en el punto de
foco. Al aumentar la intensidad del segundo láser, el
área de borrado aumenta, y el punto focal que emite
iluminación es cada vez más pequeño, hasta llegar a
ser un área que ocupa unos pocos nanómetros (dis-
tancia menor que el valor del poder de resolución
del microscopio óptico): 20-100 nm en el plano x-y,
y próximo a los 100 nm en el eje z.
Métodos en biociencias
Figura 7.24: Esquema de funcionamiento de los microscopios de super-resolución. Tomado de Schermelleh
et al. (2010). JCB 190:165-175. Disponible en color.
La base de la metodología PALM/STORM es
la posibilidad de «encender» y «apagar» la �luores-
cencia de moléculas individuales de �luoróforo, por
lo que se llamó microscopía de un único �luoróforo.
Algunos �luoróforos ópticamente inactivos pueden
ser activados al ser iluminados con una λ1 y solo
entonces pueden emitir �luorescencia al iluminar-
les con una λ2. Si después se les excita intensamente
con λ2 se consigue su fotoblanqueo. Si a una estruc-
tura se le marca con uno de estos �luorocromos, se
iluminan solo unos pocos, se toma una imagen y
después se fotoblanquean, se obtendrá una imagen
incompleta. Pero si este proceso se va repitiendo,
excitando cada vez nuevos �luoróforos, y las imáge-
nes obtenidas se van superponiendo se acaba por
obtener una imagen completa con resolución na-
nométrica (20-50 nm en el plano x-y y 20-30 nm
en el eje Z). El método PALM y el STORM, al igual
que otros que van apareciendo, se diferencian por
el tipo de �luorocromo que se usa, pues la base de la
técnica es la misma para todos ellos.
192
7.2.13. Microscopio de captura láser
El microscopio de captura láser (laser capture
microscope) o microdisector láser sirve para di-
seccionar un área o zona elegida del material
observado; por ello la técnica que con él se puede
desarrollar también se denomina microdisección
láser. El objetivo que se persiguió con su diseño fue
el de poder separar los diferentes componentes que
forman los tejidos o partes especí�icas de ellos; por
ejemplo, aislar de una sección la zona tumoral sin
que esté contaminada por células normales.
Existen dos modos básicos en la manera de
operar de estos microscopios: fusión y ablación. En
la fusión, una vez vista la sección y escogida el área
que interesa, se pone sobre toda ella una �ina pelí-
cula plástica termosensible y se irradia con un láser
de baja potencia la zona elegida. El láser calienta y
funde el plástico que de este modo se embebe por
el tejido; jamás irradia al tejido para evitar daños
 Microscopía óptica

Figura 7.25: Desarrollo de un proceso de ablación fotónica (A) en un microdisector láser PALM acoplado a un mi-
croscopio invertido Olympus IX71 (Servicio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Alcalá). La sección
corresponde a la zona más profunda de las criptas de Lieberkhün de un intestino de rata. La imagen A1 representa la
sección intacta, en la imagen A2 se observa el corte del láser y la imagen A3 muestra la sección una vez catapultado el
fragmento escogido. La imagen B es un dibujo de un proceso de catapultado del fragmento diseccionado hacia la tapa
de un tubo eppendorf. La imagen C representa un proceso de microdisección por fusión.

en este. Al retirar la película de plástico se arrastra 7.3. Preparación de muestras

el tejido que lleva plástico embebido. La otra posi-
bilidad es cortar –ablación fotónica– con el láser el
área escogida y con el propio láser, pero desenfoca-
do y con el haz más abierto, catapultarlo hacia un
tapón de tubo eppendorff que se puede situar en-
cima o debajo de la muestra; obviamente, el cristal
del porta ha de estar colocado arriba si el tapón se
sitúa debajo (Figura 7.25).
En el sistema de fusión el plástico termosen-
sible cubre al material biológico, en el sistema de
ablación el plástico se coloca entre el porta y el
material biológico. Se pueden usar todo tipo de
secciones desde 7 a 20 μm de grosor convenien-
temente tratadas (depende de lo que se quiera
hacer con el material aislado) y teñidas para faci-
litar su observación y la elección del área a extraer;
también se pueden utilizar frotis o extensiones y
cultivos celulares. Se pueden llegar a extraer áreas
muy pequeñas, de hasta 7.5 μm de diámetro e in-
cluso estructuras subcelulares como cromosomas.
La visualización no es perfecta pues no se puede
emplear cubreobjetos ni resina de montaje y el pro-
cesado de la pieza o sección ha de ser muy tenido
en cuenta dependiendo de lo que se quiera hacer
con el material extraído. La mayor ventaja es que
se consigue una extracción prácticamente pura del
material que se desea, sin contaminar por otros ti-
pos de células o tejidos.
para microscopía óptica
En una primera clasi�icación se pueden considerar
dos tipos de muestras: monturas totales y cortes.
Las monturas totales son seres vivos de pequeño
tamaño o estructuras intactas, vivas o muertas, ge-
neralmente de poco grosor; por ejemplo: protozoos,
cultivos celulares, alas de mosca, escamas, pelos...
Los cortes, como su nombre indica, son delgadas
secciones (usualmente entre 5 y 10 μm de espesor)
que la luz atraviesa y permite su análisis. Para poder
observar cortes de alguna estructura o individuo es
necesario desarrollar procedimientos que impli-
can el conocimiento de algunas técnicas y el uso
de diferentes aparatos. Este procedimiento se pue-
de subdividir en los siguientes apartados: �ijación,
inclusión, corte, tinción y montaje. En el texto que
sigue no se pretende hacer un estudio exhaustivo
de cada uno de estos apartados, ni tampoco incluir
protocolos en algunos de los procedimientos. Lo
que se pretende es hacer hincapié en el objetivo que
se persigue en cada apartado, estudiar sus posibles
variantes y analizar los factores que afectan a di-
chos procedimientos. Por lo tanto, no se insistirá en
explicaciones detalladas de las distintas manipula-
ciones sino que se intentará razonar y justi�icar los
motivos que condicionan el uso y orden temporal
de utilización de determinados tratamientos y apa-

193
Métodos en biociencias
ratos requeridos en las distintas fases del proceder
de cada apartado en cuestión.
7.3.1. Fijación
La �ijación es un proceso �ísico-químico que de-
termina la muerte de las células o del ser vivo por
insolubilización de determinados componentes, y
cuyo objetivo es que la estructura y/o composición
molecular de lo �ijado se mantenga prácticamente
igual a la que presentaba en vivo. De ello surgen los
conceptos de imagen histológica real (la que tiene el
tejido cuando está vivo) y equivalente (la obtenida
tras la manipulación histológica). Además, el pro-
ceso de �ijación suele conllevar: a) la protección de
la estructura del ataque de microorganismos, pues
ellos también resultan �ijados; b) la inhibición de la
autolisis; y c) la preparación de las estructuras para
posteriores tratamientos.
El proceso de �ijación puede ser muy variado
(tiempo, producto...) y depende de la naturaleza del
material a estudiar y del objetivo del estudio; por
ello no existe un método universal de �ijación y, en
cada caso, será necesario poner a punto el método
de �ijación adecuado.
En función del tipo de estudio a realizar so-
bre el material biológico hay dos grandes tipos de
�ijación: a) la �ijación histológica o citológica, que
intenta preservar la estructura o arquitectura de
tejidos o células y se dedica sobre todo a estudios
de tipo morfológico o estructural; y b) la �ijación
histoquímica, que preserva la composición mole-
cular y/o funcionalidad del material para poder
llevar a cabo estudios de carácter más �isiológico
como son los que en su desarrollo emplean técnicas
histoquímicas, histoenzimológicas, inmunohisto-
químicas, histoautorradiográ�icas... Se estudiarán, a
continuación, algunos parámetros y características
de interés en el proceso de �ijación.
Velocidad de penetración y velocidad de fijación
La velocidad de penetración (Vp) del �ijador es un
parámetro regido por leyes �ísicas y su conoci-
miento es útil para determinar la dimensión de la
muestra a �ijar y el tiempo idóneo que dicha mues-
tra ha de estar �ijándose. De acuerdo con las leyes
de difusión, la Vp disminuye progresivamente a par-
tir del momento en que la pieza se sumerge en el
�ijador; no obstante, el tiempo de �ijación se puede
calcular con una sencilla expresión: e=K x t, donde
“e” es la penetración en mm; “K”, el coe�iciente de
penetración en mm/h y “t” es el tiempo de �ijación
expresado en horas. Existen tablas donde averiguar
194
el valor de K para cada �ijador. Normalmente los va-
lores suelen oscilar entre 0.4 y 1.5 mm/h, la Vp del
formol es 1 mm/h.
La Vp es un fenómeno �ísico pero la velocidad
de �ijación (Vf) lo es químico, e indica el tiempo
necesario para que las moléculas del �ijador interac-
cionen con las de la muestra. En realidad informa
acerca de la velocidad con la que el �ijador estable-
ce su interacción molecular con los componentes de
la muestra. Ambas, Vp y Vf, son determinantes para
escoger el tamaño de la muestra a �ijar y el tiem-
po que la �ijación ha de durar. Por ejemplo: el O4Os
tiene una Vp muy lenta y una Vf muy rápida, esto im-
plica piezas pequeñas y poco tiempo en �ijador; un
ejemplo casi opuesto es el formol, lo que permite
la posibilidad de �ijar piezas de cierto tamaño pero
la necesidad de emplear tiempos de �ijación largos.
Coeficiente de endurecimiento
Todos los �ijadores endurecen, lo cual puede di�i-
cultar la posterior obtención de cortes, pues los
materiales muy duros se astillan al cortarlos. Existe
para cada �ijador un coe�iciente de endurecimiento
o de elasticidad; el etanol de 100º posee el coe-
�iciente con valor más alto. En general, aquellos
�ijadores que provocan una alta deshidratación ge-
neran un mayor endurecimiento.
Variaciones de volumen y presión osmótica
Las variaciones de volumen que puedan derivar de
un proceso de �ijación pueden ser muy graves, es-
pecialmente desde el punto de vista estructural,
pues provocan retracciones o hinchamientos que
modi�ican la estructura del tejido y, como muchas
modi�icaciones no son homogéneas, el efecto es aún
de mayor gravedad. En general es importante que
la Posm del �ijador sea igual a la de las células o a la
de la sangre del animal cuya muestra se quiere �ijar.
En mamíferos oscila entre 340 y 360 mOsm, equiva-
lente a la de una disolución al 9%o de NaCl (solución
isotónica o isoosmótica). Para que la Posm del �ijador
sea isoosmótica se suelen añadir al �ijador sales que
no afectan al proceso de �ijación, por ejemplo, NaCl,
CaCl2. Existen fórmulas de cálculo de la Posm para di-
ferentes concentraciones de los �ijadores de mayor
uso en distintos tampones. La existencia de halos de
retracción rodeando a las células o la vacuolización
intracelular puede, a veces, ser debida al empleo de
�ijadores con su Posm desajustada. El hinchamiento o
rotura de algunas células o estructuras suele estar
causado por �ijadores hipoosmóticos, y la retrac-
ción por �ijadores hiperosmóticos.

Temperatura, pH y concentración del fijador
Lo más usual suele ser �ijar a temperatura ambien-
te aunque en algunos casos la �ijación se hace a 4 ºC
con el �in de frenar procesos de tipo autolítico, pero
esto determina una disminución de la Vf. El pH del
�ijador no siempre se ajusta y de hecho existen nu-
merosos �ijadores cuyo pH no es neutro ni próximo
a la neutralidad; no obstante, si se puede, lo ideal
es que el pH del �ijador sea lo más parecido posi-
ble al pH �isiológico o cuando menos tamponarlo
para que alcance valores comprendidos entre 6 y
8. Fosfato, bicarbonato, cacodilato o veronal son los
tampones de más uso. La concentración del �ijador
normalmente es baja y, excepto para el etanol que
se suele usar al 70%, lo usual es que oscile entre el
0.1 y el 5%. Este no es un parámetro menor pues,
en algunos casos, el uso de soluciones muy concen-
tradas puede acabar inutilizando la muestra para
determinadas técnicas de estudio.
Efecto de mordiente
Se dice que un �ijador tiene efecto de mordiente
cuando alguno de los componentes del �ijador pro-
voca un efecto sobre el material �ijado que tiene
como �in facilitar el proceso tintorial subsiguiente.
En de�initiva, el �ijador va a tener sobre el material
�ijado un efecto preparatorio que ayuda o es esen-
cial en el proceso de tinción.
Tipos de fijación
Los agentes �ijadores se clasi�ican en: �ijadores quí-
micos y �ijadores �ísicos. La elección de uno u otro
tipo depende del estudio concreto y es importante
considerar que la �ijación química, dada la interac-
ción molecular del �ijador con la muestra, puede
provocar importantes modi�icaciones que, a su vez,
pueden invalidar el material para ciertos estudios;
por ejemplo, algunos �ijadores puede llegar a en-
mascarar determinantes antigénicos provocando la
imposibilidad de llevar a cabo estudios de tipo in-
munohistoquímico sobre estas muestras. En el caso
de la �ijación química se pueden utilizar desde �ija-
dores simples, normalmente disoluciones acuosas
débiles de un producto químico como por ejemplo
formaldehído, alcohol etílico, ácido acético, ácido
pícrico, ácido crómico, bicromato potásico, cloruro
mercúrico... a mezclas �ijadoras más o menos com-
plejas que suelen llevar el nombre de quien las
diseñó, como es el caso de los �ijadores de Bouin,
Zenker, Altmann, Helly, Carnoy... El efecto molecular
de la �ijación química no siempre es totalmente cono-
195
Microscopía óptica
cido pero sí se sabe como actúan algunos de ellos; por
ejemplo, el glutaraldehído produce puentes transver-
sales que insolubilizan (precipitan) las proteínas, el
formaldehído hace lo mismo pero los puentes que
establece son más débiles, el O4Os estabiliza los fos-
folípidos de membranas, y el alcohol o la acetona
desnaturalizan proteínas. En general, en todos los
procesos de �ijación química es muy importante un
intenso lavado tras la �ijación con el �in de parar el
proceso de �ijación y eliminar restos del �ijador que
pudiesen tener efectos negativos sobre el procesado
posterior de las muestras.
La �ijación �ísica se hace fundamentalmente
por congelación y se puede realizar mediante tres
variantes: crio�ijación, criodesecación y criosusti-
tución. La crio�ijación, o congelación instantánea,
consiste en bajar la temperatura hasta inhibir to-
talmente cualquier tipo de actividad biológica en
el tejido. La formación de un hielo amorfo, es de-
cir, sin cristales, es muy di�ícil por rápida que sea
la �ijación. Esto es debido a que, como se congelan
primero las partes más super�iciales, queda un nú-
cleo central donde el proceso de congelación es más
lento y que puede permitir la formación de cristales
que pueden dañar el material biológico. Por ello se
suele utilizar la inmersión en isopentano (-50 ºC) de
piezas no muy grandes cuyo tiempo de congelación
no exceda de 10 segundos. La inmersión en nitróge-
no líquido no es tan aconsejable pues torna la pieza
muy quebradiza. La criodesecación o lio�ilización
consiste en �ijar instantáneamente en nitrógeno lí-
quido seguido de un proceso de desecación por
sublimación en una bomba de vacío. Este método
suele aplicarse en el estudio de sustancias que pue-
den difundir por los tejidos o que son fácilmente
metabolizables. La criosustitución consiste en sus-
tituir lenta y progresivamente el agua congelada de
un tejido por �ijador. Para ello, una vez congelado el
material se pone en el líquido de sustitución, nor-
malmente una mezcla de alcohol etílico-acetona y
propilénglicol enfriada a –40 ºC, temperatura a la
que el líquido de sustitución no se solidi�ica.
Desde 1970 también se ha empleado el calor
como método de �ijación y ha sido el microondas
la fuente de calor empleada. En este caso lo que se
provoca es la desnaturalización de proteínas y, en
menor grado, el establecimiento de puentes entre
ellas. Las temperaturas óptimas suelen rondar los
50 ºC y en muchos casos suele ser útil un proceso
de post�ijación química. Otra posibilidad es calentar
el �ijador químico mediante irradiación por microon-
das para acelerar la �ijación química de modo que
procesos de �ijación que duran horas pueden verse
acortados a minutos. El empleo del microondas como
Métodos en biociencias

primer agente �ijador es lo que se llama �ijación por

microondas o estabilización por microondas; el uso
del microondas tras o simultáneamente con un �i-
jador químico se conoce como �ijación asistida por
microondas.

La fijación en la práctica
En general se pueden considerar dos tipos básicos
de �ijación: in toto o in vivo, en que la pieza o el espé-
cimen se sumergen directamente en el �ijador, y la
perfusión, que consiste en ir sustituyendo la sangre
del animal por el líquido �ijador. En el proceso de �i-
jación in toto solo es necesario tener dos aspectos
en cuenta: que el volumen de �ijador sea su�icien-
te para el tamaño de la pieza (1/10, volumen de la
muestra/volumen del �ijador, suele ser una buena
relación) y que, cuando menos al principio, el pro-
ceso se haga con agitación para evitar que alguna
de las caras de la muestra se pegue a las paredes
del recipiente y en esa zona se produzca una �ijación
distinta al resto de la pieza.
El procedimiento más habitual de �ijación por
perfusión consiste en canular la aorta a través del
ventrículo izquierdo y mediante una bomba peris-
táltica introducir el �ijador (Figura 7.26). Una vez
iniciada la perfusión ha de romperse rápidamente
la aurícula derecha para no provocar un gran au-
mento de presión sanguínea y permitir la salida de
la sangre. Es importante tener en cuenta que me-
diante este sistema no se perfunde el pulmón; para
perfundir este órgano hay que canular la arteria
pulmonar a través del ventrículo derecho y romper
la aurícula izquierda. El �ijador se ha de introducir
a la misma temperatura que el cuerpo del animal,
para evitar vasoconstricción, y se suele añadir he-
parina para evitar trombos. Puesto que para ligar
aorta hay que romper el diafragma, a veces se suele
emplear respiración asistida mediante una bomba
y traqueotomía. La velocidad de la bomba de per-
fusión es importante y hay que ajustarla en función
de la especie y del tamaño del animal, de modo que
reproduzca lo mejor posible el �lujo cardiaco del
animal. Existe una variante para evitar la rotura del
diafragma y el colapso respiratorio que conlleva, y
es realizar la perfusión a través de la aorta ventral.
El tiempo de perfusión oscila entre los 10-20 min
y a veces se puede añadir un colorante para tener
la certeza de que el �ijador ha alcanzado el órgano
de interés. Una vez �ijado, el animal queda abso-
lutamente rígido. En muchos casos puede ser de
utilidad perfundir exclusivamente algunos órganos,
por ejemplo: hígado, testículo, riñón... o embriones.
En este caso es necesario canular la arteria de en-
Figura 7.26: Esquema de una perfusión transcardial.
Para facilitar el dibujo no se ha incluido la circulación
pulmonar y las venas cavas se han representado como
una única estructura.
trada al órgano y romper la vena de salida. A veces,
es recomendable iniciar el proceso perfundiendo
con algún tampón lavador isotónico a pH �isiológi-
co antes de iniciar la perfusión con el �ijador. Una
vez terminada la perfusión, el proceso de �ijación se
continúa mediante una post�ijación por inmersión
en el mismo �ijador.
7.3.2. Inclusión
Una vez �ijada la muestra biológica y eliminados los
restos del �ijador mediante un lavado, se lleva a cabo
la inclusión. El objetivo principal del procedimiento
de inclusión es dotar a la muestra o espécimen de un
soporte de su�iciente dureza para ser cortado; ade-
más, al quedar la muestra formando parte de una
estructura rígida e inalterable también permite su
conservación y almacenamiento. La estructura que
se obtiene al �inal del proceso de inclusión se deno-
mina bloque y es en su interior donde se localiza la
muestra biológica. La inclusión debe de hacerse lo
más rápidamente posible después de la �ijación; si
no fuese así, durante un tiempo corto las muestras
se pueden conservar en la solución de lavado a 4 ºC;
para tiempos largos suele ser necesario el empleo
de líquidos de conservación entre los que destacan
el formol diluido, el butanol o la esencia de cedro.
El medio en el que las piezas �ijadas se van a
incluir debe de ser lo más neutro posible, pues la

196

Figura 7.27: (A) Procesador de tejidos Leica TP1020. (B) Estación de confección de bloques de para�ina Lei-
ca EG1150.
inclusión no se hace para rodear por fuera la pieza
sino que la sustancia de inclusión ha de alcanzar el
interior de la muestra y, en consecuencia, llegar has-
ta el interior celular. Cuando el material de inclusión
queda por fuera de la muestra al procedimiento se
le denomina enclaustrar. El material de inclusión
suele ser insoluble en agua pues son ceras, resinas,
plásticos o mezclas de estos componentes los com-
puestos que se suelen emplear en la inclusión. Entre
todos ellos, la inclusión en para�ina o en una mezcla
de para�ina y plástico (paraplast) es el procedimien-
to más usual. Al no ser estos productos miscibles en
agua es necesario deshidratar la muestra biológi-
ca. El proceso de deshidratación se suele hacer en
series crecientes de etanol hasta llegar al etanol ab-
soluto. El etanol tampoco es miscible con la para�ina
por lo que después de la deshidratación es necesa-
rio emplear un líquido intermedio que debe ser
miscible con el agente deshidratante (etanol) y con
el producto de inclusión (para�ina). Benceno, toluol
y xilol son los líquidos intermedios más comunes y
su uso debe hacerse con precaución pues suelen de-
terminar un fuerte endurecimiento de la muestra.
Tras el paso por el líquido intermedio y con el �in
de facilitar la penetración de la para�ina, la mues-
tra se introduce en soluciones con valor creciente
de para�ina en líquido intermedio hasta �inalmen-
te alcanzar el baño de para�ina pura. Estos baños en
para�ina se hacen en caliente, a la temperatura en
que la para�ina se encuentra en estado líquido. El
valor de la temperatura en cuestión dependerá del
punto de fusión de la para�ina, que suele ir desde
40 hasta 60 ºC. La elección de la para�ina en función
de su punto de fusión es importante para trata-
mientos posteriores. Por ejemplo, las para�inas con
mayor punto de fusión suelen ser más duras cuan-
do solidi�ican y ello puede tener efecto en el proceso
de obtención de cortes; además, baños de para�ina a
197
Microscopía óptica
temperaturas altas pueden afectar a las propiedades
antigénicas de la muestra. Una vez in�iltrada la para-
�ina se procede a la confección del bloque, para ello
se emplean unas piezas metálicas (piezas Leukart)
o unos recipientes de plástico donde se introdu-
ce para�ina líquida, se coloca la muestra dándole la
orientación que se desee y se deja enfriar hasta la
solidi�icación del conjunto. En los centros donde es
necesario procesar muchas muestras todo este pro-
cedimiento puede automatizarse en lo que se conoce
como estaciones de procesado de tejidos e inclusión
(Figura 7.27).
En los procedimientos de enclaustrado, cuan-
do el material de inclusión no penetra en el interior
de la muestra sino que lo rodea por fuera, la obten-
ción de secciones ha de ser inmediata; y el material
enclaustrado no se puede almacenar pues al estar en
un medio normalmente acuoso es susceptible de de-
gradarse y/o desecarse y terminar estropeándose.
Además de la inclusión en para�ina o para-
plast, existen otros medios de inclusión no tan
habituales como son la celoidina y la gelatina. La
celoidina es una mezcla de trío o tetranitratos de ce-
lulosa soluble en alcohol-éter, solución que recibe el
nombre de colodión. Se recomienda para piezas de
gran tamaño, o muy duras o cuando se desean obte-
ner cortes más gruesos. El proceso de inclusión se
hace por evaporación del alcohol-éter. La inclusión
en gelatina solo se hace como método previo y en
situaciones muy especiales; por ejemplo, antes de
incluir en para�ina con el �in de agrupar piezas muy
pequeñas. El procedimiento de inclusión es pareci-
do al anterior pues consiste en dejar deshidratar la
gelatina hasta que solidi�ica. Puesto que la gelatina
es hidrosoluble este método es de interés en el caso
de que los compuestos a estudiar puedan resultar
afectados por alcoholes.
La inclusión por congelación necesita una con-
sideración especial. Si nuestro procedimiento de
Métodos en biociencias

�ijación es la congelación la inclusión no será necesa-

ria pues la muestra queda incluida en hielo, que hace
de soporte con su�iciente dureza para ser cortado, y
también permite el almacenamiento de la muestra.
Otras veces la congelación se hace sobre material �i-
jado, pues lo que se persigue es obtener secciones
rápidamente y no tener que llevar a cabo un pro-
ceso de inclusión en para�ina que, además de lento,
puede alterar algunos de los componentes molecu-
lares de la muestra. En este caso, tras la �ijación y
previo a la congelación, la pieza se sumerge en una
disolución de sacarosa o glicerol (penetra más rá-
pido) del 10 al 30 %, también se puede usar DMSO
o etilén-glicol. El objetivo es evitar que se formen
grandes cristales al congelar que puedan rasgar o
romper las células. Este proceso recibe el nombre
de crioprotección. Después de la crioprotección el
material se congela y puede ser cortado.

7.3.3. Corte
Los cortes son secciones delgadas de la muestra que
se suelen colocar y pegar en un soporte transparen-
te, habitualmente, una lámina de vidrio o porta (su
tamaño suele ser de 7.6 x 2.5 cm y su espesor de
1 a 1.2 mm). El objetivo es obtener una sección lo
Figura 7.28: Microtomo Leitz 1512. La imagen inferior es
su�icientemente delgada para que la luz pueda atra-
vesarla. Es cierto que la obtención de cortes es el
método más empleado en histología; sin embargo,
para determinados tejidos son otras las maneras de
preparar la muestra para poder visualizarla. Una de
ellas es la extensión o frotis, que consiste (valga la
redundancia) en extender la muestra biológica, que
suele ser un líquido; por ejemplo, la sangre. La otra
es la aposición o impronta (huella), que consiste en
pegar un porta limpio sobre el órgano o la muestra
biológica fresca; al retirar el porta algunas células
quedan adheridas a él y son arrastradas. Este mé-
todo puede ser útil para estructuras blandas donde
las células no están muy ancladas al medio que las
circunda; por ejemplo, el bazo o la médula ósea. Una
vez hecha la extensión u obtenida la impronta pue-
de dejarse secar y después �ijar o �ijar directamente,
sin secado.
Los cortes se obtienen en unos aparatos espe-
ciales denominados microtomos, que tienen tres
componentes fundamentales: el portabloques, el
sistema de avance y la cuchilla con su soporte. En el
campo de la microscopía óptica es frecuente el uso
de los tipos de microtomos que se describen a con-
tinuación.
— Microtomo de rotación, también llamado
microtomo de Minot (Figura 7.28). Es el
un detalle de la zona del portamuestras y de la cuchilla.
más usado y especialmente idóneo para
obtener secciones de muestras inclui-
das en para�ina, permite obtener cortes
a partir de 4 μm de espesor. Se llama de
rotación porque el sistema de avance
va asociado a un volante que gira (rota)
ya sea de forma manual o motorizada.
Cada vuelta del volante provoca un avan-
ce del bloque hacia la cuchilla, que está
�ija. El portabloques no es otra cosa que
una mordaza que sirve para sujetar �ir-
memente el bloque, y se puede mover
en las tres direcciones del espacio con
el �in de orientar la pieza. El portacuchi-
llas, por su parte, permite modi�icar el
ángulo de corte de la cuchilla en relación
con la super�icie de corte. Elegir el ángu-
lo correcto es de suma importancia en la
obtención de cortes, pues ángulos no idó-
neos pueden dar lugar al aplastamiento
de la sección. El a�ilado de la cuchilla es
primordial para la obtención de buenos
cortes; actualmente se emplean cuchillas
desechables pero hace algunos años se

198

Figura 7.29: Tipos de cuchillas
(A, B, C y D) según la forma de su
�ilo; debajo se ha incluido la ima-
gen de un portacuchillas para
cuchillas desechables.
usaban cuchillas de acero que se podían
a�ilar repetidas veces. En función del per-
�il de la cuchilla existen 4 tipos (A, B, C y
D)(Figura 29), que se escogen para obte-
ner secciones más o menos �inas y para
cortar material más blando o más duro.
La obtención de las secciones y el mane-
jo de las mismas no se considerará pues
aprenderlo de forma empírica es la forma
más correcta de hacerlo.
— Microtomo de deslizamiento. Se suele
emplear para material incluido en celoidi-
na y para obtener cortes de gran tamaño
y/o de material duro. Recibe este nom-
bre porque es la cuchilla la que se desliza
hacia el bloque, de modo similar a como
Figura 7.30: Izquierda: imagen de la zona superior de un microtomo Microm HM505E; la zona 1 del panel de control
sirve para ajustar las características del corte, y la zona 2 para ajustar la temperatura de la cámara de congelación
y la hora de eliminación de escarcha . Derecha: detalle de la cámara de congelación; el �iltro sirve para retener mate-
rial que pudiese resultar peligroso.
199
Microscopía óptica
trabaja el cepillo de un carpintero. Las
secciones suelen ser gruesas, alrededor
de las 15 μm, y es muy di�ícil obtener cor-
tes seriados por lo que las secciones han
de tratarse de forma individual.
— Microtomos de congelación. Hay dos ti-
pos: los clásicos y los criotomos (también
llamados criostatos). Los primeros em-
plean CO2 como sistema de enfriamiento
y no poseen un sistema de control de
temperatura preciso por lo que se ne-
cesita experiencia para obtener buenos
cortes, que normalmente suelen ser ma-
yores de 15 μm. Un criotomo no es otra
cosa que un microtomo de rotación meti-
do dentro de una estructura que permite
un ajuste perfecto de temperatura (Fi-
gura 7.30). Son de diseño muy moderno
e incorporan toda una serie de avances
y prestaciones que facilitan y hacen más
segura la obtención de cortes. Como ca-
racterística especial poseen un sistema
anti-enrollamiento de la sección que
suele estar formado por una pieza de me-
tacrilato colocada encima de la cuchilla
junto con un sistema de succión que ayu-
da al estiramiento de la sección. Permiten
obtener cortes muy delgados, de hasta 3
μm. El material a cortar suele estar �ija-
do y crioprotegido, y es enclaustrado en
un compuesto especial que hace de so-
porte para facilitar el corte. Las secciones
se adhieren a portas previamente trata-
dos –normalmente silanados– por simple
contacto.
— El vibratomo es un aparato especialmente
diseñado para obtener cortes de material
sin incluir (puede ser material �ijado), o
Métodos en biociencias
Figura 7.31: Vibratomo Bio-Rad Micro-Cut H1200: 1 y 2 in-
dican los botones de ajuste de la velocidad de avance de la
cuchilla y de la frecuencia de vibración, 3 indica el selector
de avance o retroceso. La imagen inferior muestra un deta-
lle de la cubeta para hielo y de la cubeta para el tampón en
el que se introduce la muestra.
sea, tejido blando. La pieza se ancla a una
plataforma mediante pegamento y se su-
merge en tampón. La cuchilla es la que se
desplaza, pero vibrando. La velocidad de
avance de la cuchilla y la velocidad de vi-
bración son ajustables. Permite obtener
cortes mayores de 25 μm, aunque en teji-
dos muy consistentes se pueden alcanzar
espesores de 15 μm (Figura 7.31).
Figura 7.32: De izquierda a derecha; microtomo de serrado Leica SP1600, microtomo de desgaste Leica SP2600 y es-
quema que muestra el mecanismo de obtención de secciones en un microtomo de serrado.
200
— El microtomo de desgaste se utili-
za para obtener secciones de muestras
que incluyen elementos de gran dure-
za; por ejemplo, dientes, material óseo
o muestras que incluyen fragmentos del
biomaterial utilizado en prótesis metáli-
cas, cerámicas… Por ello son muy útiles
en estudios para determinar el compor-
tamiento del tejido ante el implante del
biomaterial. Estos aparatos emplean
discos que llevan polvo de diamante o
carborundo como abrasivo y que giran a
gran velocidad para desgastar la muestra
hasta dejar secciones lo su�icientemente
delgadas para poder ser observadas. Lo
usual es preparar primero una sección de
mayor grosor (100-500 μm) con un mi-
crotomo de serrado (saw microtome) en
el que se obtienen las secciones por se-
rrado con una cuchilla que gira a gran
velocidad (Figura 7.32), y es sobre estas
secciones sobre las que se lleva a cabo el
proceso de desgaste hasta obtener gro-
sores de 20-30 μm. Las muestras han de
estar incluidas en material plástico o re-
sinas.
El proceso de corte siempre conlleva la compresión
de la sección, basta comparar la altura de la sección
de corte del bloque con la altura de la sección obte-
nida: esta última es siempre menor. Para estirar y
colocar correctamente la sección sobre el porta se
suelen utilizar dos variantes metodológicas: el baño
de �lotación o la placa de estirado. En el primer caso
las secciones depositadas sobre la super�icie del
agua de un baño a 37-40 ºC se «pescan» al levantar
el porta que estaba parcialmente sumergido debajo
de ellas. La placa de estirado es una placa metáli-
ca calefactada en la que se colocan portas a los

Figura 7.33: Placa calefactora Selecta
Plac-tronic para estirado de cortes.
que se les ha añadido agua sobre la que se depo-
sitan las secciones (Figura 7.33). Una vez estiradas
las secciones, eliminada el agua sobrante y coloca-
das correctamente sobre el porta, las secciones son
secadas en estufa a 37 ºC con el �in de optimizar el
pegado. El material así procesado es susceptible de
ser almacenado en cajas diseñadas para tal �in du-
rante largo tiempo.
La correcta adhesión de la sección al porta es
de gran importancia; de hecho, una mala adhesión
puede causar el despegado de la sección y no pocos
problemas, pues puede di�icultar o llegar a impe-
dir la realización de las subsiguientes técnicas. Para
conseguir una adhesión estable de las secciones al
cristal del porta es usual recubrir el porta con un
producto que facilita la adhesión de la sección. So-
luciones de albúmina-glicerina, gelatina, poli-L-Lys
o el silanado son los productos más habitualmen-
te utilizados.
7.3.4. Tinción
El objetivo de la tinción es colorear y, por tanto,
hacer visible la muestra. Lo usual es colorear seccio-
nes pero existe la posibilidad de colorear o teñir en
bloque, previo a la inclusión de la pieza. Para teñir,
dado que la mayoría de los colorantes se emplean
en soluciones acuosas es necesario despara�inar el
corte e hidratarlo, proceso inverso a la inclusión. En
el despara�inado se emplean disolventes orgánicos
como toluol o xilol. La hidratación se realiza some-
tiendo la sección a una batería de alcoholes que
suele ir desde el alcohol absoluto hasta el de 50º.
Todo proceso de tinción implica el hecho de
que el colorante debe unirse y mantenerse unido a
la sustancia que teñirá. Esta unión puede ser muy
diferente y estar basada en atracción electrostá-
201
Microscopía óptica
tica; por ejemplo, los colorantes básicos se unen a
moléculas cargadas negativamente y viceversa. La
formación de enlaces covalentes, el establecimien-
to de puentes de H o las interacciones hidrofóbicas
también pueden ser la base de la retención del co-
lor en algunos casos. Especialmente interesante es
el efecto de mordiente que realizan algunas molé-
culas y que consiste en actuar de puente entre el
sustrato y el colorante. Los sulfatos, y más aún los
dobles sulfatos o alumbres, son las moléculas más
usadas como mordientes.
La estructura química fundamental en la ma-
yoría de los colorantes son anillos aromáticos
derivados del benceno. El benceno es incoloro pero
la adición de determinados radicales a su estructu-
ra puede generar moléculas coloreadas. El radical
responsable del color se denomina grupo cromófo-
ro y el conjunto del radical unido al anillo bencénico
recibe el nombre de cromógeno. Los cromóforos
más habituales son los grupos nitroso (-N=O), ni-
tro (-NO2), etileno (-C=C-), carbonilo (-C=O), imino
(-C=N-), azol (-N=N-), y cualquier derivado de la
estructura quinónica. El cromógeno no es necesa-
riamente un colorante, pues el término colorante se
aplica cuando la molécula coloreada posee la capa-
cidad de ligarse a los componentes del tejido. Para
ello, a veces es necesaria la presencia de determi-
nados radicales que reciben el nombre de grupos
auxocromos, la mayoría de ellos moléculas carga-
das, como por ejemplo los radicales amino (-NH2),
hidroxilo (-OH), sul�hidrilo (-SH), carboxilo (-COOH)
o algunos iones metálicos (Al, Fe, Cr…). Existe un có-
digo alfanumérico llamado CI (Colour Index) para
nominar los colorantes; por ejemplo, el azul de to-
luidina es C.I.52040.
En función de los grupos auxocromos y de su
adhesión a los tejidos se pueden establecer cin-
co grupos fundamentales de colorantes: básicos,
ácidos, neutros, indiferentes y metacromáticos.
Los colorantes básicos más usados son las hema-
toxilinas; y las eosinas los más comunes entre los
colorantes ácidos. Los neutros suelen ser sales com-
puestas que llevan un colorante ácido y otro básico;
por ejemplo, el eosinato de azul de metileno. Los
colorantes indiferentes son aquellos que colorean
al ser captados más fácilmente por algún compo-
nente de la muestra biológica que por el líquido
en que van disueltos. Suelen ir disueltos en alco-
hol y los más conocidos se emplean para colorear
lípidos; por ejemplo, el sudán III o el negro sudán.
Los colorantes ortocromáticos colorean del mismo
color que ellos poseen; sin embargo, los metacro-
máticos lo hacen en un color distinto al propio. Este
tipo de colorantes, también llamados cromotro-
Métodos en biociencias
Figura 7.34: (A) Impregnación de una neurona bipolar de corteza cerebral de rata con nitrato de plata. La sal de pla-
ta forma una capa que recubre a la neurona por fuera. (B) Impregnación de células astrogliales de corteza cerebral
de rata con cloruro de oro. En este caso la sal de oro se deposita sobre los glio�ilamentos de las células astrogliales.
pos, suelen ser catiónicos por lo que presentan una
gran avidez por estructuras ácidas, sobre todo gru-
pos sulfatos; de ahí su gran utilidad para colorear
la matriz extracelular del tejido conjuntivo y deriva-
dos, pues los proteoglucanos que forman parte de la
matriz poseen numerosos grupos sulfato en sus glu-
cosaminglucanos. Normalmente el color emitido es
de mayor λ que el color propio y la razón molecular
de este efecto parece ser la alta densidad de luga-
res de unión al colorante y la orientación del mismo,
que termina produciendo su polimerización. Dos de
los cromotropos más conocidos son el azul de tolui-
dina y el azul de metileno.
La coloración vital es aquella que permite colo-
rear la célula sin afectar a su estructura ni interferir
en su �isiología, y puede ser de dos tipos: intravi-
tal y supravital. La primera consiste en introducir el
colorante a través del sistema digestivo, vascular…
y la segunda en aplicarlo sobre células o tejidos
provenientes de un organismo vivo. En sentido
estricto, un colorante vital solo debería colorear cé-
lulas vivas; sin embargo, y esto es un oxímoron, el
término también se aplica a colorantes que marcan
únicamente células muertas en tanto que permite
diferenciar células vivas de muertas. Este tipo de
tinciones son especialmente útiles en la metodo-
logía del cultivo celular o la citometría de �lujo, y a
los colorantes empleados también se les denomina
colorantes de exclusión. El azul de tripano se em-
plea en estudios de viabilidad en cultivos celulares
pues tiñe células muertas; en citometría de �lujo es
usual el empleo de ioduro de propidio, que también
marca células muertas. Un análisis más detallado de
estos colorantes se realizará en los capítulos en los
que se tratan estas metodologías.
202
Un método de contrastado diferente al colo-
reado es la impregnación metálica, producida por la
precipitación de sales metálicas por fuera o dentro
de la célula. Este tipo de contrastado es especial-
mente útil en estudios de tejido nervioso y para
evidenciar algunas �ibras de la sustancia intercelu-
lar. El precipitado metálico suele ser muy oscuro, o
negro, por lo que es de fácil detección. Las sales más
utilizadas son el nitrato de plata, el carbonato de
plata y el cloruro de oro (Figura 7.34).
7.3.5. Montaje
Una vez coloreada la sección se lleva a cabo el
montaje, cuyo objetivo primordial es preservar la
sección. A veces, a la vez que se sigue el proceso de
montaje se pueden mejorar las propiedades ópti-
cas de la muestra. El procedimiento más usual de
montaje es cubrir la sección con una �ina lámina
de cristal denominada cubreobjetos o, más colo-
quialmente, «cubre». Los cubreobjetos pueden ser
de muy diversos tamaños y de forma cuadrangular,
rectangular o circular. Su grosor estándar es de 0.17
mm, pero los hay de diferentes grosores; hecho que
ha de ser tenido en cuenta en función de la distancia
de trabajo del objetivo que se utilizará para obser-
var la muestra.
Al �inal del montaje, entre el porta y el cu-
breobjetos queda una delgada capa de medio de
montaje que penetra en la muestra y estabiliza todo
el conjunto dotando a la sección de gran durabilidad
(Figura 7.35). Existen dos tipos básicos de monta-
je: el hidrofóbico y el hidro�ílico; el primero de ellos
más estable y con mejores propiedades ópticas.
Dado que la gran mayoría de las tinciones se hacen

Figura 7.35: Esquema del sistema de montaje de una
sección histológica que incluye un cubreobjetos cua-
drado y otro circular.
en ambiente hidro�ílico y que los medios de monta-
je más estables suelen ser resinas no hidrosolubles,
previo al montaje es necesario deshidratar la mues-
tra. Este proceso se lleva a cabo sometiendo al corte
a una batería de alcoholes de concentración crecien-
te hasta llegar al alcohol absoluto y a un tratamiento
�inal con un líquido intermedio –normalmente to-
luol, xilol o líquidos intermedios comerciales– que
es soluble en alcohol y en el medio de montaje. Este
líquido intermedio también actúa como aclarante y
suele mejorar las propiedades ópticas de la mues-
tra. En el pasado se usó una resina natural llamada
bálsamo de Canadá; sin embargo, hoy día todas las
resinas que se usan son sintéticas ya que poseen
mejores propiedades ópticas y son más estables que
el citado bálsamo. Hay dos grandes grupos de resi-
nas, las epoxi y las acrílicas, y dentro de ellas existen
diferentes productos comerciales en función del
monómero base de la resina y de algunos produc-
tos añadidos; por ejemplo, antioxidantes. Algunas
de ellas son mejores para determinadas técnicas y
hay resinas, o mejor, medios de montaje exclusivos
para �luorescencia o métodos histoquímicos.
El montaje hidro�ílico puede ser muy útil y/o
necesario en casos de urgencia, cuando no hay ne-
cesidad de guardar la muestra o cuando el producto
coloreado puede disolverse o verse afectado por
203
Microscopía óptica
los alcoholes de la deshidratación. El modo más rá-
pido de llevarlo a cabo en el laboratorio es añadir
una gota de glicerina sobre la sección y colocar el
cubreobjetos encima. Las propiedades ópticas de la
glicerina no son demasiado buenas y este es un as-
pecto que se puede mejorar utilizando medios de
montaje acuosos comerciales. Este tipo de monta-
je es muy transitorio pues se suele contaminar en
unos pocos días; para prolongar su conservación es
útil guardar en el frigorí�ico las secciones así mon-
tadas.
No es una técnica usual pero, a veces, se sue-
le sellar el cubreobjetos con el �in de evitar que se
pierda o contamine el material de montaje y tam-
bién la muestra. El sellado se suele hacer con un
pincel y una laca de secado rápido (se puede utili-
zar laca de uñas) que se deposita tapando el borde
del cubreobjetos.
Bibliografía
Biomedical Light Microscopy. 1991.
James J, Tanke HJ. Springer. ISBN 978-0792309468.
Fluorescence Microscopy. 1998.
Herman B. Springer. ISBN 978-0387915517.
Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging.
2001.
Murphy DB. Wiley-Liss. ISBN 978-0471253914.
Handbook of Biological Confocal Microscopy. 2006.
Pawley JB (ed). Springer Science-Business Media. ISBN
978-0387259215.
Introduction to Light Microscopy. 1998.
Bradbury S, Bracegirdle B. BIOS Scientific Publishers. ISBN
978-0387915159.
Introduction to Optical Microscopy. 2009.
Mertz J. Roberts & Co. Publishers. ISBN 978-0981519487.
Light Microscopy. Methods and Protocols. 2011.
Chiarini-García H, Melo R. Humana Press. ISBN 978-

Microscopía electrónica
El microscopio electrónico puede de�inirse como un
dispositivo de observación que utiliza electrones,
en vez de luz, para crear las imágenes que de�inen
a un pequeño objeto. El hecho de utilizar electro-
nes, cuya λ asociada oscila entre 0.001 y 0.01 nm,
en vez de luz visible, cuya λ oscila entre 380 y 780
nm, hace que este tipo de microscopios posea un
mayor poder de resolución que los microscopios
ópticos. Fue en la década de los años 30 donde se
sentaron las bases técnicas que concluyeron con
la aparición de los dos grandes tipos de microsco-
pios: los microscopios electrónicos de transmisión
(TEM, transmission electron microscope) y los de
barrido (SEM, scanning electron microscope). La
aplicación de estas dos poderosas herramientas en
el campo de las biociencias fue un poco posterior
y no simultánea. Desde un punto de vista semán-
tico, la microscopía electrónica trajo de la mano
la aparición de una nueva terminología cuyo ras-
go diferencial fue la aplicación del pre�ijo «ultra».
Por ejemplo, si un estudio morfológico con micros-
copio óptico se considera análisis estructural de la
muestra biológica, un estudio con el microscopio
electrónico rinde conocimiento ultraestructural.
En 1927, con los primeros experimentos so-
bre difracción de electrones, se establecieron las
8.
Guillermo Bodega
Julio Bodega
bases para el desarrollo de la técnica de micros-
copía electrónica de transmisión. A partir de aquí,
Knoll y Ruska (1932) escribieron la primera pu-
blicación en la que se desarrolla la idea de lentes
electromagnéticas, y en 1936 se construyó en Gran
Bretaña el METROPOLITAN WICKERS EM1, primer
microscopio TEM comercial. Pero no fue hasta 1939
cuando Siemens & Halske comenzaron lo que pue-
de denominarse como fabricación real de este tipo
de instrumentos. Tras la Segunda Guerra Mundial,
otras casas comerciales como HITACHI, JEOL, PHI-
LIPS y RCA continuaron fabricando microscopios a
gran escala. El desarrollo de las técnicas de prepa-
ración de las muestras biológicas para permitir su
observación en el TEM fue complejo y fundamen-
talmente llevado a cabo por Claude y Palade en las
décadas de los años 40 y 50; absolutamente todos
los procedimientos de �ijación, tinción, inclusión y
corte utilizados en microscopía óptica tuvieron que
ser rediseñados y adaptados. Los trabajos de Porter,
Blum y Sjöstrand en la década de los años 50 fueron
la base del diseño de un aparato, el ultramicroto-
mo, que permitió la obtención de cortes que por su
extremada delgadez podían ser observados en el
TEM. En el campo de la metalogra�ía, Heidenreich,
en 1949, fue el primer investigador que estableció
Métodos en biociencias

las pautas con las que preparar materiales meta-

lúrgicos «transparentes» para que pudiesen ser
analizados con estos instrumentos.
El concepto de microscopía electrónica de ba-
rrido es atribuido a Knoll (1935), cuando trabajaba
en el campo de la óptica electrónica. Fruto de los
trabajos pioneros de Knoll y von Ardenne, Zworykin
y sus colaboradores desarrollaron el primer mi-
croscopio SEM para examinar la super�icie de una
muestra sólida en 1942, y entre 1963 y 1965 apa-
recieron los primeros SEM comerciales. La puesta
a punto de las técnicas para permitir la observación
de muestras biológicas en el SEM también tiene su
década dorada en los años 60, donde destacan los
Figura 8.1: Efectos de interacción de un haz de
trabajos de Boyde. electrones sobre un material.

8.1. Electrones y materia

Al igual que la luz sufre toda una serie de modi�ica-
ciones al interaccionar con la materia, los electrones
también sufren alteraciones al interaccionar con
ella, y es el estudio de estas alteraciones lo que va a
permitir conocer muchas de las características de la
materia en cuestión. Cuando un haz de electrones,
llamados electrones primarios, interacciona con la
materia puede suceder lo siguiente (Figura 8.1):
— Que los electrones sean absorbidos por la
materia.
— Que los electrones atraviesen la materia
sin sufrir modi�icaciones, y por ello reci-
ben el nombre de electrones transmitidos
o no dispersados.
— Que los electrones atraviesen la materia y
sufran dispersión al hacerlo. Esta disper-
sión puede ser elástica o inelástica.
— Que al impactar con la materia los electro-
nes reboten o, más correctamente, sean
retrodispersados (backscattered elec-
trons). Estos electrones retrodispersados
son los mismos electrones primarios que
formaban el haz de electrones primario.
— Que los electrones del haz arranquen
electrones de la muestra. Estos electrones
arrancados reciben el nombre de electro-
nes secundarios.
— Que los electrones del haz provoquen la
emisión de rayos X o de luz por parte de
los átomos de la muestra al impactar con
ellos.
— Que se provoque la emisión de los llama-
dos electrones Auger.
En la dispersión elástica, debido a la gran diferen-
cia entre la masa de los electrones incidentes y de
los núcleos atómicos bombardeados, los electrones
primarios no pierden energía cinética tras incidir
con la muestra por lo que su velocidad permane-
ce constante, cambiando únicamente su trayectoria.
En la dispersión inelástica, debido a la interacción
con la nube electrónica (orbitales) de los átomos
del material bombardeado, los electrones inciden-
tes sufren una notable pérdida de energía y las
trayectorias pueden ser perturbadas levemente.
8.2. Tipos de microscopios: fundamentos y
aspectos constructivos
En la introducción de este capítulo ya se han pre-
sentado los dos grandes tipos de microscopios
electrónicos: el TEM y el SEM. Además, sobre la
base de ambos, se han ido desarrollando diferen-
tes subtipos al incorporar y combinar diferentes
sistemas de detección; pero aquí solo se considera-
rán aquellos que poseen una aplicación reseñable
en el campo de las biociencias. No es el objetivo de
este capítulo extenderse en las diferentes variantes
de microscopios electrónicos cuya aplicación al es-
tudio de muestras biológicas se puede considerar,
a día de hoy, marginal. Por ello, además del TEM
y del SEM, también se estudiarán el microscopio
de transmisión y barrido (STEM), el microscopio
de barrido ambiental (ESEM, environmental SEM)
y los microscopios electrónicos de alto (HVEM) y
bajo voltaje (LVEM). Dentro del apartado dedicado
a cada microscopio se incluirán los dispositivos de
detección de electrones más usados en cada uno de
ellos, ya que son los que darán lugar a los diferentes

206

modos de funcionamiento de cada tipo de micros-
copio electrónico. De hecho, los detectores son la
base y parte principal de lo que se conoce como dis-
positivos microanalíticos que se incorporan en los
microscopios electrónicos y que se verán a conti-
nuación. En general los dispositivos de detección
son de dos tipos: pantallas �luorescentes, dedica-
das principalmente a estudios de tipo morfológico,
y detectores de electrones, fundamentalmente dise-
ñados para obtener datos analíticos.
8.2.1. El microscopio electrónico
de transmisión
La técnica TEM se basa en analizar los diferentes
haces de electrones transmitidos a través de una
muestra que resultan de la interacción entre dicha
muestra y un haz primario de electrones acelerados
bajo un elevado potencial eléctrico en condiciones
de vacío.
En la �igura 8.1 se observan los tipos básicos
de electrones transmitidos a través de una delgada
capa de material que permiten, según se consideren
unos u otros, realizar diferentes tipos de análisis.
De forma general puede decirse que la técnica TEM
permite dos tipos de análisis: el análisis de imagen
y el análisis de difracción. El análisis de imagen, que
no es otra cosa que la caracterización morfológi-
ca y ultraestructural de la muestra, utiliza dos tipos
de electrones dependiendo de la técnica emplea-
da: los electrones del haz directo si la técnica es el
campo claro (BF, brigth �ield), es decir, los electro-
nes que no han interaccionado con la materia, y los
electrones del haz dispersado elásticamente por la
materia si la técnica es el campo oscuro (DF, dark
�ield). El análisis de difracción (SAD o SAED, selec-
ted area electron diffraction) también se basa en la
detección de electrones dispersados elásticamente y
se verá en el último epígrafe de este tema. En la téc-
Figura 8.2: Imágenes TEM obtenidas de un mismo material cristalino (ZrCr2) tras aplicar las
técnicas BF, DF y SAD.
207
Microscopía electrónica
nica BF la formación de imagen se debe a un efecto
de oclusión: determinadas zonas de la muestra bio-
lógica, o de un determinado material, absorben o
evitan el paso de los electrones primarios y les im-
pide formar imagen sobre la pantalla. En la técnica
DF se usa una apertura de objetivo cuyo centro es
opaco a los electrones, por lo que excluye a los elec-
trones del haz central y a aquellos que han sufrido
una dispersión débil (inelástica); por tanto, solo los
electrones fuertemente desviados por la materia
(desviación elástica) impactarán en la pantalla y for-
marán imagen, por lo que el fondo de la misma será
oscuro, de modo análogo a la microscopía óptica de
campo oscuro. La técnica BF-TEM es la más común-
mente usada en biociencias, aunque también puede
usarse la técnica DF-TEM; por el contrario, los análi-
sis SAD son más empleados en ciencia de materiales.
En cualquier caso, en las tres técnicas la imagen se
forma cuando los electrones impactan con una pan-
talla �luorescente. En comparación con la técnica BF,
la técnica DF-TEM permite obtener una gran me-
jora en la formación de imagen y es especialmente
útil para el estudio de moléculas con poco contraste,
pues aumenta el contraste y la relación señal/ruido
hasta el punto de que se obtienen excelentes imáge-
nes sin necesidad de teñirlas con metales pesados.
En la técnica de difracción, mediante control
de apertura en el plano de imagen posterior del
objetivo (selección del área de difracción, SAD) se
selecciona un área virtual de la imagen objeto (di-
fractograma) y, tras atravesar los haces electrónicos
las lentes intermedias y proyectoras, se obtiene en la
pantalla �luorescente un conjunto de puntos (spots)
que representan a los planos cuasi-paralelos al haz
que cumplen con la ley de Bragg. Las distancias y
disposición geométrica entre estos spots son un
indicador de la estructura cristalina del material ob-
servado. Por ello, esta técnica es muy utilizada en el
análisis microestructural de materiales (Figura 8.2).
Métodos en biociencias

Con el TEM se pueden conseguir excelentes

resoluciones. Como ya es sabido, la resolución indi-
ca la distancia más pequeña que puede resolver el
microscopio y, además de la longitud de onda y de
la apertura angular, depende también de las lentes
electromagnéticas. La resolución de un microscopio
óptico viene dada por la expresión:

donde n es el coe�iciente de refracción, λ la longitud

de onda de la luz que utiliza y α la apertura angular.
En un MET el valor de n=1 pues utiliza lentes elec-
tromagnéticas, y senα≈α, por lo que la expresión
anterior queda:

Para hacerse una idea del poder de resolución de

un microscopio electrónico de transmisión están-
dar utilizado en análisis de muestras de materiales,
Figura 8.3: Esquema de un TEM.
considerando un potencial de 200 kV, una apertu-
ra angular de α=6.10-3 rad, y el valor de λ corregido
bajo un punto de vista relativista, la resolución teó-
rica sería de 0.0023 nm. Si la distancia habitual entre en la que, h es la constante de Planck (6.624·10-34
los centros de los átomos que constituyen una mo-
jouls/s), e la carga del electrón (1.60·10-19 cul.), m
lécula es de 0.1 nm, la perspectiva resulta increíble.
la masa del electrón (9.10·10-31 kg) y V el potencial
Sin embargo, en la práctica, la máxima resolución
acelerador (los microscopios estándar operan entre
de un microscopio electrónico de transmisión es de
10000V y 100000V). Para obtener el valor de λ para
0.2 nm, mil veces más que el microscopio óptico y
el caso de microscopios con potenciales acelerado-
un millón de veces más que el ojo humano. La cau-
sa de la pérdida de poder resolutivo se encuentra en res bajos (microscopios utilizados para muestras
la aberración esférica de las lentes electromagnéti- biológicas), se puede utilizar la expresión aproxi-
cas. No obstante, en los microscopios electrónicos mada (no se aplica la corrección relativista):
de alta resolución la corrección de esta aberración
ha permitido alcanzar valores de resolución de 0.05
nm.
Es conveniente recordar que la longitud de
onda que lleva asociada un electrón no es constante El aspecto constructivo general de un TEM se mues-
sino que depende de la velocidad a que se mueve y, tra en la �igura 8.3. En este tipo de microscopios se
por lo tanto, del potencial acelerador al que está so- pueden distinguir cinco sistemas fundamentales:
metido. Como la velocidad a la que se desplaza el
electrón en la cámara de vacío es muy grande –en — El sistema de emisión de electrones.
muchos casos comparable a la velocidad de la luz– — Las lentes electromagnéticas.
hay que considerar los efectos relativistas — El sistema portamuestras.
originados por este hecho, lo que implica que la lon- — El sistema de recogida de imágenes.
gitud de onda en función del potencial acelerador
— El equipo auxiliar de vacío.
será:

Sistemas de emisión de electrones

Existen dos tipos elementales de sistemas de emi-
sión (o fuentes) de electrones: emisión termoiónica

208

Figura 8.4: Filamento de emisión
de tungsteno.
y emisión de campo (FEG, �ield emission gun). Los
sistemas termoiónicos se basan en la emisión de
electrones desde un �ilamento calentado por resis-
tencia al ser recorrido por una corriente eléctrica,
y los más usados son los �ilamentos de tungste-
no (�igura 8.4) o de LaB6 (hexaberilio de lantano).
Este último, aunque más caro, ofrece mejores pres-
taciones que el de tungsteno y, además, mejora la
resolución. En los �ilamentos usados en los siste-
mas FEG la liberación de electrones se produce por
fuerzas electrostáticas, al aplicar elevados campos
eléctricos. La FEG puede ser de dos tipos, caliente y
fría. Los �ilamentos empleados en los sistemas FEG
son capaces de producir haces de electrones extre-
madamente �inos y coherentes, especialmente las
FEG frías (emplean como emisor de electrones cris-
tales de tungsteno), por lo que suelen emplearse en
sistemas de alta resolución; sin embargo, necesitan
ultra alto vacío. El tipo caliente, también llamado
tipo Schottky, usa emisores de óxido de Zr y es más
idóneo para estudios analíticos. El �ilamento, sea
el tipo que fuere, siempre funciona como un cáto-
do, por lo que un poco más abajo se suele disponer
el ánodo; y es la diferencia de potencial entre estas
dos estructuras la que se utilizará para acelerar los
electrones arrancados del �ilamento.
Lentes electromagnéticas
Las lentes pueden ser electrostáticas, donde el en-
foque de los electrones se produce mediante un
campo eléctrico, y electromagnéticas, mejores y
más comunes, donde es un campo magnético quien
actúa sobre el haz de electrones (�igura 8.5). En rea-
lidad una lente electromagnética es una bobina de
un material conductor –por la que pasará una co-
rriente eléctrica– con�inada en un cilindro metálico
con estructura de anillo y una hendidura para gene-
rar los dos polos del campo magnético.
El funcionamiento del conjunto de lentes de un
MET es análogo al de las lentes de un microscopio
209
Microscopía electrónica
Figura 8.5: Esquema de una lente
electromagnética. N y S represen-
tan los polos del campo magnético,
y la línea discontinua sus líneas de
fuerza.
óptico. En el TEM, generalmente y de arriba hacia
abajo, se colocan las siguientes lentes: dos lentes
condensadoras situadas por encima de la muestra,
una lente objetivo, una lente difractora, una lente
intermedia y una proyectora (a veces dos) entre la
muestra y la pantalla. Por debajo de la segunda len-
te condensadora y por debajo de la lente objetivo
se dispone una apertura, que es una placa metálica
con un agujero de un diámetro determinado (habi-
tualmente entre 30 y 200 μm) que sirve para excluir
los electrones que se alejan del haz central.
Al igual que el microscopio óptico, el TEM pre-
senta diferentes tipos de aberraciones como son
el astigmatismo, la aberración cromática y la abe-
rración esférica. El astigmatismo se produce por
la asimetría de los campos magnéticos generados
por las lentes electromagnéticas respecto a su eje,
lo que se traduce en la aparición de diferentes dis-
tancias focales dependientes de la orientación de
los haces electrónicos que atraviesan dichas lentes.
La aberración cromática aparece debido a la impo-
sibilidad de generar un haz electrónico puramente
monoenergético, por lo que dicho haz contendrá di-
ferentes longitudes de onda, generándose, a su vez,
diferentes distancias focales. La aberración esférica
se debe a que los haces que entran en la lente pa-
ralelos al eje de la misma no focalizan en el mismo
punto por salir de la misma con ciertas desviacio-
nes angulares, por lo que tiene un efecto similar al
de la aberración cromática. Las aberraciones cita-
das pueden atenuarse de distintas formas, como
son: mejoras constructivas en las lentes, utilización
de potenciales aceleradores muy estables, o utiliza-
ción de diferentes juegos de aperturas para limitar
los haces electrónicos.
Métodos en biociencias
Portamuestras
El portamuestras cumple una función análoga a
la platina del microscopio óptico y permite la in-
troducción de la muestra en la columna con una
mínima pérdida de vacío y el desplazamiento de la
misma, normalmente por los ejes X e Y. Para deter-
minados métodos de análisis se puede incorporar
un goniómetro motorizado que también permite
desplazamiento en el eje Z y la inclinación o balan-
ceo (tilt) de la muestra.
Pantalla de observación y sistema de recogida
de imágenes
El sistema de detección de electrones transmitidos,
como ya se ha visto anteriormente, emplea como
sistema de observación una pantalla fosforescen-
te. En el TEM convencional o de campo claro, donde
solo se detectan los electrones primarios transmi-
tidos que no han interaccionado con la materia, la
detección se hace por la fosforescencia que generan
los cristales de sulfuro o sulfato de Zn de una pan-
talla al impactar en ellos los electrones; obviamente
la resolución de la pantalla depende del tamaño de
los cristales de la sal de Zn y la luminosidad de cada
punto del número de electrones que impacten en
él. Esta pantalla fosforescente se ubica en la parte
inferior de la columna del microscopio y se puede
visualizar a través de una o varias ventanas acris-
taladas. Un sistema binocular (normalmente 10x)
permite observar la imagen con más detalle. Debajo
de la pantalla, que se puede retirar, se ubica el siste-
ma de captación fotográ�ico. Los primeros soportes
de la emulsión fotográ�ica fueron de cristal, luego
sustituidos por película de plástico y hoy día no se
usan pues lo habitual es disponer de cámaras que
permiten la obtención de imagen en formato digital.
Estas mismas cámaras van asociadas a monitores
de TV que hacen más cómoda la visualización de
las muestras. Las cámaras van interconstruidas y
su posición puede variar (más alta o baja) depen-
diendo del tipo de material a estudiar. El tipo de
cámara más usado es la que utiliza sensores CCD,
aunque también se usan cámaras de sensor CMOS
(para más información sobre estos sensores ver ca-
pítulo 16).
Equipo auxiliar de vacío
El sistema de vacío, como su nombre indica, sir-
ve para alcanzar altos valores de vacío (~10-5-10-6
bar) en las diferentes partes de la columna del TEM
(cámara de emisión, cámara de muestras y cáma-
210
ra de proyección), con el �in de que los electrones
no pierdan energía ni se dispersen por colisiones
con átomos de gases. Este alto vacío es producido
mediante unas bombas que pueden ser de difusión,
descarga iónica, turbomoleculares o criogénicas.
Los �ilamentos del tipo FEG necesitan ultra alto va-
cío (~10-10 bar) y por ello la utilización de cualquiera
de los dos últimos tipos de bombas. Es importante
señalar que las muestras han de soportar las condi-
ciones de alto vacío ya que puede darse el caso de
que, bajo esas condiciones, la muestras estallen al
ser bombardeadas por electrones.
Funcionamiento general del TEM
A grandes rasgos, el funcionamiento del TEM con-
vencional es el siguiente: el sistema de emisión
de electrones genera un haz de electrones prima-
rio con una intensidad comprendida entre 10-9 y
10-6 A. Estos electrones son acelerados por medio
de un potencial eléctrico que puede variar entre 10
y 200 kV, a la vez que son con�inados mediante un
sistema de lentes electromagnéticas y aperturas
hasta formar haces de anchuras comprendidas en-
tre 1 y 10 nm. Este haz primario interacciona con
la muestra, generando una serie de haces transmi-
tidos y dispersados que, tras un sistema de control
de apertura de la lente objetivo, son selecciona-
dos y posteriormente ampli�icados por las lentes
electromagnéticas intermedias y proyectoras, con-
siguiendo magni�icaciones comprendidas entre
2500 y 100000 aumentos. Una vez que los electro-
nes alcanzan la pantalla, la emisión de luz de cada
punto dependerá del número de electrones que
impacten en ella. De este modo se generará una
imagen con puntos que van desde muy luminosos
hasta totalmente oscuros, en el caso de que en dicho
punto no impacte ningún electrón.
8.2.2. El microscopio electrónico de barrido
La microscopía electrónica de barrido se basa en el
análisis de imagen que aportan dos de los haces re-
presentados en la �igura 8.1, concretamente, el haz
de electrones retrodispersados (BSE), y el haz de
electrones secundarios (SE). Los BSE (dispersión
elástica) pertenecen al haz primario de electrones
y emergen al ser dispersados por los átomos de las
capas profundas de la muestra, por lo que no son
útiles a la hora de realizar análisis morfológicos me-
diante imágenes topográ�icas. Sin embargo, como
este tipo de interacción depende de la energía de los
electrones incidentes (E) y del número atómico (Z)
de los átomos bombardeados, los BSE pueden ser
 Microscopía electrónica

utilizados para diferenciar los distintos elementos

que componen el material y ser la base de estudios
cualitativos y cuantitativos.
La emisión de SE (dispersión inelástica) se pro-
duce por un efecto de ionización cuando los átomos
del material que hace de blanco son bombardeados
por un haz incidente. Los electrones así emitidos
pertenecen a las capas más externas de los átomos,
por lo que se les asocian energías muy bajas (~50
eV). Este hecho implica que estos electrones serán
altamente de�lectables, además de que, al no poder
recorrer largos trayectos, poseerán una alta capa- Figura 8.6: Diferentes formas que adopta el volumen de
cidad de resolución. Por lo tanto, el haz de SE será interacción del haz primario con el material de la mues-
muy útil a la hora de caracterizar morfológicamen- tra según la energía del haz incidente.
te a los materiales, y por ello se emplea para formar
imagen. Existen tres tipos de SE: SE1, SE2 y SE3. Los
SE1 se generan en la super�icie de la muestra, exac-
duzca una interacción es considerable, por lo que
tamente en el punto de impacto del haz. Los SE2 lo
un electrón podría ser dispersado varias veces. Los
hacen algo alejados del punto de impacto debido a
factores a tener en cuenta en la determinación del
fenómenos de dispersión de los electrones del haz
volumen de la muestra que interacciona con el haz
en el interior de la muestra. Los SE3 son generados
y la profundidad de penetración del haz son: la in-
por los BSE al impactar con las paredes de la cáma-
tensidad del haz primario (número de electrones),
ra o con el recubrimiento metálico de la última lente
el voltaje acelerador (kV) y el número atómico en
electromagnética.
promedio del material bombardeado. El resultado
Considerando la misma expresión que se ha
de la interacción es un volumen con forma de globo
empleado para calcular la resolución de un TEM, la
donde el cuello se sitúa en la super�icie del mate-
resolución teórica de un SEM que utilice un potencial
rial analizado. La �igura 8.6 muestra la forma de este
acelerador de 25 kV y α=6.10-3 rad será de 0.3 nm, al-
volumen según la energía del haz incidente y el nú-
rededor de 100 veces menos que la resolución del
mero atómico del material (Z). La profundidad de
TEM.
penetración electrónica suele estar comprendida
Una característica a tener en cuenta en un SEM
entre 1 y 5 µm siempre y cuando el haz incida per-
es la profundidad de campo, que puede de�inir-
pendicularmente sobre la muestra.
se como la diferencia de altura que hay entre dos
planos de la muestra que presentan la misma cali- Los elementos constructivos más destacables
dad de foco, y que generalmente puede considerase que conforman un SEM se pueden observar en la �i-
~1 µm. Al igual que la resolución, también depende gura 8.7 y, en general no di�ieren demasiado de los
de las lentes del microscopio, si bien es convenien- utilizados en el TEM pues también incluyen un sis-
te indicar que la profundidad de campo aumenta si tema de emisión de electrones, un sistema de lentes
aumentan el voltaje de aceleración y la distancia de electromagnéticas que no incluye lentes proyecto-
trabajo. ras, un portamuestras y un sistema para generar
vacío; sin embargo, existen algunas particularida-
Otro factor a tener en cuenta en el análisis de
muestras de materiales mediante el SEM es el vo- des como son el sistema para hacer el escaneo, los
lumen de material de la muestra afectado por la detectores de electrones y el sistema de obtención
incidencia de los electrones. Dicho volumen depen- de imágenes.
de de determinados factores y estará limitado por El portamuestras tiene como particularidad
la pérdida de energía de los electrones incidentes su gran movilidad pues permite desplazamientos
al actuar inelásticamente con el material y tam- relativamente grandes en las tres direcciones del
bién por la pérdida de electrones retrodispersados espacio, hecho ineludible debido al empleo del SEM
elásticamente en el mismo. La probabilidad de in- en estudios de tipo topográ�ico que pueden incluir
teracción de un haz electrónico con un átomo o ión muestras de tamaño considerable; por ejemplo, in-
de la muestra es muy baja, pues la sección e�icaz del sectos completos.
haz es muy pequeña (~10-4 pm2); sin embargo, al El haz de electrones es muy estrecho (0.2 - 5
existir un gran número de átomos en una pequeña nm) para poder enfocarlo sobre un solo punto, por
porción de material, la probabilidad de que se pro- ello es necesario barrer punto por punto (escanear)

211
Métodos en biociencias
Figura 8.7: Esquema constructivo de un microscopio elec-
trónico de barrido. Modi�icado del dibujo tomado de la pá-
gina www4.nau.edu.
toda la super�icie escogida de la muestra que se
quiere analizar. Para ello, el SEM incorpora unas bo-
binas de escaneo que rodean al haz de electrones de
modo que al variar el potencial entre ellas se produ-
ce la de�lexión del haz de electrones. Estas bobinas
están dirigidas por un dispositivo, denominado ge-
nerador de escaneo, que va sincronizado con el haz
que forma la imagen en el tubo de rayos catódicos
(CRT, cathode ray tube) empleado para formar la
imagen. Esta sincronización hace que haya una co-
rrespondencia entre cada punto de escaneo de la
muestra con cada punto de la imagen de la pantalla.
Un CRT es un dispositivo en el que un haz de rayos
catódicos es dirigido hacia un cristal (la pantalla)
recubierto internamente de fósforo (emite luz) y
plomo (apantalla los rayos X). Los dispositivos CRT
ya no se emplean en los modernos SEM, pues han
sido sustituidos por pantallas planas de tipo TFT,
LCD, plasma o LED.
Parece obvio que en la cámara de vacío del
SEM se pueden incluir tantos tipos de detectores
como tipos de emisión causa el impacto del haz de
electrones primario. No obstante lo más usual es
utilizar dos tipos de detectores, los detectores de
electrones secundarios, también llamados detecto-
res Everhart-Thornley (ETD), y los detectores para
electrones retrodispersados (BSED); otros tipos de
detectores son los de rayos X, que se verán después,
y los catodoluminiscentes. Un ETD típico se ubica
212
Figura 8.8: Esquema de un detector ETD. La estructura del
fotomultiplicador se detalla en el capítulo 11 (Figura 11.6).
lateralmente a la muestra y está formado por una
caja de Faraday (mantenida con potencial positi-
vo) colocada frente a un centellador (dispositivo
que emite luz al ser excitado por radiación ionizan-
te) acoplado a un fotomultiplicador que genera una
señal eléctrica de salida proporcional al número de
electrones colectados por la caja de Faraday (Fi-
gura 8.8). Una variante del ETD son los detectores
ubicados en el interior de la última lente electro-
magnética (ILD, in-lens detector) que solo captan
SE1 y generan imágenes con su super�icie muy me-
jorada. Los BSEDs se suelen ubicar encima de la
muestra para facilitar la captación de electrones re-
trodispersados, y los hay de dos tipos: de centelleo
y semiconductores.
Los detectores de rayos X son la base del modo
de análisis EDS (energy dispersive spectroscopy),
también denominada EDX (energy dispersive X-ray).
Esta técnica se basa en la detección y medida de la
radiación de rayos X que emergen de un material al
ser excitado mediante un haz de electrones su�icien-
temente energético. EDS es una técnica de análisis
cualitativo/cuantitativo con la que puede conocer-
se la composición de un determinado material. El
mecanismo de emisión de rayos X se basa en la inte-
racción inelástica de aquellos electrones primarios
lo su�icientemente energéticos como para producir
transiciones en los átomos de los elementos pre-
sentes en el material, posibilitando la emisión de
fotones con energías en la franja de los rayos X. La
energía y la intensidad de esta emisión son los pa-
rámetros que permiten determinar la composición
del material a estudio.
La energía de los rayos X dispersados se mide
mediante un detector –es muy común el detector de
Si(Li)– en el que los rayos X inciden sobre un mate-
rial sensible creando fotoelectrones que, a su vez,
disipan su energía mediante la generación de pa-
res electrón-hueco. El número de pares generado
es directamente proporcional a la energía fotóni-
ca incidente. Los espectros de emisión de rayos X

pueden ser analizados a varios niveles: un nivel cua-
litativo, identi�icando los elementos del compuesto
mediante sus energías características de emisión;
un nivel semicuantitativo, que además de tener en
cuenta las energías características, también con-
sidera las intensidades de emisión a la hora de
establecer una relación entre el elemento y su con-
centración; por último, un nivel cuantitativo, en el
que, antes de analizar la composición del material,
se exige la aplicación de métodos de corrección con
el �in de evitar el efecto que la matriz del material
causa en la intensidad de los rayos X emitidos por
cada uno de los elementos.
Cuando se quiere determinar con precisión la
composición de un compuesto es frecuente utilizar
la técnica denominada espectrometría de dispersión
de longitud de onda (WDS, wavelength dispersi-
ve spectrometry). Los fundamentos en que se basa
esta técnica son los mismos que los expuestos para
EDX, y lo que únicamente cambia es el sistema de
detección de rayos X del microscopio: en este caso
el sensor capta los rayos X difractados por un cristal
que cumplan con la condición de Bragg, por lo que
la discriminación energética viene dada según la
longitud de onda de la radiación emitida. Tanto las
técnica EDS como WDS pueden ser empleadas para
el análisis cuantitativo; sin embargo, en compues-
tos en los que sus elementos constitutivos posean
líneas de emisión de similar energía, resulta mucho
más e�icaz utilizar WDS ya que con esta técnica no
se necesita realizar correcciones para evitar las im-
precisiones surgidas por el solapamiento de picos
(la técnica WDS permite discriminar líneas con una
precisión de ~5 eV, frente a los ~150 eV de EDS).
También WDS ofrece una mayor precisión que EDX
en las medidas de composición de compuestos con
elementos ligeros, llegando a alcanzarse límites de
detección comprendidos entre 300 y 30 ppm.
Por último, después de analizar con un cier-
to detalle algunos de los detectores que incorporan
los microscopios de barrido –y que también pueden
incorporar los de transmisión– es conveniente des-
cribir de modo general el funcionamiento básico de
uno de estos microscopios. El haz de electrones se
obtiene a partir de un �ilamento en condiciones ho-
mologables a la del TEM pues es necesario un alto
voltaje y un alto vacío. Una vez obtenido el haz de
electrones, este es convenientemente enfocado so-
bre un punto de la muestra mediante un sistema
de lentes electromagnéticas. La muestra se ubica
en una cámara, llamada por ello cámara de mues-
tras, donde también se localizan los distintos tipos
de detectores diseñados para analizar los diferentes
tipos de señales que se generan tras el impacto del
213
Microscopía electrónica
haz de electrones con la muestra. Dado que el haz
se enfoca sobre un punto de pequeño diámetro es
necesario ir barriendo (escaneando) toda la mues-
tra con el haz. La señal proveniente de cada punto
de barrido es captada por los detectores y estará
sincronizada con el sistema de formación de ima-
gen. Por ello habrá una correspondencia entre cada
punto de escaneo de la muestra y cada punto de la
imagen. Con todo esto queda claro que el microsco-
pio de barrido no es un instrumento óptico ya que
las lentes no forman imágenes, pero emplea la ópti-
ca electrónica para formar el haz de electrones. La
imagen se forma con la utilización de detectores es-
pecí�icos.
8.2.3. El microscopio electrónico
de transmisión y barrido
El STEM (scanning transmission electron microsco-
pe) es una variante de los TEM convencionales que,
en vez de abrir el haz de electrones para iluminar de
forma simultánea todo el área de la muestra, lo que
hace es utilizar una fuente de electrones tipo FEG
que genera un haz de electrones muy �ino (menos
de 0.2 nm) que va barriendo la muestra punto por
punto. Ello le permite mezclar análisis ultraestruc-
tural de imagen en modo TEM, ya sea en modo BF o
DF, con datos cualitativos y cuantitativos obtenidos
por los modos básicos de funcionamiento del SEM:
EDX, ADF y EELS. No es extraño encontrar de�ini-
ciones de este aparato considerándolo al revés: una
variante del SEM al que se incluye la transmisión.
La microscopía electrónica de campo oscuro
(DF) se puede implementar en el TEM, como ya se
ha visto anteriormente, y en el STEM. En este último
caso es usual utilizar un detector anular de campo
oscuro (ADF, annular dark �ield) que tiene un aguje-
ro en su centro y capta los electrones dispersados
elásticamente. Existen detectores anulares de cam-
po oscuro de alto ángulo (HAADF) cuyo agujero en
el centro es mayor. Esto permite colectar electro-
nes con un gran ángulo de dispersión y obtener
imágenes donde el contraste depende del número
atómico del elemento que dispersó los electrones
(contraste Z). La técnica ADF-STEM genera imáge-
nes estructurales, pero además permite obtener
imágenes basadas en datos analíticos llegando has-
ta determinar la masa de moléculas pequeñas. Es
importante hacer notar que en la técnica DF-TEM el
dispositivo que genera el campo oscuro está antes
de la muestra pues es una apertura con su centro
obturado; sin embargo, en la técnica ADF-STEM el
detector está por debajo de la muestra.
Métodos en biociencias

La espectroscopía que estudia la pérdida de

energía de los electrones (EELS, electron ener-
gy loss spectroscopy) es una técnica analítica que
mide cambios en la energía cinética de los electro-
nes transmitidos y dispersados inelásticamente al
interaccionar con la materia. Para ello emplea un de-
tector que funciona como un espectroscopio, pues
lleva a cabo un análisis de la distribución de energía
que llevan asociados los electrones tras su interac-
ción con un punto de la materia, lo que le permite
suministrar información química y ultraestructural.
Además de datos sobre composición atómica, tam-
bién permite obtener datos sobre valencia, estado
de oxidación, enlace o propiedades conductivas del
punto estudiado. Si se compara con el análisis me-
diante EDX, EELS posee una mayor sensibilidad y
una mejor resolución espacial; además, por traba-
jar mejor con elementos de número atómico bajo,
Figura 8.9: Esquema constructivo de un
es especialmente útil para el estudio de muestras ESEM. Es destacable la variación de presión
biológicas. La sonda espectroscópica, o detector que hay a lo largo de la columna (Pa: Pascal).
EELS, se puede incorporar en TEM, pues trabaja Modi�icación del esquema tomado de JAIC
online 33(2):171–184 1994.
con electrones transmitidos, pero sobre todo lo sue-
len llevar los STEM, por eso se ha incluido en este
apartado. Es usual que el detector ADF y el detec-
tor EELS se integren en el mismo sistema. Aún más, un sistema de bombeo diferencial para retrasar al
en este tipo de microscopio es muy habitual que los máximo la interacción del haz de electrones con el
diferentes detectores que lleva acoplados trabajen gas de la cámara de muestras y evitar, en lo posi-
de forma simultánea, lo que evita tener que hacer ble, la aparición de fenómenos de dispersión son las
repetidos escaneos sobre la muestra, y ofrece la cer- dos diferencias más notables (Figura 8.9). Una vez
teza de saber que los diferentes datos obtenidos son que el haz de electrones incide con la muestra, en
exactamente del mismo punto. los ESEM comerciales al menos pueden ser analiza-
das cuatro tipos de emisiones: SE, BSE, rayos X y luz
(cátodoluminiscencia).
8.2.4. El microscopio electrónico de barrido
El uso del ESEM tiene las siguientes ventajas:
ambiental
(a) permite la observación de muestras líquidas
El primer microscopio electrónico de barrido pues a la presión ordinaria de trabajo, mayor de 609
ambiental convencional (ESEM, environmental scan- Pa, el agua se mantiene en fase líquida a temperatu-
ning electron microscope) aparece en 1988 y su ras superiores a 0 ºC, (b) las muestras no han de ser
característica más peculiar es permitir el análisis de conductoras por lo que no hay que metalizarlas, y
muestras «húmedas», es decir, la posibilidad de ob- (c) el gas que rodea la muestra también puede dar
servación de la muestra sin la necesidad de aplicar información. Todo ello permite una observación de
un tratamiento preparatorio complejo que puede las muestras biológicas más fácil y rápida y evita los
causar alteraciones. Ello conlleva la existencia de posibles artefactos que pudiesen surgir en la prepa-
un ambiente gaseoso en la cámara de muestras del ración de las mismas; de hecho, algunas muestras
microscopio y, por tanto, la falta de vacío en dicha biológicas pueden mantenerse vivas durante la ob-
cámara. En realidad, la muestra biológica se mantie- servación.
ne hidratada debido a que el ambiente de la cámara
contiene vapor de agua a saturación. 8.2.5. Microscopios electrónicos de bajo y alto
Para obtener imágenes de la muestra en es- voltaje
tas condiciones es necesario introducir variantes
técnicas si se compara el ESEM con los SEM con- Los microscopios de bajo voltaje trabajan con po-
vencionales. El uso de detectores más e�icientes y tenciales de aceleración que oscilan entre 1 y 5 kV
adaptados al ambiente gaseoso de la cámara (GDD, y alcanzan resoluciones entre 2 y 3 nm. Los que se
gaseous detection device), y la incorporación de comercializan actualmente combinan la posibili-

214

dad de trabajar en modo TEM, SEM, STEM y SAED,
y emplean un emisor de electrones tipo FEG. La
característica más relevante de este tipo de mi-
croscopía electrónica es la obtención de imágenes
mucho más contrastadas sin necesidad de tinción.
En este tipo de dispositivos los electrones tienen
una interacción mucho más intensa con la materia,
lo que conlleva una dispersión más potente y per-
mite la obtención de imágenes más contrastadas.
Finalmente, es usual combinar estos microscopios
con un sistema de microscopía óptica muy e�icien-
te que permite una mejor observación de la pantalla
�luorescente que se usa en modo TEM. El hecho de
usar voltajes de aceleración tan bajos permite dise-
ños de tamaño tan pequeño que los LVEM pueden
ser colocados en los tableros de las mesas conven-
cionales de laboratorio (Figura 8.10).
En microscopía de alto voltaje (HVEM) los
microscopios operan con voltajes de aceleración
que oscilan entre 1000 y 1500 kV. La microsco-
pía electrónica que emplea voltajes de aceleración
superiores, de hasta 3000 kV, se ha denominado mi-
croscopía electrónica de ultra alto voltaje (UHVEM).
El primer HVEM se construyó en 1947 y se utilizó
en estudios relacionados con ciencias de materia-
les; no fue hasta 1960 cuando la HVEM se aplicó al
estudio de muestras biológicas. El principal bene-
�icio de esta potente aceleración de los electrones
es una mejora en su poder de resolución; en modo
TEM alcanzan 0.1 nm y 2 nm en modo STEM. La me-
jora en el poder de resolución se debe a una menor
aberración por parte de las lentes electromagnéti-
cas y a una menor dispersión de los electrones en
el interior de la muestra. Por todo ello, a estos mi-
croscopios también se les ha denominado TEM de
alta resolución (HRTEM). La alta aceleración que
llevan los electrones les dota de un mayor poder de
penetración, por lo que pueden atravesar muestras
más gruesas (secciones de hasta 5 μm, o microor-
ganismos enteros), lo que a su vez permite análisis
tridimensionales. Al contrario que los LVEM, los
HVEM son aparatos de gran tamaño pues su co-
lumna puede medir varios metros y necesitan salas
especiales, no solo por su tamaño, pues también ne-
cesitan aislarse de las posibles vibraciones de su
lugar de ubicación (Figura 8.10).
8.3. Procesamiento del material
para su estudio al microscopio
electrónico
En la primera parte de este tema se han analizado
los diferentes tipos de microscopios electrónicos
215
Microscopía electrónica
Figura 8.10: Imágenes de un HVEM (izquierda) modelo JEOL
ARM–1000 (imagen tomada de www.eels.kuicr.kyoto–u.ac.jp), y
de un LVEM (derecha) modelo LV EM5. Imagen tomada de www.
lv–em.com.
y sus modos de funcionamiento. El objetivo de la
parte que aquí se inicia es estudiar las diferentes
técnicas de procesamiento del material biológico,
teniendo presente que el �in que todo tipo de proce-
samiento persigue es preparar la muestra biológica
para permitir su observación en un determinado
modo de análisis. No se pretende hacer una descrip-
ción exhaustiva de los diferentes procedimientos, y
mucho menos incluir protocolos de desarrollo de
los mismos; nuestro objetivo es hacer entendible el
fundamento de la preparación de las muestras, pri-
mando la explicación de las razones que justi�ican
los diferentes tratamientos que sufre la muestra en
cada modo de proceder.
A continuación se considerarán los proce-
dimientos de uso más común en el análisis de
muestras en microscopía electrónica aplicada a las
biociencias:
— Técnica de rutina en TEM.
— Técnica de rutina en SEM.
— Sombreado.
— Criofractura.
— Criograbado.
— Tinción negativa.
— Microscopía crioelectrónica.
8.3.1. Técnica de rutina para TEM
Por técnica de rutina en TEM convencional se en-
tiende el procedimiento que se sigue para obtener
y observar secciones que permitan el análisis ul-
traestructural de células y tejidos en modo BF. Se
seguirá, en lo posible, un desarrollo análogo al em-
Métodos en biociencias
Figura 8.11: Imagen de un ultramicrotomo de la marca Reichert–Jung, modelo Ultracut E.
pleado en el capítulo anterior, donde se estudió la
obtención de secciones para su observación al mi-
croscopio óptico.
El proceso de �ijación, dado el nivel ultraes-
tructural del análisis, ha de ser optimizado y por
ello, siempre que se pueda, se utiliza la perfusión
transcardial. El �ijador más usado es el glutaral-
dehído (entre 2.5 y 5%) en diferentes tampones
(Milloning, Sorensen, cacodilato, fosfato...); también
son utilizadas mezclas de paraformaldehído y glu-
taraldehído. Tras la �ijación en el aldehído se suele
post�ijar en O4Os ya que es un excelente �ijador para
lípidos y, además, por su alta densidad electrónica,
con�iere buen contraste a las muestras.
Una vez eliminados los restos de �ijador sigue
el proceso de deshidratación de la muestra; pero en
lugar de hacerlo con alcohol se suele usar acetona,
que garantiza una mejor deshidratación. La deshi-
dratación se termina con óxido de propileno como
líquido intermedio entre el agente deshidratante y
el medio de inclusión. Las piezas han de incluirse
en materiales más duros que la para�ina para que
permitan la obtención de secciones mucho más del-
gadas; normalmente son plásticos o resinas como
araldita, lovicril, epon, vestopal, durcupan... La pre-
paración de estas resinas necesita la mezcla de dos
o tres componentes: la base del polímero, acelera-
dores y endurecedores. El procedimiento a seguir
está perfectamente indicado por la empresa que
comercializa el producto, y permite obtener dife-
rentes grados de dureza. Suelen ser inclusiones
largas pues la penetración es lenta, por lo que se
suelen ayudar con un calentamiento suave para
facilitarlas ya que el calor �luidi�ica el material de
inclusión. Acabada la inclusión se deja polimerizar
la resina o el plástico; este proceso se puede acele-
rar utilizando procedimientos que dependen de la
resina usada, entre ellos la exposición a luz UV, o el
calentamiento a 60 ºC.
216
Antes de la obtención de los cortes de�initi-
vos que se observarán en el TEM es usual realizar
cortes semi�inos. Estas secciones tienen un grosor
entre 0.3 y 0.5 μm, se tiñen con azul de toluidina y
se observan al microscopio óptico. El objetivo del
corte semi�ino es comprobar el estado de �ijación
del material, su orientación y lo que contiene, pues
el tamaño de las piezas suele ser de 2 o 3 mm y di�i-
culta su orientación; además, el O4Os las ennegrece
y di�iculta la identi�icación de su contenido. Una vez
escogida el área a observar se elimina el resto, es
decir, se retalla el bloque. Con ello se consigue ob-
tener áreas de corte no mayores de 0.3 mm de lado,
pues en super�icies mayores es di�ícil obtener bue-
nos cortes ultra�inos. Las secciones de�initivas han
de ser extremadamente delgadas para permitir el
paso de los electrones a su través. El aparato que
permite la obtención de secciones de hasta 50 nm
de espesor es el ultramicrotomo; los cortes semi�i-
nos también se obtienen en él.
El ultramicrotomo (Figura 8.11) tiene dos
componentes esenciales: la cuchilla y el sistema de
avance. La cuchilla puede ser de vidrio o de diaman-
te y lleva una balsa con agua donde se recogen los
cortes (Figura 8.12). La cuchilla y el bloque porta-
muestras son orientables, y el sistema de avance es
de alta precisión; actualmente de tipo mecánico, a
diferencia de los primeros microtomos donde era
térmico. Por todo ello, el ultramicrotomo se colo-
ca sobre mesas especiales que poseen dispositivos
para evitar posibles vibraciones. Una vez seleccio-
nados los cortes �inos, proceso que se lleva a cabo
por el color de los mismos, los cortes más gruesos
son eliminados de la balsa. Los cortes gris mate y
plateados son los más �inos, los dorados y púrpura
son más gruesos.
Los cortes seleccionados se estiran con vapo-
res de toluol para anular el efecto de compresión del
corte y se recogen por contacto con una rejilla. Para
 Microscopía electrónica

Figura 8.12: En la zona superior se incluyen imágenes con diferentes modelos de balsas tomadas de
diferentes páginas web de casas comerciales. La imagen de la derecha corresponde a una cuchilla de
diamante. En la zona inferior se incluyen dos imágenes de las piezas implicadas en la obtención de
secciones (www.wcbio.science.ru.nl). Las secciones obtenidas quedan �lotando en el agua de la balsa.

facilitar el proceso de recogida se aumenta el nivel
de agua de la balsa hasta formar una super�icie con-
vexa de modo que los cortes se sitúan en la parte
más alta. Las rejillas suelen tener 3 mm de diáme-
tro y 18 μm de grosor, y el número de agujeros y
la estructura de la rejilla puede variar; el material
en que están construidas también pues pueden ser
de cobre, níquel (indicadas para inmunomicrosco-
pía electrónica), oro, molibdeno… Las más usuales
son de rejilla cuadrangular y de 100 o 200 agujeros
pero las hay de rejilla hexagonal o rectangular; tam-
bién las hay solo con barras o de un único agujero
(Figura 8.13). Para evitar que las secciones o partes
de ellas se puedan perder o doblar en los agujeros
de la rejilla, especialmente si estos son grandes, se
cubre la rejilla con una �ina capa de un plástico lla-
mado formvar cuyo espesor suele ser de 1.7 nm.
Por la propia naturaleza del material biológi-
co y su extremada delgadez, el corte tiene muy poco
contraste. La �ijación con O4Os lo aumenta, pero el
contraste de la muestra ha de ser mejorado para
su observación, por ello se ha de teñir el material
que hay en la rejilla con sustancias electrodensas.
Las dos más utilizadas son el acetato de uranilo y el
citrato de plomo. La preparación de estos produc-
tos y el proceso de tinción ha de ser muy cuidadoso
para evitar la formación de precipitados o cristales
que podrían impedir la correcta visualización de la
muestra. Una vez secas y tras eliminar los restos de
las sales de contraste mediante lavados, las rejillas
se pueden observar al TEM. Los puntos por los que
electrones atraviesan la muestra se proyectarán has-
ta alcanzar la pantalla �luorescente donde se verán
como puntos luminosos. Sin embargo, cuando los

Figura 8.13: Tipos de rejillas. (A) Rejillas de red cuadrada con diferente número de agujeros. (B) Rejilla de red
hexagonal. (C) Rejillas de barras. (D) Rejillas dobles (se pueden doblar) con diferente o igual número de agujeros
en cada cara. (E) Rejillas con un único agujero circular o alargado.

217
Métodos en biociencias
electrones del haz impactan contra las sales de
metales pesados utilizadas para contrastar, estas
impiden la transmisión de electrones y la proyec-
ción de esos puntos de la muestra en la pantalla, lo
que conlleva la aparición de puntos oscuros, pues
en ellos no impactan los electrones. Dichos puntos
serán más o menos oscuros en función de la con-
centración de dichas sales. La estructura trilaminar
de la membrana (2 regiones oscuras periféricas y
una clara o luminosa central) es un perfecto ejem-
plo de este proceso de formación de imagen. El O4Os
se deposita en la zona de las cabezas polares de los
lípidos de membrana por lo que los electrones no
atraviesan esas zonas y generan dos bandas oscuras
externas. En la zona central de la membrana, donde
se sitúan enfrentadas las colas de los ácidos grasos
que forman los fosfolípidos, no se depositan las sa-
les de contraste, se permite el paso de los electrones
y por ello aparece como una zona clara.
8.3.2. Técnica de rutina en SEM
Por técnica de rutina en el SEM convencional se
entiende la metalización de las muestras para su
análisis topográ�ico y la detección de electrones
secundarios para formar imagen. Las muestras bio-
lógicas no son conductoras, hecho que va unido a
una alta hidratación y una baja consistencia. Do-
tarles de conductividad obliga a recubrirlas de una
película metálica (metalización), pero para ello han
de estar secas. Los datos que se obtienen con este
modo de proceder son de tipo topográ�ico por lo
que es muy importante que las super�icies a obser-
var no estén contaminadas por sustancias externas
y no hayan sufrido alteraciones al preparar la mues-
tra.
Figura 8.14: (A) Unidad de secado al punto crítico de la marca Polaron (CPD7501). (B) Unidad de metalización
de la marca Polaron (E5400); la �igura C es un detalle con la cámara de metalizado abierta para permitir la
visualización del cátodo y del portamuestras.
218
La �ijación del material biológico ha de ser de
alta calidad; de hecho, el procedimiento de �ijación
de las muestras biológicas que lo requieren es muy
similar al modo de proceder en la técnica de rutina
del TEM. Tras la �ijación se sigue un procedimiento
de deshidratado y secado necesario para la poste-
rior metalización de la muestra. En un principio se
utilizaban series crecientes de alcohol o acetona y
secado �inal al vacío, procedimiento que causaba no
pocas alteraciones morfológicas en la muestra. Un
buen ejemplo para ilustrarlo es lo que ocurre cuan-
do se deja caer una gota de agua sobre un folio de
papel: en el proceso de secado el papel se acaba on-
dulando y variando su forma en la zona donde se
depositó la gota. Estos cambios estructurales pare-
cen ser ocasionados por el gradiente de fuerza de
tensión super�icial tan alto que existe en la interfa-
se entre zonas húmedas (mojadas por H2O) y secas.
Para evitar esto, Anderson (1951) diseñó la técni-
ca de secado al punto crítico (critical point drying).
Este procedimiento se realiza en una bomba de se-
cado (Figura 8.14) y en él se sustituye el agua del
tejido por un líquido deshidratante y después por
un gas bajo presión que está en fase líquida y que
tiene una muy baja tensión super�icial. El líquido
deshidratante, además de eliminar el agua, también
actúa como líquido intermedio pues es miscible
con el gas en fase líquida. Los líquidos deshidratan-
tes más usados son acetona, amilacetato, etanol y
metanol. Una vez que la muestra está bañada por
el gas en fase líquida se le hace alcanzar el punto
crítico, que es aquel donde a una temperatura y
presión determinada este compuesto en fase líqui-
da se transforma en gas. El espécimen termina seco
sin distorsiones apreciables, pues bajo estas con-
diciones la tensión super�icial de la fase líquida es

Figura 8.15: Esquema que ilustra un proceso de metalizado (parte superior) y otro
sombreado (parte inferior).
muy baja, en torno a cero. El gas más universalmen-
te empleado es CO2 (punto crítico 32 ºC, 74 bares),
pero también lo son el NO2 o el Freón 13. Uno de los
problemas más comunes en el secado al punto críti-
co al utilizar CO2 es el colapso del material biológico
que se produce al someter la muestra a presión si
en su interior quedan burbujas de aire. Es necesa-
rio considerar que solo cuando toda la muestra está
perfectamente mojada, la presión en cualquier pun-
to de la misma es cero.
El metalizado se lleva a cabo para hacer con-
ductiva la muestra biológica, pero también sirve
para dotarla de cierta consistencia pues el material
biológico seco es, en muchos casos, bastante que-
bradizo. La metalización consiste en recubrir total y
absolutamente toda la super�icie de la muestra con
una �ina capa de metal, normalmente oro, oro-pa-
ladio o platino. El procedimiento se realiza en un
aparato llamado metalizador (Figura 8.14), que
trabaja al vacío y posee un �ilamento del metal ele-
gido para recubrir la muestra en posición cenital,
de modo que al someterlo a un alto voltaje (3-5 kV
es un voltaje usual) se evapora y emite átomos de
modo análogo a como funciona un spray de pintura.
La muestra se sitúa en un soporte que permite mo-
verla y ladearla para facilitar el metalizado. La capa
de metal suele oscilar entre 5 y 20 nm de grosor, de
modo que garantice conductividad y estabilidad; ca-
219
Microscopía electrónica
pas más gruesas pueden hacer perder detalles de la
super�icie de la muestra.
La capa metálica que recubre la muestra bio-
lógica recibe el nombre de réplica. En el caso actual,
dado que los electrones no han de atravesar la mues-
tra, se suele dejar que réplica metálica y muestra
biológica permanezcan juntas (Figura 8.15).
8.3.3 Sombreado
El sombreado (shadowing) se puede de�inir como un
recubrimiento metálico no completo de la muestra
biológica debido a que el �ilamento de metalización
se encuentra lateralizado y la muestra no se mueve.
Ello hace que la réplica metálica no sea continua ni
completa, pues las propias irregularidades de la su-
per�icie de la muestra junto con la lateralización del
�ilamento metalizador hacen que se generen zonas
de sombra donde no se produce la metalización; de
modo análogo a una luz que ilumina lateralmente
un objeto rugoso genera en él zonas iluminadas y
zonas de sombra.
Esta técnica es muy útil para el estudio de
especímenes biológicos muy pequeños, como molé-
culas, estructuras subcelulares, virus... La muestra,
una vez convenientemente preparada, se somete
al sombreado. No se considera el proceso de pre-
paración del material biológico, pues puede ser
Métodos en biociencias
Figura 8.16: Super�icies de fractura que pueden aparecer en la membrana
muy variado: secado al aire, congelación, uso del
punto crítico… en función de la naturaleza del mis-
mo. El sombreado se realiza calentando el �ilamento
correspondiente hasta su vaporización y depositan-
do el metal sobre la muestra en un ángulo preciso
(normalmente 45º), lo que hace que la réplica me-
tálica sea más gruesa en unos lados que en otros,
pudiendo hasta no existir en las zonas donde no se
ha depositado el metal (Figura 8.15).
En la formación de imagen se utilizarán elec-
trones transmitidos a través de la réplica, por lo que
antes de observar la réplica es necesario ultimar su
preparación. En muchos casos la muestra biológi-
ca es lo su�icientemente gruesa como para impedir
el paso de los electrones; por ello, es necesario eli-
minarla. La eliminación del material biológico
conllevaría la desintegración de la réplica, pues por
efecto del sombreado no es continua; por ello, des-
pués del sombreado la réplica se recubre con una
�ina capa de carbono que es transparente a los elec-
trones y cohesiona toda la réplica. El �ilamento de
carbono se ubica en posición cenital de modo que
facilita un recubrimiento completo y continuo de la
réplica metálica. Una vez hecho esto, el conjunto es
sumergido en lejía (1 a 4 horas) para disolver todo
el material biológico y dejar solo la réplica metáli-
ca junto con la capa de carbono que la cohesiona.
El uso de lejía es el procedimiento más habitual,
pero también se puede usar ácido nítrico, sulfúrico
o crómico. Finalmente, la réplica es lavada, secada y
montada sobre una rejilla para ser observada en el
TEM. La réplica metálica es observada en el TEM en
modo BF y es obvio que la formación de imagen en
la pantalla dependerá de que en cada punto de la ré-
plica los electrones puedan ser bloqueados o pasar
en función de la existencia o no de la réplica y de su
espesor, de modo similar a como ocurría en el TEM
con los puntos de las secciones ultra�inas donde se
depositaban o no metales pesados.
220
8.3.4. Criofractura
La criofractura (freeze-fracture) es un método de
observación de muestras biológicas en modo TEM-
BF que sirve, especialmente, para obtener imágenes
planares de las membranas biológicas. En los pro-
tocolos de rutina las muestras pueden ser �ijadas
con glutaraldehído y crioprotegidas (glicerol, saca-
rosa, etilén glicol o DMSO) antes de ser congeladas,
o bien ser directa y rápidamente congeladas a tem-
peraturas criogénicas para evitar que se formen
cristales de hielo que puedan desgarrar toda la es-
tructura. Los criógenos más habituales son propano
(-187 ºC), nitrógeno líquido (-196 ºC), freón 12 o 22
(-165 ºC), y la forma más usual de hacerlo es por in-
mersión. La muestra congelada se introduce en una
cámara de vacío que está a -100 ºC y 10-5 bares y
se le golpea con una cuchilla. Al romperse (fractu-
rarse), el plano de fractura se produce al azar y es
irregular, y muy habitual que pase por el centro de
la bicapa que forma la membrana, generando las su-
per�icies EF (cara de fractura del lado exoplásmico)
y PF (cara de de fractura del lado protoplásmico),
pero también puede producirse por la parte externa
de la cara E (ES) o la P (PS) (Figura 8.16). El térmi-
no IMP (intramembranous particle) hace referencia
a la imagen que se obtiene de las proteínas o agre-
gados proteicos transmembrana.
El material fracturado es sombreado (alre-
dedor de 2 nm de grosor de réplica metálica) y
estabilizado con carbón (10-20 nm de espesor). Por
último, se disuelve el material biológico, se limpia
la réplica, se monta en una rejilla y se pasa al TEM
para su análisis (Figura 8.17).
En los últimos años se ha desarrollado una
nueva metodología que se denomina «citoquímica
en criofractura». Esta técnica permite estudiar las
características celulares y moleculares de las bio-
membranas. Para ello combina la criofractura con
la citoquímica, y dentro de los métodos citoquími-

Figura 8.17: Esquema del procedimiento a seguir en criofractura y criograbado. En la criofractu-
ra la réplica de metal y carbón se hace inmediatamente después de la fractura.
cos usa inmunocitoquímica (el método más usado),
autorradiogra�ía, histoenzimología... El desarrollo
básico de esta técnica es el siguiente. El material
biológico, preferentemente no �ijado para luego fa-
cilitar su disolución parcial, se congela, se fractura
y se sombrea para obtener la réplica de platino/
carbón. El material biológico subyacente a la répli-
ca se descongela y se trata con detergentes (tritón
X-100, SDS u octil-glucósido) que lo eliminan par-
cialmente, pues dejan aquellas moléculas que están
en contacto con la réplica. Finalmente, el material
biológico pegado a las réplicas es marcado con me-
dios citoquímicos (ver capítulo 5, epígrafe 5.7.2 y
�igura 5.16).
8.3.5. Criograbado
El criograbado (freeze-etching) es una variante me-
todológica de la criofractura que sirve especialmente
para el estudio tridimensional de la arquitectura de
células y tejidos en el TEM, pues se usa tanto para estu-
221
Microscopía electrónica
diar el exterior como el interior celular. Básicamente
consiste en añadir una fase de sublimado de hielo an-
tes de la fase de sombreado en el procedimiento que
se sigue en la criofractura (Figura 8.17).
El material biológico es rápidamente congela-
do sin �ijar. Una vez fracturado, el nivel de hielo de la
muestra se baja mediante sublimación al vacío su-
biendo temperatura. Conviene tener presente que
con un vacío de 10-7 bares el agua empieza a subli-
marse a -115 ºC a una tasa de 0.1 nm por segundo,
y una tasa de sublimación razonable va de 1 a 10
nm por segundo. Si se subliman alrededor de 100
nm de profundidad se denomina grabado normal
(normal-etching), si se hace hasta unos pocos μm es
grabado profundo (deep-etching). Las partes de la
célula o de la matriz extracelular expuestas por este
proceso son sombreadas para hacer una réplica de
platino/carbono siguiendo un procedimiento idén-
tico al visto en el apartado anterior. Las muestras
así obtenidas permiten estudiar el interior de las
células y revelar su estructura tridimensional con
extraordinaria claridad. La aparición de las estruc-
Métodos en biociencias
turas celulares y extracelulares en el sublimado es
un proceso comparable a la aparición de los obje-
tos sumergidos en un recipiente cuando su nivel de
agua va bajando.
8.3.6. Tinción negativa
La tinción negativa es un método de análisis en
modo TEM-BF cuya base es la tinción del medio que
rodea a la muestra biológica, que queda sin teñir. Es
el procedimiento inverso a la tinción positiva donde
se tiñe la muestra y no el medio que la rodea, y sirve
para el estudio de muestras biológicas de pequeño
tamaño como macromoléculas, virus, ribosomas,
fragmentos celulares, liposomas, orgánulos...
Existen dos variantes procedimentales bási-
cas: en la primera, una pequeña gota de la disolución
que contiene las muestras biológicas (�ijadas o no)
se deposita sobre una rejilla cubierta de formvar y
se deja secar, después se añade una gota del produc-
to de tinción y se vuelve a dejar secar. En la segunda,
se mezcla la muestra biológica con el producto de
tinción, se deposita una pequeña gota sobre la re-
jilla y se deja secar. Los productos de tinción más
Figura 8.18: Esquema de un proceso de tinción nega-
tiva. Tras el secado, las sales acumuladas en las irre-
gularidades de la muestra dispersan los electrones;
solo las zonas donde no se han acumulado las sales
permiten el paso de electrones que formarán imagen
tras impactar en la pantalla del TEM.
222
habituales son ácido fosfotúngstico, acetato de ura-
nilo o molibdato de amonio. La muestra también
puede colocarse en la rejilla por medio de un spray.
Al �inal del proceso, que ocupa solo unos pocos mi-
nutos, las sales de los productos de tinción quedan
sobre el formvar, o rodean a los especímenes, o se
depositan en algunas de sus irregularidades estruc-
turales. La formación de imagen ocurre porque la
muestra biológica deja pasar los electrones y las
sales de los metales pesados los dispersan (Figura
8.18). Por ello la muestra se ve brillante y el fondo
oscuro, obteniéndose una visión negativa. Este es
un método de desarrollo fácil y rápido, que genera
imágenes de alto contraste. Sin embargo, es necesa-
rio tener presente que el procedimiento de secado y
la forma de pegado de la muestra biológica al form-
var puede artefactar su estructura; además, ciertas
partes de la muestra, por su morfología o forma de
interacción con el formvar se pueden teñir mejor
que otras. Es muy importante evitar la formación de
precipitados que pueden disminuir la calidad de la
imagen. La resolución que se alcanza es de 2 nm y
el factor limitante es el tamaño de grano de las sales
empleadas para generar el contraste negativo.
8.3.7. Criomicroscopía electrónica
La criomicroscopía electrónica (Cryo-EM, cryo-elec-
tron microscopy) es un método de estudio en modo
TEM que analiza muestras congeladas con �ines es-
tructurales. Persigue causar a la muestra la menor
alteración posible en el proceso de preparación
para su observación, además de reducir el tiempo
empleado en el proceso, pudiendo llegar a permi-
tir la observación de especímenes hidratados, en su
estado nativo (sin �ijar, teñir o incluir), con una alta
resolución.
Se pueden observar tanto (1) criosecciones
ultra�inas como (2) capas �inas de suspensiones
acuosas de virus, ribosomas, agregados proteicos
(microtúbulos, micro�ilamentos...). La preparación
de estas suspensiones de especímenes es muy sen-
cilla, basta mojar la rejilla en la suspensión donde
se mantienen, eliminar el exceso (se forma una capa
�ina de la suspensión en el centro de la rejilla) e in-
mediatamente congelar en etano líquido (-160 ºC).
Esto produce la vitri�icación del agua, es decir, la
formación de hielo amorfo: sin cristales. La mani-
pulación de la rejilla para que no se caliente ni se
forme escarcha al ponerla al aire se realiza me-
diante un aparato llamado criotransfer, que incluso
permite su introducción en la columna del TEM, que
ha de estar al vacío y a -160 ºC. Las imágenes que
se obtienen son bastante ruidosas pero al utilizar
 Microscopía electrónica

procedimientos de reconstrucción tridimensio-

nal y disponer de muchas imágenes diferentes de
la misma estructura, pues se colocan al azar en la
super�icie de la rejilla, se puede hacer una mejora
mediante los programas pertinentes y obtener imá-
genes �inales de alta resolución. Este método de
reconstrucción ha recibido el nombre de análisis de
partícula única (single-particle cryo-EM)
La �ijación química, deshidratación e inclu-
sión en resina para obtener secciones pueden tener
efectos negativos sobre el material biológico. La
crio�ijación evita estos efectos y acelera el proceso
de preparación, pero las muestras, que han de ser
muy pequeñas (1 mm3<) para evitar la formación de
cristales de hielo, deben ser cortadas en un crioul-
tramicrotomo a temperaturas por debajo de -135 ºC
(temperatura a partir de la que se vitri�ica el agua),
montadas sobre una rejilla previamente enfriada
(hay distintos procedimentos para ello) y manipu-
ladas y observadas como la suspensión en capa �ina.
A esta técnica se le llama CEMOVIS (cryo-elec-
tron microscopy of vitreous sections).

8.4. Microscopía electrónica tridimensional

La microscopía electrónica tridimensional (3D- Figura 8.19: Demostración esquemática de la genera-

EM), también llamada tomogra�ía electrónica (ET,
electron tomography), tiene como objetivo la ge-
neración de imágenes 3D mediante la integración
de diferentes planos de proyección de una sec-
ción o muestra biológica. Esta técnica tomográ�ica
es análoga a otras usadas en biomedicina que utili-
zan otros métodos de obtención de imágenes como
son los ultrasonidos, la resonancia magnética, los
rayos X o los rayos γ. La particularidad de la ET es
su alta resolución, hasta 1000 veces mayor que las
imágenes 3D que se pueden obtener con los micros-
copios confocales de barrido o los de deconvolución
digital vistos en el capítulo anterior. Puesto que las
imágenes utilizadas son en formato digital, la re-
construcción 3D o tomograma no es otra cosa que
una agrupación de unidades volumétricas llamadas
vóxeles cuyo tamaño suele ser de 1 a 4 nm de lado.
La calidad �inal de la imagen 3D resultante ob-
viamente depende de la calidad de la muestra y, por
ello, de la preparación de la misma. Al principio, las
imágenes 3D se obtuvieron de secciones que se pre-
paraban siguiendo la técnica de rutina del TEM, hoy
la preparación de las muestras sigue protocolos de
criomicroscopía electrónica, procedimiento visto
en el apartado anterior, por lo que en este caso se
llama tomogra�ía crioelectrónica. La ET o 3D-EM, en
principio, apareció como una extensión de la TEM
ción de una imagen 3D.
tradicional (modo BF) pues consistía en someter
una sección o muestra al haz de electrones y variar
su grado de inclinación para tomar una imagen en
cada posición (en la TEM convencional la muestra
se coloca perpendicular al haz de electrones) (Figu-
ra 8.19). Hoy día, empleando el STEM en modo ADF
para la obtención de este tipo de imágenes, se han
llegado a conseguir resoluciones de 0.2 nm. Ello ha
permitido la obtención de imágenes 3D de orgánu-
los subcelulares y de macromoléculas en los casos
de máxima resolución.
El grosor de las secciones empleadas en este
método oscila entre 60 y 100 nm y el tomograma
3D �inal se puede representar como un apilamien-
to de centenares de planos. Obviamente un mayor
número de planos rinde un tomograma de mayor
resolución, y para ello es necesario tomar un ma-
yor número de imágenes con diferentes ángulos de
balanceo.
Existen diferentes técnicas de obtención de
estas series de imágenes y las más populares son
las de inclinación de un solo eje o de doble eje. De
igual modo, la construcción de la imagen 3D tam-

223
Métodos en biociencias
bién pueden ser conseguida mediante la aplicación
de diferentes algoritmos. Los dos modos más usa-
dos son la retroproyección �iltrada y reconstrucción
iterativa. Es muy importante tener presente que la
reconstrucción 3D no es la simple suma de las dis-
tintas proyecciones pues, por efecto del balanceo,
las imágenes obtenidas no tienen el mismo tama-
ño; por ello es necesario el desarrollo y mejora de
algoritmos que optimicen la obtención de la imagen
3D �inal.
8.5. Microscopía electrónica de muestras no
biológicas
En este último epígrafe solo se pretende incluir
unas nociones básicas de la preparación de mues-
tras metalúrgicas. No existe una técnica general que
pueda ser válida para todo tipo de muestras; por
ello, a continuación se describe un procedimiento
adaptado para el estudio de compuestos interme-
tálicos.
8.5.1. Microscopía electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido, al igual que la
microscopia óptica, requiere un meticuloso proceso
en la preparación de las muestras, cubriendo des-
de el embutido del material a observar en resinas
hasta el atacado �inal de su super�icie para alcanzar
brillos especulares (el microscopio óptico para este
tipo de muestras trabaja con re�lexión).
La muestra es embutida en resina líquida me-
diante un molde normalizado de 3 cm de diámetro.
La resina líquida endurece en 24 horas aproximada-
mente y la muestra así preparada recibe el nombre
de probeta. Posteriormente es pulida manualmen-
te con lijas de carburo de silicio de 240. 600 y 1200
mesh. Es usual aplicar sobre las lijas una capa de
cera de carnauba para evitar, en la medida de lo
posible, que las partículas abrasivas de la lija se
incrusten en el material, contaminándolo y provo-
cando un rayado indeseable. El proceso sigue con
un pulido con polvo de diamante efectuado con la
ayuda de una pulidora mecánica. Se comienza con
polvo de gran calibre, por ejemplo, 6 μm, se conti-
núa con calibres de 3 y 1 μm y se �inaliza con polvo
de 1/4 μm. Generalmente, al �inal de esta etapa la
muestra presenta una super�icie muy limpia no-
tablemente brillante. El atacado es la última etapa
del proceso de pulido y con ella se pueden alcanzar
brillos especulares en la probeta, condición funda-
mental para la observación en microscopía óptica,
224
no así en la microscopía electrónica de barrido. El
problema a la hora de ejecutar esta etapa es que un
atacado excesivo puede transformar el material que
se desea observar. Es importante indicar que cuan-
do una muestra de material metalúrgico embutida
en una resina ha de ser observada mediante micros-
copía electrónica de barrido, previamente hay que
metalizar la muestra junto a la resina, o, mediante
la aplicación de una sustancia conductora, formar
unos contactos metálicos en la resina con el �in de
que la probeta pueda descargarse de la electricidad
estática generada por el impacto de los electrones.
8.5.2. Microscopía electrónica
de transmisión
Una de las mayores di�icultades que presenta la
TEM es la preparación de las probetas. General-
mente, y al igual que en muestras biológicas, para
que los electrones del haz primario puedan atrave-
sar un metal, necesitan, además de un alto potencial
acelerador (generalmente de 200 kV), encontrarse
con grosores no superiores a los 100 nm. Obtener
probetas tan delgadas no es tarea sencilla y su ma-
yor o menor di�icultad depende principalmente de
las propiedades mecánicas (ductibilidad, dureza,
etc.) del material a analizar. Concretamente, si los
materiales son muy frágiles el proceso de adelgaza-
miento de la probeta se convierte en un auténtico
problema. El primer paso es cortar la muestra en
láminas gruesas (entre 0.8 y 1.2 mm de espesor)
mediante, por ejemplo, una sierra de polvo de dia-
mante. Estas secciones se embuten en un molde con
resina con el �in de dar resistencia a la probeta para
soportar los tratamientos posteriores, que empie-
zan con un pulido manual para obtener una cara
plana de referencia limpia y brillante mediante li-
jas de carburo de silicio (300, 600 y 1200 mesh),
y se continua para adelgazar la probeta hasta 150
mm. Luego, utilizando una sierra circular de baja
velocidad angular, se realiza el corte en discos nor-
malizados de 3 mm de diámetro que permiten su
introducción en el portamuestras del TEM. Por úl-
timo se realiza el electropulido, que consiste en el
adelgazamiento selectivo de una zona de la pro-
beta hasta conseguir su perforación. Así, en los
bordes de dicha perforación se obtienen los espe-
sores requeridos para su observación (~100 nm).
El electropulido se realiza mediante eyección de un
electrolito sometido a un potencial eléctrico sobre
las dos caras de la muestra; habitualmente una so-
lución de ácido perclórico al 10% y metanol al 90%
a una temperatura de -40 ºC. En determinados tipos
 Microscopía electrónica

de muestras de materiales, por ejemplo muestras Electron Microscopy. 1998.

geológicas o de metales muy frágiles, a veces no
se realizan los pasos anteriormente citados por la
imposibilidad de llevarlos a cabo, y el material a ob-
servar se dispone sobre una rejilla. En estos casos
se analizarían aquellas zonas del material pulveri-
zado que presente aristas de bajo espesor.
Bozzola JJ and Russell LD. Jones & Bartlett Publishers.
ISBN 978-0763701925.
Electron Microscopy Methods and Protocols. 1999.
Nasser Hajibagheri MA. Humana Press. ISBN 978-
0896036406.
Introducción a la microscopía electrónica aplicada a las
ciencias biológicas. 2000.

Vázquez G, Echeverría O. Fondo de Cultura Económica.

ISBN 978-9681662400.
Practical Electron Microscopy: A Beginner’s Illustrated
Guide. 1993.
Bibliografía Hunter EE. Cambridge University Press. ISBN 978-
0521385398.

Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques and

225

Microscopía de barrido
por sonda
La microscopía de barrido por sonda (SPM, scan-
ning probe microscopy) es una metodología que
permite estudiar las muestras por el rastreo (barri-
do) de su super�icie con una sonda. El análisis de las
alteraciones que la sonda va sufriendo en su proce-
so de rastreo permitirá obtener información sobre
la materia subyacente, y la naturaleza de esta in-
formación dependerá del tipo de interacción que
se establece entre sonda y materia. El tipo de in-
teracción puede ser muy variado y depende de la
sonda, del barrido y de la materia estudiada. Senci-
llas interacciones mecánicas y otras más complejas
como interacciones electrostáticas, magnéticas, de
van der Waals o de Lennard-Jones, de enlace quí-
mico, capilares, térmicas… son algunos de los tipos
de interacción que sonda y materia pueden esta-
blecer. El hecho de que sonda y materia puedan
establecer tantos tipos diferentes de interacción ha
sido la causa de aparición de más de una treintena
de tipos de SPMs. Entre todos ellos destaca el mi-
croscopio de efecto túnel (STM, scanning tunneling
microscope) por ser el primer SPM que apareció. Por
su aplicación en el campo de las biociencias son es-
pecialmente interesantes el microscopio de fuerza
atómica (AFM, atomic force microscope), el micros-
copio óptico de campo cercano (SNOM, scanning
near-�ield optical microscope), y el microscopio acús-
9.
Guillermo Bodega
tico de barrido (SAM, scanning acoustic microscope),
que serán los que se considerarán en este capítulo.
La SPM se puede considerar como la micros-
copía de última generación. Por un lado, ha sido el
último gran tipo de microscopía en aparecer: surge
en la década de los 80, época que se puede conside-
rar relativamente reciente. Por otro lado, su modo
de obtención de información se basa en un concepto
totalmente diferente al desarrollado en los micros-
copios ópticos y electrónicos estudiados en los dos
capítulos anteriores. Los SPMs no necesitan lentes,
ni de vidrio ni electromagnéticas, por lo que su re-
solución depende fundamentalmente del sistema
de control de posición y movimiento, y de la sonda.
Su diámetro, rigidez, proximidad y modo de inte-
racción con la materia son factores que afectan a la
resolución de los SPM, que en muchos casos alcan-
za niveles atómicos pues su valor es inferior al nm.
El primer SPM que apareció fue el STM en el
año 1981 y supuso la concesión del premio Nobel a
Binning y Rohrer en el año 1986. No deja de ser pe-
culiar el hecho de que ese mismo año también le fue
concedido el premio Nobel a Ruska por el desarrollo
del TEM, hecho acaecido 50 años antes. El primero de
estos microscopios con una indudable aplicación en
el campo de la biociencia es el AFM, desarrollado en
1985 por Binning, Gerber y Quate.
Métodos en biociencias
9.1. Microscopio de barrido
de efecto túnel
9.1.1. Estructura y funcionamiento
El STM es el primer SPM inventado por lo que se
puede considerar como el ancestro de todos los
demás. Por ello comparte con el resto de SPMs la
presencia de algunos componentes estructurales
como son la sonda, el sistema de escaneo y la unidad
de control informático, que dirige el escáner, mide
datos y los transforma en una imagen (Figura 9.1).
El STM no es un microscopio que se use normal-
mente en el campo de las biociencias pues, como se
verá en el siguiente párrafo, obliga a que las mues-
tras sean conductoras. Sin embargo, el hecho de ser
utilizado como modelo constructivo por otros SPMs
que utilizan muestras biológicas justi�ica su consi-
deración en este tema. Por la razón ya expuesta no
se profundizará en el análisis de la sonda del STM;
sin embargo, se prestará una atención especial a
los dispositivos que permiten ajustar la posición de
sonda y muestra, y a los que controlan el movimien-
to en el proceso de barrido, pues son componentes
esenciales en todos los SPMs. Aunque no se entrará
en detalles de la arquitectura constructiva del STM
conviene recordar que el funcionamiento del STM es
extraordinariamente sensible a vibraciones, cambios
de temperatura e interferencias acústicas y eléctri-
cas; por ello la cámara del STM donde se realiza la
medida ha de estar muy bien protegida y preferente-
mente con alto vacío o átomos inertes.
La sonda del STM, normalmente de platino/
iridio o tungsteno, es una aguja rígida y conducto-
ra, y con una punta tan delgada que termina en un
átomo, por lo que la resolución lateral que puede al-
canzar el STM es de nivel atómico, es decir, puede
diferenciar un átomo de otro que está a su lado; tén-
gase en cuenta que el diámetro de los átomos oscila
Figura 9.1: Esquema de un STM (izquierda) con un detalle de la interacción entre muestra y sonda (derecha) donde los círculos represen-
tan átomos.
228
entre 0.15 y 0.6 nm. Su resolución vertical puede lle-
gar a 1 pm. La base del funcionamiento del STM es el
establecimiento de una diferencia de potencial –que
va de mV a unos pocos V con intensidades en el rango
del nAmp– entre la muestra y la punta de la sonda, lo
que obliga a que sonda y muestra sean conductoras
o semiconductoras. Cuando sonda y muestra están
muy próximas, normalmente a menos de 1 nm, y
dependiendo del valor del potencial, se produce el
paso de electrones entre sonda y muestra o vicever-
sa en función de como estén cargadas cada una. Este
paso de corriente eléctrica entre sonda y muestra es
medible y está afectado de forma exponencial por
la distancia existente entre ellas: una variación del
10% en la distancia induce un cambio de un orden
de magnitud en la corriente, lo que dota al STM de
una extraordinaria sensibilidad.
Existen dos modos de funcionamiento del
STM: altura constante y potencial constante (Fi-
gura 9.2). En el modo altura constante la sonda se
desplaza en un plano horizontal por encima de la
muestra sin variar su altura. En su movimiento, la
distancia entre sonda y muestra varía en función de
las irregularidades de la muestra, y esto hace que
el potencial establecido entre sonda y muestra tam-
bién varíe. Por tanto, la formación de la imagen de
cada punto de la super�icie de la muestra es función
de la variación de corriente detectada en cada pun-
to. A potencial constante el sistema utiliza un modo
de retrocontrol que va ajustando continuamente la
distancia entre muestra y sonda para que el poten-
cial se mantenga constante. Aunque teóricamente
se pueden desplazar tanto sonda como muestra, lo
usual es que el desplazamiento lo realice la mues-
tra mediante un sistema de control piezoeléctrico.
En este caso, cada punto de la imagen se genera en
función de la variación de altura del sistema sobre
el que se ubica la muestra, o más concretamente, de
la energía que hay que suministrar al sistema pie-

Figura 9.2: Esquema de los dos modos de funcionamiento del STM: altura constante (izquierda) y potencial constante
(derecha).
zoeléctrico que mueve la muestra para ajustar el
potencial.
Una visión muy general del funcionamiento
podría concluir con la idea de que la sonda detecta
cambios morfológicos en la super�icie de la muestra,
pero, si se quiere ser más preciso, la realidad es que
la imagen obtenida depende de la densidad electró-
nica en cada punto de la super�icie y, de manera aún
más precisa, la imagen obtenida representaría la
probabilidad de que en un punto determinado, a una
distancia y potencial dados, se produzca el salto de
un electrón. Por ello, variaciones del estado electró-
nico en un punto o área determinada de la muestra
pueden causar errores en estudios puramente to-
pográ�icos: una super�icie absolutamente plana que
presentase este tipo de anomalías podría formar
una imagen con alteraciones en su super�icie.
9.1.2. Sistemas de control posicional
y de movimiento de sonda y muestra
Existen numerosos dispositivos que se pueden usar
para conseguir posicionar correctamente muestra
y sonda, y, además, permitir su desplazamiento; si
bien unos son más so�isticados y precisos que otros.
Los sistemas de control de movimiento durante el
escaneo pueden asociarse a la sonda o a la muestra
y son los dispositivos de mayor precisión, pues tie-
nen que generar movimiento en escalas inferiores
al nm en las tres direcciones del espacio.
Figura 9.3: Dispositivos de ajuste de tipo palanca y cantiléver. La �lecha del cantiléver sirve para ajustar la
posición de partida.
229
Microscopía de barrido por sonda
Hay dispositivos puramente mecánicos y
eléctricos. Los primeros, por ser de menor preci-
sión, se usan para el preposicionamiento de sonda
y muestra; los segundos, mucho más precisos, sir-
ven para alcanzar posicionamientos más �inos y ser
responsables del movimiento en el proceso de ba-
rrido. Entre los dispositivos puramente mecánicos
(Figura 9.3) destacan los sistemas de palanca, en los
que amplios movimientos en un extremo se trans-
forman en pequeños desplazamientos en el otro,
y los dispositivos tipo cantiléver, usualmente es-
tructuras elásticas alargadas y planas en las que un
extremo está �ijo y el otro libre; sobre ellos puede
apoyarse o no otro dispositivo elástico que permi-
te actuar sobre la posición del cantiléver. Entre los
dispositivos eléctricos destacan los motores paso a
paso, que transforman pulsos eléctricos en impul-
sos mecánicos, y los motores piezoeléctricos, en los
que el movimiento es generado por una estructura
piezoeléctrica (transforma la electricidad en vibra-
ciones o movimiento).
Los sistemas piezoeléctricos de control de
posicionamiento y movimiento son los más utili-
zados por sus propiedades: provocan cambios de
posición muy precisos, por debajo del nm, y a la
vez pueden generar fuerzas del orden de miles de
Newtons, son de respuesta rápida, no les afectan
los campos magnéticos, son de muy bajo consumo,
pueden trabajar en el vacío, no necesitan lubrica-
ción y están libres de desgaste por fricción.
Métodos en biociencias
Figura 9.4: (A) Piezoelemento tubular. La conjunción
de tres de ellos puede permitir el movimiento en los
tres ejes del espacio. La punta de �lecha en blanco rep-
resenta la punta de la sonda (B) Piezoelemento tubu-
lar formado por dos capas concéntricas. La interna es
responsable del movimiento en el eje Z. La externa no
es continua y está formada por sectores responsables
del desplazamiento en los ejes X e Y. (C) Conjunción de
los dos tipos de piezoelementos anteriores, aunque en
este caso el piezoelemento inferior no está formado
por dos capas.
Una estructura piezoeléctrica es aquella cuyo
tamaño varía cuando es sometida a un campo eléc-
trico y viceversa. Aunque usando una terminología
más precisa, en el primer caso se de�ine como un
actuador piezoeléctrico y en el segundo como un
sensor piezoeléctrico. En la mayoría de los casos
estas estructuras están formadas por materiales
piezocerámicos polarizados obtenidos a partir de
cristales ferroeléctricos como el BaTiO3 o el zirco-
nato titanato de plomo (PZT), que es el más usado.
La base estructural de un actuador piezoeléctrico
es el cambio de forma que la aplicación del campo
eléctrico provoca en su estructura cristalina.
En el campo de la SPM los piezoelemen-
tos más utilizados son estructuras tubulares que,
mediante bajos voltajes, alcanzan movimientos re-
lativamente amplios. En realidad son cilindros
Figura 9.5: Diferentes estrategias de construcción de dispositivos piezoeléctricos para control
de movimiento basados en placas bipolares.
230
huecos de pared delgada recubiertos externa e
internamente por una delgada capa metálica; la co-
rona inicial y �inal del tubo está sin recubrir.
La in�luencia de un potencial eléctrico en-
tre cara externa e interna hace que el tubo cambie
su longitud. La conjunción de tres de estos tubos
orientados perpendicularmente entre sí y unidos
a una base (lugar donde se �ija la sonda o se suje-
ta la muestra) permitirá movimientos muy precisos
en las tres direcciones del espacio (Figura 9.4). Un
diseño más evolucionado lo representa una única
estructura tubular en la que el material piezoeléc-
trico interno es continuo y el externo va dividido en
cuatros sectores. Los sectores externos son respon-
sables del desplazamiento a derecha e izquierda en
relación con el eje longitudinal del cilindro y produ-
cen un doblamiento del mismo, y el sector interno
es responsable del crecimiento en longitud. Otra
posibilidad es el empleo de placas bimór�icas que
resultan de la unión de dos láminas circulares de
material piezoeléctrico con la dirección de polari-
zación del material enfrentada. La aplicación de un
campo eléctrico a toda la estructura deforma el con-
junto pues hace que, en función de la dirección del
campo eléctrico, una de las láminas varíe su tamaño.
Estos elementos se pueden combinar en una estruc-
tura en forma de trípode o ser divididos en sectores
de modo que con un solo elemento, al modi�icar in-
dependientemente cada cuadrante, se consigue el
movimiento tridimensional (Figura 9.5).
En un proceso de escaneo, la distancia entre
dos puntos escaneados en el plano se llama tamaño
de paso, y su valor viene determinado por el tama-
ño de la sonda y el número de puntos por línea de
escaneo. En un SPM típico va desde el orden del
angstrom a centenas de μm, y de 64 a 1024 puntos
por línea. Como la imagen es usualmente cuadra-
da el número de líneas suele ser igual al número
de puntos por línea, pero es posible trabajar con
otras con�iguraciones. Las condiciones de escaneo
son muy importantes a la hora de resolver entre
 Microscopía de barrido por sonda

estructuras próximas. Por ejemplo, si se desea esca-

near un área de 20 μm x 20 μm con 512 puntos por
línea de escaneo se obtienen píxeles de 39 nm (20
μm dividido por 512) por lo que no sería posible re-
solver estructuras inferiores a estos tamaños. Para
aumentar la resolución se puede disminuir el área
de escaneo y/o aumentar el número de puntos por
línea si el sistema lo permite.

9.2. Microscopio de fuerza atómica

9.2.1. Estructura y funcionamiento

El AFM es un dispositivo donde la interacción entre
sonda y muestra es debida a las fuerzas de interac-
ción atómica entre los átomos de la muestra y los
de la aguja de la sonda. Básicamente estas fuerzas
de interacción son dos, una atractiva (fuerzas de
van der Waals) y otra repulsiva (fuerza iónica o po-
tencial de Lennard-Jones). Desde un punto de vista
constructivo, si se compara con el anterior, este mi-
croscopio introduce un nuevo sistema de sonda
elástica (no rígida) e incorpora un detector que sir-
ve para cuanti�icar la deformación de dicha sonda.
Los sistemas de control de posicionamiento y movi-
miento son del mismo tipo que en el STM.
El sistema de sonda lo forma una aguja aco-
plada en el extremo libre de un cantiléver. La aguja
es una parte muy importantes en el correcto funcio-
namiento del AFM. Generalmente es de Si o Si3N4 y
su tamaño más habitual es de 2 μm de longitud y un Figura 9.6: Esquema básico de los compo-
diámetro inferior a los 10 nm pero existen cente- nentes y modo de funcionamiento de un AFM
(imagen superior) y del fotodetector (PSPD)
nares de tipos diferentes en función de su tamaño, (imagen inferior).
forma (piramidal, cónica…), tipo de recubrimiento
(metálico, carbón, diamante…) u otras caracterís-
ticas. El cantiléver suele ser una lámina �lexible de
silicona de 100 a 500 μm de longitud que tiene dos detectadas por cada cuadrante que miden los algo-
diseños básicos: rectangulares y triangulares, estos ritmos (A+C) / (B +D) y (A+B) / (C +D) ha de ser 1.
últimos más rígidos. El funcionamiento básico del Es obvio que el primer algoritmo mide variaciones
AFM es el siguiente: las modi�icaciones (de�lexio- en la vertical y el segundo desplazamientos latera-
nes) que sufre el cantiléver al recorrer la muestra les del cantiléver.
durante el escaneo son detectadas mediante un El AFM tiene dos modos básicos de funcio-
sistema láser que lo ilumina, a la vez que re�le- namiento: altura constante o fuerza constante, y
ja la señal luminosa hasta un sistema de detección bastantes modos de operación para obtener la ima-
(PSPD, position sensitive photodetector). Las varia- gen. En el modo altura constante se �ija la altura
ciones de la luz re�lejada captadas por el PSPD son de la muestra y su desplazamiento solo se produ-
transformadas en una imagen mediante el software ce en el plano horizontal (ejes X e Y). Al moverse
correspondiente (Figura 9.6). la muestra, sus irregularidades super�iciales causan
El PSPD es un sistema de fotocélulas que la de�lexión del cantiléver, hecho que es detectado
normalmente se agrupan distribuidas en cuatro por el PSPD. La imagen de la muestra se obtiene por
cuadrantes. En reposo el haz de luz que re�leja el las variaciones posicionales detectadas por el PSPD.
cantiléver se hace incidir sobre el centro de la es- Este modo es muy útil en el caso de super�icies con
tructura de modo que la relación entre las señales muy pocas alteraciones. En el modo de fuerza cons-

231
Métodos en biociencias
tante las variaciones en la de�lexión del cantiléver
son retrocorregidas para mantener el cantiléver en
la misma posición. Para ello es necesario desplazar
(subir o bajar) la muestra en el eje Z (altura) a la
vez que se va produciendo el barrido por los ejes X
e Y. Suele ser el modo de funcionamiento más ha-
bitual, pero la velocidad de escaneo está limitada
por la respuesta de retrocorrección. En este caso,
la corriente aplicada al sistema piezoeléctrico en
cada punto es transformada en imagen mediante
el software correspondiente, por lo que la imagen
se obtiene a partir del sistema de control del movi-
miento del escáner en vez del PSPD, tal como sucede
en el modo de operar con altura constante.
Para obtener imagen el AFM opera de cuatro
maneras primarias (contacto, no contacto, intermi-
tente y resonancia de torsión) y numerosas maneras
secundarias que derivan de estas; en ningún caso
es necesario que la muestra sea conductora. En el
modo contacto a la muestra y al extremo de la aguja
solo los separa una distancia del orden del angs-
trom. En realidad, se considera que hay interacción
ente las nubes electrónicas de los átomos de sonda
y muestra, por lo que entre estos átomos se estable-
cen fuerzas de carácter repulsivo.
En el modo sin contacto la muestra y la pun-
ta de la aguja se encuentran separadas por decenas
de nm, por lo que las fuerzas interatómicas que
se establecen entre ellas son de carácter atracti-
vo. Esto hace que tiren hacia abajo del cantiléver,
lo que obliga a utilizar cantiléver algo más rígidos.
Por otra parte, la magnitud de estas fuerzas es de
varios órdenes menor que en el modo contacto, lo
que unido a la mayor rigidez del cantiléver provo-
ca una disminución en la señal. Debido a la menor
interacción entre sonda y muestra este modo de
operar es especialmente utilizado en el análisis de
muestras blandas y/o elásticas. En el modo sin con-
tacto el cantiléver vibra a frecuencias próximas a su
frecuencia de resonancia: entre 100 y 400 kHz con
una amplitud de unos pocos nm. Antes de iniciar el
escaneo se �ija la distancia de la aguja a la muestra
y el modo de vibración del cantiléver seleccionan-
do una frecuencia y una amplitud. La variación
de esta distancia que se produce en el proceso de
barrido afecta a la frecuencia y amplitud de la vi-
bración. El modo de operar requiere ir ajustando
de forma continua la separación de la muestra (se
sube o baja) hasta revertir las variaciones produci-
das en la amplitud. Ello hace que la distancia entre
muestra y aguja se mantenga constante. El sistema
alcanza resoluciones por debajo del angstrom en el
eje vertical. La vibración del cantiléver se consigue
de dos maneras, el modo AAC (acoustic amplitude
constant) y el modo MAC (magnetic AC), este últi-
232
mo más utilizado. En el modo AAC un transductor
piezoeléctrico se asocia a la pieza donde se sujeta
el cantiléver e induce la vibración. En el modo MAC
un cantiléver recubierto de material magnético es
sometido a las oscilaciones de un campo magnético
generado por un solenoide próximo a él.
El modo de operar con contacto intermitente
es muy parecido al modo sin contacto pues tam-
bién emplea un sistema vibratorio de medida; sin
embargo, en este caso la aguja llega a tocar la mues-
tra y la amplitud es mucho mayor que en el modo
sin contacto pues es del orden de decenas de nm.
El sistema funciona al detectar los cambios en la
amplitud que tienen lugar durante el proceso de
escaneo, y mueve la muestra para que dicha ampli-
tud se mantenga constante. Este modo de operar es
especialmente útil en el caso de las muestras bioló-
gicas pues reduce la mayoría de las limitaciones que
presentan los modos con y sin contacto.
El modo de obtención de imagen por
resonancia torsional consiste en detectar el movi-
miento cuasi-giratorio que sufre el cantiléver por
la aparición de fuerzas laterales que modi�ican su
desplazamiento, y para ello necesita PSPD de cuatro
elementos. El sistema mide simultáneamente cam-
bios en el desplazamiento vertical del cantiléver
(de�lexión) y en el lateral (torsión). Mediante este
sistema no solo se detectan cambios topográ�icos
sino que también pueden detectarse variaciones en
otras propiedades de la muestra estudiada. Una va-
riante de este sistema la utiliza el microscopio de
fuerza lateral (LFM, lateral force microscope) que
solo detecta variaciones en el desplazamiento la-
teral del cantiléver, hecho que le permite poner en
evidencia transiciones composicionales en la su-
per�icie de la muestra (Figura 9.7). Otro modo de
operar es la detección de fase (PDM, phase detec-
tion microscope), que forma imagen en función
del desfase entre la señal de entrada que induce la
vibración del sistema y la señal de salida tras la in-
teracción con la muestra (Figura 9.7). Este modo
de operar es especialmente útil para detectar cam-
bios en elasticidad, adhesión y fricción, y es muy útil
para analizar muestras biológicas. Una de las gran-
des ventajas del AFM es que la medida de muchos
de los parámetros que sustentan los diferentes mo-
dos de formación de imagen se puede realizar de
forma simultánea, de modo que no es necesario rea-
lizar nuevos barridos de la muestra.
9.2.2. Aplicación del AFM en el campo
de las biociencias
Los AFM adaptados al estudio de muestras bioló-
gicas suelen incluir, como mínimo, un microscopio
 Microscopía de barrido por sonda

Figura 9.7: Esquemas que ilustran los modos de operar del microscopio de fuerza lateral (LFM)
(A) y del microscopio de detección de fase (PDM) (B).

óptico que facilita la manipulación de la muestra
y la elección del área de estudio. En cuanto a tipo
de muestra biológica, el AFM permite el análisis de
moléculas dispersas (proteínas, RNA, DNA…) agru-
paciones macromoleculares (cromosomas, �ibras,
membranas...), virus, orgánulos u otras estructuras
subcelulares, células e incluso tejidos (Figura 9.8).
Prácticamente no existen restricciones en relación
con la preparación de las muestras pues en el AFM
se puede estudiar material �ijado o sin �ijar, húme-
do o seco, e incluso hasta material vivo. Existe un
curioso modo de procesamiento que permite obser-
var secciones histológicas en el AFM e implica una
mezcla de los métodos que se aplican en micros-
copía óptica, TEM y SEM. En un ultramicrotomo se
obtienen secciones con un grosor de 500-700 nm
de material incluido en polietilenglicol, luego son
montadas en portas de vidrio, se retira el medio de
inclusión, se secan al punto crítico y pasan a ser ob-
servadas en el AFM.
Un hecho importante a tener en cuenta es
la limitación del desplazamiento de la muestra en
el eje vertical, pues solo suele alcanzar unas dece-
nas de μm y puede impedir el análisis de muestras
muy rugosas, hecho relativamente frecuente en las
muestras biológicas. En el caso de utilizar muestras
vivas también es necesario tener en consideración
la duración del escaneo pues, dependiendo de la
magnitud del área a estudiar y del grado de resolu-
ción que se desee, puede oscilar entre unos pocos
minutos a algunas horas; por ejemplo, el análisis
de alta resolución de 1 μm2 de la membrana de una
célula puede durar hasta 3 horas debido a la baja
velocidad del escaneo. Otra consideración intere-
sante es la posibilidad de utilizar diferentes modos
de operación de forma simultánea, lo que permite
la obtención de datos de muy diferente naturaleza;
por ejemplo, en un único barrido de un área de la
membrana plasmática de la célula se pueden obte-
ner datos morfológicos, datos sobre la viscosidad de
la membrana y, si se ha realizado un inmunomar-
caje con oro-coloidal, también se puede estudiar la
distribución de la molécula que hace de antígeno.
La posibilidad de manipulación de la son-
da del AFM para modi�icar su modo de interacción
con la materia abre fascinantes posibilidades en el

Figura 9.8: AFM. Imagen de una partícula de oro-coloidal de 10 nm depositada en una super�icie de
mica (izquierda). Imagen que muestra la variación de resonancia en función de la elasticidad de la
membrana de un astrocito cultivado (derecha).

233
Métodos en biociencias

Figura 9.9: Esquema que demuestra que cuando el punto de captación de luz de la sonda se sitúa
a distancias inferiores a la longitud de onda empleada para iluminar se aumenta el poder de reso-
lución. La intensidad de luz (I) captada por la sonda puede ser de�inida por la expresión I ≈ 1 / d2,
donde “d” es la distancia entre el punto emisor de luz y el punto de captación; por ello, en el punto
A de la imagen superior, I1 es mucho mayor que I2 (nótese que la intensidad es inversamente pro-
porcional al cuadrado de la distancia), exactamente al revés que en el punto B. La discriminación
entre los objetos de los puntos C y D es imposible pues las intensidades captadas por la sonda en
cada punto son muy similares. En la parte inferior de la �igura, al situar la sonda a una distancia
inferior a la de la longitud de onda, se consigue una mayor resolución, pues la diferencia de las in-
tensidades emitidas por cada punto y captadas por la sonda es mucho mayor, hecho que permite
diferenciar puntos más próximos, como ahora es el caso de los puntos C y D.

campo de la biología y también de la química. Por
ejemplo, es posible acoplar anticuerpos a la agu-
ja de la sonda y de este modo localizar antígenos
sobre la muestra ya que al interaccionar el anti-
cuerpo con el antígeno se modi�ican muchos de los
parámetros que de�inen el comportamiento de la
sonda. Esto mismo se puede aplicar para cualquier
molécula que mantenga con cualquier otra una in-
teracción especí�ica, como por ejemplo, las lectinas
con carbohidratos, secuencias complementarias de
nucleótidos o interacciones ligando-receptor. Mo-
di�icaciones de otro tipo, por ejemplo, preparar
sondas magnetizadas o conductoras, han dado lu-
gar a la aparición de un sin�ín de microscopios de
fuerza atómica a los que no se prestará atención
pues la gran mayoría no se aplican en el campo de
las biociencias.
Las técnicas y modos de procesamiento del
material biológico para su estudio en el AFM han
avanzado mucho en los últimos años, como de-
muestra el hecho de la aparición de la metodología
crio-AFM; sin embargo, queda todavía mucho cami-
no que recorrer en este campo. En cualquier caso
la posibilidad de simultanear análisis que permi-

234
 Microscopía de barrido por sonda

ten obtener información estructural, propiedades

�ísicas, dinámicas e interacciones moleculares a
tiempo real en ambiente acuoso ha abierto un sin-
número de nuevas posibilidades que prácticamente
solo han empezado a ser exploradas. Finalmente,
el AFM y el STM se pueden usar de forma delibera-
da para modi�icar átomo a átomo la super�icie de la
muestra lo que supone una nueva variante de técni-
ca nanolitográ�ica.

9.3. Microscopio óptico de barrido

de campo cercano

La microscopía óptica convencional es de campo

lejano pues la distancia entre el objeto y el punto
de observación es muy grande en comparación con
la longitud de onda empleada. Unas 300 veces, si
se considera que 180 μm es una distancia mínima
razonable de aproximación del objetivo a la mues-
tra y se compara con 600 nm, un valor medio de la
frecuencia de la luz visible. Ello hace que ocurran
fenómenos de difracción que limitan el poder de re-
solución del microscopio. Al �inal del siglo XIX Abbe
y Rayleigh formularon la teoría del límite de di-
fracción del microscopio óptico que, básicamente,
signi�ica que es imposible resolver entre 2 elemen-
tos de una estructura que se encuentren a menos
de la mitad de la longitud de onda (λ) con que se les
ilumina (Figura 9.9). Sin embargo, en SNOM, al ser
estas distancias inferiores a la λ se produce una sus-
tancial mejora en el poder de resolución que puede
ir desde 100 μm hasta 10 nm. Por razones obvias el
sistema de captación de luz debe de ser muy estre-
cho, pues el diámetro de su apertura también tiene
que ser bastante inferior a la λ empleada para ilumi-
nar la muestra.
El primer SNOM fue creado por Pohl en el
año 1982, un año después de la aparición del STM y,
como ya se ha visto, al menos tenía que dar solución
a dos requisitos básicos: disponer de una sonda de
captación de luz cuya apertura fuese menor que la λ
de iluminación, y poder acercar esa sonda a distan-
cias inferiores a la λ empleada para iluminar. Puesto
que este microscopio utiliza luz, la formación de
contraste en la imagen sigue los mismos princi-
pios operacionales que en la microscopía óptica
por lo que los fenómenos de absorción, refracción,
dispersión y re�lexión son los responsables de la
formación de imagen.
La base de la sonda es una �ibra óptica de extre-
mo muy aguzado. Una �ibra óptica es una estructura
cilíndrica formada por un centro, un recubrimiento y
una capa protectora. El centro y el recubrimiento son
Figura 9.10: Esquema que ilustra dos sis-
temas de escaneo de la sonda. En la �igura
superior la sonda se acopla a un sistema
piezoeléctrico y a un dispositivo vibrato-
rio que permite ajustar su posición. En el
inferior se coloca sobre un cantiléver cuyo
control es del mismo tipo que el del AFM.
de cristal de cuarzo, el del recubrimiento suele tener
un índice de refracción un 1% más pequeño que el
cristal de cuarzo central. Este conjunto de cristal uni-
do a la capa protectora prácticamente garantiza una
re�lexión total por lo que la luz puede ser conducida
en su interior casi sin pérdidas.
La sonda se construye aguzando mediante
abrasión química un extremo de �ibra óptica al que
se ha eliminado la capa protectora hasta que el diá-
metro del extremo es inferior a 100 nm. Luego se
vuelve a recubrir con una capa protectora metálica
que se pulveriza de forma inclinada para evitar re-
cubrir la punta de la sonda.
El ajuste de la distancia entre sonda y mues-
tra es muy importante debido a que la distancia
debe ser siempre inferior a la λ de la luz emplea-
da. Los dos métodos más usuales de conseguirlo
son a través de un sistema piezoeléctrico vibrato-
rio o mediante un cantiléver (Figura 9.10). En el
primer caso la sonda va asociada a un sistema vi-
bratorio cuya parte central es un resonador de
cristal de cuarzo en forma de tenedor, al que por

235
Métodos en biociencias
Figura 9.11: Esquema de diferentes con�iguraciones de SNOM.
un lado se pega la sonda y por otro un vibrador
piezoeléctrico. Los cambios vibratorios que va ex-
perimentando la sonda al acercarse a la muestra
sirven para ajustar la distancia entre ellas y permi-
ten controlar el escaneo en el eje Z. Estos cambios
se detectan mediante un láser enfocado sobre el ex-
terior de la �ibra óptica de la sonda que re�leja luz a
un PSPD, lo que también permite hacer un registro
topográ�ico –simultáneo al análisis realizado con la
luz– de modo similar a lo que ocurre en el modo no
contacto del AFM, donde cambios en los paráme-
tros vibratorios generan imágenes topográ�icas. El
sistema vibratorio suele ir asociado a un sistema
piezoeléctrico clásico que es el responsable del es-
caneo 3D del conjunto; aunque también es posible
acoplar un sistema de barrido horizontal (plano
X-Y) a la muestra y otro distinto para el vertical (eje
Z). La otra posibilidad consiste en acoplar el extre-
mo de la sonda a un cantiléver triangular con un
agujero en su extremo que permite acoplar la pun-
ta de la sonda. En este caso el control del escaneo
lo hace el AFM del que forma parte el cantiléver tra-
bajando en modo no contacto.
Desde un punto de vista constructivo y ope-
racional existen diferentes con�iguraciones de
SNOM, las cuatro más básicas se esquematizan en
la �igura 9.11.
El SNOM presenta toda una serie de venta-
jas sobre los microscopios vistos anteriormente,
y la primera de ellas es que prácticamente permi-
te trabajar bajo cualquier condición. Además, no es
una técnica destructiva, más allá del daño que pue-
da causar la iluminación. Al utilizar señales ópticas
reales permite un procesamiento similar o igual
al que se lleva a cabo en la microscopía óptica con
el �in de obtener imagen, pero a diferencia de la
microscopía óptica, la de campo cercano puede me-
jorar hasta 20 veces la resolución.
236
9.4. Microscopio acústico de barrido
El SAM (scanning acoustic microscope) se diseñó
para observar el interior de estructuras biológicas
no transparentes con el �in de causar en la muestra
las menores alteraciones posibles. Sokolov en 1949
fue el primero en observar imágenes acústicas, pero
el primer SAM fue construido por Lemons y Quate
en 1974. La formación de imagen en el SAM es debi-
da sobre todo a la dispersión y re�lexión diferencial
que los distintos tipos de materiales de la muestra
causan sobre las ondas acústicas.
Las ondas ultrasónicas (>20.000 Hz) se
propagan mal en el aire pero lo hacen razonable-
mente bien en medios líquidos y sólidos, y por ello
se emplean en la formación de imágenes de ma-
terial biológico, y el ejemplo más familiar son las
ecogra�ías. Los SAM usan frecuencias que van desde
los 100 MHz (108 ciclos/s) hasta los 4 GHz (4x109
ciclos/s) y por ello, en el mejor de los casos, su λ
es alrededor de 0.3 μm, dato obtenido al aplicar la
expresión l = c / ν, donde c es la velocidad de pro-
pagación del sonido en el agua (1540 m/s) y ν la
frecuencia. Las longitudes de onda utilizadas en mi-
croscopía óptica también están en el rango de las
décimas de μm (0.4-0.7 μm), por lo que la capaci-
dad de resolución del SAM podría ser similar a la
del microscopio óptico. Sin embargo, el índice de re-
fracción que mide la relación de propagación de la
luz entre dos medios nunca es mayor de 1.9 y en el
caso de las ondas acústicas puede tener valores de
10, lo que aumenta hasta casi 5 veces el poder de
resolución del SAM. Otra ventaja a tener en cuen-
ta es que en el SAM no se producen ni aberraciones
esféricas ni cromáticas. Un modo más preciso de
calcular el límite de resolución para el SAM es uti-
lizar la expresión r = (0.6 x F x c) / (f x D), donde F
es la distancia focal, f es la frecuencia, y D el diáme-
tro del focalizador.

Figura 9.12: Esquema de un SAM (izquierda). Esquema básico de un SAM que ilustra el
modo de escaneo tipo TOF (derecha); “t” representa el tiempo.
La capacidad de un determinado medio para
propagar ondas acústicas recibe el nombre de im-
pedancia Z y depende directamente de la densidad
del medio (ρ) y de la velocidad de propagación del
sonido en él (Z = ρ x c), y es en los puntos donde
Z varía donde se producen fenómenos de re�lexión
diferencial. Otro efecto importante de la materia
sobre las ondas acústicas es la atenuación del haz
acústico a medida que este penetra en ella, debido
en parte a fenómenos de dispersión y transforma-
ción en calor. El coe�iciente de atenuación aumenta
con el cuadrado de la frecuencia, de modo que, por
ejemplo, utilizando 2 GHz la penetración del haz
acústico será de aproximadamente 60 μm. Es obvio
que las altas frecuencias mejoran la resolución pero
pierden capacidad de penetración.
El sistema que se encarga de producir, enfo-
car y captar las ondas acústicas está formado por
cuatro componentes: pulsador, transductor, ele-
mento focalizador y acoplante (Figura 9.12). El
pulsador o transmisor se encarga de producir pul-
sos de alto voltaje que inciden sobre el transductor,
que es un sistema piezoeléctrico formado por una
película de óxido de Zn, recubierta en ambas caras
por Au u otro metal, que va adosada a la parte pos-
terior del focalizador. Este es una pieza de cristal de
za�iro (también silicio), que normalmente termi-
na en una estructura esférico-cóncava que puede ir
desde las decenas de μm a los mm de diámetro. Las
ondas acústicas que atraviesan el focalizador con-
vergen en un punto muy próximo a lo que sería el
centro de curvatura de la esfera que generaría la
concavidad. El acoplante es un material que facilita
el paso de las ondas acústicas desde el focalizador
hasta la muestra y suele ser de naturaleza acuosa.
Como los ultrasonidos son focalizados en un peque-
237
Microscopía de barrido por sonda
ño punto de la muestra, para formar la imagen del
área a estudiar es necesario barrer o escanear la
muestra. El sistema de control de barrido permite
hacer rastreos en los ejes X, Y y Z, y suele ser un dis-
positivo de tipo mecánico pues dada la resolución
de las ondas acústicas no tiene sentido utilizar sis-
temas piezoeléctricos similares a los vistos en los
microscopios anteriores cuya resolución es de esca-
la nanométrica o inferior.
Existen dos modos básicos de captura de las
ondas aplicadas a la muestra: el de eco y el de trans-
misión o directo. En el modo de eco se emplean las
ondas re�lejadas por la muestra y el mismo conjun-
to que sirve para producir y enfocar los ultrasonidos
es utilizado para captarlos y, haciendo el camino
inverso, generar una señal eléctrica que, una vez
digitalizada, acabará formando imagen. El modo
de transmisión utiliza las ondas que se transmiten
a través de la muestra y dispone de un sistema de
captación de ultrasonidos similar al que los produ-
ce pero enfrentado a él.
Los modos de escaneo más usuales en fun-
ción de los planos analizados son escaneos en B y
en C; es decir planos verticales Y-Z perpendicula-
res entre sí y paralelos al eje de propagación de las
ondas acústicas (B-scan) o planos horizontales X-Y
perpendiculares al eje de propagación de las on-
das acústicas (C-scan). Múltiples escaneos en C a
diferentes alturas del eje Z (G-scan) son útiles para
reconstrucciones tridimensionales de la muestra.
Un modo de escaneo interesante es el modo TOF
(time of �light), que pone de mani�iesto las alteracio-
nes o cambios existentes en cada plano analizado
en función del retraso que se produce en la llegada
de la onda acústica a su receptor. Este modo es muy
útil en el posicionamiento de las diferentes estruc-
Métodos en biociencias
turas que puede haber en el interior de la muestra
en relación con la super�icie delantera y trasera. Uti-
lizando la primera onda re�lejada al impactar con la
materia también es posible realizar estudios topo-
grá�icos, obviamente combinables con estudios de
planos más profundos (Figura 9.12).
El SAM es un microscopio muy utilizado en
ciencia de materiales ya que se usa para la detec-
ción interna de fracturas, grietas, delaminaciones,
burbujas, �isuras… sin necesidad de desmontar la
pieza a analizar. Las muestras biológicas son bastan-
te idóneas para observar con el SAM pues ofrecen
alto contraste acústico y buena profundidad de pe-
netración; sin embargo, en el campo de la biociencia
todavía no es un microscopio muy utilizado, aunque
ya ha rendido espectaculares resultados en el estu-
dio de algunas estructuras intracelulares como el
citoesqueleto. La posibilidad de uso de todo tipo de
material biológico le hace interesante, pero el hecho
de poderlo utilizar con muestras vivas sin causar
daños le hace especialmente atractivo. Más concre-
tamente, los cultivos celulares son un material más
que idóneo para su observación con el SAM, pues
con ellos se pueden utilizar las frecuencias más
altas sin alcanzar el límite de su capacidad de pe-
netración.
Una variante del SAM es el SLAM (scanning
laser acoustic microscope), que mejora la toma de
muestras a tiempo real del SAM y le hace espe-
cialmente idóneo para estudio en material vivo.
Normalmente trabaja con frecuencias que van des-
de 100 a 500 MHz, lo que permite el análisis de
muestras más gruesas pero, por el contrario, con
peor resolución. Funciona aplicando, desde aba-
jo, ondas acústicas a la muestra de forma análoga a
como lo hace el SAM. Una vez que estas ondas atra-
238
viesan la muestra terminan chocando contra un
cubreobjetos que está por encima de la muestra y
que actúa como un detector de dichas ondas. La su-
per�icie del cubreobjetos es rastreada por un láser y
re�lejada hasta un detector de modo que es posible
formar una imagen con las variaciones que la onda
acústica causa en el cubre.
En algunos textos se suele incluir dentro de
los microscopios acústicos a AFMs que operan en
modo no contacto con frecuencias vibratorias que
van de los 100 a los 400 KHz. Es cierto que estas fre-
cuencias también se usan en los SAM pero los SAM
y los AFM son microscopios totalmente diferentes,
basta comparar su modo de funcionar, su resolu-
ción o su modo de interacción con la muestra.
Bibliografía
Acoustic Microscopy: Fundamentals and Applications.
2008.
Maev RG. Wiley-VCH. ISBN 978-3527407446.
Atomic Force Microscopy for Biologists. 2009.
Morris VJ, Kirby AR, Gunning AP. World Scientific. ISBN 978-
1848164673.
Atomic Force Microscopy in Liquids. Biological Applica-
tions. 2012.
Baró AM, Reifenberger G. Wiley-VCH. ISBN 978-
3527327584.
Scanning Probe Microscopy. 2011.
Tomczak N, Goh KEJ. World Scientific. ISBN 978-
8914324762.
Scanning Probe Microscopy. The Lab on a Tip. 2004.

Histoquímica
e histoenzimología
10.1. Histoquímica
En sentido estricto la Histoquímica es la parte de
la Histología que estudia la composición química
de los tejidos, aunque también se considera la cien-
cia que se ocupa de la localización topográ�ica de
sustancias químicas (histoquímica) y actividades
metabólicas (histoenzimología) a nivel de tejidos,
células y orgánulos celulares que conservan íntegra
su estructura. La Histoquímica permite obtener una
imagen química y un per�il metabólico de órganos,
tejidos y células, completando así los conocimien-
tos citológicos e histomorfológicos de los mismos.
Atendiendo a los mecanismos usados en la
identi�icación de una determinada sustancia, se di-
ferencian varios tipos de técnicas histoquímicas:
— La identi�icación simple: aquella en la que
no se precisa ninguna reacción química
porque la sustancia del tejido es recono-
cida en virtud de sus propiedades �ísicas:
absorción UV o de rayos X, �luorescencia,
características espectrales, etc.
— La identi�icación directa: posible si las
moléculas, al reaccionar con otros com-
puestos químicos, originan un producto
coloreado e insoluble.
10.
Raquel R. Gragera
Joaquín Plumet
— La identi�icación mediante reacciones
indirectas: posible al usar una o varias re-
acciones acopladas intermedias antes de
obtener un producto �inal identi�icable.
Son varios los condicionantes que debe cumplir una
reacción histoquímica para que el resultado sea �iable:
— La conservación de la exacta localiza-
ción de las moléculas, lo que implica la
perfecta conservación morfológica del
tejido y la ausencia de fenómenos de
desplazamiento de las sustancias en los
pre-tratamientos de las muestras.
— La especi�icidad de la propia reacción his-
toquímica, debiendo existir reactivos
activadores o inhibidores para la identi�i-
cación de las moléculas.
— La detección microscópica del producto
�inal.
De modo general, la técnica histoquímica con-
siste en someter las muestras histológicas a su
incubación en soluciones especí�icas que contie-
nen determinados reactivos, que posibilitarán
la localización de ciertas moléculas, dependien-
do de su naturaleza exacta y condicionada por sus
propiedades �ísico-químicas. Si la sustancia a in-
Métodos en biociencias
Figura 10.1: Formación de compuestos de adición por reacción del reactivo de Schiff con aldehídos.
vestigar no es hidrosoluble, en su determinación
histoquímica solo será necesario mantener dicha
insolubilidad. En el caso de ser hidrosolubles su
determinación histoquímica requerirá su precipita-
ción in situ. La mayoría de las reacciones químicas
son dependientes de la temperatura, teniendo lu-
gar a mayor velocidad al aumentar la temperatura
de la reacción. Teniendo ello en cuenta las reaccio-
nes histoquímicas veri�icadas a baja temperatura
revelarán las localizaciones en las que existan las
mayores concentraciones de la sustancia que se in-
vestiga. También puede resultar útil la reacción a
distintas temperaturas, identi�icando diferentes
isoformas de una determinada enzima.
Las reacciones histoquímicas o las incu-
baciones pueden llevarse a cabo sobre cortes
histológicos adheridos a portaobjetos o �lotando
en un pocillo que contenga el medio de reacción
o incubación. Como muchas de ellas se desarro-
llan a 37 ºC, será necesario evitar la evaporación
del medio en atmósfera húmeda o utilizando
pocillos cerrados herméticamente. Es aconsejable
desarrollar las reacciones con agitación ligera o
vibración, facilitando así la impregnación de los
cortes y evitando que por gravedad se depositen en
el fondo del pocillo.
El reactivo histoquímico debe ser difusible,
para penetrar rápidamente y llegar simultáneamen-
te a las diferentes regiones del corte histológico. La
importancia es obvia: si su penetración es lenta, el
producto de reacción formado puede impedir la pe-
netración del resto del reactivo hacia zonas más
240
profundas del propio corte histológico. Para faci-
litar la penetración de los reactivos en los cortes,
estos pueden tratarse con dimetilsulfóxido (DMSO),
un disolvente que aumenta la permeabilidad de las
membranas biológicas. Sin embargo, será necesario
desarrollar paralelamente los controles adecuados,
para veri�icar su efecto sobre la estructura.
Una vez �inalizada la reacción histoquímica, los
cortes histológicos deben ser lavados en soluciones
tamponadas y montados convenientemente, tenien-
do en cuenta que los medios de montaje no deben
alterar la estabilidad del producto �inal de la reac-
ción. En general los medios de montaje más usados
son el bálsamo del Canadá, el CAEAX (bálsamo del
Canadá sintético), el DePeX, la glicerina-gelatina,
la para�ina líquida o la para�ina espesa y el Fluoro-
pan®.
10.1.1. Determinación de radicales alifáticos:
aldehídos y cetonas
A excepción de las �ibras elásticas, resulta excepcio-
nal que los tejidos biológicos exhiban compuestos
aldehídicos y cetónicos libres, por lo que solo son
efectivos después de pretratamientos capaces de
originar estos grupos. El reactivo más utilizado es
el reactivo de Schiff, formado a partir de fuscina bá-
sica que al reaccionar con grupos aldehído origina
compuestos de adición coloreados rojo/rojo-viole-
ta tras la alteración del cromóforo generando una
forma con conjugación extendida causante del co-
lor (Figura 10.1).
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.2: Determinación de alcoholes y glicoles.

Existe cierta controversia acerca de la estruc-
tura del producto �inalmente formado, con uno
o dos restos aldehídicos incorporados, si bien la
forma di-sustituida parece la más probable. El me-
canismo de esta reacción parece complejo y está
aún sujeto a discusión. Sin embargo, en la prácti-
ca histoquímica pocos son los casos en los que la
reacción positiva con el reactivo de Schiff no sea in-
dicativo de la presencia de aldehídos.
— Protección del ácido carboxílico mediante
su esteri�icación con metanol en presen-
cia de un ácido (Figura 10.3), de forma
que el éster formado no reacciona con
colorantes básicos ni produce metacro-
masia.
— Inhibición de la metacromasia con pre-
tratamiento con acetato de uranilo.

10.1.4. Determinación de alquenos

10.1.2. Determinación de alcoholes
Los alcoholes no son fácilmente detectables, salvo
si previamente se hacen reaccionar con ácido sulfú-
rico o ácido fosfórico. En ambos casos se forma un
éster (sulfúrico o fosfórico) con propiedades fuerte-
mente metacromáticas.
La evidencia de agrupaciones de radicales -OH
como en los glicoles consiste en la oxidación me-
diante ácido periódico seguida del tratamiento con
reactivo de Schiff, procedimiento que se denomina
reacción del PAS (ácido periódico-reactivo de Schi-
ff). La oxidación producida por el ácido periódico, a
temperatura ambiente y en medio ligeramente áci-
do, conduce a la rotura del enlace C-C y la formación
de los aldehídos correspondientes. Esta ruptura
ocurre también cuando uno de los átomos de car-
bono está unido a un grupo hidroxilo o carbonilo y
el otro es portador de un grupo hidroxilo, carbonilo,
amino primario o secundario (Figura 10.2).
10.1.3 Determinación de grupos carboxilo
Los alquenos (CnH2n) son hidrocarburos cuyo gru-
po funcional es un doble enlace (>C=C<) sin libertad
de giro debido a las características de su hibrida-
ción sp2. Se dice que un isómero es Z cuando los dos
grupos más importantes se encuentran en el mismo
lado del plano medio molecular, y es E cuando se
encuentran en lados opuestos. Este sistema emplea
las reglas de Cahn-Ingold-Prelog para la prioriza-
ción de sustituyentes (Figura 10.4).
En los tejidos animales encontramos dobles
enlaces en los lípidos insaturados, pigmentos como
los ceroides, y ciertas fuscinas y lipofuscinas.
Figura 10.3: Formación de un éster metílico por re-
acción de un ácido carboxílico con metanol.

El grupo carboxilo de un ácido carboxílico puede

encontrarse bien en forma ionizada (-COO-) o no io-
nizada (-COOH). En la primera el grupo carboxilo
reacciona con colorantes básicos, siendo esta la cau-
sa de la baso�ilia y la metacromasia de numerosos
constituyentes celulares y tisulares. Sin embargo, se
pueden realizar las siguientes reacciones de identi-
�icación de la función carboxilo: Figura 10.4: Alquenos Z y E.

241
Métodos en biociencias
Figura 10.5: Determinación histoquímica de dobles enlaces.
Se consideran dos tipos de reacciones histo-
químicas que sirven para poner de mani�iesto los
dobles enlaces: las reacciones de oxidación y las de
adición de halógenos.
— Oxidación con formación de peróxidos y al-
dehídos, utilizando reactivos como ácido
perfórmico-reactivo de Schiff y ácido pera-
cético-reactivo de Schiff. El proceso implica
la formación del epóxido por acción del
perácido, transformación del epóxido en
aldehído y determinación del mismo por
medio del reactivo de Schiff (Figura 10.5).
— Adición de Br2: la reacción con Br2 permi-
te la identi�icación de dobles enlaces por la
desaparición del color violeta característi-
co del bromo. En histoquímica la reacción
se realiza incubando los cortes histológicos
con una solución de bromo en cloroformo,
en ácido acético o tetraclorometano (Figu-
ra 10.5).
10.1.5. Determinación de compuestos aromá-
ticos
El concepto de aromaticidad y de compuestos aro-
máticos está asociado a su estabilidad relacionada
con su estructura electrónica. Esta estabilidad ex-
plica que tiendan a experimentar procesos de
sustitución y no de adición, a �in de preservar su
estructura electrónica básica. Se de�ine como aro-
Figura 10.6: Principales sistemas aromáticos en Histoquímica.
242
mático todo compuesto cíclico con dobles enlaces
conjugados y 4n+2 electrones deslocalizados en su
estructura, siendo n un número entero igual o ma-
yor que 0.
Los principales sistemas aromáticos de interés
en Histoquímica (Figura 10.6) son el fenol (pre-
sente en la tirosina, adrenalina, noradrenalina), el
indol, el pirrol (en el triptófano, serotonina y me-
latonina), el imidazol (en la histidina), la pirimidina
(en la citosina, timina o uracilo) y la purina (en la
adenina y guanina).
La determinación histoquímica se basa, en pri-
mer lugar, en la formación de sales complejas de
hierro de color azul-violeta en presencia de una
solución acuosa de cloruro férrico, neutra o débil-
mente ácida. Los procedimientos más especí�icos
son las reacciones de Millon y la azorreacción.
Reacción de Millon
Se utiliza para evidenciar la presencia de tirosina en
las proteínas. Se basa en el tratamiento de los cortes
con una sal de mercurio y nitrito sódico en solución
muy ácida. En estas condiciones el nitrito sódico ge-
nera ácido nitroso que pierde agua para dar lugar
al catión nitrosonio. La reacción de este con el fe-
nol tiene lugar en posición orto proporcionando el
correspondiente nitrosoderivado. Este último, en
equilibrio con su forma tautómera, reacciona con la
sal mercúrica formando un complejo mercurial de
color rojo. Esta reacción se produce con todos los
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.7: Reacción de Millon.

Figura 10.8: Reacción de copulación de los fenoles con una sal de diazonio
para dar un colorante azoico o azocolorante.

Figura 10.9: Principales sales de diazonio o precursores empleados en la azorreacción.

fenoles excepto con aquellos disustituidos en posi- ción)

ciones orto y meta (Figura 10.7).
Se denomina tautomería al intercambio de
un átomo de hidrógeno entre otros dos átomos de
la misma molécula, en ambos casos formando un
enlace covalente.
Copulación con una sal de diazonio (azorreac-
Se basa en la formación de un azocompuesto colorea-
do o colorante azoico por reacción de un fenol o naftol
en medio alcalino, con una sal de diazonio, generada
por reacción de anilina o un derivado suyo con nitrito
sódico en medio ácido (ver �igura 10.7). Los azocom-
puestos así formados (Figura 10.8) tienen anillos
aromáticos conjugados con un grupo azo, que es un
fuerte cromóforo, por lo que la mayoría son colorea-
dos (azocolorantes).

243
Métodos en biociencias

10.1.6. Determinación de grupos reductores

Los grupos reductores se ponen de mani�iesto me-
diante la reducción con reactivos que conduzcan a
la formación de un producto �inal, no difusible y vi-
sible A microscopía. Los reactivos más utilizados
son el ferricianuro férrico, el ferricianuro potásico
Figura 10.10: Reacción argenta�ín.
en presencia de sulfato de cobre, las sales de plata y
las sales de tetrazolio.

Las principales sales de diazonio utilizadas

como tales o generadas a partir de las correspon-
dientes aminas aparecen en la �igura 10.9. Asimismo,
con el mismo nombre general debe incluirse el
llamado Nuclear Fast Red, con la estructura antra-
quinónica.
Reacción argentafín de oxidación
Reacción con ferricianuro férrico
Consiste en la reducción del ferricianuro férrico
incoloro en ferrocianuro férrico de intenso color
azul (azul de Prusia) por acción de grupos reduc-
tores (Figura 10.11). Dan reacción positiva frente al
ferricianuro férrico los tioles (RSH) y los mono- o
polifenoles presentes en numerosas moléculas (Fi-
gura 10.11).

La identi�icación de orto- y para-difenoles se basa Reacción con ferricianuro potásico en presencia

en su elevado poder reductor, lo que permite su fácil
oxidación a quinonas. Es el caso de la llamada reac-
ción argenta�ín, empleada en la determinación de
los precursores biológicos de la melanina como el
5.6-dihidroxindol (método de Fontana-Masson) (Fi-
gura 10.10).
de sulfato de cobre
Permite determinar grupos tiol con formación de
disulfuros. Por ejemplo, la reacción de la tiocolina
con ferricianuro potásico (rojo de Prusia) da lugar a
la formación de ditiobiscolina y ferricianuro de co-
bre (pardo de Hatchett) (Figura 10.12).

Figura 10.11: Reacción de reducción del ferricianuro férrico y algunas estructuras que pueden determinar-
se por este método.

Figura 10.12: Esquema de la reacción de grupos tiol con ferricianuro potásico

en presencia de sulfato de cobre.

244
 Histoquímica e histoenzimología

Reacción con sales de plata

Estas sales permiten poner de mani�iesto grupos
reductores, precisando que estas reacciones no son
las impregnaciones argénticas, en las que las mues-
tras se tratan con sales de plata y siendo los agentes
reductores las propias moléculas presentes en los
tejidos.. Los principales compuestos tisulares capaces
de reducir sales de plata son los orto- y para-difeno-
les (como la adrenalina y noradrenalina), ciertos
aldehídos, el ácido úrico y los uratos, las hexosas y la
5-hidroxitriptamina (serotonina).
Figura 10.13: Reacción de reducción de las sales de tetrazolio.
Reacción con sales de tetrazolio

Estas sales son solubles e incoloras en estado oxi-

dado, e insolubles y coloreados en estado reducido,
formando sales denominadas formazanos. Ello las
convierte en las herramientas adecuadas para la
determinación de funciones reductoras en medios
fuertemente alcalinos.
Son muchas las sales de tetrazolio empleadas
en Histoquímica. Todas ellas derivan del ión mono-
tetrazolio o del ditetrazolio y su reducción conduce,
respectivamente, a la formación de monoformaza-
nos o diformazanos (Figura 10.13).
10.1.7. Determinación de hidratos de carbono
Histoquímicamente se clasi�ican con arreglo a la
presencia en ellos de determinados grupos funcio-
nales, detectables mediante apropiadas técnicas de
visualización. En este sentido pueden considerar-
se tres grandes grupos de hidratos de carbono: los
polisacáridos simples, las mucosustancias neutras
y las mucosustancias ácidas (glicosaminoglicanos).
Reacción del PAS o del ácido peryódico de Schiff
Permite revelar la presencia de mucinas, almidón,
amiloide, celulosa y glucógeno. El ácido peryódi-
co es un oxidante que rompe los dioles vecinales
originando compuestos carbonílicos, cetonas o al-
dehídos (véase �igura 10.2b). No se producen, en
cambio, reacciones de oxidación si los grupos –OH,
C=O, –NH2 y –NH– no están situados en un carbono
contiguo a otro que soporta un grupo –OH, ni si este
está esteri�icado.
Reacción con hidrazidas
Los grupos aldehído de los hidratos de carbono
reaccionan con hidrazidas, como la 3-hidroxi-2-naf-
tohidrazida, dando lugar a la correspondiente
hidrazina. A su vez estas hidrazinas reaccionan con
sales de diazonio para dar lugar a los correspon-
dientes colorantes azoicos (Figura 10.14).

Figura 10.14: Reacción de los aldehídos con hidrazinas sustituidas dando lugar a hidrazonas que se
revelan con sales de diazonio formando colorantes azoicos visibles microscópicamente.

245
Métodos en biociencias

Figura 10.15: Reacción de los aldehídos para proporcionar compuestos colo-

reados.

Reacción con p-fenilendiamina

Los aldehídos, formados por oxidación de poli-
sacáridos, reaccionan en presencia de H2O2 con
p-fenilendiamina (Figura 10.15) dando un produc-
to �inal coloreado.

10.1.8. Determinación de mucosustancias áci- Figura 10.16: Estructura del azul de me-
das (glicosaminoglicanos) tileno y del azur A.

Las mucosustancias ácidas (glicosaminoglicanos)

son macromoléculas formadas por hexosas, al-
gunas de ellas pueden ser portadoras de grupos
ácidos (carboxilo, sulfato o fosfato) que les con-
�ieren carácter polianiónico. Ello resulta útil en su
identi�icación. Varias son las reacciones utilizadas
para revelar mucoustancias:
Estudio de la basofilia
Las mucosustancias ácidas son polianiones capa-
ces de reaccionar con colorantes catiónicos. Entre
los más utilizados se encuentran el azul de metileno
y el azur A, usados a diferentes valores de pH (Figu-
ra 10.16).
Estudio de la metacromasia
Las mucosustancias ácidas se caracterizan por teñir-
se de un color distinto al que presentan las soluciones
de colorantes básicos. Esta propiedad es más acusada
en las mucosustancias portadoras de un éster sulfú-
rico que en las portadoras de grupos carboxilo, y es
suprimida totalmente cuando se bloquean los grupos
responsables de la misma. Para analizar metacroma-
sia se utilizan tiazinas como azul de toluidina, azur A,
B y C; acetato de tionina y violeta de metilo (Figura
10.17).

Figura 10.17. Estructura de los colorantes catiónicos empleados en el estudio de la metacromasia de

las mucosustancias ácidas.

246

Figura 10. 18: Estructura del azul Alcián.
Reacción con azul Alcián
Este compuesto pertenece al grupo de las ftalociani-
nas cúpricas, compuestos coloreados formados por la
unión de cuatro anillos de isoindol a través de cua-
tro átomos de nitrógeno, llegándose a un sistema con
dobles enlaces conjugados. La parte central de la mo-
lécula puede coordinarse con un átomo metálico. En
solución a pH=2.0, reacciona con los ácidos urónicos
de las mucosustancias, mientras que a pH=1.0 la re-
acción solo se produce con las sulfosustancias (Figura
10.18).
Reacción de captura de hierro o del hierro coloi-
Figura 10.19: Técnica del hierro coloidal para el revelado de mucosustancias ácidas.
Figura 10.20. Estructura de la
N,N-dimetil-p-fenilendiamina.
247
Histoquímica e histoenzimología
dal
Los grupos ácidos libres de los tejidos tienen
a�inidad por el Fe3+ coloidal a pH=2.0. Esta deter-
minación comprende dos etapas: en la primera,
no visible a microscopía óptica, el hierro coloidal
reacciona con los grupos ácidos. En la segunda, el
compuesto formado se revela mediante la reacción
del azul de Prusia, usando HCl y ferrocianuro potá-
sico (Figura 10.19).
Método de la diamina
La N,N-dimetil-p-fenilendiamina (Figura 10.20) for-
ma productos de condensación pardo-naranja con
aldehídos. Tras un tiempo de reacción prolongado,
reacciona con los grupos ácidos de los mucopolisa-
cáridos, originando complejos de color negro.
10.1.9. Determinación de glucógeno
El glucógeno es el polisacárido de reserva ener-
gética de los tejidos animales. Se encuentra como
gránulos citoplásmicos en numerosas células como
hepatocitos, miocitos y células de glía. Algunos �i-
jadores pueden alterar su localización por lo que
deben usarse los líquidos de Carnoy, de Bouin-Allen,
etanol-formol y líquido de Gendre (ver capítulo
7). A pesar de todo, los métodos de �ijación �ísicos
(crio-desecación y congelación-sustitución) pro-
porcionan los mejores resultados.
La determinación del glucógeno puede llevarse
a cabo con la determinación de los grupos vic-gli-
col (PAS-dimedona o método de Bauer) o método
de PAS con digestión enzimática previa con amilasa.
El primero consiste en el tratamiento con solución
 Métodos en biociencias

Figura 10.21: Estructuras del rojo Congo y DMAB.

etanólica de dimedona (5.5-dimetil-1.3-ciclohexa- 10.1.11. Determinación de glicoproteínas

nodiona) entre la oxidación y el reactivo de Schiff
La identi�icación de glicoproteínas se basa en su
(véase epígrafe 1.4), para bloquear la reactividad de
unión especí�ica a lectinas vegetales. Hay cientos de
todos los aldehídos formados por la oxidación de los lectinas diferentes, cada una de las cuales reconoce
polisacáridos, excepto los procedentes del glucóge- residuos especí�icos de un hidrato de carbono.
no. En el método de Bauer la oxidación se realiza La concanavalina-A es una proteína tetramérica
con una solución acuosa de ácido crómico, y los al- globular, que se une especí�icamente a polisacáridos
dehídos formados se revelan con reactivo de Schiff. rami�icados que contienen residuos terminales no
reducidos de α-D-glucopiranosa, α-D-manopirano-
sa y α-D-fructopiranosa, en regiones super�iciales
10.1.10. Determinación del amiloide de las glicoproteínas (Figura 10.22).
La reacción es de tipo inmunológico: la conca-
El amiloide es una glicoproteína que se deposita en
navalina-A posee dos sitios activos, uno de unión a
diversos órganos y tejidos en diferentes estados pa-
tológicos como consecuencia de una alteración en
el metabolismo proteico. Con rojo Congo (Figura
10.21) el amiloide muestra birrefringencia y di-
croismo cuando se examina con luz polarizada, de
forma que el verde anisotrópico facilita la identi�i-
cación especí�ica del amiloide; con violeta de metilo,
la metacromasia se produce a pH=1.6, y desaparece
si se pretratan los tejidos con fenol en frío.
El amiloide da reacción positiva frente a la
reacción del DMAB (4-(dimetilamino) benzaldehí-
do-nitrito (Figura 10.21), reacción característica de
indoles.

Figura 10.23: La concanavalina-A es una herramienta

Figura 10.22: Estructura de los residuos terminales a los que se une la con- útil en la determinación microscópica y submicroscópi-
canavalina-A. ca de glicoproteínas.

248
 Histoquímica e histoenzimología

las glicoproteínas de membrana y otro por el que

se une a la peroxidasa, por lo que se convierte en
una herramienta útil en la localización de glicopro-
teínas (Figura 10.23). Además son capaces de unir
�luorocromos (�luoresceína, rodamina) y otras enzi-
mas (fosfatasa alcalaina), lo que permite reacciones
de �luorescencia o enzimáticas.

10.1.12. Determinación histoquímica de lípidos

Los lípidos son moléculas orgánicas con muy dife-

rentes grupos funcionales, por lo que se clasi�ican
atendiendo a su solubilidad. Son numerosas las téc-
nicas destinadas a la identi�icación de lípidos.
Figura 10.24: Depósitos negros que revelan la presencia
de lípidos hidrófobos en hepatocitos de hígado de rata. Mé-
todo NaOH-OTAN (x100).

Método del nitrato de mercurio

Consiste en el tratamiento con nitrato de mercurio

II, formándose un complejo mercurial que, al reac-
cionar con difenilcarbazona, origina un producto
�inal de color azul-violeta.
Método OTAN (tetróxido de osmio-naftilamina)
Método NaOH-OTAN
Consiste en una hidrólisis previa con NaOH antes de
tratar los cortes histológicos con el método OTAN.
Así se revelan lípidos álcali-resistentes como la es-
�ingomielina (Figura 10.24).

Consiste en el tratamiento con clorato potásico,

tetróxido de osmio y 1-naftilamina. Como conse-
cuencia de la reacción histoquímica se producen
dos productos �inales, de los cuales uno es negro
(OsO2 que revela los lípidos hidrófobos) y el otro
rojo (complejo de osmio-naftilamina) que revela los
lípidos hidró�ilos.
Método del hidroxamato
Se basa en la facilidad de los ésteres carboxílicos
para reaccionar con hidroxilamina, con formación
del correspondiente ácido hidroxámico. Este re-
acciona con ciertos iones metálicos, como Fe(III)
y Au(III), proporcionando compuestos coloreados

Figura 10.25: Reacción histoquímica del hidroxamato para revelar fosfolípidos.

Figura 10.26: Método del cloruro de mercurio para la determinación de plasmalógenos, factor acti-
vador de plaquetas (PAF).

249
Métodos en biociencias
Figura 10.27: Técnica del PAN (ácido perclórico-naftoquinona) para revelar colesterol y derivados.
(Figura 10.25). Al ser el reactivo hidrosoluble, solo
darán reacción positiva los fosfoglicéridos hidró-
�ilos. No reaccionan los es�ingolípidos porque el
ácido graso se une a es�ingosina por un enlace ami-
da no reactivo en las condiciones empleadas.
Método del cloruro de mercurio
Se basa en la reacción entre el mercurio y los en-
laces éter , β-insaturados con formación de un
compuesto de adición mercurial. Este, al reaccionar
con difenilcarbazona origina un quelato de color
azul-violeta (Figura 10.26).
10.1.13. Determinación de glicolípidos
Técnica del PAS
Permite identi�icar la presencia de 1.2-glicoles
en las hexosas de los gangliósidos y cerebrósidos
mediante la reacción PAS positiva en cortes his-
tológicos tratados previamente con bromo (que
bloquea los dobles enlaces) o tratados previamente
con 2.4-dinitrofenilhidrazina (que bloquea los alde-
hídos originados a partir de los enlaces ole�ínicos
tras la reacción con ácido perfómico).
Figura 10.28: Reacción de Lieberman-Schultz.
250
Técnica del resorcinol (1.3-dihidroxibenceno)
Se basa en la capacidad del resorcinol para reaccio-
nar con los aldehídos que se producen durante la
hidrólisis con HCl del ácido neuramínico y del ácido
siálico. Como consecuencia de la reacción se forma
un producto �inal de color rojo.
10.1.14. Determinación del colesterol
y sus derivados
Técnica del ácido perclórico-naftoquinona (PAN)
Se trata de una técnica muy especí�ica basada en la
reacción del colesterol, y otros esteroides de con-
�iguración 3-hidroxi-Δ5 ó 3-hidroxi-Δ3.7, con ácido
perclórico. En la reacción se forma colesta-3.5-die-
no que, en presencia de 1.2-naftoquinona-4-sulfato,
origina un pigmento azul oscuro (Figura 10.27).
Reacción de Lieberman-Schultz
Consiste en el tratamiento del colesterol y sus de-
rivados con alumbre de hierro o cloruro férrico,
seguido de tratamiento con una mezcla de anhí-
drido acético y ácido sulfúrico (Figura 10.28) con
formación de un producto �inal verdoso.

Figura 10.29: Revelado de grupos amino de las proteínas con ninhidrina.
Reacción de la digitonina
El colesterol reacciona con digitonina conduciendo
a la formación de un complejo cristalino insoluble
en agua, alcohol y éter, pero soluble en ácido acético
y piridina, que resulta visible a microscopía electró-
nica.
10.1.15. Determinación de lípidos no saturados
Se lleva a cabo mediante la reducción con OsO4, que
origina la formación de óxido de osmio negro (OsO2),
por la oxidación de los dobles enlaces mediante tra-
tamiento con ácido perfórmico o peracético, con la
formación de los epóxidos correspondientes.
10.1.16. Determinación de proteínas
Las proteínas son polímeros de aminoácidos uni-
dos mediante un enlace amida (enlace peptídico).
Pese a la ubicuidad de las proteínas en células y
tejidos, la determinación de qué tipo de proteína
predomina en una estructura histológica concreta,
en diferentes condiciones de experimentación o en
diversas situaciones patológicas es el objetivo de la
histoquímica. Son muchas las técnicas que permi-
ten esta identi�icación.
Reacción con sales de diazonio
Consiste en el tratamiento con una solución alcalina
de una sal de diazonio, de forma que se combinan
con el grupo fenólico de la tirosina, el núcleo indó-
lico del triptófano y con el resto de imidazol de la
histidina, para originar un producto intensamente
coloreado. Esta reacción puede, por tanto, utilizarse
251
Histoquímica e histoenzimología
como indicadora general del contenido proteico en
un determinado corte histológico.
Método OTA (oxidized tannin-azo method)
Consiste en la reacción del ácido tánico (ácido
digálico) con las proteínas, con la oxidación
subsiguiente con ácido peryódico para originar una
quinona, que se une �inalmente a una sal de diazo-
nio, dando lugar a un colorante azo-quinónico.
Método OTO (oxidized tannin-oxazine method)
Consiste en la reacción de la quinona, formada de la
misma forma que en el método anterior, con 6-ami-
no-3-dimetilaminofenol, formándose una solución
de color azul.
Método de la acroleína-Schiff
Se basa en el acoplamiento de la acroleína (prope-
nal) con las proteínas y la posterior reacción del
reactivo de Schiff con los grupos aldehído de la acro-
leína. La acroleína puede reaccionar con los grupos
sulfuro, amino primario y secundario e imidazol de
las proteínas. El compuesto formado reacciona con
el reactivo de Schiff. Esta reacción es especí�ica si
previamente se realiza una extracción de fosfolípi-
dos.
Identificación de proteínas por su contenido
en grupos amino
Reacciones basadas en la desaminación oxidati-
Métodos en biociencias

Figura 10.30: Esquema de la reacción que permite revelar los grupos amino de las proteínas cuando reaccio-
nan con aloxán.

Figura 10.31: Compuestos aldehídicos utilizados para la condensación

con aminas primarias en la reacción de formación de iminas para la de-
terminación de grupos amino.

va con ninhidrina o aloxán dan origen a CO2, NH3 y aldehídos, reduciéndo-

La ninhidrina origina un compuesto coloreado al re-
accionar con aminoácidos, proteínas o polipéptidos.
En el curso de esta reacción se originan aldehídos,
amoniaco y CO2 (Figura 10.29). A continuación
se produce la condensación entre el producto de
reducción de la ninhidrina, una molécula de ninhi-
drina intacta y una de amoniaco, dando origen a un
compuesto violeta.
En presencia de aloxán (Figura 10.30) y al
igual que ocurre con la ninhidrina, los aminoácidos
se el aloxán a ácido dialúrico. Una molécula de
este reacciona con otra de aloxán sin transformar,
formándose aloxantina. Esta reacciona con el amo-
niaco formado en la primera etapa proporcionando
purpurato de amonio (murexida).
Reacciones de formación de iminas
Consisten en la formación de iminas por conden-
sación de aldehídos (Figura 10.31) con aminas

Figura 10.32: Revelado de grupos amino de las proteínas mediante reacción con DNFB y una sal de dia-
zonio para formar un colorante azoico.

252

Figura 10.33: Esquema del desarrollo de reacciones para la determinación histoquímica de
triptamina y 5-hidroxitriptamina.
primarias. Las iminas, una vez formadas, se determi-
nan mediante el reactivo de Schiff (véase �igura 10.1).
Reacciones de condensación
El DNFB reacciona con los grupos amino forman-
do un producto de condensación (Figura 10.32).
Su monoreducción, diazotación de la amina resul-
tante y copulación de la sal de diazonio con el ácido
bis-sulfónico, proporciona un colorante azoico.
10.1.17. Determinación de aminas biógenas
Las aminas biógenas se originan por descarboxi-
lación de aminoácidos. Suelen tener una intensa
actividad farmacológica, actuando como precur-
sores de enzimas o interviniendo activamente en
la transmisión del impulso nervioso. De entre las
aminas biógenas con actividad neuroefectora, unas
poseen en su molécula el grupo catecol, mientras
que otras poseen el grupo indol. A las primeras
se las denomina catecolaminas (adrenalina, nora-
drenalina, dopamina y tiramina) y a las segundas
indolaminas (triptamina y 5-hidroxitriptamina)
(ver �igura 10.11).
Estudio histoquímico de la histamina
Se utiliza el método OPT que consiste en la con-
densación de la amina con o-ftaldialdehído
(1.2-bencenodicarboxaldehído) para dar origen a
un �luoróforo que emite dos tipos de �luorescencia:
una azul con excitación máxima en 365 nm, y otra
amarillenta con excitación máxima en 405 nm.
253
Histoquímica e histoenzimología
Determinación de catecolaminas
La técnica consiste en usar etilendiamina, disuelta
en isopropanol o en forma de vapor: con ello, la no-
radrenalina tisular emite una �luorescencia máxima
a 470 nm, la adrenalina a 500 nm y la dopamina a
490 nm.
Determinación de indolaminas
La triptamina reacciona con formaldehído originan-
do norharmanos a través de la formación de triptolina
como intermediario (Figura 10.33). La 5-hidroxitrip-
tamina se detecta a través de la misma reacción y
mediante la formación de colorantes tioíndigo de
color rojizo, vía oxidación de la β-carbolina inicial-
mente formada y posterior reacción con tioindoxilo.
10.1.18. Determinación de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son agrupaciones de nucleó-
tidos formados, a su vez, por ácido fosfórico, una
pentosa (ribosa o desoxirribosa) y una base (púri-
ca o pirimídica). Son, por lo tanto, polinucleótidos
que, por otra parte, bajo la acción de una fosfata-
sa se escinden dando lugar a una molécula de ácido
fosfórico y a otra de nucleósido. Las nucleoproteí-
nas resultan de la combinación de proteínas básicas
con ácidos nucleicos. Para detectar ácidos nucleicos
se usan reacciones como las siguientes.
Reacciones de residuos púricos y pirimídicos
El método se basa en que las bases púricas con es-
tructura de purina y pirimídinicas con estructura de
pirimidina (véase �igura 10.6) absorben luz ultra-
violeta de 260 nm. Esta absorción depende en parte
Métodos en biociencias

Figura 10.34: Esquema de la reacción de Feulgen-Rossenbenck para la detección histo-

química de los residuos glucídicos de los ácidos nucleicos.

Figura 10.35: Estructura de las moléculas de verde de metilo y pironina Y usados en la reacción di-
ferencial para determinar ácidos nucleicos.

del pH, debido a las reacciones de ionización de las
bases. Es recomendable un pretratamiento con áci-
do tricloroacético en frío, eliminando del tejido las
sustancias que absorben en la misma longitud de
onda.
La metodología a seguir para efectuar un es-
tudio diferencial de cada ácido nucleico implica el
pretratamiento de algunas preparaciones con ribo-
nucleasa y la posterior reacción diferencial.

Reacciones que evidencian residuos

de carbohidrato
La reacción de Feulgen y Rossenbeck se basa en
que una hidrólisis ácida ocasiona la ruptura del nu-
cleótido y la separación de las bases. El resto de
carbohidrato que se obtiene tras la escisión (ácido
apurínico) es capaz de reaccionar con el reactivo de
Schiff, originando como producto �inal una azome-
tina coloreada (Figura 10.34).
Reacción diferencial con verde de metilo-pironi-
na
Es un método muy útil porque pone de mani�iesto
simultáneamente los dos tipos de ácidos nucleicos.
Esta técnica utiliza dos reactivos catiónicos, verde
de metilo y pironina Y (Figura 10.35), aplicados si-
multáneamente bajo condiciones, cuidadosamente
controladas de concentración y pH. Los resultados
son la tinción del DNA de azul verdoso y del RNA de
rojo brillante.
10.2. Histoenzimología
Las técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas
permiten la localización de las enzimas en los teji-
dos; sin embargo, estas metodologías no aseguran
la demostración de la actividad enzimática, es de-
cir, las enzimas pueden estar �ísicamente pero no
encontrarse en sus formas activas. Son las técnicas
histoenzimológicas las que permiten localizar la ac-
tividad de una determinada enzima en los tejidos.
Su estudio resulta de gran importancia ya que el
conjunto de enzimas sintetizadas en una célula de-
termina el tipo de metabolismo que tendrá, siendo
esta síntesis, a su vez, dependiente de la regulación
de la expresión génica.
Las enzimas son proteínas que actúan de bio-
catalizadores especí�icos que, sin consumirse en
una reacción, aumentan notablemente su velocidad,
siempre que estas sean termodinámicamente posi-
bles. Prácticamente todas las reacciones químicas
que tienen lugar en los seres vivos están cataliza-
das por enzimas.

254
 Histoquímica e histoenzimología

Son diversas las formas de nombrar las enzi- — Clase EC 5, Isomerasas. Catalizan la in-
mas: bien se les asignan nombres particulares, que terconversión de isómeros. Incluyen las
no obedecen a ninguna regla sistemática o nombres epimerasas, mutasas, racemasas, tauto-
sistemáticos, que consisten en un nombre con tres merasas, etc.
partes haciendo referencia al sustrato preferente, — Clase EC 6, Ligasas. Catalizan la unión de
el tipo de reacción catalizada y una terminación en
dos sustratos con la hidrólisis simultá-
–asa. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología
nea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP,
Molecular ha desarrollado una nomenclatura para
identi�icar a las enzimas basada en los denomina- etc.). Incluyen las carboxilasas, peptido-
dos Números EC (enzyme comission): así, cada enzima sintetasas, etc.
queda registrada por una secuencia de cuatro núme-
En histoenzimología, a diferencia de lo que ocu-
ros precedidos por las letras «EC». El primer número
rre con las enzimas ligadas a estructuras celulares
clasi�ica a la enzima según su mecanismo de acción.
(desmoenzimas), la determinación de las formas
En función de su actividad catalítica las enzi-
solubles de las mismas (lioenzimas) constituye un
mas se clasi�ican en seis clases:
inconveniente. El problema se complica ante la po-
— Clase EC 1, Oxidorreductasas. Catalizan re- sibilidad de que muchas de las enzimas asociadas a
acciones de oxidorreducción, es decir, de estructuras puedan desligarse de ellas por la acción
transferencia de hidrógeno o electrones de la propia técnica histoquímica. Para la inmovili-
de un sustrato a otro. Precisan la colabora- zación de las enzimas se han utilizado numerosos
ción de las coenzimas de oxidorreducción procedimientos, de los que solo los líquidos �ijado-
(NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden res de proteínas (aldehídos, alcoholes y acetona)
los electrones correspondientes. Tras la han demostrado ser verdaderamente efectivos.
reacción enzimática queda modi�icado
el grado de oxidación de las enzimas, por Es importante tener en cuenta que debe
lo que deben ser transformadas antes de veri�icarse la especi�icidad de las reacciones intro-
actuar de nuevo. Incluyen las implicadas duciendo en la preincubación o durante el curso de
en respiración y fermentación: deshi- la incubación enzimática inhibidores especí�icos.
drogenasas, aminooxidasas, deaminasas,
catalasas, etc.
— Clase EC 2, Transferasas. Trans�ieren un 10.2.1. Hidrolasas
grupo químico activo (obtenidos de la
ruptura de ciertas moléculas), diferen- Aunque pueden actuar también como transferasas,
te al hidrógeno, de un sustrato a otro. Su catalizando la transferencia de algún metabolito
clasi�icación se basa en la naturaleza quí- para formar nuevos enlaces éster o amida, o como
mica del sustrato atacado y del aceptor. enzimas de síntesis, desde el punto de vista histo-
Suelen actuar en procesos de intercon- químico, estas enzimas suelen ser identi�icadas por
versiones de azúcares, aminoácidos, etc. su actividad hidrolítica.
Incluyen las transaldolasas, transcetola-
sas, transaminasas, etc.
— Clase EC 3, Hidrolasas. Veri�ican reaccio-
nes de hidrólisis de enlaces C-N o C-O,
concomitantemente a la hidrólisis del
agua. Se clasi�ican en función del tipo
de enlace sobre el que actúan, de forma
que se incluyen en este grupo las gluco-
sidasas, lipasas, peptidasas, esterasas y
fosfatasas.
— Clase EC 4, Liasas. Catalizan reacciones
de ruptura de sustratos (enlaces C-C, C-O,
C-N y C-S) y raramente de soldadura, en
cuyo caso se denominan sintetasas. Inclu- Figura 10.36: Revelado de esterasas mediante el uso de acetato de
yen las aldolasas, las decarboxilasas, etc. 1-naftilo como sustrato y formación �inal de un colorante azoico.

255
Métodos en biociencias

diazonio formándose un colorante azoico

(Figura 10.36).
— Método de quelación. Las esterasas hidro-
lizan la 8-propionoxi-5-nitroquinolina, a
pH=7.0-8.0, originándose 8-hidroxi-5-ni-
troquinolina, que puede quelarse con
bismuto (Figura 10.37). Este producto de
quelación puede, �inalmente, formar tri-
sulfuro de bismuto, de color negro, si se
realiza tratamiento con sulfuro de amo-
Figura 10.37: Esquema de la determinación histoenzimológica nio.
de esterasas mediante el método de quelación.
— Métodos basados en la producción de ín-
digo. Se utiliza como sustrato el acetato
de 5-bromo-4-cloroindoxilo, oxidándose
indoxilo y a partir de él azul de índigo in-
soluble (Figura 10.38).

Lipasas

Son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace

de éster que une el ácido graso en el triacilglicerol.
La reacción es reversible, de manera que la enzima
puede catalizar la esteri�icación del glicerol para
formar los mono-, di- y triglicéridos. Se han descrito
dos métodos para demostrar lipasas:
Figura 10.38: Esquema de la reacción de producción de azul de
índigo para demostrar esterasas en una muestra histológica. — Método de los Tweens. Consiste en incu-
bar los cortes en un medio que contenga
un éster de glicol o de polimanitol de áci-
Carboxilesterasas dos grasos saturados de cadena larga
(tweens) e iones calcio (Figura 10.39).
Son hidrolasas que rompen ésteres carboxílicos,
La hidrólisis de estos ésteres da origen
resultando de la reacción un alcohol y un ácido car-
a ácidos grasos que precipitan en for-
boxílico. A este grupo pertenecen las esterasas, las
ma de jabones de calcio insolubles. Esos
lipasas o las colinesterasas. En su determinación se
compuestos de calcio se transforman en
usan varios métodos:
compuestos de plomo que, �inalmente,
— Método de copulación azoica. Consiste en pueden ponerse en evidencia al tratarlos
la utilización de acetato de 1-naftilo o de con sulfuro de amonio.
2-naftilo como sustratos. Las muestras �i- — Método del nonanoato de naftol-AS. Con-
jadas en acetona fría, se incuban, a 20 ºC siste en incubar cortes en un medio que
(pH=7.8), en un medio en el que el sustra- contenga nonanoato de naftol-AS, y efec-
to se disuelve en una pequeña cantidad tuar posterior copulación del naftol
de acetona. Al �inal de la reacción los cor- formado con una sal de diazonio (Fast
tes se tratan con una solución de sal de blue BB Salt).

Figura 10.39: Método de los tweens para revelar lipasas.

256
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.40: Método de Ottolenghi para demostrar lisofosfolipasa a través de la

formación de un precipitado �inal de color negro.

Figura 10.41: Esquema de los tres pasos de la reacción de Koelle para la demostración de acti-
vidad colinesterasa.

Lisofosfolipasa o lecitinasa B Colinesterasas

Cataliza la hidrólisis de la 2-lisofosfatidilcolina, for-
mando glicerofosfocolina y -carboxilato. El método
para detectarla consiste en incubar cortes un medio
que contenga 2-lisofosfatidilcolina y acetato de cobal-
to. El ácido graso liberado reacciona inmediatamente
con el cobalto para formar un jabón de cobalto, vi-
sualizado en forma de precipitado negro mediante
tratamiento con sulfuro de amonio (Figura 10.40).
Son enzimas que hidrolizan ésteres de colina. De-
pendiendo de la naturaleza del sustrato sobre el
que actúen, se dividen en colinesterasas verdade-
ras o acetilcolinesterasas y pseudocolinesterasas o
colinesterasas inespecí�icas. La acetilcolinesterasa
utiliza como sustrato especí�ico acetilcolina mien-
tras que las segundas utilizan como sustrato una
gran variedad de ésteres de colina con ácidos gra-
sos de cadena larga.
Un método para detectar colinesterasas con-
siste en incubar los cortes en un medio que contenga
el éster de tiocolina (acetiltiocolina o butiriltioco-

257
Métodos en biociencias
Figura 10.42: Método de Gomori para la demostración de fosfatasas alcalinas.
Figura 10.43: Método del colorante azoico para la demostración de fosfatasas ácidas.
lina), sulfato de cobre y glicina (Figura 10.41). En
una primera fase (I) el yoduro de acetiltiocolina re-
acciona con el sulfato de cobre eliminándose yodo.
A continuación, la colinesterasa hidroliza el éster de
tiocolina originando ácido acético y tiocolina (II).
La tiocolina forma un mercáptido con el ión cobre
presente en el medio de incubación. En la reac-
ción �inal (III) el precipitado de tiocolina de cobre
se transforma en un depósito de sulfuro de cobre,
pardo-oscuro, por la acción del sulfuro amarillo de
amonio.
Un segundo método consiste incubar en un
medio que contiene el éster de tiocolina, sulfato de
cobre, ferricianuro potásico y citrato sódico que, al
acomplejarse con la sal de cobre, evita que se forme
un precipitado de ferricianuro de cobre. La tiocolina
formada por la actividad enzimática reduce el ión
Fe3+ preferentemente, de forma que el ferrocianu-
ro formado se combina con el ión Cu2+ originando
ferrocianuro de cobre insoluble y de color pardo
(pardo de Hatchett).
Figura 10.44: Demostración histoenzimológica de la actividad
glucosa-6-fosfatasa usando la técnica de Gomori (a) en neuronas
de la corteza cerebral de rata, y (b) en el sistema endomembra-
noso de un hepatocito de rata.
258
Fosfatasas
Son hidrolasas que catalizan la ruptura de un és-
ter fosfórico, aunque realmente intervienen tanto
en la hidrólisis del grupo fosfato del éster como en
su transferencia hacia otro alcohol, de modo que in
vivo estas enzimas son más bien transfosforilasas.
En general, presentan poca especi�icidad por el sus-
trato, diferenciándose unas de otras por el pH al que
actúan por lo que histoquímicamente se clasi�ican
en fosfatasas alcalinas (pH 8.8-9.4) y fosfatasas áci-
das (pH 4.8-5.4).
El método de Gomori para demostrar fosfatasas
alcalinas inespecí�icas consiste en la precipitación
de fosfato cálcico en los lugares en donde se ha de-
sarrollado la actividad enzimática (Figura 10.42),
incubando los cortes en un medio que contiene
Ca2+, un éster orgánico de fosfato como sustrato
(β-glicerofosfato sódico, fosfato de fenilo o fosfato
de 1-naftilo) e iones Mg2+ o Mn2+ que actúan como
activadores en tampón veronal. El fosfato cálcico se
transforma en sulfuro de cobalto, de color negro, al
tratar los cortes sucesivamente con soluciones de
nitrato de cobalto y sulfuro amarillo de amonio.
Un segundo método es el de los colorantes
azoicos (Figura 10.43), que consiste en hacer reac-
cionar el radical fenol o naftol que se libera desde
un fosfato de fenol o naftol en la reacción enzimáti-
ca con una sal de diazonio. El fenol o naftol liberado
se combina con la amina diazotada para dar origen
a un precipitado insoluble y coloreado en el lugar en
el que se desarrolla la reacción enzimática.
La demostración de las fosfatasas alcali-
nas especí�icas presenta mayor di�icultad ya que
el sustrato puede también ser hidrolizado por ac-
ción de las fosfatasas alcalinas inespecí�icas. Entre
las más interesantes histoquímicamente destacan
la 5´-nucleotidasa, la ATPasa, la tiamina-pirofos-
fatasa, la glucosa-6-fosfatasa, la ribonucleasa, las
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.45: Estrategia para la evidenciación histoenzimológica de la actividad fosfoglucomutasa

a través de la recucción de una sal de tetrazolio y formación del formazano correspondiente.

Figura 10.46: Revelado de actividad fosfatasa ácida siguiendo el método del fosfato de plomo de Gomori.

fosfodiesteresas, la nucleósido-difosfatasa y la fos- — Las fosfodiesterasas son hidrolasas que

foglucomutasa. catalizan la ruptura de los nucleótidos cí-
clicos, es decir, la conversión de AMPc y
— La 5´-nucleotidasa, que cataliza la hi-
GMPc en 5´-AMP y 5´-GMP vía la hidrólisis
drólisis de los ribonucleósido-5-fosfato,
de los enlaces 3´-fosfoéster. Su demostra-
puede demostrarse usando la técnica
ción histoquímica se basa en la formación
del fosfato calcio usando ácido adenílico
(adenosín-5´-fosfato) como sustrato, o un de 5’-AMP, que es �inalmente hidroliza-
medio de incubación que contiene nitrato do por la 5-nucleotidasa que puede estar
de plomo, una sal de calcio y adenosi- presente en el medio de incubación. Los
na-5´-monofosfato. grupos fosfato libres reaccionan con plo-
— La nucleósido-difosfatasa, que cataliza la mo.
reacción de hidrólisis de nucleósidos di-
fosfato, puede demostrarse incubando
los cortes en medios que contienen como
sustrato difosfatos de guanosina (GDP),
uridina (UDP) o inosina (IDP).
— Las ATPasas hidrolizan el ATP y pueden
demostrarse con el método del fosfato
cálcico, usando ATP como sustrato.
— La tiaminopirofosfatasa se demuestra
incubando los cortes en un medio que
contenga tiamina-pirofosfato, CaCl2 y cis-
teína.
— La glucosa-6-fosfatasa se demuestra con
la técnica de Gomori del plomo (Figura
10.44), usando glucosa-6-fosfato como
sustrato en el medio de incubación y ajus- Figura 10.47: Reacción de Hanker de copulación con
tando el pH entre 6.5-7.0. osmio para revelar fosfatasas ácidas.

259
Métodos en biociencias
Figura 10.48: Esquema de las reacciones utilizadas para revelar disacaridasas.
— La fosfoglucomutasa es realmente una
fosfotransferasa que cataliza la formación
de D-glucosa-6-fosfato a partir de α-D-
glucosa-1-fosfato. En su demostración se
usa como sustrato α-D-glucosa-1-fosfato,
y se forma glucosa-6-fosfato, metabolito
que en presencia de la glucosa-6-fosfato-
deshidrogenasa y NADP+ (o NAD+),
produce la reducción de una sal de
tretazolio, que se añade también al medio
(Figura 10.45).
Fosfatasas ácidas
Las fosfatasas ácidas catalizan la hidrólisis de mo-
noésteres de fosfato originando un alcohol y fosfato.
Pueden detectarse mediante dos técnicas:
La técnica del fosfato de plomo de Gomori se
basa en la liberación de iones fosfato a partir de és-
teres orgánicos de fosfato por la acción enzimática,
seguido de la reacción de estos con una sal de plo-
mo (Figura 10.46). Este precipitado de plomo se
convierte en sulfuro de plomo negro al incubar con
sulfuro de amonio.
La técnica de Hanker de copulación con osmio
se basa en la formación de pardo Hatchett (ferro-
cianuro de cobre), permitiendo su observación a
nivel de la microscopía electrónica. Los depósitos
de pardo Hatchett, pueden identi�icarse mediante
su reacción con osmio a través de tiocarbohidrazi-
da. También pueden conseguirse buenos resultados
utilizando 3.3’-diaminobenzidina (DAB), con lo que
resulta la formación de un polímero osmió�ilo (Fi-
gura 10.47).
260
Fosfoamidasa o creatina fosfatasa
Cataliza la hidrólisis de N-fosfocreatina originan-
do creatina y fosfato; aunque actúa también sobre
N-fosfoarginina y otras fosfoamidas. La actividad
fosfoamidasa se puede observar mediante métodos
de copulación azoica en los que se utilizan como
sustratos fosfatos de naftol AS.
Sulfatasas
Catalizan la hidrólisis de ésteres sulfato. Las aril-
sulfatasas catalizan la reacción de hidrólisis de un
sulfato de fenol sulfato, originando sulfato y el fenol
correspondiente y pueden demostrarse histoquí-
micamente utilizando como sustrato la sal sódica o
potásica del sulfato de indoxilo.
Glicosilasas
Son enzimas que hidrolizan enlaces glicosídicos. En
todas ellas se utiliza, además de una sal de diazonio,
un sustrato especí�ico: la α-glucosidasa se revela
incubando cortes histológicos con 6-bromo-2-naf-
til-α,D-glucopiranósido; la β-glucosidasa con
6-bromo-2-naftil-β,D-glucopiranósido; la α-galacto-
sidasa con 6-bromo-2-naftil-α,D-galactósido y la
N-acetil-α-glucosaminidasa con α-naftil-N-acetil-β-
D-glucosamina. El producto �inal en todos los casos
es la formación de un colorante azoico.
Glucuronidasas
Catalizan la hidrólisis de α-D-glucuronósidos y β-D-
glucuronósidos, rindiendo �inalmente D-glucuronato
y el correspondiente alcohol. Su demostración se
puede realizar incubando los cortes con 8-hidroxi-
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.49: Esquema de las reacciones histoenzimológicas que tienen lugar en la demostración
de la actividad cis-aconitasa.

quinolina-β,D-glucurónido y una sal de diazonio,
formándose como producto �inal el correspondien-
te colorante azoico.
Disacaridasas
Actúan hidrolizando disacáridos. Se demuestran in-
cubando en un medio que contenga el disacárido,
glucosa-oxidasa, metosulfato de fenazina y una sal
de tetrazolio (TNBT), formándose un formazano
como producto �inal (Figura 10.48).
Peptidasas
Son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos.
Se reconocen dos subclases: las exopeptidasas y
las endopeptidasas, las primeras actúan cerca de
los extremos de las cadenas polipeptídicas: si ac-
túan en el extremo N-terminal se denominan
aminopeptidasas, y si lo hacen cerca del C-terminal
carboxipeptidasas. Las endopeptidasas, sin embar-
go, actúan en las regiones internas de las cadenas
polipeptídicas, y se clasi�ican en función de sus me-
canismos catalíticos.
La identi�icación de estas enzimas en general
se realiza usando como sustrato proteinato de pla-
ta. La plata liberada durante la actividad enzimática
se combina con bromo, formándose bromuro de
plata, que se convierte �inalmente en plata metálica
al efectuar una reducción con hidroquinona.

Figura 10.50: Método histoenzimológico para revelar la activi-

dad fumarasa.

261
Métodos en biociencias

Figura 10.51: Esquema desarrollado en la reacción de Nadi para revelar citocromo oxidasa a través de la
formación de azul de indofenol.

cis-Aconitasa o citrato (isocitrato) hidroliasa 10.2.2. Oxidorreductasas

Cataliza la isomerización estereoespecí�ica de Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir,

citrato a isocitrato a través de cis-aconitato. Se de-
muestra a través de la formación de un formazano,
incubando los cortes con cis-aconitato, MnCl2, NADP
y una sal de tetrazolio (Figura 10.49).
Fumarasa o (S)-malato hidroliasa
Cataliza la reacción de conversión del fumarato
en malato. La investigación de esta actividad en-
zimática puede realizarse incubando los cortes
histológicos en un medio que contenga ácido fu-
márico como sustrato, NADP y una sal de tetrazolio,
revelándose por la aparición del formazano corres-
pondiente (Figura 10.50).
de transferencia de hidrógeno o electrones. Tras
la reacción enzimática queda modi�icado el grado
de oxidación de las enzimas, por lo que deben ser
transformadas antes de actuar de nuevo. Entre ellas
se incluyen las relacionadas con los procesos de
respiración y fermentación: deshidrogenasas, ami-
nooxidasas, desaminasas, catalasas, etc.
Oxidasas
Catalizan la transferencia de protones desde un do-
nador apropiado hasta el oxígeno molecular. En la
demostración de estas enzimas se utiliza la reac-
ción de Nadi, una técnica basada en el hecho de que
una mezcla equimolecular de 1-naftol y N,N-dime-
til-p-fenilendiamina se transforma en un compuesto
coloreado (azul de indofenol) cuando se produce la
reacción de oxidación (Figura 10.51). La mezcla se

Figura 10.52: Esquema de la reacción de demostración de monofenol monooxigenasa a través de la

formación de pigmentos melánicos.

262
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.53: Esquema de las reacciones acopladas de la aldehído deshidrogenasa o la pe-

roxidasa para revelar en los tejidos la actividad MAO.

comporta como un donador arti�icial de protones,
sustituyendo al citocromo reducido.
Una segunda técnica, la polimerización de
diaminas, se basa en la formación de políme-
ros osmió�ilos de diaminas cuando estas resultan
oxidadas. Se utilizan como reactivos diaminas p-sus-
tituidas, como N-bencil-p-fenilendiamina (BPDA),
3.3´-diaminobencidina (DAB) o N,N´-bis(p-amino-
fenil)-1.3-etilendiamina (BAXD).
También se utiliza la reacción de Burstone, que
consiste en incubar los cortes con p-amino-N,N-di-
fenilamina y p-metoxi-p-amino-N,N-difenilamina,
originándose polímeros capaces de quelarse con
metales, como cobalto o plomo. El polímero quela-
do con cobalto puede, posteriormente, reaccionar
con sulfuro amarillo de amonio, dando origen a sul-
furo de cobalto negro, visible a microscopía.

Figura 10.54: Revelado de la actividad MAO a través de la formación de un producto �inal coloreado
formado en una reacción de acoplamiento de una peroxidasa exógena.

Figura 10.55: Esquema de reacción utilizado para revelar actividad histaminasa a través de una peroxi-
dasa exógena acoplada.

263
Métodos en biociencias

Figura 10.56: Esquema de la reacción usada en la demostración de la actividad urato oxidasa a través del acoplamiento de una
peroxidasa exógena.

Monofenol monooxigenasa intestino en el proceso de decarboxilación de los

aminoácidos.
Esta enzima, portadora de cobre, cataliza la conver-
La actividad MAO puede demostrarse a través
sión de tirosina en Dopa (3.4-dihidroxifenilalanina)
de dos vías acopladas (Figura 10.53), catalizadas
y de Dopa en Dopa-quinona (�igura 10.52). Se co-
por la aldehído deshidrogenasa o la peroxidasa.
noce también como tirosinasa, fenolasa, cresolasa,
Un segundo protocolo consiste en incubar en
etc., aunque su nombre sistemático es el de monofe-
un medio que contenga, además del sustrato especí-
nol-L-dopa-oxígeno reductasa. Su demostración se
�ico de la MAO, 3-amino-9-etilcarbazol y peroxidasa
realiza con Dopa, formándose un pigmento meláni-
exógena. Así, el peróxido de hidrógeno formado
co marrón, fácilmente visualizable.
durante la reacción se evidencia a través de la for-
mación de un producto �inal de color rojo (Figura
Monoamino oxidasa (MAO) 10.54).

Cataliza la oxidación de aminas. La MAO es una

metaloenzima que contiene cobre, y cuyo cen-
tro activo contiene un grupo tiol, por lo que es
inhibida en un medio que contenga PCMB (ácido
p-cloromercuribenzoico) o iproniazid. Esta enzima
actúa especí�icamente sobre tiramina y dopamina,
y con menor especi�icidad sobre adrenalina, no-
radrenalina, triptamina, 5-hidroxitriptamina y
1-feniletilamina.
Su papel �isiológico se relaciona con la des-
trucción de las catecolaminas liberadas en la
transmisión nerviosa y las aminas originadas en el
Diamino oxidasa o histaminasa
Es una cuproproteína que contiene quinona y cuya
demostración es sencilla evidenciando una acti-
vidad peroxidasa acoplada, al añadir al medio de
incubación peroxidasa exógena y un reactivo cro-
mogénico apropiado (Figura 10.55).
Urato oxidasa o uricasa
Es una oxidorreductasa que cataliza la oxidación
del ácido úrico para formar 5-hidroxiisourato,

Figura 10.57: Esquema de la reacción desarrollada para la demostración histoen-

zimológica de la actividad D-aminoácido oxidasa a través de el acoplamiento de una
peroxidasa exógena.

264
 Son oxidorreductasas que catalizan el transporte de electrones y protones desde un
sustrato donador hasta un aceptor, diferente al oxígeno molecular; si bien, en último
término pueden ser transportados por la cadena respiratoria hasta el oxígeno
Histoquímica e histoenzimología
molecular. El protocolo experimental que conduce a la demostración histoquímica de
estas enzimas se realiza siguiendo la figura 10.58.

Figura 10.58. Esquema de las reacciones necesarias para la detección histoenzimológica de las
deshidrogenasas anaerobias.
Figura 10.58: Esquema de las reacciones necesarias para la detección histoenzimológica de las
deshidrogenasas anaerobias.

En su demostración se incuban los cortes en un medio que contenga el

sustrato, un aceptor de protones, agentes estabilizadores del pH y la presión
producto muyosmótica,
inestable que
un se transforma
reactivo espontá-de protones
de captura La actividad
que, al de esta enzima
reducirse, puedevisible
se haga demostrar-
neamente en alantoína (Figura 10.56). Su actividad se incubando las secciones
cuando el primer aceptor no tenga esa propiedad. En casi todas las reacciones histológicas en un medio
se evidencia mediante el acoplamiento de la reac- que contenga xantina y
histoquímicas de las deshidrogenasas el aceptor primario de protones es una una sal de tetrazolio.
ción de una peroxidasa
coenzima exógena, al actuar
y el aceptor final osobre el de captura, una sal de tetrazolio o la mezcla
reactivo
peróxido de hidrógeno que se forma en la oxidación
cobre-ferricianuro. En algunos casos, entre el aceptor inicial de protones y el reactivo
Peroxidasas
del ácido úrico.
de captura se intercalan otros transportadores que facilitan la transferencia de
protones y electrones. Entre los transportadoresLas peroxidasas degradan el
intermediarios másperóxido de hidrógeno
utilizados se
oxidasa la menadiona y el metosulfatodedelos
D-aminoácidoencuentran tejidos.
fenazina. La demostración histoquímica de las
peroxidasas se realiza a través de la reacción de la
En condiciones fisiológicas la actividad de la deshidrogenasa va
Es una �lavoproteína que cataliza la oxidación de 3.3´-diaminobenzidina (DAB). La 3.3´-diaminoben-
acompañada de la reducción de su coenzima o grupo prostético, de forma que ésta
los D-aminoácidos originando los cetoácidos co- zidina como sustrato de la peroxidasa, en presencia
cede su protón y los electrones, en la mayoría de los casos, a la cadena respiratoria.
rrespondientes, usando el oxígeno molecular como de peróxido de hidrógeno se oxida, dando origen a
aceptor naturalPordeello,
los para que tenga
protones; lugar una
sin embargo, en reacción histoquímica,
un polímero capaz deesserdecir, para que
nuevamente sea por
oxidado
posible detectar la formación
condiciones de anaerobiosis, otras sustancias como de la coenzima reducida durante la
el OsO4, formándose un precipitado negro. actividad
deshidrogenasa, es necesario
las sales de tetrazolio pueden actuar como acepto- lograr que los protones y electrones de la misma sean
captados por aceptores no
res cuando son transportados por la metosulfato de naturales, que al reducirse se vuelvan insolubles y
Deshidrogenasas anaerobias
visibles. También será necesario
fenazina. Puede demostrarse la actividad de esta impedir que los aceptores naturales de la cadena
enzima a travésrespiratoria captendelos
de la actividad unaprotones
peroxidasa y electrones y los conduzcan
Son oxidorreductasas hasta eleloxígeno
que catalizan transporte de
exógena sobremolecular.
el peróxido de hidrógeno formado electrones y protones desde un sustrato donador
como en la oxidación de los D-aminoácidos (Figu- hasta un aceptor, diferente al oxígeno molecular; si
ra 10.57). bien, en último término pueden ser transportados
por la cadena respiratoria hasta el oxígeno mole-
cular. El protocolo experimental que conduce a la
Xantina oxidasa demostración histoquímica de estas enzimas se
realiza siguiendo la �igura 10.58.
Cataliza la oxidación de las purinas, xantina e hi-
En su demostración se incuban los cortes en un
poxantina, originando ácido úrico y peróxido de
medio que contenga el sustrato, un aceptor de pro-
hidrógeno. Se conoce también como hipoxantina
tones, agentes estabilizadores del pH y la presión
oxidasa o enzima de Schardinger. Es una �lavopro- osmótica, un reactivo de captura de protones que, al
teína hierro-molibdénica que contiene centros reducirse, se haga visible cuando el primer aceptor
[2Fe-2S]. En la reacción con xantina para formar no tenga esa propiedad. En casi todas las reacciones
ácido úrico, un átomo de oxígeno es transferido del histoquímicas de las deshidrogenasas el aceptor pri-
molibdeno a la xantina. La reconstitución del centro mario de protones es una coenzima y el aceptor �i-
activo de molibdeno ocurre por la adición de agua, nal o reactivo de captura, una sal de tetrazolio o
el átomo de oxígeno introducido al substrato por la la mezcla cobre-ferricianuro. En algunos casos, en-
xantina oxidasa se origina del agua en lugar del oxí- tre el aceptor inicial de protones y el reactivo de
geno molecular. captura se intercalan otros transportadores que

265
Métodos en biociencias
Figura 10.59: Reacciones desarrolladas en la demostración de la
isocitrato deshidrogenasa a través de la formación de formazanos
coloreados.
facilitan la transferencia de protones y electro-
nes. Entre los transportadores intermediarios más
utilizados se encuentran la menadiona y el meto-
sulfato de fenazina.
En condiciones �isiológicas la actividad de la
deshidrogenasa va acompañada de la reducción
de su coenzima o grupo prostético, de forma que
esta cede su protón y los electrones, en la mayoría
de los casos, a la cadena respiratoria. Por ello, para
que tenga lugar una reacción histoquímica, es de-
cir, para que sea posible detectar la formación de
la coenzima reducida durante la actividad deshi-
drogenasa, es necesario lograr que los protones y
electrones de la misma sean captados por aceptores
no naturales, que al reducirse se vuelvan insolubles
y visibles. También será necesario impedir que los
aceptores naturales de la cadena respiratoria cap-
ten los protones y electrones y los conduzcan hasta
el oxígeno molecular.
10.2.3. Histoenzimología de las principales ru-
tas metabólicas
Enzimas implicadas en el ciclo de Krebs
El ciclo de Krebs es la más importante ruta de oxi-
dación de los combustibles metabólicos; tiene lugar
en las mitocondrias y forma parte de la vía cata-
bólica que realiza la oxidación de los hidratos de
carbono, ácidos grasos y aminoácidos, hasta produ-
cir CO2 y agua, liberando energía en forma utilizable
(poder reductor y ATP). El ciclo también proporcio-
na precursores para muchas biomoléculas, por lo
266
Figura 10.60: Reacción desarrollada para la demostración
histoenzimológica de la malato deshidrogenasa a través de la re-
ducción de una sal de tretrazolio.
que se considera una vía an�ibólica, es decir, catabó-
lica y anabólica al mismo tiempo.
Una de las enzimas más utilizadas en el estudio
histoquímico del ciclo de Krebs es la demostración
de la isocitrato deshidrogenasa, enzima que reali-
za la descarboxilación oxidativa del isocitrato para
formar α-oxo-glutarato y las primeras moléculas de
CO2 y NADH del ciclo.
La técnica para investigar la actividad de esta
enzima es incubar los cortes en medios que conten-
gan NAD+, NADP+ o ambos y una sal de tetrazolio,
dando origen a un formazano coloreado e insoluble,
visible a microscopía (Figura 10.59).
El complejo enzimático que lleva a cabo la for-
mación de succinil-CoA a partir de α-oxo-glutarato
tiene tres actividades y diversas coenzimas: la
primera actividad es la de la cetoglutarato des-
hidrogenasa, una enzima que contiene tiamina y
origina un grupo lipoilo. A continuación actúa la
dihidrolipoil lisina-succiniltransferasa, una enzima
multimérica que constituye el núcleo del complejo
multienzimático, da origen a un grupo dihidrolipoi-
lo y succinil-CoA. Finalmente actúa la dihidrolipoil
deshidrogenasa, una �lavoproteína que cataliza la
oxidación del grupo dihidrolipoilo con regenera-
ción del grupo lipoilo.
La actividad de la cetoglutarato deshidroge-
nasa se realiza añadiendo CoA y NAD+, no siendo
necesaria la adición de TPP ni ácido lipoico, puesto
que estos están ya presentes en el corte histológico
asociados al complejo multienzimático. La dihi-
drolipoil lisina-succiniltransferasa (o dihidrolipoil
deshidrogenasa) puede demostrarse histoquími-
camente incubando los cortes histológicos en un
medio que contenga DL-dihidrolipoamida, NAD+ y
una sal de tetrazolio.

La succinato deshidrogenasa cataliza la oxi-
dación de succinato para formar fumarato. Es una
�lavoproteína con un centro hierro-azufre presen-
te en la membrana mitocondrial interna. No puede
reducir directamente las sales de tetrazolio, por lo
que en su demostración se requiere la adición de
ciertos transportadores de protones y electrones,
como metosulfato de fenazina o menadiona.
Finalmente la malato deshidrogenasa NAD+-de-
pendiente cataliza la regeneración de oxalacetato, a
través de la oxidación de L-malato. Puede demos-
trarse su actividad con muy buenos resultados,
usando sales de tetrazolio o ferricianuro, como
aceptores de protones y electrones (Figura 10.60).
Enzimas implicadas en la glicolisis
o ciclo de Embden-Meyerhof
Es la ruta metabólica más difundida en la natu-
raleza y la única vía de obtención de energía de
muchos organismos; metaboliza la glucosa y otros
monosacáridos hasta piruvato, sin intervención del
oxígeno molecular. Es una ruta controlada por en-
zimas citoplásmicas, algunas de las cuales pueden
demostrarse histoquímicamente.
— Hexoquinasa. Cataliza la fosforilación de
la glucosa en presencia de Mg2+. Su de-
mostración histoquímica requiere la
incubación de los cortes en un medio
que contenga el sustrato especí�ico de la
misma, NADP+ y una sal de tetrazolio, for-
mándose el correspondiente formazano.
— Fosfoglucoisomerasa. Cataliza la isomeri-
zación reversible de la glucosa-6-fosfato,
en presencia de Mg2+. La reacción, que re-
quiere la apertura del anillo piranósico, la
isomerización y, por último, el cierre del
anillo en forma furanósica, a través de un
intermediario enediol. Esta enzima pue-
de demostrarse histoenzimológicamente
incubando los cortes en medios que con-
tengan el sustrato, NADP+, una sal de
tetrazolio y la enzima glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, con la formación del co-
rrepondiente formazano.
— Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.
Cataliza la formación de 1.3-bifosfo-
glicerato, a través de la oxidación de
gliceraldehído-3-fosfato para formar
un acil-fosfato, el 1.3-bifosfoglicerato.
La enzima requiere NAD+, para aceptar
los electrones del sustrato que se oxi-
da y genera el primer intermediario de
267
Histoquímica e histoenzimología
alta energía y un par de equivalentes
reductores. La demostración histoenzi-
mológica de la actividad de esta enzima
se realiza incubando los cortes en un
medio que contenga el sustrato (glice-
raldehído-3-fosfato), NAD+ y una sal de
tetrazolio. Los aceptores arti�iciales más
usados son la coenzima Q y la menadio-
na. Como la enzima contiene grupos tiol
en su centro activo, resulta inhibida por
PCMB y N-etilmaleimida.
— Piruvato quinasa. Cataliza la forma-
ción de piruvato en presencia de Mg2+ y
K+, trans�iriendo el grupo forforilo del
fosfoenolpiruvato al ADP, formándose �i-
nalmente ATP y piruvato. Realmente
es un complejo multienzimático en el
que participan tres enzimas: la piruva-
to deshidrogenasa, la dihidrolipoamida
transacetilasa y la dihidrolipoamida des-
hidrogenasa; así como varias coenzimas:
TPP, ácido lipoico, FAD, NAD+ y CoA-SH.
La actividad de este complejo multien-
zimático puede demostrarse incubando
los cortes histológicos en un medio que
contenga piruvato, NAD+, una sal de tetra-
zolio y CoA-SH.
Enzimas implicadas en el destino anaeróbico
del piruvato
El destino del piruvato formado varía en función del
estado energético de la célula: en condiciones anae-
róbicas los dos mecanismos de reciclado del NAD+
son la fermentación homoláctica, en la que intervie-
ne la lactato deshidrogenasa, y la alcohólica, en la
que participa la piruvato decarboxilasa y la alcohol
deshidrogenasa, originadas en músculo y levaduras
respectivamente.
— La lactato deshidrogenasa puede demos-
trarse mediante el formazano que se
origina incubando los cortes con NADH,
ácido láctico y una sal de tetrazolio.
— La alcohol deshidrogenasa, por su par-
te, es una enzima NAD+-dependiente,
con grupos tiol en su centro activo. Su
actividad enzimática puede bloquearse
incubando con yodoacetato, N-etilmalei-
mida y metales pesados. Además, como
esta es Zn2+-dependiente, su actividad se
inhibe en presencia de EDTA o dietil-di-
tiocarbamato. Histoquímicamente puede
demostrarse su actividad incubando los
Métodos en biociencias
Figura 10.61: Fase oxidativa de la vía de las pentosas y reacciones para demostrar la glucosa-6P-deshidrogenasa y
6-fosfogluconato deshidrogenasa, acopladas a la formación de formazanos.
cortes en medios que contengan etanol,
NADH y una sal de tetrazolio.
Enzimas implicadas en la vía de las pentosas
Una ruta alternativa al catabolismo glicolítico de la
glucosa es la que se produce a través de la ruta de las
pentosas fosfato, ruta del fosfogluconato o ruta de
Warburg. A través de esta ruta citoplásmica la glu-
cosa se convierte en otros azúcares aprovechables
en la obtención de energía; aunque su principal �i-
nalidad es la de producir NADPH para la biosíntesis
reductora y ribosa-5-fosfato, precursor de nucleóti-
dos y ácidos nucleicos. Esta ruta es particularmente
importante en tejidos en los que se produce una ac-
tiva síntesis de ácidos grasos y colesterol.
En esta vía se diferencian dos fases, una
primera fase oxidativa en la que se forma ribu-
losa-5-fosfato, CO2 y NADPH, y una segunda fase
no oxidativa. Son dos las enzimas de esta vía que
pueden demostrarse histoenzimológicamente: la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluco-
268
nato deshidrogenasa, enzima esta última activada
por iones Mg2+ ó Mn2+.
La reacción histoquímica consiste en incubar
los cortes histológicos en un medio provisto del
sustrato especí�ico de cada enzima (glucosa-6-fos-
fato o 6-fosfoglucono-1.5-lactona respectivamente),
NADP+, una sal de tetrazolio y, Mg2+ ó Mn2+ en el caso
de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. La formación
del formazano correspondiente será demostrativo
de la actividad de la enzima (Figura 10.61).
Enzimas del metabolismo del glucógeno
y otros hidratos de carbono
El glucógeno, polímero rami�icado de moléculas de
glucosa unidas mediante enlaces α(1→4), repre-
senta la principal forma de reserva de hidratos de
carbono en las células animales. Dos son los proce-
sos implicados en el metabolismo del glucógeno, su
síntesis, la glucogenogénesis, y su degradación, la
glucogenolisis.
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.62: Esquema de la reacción desarrollada para la demostración

de la 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa a través de la reducción de una sal
de tetrazolio.

Figura 10.63: Reacción acoplada con una sal de plomo para formar �inalmente sulfuro de plomo y revelar la actividad de
la ornitina transcarbamilasa.

269
Métodos en biociencias

Figura 10.64: Esquema seguido para la demostración histoenzimológica de la colin-O-acetiltransferasa

a través de la formación de sulfuro de plomo.

En la glucogenogénesis es posible demostrar En la glucogenolisis puede estudiarse la

la actividad de esta uridiltransferasa, enzima que
cataliza la formación de UDP-glucosa a partir de
-D-glucosa-1P, incubando los cortes histológicos
con UTP, glucógeno y ácido etildiaminotetraacético
(EDTA), con lo que se forman nuevas cadenas de glu-
cógeno que se añaden a las preexistentes en el corte;
glucógeno que puede demostrarse con la técnica del
PAS. La diferencia entre el glucógeno preexistente y
el que aparece tras la incubación histoquímica será
demostrativo de la actividad enzimática.
actividad de la glucantransferasa, la enzima desra-
mi�icante que cataliza dos reacciones: su actividad
transferasa elimina tres residuos de glucosa an-
tes de la rami�icación y trans�iere este trisacárido
al extremo de alguna rami�icación interna. Esta
enzima puede demostrarse incubando los cortes
histológicos en un medio que contenga β-amilasa,
glucosa-1-fosfato, ATP y Mg2+. El glucógeno for-
mado durante la incubación de los cortes como
consecuencia de la actividad enzimática puede evi-
denciarse mediante las técnicas del PAS. También es

270
 Histoquímica e histoenzimología

Figura 10.65: Esquema del desarrollo de las reacciones con ferricianuro de potasio
o con el reactivo del Ellmans que permiten la demostración histoenzimológica de la
actividad acetilcolinesterasa.

posible estudiar la actividad de la glucógeno fosfori-
lasa incubando los cortes en un medio que contenga
glucosa-1-fosfato, ATP, Mg2+ y etanol, demostrán-
dose el glucógeno formado durante la reacción
mediante la técnica del PAS.
Enzimas implicadas en la síntesis y degradación
de ácidos grasos
cuerpos cetónicos (acetoacetato, acetona y β–hi-
droxibutirato).
Una de las reacciones clave de esta ruta es la
catalizada por la β-hidroxibutirato deshidrogenasa,
que rinde β-hidroxibutirato a partir de acetoa-
cetato, en presencia de NADH. Su determinación
histoquímica se realiza en presencia del sustrato de
la enzima y una sal de tetrazolio.

Todas las enzimas �lavínicas que intervie-
nen en la síntesis y degradación de los ácidos
grasos son susceptibles de ser investigadas his-
toenzimológicamente, gracias a la formación de los
correspondientes formazanos, al incubar los cortes
histológicos en medios que contengan el sustrato
adecuado, un aceptor intermediario de electrones y
protones y una sal de tetrazolio (Figura 10.62).
Enzimas de la síntesis de las hormonas esteroi-
deas
Todas las esteroide-deshidrogenasas son depen-
dientes de NAD+ ó NADP+. En su demostración se
precisa incubar los cortes en medios que contengan
el sustrato apropiado de cada enzima, la coenzima
y una sal de tetrazolio, visualizándose la actividad
enzimática a través de la formación del correspon-

diente formazano.
Enzimas de la cetogénesis

El exceso de acetil-CoA estimula en las mitocondrias

otra vía metabólica importante, la vía cetogéni-
ca, originando la formación de los denominados

271
Métodos en biociencias
Enzimas del ciclo de la urea
El ciclo de la urea es un proceso que requiere apor-
te energético para procesar los derivados proteicos
generando urea como producto �inal. La ornitina
carbamoiltransferasa cataliza la reacción entre la L-or-
272
nitina y el carbamoil-fosfato para originar L-citrulina,
liberándose fosfato en el curso de la reacción. La acti-
vidad de esta enzima puede demostrarse incubando
los cortes en presencia de L-ornitina, carbamoil-fos-
fato y una sal de plomo (Figura 10.63).

Técnicas radiactivas
Las técnicas radiactivas se basan en el empleo de ra-
dioisótopos como trazadores, entendiendo que un
trazador es aquella sustancia que, de algún modo,
mani�iesta su presencia y permite al investigador
seguirla. El trazador ideal es aquel cuya presencia
no causa efecto alguno sobre el sistema a anali-
zar y, en este sentido, los radioisótopos son uno de
los mejores trazadores, especialmente para estu-
dios a corto plazo; a largo plazo sus propiedades
radiactivas pueden causar efectos sobre el sistema
biológico a estudiar.
El gran inconveniente de las técnicas radiac-
tivas es su peligrosidad, hecho que, además, se
ve agravado por el retraso en la aparición de sus
efectos tóxicos. Sin embargo, con respecto a otras
técnicas, tienen la ventaja de una altísima sensibili-
dad. En el apogeo de su uso, década de los 60 y 70, la
sensibilidad de las pruebas químicas era del rango
μM; sin embargo, con el uso de isótopos radiactivos
la sensibilidad alcanzaba el rango pM. En cualquier
caso, como regla de elección, si alguna otra técnica
puede ofrecer los mismos resultados o muy pare-
cidos a los que se obtienen usando una técnica que
emplea isótopos radiactivos, conviene dejar a un
lado esta última.
En el campo de la biología existen numerosos
ámbitos donde se utiliza la detección de radioi-
11.
Guillermo Bodega
Lilian Puebla
sótopos. Esto ha provocado que existan numerosas
variantes metodológicas, lo que hace imposible
abordar todas ellas en un libro como este, conce-
bido con el propósito más especí�ico de estudiar
aquellas técnicas de uso más actual en el entorno
de las biociencias relacionadas con la biología ce-
lular y molecular, la bioquímica, la genética o la
�isiología. En consecuencia, se prestará atención a
la histoautorradiogra�ía y a dos aplicaciones de la
espectrometría de centelleo: los experimentos de
pulso y caza y el radioinmunoanálisis. Es importan-
te dejar constancia, desde un principio, que la gran
diferencia entre las técnicas autorradiográ�icas y las
espectroscópicas es el modo de detección de la ra-
diación: en las primeras se utiliza una emulsión de
tipo fotográ�ico, en las segundas se utilizan conta-
dores/detectores. Por último, también se estudiará
la radiometría, como método de datación paleon-
tológica basado en la determinación de isótopos
radiactivos.
En el ámbito de las técnicas radiactivas existen
dos términos, caliente y frío, que es necesario ex-
plicar por su uso cotidiano. La molécula caliente es
aquella que incorpora el isótopo radiactivo, la fría
no lo lleva. Por ejemplo, en una técnica en la que se
estuviese usando 3H-Leu, se hablaría de Leu calien-
te si se hace referencia a la que incorpora el tritio, y
Métodos en biociencias
Leu fría cuando se menciona la que no lo incorpo-
ra. De forma análoga, en adelante se utilizarán los
términos �luorescencia y fosforescencia, por lo que
conviene de�inirlos. La �luorescencia tiene lugar
cuando la reemisión, en forma de luz, de la energía
de excitación es muy rápida, casi simultánea (10-8
s), y corta, pues termina cuando cesa la causa de ex-
citación. En la fosforescencia la reemisión de luz es
más lenta y mucho más estable pues puede durar de
μs a horas después de haberse extinguido la fuente
de excitación.
11.1. Radioisótopos
Para empezar, un poco de historia. Röntgen descu-
brió los rayos X en 1895 y Becquerel, un año más
tarde, demostró que determinados elementos,
uranio por ejemplo, emitían radiación de forma es-
pontánea. El término radiactividad fue acuñado por
Marie Curie (1898), y el matrimonio Joliot-Curie
consiguió la producción de elementos radiactivos
de forma arti�icial en la década de los 30.
Todos los átomos de un elemento tienen el
mismo número de protones (Z); sin embargo, no
todos poseen el mismo número de neutrones (N).
A estos átomos con diferente número de neutrones
se les llama isótopos. En general, los isótopos son
radiactivos cuando se produce una combinación
inestable de protones y neutrones. Por ejemplo,
en el caso del H, que puede poseer 0, 1 o 2 neutro-
nes, solo el último isótopo, llamado tritio (3H), es
radiactivo pues es el que posee esta relación más
desproporcionada.
Cuando hay una combinación de protones y
neutrones inestable el núcleo tiende a liberar ener-
gía (desintegrarse) para alcanzar una con�iguración
más estable. La liberación de energía se suele dar
en forma de emisión de partículas y/o radiación
electromagnética. Llegados a este punto, conviene
de�inir radiactividad y radiación, pues son términos
que, de forma incorrecta, se suelen intercambiar
habitualmente. La radiactividad es una propiedad
�ísica de la materia que implica la existencia de áto-
mos inestables y cuyo efecto es la radiación, que es
la emisión de energía por parte de esos átomos; por
ello, la radiactividad no se emite, se posee o no se
posee.
Las características más importantes que de�i-
nen a un isótopo radiactivo son tres: (1) el tipo de
emisión radiactiva, (2) la energía que lleva asociada
dicha emisión y (3) su periodo de semidesintegra-
ción.
274
Figura 11.1: Tipos de radiación nuclear.
11.1.1. Tipo de emisión radiactiva
Fue Rutherford, entre 1898 y 1902, el primero en
darse cuenta de que existían tres tipos principales
de radiación nuclear: emisión de partículas α, emi-
sión de partículas β y radiación γ (Figura 11.1), que
se pueden emitir de forma independiente o simul-
tánea. Estos tres tipos de emisión radiactiva son de
origen nuclear, a diferencia de los rayos X, que es
emisión radiactiva de origen cortical emitida cuan-
do los electrones cambian de órbita en un átomo.
También existe la emisión de neutrones, que tiene
lugar en procesos de fusión o �isión nuclear, y no se
considerarán en este capítulo pues se hará en el ca-
pítulo 13.
Las partículas α están formadas por dos pro-
tones y dos neutrones por lo que tienen carga
positiva y masa; equivalen a un núcleo de Helio. La
detección de partículas α no es habitual pues al ser
absorbidas por la misma muestra se detectan mal
y, además, hay pocos radioisótopos que las emitan
que se puedan usar en el material biológico. Las
partículas β tienen una masa pequeña (la misma
que la del electrón) y su carga puede ser negativa o
positiva. Las partículas β negativas son electrones
moviéndose a gran velocidad. Las partículas β posi-
tivas o positrones se emiten cuando la relación N/Z
es menor que la estable. La energía que llevan aso-
ciada las partículas β emitidas por un radioisótopo
concreto es muy diferente y la representación grá-
�ica del porcentaje de partículas en función de su
energía es conocida como su espectro de emisión
de energía, especí�ico para cada radioisótopo. Dos
parámetros importantes que derivan del espectro
de emisión de energía son la energía máxima y la
energía media, que suele ser un tercio de la máxi-
ma (Figura 11.2).
La radiación γ es radiación electromagnéti-
ca emitida en forma de quanta o fotones, que no

Figura 11.2: Espectro de emisión de energía.
tienen ni carga ni masa, y cuya energía es inversa-
mente proporcional a la longitud de onda que llevan
asociada. Los fotones emitidos en este tipo de desin-
tegración no presentan un espectro de distribución
de energía pues llevan asociados valores discretos.
11.1.2. Poder de penetración
Las partículas α poseen un escaso poder de pene-
tración ya que, debido a su tamaño, interaccionan
fácilmente con la materia. Por el contrario, la radia-
ción γ posee un gran poder de penetración pues, al
ser radiación electromagnética, su interacción con
la materia es menos probable. Las partículas β pre-
sentan un poder de penetración bastante variable
pues la energía que llevan asociada también puede
ser muy diferente. Por ejemplo, la partícula β del tri-
tio solo viaja unos pocos μm y la detiene el vidrio,
Figura 11.3: Poder de penetración de los diferentes tipos de radiación.
275
Técnicas radiactivas
pero la del 32P puede atravesar la pared de una habi-
tación y, por ello, las soluciones que lo contienen se
mantienen en envases de plomo (Figura 11.3).
Cuando una partícula α o β interacciona con la
materia pierde su energía al ionizar (arranca elec-
trones) o excitar (cambia electrones de órbita) los
átomos con los que choca. La radiación γ tiene mu-
cha mayor di�icultad a la hora de interaccionar con
la materia, pero también excita e ioniza a los áto-
mos, e incluso arranca positrones de su núcleo.
11.1.3. Periodo de semidesintegración
Cuanto más inestable es un isótopo, mayor es la
probabilidad de su desintegración. El periodo de se-
midesintegración (t1/2) es el tiempo necesario para
que se desintegren la mitad de los átomos radiac-
tivos de una muestra. Este parámetro no se debe
confundir con la «vida media» (τ), que es el pro-
medio de vida de un átomo antes de desintegrarse.
Obviamente, ambos son conceptos diferentes, pero
están relacionados, pues t1/2 = τ x ln 2.
Además de la vida media �ísica, otro paráme-
tro interesante en relación con los elementos que se
emplean como radioisótopos es la vida media bio-
lógica, que hace referencia a la tasa de recambio
de dicho elemento en el organismo. La vida me-
dia efectiva, parámetro que considera la vida media
biológica y la �ísica, es un dato de interés para anali-
zar la peligrosidad de un compuesto (Cuadro 11.1),
y viene de�inida por la siguiente expresión, donde
Ve es la vida media efectiva y Vb y Vf la vida media
biológica y �ísica respectivamente:
Ve = (Vb x Vf) / (Vb + Vf)
Métodos en biociencias

Cuadro 11.1: Radioisótopos más comúnmente usados en biología.

Isótopo Emisión (Energía en MeV) Vida media Vida biológica Vida efectiva

3
H β- (0.017) 12.43 años 19 días 19 días
14
C β- (0.154) 5730 años 180 días 180 días
24
Na β- (1.39) γ (1.37 –2.25) 14 horas 19 días 14.64 horas
32
P β- (1.71) 14.3 días 3 años 14.1 días
35
S β- (0.16) 87.4 días 90 días 44.3 días
42
K β- (3.60 – 2.10) γ (1.50) 12 horas 16 días 11.4 horas
45
Ca β- (0.25) 164 días 73 años 163 días
59
Fe β- (0.27 – 0.46) γ (1.29 – 1.10) 45.1 días 3.4 años 43.5 días
60
Co β- (0.31) γ (1.17 – 1.33) 5.3 años 8.1 días 8.1 días
125
I γ (0.035) 60 días 138 días 42 días
131
I β (0.61 – 0.34)
-
γ (0.36 – 0.63) 8.04 días 156 días 7.7 días

La radiactividad de un compuesto (número medio de cultivo. La elección de la molécula que lle-

de átomos inestables que se desintegran en la uni-
dad de tiempo) se mide en curios (Ci), siendo un Ci
3.7 x 1010 desintegraciones nucleares por segundo.
Las actividades que más se manejan son mCi (10-3
Ci) y μCi (10-6 Ci). En el sistema internacional, la ra-
diactividad se mide en Becquerels (Bq), de manera
que 1 Ci = 3.7 x 1010 Bq. Es decir, que el Bq es una
desintegración nuclear por segundo. Debido al fun-
cionamiento de los contadores, es muy complejo
determinar el número absoluto de desintegracio-
nes por lo que la emisión (medición) de radiación
se indica como cuentas por minuto (cpm), y no des-
integraciones por minuto (dpm). Las cpm son, por
tanto, las desintegraciones nucleares que llegan al
contador y este es capaz de detectar y contar. No
obstante, las desintegraciones por minuto (dpm) se
pueden calcular teniendo en cuenta la e�iciencia del
proceso de contaje.
11.1.4. Radioisótopos de interés biológico
En la mayoría de los casos y desde un punto de vis-
ta metodológico, el empleo de un radioisótopo en
el campo de las biociencias persigue la incorpora-
ción del radioisótopo en las moléculas del sistema
a estudiar. Para ello, la molécula marcada radiacti-
vamente se puede suministrar en la dieta, a través
de inyecciones (venosas, intraperitoneales o intra-
musculares) o, en el caso de células cultivadas, en el
va el marcaje dependerá, obviamente, del objetivo
del estudio. Por ejemplo, el suministro de nucleó-
tidos o aminoácidos que incorporan un isótopo
radiactivo es lo habitual en estudios que afectan
al DNA o las proteínas. El objetivo del estudio y el
material sobre el que se va a llevar a cabo también
serán los que determinen condiciones más especí�i-
cas. Por ejemplo, en el caso de proteínas, en función
de su propia composición, localización o metabolis-
mo, se puede escoger entre diferentes aminoácidos
que pueden incorporar distintos radioisótopos;
3
H-Leu, 35S-Cys y 125I-Tyr suelen ser tres de los más
usados.
En general, los radioisótopos de uso más co-
mún en biología son los que aparecen en el cuadro
11.1.
11.2. Detección de la emisión radioactiva
Como ya se vio en el inicio de este capítulo, existen
dos maneras básicas de detectar y/o medir la emi-
sión radiactiva: usando emulsiones fotográ�icas y
usando detectores/contadores. Las propiedades de
las emulsiones fotográ�icas se analizarán en el apar-
tado dedicado a la autorradiogra�ía; los detectores
serán estudiados en este epígrafe. Existen tres ti-
pos básicos de detectores: el de ionización de gases
o contador Geiger-Müller, el contador de centelleo

276

Figura 11.4: Esquema de un contador Geiger-Müller.
sólido y el contador de centelleo líquido. Los con-
tadores de centelleo se basan en la propiedad de
algunas moléculas, llamadas fosforescentes, cen-
telleantes o luminiscentes, de absorber parte de la
energía de la emisión radiactiva y liberarla en forma
de luz; por ello, el conjunto de técnicas que utilizan
este tipo de contadores también se denomina es-
pectrometría de centelleo.
11.2.1. El contador Geiger-Müller
El contador Geiger-Müller sirve para detectar y me-
dir radiación ionizante ya que su fundamento se
basa precisamente en la capacidad de ionización de
algunos tipos de radiación. El contador Geiger-Mü-
ller más usado es el llamado de ventana terminal ya
que posee un tubo lleno de un gas inerte (He, Ne o
Ar) a baja presión que se ioniza por efecto de la ra-
diación que penetra a través de una ventana muy
delgada de mica, berilio o Mylar, por lo que en el
interior del tubo se generan electrones e iones posi-
tivos. Los primeros impactan con un �ilamento que
existe dentro del tubo y que funciona como ánodo,
los segundos lo hacen con las paredes del tubo, que
funcionan como cátodo (Figura 11.4). Esta diferen-
cia de potencial inicial que se genera en el interior
del tubo induce la ionización de más átomos del gas,
proceso conocido como avalancha, generando una
potente respuesta eléctrica (1 a 10 V), por ello fácil
Figura 11.5: Esquema del proceso de excitación que sucede en el medio líquido.
277
Técnicas radiactivas
de medir, cuyo valor es proporcional a la radiación
detectada por el tubo.
El tubo también contiene un agente extintor
(butano, propano…) para evitar la continua ioni-
zación que terminaría bloqueando la respuesta del
contador. Para evitar el bloqueo del tubo por la
desaparición del agente extintor y mejorar la sen-
sibilidad existen unos contadores más so�isticados
denominados contadores de �lujo sin ventana.
11.2.2. El contador de centelleo líquido
La desintegración de los átomos radiactivos dentro
de un recipiente genera una emisión de radiación
que es absorbida por una molécula �luorescente
(centelleante o luminiscente). La emisión de luz de
esta molécula es detectada, ampli�icada y su valor
transformado en cuentas por minuto. Las muestras
se preparan mezclando el material que incorpora
los elementos radiactivos con las moléculas cente-
lleantes. Como el isótopo radiactivo y la molécula
�luorescente están en contacto muy íntimo o próxi-
mas se puede medir la emisión de radiación aun en
los casos de emisiones de muy baja energía o muy
bajo poder de penetración.
En los sistemas líquidos, el líquido de centelleo
contiene: (a) un disolvente orgánico (normalmen-
te tolueno o xileno), (b) un �luorescente primario
(PPO, PBD, antraceno o naftaleno) y (c) un �luo-
rescente secundario (POPOP, dmPOPOP (dimetil
POPOP) o BBOT). Mezclas de uso habitual son las
de los compuestos derivados del feniloxazol: PPO
(300-350 nm de λ de excitación-emisión), POPOP
(350-410 nm) y dmPOPOP (370-430 nm). La ener-
gía de las partículas β es absorbida por el disolvente,
excitando sus moléculas. La radiación liberada por
el disolvente es absorbida por el �luorescente pri-
mario que la emite en el UV cercano. Esta emisión
en UV no es bien captada por los fotocátodos y, por
ello, se hace necesaria la presencia de un �luores-
cente secundario que capta la radiación UV y emite
en el visible (Figura 11.5). Por esto, al �luorescente
Métodos en biociencias

embargo, una partícula β es capaz de generar va-

rios fotones y afectar a ambos fotomultiplicadores.
El circuito de coincidencia sirve para �iltrar estas se-
ñales dando validez a aquellas que aparecen en los
dos fotomultiplicadores de forma simultánea. Las
señales que solo aparecen en un fotomultiplicador
son anuladas pues proceden del ruido de fondo.

11.2.3. El contador de centelleo sólido

Este tipo de contador se emplea para la detección
de radiación γ. La muestra que contiene el material
radiactivo se coloca en un tubo de vidrio o plásti-
co que se inserta en un cristal de ioduro de sodio
(NaI) llamado pozo de recuento (contiene trazas
de Talio) situado en la cámara de contaje del conta-
dor. La interacción de los rayos γ con las paredes del
tubo produce partículas β, que al interaccionar con
los cristales de NaI y el talio generan luminiscencia,
Figura 11.6: Esquema de un contador de cen- que es detectada por varios tubos fotomultiplicado-
telleo líquido (imagen superior) y de un tubo res que rodean el conjunto (Figura 11.7).
fotomultiplicador (imagen inferior).
El dispositivo también produce ruido de fondo
pero, en este caso, es muy pequeño en comparación
con la señal; por ello no es necesaria la existencia de
secundario también se le llama cambiador de lon- un circuito de coincidencia.
gitud de onda.
La �igura 11.6 incluye un esquema de un con-
tador de centelleo donde destaca la presencia de los 11.3. Autorradiografía
tubos fotomultiplicadores y un circuito de coinci-
dencia. Es un método cuya función principal es permitir la
Un tubo fotomultiplicador es un dispositi- localización de los sitios donde se ubican los isóto-
vo que, en un tiempo muy corto (rango de ns), pos radiactivos, ya sea en secciones histológicas,
convierte una señal luminosa en una señal eléctri- tanto de microscopía óptica como de microsco-
ca medible. Está formado por un tubo de cristal al pía electrónica, o en otros soportes como geles de
vacío en el que se incluye un fotocátodo, un siste-
ma de enfoque, una cadena de ampli�icación y un
ánodo. El fotocátodo, tras el impacto de la luz, emi-
te electrones (fotoelectrones) que son acelerados y
enfocados mediante campos eléctricos y magnéti-
cos hacia el primer dínodo. Un conjunto de dínodos
se encarga de ampli�icar el número de electrones,
de modo que la llegada de un fotón al cátodo ter-
mina transformándose en el impacto de alrededor
de 106 electrones en el ánodo. El ánodo se encarga
de transformar el impacto de los electrones en co-
rriente eléctrica, cuyo rango es de mA.
Uno de los problemas importantes de estos
contadores es la aparición de ruido de fondo en los
fotomultiplicadores por efecto de la temperatura,
hecho especialmente grave porque la señal del fo-
totubo, como se acaba de ver, es muy débil. El ruido
de fondo genera una única señal (pulso) por lo que Figura 11.7: Esquema de un contador de
solo puede estimular a un fotomultiplicador. Sin centelleo sólido.

278

poliacrilamida o papel de nitrocelulosa; también
puede servir como método de semicuanti�icación.
Básicamente, consiste en incorporar un compues-
to marcado radiactivamente en el ser vivo, obtener
la muestra biológica que ha incorporado el elemen-
to radiactivo, recubrir la muestra con una emulsión
fotográ�ica y, tras un tiempo de impresión, revelar
la emulsión de modo que sobre la muestra apa-
rece marcaje en los lugares donde se localiza el
radioisótopo marcador. El empleo de la emulsión
fotográ�ica se puede considerar un método tra-
dicional pues gradualmente va siendo sustituido
por sistemas de detección más modernos que de-
tectan la radiación y forman imagen utilizando
cámaras digitales, lo que conduce a una drástica
disminución de los tiempos de exposición y a la eli-
minación del trabajo en el laboratorio fotográ�ico.
El término autorradiogra�ía se debe a que la propia
muestra a estudiar actúa como emisor de radiación,
a diferencia de las técnicas radiográ�icas, donde el
emisor no es la propia muestra. Lacassagne y Lattes
(1924) fueron los primeros en desarrollar una téc-
nica autorradiográ�ica usando polonio. El empleo
de isótopos radiactivos en secciones histológicas se
debe a Bulliard, Grundland y Moussa en 1938.
Aunque, como se ha visto, pueden existir di-
ferentes técnicas autorradiográ�icas en función del
procesamiento del material biológico que incor-
pora el isótopo radiactivo, en este capítulo solo se
considerará la histoautorradiogra�ía. No se inclui-
rán procedimientos de electroforesis pues, en el
momento actual, el empleo de marcadores radiac-
tivos en técnicas electroforéticas está en desuso. La
peligrosidad, la mejora en la sensibilidad de otros
marcadores y la aparición de nuevas técnicas con
alta sensibilidad han sido los principales responsa-
bles de esta situación.
11.3.1. Histoautorradiografía
Las técnicas histoautorradiográ�icas son aquellas
que permiten la localización del radioisótopo en
secciones de tejido, tanto en microscopía óptica
como en microscopía electrónica. En la mayoría de
los casos se estudian secciones de órganos de ani-
males a los que previamente se les ha suministrado
el radioisótopo, pero también se pueden utilizar
secciones a las que se ha incubado con material ra-
diactivo, como puede ser el caso de la incubación
con un ligando radiactivo para estudiar su receptor.
Incluso con las secciones de tejido también es po-
sible realizar técnicas historradiográ�icas, aunque
este modo de proceder esté totalmente en desu-
so. Para ello hay que disponer la emulsión sobre la
279
Técnicas radiactivas
sección e irradiar el conjunto con rayos X. Tras el
procedimiento de revelado y �ijado, el material se
examina al microscopio óptico.
La mayoría de los radioisótopos utilizados en
estas técnicas emiten radiación β, y se suelen cla-
si�icar en función de su energía asociada como de
alta (32P), media (14C y 35S) o baja energía (3H). De
forma poco habitual también se usan radioisótopos
que emiten radiación α, como el Po y el Th.
El procesado del tejido
La molécula a estudiar (DNA, RNA, proteínas, lípi-
dos…) siempre debe considerarse para elegir el
�ijador, y el procedimiento de �ijación debe ser si-
milar al que se sigue para microscopía óptica o
electrónica. Sin embargo, es interesante incluir en
el �ijador el mismo compuesto que se utilizó como
marcaje pero frío (sin el elemento radiactivo), pues
provoca el lavado por arrastre de los compuestos
marcados unidos de modo inespecí�ico. El lavado
posterior también debe ser muy profundo para eli-
minar todos los restos de �ijador.
El grosor del corte ha de ser tenido muy en
cuenta pues solo las 2 o 3 μm más periféricas de los
cortes muy gruesos contribuyen a la señal, ya que la
radiación emitida por las zonas más profundas pue-
de ser absorbida por el material del propio corte,
especialmente si se emplea radiación α o β de baja
energía. En el caso de cortes muy �inos, 1 μm de es-
pesor, o cortes de microscopía electrónica (60 nm),
es conveniente prolongar los tiempos de exposición
para aumentar la probabilidad de impacto de la ra-
diación con los cristales de la emulsión.
Emulsiones
Son suspensiones de cristales de haluros (cloruros,
ioduros y bromuros) de plata en gelatina; de hecho,
funcionan como las emulsiones fotográ�icas, aun-
que poseen una mayor concentración de sales de
plata (hasta el 90%) que las emulsiones para foto-
gra�ía de luz. Esta mayor concentración de sales de
plata tiene como �in facilitar su interacción con la
radiación.
Para aplicar la emulsión se emplean dos téc-
nicas fundamentales: el método en placa (stripping
�ilm) y el método de la emulsión líquida (dipping o
coating �ilm). En el primer método se utilizan placas
de emulsión comerciales, cuyo grosor oscila entre
10 y 20 μm, que van pegadas a un soporte del que se
desprenden fácilmente. Se corta el fragmento que
se desee de la placa y, una vez despegada la emul-
sión, se deja �lotando en un baño. La emulsión se
Métodos en biociencias
Figura 11.8: Método de la emulsión líquida (�igura izquierda) y método del asa (�igura de-
recha) para colocar la emulsión sobre la muestra.
pesca sumergiendo el porta de modo que, al sacar-
lo, queda situada encima de la sección del tejido. El
segundo método consiste en introducir el porta en
un recipiente que contiene la emulsión líquida (Fi-
gura 11.8). Una vez aplicada la emulsión, los portas
se guardan en una cámara oscura y lugar fresco y
seco durante un tiempo que viene determinado por
el isótopo; por ejemplo, de 1 a 2 semanas para el 32P,
entre 1 y 30 semanas para el 35S y entre 1 semana y
1 año para el 14C. Por motivos de seguridad suele ser
aconsejable emplear una caja de paredes de plomo
para mantener las secciones durante el tiempo de
exposición. El revelado de la emulsión hace que las
sales de plata reducidas por impacto de la radiación
queden como puntos negros, plata metálica. El res-
to de sales serán disueltas por el �ijador fotográ�ico,
por lo que quedarán como zonas transparentes.
En el caso de microscopía electrónica, uno de
los procedimientos más sencillos es sumergir la
rejilla en una emulsión líquida; también se puede
cubrir la rejilla al tocar la emulsión que va coloca-
da en un asa de alambre. Métodos más so�isticados
pueden llegar a incluir la centrifugación de las re-
jillas cubiertas de emulsión con el �in de conseguir
capas de emulsión más �inas y homogéneas.
En su interacción con la emulsión, las partícu-
las α suelen mantener trayectorias rectas y dan muy
buena señal, pero no penetran más allá de 15 a 45
μm en ella. Las partículas β penetran mucho más,
especialmente las de alta energía, pero presentan
trayectorias más erráticas.
Localización del marcaje
La exactitud de la localización del marcaje depen-
de fundamentalmente de tres factores: el tiempo de
exposición, y el espesor del corte y de la emulsión.
280
El tiempo de exposición debe ser controlado, pues
las exposiciones muy largas facilitan la difusión de
la radiación por lo que su localización en la emul-
sión termina siendo menos precisa. En los cortes
gruesos, los radioisótopos más profundos gene-
ran marcajes más dispersos, y lo mismo ocurre si
la emulsión es demasiado gruesa. La dilución de la
emulsión evita el problema causado por el grosor,
pero conduce a una pérdida de sensibilidad.
Resolución
La resolución de la histoautorradiogra�ía depen-
de del tamaño de grano de la emulsión, del tipo
de radiación y de la sensibilidad de la emulsión.
El tamaño de grano de la emulsión es el factor de-
terminante del poder de resolución de la técnica.
En las técnicas estándar de microscopía óptica el
tamaño de grano revelado es de 0.2 μm, útil para
microscopía óptica pero no para microscopía elec-
trónica; piénsese que la membrana plasmática tiene
7 nm de espesor y el grano 200 nm. Por ello fue ne-
cesario utilizar emulsiones de grano más pequeño y
reveladores especiales hasta alcanzar un poder de
resolución de 20 nm. El tipo de radiación también
afecta a la resolución de modo que cuanto mayor es
la energía de la emisión radiactiva menor es la re-
solución debido a que la partícula emitida puede
hacer un viaje más largo en la emulsión y los granos
de plata, siempre más abundantes al �inal del reco-
rrido de la partícula, estarán más lejos de la zona de
emisión.
La sensibilidad viene de�inida por la energía
que se necesita para activar un cristal de haluro
de plata de la emulsión, y también afecta a la reso-
lución. Una emulsión de menor sensibilidad tarda
más en interaccionar con la radiación y permite que

la radiación se aleje del punto de emisión, lo que
acaba redundando en una menor resolución.
Marcaje de fondo
Lo forman aquellos granos que no se forman por
efecto de la radiación. Las causas de su aparición
son de origen muy variado: exposición accidental a
la luz, existencia en la muestra de iones metálicos,
el proceso de revelado, radiactividad de fondo, etc…
En general, se considera que este marcaje es fondo y
no es señal especí�ica cuando la densidad de los gra-
nos no es mayor de 0.01 grano/μm2.
Contraste
En microscopía óptica es usual teñir las secciones
para facilitar la identi�icación de los componentes
del tejido, y el proceso de tinción puede llevarse a
cabo antes o después de utilizar la emulsión. Para
microscopía electrónica, las secciones, ya colocadas
en las rejillas, se tiñen con citrato de plomo y aceta-
to de uranilo y, una vez secas, se aplica la emulsión.
Doble marcaje
Aunque es muy poco habitual, en la histoautorra-
diogra�ía también es posible llevar a cabo técnicas
de doble marcaje. Un procedimiento usual es utili-
zar dos isótopos radiactivos con diferente energía
– 3H y 14C por ejemplo– y cubrir las secciones con
dos capas diferentes de emulsión y una capa de
celoidina o gelatina entre ellas. El 3H, menos ener-
gético, impresionará únicamente la primera capa
de emulsión, la más próxima al tejido, y el 14C, más
energético, la capa superior, que suele prepararse
con el doble de concentración de sales de plata que
la primera.
11.4. Experimentos de pulso y caza
Los experimentos de pulso y caza (pulse-chase
analysis) clásicamente se usan para estudiar (1) la
vida media de algunas moléculas, (2) el movimiento
de moléculas dentro de la célula o de células den-
tro del organismo, este último menos usual, y/o
(3) la capacidad proliferativa de algunas células. La
determinación de la vida media es de mucha utili-
dad pues indica la tasa de recambio de la molécula
estudiada. Es cierto que, desde un punto de vista
molecular, uno de los cambios más usuales en el
material biológico es aumentar o disminuir la con-
centración de la molécula estudiada; sin embargo, a
281
Técnicas radiactivas
veces, y no es menos importante, se pueden produ-
cir cambios en la tasa de recambio de la molécula
en cuestión. En cuanto al movimiento de moléculas
dentro de la célula, esta técnica, unida a la histoau-
torradiogra�ía, fue extraordinariamente útil para
diseñar el mapa del proceso de biosíntesis de pro-
teínas. La incorporación de 3H-timidina en el DNA
fue, en su momento, el método más �iable de de-
mostrar la capacidad proliferativa de una célula;
sin embargo, el uso del marcaje con BrdU (bromo-
deoxiuridina) lo ha sustituido en la actualidad.
Básicamente, estos experimentos consisten en
suministrar un precursor marcado radiactivamente
durante un tiempo determinado (pulso), retirarlo,
tomar una muestra biológica a diferentes tiempos
(caza) y analizar después la evolución de la se-
ñal radiactiva. La muestra biológica puede ser una
sección de tejido o un extracto de tejido vivo o cul-
tivado. Para explicar el desarrollo de esta técnica,
se tomará como ejemplo averiguar la vida media de
una proteína P en células cultivadas.
El pulso se realiza retirando el medio normal y
añadiendo el medio de marcaje. Como la molécula
a estudiar es una proteína, al medio de cultivo se le
añade un aminoácido marcado, por ejemplo 35S-Cys.
La duración del pulso (tiempo de incubación en
el medio de marcaje) vendrá determinada por la
abundancia de la proteína P en las células y por la
cantidad de Cys que tiene dicha proteína, pero sue-
le ir desde 30 min a algunas horas. Es importante
tener en cuenta que la incorporación de Cys habrá
tenido lugar no solo en la proteína P, sino en todas
las proteínas que se estaban sintetizando durante
el pulso. La concentración del isótopo radiactivo en
el medio de incubación suele ser de 100-200 μCi/
mL. Una vez concluido el pulso, se retira el medio
de incubación, se lavan las células y se añade medio
normal con Cys fría a muy alta concentración para
evitar que la Cys caliente que se va liberando en los
procesos de degradación de proteínas pueda ser re-
utilizada. De lo contrario, si hay reutilización de la
Cys caliente, no se detectará una caída en la señal
radiactiva. Comienza entonces el proceso de caza,
que consiste en ir extrayendo muestras (placas de
cultivo en este caso) a diferentes tiempos. Si no se
dispone de datos previos, la elección de los tiempos
de caza se suele hacer teniendo en cuenta criterios
de funcionalidad; por ejemplo, proteínas citoes-
queléticas suelen ser mucho más estables que las
implicadas en procesos de señalización. Las células
de la muestra de caza se lisan y se inmunoprecipi-
ta la proteína P. La inmunoprecipitación es un paso
absolutamente obligatorio pues permitirá detectar
exclusivamente la señal que proviene de la proteína
Métodos en biociencias

P y no del resto de proteínas, que también resulta-

ron marcadas. El contaje de la señal radiactiva del
pellet obtenido tras la inmunoprecipitación se rea-
liza en un contador de centelleo y, �inalmente, se
elabora una curva de marcaje donde se representan,
en el eje Y, la señal radiactiva en cpm considerando
el 100% la que emite la muestra cazada en el punto
0, y en el eje X, el tiempo. El tiempo interpolado con
la señal radiactiva al 50% es el valor de la vida me-
dia de la proteína estudiada.

11.5. Radioinmunoanálisis

El radioinmunoanálisis (RIA) es una técnica in-

munológica que permite detectar y cuanti�icar un
antígeno (analito) presente en una muestra com-
pleja, como puede ser un líquido biológico (plasma
o suero sanguíneo, orina…) o un extracto tisular,
empleando para ello un análogo de dicho antígeno
marcado con un radioisótopo. Se trata de un ensayo
de elevada especi�icidad y sensibilidad, pudiéndose
detectar cantidades muy pequeñas del analito, en el
Figura 11.9: Principio de un radioinmunoanálisis de unión
rango de pg (10-12 g) a fg (10-15 g), cuando se utilizan competitiva.
anticuerpos de alta a�inidad.
El primer método de RIA fue desarrollado por
Yalow y Bersen en 1959 para cuanti�icar insulina en
muestras de sangre de pacientes con diabetes tipo pite con el antígeno frío por un número �ijo de sitios
2. Esta técnica supuso una gran revolución en las de unión del anticuerpo (Figura 11.9). Esto es posi-
distintas áreas de las ciencias biomédicas al hacer ble ya que el anticuerpo no distingue entre ambas
posible el diagnóstico de enfermedades debidas a formas (caliente y fría). En el punto de equilibrio,
una alteración hormonal así como la identi�icación la cantidad de antígeno frío y caliente unida al an-
en sangre de antígenos asociados a la hepatitis C. ticuerpo será un re�lejo de la proporción relativa de
Por ello, Yalow fue galardonada con el premio No- ambos. Por ejemplo, una mayor concentración del
bel en Medicina y Fisiología en 1977. Hoy en día, el antígeno frío determina una competencia más e�i-
RIA se puede utilizar para la cuanti�icación de una caz por su unión con el anticuerpo, desplazará la
amplia variedad de analitos, desde esteroides y hor- unión del antígeno caliente con el anticuerpo y de-
monas peptídicas hasta proteínas grandes como la terminará una mayor proporción de antígeno frío
β2-macroglobulina e inmunoglobulinas. unido al anticuerpo. Obviamente, para que la pro-
porción de antígeno frío y caliente unido sea un
re�lejo de su proporción relativa, es necesario que
11.5.1. Principio del RIA el anticuerpo esté en concentración limitante (se
emplea a una dilución que proporciona aproxima-
La técnica del RIA requiere tres compuestos bási-
damente un 50% de unión del antígeno caliente en
cos: (1) la muestra, que contiene o puede contener
ausencia de antígeno frío). Una concentración de
el antígeno de interés, (2) un anticuerpo primario
anticuerpo en exceso no determina un ensayo de
especí�ico para dicho antígeno y (3) un análogo del
competencia pues siempre, fuese cual fuese la con-
antígeno puri�icado marcado con un radioisótopo.
centración de antígeno frío, se terminaría uniendo
La elección del radioisótopo marcador dependerá
todo el antígeno marcado.
de la estructura molecular del antígeno, pero 3H o
125
I son los de uso más habitual. Dado que el antíge-
no que contiene la muestra va sin marcar es usual 11.5.2. Procedimiento
denominarlo antígeno frío; el antígeno caliente es el
antígeno marcado. El método se fundamenta en una Después de un periodo de incubación (el necesario
unión competitiva donde el antígeno caliente com- para que el sistema alcance el equilibrio), se ha de

282

separar el antígeno que ha quedado libre (no uni-
do al anticuerpo) del antígeno unido al anticuerpo
(Figura 11.9). Para ello existen distintos métodos
que siguen dos estrategias básicas: o se precipita
la fracción unida (complejo antígeno-anticuerpo)
o se adsorbe el antígeno libre (Cuadro 11.2). Un
método usual de precipitación del complejo antí-
geno-anticuerpo es la utilización de un anticuerpo
secundario dirigido contra el que se une al antígeno
(y, por ello, con carácter de primario). Después de
Cuadro 11.2: Métodos para la separación del antígeno unido y li-
bre en un RIA.
Principio Método
Carbón cubierto de dextrano
Adsorción de la frac-
Florisil (silicato de magnesio activa-
ción libre
do)
Proteína A de S. aureus
Figura 11.10: Representación esquemática de un radioinmunoanálisis con una curva patrón hipotética.
283
Técnicas radiactivas
Anticuerpo secundario
Precipitación de la Polietilén glicol
fracción unida
Etanol
Sulfato amónico
centrifugar los tubos, se desecha el sobrenadan-
te que contiene el antígeno no unido y se mide la
radiactividad (en cpm) del sedimento con un con-
tador de centelleo líquido (para emisores β como el
3
H) o de centelleo sólido (para emisores γ como el
125
I). Entre los métodos de adsorción, lo más usual
es utilizar carbón cubierto de dextrano como adsor-
bente del antígeno libre. En este caso, después de la
centrifugación, se recoge el sobrenadante que con-
tiene el complejo antígeno-anticuerpo y se mide la
radiactividad.
La medida de la radiactividad obtenida es in-
versamente proporcional a la cantidad de antígeno
frío presente en la muestra. La concentración des-
conocida de dicho antígeno se determina a partir de
una curva patrón que se prepara con concentracio-
nes crecientes del antígeno frío puri�icado (también
denominado patrón) (Figura 11.10). La curva se ob-
tiene al representar en una grá�ica el porcentaje de
unión del antígeno caliente (eje Y), calculado me-
diante la ecuación
Métodos en biociencias
%B= (cpm tubo/cpm totales) x 100
frente al logaritmo de las concentraciones del antí-
geno frío (eje X). Es también habitual representar
%B/B0 = (cpm tubo/cpm del patrón 0) x 100. Al in-
terpolar en dicha curva el porcentaje de unión del
antígeno de la muestra, se obtiene el logaritmo de su
concentración y, de allí, su concentración y cantidad.
11.6. Radiometría
La radiometría es un método de datación absoluta
que consiste en la determinación de la presencia de
isótopos radiactivos de una muestra biológica/pa-
leontológica con el �in de conocer su edad. Se basa
en el hecho de que determinados isótopos radiacti-
vos naturales, por efecto de la emisión de radiación,
se van transformando en otros compuestos quími-
cos. Al elemento inicial se le llama elemento padre
y elemento hijo al que se genera. Son muchos los
isótopos radiactivos que se pueden emplear, pero
entre los más usados destacan las transformaciones
siguientes: U235  Pb207, Rb87  Sr87, K40  Ar40 y
C14  N14, donde el primero es el elemento padre y
el segundo el elemento hijo. La base del cálculo de la
edad es la determinación de la proporción relativa
de uno y otro en la muestra y la expresión que se usa
para ello es t = (1/λ) ln (1+ D/P). Donde t es el tiem-
po a determinar, λ la constante de desintegración del
elemento padre, y D y P el número de átomos del ele-
mento hijo y padre respectivamente. El uso de una u
otra serie de desintegración depende del tiempo es-
timado que se quiere datar pues cada serie tiene un
periodo distinto de semidesintegración, 713 millo-
nes de años, 47 millones de años, 1.27 millones de
años y 5730 años son los correspondientes a las cua-
tro series citadas anteriormente.
Probablemente el isótopo radiactivo más usa-
do en la datación paleontológica sea el 14C. Para ello,
se utiliza una variante metodológica que consiste en
averiguar la proporción relativa de 14C y 12C presen-
te en los restos del material biológico. En un ser vivo
esta proporción es la misma que hay en la natura-
leza (14C/12C ≈ 1.3 x 10-12) pues el ser vivo toma el
C de ella. Una vez muerto, el isótopo 14C se va des-
integrando, pues es inestable, y la proporción entre
284
ambos elementos va variando, hecho que permite
extrapolar la edad de los restos biológicos. El máxi-
mo tiempo de datación de esta técnica es de 60000
años. La evolución del modo de detección del 14C
puede representar un paradigma de la evolución
de las técnicas de detección. En la década de los 50
todo el C de la muestra se transformaba en gas y en
la cuanti�icación del material radiactivo se usaban
contadores gaseosos. Este método fue desarrollado
por Libby y le supuso el premio Nobel de Quími-
ca en 1960. Los contadores de centelleo líquido se
emplearon en la década de los 60 y, actualmente,
se usan espectrómetros de masas (14C y 12C pueden
diferenciarse por su distinta masa) ya que son mu-
cho más sensibles y necesitan muy poca muestra.
La datación con 14C es muy �iable hasta 1950 pues
se consideraba que hasta ese instante la concentra-
ción de 14C fue constante; sin embargo, los ensayos
nucleares que se realizaron después provocaron un
aumento de 14C que puede provocar errores de me-
dida. La existencia de �luctuaciones del contenido de
14
C por otros motivos ha hecho necesario realizar un
recalibrado de la concentración de 14C de los últimos
15000 años con el �in de corregir posibles desvia-
ciones.
Bibliografía
Autoradiography. A Comprehensive Overview. 1989.
Baker JRJ , Baker P. Bios Scientific Publishers. ISBN 978-
0198564225.
Autoradiography for Biologists. 1972.
PB Gahan (ed). Academic Press. ISBN 978-0122732508.
Handbook of Experimental Immunology. Volume 1 Immu-
nochemistry. 1986.
Weir DM (ed). Blackwell Scientific Publications. ISBN 0632
014997.
Handbook of Radioimmunoassay. 1977.
Abraham GE, Dekker-University of Minnesota. ISBN 978-
0824764531.
Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 2000.

Técnicas
electrofisiológicas
Las técnicas electro�isiológicas se utilizan para el es-
tudio de los fenómenos eléctricos que tienen lugar
en células y tejidos biológicos. Lo más excitante de
estas técnicas es que nos permiten estudiar en di-
recto la actividad de células y tejidos mientras están
en funcionamiento. Aunque esta actividad eléctrica
no sea directamente perceptible por nuestros senti-
dos, se dispone de dispositivos que permiten ver o
incluso escuchar esa actividad.
La electro�isiología abarca una amplia gama
de técnicas que se aplican al estudio de los fenóme-
nos eléctricos desde el nivel de una molécula, por
ejemplo un canal iónico, hasta el nivel de un órgano
completo como puede ser el encéfalo. La generación
y el mantenimiento de los potenciales bioeléctricos
por elementos biológicos requieren inevitablemen-
te la conservación de la integridad y funcionalidad
de los tejidos. Esto se puede conseguir usando di-
ferentes tipos de preparaciones que se adecúan al
tipo de estudio que se pretende realizar.
Para ordenar las explicaciones que siguen, este
capítulo se va a dividir en dos grandes bloques:
1) El primero se centrará en las técnicas
que se realizan a nivel de un organismo
completo mediante aproximaciones no
invasivas. Se trata de técnicas, como la
12.
Iván Rivera Arconada
José Antonio López García
electroencefalogra�ía (EEG), que se utili-
zan para el diagnóstico clínico y también
en investigación.
2) El segundo se ocupará de las técnicas
que se utilizan sobre todo en células o te-
jidos aislados. Estas técnicas invasivas
permiten un estudio más detallado de los
fenómenos bioeléctricos, pero su uso está
limitado al campo de la investigación. El
uso de esta tecnología en humanos está
restringido por las obvias di�icultades éti-
cas que conlleva.
Pero antes de comenzar con el estudio de estas téc-
nicas se hará una breve reseña explicando qué son,
cómo se originan y cuál es la importancia �isiológica
de estos potenciales bioeléctricos.
12.1. Potenciales bioeléctricos
El término «potenciales bioeléctricos» englo-
ba todas las formas de potencial eléctrico generado
por estructuras biológicas, fundamentalmente cé-
lulas llamadas excitables. En casos extraordinarios
que se dan en algunos peces, estas células se agru-
pan para formar órganos eléctricos capaces de
Métodos en biociencias
generar descargas puntuales de voltaje conside-
rable que son útiles para aturdir a presas o para
generar señales de comunicación entre individuos
de la misma especie.
En la mayoría de casos, estos potenciales
bioeléctricos son de poca amplitud y se encuentran
intrínsecamente acoplados a la función fundamen-
tal de las células excitables. Por ejemplo, las �ibras
musculares disparan potenciales de acción dos o
tres milisegundos antes de contraerse. Más aún, en
condiciones �isiológicas las �ibras solo se contraen
si se produce un potencial de acción. Por tanto el
potencial de acción es un evento dentro de la ca-
dena causal que controla la contracción. Lo mismo
podría aplicarse a las neuronas y también a algu-
nas células secretoras del sistema endocrino. Como
el potencial eléctrico está íntimamente ligado a la
función de la célula, el estudio del potencial eléctri-
co nos da información relevante sobre la función de
la célula.
Las primeras observaciones referentes a la
«bioelectricidad» o «animal electricity» son tan an-
tiguas como los propios conceptos eléctricos a los
que hacen referencia. Luigi Galvani en 1750 des-
cubrió casualmente que se puede provocar una
contracción de la pata de una rana muerta sobre
la mesa de disección, acercando una pinza cargada
electrostáticamente al nervio ciático. Las discusio-
nes posteriores entre Galvani y Volta para explicar
este fenómeno dieron lugar a la construcción por
este último de la pila voltaica: una demostración
clara de que la llamada electricidad animal se podía
producir fuera de un ser vivo.
La explicación en profundidad de la bio�ísi-
ca de membranas excitables no es objetivo de este
capítulo. Los potenciales de reposo y de acción se
explican con detalle en muchos manuales de Fisio-
logía y de Neurociencias a los que se puede recurrir
para comprender mejor estos fenómenos. Aquí solo
se repasarán algunos conceptos clave.
A diferencia de los metales, en estructuras
biológicas no existen electrones libres y por tanto
la carga es portada por iones en disolución y tam-
bién por algunas proteínas. Las principales especies
iónicas que contribuyen a la generación de poten-
ciales eléctricos son el potasio y el sodio aunque
otras especies como el calcio y el cloro también pue-
den contribuir. Por tanto la separación de carga que
es esencial para generar un potencial eléctrico, en
las estructuras biológicas equivale a la separación
de iones. Todas las células del organismo son capa-
ces de «separar iones» concentrando o diluyendo
especies particulares con respecto del medio en el
que viven y como consecuencia todas las células son
capaces de generar «potenciales de reposo».
286
12.1.1 Potencial de reposo
El elemento fundamental para la generación y man-
tenimiento de potenciales de reposo es la membrana
plasmática. Las membranas son bicapas lipídicas de
solo unos amstrongs de grosor. Experimentalmente
se demuestra que el interior celular y el exterior tie-
nen una diferencia de potencial eléctrico que es de
unos -65mV en las neuronas en reposo. A este po-
tencial se le llama potencial de reposo.
Los iones en disolución acuosa no pueden atra-
vesar libremente la membrana por no ser solubles en
lípidos. Pero si pueden atravesarla a través de cana-
les iónicos. Los canales son estructuras proteicas que
forman poros selectivos en la membrana dejando pa-
sar a una especie iónica pero no a las demás.
En el interior celular se acumulan grandes
aniones (en proteínas) y potasio. En el exterior so-
dio y cloro. Imagínese una situación de partida en
la que el número de cargas positivas y negativas es
igual en ambos compartimentos y la membrana es
completamente impermeable a cualquier ión. En
estas condiciones no existiría diferencia de poten-
cial entre el exterior y el exterior.
Si ahora se incorpora un canal iónico para el
potasio, ¿qué ocurrirá previsiblemente?
El potasio debería salir de la célula a favor de
su gradiente de concentración. En este proceso, por
cada potasio que sale, se quedaría una carga negati-
va atrapada en el interior celular.
La siguiente cuestión es ¿hasta cuándo seguirá
saliendo potasio? El potasio debería seguir salien-
do de la célula hasta que la fuerza que lo impulsa a
salir (gradiente de concentración) se iguale con la
fuerza que le impulsa a quedarse. Esta última fuerza
es el gradiente eléctrico que se genera con la pro-
pia salida de potasio. La ecuación de Nernst (Figura
12.1) explica cuál es el potencial de la membrana
(o potencial eléctrico a través de la membrana) que
nuestra célula alcanzará cuando ambas fuerzas se
igualen.
En las células excitables reales, además de ca-
nales para el potasio, existen también unos pocos
canales para otras especies iónicas. El potencial de
membrana en reposo dependerá de las concentra-
ciones intra y extracelular para cada ión así como de
las permeabilidades para cada ión. La ecuación de
Goldman nos da el potencial de membrana en fun-
ción de estas variables (Figura 12.1).
12.1.2. Potencial de acción
La mayoría de las células del organismo tienen un
potencial de reposo más o menos �ijo y no pueden

Figura 12.1: Ecuaciones de Nernst y Goldman.
alterarlo. Las células excitables, por el contrario, tie-
nen un potencial de membrana variable.
La desviación más conocida del potencial de
reposo es el potencial de acción que se da en �ibras
musculares y neuronas. El potencial de membra-
na que en reposo se encuentra aproximadamente
a -65 mV pasa súbitamente a +20 o +40 mV. Inme-
diatamente después se recupera el potencial de
reposo de tal forma que el potencial de acción es
una despolarización transitoria que dura solo unos
milisegundos.
Se acaba de ver que el potencial de reposo es el
resultado de procesos bio�ísicos opuestos alcanzan-
do un equilibrio. El potencial de acción supone un
desequilibrio transitorio que se debe a la apertura
de un conjunto de canales iónicos activos. Estos ca-
nales se encuentran normalmente cerrados pero se
abren cuando la membrana sufre pequeñas altera-
ciones de su potencial de reposo. Así, por ejemplo,
una pequeña despolarización generada en una
neurona al interaccionar con un neurotransmisor
puede ocasionar la apertura de canales iónicos ac-
tivos, abriendo una nueva puerta a iones que ahora
movidos por las mismas fuerzas �isicoquímicas in-
tentarán encontrar un nuevo equilibrio.
Los canales activos presentes en neuronas y �i-
bras musculares no son exactamente los mismos y,
por tanto, la forma y curso temporal del potencial
de acción no son idénticos. En neuronas los canales
activos más típicos son los de sodio. Cuando estos se
abren, el sodio tiende a entrar en la célula portando
carga positiva y despolarizando la membrana.
El potencial de acción se acaba debido a dos
factores: a) la apertura de los canales de sodio es
temporal, de tal forma que se abren durante una
fracción de milisegundo y vuelven a cerrarse inme-
diatamente; b) la despolarización de la membrana
ocasionada por la entrada de sodio abre canales de
287
Técnicas electrofisiológicas
potasio dependientes de voltaje y estos ayudan a re-
polarizar la neurona.
En �ibras musculares el potencial de acción
puede durar algo más debido a la apertura de cana-
les de calcio que tienen una cinética algo más lenta
que los de sodio, pero en líneas generales la secuen-
cia de acontecimientos es semejante.
12.1.3. Campos eléctricos y sincronía
El potencial de reposo solo puede detectarse con
técnicas de registro intracelular, sin embargo, los
cambios dinámicos de este potencial, como ocu-
rre con los potenciales de acción, crean campos
eléctricos que, aunque débiles, pueden ser detec-
tados a una cierta distancia de su lugar de origen.
Así, los potenciales de acción pueden ser detecta-
dos desde el exterior con un electrodo situado en la
proximidad de una célula. Cuando un conjunto de
células tiene actividad eléctrica sincrónica, los cam-
pos eléctricos se pueden sumar y viajar por el medio
extracelular hasta la super�icie del cuerpo. Estos
campos eléctricos pueden ser detectados por elec-
trodos de super�icie. La intensidad de estos campos
dependerá: (a) del tamaño de las estructuras que
los originan (por ejemplo una �ibra muscular origi-
na un campo eléctrico mayor que una neurona), (b)
el número de células que intervenga (unas docenas
de células producen campos más débiles que unas
centenas o millares) y (c) del grado de sincronía con
el que cambie su potencial de reposo.
12.2. Técnicas no invasivas
Estas técnicas tienen una aplicación continua en el
ámbito clínico. Nos aportan información proceden-
Métodos en biociencias

Figura 12.2: La imagen de la izquierda muestra electrodos desechables típicos para realizar electrocar-
diograma o electromiograma. La imagen de la derecha muestra un «casco de registro EEG» donde cada
punto blanco corresponde a un electrodo. Modi�icado de http://electroencefalogramacepi.blogspot.com.
es/2011/05/senales-biomedicas.html. Disponible en color.

te de la actividad sincrónica de grandes grupos de 12.2.2. Equipo de registro

células capaces de generar campos eléctricos detec-
tables desde la super�icie de la piel. Con este tipo
de técnicas se estudia el comportamiento eléctri-
co del corazón (electrocardiograma), del cerebro
(electroencefalograma), de músculos especí�icos
(electromiograma) o del movimiento ocular (ele-
trooculograma). Todas estas técnicas funcionan
sobre principios teóricos y tecnológicos muy seme-
jantes. Este capítulo se centrará en la descripción
del EEG.
12.2.1. Electrodos
Los electrodos suelen ser pequeños discos metálicos
que habrá que situar pegados a la piel conveniente-
mente limpia y desescamada. Típicamente tienen
diámetros de 4 a 9 mm y están compuestos de pla-
ta-cloruro de plata. Generalmente se utilizan geles
conductores con abundante cloro para mejorar el
contacto con la piel. Muchas veces los electrodos
están insertados en una estructura plástica autoad-
hesiva y son desechables. Para el cuero cabelludo
donde la adherencia está limitada suelen usarse
cascos como el de la imagen (Figura 12.2).
Los electrodos suelen ubicarse sobre la es-
tructura que se va a estudiar (la cabeza, un músculo
especí�ico). En el caso del corazón que genera ondas
de gran amplitud debido a la sincronía del disparo
de sus �ibras, los electrodos pueden situarse lejos
del foco.
Los cables procedentes de los electrodos están co-
nectados a un complejo equipamiento que nos
permitirá visualizar los cambios eléctricos en forma
de ondas para su estudio. Estos equipos comparan
el potencial eléctrico entre pares de electrodos y
las diferencias de potencial son cuantitativamente
registradas frente al tiempo. Normalmente se uti-
lizará un tercer electrodo de «toma a tierra» del
sujeto para reducir en lo posible la contaminación
de las señales biológicas por ruido eléctrico proce-
dente del ambiente.
Las señales biológicas pasan primero por una
fase de ampli�icación. Ya que se trata de señales de
muy pequeña amplitud, sobre todo las de EEG, se
pueden ampli�icar en dos pasos, uno muy cercano
al lugar de origen («head stage» o preampli�icador)
y otro de mayor tamaño en el lugar de registro (am-
pli�icador).
Las señales son después �iltradas para elimi-
nar frecuencias de origen no biológico. Típicamente
se eliminan frecuencias muy altas y muy bajas ade-
más de los 50 Hz, una banda de frecuencia en la que
es muy probable encontrar ruido generado por las
instalaciones eléctricas circundantes.
Después de este tratamiento, las señales se
pueden visualizar por varios métodos distintos.
Tradicionalmente se utilizaban osciloscopios e im-
presoras de plumilla que imprimían las ondas sobre
papel continuo. Hoy en día se suelen utilizar equi-
pos digitales lo cual añade grandes ventajas aunque

288
 Tema 12, página 7

Técnicas electrofisiológicas

Figura 12.3: Digitalización de señales analógicas.La primera grá�ica representa una señal sinusoidal
analógica cuya amplitud varía de forma continua a lo largo del tiempo con una frecuencia aproxima-
Figura
da de 80 Hz ya que tiene 2 ciclos 12.3. en
enteros Digitalización de señales
25 ms. La segunda analógicas.
gra�ica representa una digitalización
de
Lalaprimera
señal con un muestreo
gráfica de amplitud
representa cada
una señal 2 ms (500analógica
sinusoidal Hz). La última
cuyarepresenta una digitalización
amplitud varía de forma continua a
cada
lo 4 ms
largo del(250 Hz).con
tiempo Nótese
unacomo la �idelidad
frecuencia de la reproducción
aproximada de 80 Hz yadigital disminuye
que tiene conenteros
2 ciclos la frecuencia
en 25 ms. La
segunda grafica representa una digitalización de muestreo.
de la señal con un muestreo de amplitud cada 2 ms (500
Hz). La última representa una digitalización cada 4 ms (250 Hz). Nótese como la fidelidad de la
reproducción digital disminuye con la frecuencia de muestreo.

supone un paso más en el procesamiento de las se-
ñales: la conversión analógico-digital.
Las señales procedentes de los ampli�icado-
res son analógicas, es decir continuas en el tiempo.
Los ordenadores necesitan señales digitales. Para
ello, la señal original debe ser muestreada a espa-
cios regulares de tiempo y para cada muestreo se
debe obtener un valor de amplitud en micro o mi-
livoltios. De esta forma las ondas analógicas se
convierten en pares de números, el primero nos da
el dato de tiempo y el segundo, el valor de la ampli-
tud. Este proceso es delicado ya que debe elegirse
adecuadamente el intervalo de tomas de muestra o
frecuencia de muestreo. Se suele aconsejar que la
frecuencia de muestreo sea unas 10 veces superior
a la frecuencia máxima de la señal que se va a estu-
diar (Figura 12.3).
12.2.3. Electroencefalografía
De entre las técnicas de registro no invasivas, la
electroencefalogra�ía (EEG) es la más compleja y
la que más entrenamiento requiere. Esto se debe

289
Métodos en biociencias
a varias cuestiones. Primero los campos eléctricos
generados por las neuronas son muy débiles y esto
hace que la obtención y tratamiento de los registros
sea técnicamente muy demandante. A esto se une la
topogra�ía del cerebro, su complejidad intrínseca y
su aislamiento de la super�icie corporal por una cu-
bierta ósea discontinua (el cráneo).
Posicionamiento de electrodos y montajes
de registro (derivaciones)
Se usan electrodos de copa redondos autoadhesivos
o insertados en un gorro elástico como en la imagen
anterior. El número de electrodos es muy variable
dependiendo de los objetivos del estudio. Típica-
mente se usan de 8 a 20 pero pueden ser muchos
más en casos donde la localización de focos de acti-
vidad requiere precisión y se cuenta además con la
capacidad de analizar los registros de forma auto-
mática por ordenadores. El posicionamiento de los
electrodos se realiza en lugares especí�icos cubrien-
do todas las regiones craneales. La posición de cada
electrodo se nombra con una letra mayúscula que
corresponde al hueso craneal sobre el que se sitúa
(por ejemplo F de frontal o P de parietal) seguido
de un número que indica más �inamente la posición
(Figura 12.4). Este código de nombre es esencial
para identi�icar los canales de registro y saber de
dónde proceden las señales.
Las derivaciones o montajes de registro ha-
cen referencia a cómo se usan los electrodos para
comparar el potencial eléctrico. Los registros mono-
Figura 12.4: Posicionamiento y nomenclatura de
electrodos para el EEG (sistema de 21 electrodos). Mo-
di�icado de http://commons.wikimedia.org/wiki/
File:21_electrodes_of_International_10-20_system_
for_EEG.svg#/media/File:21_electrodes_of_Interna-
tional_10-20_system_for_EEG.svg.
290
polares comparan un electrodo activo (posicionado
sobre el cuero cabelludo) con un electrodo neu-
tro o de referencia, teóricamente a potencial 0. Una
buena ubicación para este segundo electrodo es el
lóbulo de la oreja o el mentón. En este tipo de deri-
vación cada canal de registro nos dará la diferencia
de potencial en el tiempo entre un electrodo acti-
vo y el de referencia. Todos los electrodos activos
usan la misma referencia. En los registros bipolares
se miden diferencias de potencial entre parejas de
electrodos activos pero la interpretación de estas
señales es más compleja.
Tratamiento de las señales de EEG
Las señales biológicas se ampli�ican para poder me-
dir amplitudes entre 2 y 200 microvoltios que son
los límites típicos de amplitud para las ondas de
EEG. En la fase de �iltrado normalmente se eliminan
frecuencias menores a 0.5 Hz y mayores de 35 Hz.
Debido a las características de los equipos de �iltra-
do, las frecuencias por encima y por debajo de los
límites �ijados no se eliminan sino que se atenúan.
Por esta razón se suele incorporar un �iltrado es-
pecí�ico de 50 Hz para reducir los ruidos eléctricos
ambientales. Para conocer con exactitud la ampli-
tud de las señales, los equipos de registro suelen
presentar un sistema de calibrado de tal forma que
hacen pasar por el sistema de registro una señal de
amplitud y frecuencia conocidas. De esta forma se
puede conocer el impacto exacto que tiene el proce-
sado de la señal sobre la señal misma.
Análisis de señales de EEG
Durante muchos años el análisis del EEG se ha he-
cho en base a una simple inspección visual de las
ondas registradas. De esta forma se detectan los
ritmos básicos del EEG y algunos fenómenos es-
peciales. Los ritmos básicos se diferencian por su
frecuencia. Normalmente a la frecuencia se asocia
la amplitud de tal forma que las amplitudes mayo-
res se detectan normalmente en los ritmos con más
baja frecuencia. Las ondas de menor frecuencia (<
4Hz) se llaman ondas Delta, los ritmos entre 4 y 8
Hz son las ondas Theta, entre 8 y 13 Hz ritmos Alfa
y por encima de los 13 Hz es el ritmo Beta (Figu-
ra 12.5).
Siguiendo el principio de sincronía, los ritmos
de mayor amplitud se corresponden con mayor sin-
cronía en el funcionamiento neuronal. Los ritmos
más sincrónicos (Delta) suelen encontrarse duran-
te los primeros estadios del sueño mientras que los
ritmos más rápidos (Beta) son típicos de los estados

 
Figura 12.5: Ritmos básicos del EEG y espigas epilépticas. La barra vertical de calibración mide 200 micro voltios.
El ritmo alfa contiene tres ejemplos, uno de ellos obtenido con ojos cerrados. Modi�icado de http://www.trueim-
pact.ca/introduction-to-electroencephalogram-eeg/.
vigiles. El ritmo Alfa se registra con mayor amplitud
de las zonas occipitales cuando se cierran los ojos
indicando que esta maniobra (cerrar los ojos) pro-
duce un aumento de la sincronía neuronal.
En un EEG real es muy común la aparición de
ritmos más complejos que muchas veces corres-
ponden a la combinación de dos o más sinusoides
con distinta frecuencia. Además de estos ritmos bá-
sicos es posible identi�icar fenómenos especiales.
Algunos de estos son típicos del sueño, otros dela-
tan la activación de focos epilépticos.
Hoy en día se dispone de complejos sistemas
de análisis de señales por ordenador que permiten
hacer análisis muy detallados de las ondas y, cuan-
do se combinan con un número alto de electrodos,
nos permiten hacer inferencias bastante precisas de
la localización de los generadores de la actividad re-
gistrada.
291
Técnicas electrofisiológicas
Beta:
13-30
Alfa:
8-13 Hz
(Ojos abiertos)
Theta:
4-8 Hz
Delta:
0.5-4
Espigas repetidas
procedentes de un
foco epiléptico
Aplicaciones del EEG
La electroencefalogra�ía se usa sobre todo en si-
tuaciones clínicas para diagnosticar epilepsias,
situaciones de coma y también para asistir al diag-
nóstico de algunos problemas del sueño.
El EEG es una herramienta fundamental para
clasi�icar las epilepsias. Ayuda a detectar la existen-
cia de focos y cuando se emplaza un número alto
de electrodos sobre el cuero cabelludo y se combina
con un análisis computacional de las señales apli-
cando modelos topográ�icos de la cabeza, es posible
predecir la localización de los focos. Este tipo de aná-
lisis de localización espacial del foco es complejo y
de índole predictiva. En el caso de epilepsias farma-
corresistentes e inhabilitantes cuya única terapia es
la resección quirúrgica del foco, se comprueba que
las predicciones hechas por estos modelos pueden
Métodos en biociencias

ser bastante buenas. Durante la intervención qui- Potenciales evocados

rúrgica, es posible introducir electrodos de aguja en
el parénquima cerebral y detectar con precisión la
localización del foco (véase más adelante en este ca-
pítulo potenciales de campo).
El EEG se utiliza también para el estudio y
clasi�icación de las alteraciones patológicas de la
consciencia o comas. Basándonos en un principio
general según el cual el enlentecimiento de las on-
das del EEG se relaciona con estados de depresión
de la consciencia, los comas se clasi�ican por grados
de profundidad hasta llegar al de muerte cerebral
en el que no se aprecia actividad cerebral ni siquie-
ra en las condiciones más favorables de registro
(máxima ampli�icación, mínima �iltración).
El EEG es parte fundamental del estudio de las
patologías del sueño. En condiciones normales, se
pasa por diferentes fases durante un periodo de sue-
ño nocturno. Cada una de estas fases se caracteriza
sobre todo en base a las ondas de EEG registradas.
Típicamente las ondas se enlentecen desde la vigilia
a las fases de sueño más ligero hasta las fases más
profundas. En la fase de sueño REM, se da la parado-
ja de que el EEG gana frecuencia para asemejarse al
de la vigilia siendo la fase más profunda del sueño,
donde más cuesta despertar a un sujeto dormido,
quizá re�lejando la activación cortical y la presencia
de actividad onírica.
La técnica de potenciales evocados se deriva direc-
tamente de la electroencefalogra�ía y, aunque aquí
no se va a tratar en profundidad, sí se quiere hacer
una breve introducción al menos a nivel intuitivo,
dada su importancia para el diagnóstico de enfer-
medades sensoriales y en la investigación.
Durante la realización de un EEG normal, se
observa que la activación de un sistema sensorial
por la presentación de un estímulo (una palmada
o un �lash de luz) tiene un impacto mínimo sobre
las ondas registradas. Para estudiar con más de-
talle estas ondas evocadas por la estimulación de
un sistema sensorial especí�ico se ha desarrollado
la técnica de potenciales evocados. Esta se basa en
el promediado de fragmentos del EEG que corres-
ponden a los instantes en los que se presenta un
estímulo. Un �lash de luz se puede presentar al su-
jeto 20 veces a intervalos regulares, pues bien, se
tomará la señal de EEG producida en cada presenta-
ción del �lash y se promediará su amplitud en cada
punto de tiempo. El resultado previsible es que las
pequeñas deformaciones del EEG producidas por
el estímulo sobrevivirán al proceso de promedia-
do. Por el contrario las señales no relacionas con el
estímulo ocurren de forma aleatoria en el tiempo y
tenderán a desaparecer en el promediado.

Figura 12.6: Potenciales evocados. La imagen superior muestra la superposición de

30 respuestas a un mismo estímulo que se presentaba en el instante marcado por la
línea de puntos. La imagen de abajo muestra el promediado de las señales nombran-
do los distintos picos y valles (N signi�ica negativo, P positivo y el número indica la
latencia en ms desde la presentación del estímulo). Modi�icado de Journal of Neuro-
physiology, 1 October 2001 Vol. 86, 1983-1990.

292

Este tipo de análisis permite estudiar la res-
puesta del cerebro ante estímulos de variada
naturaleza. Así se usan estímulos simples como el
�lash o la palmada para estudiar el procesamiento
cerebral de señales sensoriales y detectar cegueras
o sorderas de origen central, es decir debidas a la
malfunción de un núcleo cerebral. Por el contrario
se pueden usar estímulos complejos como palabras
o frases unidos a tareas de discriminación o memo-
rización para estudiar el procesamiento cognitivo
de estímulos complejos.
12.3. Técnicas invasivas
Esta segunda parte se irá introduciendo progre-
sivamente en el estudio de fenómenos eléctricos
cada vez más simples, pasando del nivel de siste-
ma-órgano hasta el nivel molecular. Para realizar
estos registros se emplearán técnicas cada vez más
especí�icas y complejas que se irán describiendo ha-
ciendo hincapié en sus características principales,
su objeto de estudio, tipo de preparación más ade-
cuada y algunos ejemplos.
Una de las diferencias fundamentales con las
técnicas no invasivas es que el electrodo se tiene
que aproximar mucho o incluso introducir en las
células que se quieren estudiar. Para llevar a cabo
estas aproximaciones es necesario introducir el
o los electrodos a una profundidad variable den-
tro del tejido donde se va a registrar, para lo cual
es muy útil que tengan forma a�ilada y una punta
lo más reducida posible, causando así un menor
daño durante la penetración. Como en el caso an-
terior los electrodos van a estar constituidos de un
material conductor, bien siendo electrodos de mate-
rial conductor directamente (metálicos en general,
pero más recientemente también se están desa-
rrollando electrodos con nanotubos de carbono) o
bien capilares de vidrio moldeados a medida y re-
llenos de una solución salina conductora. En el caso
de los electrodos metálicos la ventaja fundamental
es su durabilidad frente a los de vidrio que son de
un solo uso. En contraposición, los capilares de vi-
drio permiten conseguir electrodos con diámetros
en la punta de hasta 0.1 µm, lo cual es fundamen-
tal a la hora de su aplicación para las técnicas de
registro intracelular, y son más económicos. Dado
que la fabricación de los electrodos es un punto cla-
ve para obtener unos registros adecuados, antes de
empezar a describir las técnicas invasivas se van a
comentar algunos detalles acerca de la fabricación
de electrodos con capilares de vidrio.
293
Técnicas electrofisiológicas
12.3.1. Fabricación de electrodos de vidrio
Para la fabricación de los electrodos de vidrio se ne-
cesitan: capilares de vidrio, estirador de electrodos
y una solución salina conductora para rellenarlos.
Los capilares de vidrio más utilizados son de
borosilicato debido a su menor coste. Los capila-
res disponibles comercialmente abarcan diferentes
diámetros tanto externos como internos, lo que
proporciona a su vez diferentes grosores de pared
que pueden utilizarse para los diferentes tipos de
registro. Otro elemento importante de los capilares
es la posibilidad de dotarlos de un �ilamento ado-
sado a la parte interna de la pared, para facilitar el
llenado del electrodo hasta la punta sin que aparez-
can burbujas de aire que impidan la conducción de
las señales eléctricas. La solución de relleno es una
solución salina para permitir la conducción de las
señales eléctricas registradas en la punta del elec-
trodo, aunque su composición especí�ica varía con
cada técnica.
El estirador de electrodos o puller es el apara-
to utilizado para la fabricación de los electrodos de
vidrio, y permite conseguir electrodos con puntas
�inas y reproducibles. Comercialmente existen va-
rios modelos con disposición horizontal o vertical
donde se �ija el capilar por sus dos extremos a unas
piezas móviles, dejando su porción central en torno
a un �ilamento metálico. Este �ilamento se calienta
de forma controlada por el paso de una corriente
eléctrica y es el encargado de fundir el capilar de
vidrio para permitir su moldeado. Controlando la
temperatura de fusión, la fuerza de estiramiento de
las piezas móviles y el enfriamiento por aire en los
equipos que disponen de esta posibilidad, junto con
los intervalos de tiempo entre calentamiento-estira-
miento-enfriamiento, e incluso el tipo de capilar, se
puede conseguir una punta idónea para su utiliza-
ción en cada una de las técnicas electro�isiológicas.
12.3.2. Elección del modelo experimental: pre-
paraciones in vivo e in vitro
Otro aspecto importante que conviene destacar en
este punto, dado que es de aplicación para el con-
junto de técnicas invasivas, tiene relación con el
tipo de preparación biológica donde se realiza-
rán los registros electro�isiológicos. Las técnicas
electro�isiológicas invasivas se pueden utilizar en
preparaciones in vivo o in vitro, dependiendo del
tipo de estudio que se quiera realizar.
Las preparaciones in vitro (en vidrio) son
aquellas en las que el ensayo se realiza fuera del
organismo, bien utilizando un cultivo celular o me-
Métodos en biociencias
diante el mantenimiento de un tejido, completo
o seccionado, extraído de un animal (ex vivo). En
cambio, en las preparaciones in vivo se trabaja con
el animal completo. Dentro de las preparaciones in
vivo se puede a su vez distinguir entre:
— Preparaciones agudas, en las que todo
el desarrollo experimental se realiza ne-
cesariamente con el sujeto experimental
anestesiado debido a la severidad del tipo
de procedimiento utilizado.
— Preparaciones con animal intacto, en las
que el sujeto experimental está despier-
to y consciente durante el experimento.
Estas preparaciones solo sirven para ha-
cer registros con técnicas no invasivas o
mínimamente invasivas como se vio más
arriba.
— Preparaciones crónicas, en las cuales pre-
vio al estudio experimental se realiza una
preparación del sujeto que requiere pro-
cedimientos de cierta severidad, por lo
que se utilizará anestesia, pero que du-
rante el ensayo utiliza procedimientos
leves que se realizan con el sujeto cons-
ciente y despierto.
A la hora de la selección del modelo más adecua-
do un aspecto fundamental que puede decantar la
elección hacia un tipo de preparación u otro se basa
en las propias condiciones de ensayo que se pue-
den obtener. Si el elemento de estudio se encuentra
dentro de un organismo vivo tiene la ventaja de
que el «mantenimiento de la homeostasia» se lleva
a cabo de una forma natural, aprovechando el lati-
do cardiaco para la perfusión y los pulmones para
conseguir el intercambio gaseoso, afectándose en
menor medida el ambiente y la estructura natural
del tejido y evitando en cierta medida procedimien-
tos quirúrgicos lesivos para el tejido. Sin embargo,
esto supone también un inconveniente a la hora de
aplicar fármacos o modi�icar las concentraciones
iónicas del medio. Los cambios de concentraciones
se verán tamponados y los fármacos se verán ex-
puestos a los sistemas de degradación y eliminación
del organismo (hepática, renal), siendo di�ícil cono-
cer la concentración alcanzada en el tejido diana,
así como el momento en el que el fármaco acceda o
se elimine del tejido de interés. En cambio, en una
preparación in vitro, se pueden modi�icar las condi-
ciones del medio y controlar la concentración y los
tiempos de aplicación de los fármacos de una mane-
ra precisa, sencilla y rápida.
En el caso de utilizar preparaciones agudas in
vivo que emplean técnicas invasivas será además
294
necesario el «uso de anestesia», lo que a su vez pue-
de interferir en las señales objeto de estudio puesto
que algunos anestésicos inter�ieren con los meca-
nismos responsables de las señales bioeléctricas.
La ventaja fundamental de las preparacio-
nes in vivo estriba en la posibilidad de estudiar las
«relaciones entre distintos órganos y sistemas», lo
que permitiría, por ejemplo, estudiar la respuesta
de una �ibra muscular frente a la activación de las
neuronas motoras espinales o las relaciones entre
distintas estructuras dentro del sistema nervioso
central.
También existen algunas di�icultades técnicas
a la hora de realizar los ensayos con preparaciones
in vivo. Como se explicará más adelante, para llevar
a cabo algunas de las técnicas invasivas es necesaria
una gran «estabilidad mecánica». Dentro de un ani-
mal vivo, el propio latido cardiaco y la respiración
generan inestabilidad que di�iculta el mantenimien-
to del registro. Además la facilidad de acceso con el
electrodo de registro y la posibilidad de visualizar
el elemento a estudiar son obviamente superiores
en una preparación mantenida in vitro que en un or-
ganismo completo.
Finalmente otro aspecto a considerar para la
elección de un modelo experimental u otro tiene
relación con los «aspectos éticos y legales», pues-
to que en la medida de lo posible se trata de tender
hacia modelos in vitro para reducir el sufrimiento y
malestar animal.
En cada caso el investigador debe decidir qué
aspectos son fundamentales para su estudio y cuá-
les son prescindibles a la hora de elegir un modelo
u otro, asumiendo los inconvenientes inherentes a
cada uno de ellos.
12.3.3. Registros extracelulares
Los registros extracelulares son aquellos en los cua-
les se registra la actividad eléctrica de una célula o
un grupo de células desde el medio externo, siendo
necesario que estas células sean excitables y pro-
duzcan señales eléctricas grandes que puedan ser
registradas como cambios en el campo eléctrico
en un área de un tejido («potenciales de campo»)
o como potenciales de acción extracelulares de una
«célula individual». Con esta técnica se va avanzan-
do en complejidad y adentrándonos en un nivel de
estudio menor que con las técnicas no invasivas,
abarcando desde el nivel de órgano-sistema al nivel
celular. Por ello, para estos registros se pueden uti-
lizar preparaciones in vivo agudas o crónicas donde
se dispone del organismo completo, pero también

Figura 12.7: Tipos de electrodos utilizados para re-
gistros extracelulares. Modi�icado de J. Neural Eng.
12(1):011001 2015.
in vitro utilizando preparaciones ex vivo, como una
rodaja de tejido nervioso. Hay que tener en cuen-
ta que al tratarse de técnicas invasivas se trabajará
fundamentalmente con animales y no con seres hu-
manos, salvo en situaciones excepcionales (por
ejemplo con tejido extraído de biopsias).
Los electrodos utilizados para los regis-
tros extracelulares son metálicos (por ejemplo
de tungsteno) o de vidrio (Figura 12.7). Indepen-
dientemente del tipo de electrodo a utilizar todos
los registros requieren la utilización de electrodos
de referencia que cierren el circuito eléctrico per-
mitiendo el registro de las diferencias de potencial
entre el electrodo de registro y el de referencia. En
las preparaciones in vivo el electrodo de referen-
cia se debe situar en contacto con algún tejido del
propio animal y cercano al lugar de registro. En
las preparaciones in vitro el electrodo de referen-
cia se introduce dentro del baño de órganos o placa
de cultivo. En el caso de elegir electrodos metáli-
cos pueden existir diferentes posibilidades (Figura
12.7), que van desde un único sensor en la punta
de una aguja a�ilada, hasta novedosas con�iguracio-
nes que incluyen un elevado número de sensores
acoplados entre sí con diseños muy versátiles, que
permiten registros múltiples simultáneos e incluso
implantarse para utilizarlos en animales despier-
tos (matrices de microelectrodos o microelectrode
arrays, MEAs). En cuanto a los electrodos de vidrio
se van a rellenar con soluciones salinas similares a
las que se encuentran en el medio externo de las cé-
lulas a estudiar (generalmente basados en cloruro
de sodio), para reducir en la medida de lo posible
los efectos de la difusión de su contenido. Además
es importante tener en cuenta que a medida que
disminuye el tamaño de la punta del electrodo la re-
sistencia eléctrica se incrementa; esto permite que
electrodos con puntas muy estrechas registren ac-
tividad solo de zonas próximas, mientras que los
295
Técnicas electrofisiológicas
electrodos gruesos (y por tanto de menor resisten-
cia) son capaces de registrar actividad de zonas más
extensas.
El equipamiento necesario para estos tipos de
registros incluye necesariamente un ampli�icador
puesto que las señales registradas son de poca am-
plitud (del orden de microvoltios o pocos milivoltios
generalmente) y un sistema de acondicionamiento
de la señal para conservar las señales de interés y
�iltrar el resto de señales eléctricas que son captu-
radas por el electrodo. En estos registros las señales
rápidas como los potenciales de acción se ven más
atenuados en el medio externo con la distancia, lo
que permite detectar solo los procedentes de las
células más próximas al electrodo, sin embargo se-
ñales más lentas como los potenciales sinápticos
se pueden detectar también desde distancias algo
más grandes. Así, en el caso de que se registren po-
tenciales de campo, en nuestra señal predominarán
eventos lentos de una población considerable de
células, con lo que se utilizan �iltros que permiten
conservar las frecuencias bajas (eventos lentos)
eliminando solo las frecuencias muy altas que no
se corresponden con la actividad biológica que se
pretende estudiar. Sin embargo, para registros de
célula aislada donde se registran potenciales de ac-
ción extracelulares de un número más limitado de
células, se pueden utilizar �iltros de banda en los
cuales se eliminan las frecuencias más bajas y tam-
bién las más elevadas, conservando las señales que
se corresponden con las frecuencias de los poten-
ciales de acción y reduciendo el resto.
Dependiendo del tipo de estudio y la prepara-
ción a utilizar también va a ser necesario en mayor
o menor medida una serie de elementos que con-
tribuyan a mantener la estabilidad mecánica del
electrodo en el lugar de registro, puesto que al in-
troducirlo en una región del tejido se van a obtener
registros de una zona concreta dentro de él, y cual-
quier movimiento puede desplazarlo hasta otra
zona diferente, comprometiendo la durabilidad del
estudio en el tiempo. Estos elementos pueden ser de
diversa naturaleza, desde el uso de cemento dental
para �ijar una matriz de microelectrodos al cráneo
de un animal despierto (preparación crónica), el
empleo de aparatos estereotáxicos para sujetar el
cráneo y los electrodos e impedir que se desplacen
en una preparación in vivo aguda, o como el uso de
un micromanipulador o una mesa antivibratoria en
el caso de registros utilizando una rodaja de cere-
bro in vitro.
Dada la gran variedad de estudios que se pue-
den llevar a cabo con registros extracelulares a
continuación se van a explicar únicamente algunos
Métodos en biociencias
ejemplos que cubran distintas posibilidades para
dotar al lector de una visión lo más completa posi-
ble de estas técnicas.
Registros de neuronas individuales en la corteza
de ratas en movimiento (in vivo)
Para este tipo de aproximación se utiliza una pre-
paración crónica implantando electrodos metálicos
en una región del encéfalo. Los electrodos que se
utilizan en este caso pueden ser MEAs con un nú-
mero elevado de sensores, que se �ijan al cráneo
por medio de cemento dental y pequeños torni-
llos (que a su vez pueden emplearse como tierra).
Una correcta �ijación de los electrodos que evite el
desplazamiento es fundamental para (1) evitar el
malestar y el sufrimiento del animal si el dispositi-
vo se mueve dentro del cráneo y (2) asegurar que el
registro de la actividad de las neuronas sea estable
mientras el animal se está moviendo (Figura 12.8a).
Dado que se trata de una preparación crónica toda
la manipulación y la colocación de los electrodos se
realiza con el animal anestesiado y posteriormen-
te, cuando el animal se recupera de la anestesia,
se puede registrar la actividad de esa población de
neuronas con el animal despierto y con libertad de
movimientos. Una vez que el implante está colocado
la presencia del investigador no es necesaria puesto
que la señal registrada puede enviarse por cable o
incluso por medios inalámbricos hacia el sistema de
registro, eliminando la posible in�luencia del inves-
tigador sobre el comportamiento del animal. Puesto
que el registro con electrodos múltiples permite es-
tudiar la actividad de muchos elementos de forma
simultánea, el sistema de registro en este caso va a
utilizar algoritmos que permiten el reconocimien-
to y la clasi�icación de la actividad de las distintas
neuronas que se están registrando, para tener una
Figura 12.8: Disposición del sistema de registro sobre
el cráneo de un ratón (A) y agrupamiento-clasi�icación
de los diferentes potenciales de acción de un registro
en base a algoritmos (B). Modi�icado de Nat Neurosci.
15(1):163-70 2011.
296
idea de la actividad individual de cada una de ellas
en las distintas situaciones experimentales. El aná-
lisis de estos estudios se basa en la cuanti�icación
del número y el patrón de disparo de las distintas
neuronas así como las relaciones temporales en-
tre la actividad de varias neuronas entre sí (Figura
12.8b).
Esta aproximación es similar a algunas de las
que utilizaron los galardonados con el nobel de �i-
siología y medicina el año 2014 (May-Britt Moser y
Edvard I. Moser) para estudiar las neuronas encar-
gadas del sistema de posicionamiento del cerebro.
Esta estrategia aprovecha una técnica invasiva, que
permite estudiar la actividad eléctrica de grupos de
neuronas en una región del cerebro, con una prepa-
ración que permite realizar el estudio en neuronas
que se encuentran en su ambiente y con unas co-
nexiones naturales, y además en un animal con
libertad de movimientos, algo imprescindible para
estudiar los cambios de actividad de estas neuronas
con los cambios de posición del animal consciente
en el espacio.
Registros de potenciales de campo en rodajas
de tejido nervioso (in vitro)
Para este tipo de aproximación se pueden utilizar
secciones de tejido de una gran variedad de regio-
nes del sistema nervioso, desde corteza cerebral
hasta médula espinal. La necesidad de realizar ro-
dajas de tejido viene dada por la imposibilidad de
conseguir una perfusión adecuada in vitro cuando
el tejido presenta un grosor excesivo. Mediante un
aparato especí�ico llamado vibratomo se consigue
secciones de tejido de diferente grosor por medio
de una cuchilla que va oscilando en el mismo plano
del corte (ver epígrafe 7.3).
Una vez que se dispone de la rodaja de tejido
esta se coloca en un baño de órganos o cámara de
registro adecuada, donde se �ijará para evitar el mo-
vimiento. Para optimizar las condiciones de registro
se pueden utilizar elementos que mejoren la esta-
bilidad mecánica (como mesas antivibración), así
como elementos para reducir la in�luencia del ruido
eléctrico (todos los equipos conectados a una buena
toma de tierra o una caja de Faraday).
Para esta técnica se suelen utilizar electrodos
de vidrio de baja resistencia rellenos de solución
salina (basada en NaCl por ejemplo), pero tam-
bién pueden usarse electrodos metálicos. Estos
electrodos, mediante micromanipuladores, se pue-
den situar en zonas especí�icas de la rodaja de
tejido, permitiendo el estudio de regiones o áreas

! vos), que permite una mayor estabilidad mecánica.
Figura 12.9: Ejemplo de un estudio de potenciación a largo plazo
en hipocampo utilizando potenciales de campo. El registro in-
crustado en la �igura muestra las señales antes y después de la
potenciación producida por la estimulación eléctrica a tiempo 0
min (barras de calibración 1 mV, 5 msec). Tomado de Learn. Mem.
16:69-81 2009.
concretas. La señal recogida por el electrodo será
ampli�icada y se aplicará un �iltrado para eliminar
las frecuencias más altas. De esta forma se pueden
estudiar las señales sinápticas más lentas proce-
dentes de una zona extensa del tejido.
La ventaja fundamental de esta técnica de re-
gistro es su relativa sencillez y su estabilidad. Dado
que las señales proceden de una población de
neuronas registradas desde exterior las células es-
tudiadas no sufren grandes daños y mantienen su
integridad. Este tipo de aproximación experimental
ha sido utilizada en numerosos estudios de poten-
ciación a largo plazo (LTP) de respuestas sinápticas,
los cuales requieren un registro estable duran-
te un periodo muy largo de tiempo, incluso varias
horas, para permitir que los cambios en las sinap-
sis tengan lugar (Figura 12.9). El análisis de estas
respuestas incluye medidas que pueden abarcar la
amplitud máxima, el área o la pendiente de la res-
puesta.
12.3.4. Registros intracelulares de fijación
de corriente
Los registros intracelulares se realizan con electro-
dos ultra�inos que permiten atravesar la membrana
plasmática, sin perder la integridad celular, y es-
tudiar la diferencia de potencial eléctrico entre el
electrodo de registro (dentro de la célula) y el de re-
ferencia (fuera de la célula), así como los cambios
en este potencial, desde pequeñas despolariza-
ciones e hiperpolarizaciones hasta potenciales de
acción. Además permiten la aplicación de corriente
297
Técnicas electrofisiológicas
a través del electrodo, por eso este modo de registro
se conoce como también como �ijación de corrien-
te (current-clamp). Esta técnica permite realizar
estudios a nivel celular, centrándose en las propie-
dades de la membrana y los canales presentes, pero
también a nivel de órgano y sistema, puesto que
se pueden estudiar los potenciales post-sinápti-
cos generados por la activación de otros elementos
conectados. El tipo de preparación más adecuada
sería una aproximación in vitro (rodajas o culti-
La obtención de registros intracelulares in vivo con
preparaciones agudas es más complicada debido a
los movimientos respiratorios y cardíacos.
Los electrodos más comúnmente utilizados
para los registros intracelulares son capilares de
vidrio estirados y rellenos de una solución salina
concentrada (en el rango Molar). Se utilizan electro-
dos que presentan un resistencia eléctrica elevada
(50-150 MΩ) indicativa de un diámetro de punta
muy reducido, aunque dependiendo del tipo celular
a estudiar pueden existir ligeras diferencias. Dado
que el líquido del interior del electrodo entra en
contacto con el líquido intracelular y puede existir
una ligera difusión, para rellenar el electrodo se uti-
lizan sobre todo sales de potasio (cloruro de potasio
o acetato de potasio), puesto que el potasio es el ión
fundamental del líquido intracelular.
Como en los casos anteriores, el equipamiento
necesario para este tipo de registros incluye un am-
pli�icador y un sistema de acondicionamiento de la
señal. Dado que las señales son grandes (del orden
de milivoltios) y se consigue una muy buena rela-
ción señal ruido, la ampli�icación que se utiliza no
necesita ser muy potente y simplemente se utiliza
un �iltrado para atenuar las altas frecuencias. Sin
embargo es muy importante que el ampli�icador sea
capaz no solo de recibir la señal eléctrica proceden-
te de la célula, sino también de aplicar corriente a
través del electrodo, lo que permite modi�icar tran-
sitoriamente el potencial de la célula posibilitando
el estudio de sus propiedades eléctricas. Como en
el resto de técnicas es importante reducir al máxi-
mo el ruido eléctrico, por lo que el uso de cajas de
Faraday y buenas conexiones de tierra es de gran
utilidad. En este caso, dado que la célula va a estar
empalada por el electrodo, es fundamental con-
seguir unas condiciones de estabilidad mecánica
excelentes, evitando cualquier movimiento o vibra-
ción que pueda comprometer el registro. El empleo
de micromanipuladores de precisión o estereotáxi-
cos para controlar el movimiento del electrodo, así
Métodos en biociencias

Figura 12.10: (A) la aplicación de un pulso de corriente a través del electrodo permite obtener información sobre el
avance del electrodo y la proximidad a las células. Este procedimiento se basa en la Ley de Ohm (a), si la magnitud del
pulso es constante (50 pA; c) la resistencia será directamente proporcional al voltaje registrado (b). A medida que el
electrodo se aproxima a la membrana de la célula (d) el voltaje se incrementa re�lejando un aumento de la resistencia.
(B) cuando el electrodo esta sobre la membrana la oscilación de este por la aplicación de una breve corriente (asterisco)
favorece la penetración, registrándose inmediatamente una diferencia de potencial, así como el disparo de potenciales
de acción (líneas verticales). Registros obtenidos por los autores.

como una mesa anti-vibración son fundamentales
para conseguir registros estables en el tiempo.
Obtención del registro
En el caso de que se trabaje con células aisladas
en cultivo o incluso en rodajas de tejido se sue-
len utilizar microscopios invertidos para facilitar
la obtención del registro. Esto permite seleccionar
la célula que se quiere estudiar y buscar aquellas
que tengan un aspecto más saludable. Aunque en
este caso la aproximación inicial se realiza median-
te control visual, a la hora de la penetración es útil
la aplicación de un pulso de corriente a través del
electrodo para saber el momento justo en el que se
contacta con la célula. En el caso de trabajar a cierta
profundidad en el tejido, no es posible ese contacto
visual a través el microscopio y se tiene que utili-
zar desde el primer momento un pulso de corriente
para ir controlando el avance del electrodo a me-
dida que este penetra en el tejido. El proceso de
obtención del registro guiado por el pulso de co-
rriente se muestra en la �igura 12.10a.
Parámetros de estudio
Cuando se consigue empalar una célula sin romper-
la, lo primero que se observa es un cambio súbito
en el potencial registrado (Figura 12.10b). Este va-
lor de voltaje constituye la diferencia de potencial
entre ambos lados de la membrana o «potencial de
membrana» (Vm). El potencial de membrana de una
célula puede ser un parámetro de estudio muy in-
teresante puesto que puede verse alterado en las
diferentes situaciones �isiológicas y patológicas que
experimentan las células.
Con el electrodo dentro de la célula y la re-
sistencia del electrodo compensada se puede
calcular la «resistencia eléctrica» de la membrana
celular aplicando corriente a través del electrodo
(Figura 12.11). Al aplicar un pulso de corriente de
intensidad conocida se registrará un cambio en el
voltaje proporcional a la resistencia eléctrica de la
membrana de la célula. Esta resistencia viene de-
terminada por la cantidad de canales pasivos que
tenga la célula (aquellos que se mantienen abiertos
independientemente de la diferencia de potencial).
Un mayor número de canales abiertos se corres-
ponde con una resistencia eléctrica menor (dado
que permite el �lujo de corriente) mientras que un
número menor de canales abiertos nos daría una
resistencia mayor (porque la corriente encontraría
más resistencia para atravesar la membrana). Este
parámetro se puede utilizar para obtener una indi-
cación del tamaño de la célula dado que la densidad
de canales pasivos dentro de un tipo celular concre-
to (por ejemplo neuronas) es similar. Por tanto una
célula con más resistencia tendría menos canales de
este tipo y por tanto una super�icie de membrana
menor.
Pero además, la aplicación de pulsos de co-
rriente puede ser útil en las células excitables
porque va a permitir que se pueda despolarizar la
célula lo su�iciente para que se supere el umbral
de disparo y conseguir el disparo de potenciales
de acción (Figura 12.11). Así se podrán estudiar
las «características del potencial de acción» en es-
tas células: tiempo de subida y bajada, amplitud,
duración y la presencia de despolarizaciones e hi-
perpolarizaciones después del potencial de acción.
También se pueden estudiar posibles cambios en
los potenciales de acción a consecuencia de la apli-

298

  el receptor implicado en esas sinapsis. Además en
Figura 12.11: Registro de la respuesta producida por
una neurona del asta dorsal espinal de ratón frente a la
aplicación de pulsos de corriente positiva y negativa de
magnitud controlada (parte inferior). Registro obteni-
do por los autores.
cación de fármacos moduladores de canales de
sodio o potasio entre otros. Cuando se estudian
neuronas también se puede estudiar lo que se co-
noce como «patrones de disparo». Si se despolariza
una neurona con una intensidad su�iciente duran-
te el tiempo necesario se puede provocar el disparo
repetitivo de potenciales de acción, este patrón de
disparo repetitivo dependerá de la variedad de ca-
nales que expresa esa neurona, y puede ir desde un
disparo fásico (con mucha adaptación en el disparo)
hasta disparos tónicos (continuos) con diferentes
frecuencias. Además es posible inferir la presencia
de determinadas corrientes particulares que oca-
sionan patrones de disparo peculiares (retrasado,
ráfagas, etc.) (Figura 12.12). La presencia de un pa-
trón de disparo u otro puede ayudar a entender la
función de una neurona concreta dentro de un cir-
cuito y como integra información, también se utiliza
como criterio de clasi�icación. De nuevo estos patro-
nes pueden verse modi�icados por la aplicación de
diferentes agentes farmacológicos.
En el caso de estudiar neuronas dentro de un
tejido, existe la posibilidad de registrar las «res-
puestas sinápticas» originadas por la activación de
neuronas pre-sinápticas. En este caso resulta útil la
Figura 12.12: Ejemplo de diferentes patrones de disparo obtenidos en neuronas super�iciales del asta dorsal de ra-
tón en respuesta a despolarización por aplicación de corriente intracelular. Registros obtenidos por los autores.
299
Técnicas electrofisiológicas
presencia en la preparación de algún haz o vía de
entrada de información (in vitro) o se puede utilizar
por ejemplo la activación natural de vías aferen-
tes (preparación aguda in vivo fundamentalmente).
Las respuestas sinápticas pueden ser bien despo-
larizantes o excitadoras (potenciales excitadores
post-sinápticos, PEPs) o bien hiperpolarizantes o
inhibitorias (potenciales inhibidores post-sináp-
ticos, PIPs) dependiendo del neurotransmisor y
el caso de señales excitadoras se puede originar
también el disparo de potenciales de acción. Estas
respuestas de pueden cuanti�icar como área de des-
polarización o amplitud de la respuesta, además de
poder considerar las posibles respuestas en forma
de potenciales de acción.
Como se ha podido comprobar, la cantidad de
información que es posible obtener por medio de
los registros intracelulares es mucho mayor que la
obtenida con registros extracelulares. Sin embar-
go la complejidad técnica a la hora de conseguir los
registros y la menor duración de los mismos hacen
desaconsejable su uso para determinados estudios.
12.3.5. Registros de fijación de voltaje
Otro conjunto de técnicas electro�isiológicas a nivel
celular se basan en el estudio de las corrientes ió-
nicas producidas por una célula o un canal aislado.
En esta técnica se controla el voltaje y se estudia el
�lujo de corriente producido por la célula o canal.
Para esto es necesario un equipo de registro que
disponga de un sistema de retroalimentación que
permita monitorizar el voltaje y aplicar la corriente
necesaria para mantenerlo �ijo en un valor deter-
minado. Esta cantidad de corriente que tiene que
aplicar el electrodo es exactamente la opuesta a la
que desarrolla la célula a ese voltaje, por tanto la co-
rriente que se aplica por el electrodo es la corriente
que genera la célula, pero con el signo opuesto.
Por ejemplo, cuando el voltaje de una neurona se
�ija desde un valor cercano al reposo hasta un va-
Métodos en biociencias
lor de voltaje que supere el umbral de activación de
los canales de sodio (por ejemplo -40 mV), estos se
abren y se genera una corriente de entrada que tra-
taría de despolarizar aún más la neurona (incluso
hasta valores positivos), para mantener �ijo el vol-
taje el ampli�icador debe aplicar una corriente de
la misma magnitud pero de signo opuesto que anu-
le el efecto de la corriente de sodio sobre el voltaje.
Por tanto la corriente que aplica el ampli�icador es,
en este caso, la variable de estudio que indica la co-
rriente generada por la célula. Por convenio, una
corriente producida por un ion positivo que entra
en la célula tiene un signo negativo (si sale de la cé-
lula positivo, y si el ion tiene carga negativa es justo
al revés).
En un primer momento la �ijación de voltaje
requería necesariamente la presencia de dos elec-
trodos, uno para medir el voltaje y otro para aplicar
la corriente. Esta disposición se conoce como �ija-
ción de voltaje con dos electrodos (two electrode
voltage-clamp). Esta técnica fue utilizada por Ho-
dking y Huxley para desentrañar la naturaleza del
potencial de acción (descubrimiento por el que
fueron galardonados con el premio Nobel de me-
dicina y �isiología en el año 1963). Estos cientí�icos
utilizaron el axón gigante de calamar para sus estu-
dios dado que necesitaban utilizar electrodos muy
grandes que no era posible insertar en otro tipo de
preparaciones. El desarrollo posterior ha permitido
que esta técnica se pueda llevar a cabo con dos elec-
trodos de vidrio, similares a los intracelulares que
se comentaron anteriormente, lo que posibilita su
utilización en algunos tipos celulares en cultivo. Sin
embargo la mayoría de las células de mamífero no
es posible empalarlas con dos electrodos a la vez,
por lo que la técnica de dos electrodos, se utiliza
solo en células muy grandes (por ejemplo en ooci-
tos de an�ibio).
Posteriormente se desarrolló un sistema que
permitía realizar estos estudios con un solo elec-
trodo que realizaba las dos funciones de una forma
alternante (�ijación de voltaje discontinua o dis-
continuous voltage-clamp) y unos años después se
implementó el uso de electrodos de baja resistencia
que permiten fusionar el electrodo y la membra-
na, permitiendo registrar incluso la corriente iónica
generada por un único canal (en 1991 Neher y Sak-
mann fueron galardonados con el premio Nobel por
estos estudios).
La utilización de electrodos de baja resisten-
cia, habitualmente entre 1 y 10 MΩ, supone un gran
avance en los estudios de �ijación de voltaje ya que
permite realizarlos en células pequeñas y solo con
un electrodo, consiguiendo además una relación se-
300
ñal-ruido excelente. Para entrar en contacto con el
interior celular se tiene que conseguir en primer
lugar que la membrana de la célula se fusione con
la punta de la micropipeta, proceso que se ve favo-
recido por la aplicación de una pequeña succión a
través del electrodo. De esta forma se consigue la
formación de un sello de muy alta resistencia eléc-
trica (gigasello), que será lo que permita el registro
electro�isiológico reduciendo el ruido eléctrico de
fondo. Después se puede conseguir el acceso com-
pleto al interior celular (para estudiar las señales
producidas por todos los canales de la célula) o bien
trabajar con un pequeño fragmento de la membra-
na (para estudiar las señales producidas solo por
los presentes en ese fragmento). Además, como se
tiene acceso al interior celular, se pueden realizar
también registros de �ijación de corriente como en
los registros intracelulares. Con la ventaja de que
gracias a estos electrodos se pueden realizar estos
estudios en células de pequeño tamaño, consiguien-
do además una mejor relación señal-ruido y mayor
capacidad de aplicar corriente. Esta técnica permi-
te gran variedad de aplicaciones, por lo que abarca
estudios desde un nivel de sistema a estudios a ni-
vel de molécula (canal). El tipo de preparación más
adecuada, para poder conseguir la máxima reso-
lución que permite esta técnica, serían los cultivos
celulares donde las membranas de las células se en-
cuentran más accesibles, sin embargo se pueden
obtener buenos registros utilizando preparaciones
ex vivo y en menor medida preparaciones in vivo.
Como en las técnicas anteriores es fundamental la
estabilidad mecánica y el aislamiento eléctrico para
conseguir buenos registros, por lo que se utilizan
micromanipuladores, mesas antivibración y cajas
de Faraday.
Estos electrodos presentan un diámetro de
punta relativamente grande, eso hace que el líquido
de relleno de la micropipeta difunda al interior celu-
lar modi�icando el �luido interno, por lo que algunos
procesos celulares pueden verse alterados. Esta es
la razón por la que el relleno de las micropipetas se
realiza con un líquido con una composición lo más
semejante posible a la que se espera encontrar en
el interior celular. Aunque existe una grandísima
variedad de líquidos de relleno, en general suelen
presentar una elevada concentración de potasio,
moléculas energéticas como ATP y GTP, algún que-
lante de calcio y algún tampón como Hepes.
 Técnicas electrofisiológicas

 
Figura 12.13: (A) El acercamiento progresivo de la punta de la micropipeta a la mem-
brana de una célula (a) provoca que la corriente necesaria para modi�icar el voltaje -1
mV (c) se reduzca progresivamente (b) re�lejando un incremento de la resistencia eléc-
trica (R= V/I). (B) cuando la micropipeta se encuentra sobre la membrana celular la
aplicación de una ligera succión favorece la formación del gigasello (nótese la ín�ima co-
rriente necesaria para modi�icar el voltaje -10 mV, izquierda). Una posterior succión más
explosiva genera la rotura de ese fragmento de membrana y el acceso al interior de la cé-
lula modi�icándose la lectura de corriente (derecha, registro de célula completa que se
explicará más adelante). Registros obtenidos por los autores.

Obtención del gigasello y configuraciones
del patch-clamp
A la hora de conseguir un registro con micropipetas
es importante identi�icar el momento en el cual la
punta se sitúa sobre la membrana de la célula para
evitar empujarla en exceso, pero debiendo estar lo
su�icientemente cerca para poder obtener el giga-
sello mediante la aplicación de una ligera succión
a través de la micropipeta. El proceso de obtención
del gigasello se muestra en la �igura 12.13.
Cuando se consigue el gigasello (valores de
resistencia superiores a 1-2 GΩ) se puede optar
por diversas con�iguraciones de patch-clamp de-
pendiendo del tipo de estudio que se quiera llevar
a cabo. Si se mantiene esta disposición se pueden
realizar registros de los canales que se disponen en
esta porción de la membrana, esta con�iguración se
denomina «cell-attached». Esta disposición presen-
ta la ventaja de que no se altera el funcionamiento
de la célula ni su composición interior, pero no per-
mite un control de las condiciones de ensayo tan
amplio como el resto de las con�iguraciones (Figu-
ra 12.14).
Si desde la situación anterior se consigue tener
acceso al interior de la célula, rompiendo o perfo-
rando el fragmento de membrana donde se sitúa la
luz de la micropipeta, se estaría en la con�iguración

 
Figura 12.14: Con�iguraciones del patch-clamp y procedimiento para obtener cada tipo de regis-
tro, ver descripción detallada en el texto. La línea negra representa la cara externa de la membrana
y la gris la interna. Imagen basada en la descripción original publicada en P�lügers Arch 391:85-
100 1981.

301
Métodos en biociencias
de «célula completa» (whole cell recording), que
permite el estudio de las señales producidas por la
totalidad de canales presentes en la célula (Figu-
ra 12.14). El acceso al interior se puede conseguir
mediante la aplicación de una corriente intensa
o con una succión breve puesto que en ambos ca-
sos se puede romper la región de membrana que se
encuentra en la luz de la micropipeta. Otra posibili-
dad para ganar acceso eléctrico al interior celular se
basa en añadir al líquido intracelular de relleno de
la pipeta antibióticos (como nistatina, gramicidina
o anfotericina-B) que forman poros en la membra-
na permitiendo el registro, en este caso se estaría
hablando de patch perforado. La diferencia funda-
mental entre utilizar la rotura de la membrana o
su perforación con antibiótico estriba en la capaci-
dad de difusión de sustancias entre el electrodo y
el interior celular, alterando en mayor o menor me-
dida el medio intracelular. La utilización de poros
en la membrana permite el contacto eléctrico con
una reducida capacidad de difusión y dilución de los
componentes internos, preservando mejor el medio
interno de la célula, lo que resulta fundamental para
el estudio de canales que requieren la presencia de
moléculas intracelulares para funcionar correc-
tamente. Las posibilidades de la con�iguración de
célula completa se explicarán detalladamente más
adelante.
Para el estudio de un «canal aislado» en un
fragmento de membrana existen dos posibilidades.
En la primera de ellas, partiendo de la situación de
célula completa, se puede retroceder la micropipeta
arrastrando la membrana pegada a él, si la tensión
es su�iciente se puede conseguir que la membrana
colapse, consiguiendo que se cierre sobre el electro-
do formando un pequeño parche de membrana que
mantendrá su cara interna hacia la luz de la micro-
pipeta y la externa hacia el exterior (con�iguración
outside-out, Figura 12.14). En esta con�iguración se
puede obtener un registro de la actividad de uno o
unos pocos canales que se sitúan en este fragmen-
to de membrana. Mediante la �ijación del voltaje se
puede modi�icar la diferencia de potencial a ambos
lados de la membrana consiguiendo estudiar el fun-
cionamiento de canales dependientes de voltaje,
también se pueden aplicar ligandos del canal en el
caso de canales dependientes de ligando o se puede
exponer la cara extracelular del canal a diversos fár-
macos para alterar su funcionamiento.
En la otra posibilidad, partiendo desde la po-
sición de gigasello, pero sin romper el parche de
membrana, se retrocede el electrodo produciendo
que la membrana se estire y colapse, si este estira-
miento se produce en un medio con bajo calcio la
membrana no es capaz de fusionarse por lo que el
302
fragmento de membrana dentro de la luz de la mi-
cropipeta se mantiene y el resto es eliminado, pero
en este caso la cara externa de la membrana queda
hacia la luz del electrodo y la interna hacia el ex-
terior (con�iguración inside-out, Figura 12.14). Si
el retroceso del electrodo se realiza en un medio
con calcio también se puede alcanzar esta con�igu-
ración, pero en este caso se consigue arrancar una
porción de la célula con citoplasma y rodeada com-
pletamente por membrana. Con la exposición al
aire se consigue que la parte de membrana que no
está en la luz de la micropipeta se degrade alcan-
zando una situación similar que en el caso anterior.
En esta con�iguración hay que tener en cuenta que
la parte interna de la membrana queda expuesta al
�luido del baño por lo que este debe ser un líquido
que contenga los componentes del líquido intra-
celular, del mismo modo el líquido de relleno de la
pipeta debe ser un líquido extracelular. En este caso
la ventaja fundamental estriba en poder estudiar
un canal iónico exponiendo su porción intracelular
a diversas moléculas o segundos mensajeros que
puedan regular su funcionamiento.
Registro de célula completa y aislamiento
de corrientes macroscópicas
Con esta técnica se obtiene un registro intra-
celular con una baja resistencia eléctrica de acceso
que permite conseguir un control sobre el voltaje de
la célula �ijándolo a los valores deseados y estudiar
las corrientes que genera la célula a esos volta-
jes. Para estos estudios el tipo de preparación más
adecuada sería un cultivo celular donde las células
presenten un aspecto esférico y no tengan prolon-
gaciones, con esta disposición la �ijación de voltaje
es completa en todas las regiones de la célula. En
el caso de utilizar preparaciones ex vivo las células
pueden presentar geometrías complejas y por tan-
to cabe la posibilidad de que algunas regiones de la
célula donde pueden encontrarse canales de interés
no se puedan �ijar al voltaje deseado, lo que puede
confundir la interpretación de los resultados.
Esta técnica puede utilizarse para estudiar co-
rrientes producidas por canales dependientes de
voltaje, como por ejemplo los canales de sodio que
producen el potencial de acción, o de ligando, como
los receptores inotrópicos de glutamato presentes
en la mayor parte de las sinapsis excitadoras en el
sistema nervioso central. Hay que tener en cuenta
que como se está registrando la corriente produci-
da por la totalidad de canales de la célula, va a ser
necesario aislar el tipo de corriente que se quie-
re estudiar para evitar la in�luencia del resto. En
el caso de estudiar corrientes dependientes de li-
gando, el aislamiento es más sencillo puesto que se
 Técnicas electrofisiológicas

adecuado de una corriente dependiente de voltaje

  Si la corriente de estudio presenta un patrón
Figura 12.15: Registro de la corriente activada por
hiperpolarización (Ih) utilizando un protocolo de
pulsos de voltaje entre -50 y -130 mV, un rango don-
de esta corriente se activa de forma aislada del resto
facilitando su estudio. La magnitud de esta corrien-
te se mide como la diferencia de corriente al inicio y
�inal de cada pulso, nótese como se incrementa con
los pulsos mayores. Registro original obtenido de una
neurona del asta dorsal espinal de ratón. Modi�icado
de Neuropharmacology 70: 148-155 2013.
puede controlar cuando se activa la corriente me-
diante el control de la aplicación del ligando. Aun
así, dependiendo del tipo de estudio, puede ser ne-
cesaria la aplicación de fármacos que bloqueen
otras corrientes que puedan interferir y también el
uso de protocolos de voltaje que permitan estudiar
la corriente a diferentes voltajes, para caracterizar
el funcionamiento del canal.
En el caso de estudiar corrientes dependientes
de voltaje lo habitual es que la corriente de interés
resulte activada a voltajes donde otras corrientes
también se activan, con lo cual el aislamiento ad-
quiere una importancia capital. Para el aislamiento
es útil conocer su funcionamiento para diseñar un
«protocolo de voltaje» que permita que la corrien-
te de interés se mani�ieste y reducir en la medida
de lo posible la in�luencia de otras. Por ejemplo, si
la corriente de estudio se activa a voltajes más ne-
gativos del reposo, se podrá trabajar en un rango de
voltajes donde habrá pocas corrientes activas, sim-
pli�icando su aislamiento (Figura 12.15).
de activación sostenido, es decir, si no se inactiva
con el tiempo, se pueden utilizar pulsos de volta-
je más duraderos para poder medir la corriente de
interés cuando el resto de corrientes transitorias
se hayan inactivado (Figura 12.16a). Además de
la utilización de un protocolo de pulsos de volta-
je adecuado también suele ser necesario el uso de
«estrategias farmacológicas» que permitan el aisla-
miento de la corriente de interés (Figura 12.16a).
La sustitución iónica puede utilizarse para elimi-
nar las corrientes producidas por un ion concreto,
por ejemplo la eliminación del calcio intra y ex-
tracelular abole las corrientes de calcio, pero esta
estrategia hay que realizarla con cuidado para
evitar modi�icar la osmolaridad o afectar a los me-
canismos �isiológicos dependientes del ion que se
sustituya. La estrategia más habitual es utilizar blo-
queantes de las corrientes que puedan interferir en
los registros, aplicándolos en el líquido extracelular.
Por ejemplo se utiliza tetrodotoxina para bloquear
corrientes de sodio, iones cadmio o cobalto para
bloquear corrientes de calcio y tetraetilamonio o
4-aminopiridina para bloquear corrientes de pota-
sio. En algunos casos el bloqueante actúa sobre la

 
Figura 12.16: (A) Registro de corrientes de potasio transitorias y sostenidas utilizando un protocolo de pulsos de voltaje entre -80 y +50
mV (a) para activar ambos tipos de corriente, un prepulso hasta -10 mV consigue activar las corrientes transitorias y que se inactiven per-
mitiendo medir de forma aislada las corrientes sostenidas (b), �inalmente la corriente transitoria se aísla como la diferencia de las otras
dos señales al inicio del pulso (c). El aislamiento de estas corrientes requiere el bloqueo de las corrientes de calcio y de sodio utilizando
iones cadmio y tetrodotoxina, respectivamente. La grá�ica en (B) muestra una curva construida con los valores de corriente transitoria,
normalizados frente al máximo, respecto al pulso de voltaje utilizado, esta curva arroja un valor de V50 (voltaje al cual se consigue la mitad
de la corriente máxima) de aproximadamente -20 mV. Registro original obtenido de una neurona del asta dorsal espinal de ratón. Modi-
�icado de J Neurosci. 30(15):5376-83 2010.

303
Métodos en biociencias

porción intracelular del canal y se debe incorporar
en el líquido intracelular de relleno de la micropi-
peta, por ejemplo los iones cesio bloquean canales
de potasio si se introducen en la célula, pero no si se
añaden al �luido extracelular.
Una vez que la corriente de interés está ade-
cuadamente aislada se pueden analizar toda una
serie de parámetros que caracterizan el funciona-
miento de los canales responsables. La intensidad
de corriente para determinado voltaje se puede uti-
lizar directamente como valor de referencia o mejor
utilizar como un valor relativo al tamaño de cada
célula utilizando la densidad de corriente (intensi-
dad –pA– dividido por capacidad de la célula –pF–),
puesto que un mayor número de canales va a de-
terminar una cantidad de corriente superior. Para
las corrientes dependientes de voltaje, dentro de los
parámetros más comunes se encuentra el voltaje de
activación o, lo que es lo mismo, a qué voltaje se co-
mienzan a abrir los canales responsables. Además
se pueden estudiar otros parámetros relacionados
con la dependencia de voltaje de los canales, repre-
sentando la corriente obtenida a diferentes voltajes
se pueden construir curvas donde obtener el valor
al cual se activa el 50% de la corriente (V50) que es
un parámetro muy utilizado (Figura12.16b).
El análisis de las características cinéticas
de la corriente también puede proporcionar un
buen número de valores útiles para caracterizar el
funcionamiento de los canales responsables. De-
pendiendo del tipo de corriente se pueden estudiar
las constantes de tiempo de activación, inactiva-
ción o desactivación, para obtener datos acerca de
la velocidad de apertura de los canales o el tiempo
que tardan en inactivarse o desactivarse. Incluso se
puede estudiar la relación de estas constantes de
tiempo con el voltaje al que se analizan, dado que la
cinética de algunos canales es también dependien-
te del voltaje. Si los canales de estudio presentan
inactivación, es decir, solo se mantienen activos
transitoriamente, también se puede caracterizar la
dependencia de voltaje de esa inactivación constru-
yendo curvas de corriente-voltaje.
En el caso de estar registrando una neurona
situada dentro de un tejido también se pueden re-
gistrar las corrientes sinápticas. Si se dispone de
una vía o tracto que aporte una entrada de infor-
mación sináptica a la neurona de estudio se puede
estimular esa vía desencadenando la respuesta si-
náptica. Mediante un protocolo de voltaje adecuado
y herramientas farmacológicas se pueden estudiar
las respuestas producidas por neurotransmiso-
res excitadores o inhibidores por separado (dado
que ambos pueden con�luir en la misma neurona
en diferentes sinapsis). Por ejemplo, las corrien-
tes mediadas por el neurotransmisor glutamato se
pueden aislar de la respuesta generada por neuro-
transmisores inhibidores realizando los registros al
potencial de equilibrio para iones cloro, dado que
los principales neurotransmisores inhibidores pre-
sentan receptores ionotrópicos permeables para el
cloro, pero también se pueden utilizar bloqueantes
para estos receptores. En el caso de no disponer de
una vía de entrada de información sináptica que se
pueda activar, también se pueden estudiar las co-
rrientes sinápticas espontaneas que se producen
por la activación y el disparo de potenciales de ac-
ción en elementos presinápticos al que se estudia
(Figura 12.17a) . Así se analizan el número y la am-
plitud de los eventos producidos para obtener una
idea acerca del funcionamiento del circuito en el
que se encuentra el elemento de estudio.

 
Figura 12.17: Registros originales de neuronas espinales de ratón mos-
trando corrientes espontaneas excitadoras (A) y corrientes excitadoras en
miniatura después de la aplicación de tetrodotoxina (B). Los registros se
realizaron a -70 mV para minimizar la contribución de las corrientes inhi-
bidoras. Calibración 20 pA y 100 ms. Registros obtenidos por los autores.

304
 Técnicas electrofisiológicas

Figura 12.18: Registro de la actividad de un receptor ionotrópico de GABA tipo A (dependiente

de ligando) registrado en la con�iguración outside-out (A), esta con�iguración permite apli-
car el ligando (neurotransmisor GABA, �lecha en Ba) en la porción externa de la membrana y
registrar la corriente producida por la apertura del canal. La ampliación en (b) muestra la co-
rriente registrada cuando el canal está cerrado (nivel de la línea continua superior) y cuando
se encuentra abierto (línea punteada inferior). Registro tomado de J Neurophysiol. 86:2312-
2322 2001.

Otra alternativa en línea con esta última apro-
ximación seria el estudio de corrientes sinápticas
en miniatura, que se consiguen cuando se abolen
los potenciales de acción utilizando tetrodotoxina.
En esta situación se produce la liberación estocás-
tica de vesículas sinápticas en algunos contactos
sinápticos, de tal forma que se consigue registrar
la corriente generada por la liberación de una úni-
ca vesícula de forma aislada en un único contacto
sináptico (Figura 12.17b). Así se puede estudiar
tanto la maquinaria presináptica de liberación de
vesículas como el funcionamiento de los receptores
post-sinápticos.
Registro de canal único
Como se mencionó anteriormente, tras la obten-
ción del gigasello se puede aislar un fragmento de
membrana para realizar un registro de la corriente
generada por uno o unos pocos canales presentes
en ese fragmento. Tanto la con�iguración inside-out
como outside-out permiten estudiar estas corrien-
tes, pero en cada una de ellas se consigue una
diferente disposición y accesibilidad de las porcio-
nes intra- y extracelular de la membrana, debido
a esto una con�iguración puede resultar más con-
veniente que otra dependiendo del estudio que se
quiera realizar. Estos estudios son más fáciles de
realizar en cultivos celulares porque requieren de
un sellado excelente entre la membrana y el elec-
trodo para conseguir que el ruido se reduzca al
mínimo y se puedan registrar las corrientes de pe-
queña magnitud (del orden de pA) generadas por
un único canal.
A la hora de estudiar un canal iónico es impor-
tante diferenciar si se trata de un canal dependiente
de ligando o de voltaje. En el caso de ser dependien-
te de voltaje en ambas con�iguraciones es posible
controlar la diferencia de potencial entre ambos
lados de la membrana y es posible �ijarla al valor
deseado para controlar el funcionamiento del ca-
nal. Sin embargo, en el caso de tratarse de un canal
dependiente de ligando, es importante diferenciar
si se trata de un ligando intracelular o extracelular,
porque de ello puede depender la elección de una
con�iguración u otra.
En el caso de tratarse de un ligando extra-
celular, como por ejemplo un neurotransmisor
u hormona, el empleo de la con�iguración outsi-
de-out es en principio más adecuada porque facilita
la aplicación del ligando a la porción externa de la
membrana y por tanto del canal (Figura 12.18A). En
esta con�iguración la parte interna de la membrana
quedaría hacia el interior de la pipeta conteniendo
líquido intracelular, el recambio o adición de com-
puestos al interior de la pipeta es harto complicado
mientras se está registrando, pero el líquido exter-
no se recambia adecuadamente porque está en el
baño, con lo cual esta con�iguración facilita el pro-
ceso de aplicación del ligando en la cara externa de
la membrana, mientras que lo di�icultaría para ha-
cerlo en sobre la cara interna.
Si se pretende estudiar la modulación de un
canal por ligandos intracelulares, como por ejemplo
calcio o ATP, el �luido que se debería poder modi�i-
car de una forma precisa sería el líquido intracelular,
en el cual se podría controlar la concentración del
ligando. En este caso la con�iguración inside-out per-
mite disponer de la porción interna de la membrana
(y del canal) expuesta hacia fuera del electrodo en
contacto con un líquido con una composición seme-
jante al �luido intracelular, mientras que la porción
externa de la membrana quedaría hacia la luz del

305
Métodos en biociencias
electrodo en contacto con �luido extracelular. De
esta forma se favorece la manipulación del líquido
intracelular lo que permite la realización del ensa-
yo adecuadamente.
Una vez que se consiga obtener un fragmento
de membrana con un canal el siguiente paso será
comprobar si el canal del que se está registrando
se corresponde con el que se quiere estudiar. Para
esto es importante conocer las características del
canal y poder diferenciarlo de otros canales. Si se
trata de un canal dependiente de ligando se puede
utilizar este ligando para comprobar si el canal se
abre en su presencia. En canales dependientes de
voltaje se puede utilizar un protocolo que permi-
ta su caracterización, comprobando si se trata del
canal adecuado. También se puede realizar la iden-
ti�icación estudiando otras características propias
del canal como su conductancia unitaria (capacidad
de �lujo de iones), selectividad iónica o sensibilidad
a diferentes bloqueantes o activadores. En la prácti-
ca suele ser útil realizar varias de estas maniobras
para asegurar la identidad del canal.
Los registros de canal único permiten un
estudio detallado de las características y el funcio-
namiento de un canal iónico. Puesto que se trata de
un único canal se puede medir la corriente que se
genera cuando este se abre y permite el movimien-
to de iones (Figura 12.18b).
Como la magnitud de la corriente a un poten-
cial dado dependerá del potencial de equilibrio para
el ion que �luya por el canal, esta medida se suele
transformar a un valor de «conductancia unitaria»
para obtener una idea de la capacidad que tiene
ese canal para permitir el �lujo de iones. Este va-
lor depende del tamaño del poro y constituye una
característica típica de un determinado canal. Tam-
bién se puede estudiar la «selectividad iónica» de
un canal variando las concentraciones de los di-
ferentes iones en los medios interno y/o externo,
modi�icando por tanto el potencial de equilibrio
para ese ion, y midiendo la variación que se produce
en la corriente cuando se abre el canal, o directa-
mente el potencial de reversión de la corriente, que
se corresponde con ese potencial de equilibrio. La
«probabilidad de apertura» del canal es otro pa-
rámetro que se puede analizar en los registros de
canal único y estudiar como varía con cambios en
el voltaje o en la concentración de un ligando, de-
pendiendo del tipo de canal. Además, en el caso de
tratarse de un canal dependiente de ligando se pue-
de establecer una relación concentración-efecto
entre la concentración del ligando y su efecto sobre
algunos de los parámetros anteriores, y si se trata
306
de un canal dependiente de voltaje la dependencia
de voltaje de su activación. Sin embargo este aná-
lisis también se puede realizar utilizando registros
de corrientes macroscópicas en célula completa de
una forma más fácil.
12.3.6. Marcaje intracelular
Para completar la información obtenida con re-
gistros de �ijación de corriente o voltaje, se puede
realizar un marcaje intracelular para conocer el ta-
maño, posición dentro del tejido y morfología de la
célula estudiada. El marcaje se realiza añadiendo
al líquido de relleno del electrodo alguna molécu-
la que permita la identi�icación. Puesto que en estos
registros se consigue acceso directo al interior celu-
lar, estas moléculas pueden introducirse en la célula
por simple difusión, como en el caso de registros de
célula completa con electrodos de baja resisten-
cia, o mediante electroforesis en el caso de utilizar
electrodos ultra�inos de alta resistencia (reducido
diámetro de la punta). Con la aplicación electroforé-
tica se favorece la introducción en la célula de una
cantidad su�iciente de marcador, mediante la aplica-
ción de una corriente eléctrica. Para poder realizar
este proceso es necesario que la molécula se en-
cuentre cargada, y así, conseguir que por repulsión
eléctrica se favorezca que el compuesto viaje desde
el electrodo al interior de la célula.
Existen distintos tipos de moléculas con ca-
racterísticas diferentes que pueden utilizarse para
realizar el marcaje; según su naturaleza estas mo-
léculas pueden ser detectadas directamente o
mediante una reacción química especí�ica. Para
conseguir una detección directa se puede realizar el
marcaje con una molécula �luorescente como «luci-
fer yellow» incorporada en el interior del electrodo
de registro. Una detección indirecta mediante una
reacción química se puede conseguir realizando el
marcaje con un derivado de la biotina como es la
biocitina seguido por un procedimiento de revelado
enzimático posterior, como se explicará más ade-
lante, aunque también se puede hacer el marcaje
directamente con enzimas como peroxidasa de rá-
bano picante (Figura 12.19).
Todas estas moléculas comparten una serie de
características que permiten su uso como marca-
dores, como son la solubilidad en medios acuosos
y su capacidad de difusión y retención dentro de
la célula para conseguir un marcaje completo de la
estructura celular, pero además es necesario que
puedan soportar un proceso de �ijación necesario
para el mantenimiento del tejido.

Figura 12.19: Estructura de la molécula de
biocitina y fotogra�ía de una neurona motora
espinal de rata registrada utilizando electrodos
ultra�inos y visualizada por medio de un procedi-
miento histológico tras el marcaje con biocitina.
Estructura de la molécula obtenida de Sigma-Al-
drich. Fotogra�ía obtenida por los autores.
Utilizando el marcaje mediante moléculas
�luorescentes se puede conseguir la visualización
de la célula en estudio en el mismo momento del
registro. Para ello es necesario utilizar un microsco-
pio de �luorescencia en el equipo de registro y una
preparación de tejido con un grosor reducido para
307
Técnicas electrofisiológicas
permitir la estimulación del �luorocromo y la visua-
lización de la célula. Para conseguir una difusión
rápida que permita la visualización mientras aún
se mantiene el registro es más adecuado el uso de
electrodos de baja resistencia.
En el caso de utilizar biocitina es necesario
un procesamiento histológico posterior al regis-
tro que conlleva la �ijación del tejido y un revelado
utilizando una reacción enzimática. La biocitina es
un derivado de la vitamina biotina que es capaz de
unirse con gran a�inidad y especi�icidad a avidina
(al igual que la vitamina de la que deriva). Esta avi-
dina puede conjugarse con la enzima peroxidasa de
tal forma que al producirse la unión biotina-avidina
se consigue situar la enzima únicamente en la cé-
lula que se ha marcado con biocitina, evitando así
marcaje del resto de regiones del tejido. Después se
aprovecha la reacción catalizada por la peroxidasa
para producir la oxidación de un cromógeno como
3-3 diaminobencidina y su depósito permanente en
el tejido, que podrá ser visualizado posteriormente
utilizando el microscopio para estudiar la morfolo-
gía celular (Figura 12.19).
Bibliografía
EEG Technology. 1980.

Técnicas de imagen
funcional
La visualización de la estructura interna del cuerpo
sin necesidad de maniobras de disección laboriosas
e invasivas ha sido un sueño largamente perse-
guido por la ciencia médica. A �inales del siglo ���
y principios del �� se establecieron las bases de la
radiogra�ía gracias a los experimentos de Röntgen,
Becquerel y los Curie. Estos pioneros descubrieron
fuentes de radiación no visible que atraviesa la ma-
teria y puede impresionar el papel fotosensible.
Los rayos X y las radiaciones gamma, proce-
dentes de elementos como el uranio y el radio, son
radiaciones electromagnéticas de la misma natura-
leza que la luz pero con una longitud de onda mucho
menor. Esta característica les permite atravesar la
materia con mucha más e�iciencia que la luz, si bien
su gran energía rompe enlaces químicos en este
tránsito produciendo daños al tejido expuesto. Ade-
más, la radiación es absorbida por la materia en un
porcentaje que depende de su energía y de la densi-
dad de la materia.
Estas propiedades permitieron hacer las
primeras radiogra�ías, que son proyecciones bi-
dimensionales de partes del cuerpo en las que se
visualiza con claridad el hueso frente a los tejidos
blandos (Figura 13.1 izquierda). Durante muchos
años se usaron para el diagnóstico de fracturas y
malformaciones óseas.
13.
José Antonio López García
Elsa Cisneros
Al mismo tiempo, estas tecnologías pioneras
en su tiempo permitieron estudiar a un nivel mo-
lecular la estructura tridimensional de grandes
moléculas como el DNA (por difracción de rayos X)
o realizar estudios farmacológicos de interacción
entre ligandos y receptores (autorradiogra�ía).
El último cuarto del siglo �� produjo avances
importantes en la tecnología radiográ�ica que con-
dujeron a las técnicas de tomogra�ía computarizada
(Figura 13.2 derecha). Estas técnicas han mejorado y
re�inado la radiogra�ía básica en varios sentidos. Pri-
mero incorporan fuentes de radiación más ligeras y
menos dañinas para los tejidos y segundo sustituyen
el papel fotosensible por detectores electrónicos.
Estas dos mejoras han conducido a la obtención
de imágenes más ricas en las que se pueden dis-
tinguir con claridad tejidos blandos de distintas
densidades. Finalmente, incorporando tecnología
computacional, han conseguido generar modelos de
visualización tridimensional del cuerpo.
Todos estos avances han preparado el terreno
para el desarrollo de las técnicas de imagen fun-
cional, donde el foco cambia de la estructura a la
función. La imagen funcional serviría por ejemplo
para investigar qué parte del cerebro es respon-
sable de la generación y control del movimiento
Métodos en biociencias
Figura 13.1: La imagen de la izquierda muestra una de las primeras radigra�ías conocidas (la mano de la Sra.
Röntgen). La imagen de la derecha muestra un máquina de tomogra�ía axial computarizada (TAC) moderna. Las
máquinas de PET y RMI tienen una apariencia semejante.
corporal. Para responder a una pregunta como esta
no basta con conocer la estructura del cerebro, se
necesita saber dónde se encuentran las neuronas
cuya activación sirve para para preparar o ejecu-
tar el movimiento. Pero, ¿cómo puede una técnica
óptica proporcionar información del estado de ac-
tivación de una célula? Las técnicas que se discuten
en este capítulo registran las señales ópticas que se
producen como consecuencia de los cambios en el
ambiente �ísico y químico de las células y que a su
vez correlacionan con su estado de activación.
Las células requieren energía para llevar a
cabo sus principales funciones, así como los pro-
cesos que permiten su mantenimiento. Puesto que
el suministro y consumo de nutrientes y oxígeno
está ajustado a la demanda energética de los teji-
dos, especialmente en el caso del tejido nervioso, su
medida constituye una manera indirecta de medir
la actividad celular. En este capítulo se discutirán
en detalle dos técnicas que se basan en este tipo de
aproximación, la tomogra�ía de emisión de positro-
nes y la resonancia magnética funcional.
Las técnicas de imagen funcional de nivel ce-
lular suponen un método más directo para medir la
actividad puesto que se basan en la medida de los
cambios que ocurren en las células excitables como
parte del proceso de activación, es decir, la varia-
ción en el potencial de membrana, los cambios en
las concentraciones de ciertos iones, o la liberación
de neurotransmisores. Aquí se verán en detalle las
técnicas de imagen de calcio, las más utilizadas en la
actualidad, y las técnicas de imagen de voltaje.
310
13.1. Tomografía de emisión de positrones
(PET)
La tecnología PET comenzó a desarrollarse en los
años 50 y se basa en el principio �ísico de la «emi-
sión por aniquilación» que se explica a continuación
a un nivel puramente intuitivo, ya que la �ísica sub-
yacente encierra una complejidad que supera los
límites de este manual.
Los positrones son partículas subatómicas
elementales que se caracterizan por ser la antipar-
tícula del electrón: tienen su misma masa pero con
carga positiva. Cuando un positrón y un electrón
chocan accidentalmente se aniquilan produciendo
una radiación gamma en direcciones opuestas so-
bre una misma línea.
En los años 70 se construyeron detectores de
radiación gamma formando anillos de tal forma que
el sujeto de estudio podía situarse en su interior.
Allí donde ocurran choques de electrones y positro-
nes se producirán radiaciones gamma. La posición
aproximada de la colisión podrá ser reconstruida
ya que se detectarán dos radiaciones gamma simul-
táneamente en dos lugares del anillo de detección
electrónico. Esto nos permitirá establecer la línea
de origen. Si en el mismo lugar siguen ocurriendo
choques, estos producirán distintas líneas de ori-
gen cuya intersección informará sobre el punto de
origen.
Los anillos de detectores pasarán información
continua sobre los impactos detectados a un orde-
nador que será capaz de situar el foco de origen de
los choques allí donde ocurren usando una tecno-

Figura 13.2: La imagen muestra el proceso de aniquilación, la captación de radiación gamma, su con-
versión en señales digitales y la visualización en un ordenador. Modi�icado de http://www.slideshare.
net/tmhnehru/handout-rmnlectureapplication-of-radiationinmedicineandresearch30122013.
logía basada en la tomogra�ía (Figura 13.2) que en
última instancia nos permitirá generar imágenes
tridimensionales.
13.1.1. Radiofármacos
Las colisiones entre electrones y positrones no ocu-
rren de forma espontánea en los tejidos y esto hace
necesario que a los sujetos experimentales haya
que administrarles un radiofármaco.
Los radiofármacos se componen de un radio-
núcleo (componente emisor de positrones) y de
una molécula usada de forma habitual por el orga-
nismo, por ejemplo glucosa. Los radionúcleos son
isótopos radiactivos del carbono (11C), el nitrógeno
(13N), el �lúor (18F) u otros elementos. Los radionú-
cleos se producen en ciclotrones y, debido a su corta
vida media de emisión, es necesario que el lugar de
uso se encuentre relativamente próximo al lugar de
producción. Esto hace que estas técnicas sean más
rentables en grandes núcleos urbanos donde mu-
chos hospitales usan la producción de un ciclotrón
próximo.
Los radionúcleos producidos en los ciclotrones
no tienen la forma química y farmacéutica adecua-
311
Técnicas de imagen funcional
da para ser utilizados como trazadores biológicos,
por lo que deben ser incorporados a moléculas más
complejas para dar lugar al radiofármaco en un la-
boratorio radiofarmacéutico. El radiofármaco más
utilizado actualmente en la PET es la (18F)-2-�luo-
ro-desoxi-D-glucosa (2FDG). Sin embargo para
distintos propósitos pueden usarse otras combina-
ciones de radionúcleo y compuesto de uso biológico,
pueden marcarse por ejemplo grupos amonio o
neurotransmisores.
13.1.2. Administración y funcionamiento
del radiofármaco
El radiofármaco de elección se administra al sujeto
generalmente por vía intravenosa y luego se espe-
ra aproximadamente 1 h para que este se distribuya
adecuadamente por los diversos compartimentos
del organismo. En el caso de la 2FDG, esta es trans-
portada al interior celular de la misma manera que
la glucosa normal no marcada. Una vez dentro de
la célula, es fosforilada y la forma fosoforilada ya
no puede abandonar libremente la célula, por tan-
to se acumula en su interior. Las células más activas
consumen más glucosa y por tanto concentran
Métodos en biociencias
más 2FDG. El radiofármaco irá perdiendo positro-
nes atrapado en su localización celular de tal forma
que en estas zonas de acumulación la probabilidad
de colisión y aniquilación aumenta extraordina-
riamente con respecto a las zonas donde no hay
acumulación del radiofármaco. Se calcula que por
término medio, un positrón tras ser liberado se des-
plaza aproximadamente 1 mm antes de colisionar
con un electrón. La radiación liberada en este pro-
ceso servirá para detectar el origen de la emisión
como ya se ha explicado.
13.1.3. Aplicaciones de la PET en clínica
e investigación
La tomogra�ía de emisión de positrones se utiliza de
forma intensiva en oncología. Una de sus aplicacio-
nes más común es la detección precoz de recidivas
de tumores que ya han sido extirpados previa-
mente. Puesto que las células tumorales tienen un
crecimiento anormalmente rápido y por tanto un
mayor consumo de glucosa, se utiliza la 2FDG para
detectar su presencia. La PET es extraordinaria-
mente sensible, de tal forma que se puede detectar
un pequeño grupo de células tumorales antes de
que se produzcan metástasis, siempre y cuando los
escáneres se realicen de manera periódica.
También se usan estas técnicas en cardiología,
psiquiatría y neurología. Se puede valorar la via-
bilidad del miocardio, detectar focos epilépticos o
ayudar en el diagnóstico de enfermedades neurode-
generativas o incluso neuropsiquiátricas.
La PET permite, además, la obtención de imá-
genes de la farmacocinética y farmacodinámica
de distintas drogas y fármacos. Pueden emplearse
como radiotrazadores los mismos fármacos mar-
cados con 11C o 18F, o bien puede medirse su efecto
sobre el �lujo sanguíneo, el metabolismo de la gluco-
sa o la ocupación de receptores especí�icos.
La investigación neurobiológica se ha servido
de esta técnica para estudiar la localización de fun-
ciones cerebrales sobre la base de que las neuronas
más activas durante la realización de una función
especí�ica consumen más glucosa. La miniaturiza-
ción de equipos PET ha permitido el uso de estas
técnicas con pequeños animales de laboratorio im-
pulsando su uso en investigación.
13.1.4. Limitaciones de la PET
Las limitaciones de esta técnica vienen dadas por
cuestiones puramente pragmáticas y también por
alguna de sus características técnicas. Así, por ejem-
312
plo a nivel pragmático, la escasa durabilidad de los
radiofármacos así como su escasa disponibilidad
en lugares alejados del lugar de producción es una
limitación clara. Además, aunque la técnica no es in-
vasiva, al estar basada en radiación, su uso debe ser
espaciado convenientemente para evitar una expo-
sición excesiva.
En el plano técnico hay que hacer varias con-
sideraciones. La PET tiene una baja resolución
temporal ya que para completar un escáner se
requieren de 1 a 2 minutos. Por esta razón algu-
nos fenómenos que son muy dinámicos, como por
ejemplo la función cerebral, resultan di�íciles de ob-
servar con esta técnica. Asimismo, la localización
espacial del foco de emisión tiene un error medio de
± 1 mm debido a que no todos los positrones emiti-
dos colisionan con electrones a la misma distancia
de la emisión. Finalmente, esta técnica es exclusi-
vamente funcional y no proporciona información
anatómica. Esto obliga a realizar una tomogra�ía
computarizada a los sujetos sin cambiar de posi-
ción de tal manera que las imágenes funcionales
obtenidas se puedan superponer a las imágenes
anatómicas para localizar el foco.
13.2. Resonancia magnética funcional (fMRI)
La tecnología basada en la resonancia magnética
constituye la forma más moderna y más promete-
dora de producir imagen anatómica y funcional de
gran calidad de los órganos y tejidos del cuerpo.
La tomogra�ía por resonancia magnética (o reso-
nancia magnética nuclear) es la técnica precursora
de esta familia y solo produce imagen anatómica.
Posteriormente se desarrollaron procedimientos
basados en la misma tecnología para producir ima-
gen funcional (resonancia magnética funcional). La
�ísica subyacente es muy compleja y una explicación
exhaustiva sobre estos aspectos está fuera de las in-
tenciones de este libro. Por razones pedagógicas y
también biográ�icas, se empezará revisando la téc-
nica de resonancia magnética nuclear.
13.2.1. Resonancia magnética nuclear
Los principios �ísicos de la resonancia magnéti-
ca nuclear se estudiaron en los años 30 y 40 en el
entorno de la investigación militar y se han desarro-
llado en años posteriores para dar lugar a técnicas
como la espectroscopia, que sirve para estudiar fe-
nómenos �ísicos a nivel molecular y la generación
de imágenes en biomedicina, tema que nos interesa
aquí. Las primeras imágenes basadas en resonancia
 Técnicas de imagen funcional

Figura 13.3: Imagen de un escáner. La imagen en A muestra un escáner anatómico obtenido por medio de RMI. La imagen en B muestra
escáneres funcionales obtenidos con fMRI durante la realización de tareas. C muestra una reconstrucción tridimensional del cerebro con
imágenes de fMRI. El grado de activación neuronal en cada zona se muestra por un código de colores. Disponible en color.

313
Métodos en biociencias
del cuerpo de animales experimentales se obtu-
vieron en los años 70 y su creador, Paul Lauterbur
obtuvo el premio Nobel por su trabajo en 2003.
La resonancia magnética es un fenómeno �ísico
por el cual algunos núcleos atómicos sometidos a un
campo magnético pueden absorber y emitir radia-
ción electromagnética. Este fenómeno de absorción
ocurre a una radiofrecuencia dada a la que se llama
frecuencia de resonancia. La frecuencia de resonan-
cia depende de la intensidad del campo magnético y
de las propiedades del núcleo estudiado.
La obtención de imágenes por resonancia pasa
por la siguiente secuencia de acontecimientos:
— Primero la muestra (o sujeto) de estudio
debe someterse a un campo magnético, lo
cual producirá el alineamiento (o polariza-
ción) de los núcleos atómicos polarizables.
La tecnología para producir campos mag-
néticos de gran intensidad se ha mejorado
mucho, de tal forma que hoy se puede lle-
gar a producir un campo magnético de
hasta 7 Tesla. Muchos equipos en uso en
hospitales usan campos magnéticos de 1.5
a 3 Tesla.
— Después el alineamiento es perturbado
por la emisión de un pulso de ondas de ra-
dio. La frecuencia de estas ondas vendrá
dada por el núcleo que se quiera observar
y por la intensidad del campo magnético
al que está sometido (frecuencia de reso-
nancia). Las ondas de radio son campos
magnéticos oscilantes y se aplican en una
dirección perpendicular a la dirección del
campo magnético estático.
— La terminación del pulso producirá un re-
torno de los núcleos al estado polarizado
original dentro del campo magnético es-
table.
— Los cambios electromagnéticos produci-
dos por estos fenómenos de perturbación
y realineación de los núcleos inducen co-
rrientes eléctricas en antenas receptoras.
— Las señales inducidas en las antenas son
convertidas en una imagen de densi-
dad del núcleo resonante a través de un
complejo análisis computacional (�igura
13.3).
En principio son muchos los núcleos que se pue-
den estudiar con esta técnica. En la práctica el más
usado es el átomo de hidrógeno (protón). Es muy
abundante en el agua y otras muchas moléculas
presentes en los tejidos y además tiene propiedades
314
magnéticas muy favorables. La utilización del hidró-
geno permite obtener imágenes anatómicas de gran
calidad y sensibilidad en planos tomográ�icos que
permiten hacer reconstrucciones tridimensionales
del objeto de estudio.
Para poder realizar una imagen de resonan-
cia magnética, los pacientes son introducidos en un
escáner de MRI que genera un fuerte campo magné-
tico alrededor de la zona que se va a estudiar.
Esta tecnología se usa de forma rutinaria hoy
en día en los hospitales para una gran variedad de
funciones en servicios de oncología (detección de
tumores), neurología (detección de trastornos por
desmielinización, demencia, trastornos cerebro-
vasculares, etc.), cardiovascular (diagnóstico de
miocardiopatías) y se usa también para la detección
y caracterización de lesiones de hígado, páncreas y
conductos biliares.
13.2.2. fMRI
Esta técnica es un procedimiento que produce imá-
genes de la actividad cerebral estimadas a partir de
cambios en �lujos sanguíneos locales. La actividad
cerebral produce cambios de �lujo sanguíneo y de
oxigenación de la sangre. Cuando las neuronas de
un área cerebral se activan, aumenta su consumo de
oxígeno y esto provoca una respuesta hemodinámi-
ca por la cual el �lujo local aumenta en esa área y la
sangre oxigenada desplaza a la desoxigenada.
El mecanismo por el cual el sistema nervioso
informa del aumento en sus necesidades de oxígeno
se relaciona con la liberación de neurotransmiso-
res (glutamato) cuando se producen potenciales de
acción. El glutamato liberado en exceso es transpor-
tado por los astrocitos, lo que genera un cambio de
concentración de calcio en su interior y esto a su
vez produce liberación de óxido nítrico que tiene un
efecto vasodilatador sobre las arteriolas.
La respuesta hemodinámica producida por la
activación neuronal consiste en una desoxigena-
ción instantánea de la sangre seguida por un pico
de oxigenación que llega de 2 a 6 s después. Poco
después de este pico de oxigenación, la sangre vuel-
ve a alcanzar su nivel normal de oxígeno, siempre y
cuando la actividad neuronal se normalice también.
Si la actividad neuronal persiste, se mantienen los
niveles altos de oxigenación.
La forma original de fMRI usa el contraste de-
pendiente de la oxigenación de la sangre (BOLD
por sus siglas en inglés). El oxígeno es transporta-
do en sangre por la hemoglobina y la hemoglobina
desoxigenada es paramagnética mientras que la oxi-

genada no lo es. Esta propiedad paramagnética de
la desoxihemoglobina intensi�ica local y débilmente
el campo magnético estático producido por el equi-
po de registro alterando la resonancia magnética de
la sangre y tejidos inmediatamente circundantes.
Las primeras imágenes producidas en animales de
experimentación por este procedimiento las obtu-
vo Seiji Ogawa en 1990. En 1992 se obtuvieron las
primeras imágenes en seres humanos y hoy en día
se utilizan de manera rutinaria en muchos laborato-
rios y hospitales.
En resumen, estos cambios locales de oxige-
nación de la sangre y, por tanto, la activación de
áreas cerebrales concretas se representan grá�ica-
mente en planos cerebrales con un código de color
que muestra el grado de activación (Figura 13.3b y
c). Esta técnica es precisa en el espacio y puede lo-
calizar cambios pequeños con una precisión de
milímetros, sin embargo su resolución temporal es
más pobre ya que la realización de un escáner re-
quiere varios segundos.
Existen voces críticas que advierten que es-
tas estimaciones de la actividad cerebral se basan
en el supuesto acoplamiento entre los procesos de
activación neuronal y consumo de oxígeno. Además
la respuesta hemodinámica es relativamente len-
ta con respecto de la activación neuronal. A pesar
de estas críticas que deben ser tenidas en cuenta,
la fMRI es hoy en día una técnica de elección para
la investigación neurobiológica en seres humanos.
13.2.3. Limitaciones de la resonancia magnéti-
ca
Las técnicas basadas en la resonancia magnética
son en general más convenientes que las de PET si
bien es cierto que no siempre son intercambiables
y hay problemas especí�icos que requieren PET. Sin
embargo la fMRI no usa radiofármacos y por tanto
no expone a los sujetos a radioactividad ni depen-
de de la proximidad de los centros de fabricación de
estos. Además la fMRI es simultáneamente una téc-
nica funcional y anatómica simpli�icando mucho los
procedimientos.
PET y fMRI comparten ciertas limitaciones
referidas a la resolución espacial y temporal de
las imágenes. En el caso del análisis funcional del
cerebro donde estas limitaciones pueden ser res-
trictivas, se compensan con diseños experimentales
adecuados, por ejemplo usando repetición de tareas
de tal forma que los escáneres se puedan repetir y
promediar para evitar errores.
A pesar de que a las técnicas basadas en la
resonancia magnética se las ha considerado com-
315
Técnicas de imagen funcional
pletamente inocuas, hoy en día se está poniendo
un gran interés en dilucidar los efectos especí�icos
que produce la exposición a campos magnéticos de
gran intensidad. Se reportan casos de estimulación
de nervios periféricos, calentamiento del cuerpo y
riesgo carcinogénico en el largo plazo.
En condiciones normales se admite que la
prueba puede producir una ligera incomodidad
debido a ruidos y el efecto potencialmente claustro-
fóbico que puede producir en algunas personas. En
todos los casos es necesario evitar la utilización du-
rante los escáneres de objetos metálicos y la prueba
está contraindicada en sujetos con implantes de vál-
vulas cardíacas.
13.3. Técnicas de imagen funcional celular
Aunque técnicas como las descritas en el apartado
anterior ofrecen la posibilidad de realizar medidas
de la activación celular, estas no están directamen-
te relacionadas con la actividad del tejido objeto de
estudio y tienen una resolución temporal baja (del
orden de segundos). Las técnicas que se detallan en
este apartado solventan estos problemas, además
de presentar otras ventajas.
Las técnicas de imagen funcional celular tie-
nen su origen en las técnicas de imagen destinadas
a visualizar especímenes histológicos que, gracias a
numerosos desarrollos tecnológicos, han evolucio-
nado hasta hacer posible el registro de los procesos
que ocurren en las células vivas.
El elemento fundamental en estas metodolo-
gías es el marcador exógeno, una molécula externa
al organismo capaz de actuar como reportera de los
cambios moleculares o celulares que se producen
como consecuencia de la activación celular.
Puesto que las técnicas de imagen funcional
celular se aplican fundamentalmente al estudio
del sistema nervioso, este apartado se centrará en
la obtención de imágenes funcionales en el teji-
do neural. La activación neuronal comienza con un
cambio en el potencial de membrana que se sucede
de cambios en la concentración intracelular de cal-
cio o en la señalización sináptica. A continuación se
explicarán las técnicas de imagen que se basan en
el uso de marcadores de calcio, que son sensibles
a los cambios de concentración de calcio intrace-
lular, y marcadores de voltaje, que son sensibles a
los cambios en el potencial de membrana. Puesto
que los marcadores son moléculas exógenas es ne-
cesario introducirlos en las neuronas. Los métodos
para cargar las neuronas varían tanto en función
Métodos en biociencias
del marcador, como de la pregunta experimental.
Una vez que los marcadores se han incorporado
al interior celular o a la membrana plasmática, las
señales que emiten, cambios en la absorbancia o
emisión de �luorescencia, se registran mediante mi-
croscopios confocales o multifotónicos acoplados a
dispositivos de captura de imágenes, normalmente
cámaras de video de alta velocidad. El uso de soft-
ware especí�ico hace posible la interpretación y
cuanti�icación de las señales obtenidas. Gracias al
desarrollo de los marcadores y de las tecnologías
óptica e informática, estas metodologías permi-
ten la visualización en tiempo real de eventos que
ocurren durante amplias escalas de tiempo (desde
microsegundos hasta horas) y en amplias escalas
de espacio (desde el nivel sub-celular hasta grandes
grupos de neuronas) con una elevada resolución
espacial (20-50 µm) y temporal (por debajo del mi-
lisegundo). Además, pueden aplicarse al estudio del
funcionamiento de diferentes tipos celulares, en di-
versos organismos, in vitro (en cultivos celulares o
rodajas de tejido) o in vivo (en animal anestesiado,
o despierto y en movimiento), y en condiciones nor-
males y patológicas.
13.3.1. Técnicas de imagen de calcio
Señalización de calcio en las neuronas
Los iones de calcio generan señales intracelula-
res que median una gran variedad de funciones en
prácticamente todos los tipos celulares de los se-
res vivos. En las neuronas, cada potencial de acción,
por lo general, produce la apertura de los canales
de calcio dependientes de voltaje de la membrana
plasmática del soma y del árbol dendrítico. Como
resultado, hay un breve aumento de los niveles de
calcio, que puede mediar procesos tan variados
como la liberación de neurotransmisores desde el
terminal presináptico, la inducción de la plasticidad
O2
C + Ca
2+
CO2
Figura 13.4: Indicadores bioluminiscentes. La unión de Ca2+ a la acuorina provoca la oxidación de la
coelenterazina a coelenteramida. Esta última pasa a su estado relajado y emite un fotón de 470 nm.
316
sináptica en las dendritas y la regulación de la trans-
cripción génica en el núcleo. Todos estos procesos,
además de ocurrir en diferentes compartimentos
celulares, tienen duraciones muy variables que van
de los microsegundos hasta las horas.
Los marcadores de calcio varían la emisión de
�luorescencia en respuesta a los cambios en la con-
centración de calcio en el interior de la célula, por
lo que proporcionan información sobre el estado
de activación neuronal. Por otra parte, si se analiza
la localización y la duración de las señales de calcio
también es posible inferir cuáles son los procesos
celulares que están mediando.
El papel clave del calcio en la transmisión
sináptica, y por tanto el procesamiento de la in-
formación en el sistema nervioso, ha motivado el
esfuerzo que se ha realizado durante las últimas
cuatro décadas para desarrollar nuevos marcado-
res de calcio y la instrumentación necesaria para
detectar sus cambios. Como resultado, la imagen de
calcio es la metodología más avanzada en imagen
funcional de nivel celular y se utiliza en muchos la-
boratorios de neurociencias en la actualidad.
Marcadores de calcio
Indicadores de calcio bioluminiscentes
Este tipo de indicadores fueron de los primeros en
usarse. A �inales de los años 60 varios grupos uti-
lizaron como marcador de calcio la acuorina, una
foto-proteína derivada de la medusa luminiscente
Aequorea victoria. La acuorina está compuesta por
una apoproteína, la apocuorina, que contiene tres
lugares de unión al calcio y un cromóforo unido no
covalentemente, una combinación de coelenterazi-
na y oxígeno molecular. Tras la unión de los iones
de calcio, la proteína sufre un cambio conformacio-
nal que resulta en la oxidación de la coelenterazina
a coelenteramida. Esta última emite un fotón con
470 nm
C + CO2

una longitud de onda de 470 nm como resultado
del paso del estado excitado al estado basal (Figu-
ra 13.4). La relación señal-ruido obtenida con la
acuorina permite detectar variaciones en la con-
centración de calcio de 10-7 a 10-3 M. La acuorina, al
igual que otras proteínas bioluminiscentes, no re-
quiere iluminación externa, por lo que con su uso
se evita la fototoxicidad, la pérdida de señal por so-
breexposición, la auto�luorescencia y la activación
de procesos biológicos fotosensibles. Como contra-
partida, cada molécula lleva a cabo un solo ciclo de
emisión y su vuelta al estado excitado es lenta, de
manera que las señales obtenidas son débiles y con
poca resolución temporal. Por otra parte, la acuori-
na obtenida por extracción a partir de la medusa no
atraviesa la membrana plasmática y debe microin-
yectarse. El clonaje de la proteína ha permitido su
expresión en una gran variedad de tipos celulares
e incluso en compartimentos intracelulares de-
�inidos. Además, se ha combinado con proteínas
�luorescentes para aumentar la intensidad de emi-
sión. No obstante, en estos casos es necesario una
suplementación exógena de coelenterazina.
Indicadores de calcio sintéticos
Los primeros indicadores de calcio sintéticos fue-
ron desarrollados por Roger Tsien en los años 80.
Estos marcadores son el resultado de la hibridación
de un quelante del calcio, como por ejemplo el EGTA
o el BAPTA, con un cromóforo �luorescente. Durante
las últimas décadas se han desarrollado numerosos
marcadores con diferentes a�inidades por el calcio y
diferentes propiedades espectrales.
La primera generación de indicadores de calcio
estaba formada por quin-2, fura-2, indo-1 y �luo-3.
El marcador quin-2 fue el primer marcador
sintético usado en experimentos biológicos. Se ex-
cita por la luz UV (339 nm) y no es especialmente
brillante, por lo que necesita usarse a elevadas
concentraciones para superar los niveles de auto-
�lorescencia intracelular.
El marcador fura-2 es uno de los indicadores
de calcio más populares. Se excita con luz UV de
350 y 380 nm y emite a una longitud de onda de
entre 505-520 nm. Cada molécula de fura-2 puede
unir un ion de calcio, que provocará un cambio con-
formacional, y en consecuencia, un cambio en las
propiedades ópticas de la molécula. Así, cuando las
concentraciones de calcio son bajas, fura-2 respon-
de a longitudes de onda de excitación de 380 nm. Al
aumentar la concentración de calcio en la célula, el
espectro de excitación se desplaza hacia los 340 nm.
La longitud de onda de emisión se mantiene �ija en-
317
Técnicas de imagen funcional
tre 505-520 nm. Gracias a estas características, si se
combina el uso de fura-2 con la microscopía confo-
cal es posible realizar una medida ratiométrica de
la concentración de calcio en la neurona. La relación
entre la emisión para cada longitud de onda de ex-
citación es proporcional a la cantidad de calcio en
la célula y no depende de la cantidad de marcador
o el tamaño de la célula. El fura-2 no permite reali-
zar medidas ratiométricas si se usa el microscopio
de dos fotones debido a su espectro de excitación.
En este caso, se realizan medidas de la intensidad
de la �luorescencia emitida, que disminuye cuando
aumentan los niveles de calcio intracelular. Por otra
parte, la microscopía de dos fotones ofrece buenas
secciones ópticas y permite realizar dobles mar-
cajes de fura-2 con GFP, gracias a que sus picos de
absorción están bastante separados (Figura 13.5).
Las siguientes generaciones de indicadores
sintéticos son excitables en un amplio rango del es-
pectro. Las familias de marcadores Oregon Green
BAPTA y �luo-4, por ejemplo, se excitan a una úni-
ca longitud de onda (en torno a los 488 nm) y por
tanto no permiten realizar medidas ratiométri-
cas. Sin embargo, la elevada relación señal-ruido y
la compatibilidad con diferentes métodos de carga
convierten a estos marcadores en la mejor opción
para registrar señales de calcio in vivo. Los indi-
cadores de calcio excitables a longitudes de onda
largas, como Rhod-2, son muy útiles para medir el
calcio en tejidos con elevada auto�luorescencia.
Muchos indicadores están disponibles en la
forma éter acetoximetil (AM) y pueden atravesar la
Intensidad de fluorescencia
[Ca2] máxima
emitida a 510 nm
[Ca2] mínima
300 350 400 450
Longitud de onda de excitación (nm)
Figura 13.5: Indicadores sintéticos usados en medidas ratiométri-
cas. El indicador fura-2 responde a diferentes longitudes de onda
de excitación dependiendo de la concentración de calcio. A medida
que aumenta la concentración de calcio la longitud de onda de ex-
citación se desplaza desde 380 nm a 340 nm.
Métodos en biociencias
440 nm a M13
l modulin
Ca
2+
Ca
us
Ven
ECFP
480 nm
Figura 13.6: GECIs basados en FRET. Tras la unión de calcio a cameleon el dador ECFP y el aceptor Venus se aproximan. Esto permite que
se produzca el fenómeno de FRET, disminuyendo la emisión de �luorescencia de 480 nm (azul) y aumentando la de 530 nm (amarilla).
membrana. No obstante, en experimentos de larga
duración las formas AM de los indicadores pue-
den translocarse a compartimentos intracelulares o
unirse a proteínas, alterando la especi�icidad de las
señales obtenidas. La Rhod-2 AM, por ejemplo, se
capta principalmente por las células gliales, por lo
que no se usa en los estudios de imagen neuronal.
Para solventar estos problemas se han desa-
rrollado indicadores acoplados a dextranos. Los
dextranos son polisacáridos hidro�ílicos, de baja
toxicidad e inertes biológicamente. Di�ícilmen-
te pasan a los compartimentos intracelulares ni se
unen a proteínas citosólicas. Además, los dextra-
nos se transportan de manera activa por las �ibras
nerviosas adultas y se retienen en los terminales
presinápticos, de forma que permiten monitorizar
la dinámica de calcio presináptica.
En resumen, los indicadores de calcio sintéti-
cos proporcionan una buena relación señal-ruido,
tienen una cinética rápida, sufren poca saturación
de la señal cuando se excitan con dos fotones y no
tienen efectos farmacológicos colaterales. Su princi-
pal desventaja es que son di�íciles de cargar en tipos
celulares especí�icos y no es posible usarlos en ex-
perimentos que requieren registros de duración de
varios días.
Indicadores de calcio codificados genéticamente
(GECIs)
Los GECIs (genetic encoded calcium indicators)
empezaron usarse hace más de 10 años. Pueden ba-
sarse en el sistema de transferencia de energía de
resonancia de Förster (FRET) o en la emisión de
�luorescencia de un único �luoróforo.
Los primeros GECIs pertenecen a la fami-
lia cameleon. Estos marcadores están formados
318
440 nm a
l m odulin
Ca M13
s
ECFP Venu
FRET 530 nm
por una proteína �luorescente cian mejorada
(ECFP), que actúa como dador, y la proteína Venus,
que actúa como aceptor. Ambas proteínas están
fusionadas por la proteína de unión al calcio cal-
modulina y el péptido de unión a la calmodulina,
M13. En ausencia de iones de calcio domina la emi-
sión de �luorescencia azul de la ECFP (480 nm).
Tras la unión del calcio, un cambio conformacio-
nal intramolecular disminuye la distancia entre la
ECFP y la proteínas Venus, que se excita y emite fo-
tones con una longitud de onda de 530 nm. Como
consecuencia disminuye la �luorescencia azul y au-
menta la amarilla (Figura 13.6). La señal de calcio
se expresa como la relación entre la emisión de
�luorescencia de las dos proteínas. La calmoduli-
na de estos indicadores puede unirse a proteínas
endógenas. Para evitarlo, se han usado formas mu-
tadas de la calmodulina o esta se ha sustituido por
la troponina, que no tiene parejas endógenas en
las neuronas.
Una segunda familia de marcadores de este
tipo es la GCaMP que consta de tres elementos: la
proteína �luorescente verde mejorada (EGFP) �lan-
queada por la calmodulina y por el péptido M13.
En presencia de calcio, la calmodulina y el
péptido M13 interaccionan y aumenta la cantidad
de �luorescencia emitida por la EGFP. Estos GECIs
son los más usados en experimentos in vivo (Figu-
ra 13.7).
Los GECIs, en general, permiten realizar regis-
tros crónicos durante largos periodos de tiempo en
poblaciones neuronales de�inidas e incluso en com-
partimentos celulares determinados. Además, los
GECIs basados en el sistema FRET son los más indi-
cados para realizar experimentos in vivo, ya que las
señales que emiten tienen poco solapamiento con
la auto�luorescencia de los tejidos. Sin embargo, la

485 nm
a 2+
lmodulin
Ca
EGFP
M1
3
Figura 13.7: GECIs basados en un solo �luoróforo. La unión de calcio a GCaMP provoca un cambio conformacional que provoca una au-
mento en la intensidad de la emisión de �luorescencia a 515 nm.
cinética de los GECIs es lenta, su expresión a largo
plazo puede resultar citotóxica y pueden modi�icar
de manera signi�icativa la concentración de calcio
intracelular cuando se expresan en altos niveles.
Afinidad de los indicadores por el calcio
La disponibilidad de marcadores con diferentes
a�inidades es una característica importante pues-
to que el rango de concentraciones de calcio varía
desde el nivel nanomolar (por ejemplo, en los com-
partimentos celulares más grandes) hasta el nivel
micromolar (por ejemplo, en dominios de calcio ad-
yacentes a la membrana plasmática). Por otra parte,
todos los indicadores de calcio, a excepción de la
acuorina, actúan como tamponadores exógenos de
calcio, y por tanto pueden modi�icar la dinámica del
calcio intracelular.
La a�inidad por el calcio se mide por la cons-
tante de disociación (Kd). La Kd se mide en unidades
de molaridad y hace referencia a la concentración
de calcio necesaria para unir la mitad de moléculas
del indicador. La Kd varía en función de paráme-
tros como el pH, la temperatura o la presencia de
otros iones. Las señales obtenidas con indicadores
con baja a�inidad re�lejan de manera más precisa
las variaciones en la concentración de calcio cito-
sólico, pero producen señales menos intensas. Por
tanto, todos estos factores deben tenerse en cuen-
ta para elegir el indicador de calcio más adecuado
para cada tipo de experimento.
Administración de los marcadores de calcio
La carga de los indicadores de calcio en la neurona
depende del tipo de indicador, el tipo de prepara-
ción y la pregunta experimental.
Técnicas de imagen funcional
485 nm 515 nm
a
Ca
lmodulin
Ca 3
EGFP M1
Carga por baño de indicadores sintéticos
que permean la membrana
Este tipo de carga sirve para marcar poblaciones ce-
lulares con indicadores sintéticos en forma AM.
Para la carga in vitro, las muestras se incuban
en una solución del marcador, que gracias a la natu-
raleza hidrófoba del grupo AM atraviesa fácilmente
la membrana. Una vez en el interior de la célula, el
grupo AM se hidroliza por las esterasas intracelula-
res, y el indicador queda retenido en el citosol. La
concentración del colorante, tiempo de incubación,
y temperatura deben determinarse empíricamente
para cada preparación experimental. Una incuba-
ción prolongada o a temperaturas elevadas puede
provocar la carga del marcador en los compartimen-
tos intracelulares. Esto debe evitarse puesto que los
cambios en la concentración de iones de calcio en
estos compartimentos no re�lejan con exactitud los
cambios en la concentración de calcio citosólica.
Para la carga in vivo, los marcadores AM se
aplican usando una micropipeta que se descarga
mediante presión positiva de aire. Generalmente,
este método se usa para marcar el parénquima ce-
rebral y se consiguen teñir áreas de entre 300-500
µm (Figura 13.8)
La e�iciencia de la carga por baño de los mar-
cadores tipo AM depende de la edad, siendo más
elevada en las preparaciones de individuos jóvenes.
Por otra parte, el marcaje mediante este método es
inespecí�ico.
Microinyección
Sirve para marcar células individuales en cultivo
celular o en rodajas de tejido con los indicadores
bioluminiscentes o sintéticos que no atraviesan
la membrana celular (Figura 13.8). En los prime-
319
Métodos en biociencias

Microinyección
Marcadores bioluminiscentes
Marcadores sintéticos Baño
Marcadores-AM Electroporación
Marcadores sintéticos
GECIs

Carga retrógrada
Marcadores-dextrano

Figura 13.8: Resumen esquemático de los métodos de carga de los diferentes tipos de in-
dicadores de calcio en la corteza cerebral.

ros experimentos de imagen de calcio se usaban
microelectrodos estirados. Actualmente está es-
tandarizada la inyección mediante el uso de micropi-
petas de whole-cell clamp ya que es común combinar
los experimentos de registro de célula entera y la ad-
quisición de imágenes de calcio.
Para aumentar la especi�icidad celular, la mi-
croinyección se puede realizar en animales en los
que una determinada población neural está marca-
da mediante transgénesis o transducción viral.
En el caso de los indicadores acoplados a dex-
tranos, se tranportan anterogradamente desde el
soma hasta el axón.
Electroporación
Se usa para cargar indicadores sintéticos que no
atraviesan la membrana o GECIs en una única cé-
lula o una población neural in vitro e in vivo (Figura
13.8). En el primer caso, se coloca una micropipe-
ta sobre la neurona de interés. En el segundo, la
micropipeta se coloca en la región de interés. La co-
rriente eléctrica cumple dos cometidos. Perturba
la integridad de la membrana plasmática de mane-
ra transitoria permitiendo la entrada del marcador
dentro de la célula, y mueve las moléculas carga-
das del marcador hacia el interior de la célula. Este
método no es especí�ico, de manera que casi todas
las células, neuronas y células gliales, bañadas por
el marcador y sometidas a la corriente eléctrica, se
cargan.
In vivo esta técnica se ha usado para marcar
poblaciones neurales de la corteza cerebral, el bul-
bo olfatorio y el cerebelo de ratón.
La electroporación in utero se usa para intro-
ducir GECIs en los precursores neurales. Con este
método se consigue un marcaje disperso. El área y
la especi�icidad del marcaje dependen de la edad
del embrión y de la con�iguración de los electro-
dos. Tiene la ventaja de que no hay limitaciones en
cuanto al tamaño del DNA a introducir, y que se pue-
de aplicar en especies en las que la transgénesis no
está disponible.
Carga retrograda
Se utiliza para los marcadores sintéticos acoplados
a un dextrano y permite marcar poblaciones neuro-
nales en preparaciones in vitro. Los indicadores se
aplican por presión positiva de aire con una micro-
pipeta sobre la super�icie de las �ibras axonales. Los
terminales captan el marcador que se transporta
retrógradamente hacia los somas celulares y tam-
bién queda retenido en el terminal sináptico donde
permite estudiar la transmisión sináptica (Figura
13.8).
Este método de carga se ha usado con éxi-
to para registrar señales del terminal sináptico de
neuronas del bulbo olfatorio, el cerebelo y la médu-
la espinal de ratón.
Transducción viral y transgénesis
Estas dos estrategias son la principal manera de ex-
presar los GECIs en poblaciones neurales in vivo.
La transducción viral permite expresar los GE-
CIs en dominios especí�icos del cerebro mediante
inyección estereotáxica o en determinados tipos
neurales usando promotores especí�icos. En la ac-
tualidad los lentivirus y los virus adenoasociados
son los vectores virales más usados. Los primeros
pueden contener DNA de mayor tamaño. Ambos

320
 Técnicas de imagen funcional

Figura 13.9: Ejemplo de registro de las señales de calcio en dendritas de células de Purkinje in vivo. Izquierda: imagen de �luorescencia de
dos células de Purkinje electroporadas con Oregon Green BAPTA-1 y dibujo esquemático en el que se delimitan las áreas de los árboles den-
dríticos de cada una de las células (arriba). Imágenes �ijas de las señales de calcio en dos puntos temporales. Para la interpretación de las
señales se asigna de manera arbitraria un color a una concentración de calcio. Así, las concentraciones más bajas de calcio se representan
en azul y las más altas en rojo (abajo). Derecha: curso temporal de las señales de calcio en los árboles dendríticos de las dos neuronas. Las
barras verticales se corresponden con las fotos �ijas de la izquierda. Los cambios relativos en la �luorescencia se expresan como ΔF / F. Ex-
traído de Göbel and Helmchen. J Neurophysiol. 2007. 98:3770-9. Disponible en color

tienen la capacidad de liberar varias copias de su
genoma por célula, por lo que proporcionan niveles
de expresión elevados a largo plazo, y presentan po-
cos efectos adversos. Para conseguir especi�icidad
se pueden usar promotores especí�icos de tipo ce-
lular. Alternativamente, se pueden generar vectores
dependientes de la recombinasa e inyectarlos en
líneas de ratones con la expresión de la Cre recom-
binasa bajo un promotor especí�ico.
La generación de ratones transgénicos está en
desarrollo. Varios de los intentos para generar lí-
neas transgénicas han resultado fallidos, puesto
que no se ha conseguido la expresión de indicado-
res funcionales. Actualmente hay disponibles unas
pocas líneas. Un ejemplo sería una línea de ratón
que expresa GCamp2 en el bulbo olfatorio y que
muestra señales de calcio en respuesta a estímulos
olorosos.
Aplicaciones y limitaciones
Las técnicas de imagen de calcio se han usado prin-
cipalmente en mamíferos como la rata y el ratón,
pero también se han aplicado con éxito a inverte-
brados, como Aplysia, Drosophila y el calamar, y
otros vertebrados como el pez cebra, la rana y la
tortuga.
Los marcadores de calcio se aplican de mane-
ra relativamente poco invasiva, son muy sensibles y
permiten analizar la función de las señales de calcio
a nivel presináptico, en el terminal, o postsináptico,
en las dendritas.
La imagen de calcio obtenida mediante mi-
croscopía confocal en rodajas de cerebro o cerebelo
ha servido para demostrar que las señales de calcio
pueden estar restringidas a las espinas dendríti-
cas. Además, la administración de bloqueantes de la
transmisión sináptica durante este tipo de experi-
mentos ha servido para identi�icar los mecanismos
moleculares responsables de activar la señaliza-
ción de calcio en las dendritas de diferentes tipos
celulares. Por otra parte, se ha demostrado que las
señales de calcio en las dendritas son fundamen-
tales para que se den los procesos de depresión
sináptica a largo plazo en el cerebelo.
El registro de las señales de calcio en el ter-
minal presináptico de las neuronas piramidales de
la corteza cerebral ha demostrado que un solo po-
tencial de acción es capaz de provocar una señal de
calcio en el terminal sináptico y que las señales de
calcio de mayor intensidad están localizadas princi-
palmente en los botones sinápticos.
En los últimos años, la microscopía multi-fotó-
nica se ha combinado con la imagen de calcio para
registrar la actividad en las espinas dendríticas in
vivo (Figura 13.9). Una de sus aplicaciones ha sido la
investigación de la distribución espacial y temporal
de los inputs sinápticos en las neuronas corticales.
Recientemente, los experimentos de imagen en ani-
males despiertos han permitido analizar las señales
de calcio en respuesta a estímulos determinados y
establecer los mapas funcionales de los inputs si-
nápticos de una neurona especí�ica.
La imagen de calcio también se ha usado
extensamente para monitorizar la actividad de po-

321
Métodos en biociencias
blaciones de neuronas interconectadas. Los primeros
experimentos a nivel poblacional se realizaron para
estudiar la actividad sináptica en la corteza, el hipo-
campo y la retina. En este tipo de experimentos a
partir de las señales de calcio somáticas se in�iere la
actividad de disparo, de manera que se obtienen re-
gistros del disparo de cientos a miles de neuronas de
un circuito neuronal y a la vez, del disparo de cada
neurona individualmente. In vivo se ha investigado
la respuesta de los barriles corticales al estímu-
lo de las vibrisas o la preferencia de orientación de
las neuronas de la corteza visual. El desarrollo de
minimicroscopios portátiles ha permitido analizar
las señales de calcio en circuitos cerebrales de ani-
males despiertos que ejecutan tareas complejas.
Aunque este tipo de estudios se realiza principal-
mente en roedores, su uso se ha extendido a otras
especies, incluyendo a los primates.
Finalmente, la disponibilidad de modelos ani-
males de diversas enfermedades ha propiciado el
estudio de las señales de calcio en condiciones pa-
tológicas.
Las técnicas de imagen de calcio tienen una
elevada sensibilidad y resolución espacial. No
obstante, su resolución temporal es limitada, no
permiten detectar los cambios subumbrales más
pequeños y, aunque sirven para monitorizar poten-
ciales de acción, no permiten cuanti�icar el número
de espigas o la frecuencia de disparo. Por este mo-
tivo esta metodología no ha podido sustituir a las
técnicas de imagen de voltaje.
Por otra parte, las señales de calcio no solo res-
ponden al in�lujo de calcio a la célula a través de los
canales de voltaje de la membrana plasmática, sino
que también varían por la entrada de calcio desde
los compartimentos intracelulares, por lo que no
50 mV
1 ms
Figura 13.10: Cambios en la absorción (puntos) de un axón gi-
gante de calamar teñido con el marcador sensible a voltaje XVII
durante un potencial de acción (línea continua) registrado me-
diante electrodos intracelulares. Durante el potencial de acción la
señal del marcador sensible a voltaje re�leja con precisión los cam-
bios en el potencial de membrana. Modi�icado de Ross et al. 1977.
322
re�lejan �ielmente los cambios en el potencial de
membrana de la célula. Además, los marcadores de
calcio pueden inducir cambios en la concentración
de calcio intracelular, afectando a las medidas ob-
tenidas.
13.3.2. Técnicas de imagen de voltaje
El potencial de membrana sufre cambios rápidos
durante el transcurso de un potencial de acción así
como durante las oscilaciones subumbrales y por
ello se considera que los cambios de voltaje son la
primera señal de interés y la forma más directa para
monitorizar la actividad neural. Los marcadores
sensibles a voltaje son capaces de responder rápida-
mente a los cambios en el potencial de membrana,
aun cuando estos son de una amplitud muy baja,
por lo que proporcionan señales de elevada especi-
�icidad y resolución temporal. Estas características
hacen que esta técnica, pese a presentar importantes
limitaciones, no se haya sustituido completamente
por las técnicas de imagen de calcio.
Principio general
Los marcadores sensibles a voltaje se unen a la
super�icie externa de la membrana celular sin inte-
rrumpir el funcionamiento normal de la célula. En la
membrana celular actúan como transductores mole-
culares transformando los cambios del potencial de
membrana en cambios en la absorción o emisión de
�luorescencia. Las señales ópticas así obtenidas son
pequeñas, pero correlacionan linealmente con los
cambios en el potencial de membrana y con el área
de la membrana de todos los elementos teñidos.
La validez de las señales obtenidas con los
marcadores sensibles a voltaje quedó patente al
comprobar su elevada correlación con las señales
obtenidas mediante registros electro�isiológicos en
experimentos que combinaban ambas técnicas (Fi-
gura 13.10).
Marcadores sensibles a voltaje
La calidad de las señales obtenidas depende en gran
medida de la elección de un marcador adecuado.
Desde el comienzo del uso de la técnica, a �inales de
los años 60, hasta la actualidad, se ha realizado un
esfuerzo continuo por mejorar sus propiedades.
Marcadores sensibles a voltaje orgánicos
Estos marcadores derivan principalmente de la me-
rocianina y la hemicianina, cuyos cambios en la

Figura 13.11: Resumen esquemático de los mecanismos responsables de los cambios en las propiedades ópticas de los marcadores sensi-
bles a voltaje.
absorción o emisión correlacionan linealmente con
los cambios en el potencial de membrana y son más
rápidos que estos últimos, con tiempos de respues-
tas por debajo de los 2 µs. Debido a su naturaleza
lipo�ílica se incorporan en las membranas.
Existen varios mecanismos por los cuales un
marcador sensible a voltaje puede cambiar sus pro-
piedades ópticas en respuesta a un cambio en el
potencial de membrana (Figura 13.11):
— Redistribución: las moléculas de cromó-
foro poseen carga eléctrica y sufren un
cambio completo o parcial en su posición
dentro de la célula como consecuencia
de un cambio en el campo eléctrico de
la membrana. Como resultado, su con-
centración absoluta en la célula cambia.
Este tipo de cromóforos se conocen como
marcadores nernstianos (se redistribuyen
de acuerdo con el equilibrio nernstia-
no) o marcadores lentos (la inserción o
el desprendimiento de la membrana son
relativamente lentos, pudiendo durar
varios segundos). En esta categoría se en-
cuentran los marcadores derivados de la
carbocianina. Los cambios producidos
por este mecanismo son grandes y gene-
ran señales claras, pero no son útiles para
aplicaciones en las que las que la resolu-
ción temporal es crucial.
— Reorientación: el cromóforo está situa-
do sobre o dentro de la membrana con
una orientación particular, determinada
por la suma de fuerzas que interactúan
sobre él. Los cambios en el campo eléctri-
co actúan sobre el momento dipolar del
cromóforo, que sufre una rotación. Como
consecuencia de la nueva alineación, las
propiedades ópticas del marcador varían.
323
Técnicas de imagen funcional
La reorientación es un proceso rápido
puesto que no implica un movimiento sig-
ni�icativo del cromóforo.
— Electrocromismo: el cromóforo cambia su
estructura electrónica como resultado de
los cambios en la fuerza y dirección del
campo eléctrico externo. En consecuencia
su espectro de absorción y emisión y vida
media varían. Los marcadores electro-
crómicos típicos son polares, lipo�ílicos
y suelen ser derivados de la hemiciani-
na, que sufre una gran distribución de
sus cargas cuando se excita eléctricamen-
te. El efecto electrocrómico es rápido, ya
que solo implica una redistribución de
cargas. Como genera diferencias espec-
trales, permite monitorizar los cambios
en el potencial de membrana midiendo
las señales ópticas a longitudes de onda
especí�icas.
Los marcadores electrocrómicos o también lla-
mados rápidos son los más usados. A partir de
modi�icaciones de la hemicianina se han desa-
rrollado numerosos marcadores electrocrómicos
con diferentes propiedades de orientación e in-
serción en la membrana. di-5-ASP, di-4-ANEPPS,
di-8-ANNEPS y di-4-ANNEPPDHQ son un conjun-
to de compuestos de uso general en las técnicas
de voltaje que sirven para registrar potenciales de
acción. Los llamados marcadores azules tienen un
espectro de absorbancia y emisión desplazado ha-
cia la región de mayor longitud de onda del espectro
visible, lo que los hace útiles para los experimentos
in vivo, donde la absorbancia de cromóforos endó-
genos como la hemoglobina debe evitarse. Además,
gracias a las longitudes de onda largas permiten re-
gistrar señales de posiciones más profundas en el
tejido. Los miembros más recientes de este grupo,
Métodos en biociencias
I I
l l
- +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ -
Fluorescencia sencilla
ArcLight
Figura 13.12: GEVIs basados en la �luorescencia de una sola proteína o de un sistema FRET. D:
donador. A: aceptor.
los ANINEs, se excitan a longitudes de onda cortas y
tienen mayor solubilidad, por lo que se pueden apli-
car más fácilmente.
Los principales inconvenientes derivados del
uso de marcadores de voltaje orgánicos son los si-
guientes:
— Baja accesibilidad al tejido: no tiñen todas
las células del tejido al que se aplican. Es-
tos marcadores difunden, de manera que
se forma un gradiente desde el punto en
el que se han aplicado.
— Falta de especi�icidad: tiñen diferentes
elementos neurales, por lo que la detec-
ción e interpretación de las señales de
interés se ve di�icultada por la señal de
fondo de las células inactivas, o por las se-
ñales de células que no son el objeto de
estudio.
— Baja resolución espacial: mientras que
en las preparaciones de invertebrados se
puede llegar a registrar el potencial de ac-
ción de una única neurona, en el tejido de
mamíferos no es fácil obtener resolución
celular.
— Toxicidad
Para resolver los problemas de falta de especi�ici-
dad y resolución espacial, los marcadores orgánicos
�luorescentes se pueden microinyectar en la célula
de interés de la preparación y la señal se puede ob-
tener usando microscopía confocal o multifotónica.
De esta manera es posible visualizar los potenciales
de acción de las dendritas o las espinas dendríti-
cas. No obstante, si el marcador se libera por error
fuera de la célula durante el proceso de inyección,
324
D A
I I
A D
l l
FRET
A D A
-D +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ -
FRET
VSFP butterfly 1.2
marcará las membranas de las células de alrededor,
persistiendo el problema de inespeci�icidad.
El desarrollo de marcadores de voltaje adecua-
dos para la excitación con un fotón o dos fotones
ha permitido obtener señales de elevada resolu-
ción óptica en medios de elevada dispersión óptica,
como el tejido de los mamíferos.
No obstante, ha sido el desarrollo de marca-
dores codi�icados genéticamente el que ha resuelto
varios de los problemas derivados del uso de los
marcadores de voltaje orgánicos.
Indicadores de voltaje codificados genéticamente
(GEVIs)
Los canales iónicos y otras proteínas poseen sus
propios sensores de voltaje, que están localizados
en la membrana y expuestos a su campo eléctrico.
Los primeros GEVIs (genetic encoded voltage
indicators), como FlaSh, SPARC o VSFP1, se desarro-
llaron a partir de canales de potasio dependientes
de voltaje, o sus dominios sensores de voltaje, sin
modi�icar y fusionados a una proteína �luorescente.
La localización de estos marcadores en la membra-
na es limitada, tienen una relación señal-ruido baja,
su cinética es lenta y además son citotóxicos.
La siguiente generación de GEVIs (cuyos miem-
bros se denominan genéricamente como VSFPs) se
diseñó usando el dominio sensor de voltaje de la
fosfatasa de Ciona intestinalis (CiVSP) fusionado a
una sola proteína �luorescente o a un par de pro-
teínas. Los mecanismos de sensibilidad al voltaje
di�ieren entre las diferentes modi�icaciones genéti-
cas (Figura 13.12). En el caso más simple, el sensor
de voltaje o la molécula reportera sufren un cambio
conformacional que altera su espectro, como por

ejemplo los sensores ArcLight. Cuando hay varios
componentes se produce el fenómeno FRET. Las in-
teracciones alostéricas varían en función del voltaje
y en consecuencia se modi�ican la orientación y el
ambiente del �luoróforo, y con ello sus propiedades
ópticas. Uno de los sensores más avanzados de este
tipo es VSFP butter�ly 1.2. Los VSFPs han supues-
to una mejora notable en cuanto a integración en la
membrana, intensidad de la señal y cinética.
La ingeniería genética ha permitido el desa-
rrollo de GEVIs basados en la �luoresecencia de una
sola proteína más sensibles a los cambios de voltaje
y con una cinética más rápida. Es el caso de ASAP1,
que consiste en una GFP circular permutada (cpG-
FP) insertada en el dominio sensor de una proteína
sensible al voltaje. ASAP1 permite la detección de
trenes de potenciales de acción, potenciales subum-
bral y ondas de hiperpolarización.
Recientemente se ha desarrollado un nuevo
tipo de GEVIs basados en la modulación dependien-
te de voltaje del cofactor retinal y la rodopsina. La
rodopsina actúa como un sensor de voltaje, mien-
tras que el cofactor retinal sirve como reportero
�luorescente vía �luorescencia directa o actuando
como aceptor FRET. Comparados con los sensores
basados en Ci-VSP son extremadamente rápidos,
con cinéticas por debajo del milisegundo, y por tan-
to pueden resolver potenciales de acción sencillos
y �luctuaciones del potencial de membrana subum-
brales. Por contraposición, la señal que produce el
retinal es muy débil.
Los indicadores genéticos pueden, además, ex-
presarse en determinados tipos celulares mediante
el uso de promotores especí�icos.
Este tipo de marcadores están todavía en fase
de desarrollo y, aunque responden a los cambios
en el potencial de membrana, por el momento las
señales que emiten son de baja intensidad y sus res-
puestas son lentas (varios ms). Por el momento, el
uso de los GEVIs in vivo está limitado al cerebro de
ratón.
Indicadores de voltaje híbridos
Este tipo de indicadores combinan componentes de
los marcadores sensibles a voltaje orgánicos y los
GEVIs y se basan en un sistema FRET.
Estas estrategias comenzaron con el uso de
un derivado del oxonol como donador y una lectina
acoplada al marcador �luorescente Texas Red como
aceptor. El oxonol se inserta en la membrana y se
sitúa en la cara externa o interna dependiendo del
potencial de membrana. La membrana es imper-
325
Técnicas de imagen funcional
I I
l l
- +
- - - - -
- - - - -
+ -
Figura 13.13: Indicadores de voltaje híbridos.
meable a la lectina, que se sitúa fuera de ella. Los
cambios en la e�iciencia de transferencia de ener-
gía entre el oxonol y la lectina re�lejan la posición
del oxonol y, por tanto, los cambios en el potencial
de membrana.
Como alternativa, se ha usado un sensor de
voltaje híbrido consistente en una molécula de
GFP fusionada a un motivo farnesilado y palmotila-
do que sirve de anclaje a la membrana. El segundo
componente es un compuesto sintético, dipicri-
lamina (DPA), que sirve como sensor de voltaje y
aceptor de electrones, cuya posición en la membra-
na depende del campo eléctrico (Figura 13.13).
Recientemente se han desarrollado siste-
mas híbridos estrictamente químicos como el que
combina DPA y el marcador lipo�ílico diO. Los com-
ponentes químicos ofrecen mayor �lexibilidad, pero
su administración es más complicada.
La DPA cambia la capacitancia de la membra-
na, por lo que debe usarse a una concentración que
no altere las respuestas �isiológicas. Además, es tó-
xica y di�ícil de aplicar, por lo que el uso de estas
aproximaciones es limitado.
Administración de los marcadores de voltaje
Carga por baño
Se usa para los marcadores orgánicos. Las prepa-
raciones in vitro pueden incubarse en una solución
con el marcador, de manera que este se una a las
membranas. En el caso de los estudios de la ac-
tividad cerebral in vivo, tras abrir el cráneo y la
duramadre, se aplica el marcador sobre la super�i-
cie de la corteza. El marcador se une a la super�icie
externa de la membrana de las células, formando un
Métodos en biociencias
gradiente desde la corteza hasta la sustancia blanca.
En ambos casos el marcador se capta desde el espa-
cio extracelular y el marcaje es inespecí�ico.
Carga retrógrada
Se usa para cargar marcadores orgánicos en prepa-
raciones in vitro como, por ejemplo, las rodajas de
cerebro. El marcador se puede aplicar en forma de
solución con una micropipeta o en forma de cristal
solido sobre los troncos de los nervios. El marca-
dor difunde a través de la membrana. El marcaje es
inespecí�ico.
Microinyección
Este método se usa tras realizar experimentos de
registro intracelular. El marcador se introduce di-
rectamente en la célula y difunde hasta unirse a la
membrana plasmática. Es más especí�ico que las
dos técnicas anteriores.
Transducción viral y transgénicos
Se utiliza para los GEVIs. Se explica en el epígrafe de
«Técnicas de imagen de calcio» (13.3.1).
Aplicaciones y limitaciones
El procesamiento sensorial, la coordinación moto-
ra y las funciones cerebrales superiores se llevan a
cabo por complejas redes neuronales formadas por
millones de neuronas organizadas en columnas cor-
ticales. Para poder registrar la actividad a este nivel
es necesario una resolución de alrededor de 200
µm. Además, la comunicación en estas redes ocurre
en milisegundos. Las técnicas de imagen de voltaje
se ajustan a estos requisitos de resolución espacial
y temporal, y por ello son la mejor opción para el es-
tudio de la dinámica del procesamiento cortical. De
hecho, junto con la imagen basada en señales intrín-
secas, es la técnica más usada para el estudio de la
función cerebral in vivo.
Los primeros experimentos de imagen de
voltaje se realizaron en células en cultivo o en pre-
paraciones de invertebrado, como el ganglio de la
sanguijuela o el axón gigante de calamar, con una re-
solución celular. En el resto de casos, la técnica tiene
resolución de población neuronal.
In vitro, la técnica se ha usado principalmente
en rodajas de cerebro de ratón y hurón y su uso ha
permitido registrar la actividad del hipocampo, la
corteza visual, la corteza somatosensorial y la cor-
teza auditiva.
326
La salamandra, la rana y el ratón fueron las
primeras especies usadas para registrar in vivo la
actividad del sistema olfatorio, visual y somatoseno-
rial respectivamente. Estos primeros experimentos
se realizaron con el animal anestesiado. En los úl-
timos años se han realizado registros de voltaje en
ratón y mono despiertos.
La técnica de imagen de voltaje ha permitido
realizar mapas cerebrales funcionales, tales como
los mapas de orientación o de dominancia ocular,
de alta resolución. Gracias a experimentos in vivo,
se ha podido visualizar la dinámica espaciotem-
poral de la respuesta a estímulo sencillos, como la
estimulación de una vibrisa (Figura 13.14), o com-
plejos, como una imagen en movimiento. Además,
la exploración de las conexiones intracorticales e
intercorticales ha permitido obtener información
anatómica y �isiológica, además de funcional, de las
redes locales de la corteza visual.
La adecuada localización de los marcadores de
voltaje en la membrana es un factor crítico para la
obtención de señales mediante estas técnicas. Si el
marcador no se integra en la membrana o su posi-
ción en esta no es la correcta las señales obtenidas
no re�lejarán con precisión los cambios en el vol-
taje de la membrana. Por otro lado, la membrana
es una estructura muy �ina, de unos pocos nanó-
metros, cuya área en una imagen bidimensional es
signi�icativamente menor que la del citosol. Como
consecuencia, las señales que se obtienen median-
te marcadores de voltaje son de menor intensidad
que las obtenidas mediante indicadores de calcio.
Por tanto es necesario que los marcadores sean
muy e�icientes, utilizar fuentes de iluminación po-
tentes o promediar, espacial o temporalmente, las
señales obtenidas para que la relación señal-ruido
sea la adecuada. La baja intensidad de las seña-
les de los marcadores de voltaje es especialmente
problemática en los experimentos in vivo, donde la
auto-�luorescencia puede enmascarar las señales
especí�icas. La iluminación excesiva de la membra-
na para mejorar las señales de voltaje no resuelve
totalmente el problema, puesto que puede com-
prometer la integridad de la membrana e incluso
provocar la muerte de la célula, razón por la que la
imagen de voltaje ha caído en desuso y se ha susti-
tuido por la imagen de calcio.
Por otra parte, la membrana plasmática es solo
una porción de todas las membranas que contiene
la célula. Cualquier marcador que se una a las mem-
branas internas de la célula contribuirá a la señal
de fondo. Además, la membrana tiene una capaci-
dad limitada para albergar moléculas de marcador.
Si se sobrecarga, las propiedades de la membrana
 Técnicas de imagen funcional

Figura 13.14: Activación de las células de los barriles corticales en respuesta a la estimulación de las vibrisas. En la parte superior de la
�igura se muestran las imágenes de voltaje a diferentes tiempos tras la estimulación de una vibrisa. Los cambios relativos en la �luorescen-
cia se expresan como ΔF / F. Las concentraciones más bajas de calcio se representan en azul y las más altas en rojo. Abajo a la izquierda
se muestra el mapa funcional resultante de estimular la vibrisa D2 y se delimitan cada uno de los barriles corticales. Abajo a la derecha se
muestra la intensidad de la respuesta en cada uno de los barriles corticales. Extraído de Wang et al Eng. J Neural Eng. 2012. 9:026008.
Disponible en color.

pueden alterarse, de manera que los resultados ob-
tenidos serán artefactuales.
Finalmente, los elementos teñidos por los
marcadores sensibles a voltaje incluyen diferentes
tipos neurales (neuronas y células gliales), y dife-
rentes compartimentos celulares (soma, axón y
dendritas). Puesto que es posible que todos estos
elementos se marquen por igual, hay que considerar
que las señales ópticas tienen múltiples componen-
tes. Las señales producidas por la glía son débiles,
y lentas (se producen varios segundos después
del estímulo), por lo que es improbable que la ac-
tividad glial participe de manera signi�icativa en la
señal obtenida. En base a las diferencias en el área
de los compartimentos celulares en la corteza cere-
bral, es comúnmente aceptado que la señal óptica
en un pixel determinado procede principalmen-
te de las dendritas de las células y por tanto re�leja
actividad post-sináptica. En cualquier caso, las se-
ñales obtenidas mediante las técnicas de imagen de
voltaje son complejas por lo que se han desarrolla-
do modelos computacionales para reproducirlas y
analizarlas. Estos modelos suelen considerar que
la unidad de procesamiento en el cerebro es la co-
lumna cortical (conjunto de células de la corteza
cerebral agrupadas verticalmente que comparten
los mismos campos receptivos) y por tanto tienen
una escala de análisis mesoscópica.
13.3.3. Adquisición de imágenes funcionales
celulares
Las señales que se generan mediante las técni-
cas de imagen celular se registran por medio de
un dispositivo de captura de imagen acoplado a un
microscopio. Dependiendo de la aplicación, el mi-
croscopio se acoplará a la fuente de luz adecuada.
La adquisición de las imágenes de prepara-
ciones in vitro se realiza mediante microscopios de
campo ancho o microscopios confocales invertidos
que permiten la perfusión de la muestra. Según los
requisitos del experimento se usan junto con lám-
paras de mercurio o xenón, que permiten cambiar
fácilmente la longitud de onda de excitación. En los
experimentos en los que se realizan medidas ra-
tiométricas es necesario alternar rápidamente la
excitación a dos longitudes de onda, por lo que se
usan ruedas de �iltros. El uso de luz estroboscópi-
ca ha permitido alcanzar una elevada resolución
espacial, de manera que este parámetro está limi-

327
Métodos en biociencias
Figura 13.15: Microscopio de �luorescencia desarrollado por un
equipo de la Universidad de Standford (Gosh et al. Nat Methods.
2011. 8:871-8) (izquierda). Representación grá�ica de un ratón
con el microscopio implantado en la cabeza permitiendo que se
mueva libremente (derecha).
tado por las características de los marcadores y no
por tecnología óptica. Por lo general, la resolución
óptica de estas técnicas está en el rango de los 20-
50 µm, aunque se han llegado a alcanzar valores de
0.5 µm.
La adquisición de imágenes in vivo es una de
las principales di�icultades a las que se han en-
frentado las técnicas de imagen funcional. Los
microscopios se han adaptado a los requisitos de es-
tas técnicas mediante la incorporación de objetivos
de larga distancia de trabajo y mayor apertura nu-
mérica y �iltros multicromáticos. El uso de objetivos
de larga distancia de trabajo con una mayor apertu-
ra numérica ha permitido aumentar la resolución y
la sensibilidad, y disminuir los tiempos de exposi-
ción de la muestra y con ello la fototoxicidad. El uso
de �iltros multicromáticos también ha contribuido
al aumento de la sensibilidad y ha supuesto un au-
mento en la velocidad de captura de la imagen. Por
otra parte, la automatización de los microscopios ha
permitido realizar observaciones a largo plazo sin
la necesidad de la intervención del usuario. Pero el
avance decisivo para estas técnicas ha sido la mi-
croscopía multifotónica, la adquisición de imágenes
mediante detectores de elevada sensibilidad (como
328
las cámaras CCD o los tubos fotomultiplicadores) y
el procesamiento computarizado de las imágenes.
La microscopía multi-fotónica reduce la excitación
al volumen perifocal. En consecuencia se reduce la
fototoxicidad, se permite el seccionamiento óptico y
disminuye la dispersión de la luz.
Actualmente hay disponibles cámaras de hasta
106 (CCD) o 104 (CMOS) detectores, que funcionan a
104 Hz y que permiten obtener una elevada resolu-
ción temporal (por debajo de 1 µs) y espacial.
Finalmente, el registro de señales en animales
que se mueven libremente ha supuesto el desarro-
llo de dispositivos miniaturizados que se implantan
en la cabeza (Figura 13.15). Estos dispositivos cons-
tan de dos componentes. Un componente que se �ija
al cráneo del animal y que contiene los componen-
tes ópticos y un componente conectado al anterior a
través de �ibra óptica y que generalmente contiene
el hardware y software para el registro de imagen.
Bibliografía
Current Protocols in Neuroscience. Volume 1. 1999.
Crawley JN. John Wiley & Sons. ISBN 0471163597.
Grienberger C, Konnerth A. 2012. Imaging Calcium in
Neurons. Neuron 73:862–885.
Handbook of Neural Activity Measurement. 2012.
Brette R. Cambridge University Press. ISBN 978-
0511979958.
Imaging the Brain with Optical Methods. 2010.
Roe AW. Springer. ISBN 978-1441904522.
Logothetis NK. 2003. The Underpinnings of the BOLD
Functional Magnetic Resonance Imaging Signal. J Neurosci
23 :3963–3971.
Peterka DS, Takahashi H, Yuste R. 2011. Imaging Voltage in
Neurons. Neuron 69: 9–21.
Review Questions for MRI. 1995.
Roth CK, Faulkner WH Jr. John Wiley & Sons. ISBN
0632039051.

Transferencia génica
La transferencia génica hace referencia a la intro-
ducción en una célula de moléculas de DNA foráneo.
Este fenómeno se produce de forma natural tanto
en bacterias, durante los procesos de transforma-
ción, conjugación y transducción, como en células
eucariotas al darse algunos tipos de infección bac-
teriana o viral, incluso se puede dar entre el DNA de
orgánulos como las mitocondrias y/o los cloroplas-
tos y el DNA nuclear. Una vez transferido el DNA,
este se puede integrar o intercambiar con el DNA
de la célula dando lugar a un DNA recombinante,
como resultado de la reunión de dos DNAs de dis-
tinta procedencia.
Este capítulo se va a centrar en los mecanis-
mos de transferencia génica empleados en los
laboratorios de biología molecular, que son de gran
utilidad en estudios básicos, en biotecnología y te-
rapia génica.
14.1. El DNA recombinante
El desarrollo de la Ingeniería Genética o Tecnología
del DNA recombinante en la década de los 70 del
siglo �� proporcionó las herramientas que hacen
posible la manipulación de los genomas. Dos des-
cubrimientos fueron determinantes, el deducido
14.
Yolanda Loarce
Juan Manuel González-Triguero
por Watson y Crick de que el DNA de todos los or-
ganismos tiene la misma composición y estructura,
y el descubrimiento de las enzimas de restricción
en bacterias, que las utilizan como mecanismo de
defensa frente a la entrada de DNA extraño, degra-
dándolo.
Las enzimas de restricción son «tijeras mole-
culares del DNA», y se caracterizan por reconocer
secuencias especí�icas en la doble hélice, por donde
cortan el DNA mediante la ruptura de dos enlaces
fosfodiéster. Los blancos de las enzimas son se-
cuencias de DNA palíndrómicas con 4, 6 u 8 pares
de bases (pb), a las que se unen para cortar la do-
ble hebra, generándose dos tipos de extremos tras
el corte, romo o cohesivo, dependiendo de si los en-
laces fosfodiéster rotos se encuentran enfrentados
o no en la molécula de DNA (Figura 14.1).
Además de las enzimas de restricción, las cé-
lulas cuentan con muchos otros tipos de enzimas
de modi�icación de ácidos nucleicos que participan
en los diferentes procesos biológicos. Estas proteí-
nas, una vez identi�icadas y caracterizadas, han sido
aisladas y puri�icadas desde diferentes tipos celula-
res o virus para su utilización in vitro. Una de estas
enzimas de uso habitual en el laboratorio es la li-
gasa, que participa en la replicación promoviendo
la formación de los enlaces fosfodiéster entre los
Métodos en biociencias
Figura 14.1: Tipos de extremos de DNA generados por las enzimas de restricción. Dispo-ni-
ble en color.
fragmentos de Okazaki. La combinación de enzi-
mas de restricción con la ligasa permite la unión
de fragmentos de DNA de diferentes procedencias.
Al cortar DNAs distintos con la misma enzima de
restricción se generan fragmentos con las mismas
marcas en los extremos, que se pueden pegar fácil-
mente por la acción de la enzima ligasa, dando lugar
a una única molécula de DNA que recibe el nombre
de «DNA recombinante». Más adelante se indican
las características que deben reunir estas moléculas
sintéticas para poder ser transferidas a las células
para su clonación y expresión.
14.2. Enzimas de modificación de los ácidos
nucleicos
En la actualidad se dispone de multitud de enzimas
que permiten modi�icar los DNAs in vitro para su
ampli�icación, secuenciación, clonación y expresión
en células u organismos. En general, las enzimas de
modi�icación de ácidos nucleicos se pueden clasi�i-
car en polimerasas, nucleasas y un tercer grupo que
recoge las no incluidas en las dos categorías ante-
riores.
Las polimerasas son enzimas que sintetizan
DNA a partir de una molécula molde. Algunas tra-
bajan especí�icamente sobre DNA y otras lo hacen
sobre RNA (transcriptasas inversas). Una de sus
principales características es que carecen de acti-
vidad primasa, por lo que no pueden sintetizar de
novo una molécula de DNA, sino que necesitan un
cebador que aporte un extremo 3’-OH a partir del
cual ir añadiendo nucleótidos en dirección 5’-3’
bajo la dirección de la cadena molde.
330
Por el contrario, las nucleasas son enzimas
que degradan ácidos nucleicos ejerciendo su ac-
tividad de forma especí�ica sobre DNA o RNA,
rompiendo enlaces fosfodiéster en el interior de
la molécula (actividad endonucleasa) o a partir de
un extremo (actividad exonucleasa 3’-5’ o 5’-3’).
Algunas polimerasas tienen asociadas a su acti-
vidad de polimerización una o las dos actividades
exonucleasas. La 3’-5’ permite eliminar los aparea-
mientos incorrectos durante la síntesis, de ahí que
se la denomine «actividad correctora de pruebas»,
resultando de gran interés en los casos en los que
es necesario sintetizar DNA con una alta �idelidad
de copia.
Dentro del tercer grupo, se encuentran las
enzimas que modi�ican los extremos de las molécu-
las de DNA, favoreciendo o impidiendo la unión de
fragmentos en una reacción de ligación, actuando
sobre los elementos que participan en la forma-
ción del enlace fosfodiéster. Destacan las fosfatasas
responsables de la eliminación del grupo fosfato
del extremo 5’, y las quinasas que añaden el gru-
po fosfato en el caso de moléculas defosforiladas.
Otras enzimas como las metilasas, responsables
de adición de grupos metilo (-CH3), o la transfera-
sa terminal, que se encarga de la incorporación de
nucleótidos trifosfatos (dNTPs) a un extremo de la
molécula, añaden elementos nuevos a las moléculas
para facilitar su análisis o caracterización.
14.3. Clonación de DNA en bacterias
El análisis y caracterización estructural de un geno-
ma requiere de su fragmentación y multiplicación

para tener cantidad su�iciente de cada fragmen-
to obtenido. Una forma de mantener y multiplicar
(clonar) los fragmentos de DNA genómico (gDNA) o
de DNA copia (cDNA) si proceden de la retrotrans-
cripción de una población de RNAs mensajeros es
mediante su introducción en bacterias, donde se re-
plicarán y transferirán a las células hijas, proceso
conocido como Transformación. Es importante que
el DNA transferido se mantenga sin degradar en el
interior de la bacteria, se replique y se reparta du-
rante la división. Para ello es necesaria la inclusión
del fragmento que se desea clonar en una molécu-
la de DNA vector, de la que depende la replicación
autónoma dentro de la bacteria y el reparto entre
las células hijas. La unión de los dos DNAs da lugar
a una molécula de DNA recombinante, constitui-
da por el inserto (fragmento de DNA que se quiere
clonar) y el vector. El conjunto de clones que contie-
nen en forma de fragmentos aleatorios el genoma
completo en estudio, o los cDNA si se trata de los
productos de expresión de un tipo celular parti-
cular, reciben el nombre de Genoteca o Librería
genómica o de cDNA, respectivamente.
Se cuenta con diferentes tipos de vectores de
clonación, unos de origen natural y otros sintéticos.
La elección de un tipo u otro depende fundamen-
talmente del tamaño del fragmento que se quiere
clonar, generalmente mayores en las genotecas ge-
nómicas y menores en las de cDNA (Cuadro 14.1).
Cuadro 14.1: Tipos de vectores utilizados en la clonación de fragmentos de DNA derivados de digestiones de genomas completos (genote-
cas genómicas) y de cDNA producto de retrotranscripción de una población de mensajeros (genotecas de cDNA).
Tipo de vector Tamaño del inserto (Kb)
GENÓMICAS 9-23
Lambda
Cósmido 30-45
Fago P1 (PAC) 50-100
Factor F (BAC) 50-300
YAC (levadura) 200-1000
DNAc 0.5-7
Lambda
331
Transferencia génica
En el caso de fragmentos pequeños de DNA (menor
de 3 kpb) es habitual la utilización de los plásmidos,
que son moléculas de DNA duplexo circular presen-
te de forma natural en muchas especies bacterianas,
y que se replican de forma autónoma al genoma
bacteriano. Los plásmidos no son indispensables
para la bacteria, pero pueden contener genes que
le aporten alguna característica de interés. Cuan-
do se desea transformar bacterias con plásmidos
recombinantes, es necesario tratar químicamente
las bacterias para conseguir un estado �isiológico
de «competencia» durante el cual las bacterias son
más permeables a la entrada de DNA del exterior.
Las bacterias competentes se mezclan con el DNA
recombinante, y se les aplica un cambio brusco de
temperatura (choque térmico) o una corriente eléc-
trica (electroporación) de 1.5-1.8 Kv, procesos que
favorecen la entrada del DNA en la bacteria.
A veces se utilizan vectores derivados de virus
bacterianos (bacteriófagos o fagos), como es el caso
del fago λ, porque tienen la ventaja de que al infectar
las bacterias inyectan el DNA recombinante, aunque
estas no se encuentren en estado competente.
Entre los vectores sintéticos se encuentran los
cósmidos, que reúnen características de los plásmi-
dos (el origen de replicación para su mantenimiento
en el interior de la bacteria) y de los fagos (mecanis-
mo de infección). Aunque los cósmidos son capaces
de albergar fragmentos sensiblemente mayores que
Ventaja Desventaja
Fácil propagar y amplificar Inserto relativamente
pequeño
Mayor tamaño de inserto Más difícil de rastrear
Hasta 100 Kb Empaquetamiento variable
Hasta 300 Kb Dificultad para transfor-
mación
Genoma humano en 5000 Reordenaciones
clones
Fácil rastreo y almacenaje Pocas
Métodos en biociencias
Figura 14.2: Esquema del vector pBluescript.
los plásmidos y fagos, para la clonación de fragmen-
tos genómicos muy grandes se recurre a otro tipo
de vectores como los BACs (cromosomas arti�icia-
les bacterianos) y los YACs (cromosomas arti�iciales
de levaduras).
Independientemente del tipo de vector elegido
para la clonación de un determinado fragmento de
DNA, todos deben tener una serie de características
mínimas para ejercer su función: un origen de re-
plicación que permita la duplicación de la molécula
de DNA recombinante y de forma independiente al
genoma bacteriano; un gen marcador que permita
seleccionar las bacterias transformadas (ej. algún
gen de resistencia a antibióticos); y secuencias dia-
na para distintas enzimas de restricción, que van a
cortar al vector por un único sitio (sitio de clona-
ción).
Con el tiempo, los vectores de clonación se
han optimizado. Actualmente se cuenta con vecto-
res con orígenes de replicación modi�icados para
obtener un elevado número de copias en el inte-
rior de la bacteria, además contienen una región
con múltiples dianas de restricción únicas, que les
proporciona una gran versatilidad para la clonación
(polylinker). También pueden incluir sistemas de
detección que permitan una discriminación rápida
entre las bacterias transformadas con moléculas de
DNA recombinante o con moléculas de vector o de
inserto, de las no transformadas.
Un ejemplo de plásmido mejorado es Blue-
script (Figura 14.2). Este vector cuenta con 2 genes
332
marcadores de selección, el gen de resistencia al an-
tibiótico ampicilina y el gen lac Z, que codi�ica para
el extremo amino terminal de la proteína β-galac-
tosidasa y que le permite a la bacteria metabolizar
el galactósido X-gal que se añade al medio sóli-
do de cultivo bacteriano. Este gen se localiza en el
polylinker, por lo que su expresión dependerá de
que en el sitio de clonación no se haya insertado
ningún fragmento de DNA, permitiendo diferenciar
colonias de las células transformadas por su color
blanco.
Hay que tener en cuenta que, a pesar de que
se optimizan las condiciones de la reacción para
fomentar la ligación del fragmento de DNA con la
molécula de vector, además del DNA recombinante
hay moléculas de vector y del inserto que que-
dan sin ligar y algunas moléculas del vector que
vuelven a cerrarse. Todas estas moléculas son sus-
ceptibles de transformar a las bacterias, pero el
crecimiento de las mismas en un medio selectivo en
presencia del antibiótico ampicilina sólo permitirá
el crecimiento de las bacterias resistentes, es de-
cir aquellas que han adquirido DNA recombinante
o DNA vector. Estas bacterias formarán colonias en
la placa de cultivo y se diferenciarán por su color, ya
que las colonias procedentes de bacterias con molé-
culas de vector tienen el gen Lac Z intacto, pudiendo
metabolizar el galactósido del medio y serán de co-
lor azul. Sin embargo, en las colonias procedentes
de bacterias transformadas con DNA recombinan-
te, el inserto incluido en el polylinker inactiva el gen

Figura 14.3: Placa con colonias blancas (con
inserto) y grises (sin inserto) fruto de la transfor-
mación con pBluescript. En una imagen en color
las colonias grises serían azules.
Lac Z que ya no produce la enzima capaz de meta-
bolizar el X-gal, y por lo tanto serán de color blanco
(Figura 14.3).
Otro aspecto importante del proceso de clo-
nación de DNA recombinante en bacterias es el de
su utilización como factorías para la producción de
proteínas de interés biotecnológico. En estos casos
los vectores utilizados para la clonación (vectores
de expresión) deben contener en su secuencia los
motivos que permitan la expresión del fragmen-
to clonado (transcripción y traducción), además de
las características generales de los vectores de clo-
nación ya mencionadas. Uno de estos motivos clave
para la expresión es la presencia de un promotor
fuerte e inducible, que es el elemento que recono-
ce la RNA polimerasa, enzima responsable de la
transcripción. Para facilitar la síntesis de proteínas,
a continuación del promotor, el vector de expresión
incluye una secuencia de reconocimiento de riboso-
mas (RBS) que, una vez transcrita en el mensajero,
facilita la unión de este al rRNA 16s del ribosoma
donde tiene lugar la traducción. También el vector
debe contener una señal de terminación de la trans-
cripción, que determina que la RNA polimerasa y
el RNA recién formado se suelten del DNA molde.
Además, antes o después del sitio de clonación, el
vector de expresión puede contener la secuencia de
algún gen que codi�ique una proteína que quedará
fusionada a la del gen clonado (proteína de fusión),
que puede facilitar la detección, aislamiento o puri-
�icación posterior de la proteína de interés (Figura
14.4).
333
Transferencia génica
Figura 14.4: Esquema de un vector de expresión.
14.4. Clonación de DNA en células eucariotas
Aunque la sobreexpresión de genes clonados en
Escherichia coli ha facilitado la síntesis a escala
industrial de muchas proteínas procariotas y euca-
riotas (insulina humana, hormona del crecimiento,
etc.), este sistema no está exento de problemas. A
veces, las proteínas eucariotas producidas en las
bacterias son inestables, lo que reduce su concentra-
ción y, otras veces, estas proteínas forman cuerpos
de inclusión insolubles que deben ser rotos por tra-
tamientos químicos agresivos. En ocasiones, las
proteínas eucariotas son expresadas en el interior
de la bacteria, pero para ser funcionales necesitan
de modi�icaciones y plegados postraducionales, lle-
vados a cabo por enzimas ausentes en E. coli y que
son necesarias en procesos de glicosilación, γ-car-
boxilación, formación de puentes disulfuro, roturas
proteolíticas, etc. En aquellas situaciones en las que
las bacterias son incapaces de expresar correcta-
mente las proteínas, se recurre a la clonación en
sistemas celulares eucarióticos (levaduras y líneas
celulares derivadas de células madre embrionarias
o tumorales) o se producen en plantas o animales
transgénicos.
En general, el proceso de introducción de
DNA en células eucariotas se denomina transfec-
ción, haciéndose distinción entre transfección
estable y transfección transitoria, dependiendo de
la integración o no del DNA foráneo (transgén) en
el genoma nuclear. Hay varios mecanismos para in-
troducir DNA en las células eucariotas. Algunos de
ellos son similares a los utilizados en la transforma-
ción bacteriana, como el de la electroporación, que
aplica descargas eléctricas de alto voltaje (2-4 Kv)
Métodos en biociencias
a las células para producir poros de nanómetros en
la membrana; la permeabilización de la membra-
na con sales de litio y polietilén glicol y posterior
choque térmico utilizado en levaduras; o la copreci-
pitación de DNA con fosfato de calcio con el que se
consigue que hasta un 90% de las células adquieran
el DNA por endocitosis, aunque en menos del 5%
se incorpora al genoma celular. Otras herramientas
con un alto porcentaje de éxito son el bombardeo
y la microinyección. La primera utiliza partículas
de oro o tungsteno recubiertas de DNA, que se dis-
paran a gran velocidad mediante una descarga de
helio como si fuera una pistola, y la segunda co-
loca el DNA en el núcleo de células mediante una
microinyección, evitándose así la degradación cito-
plasmática y lisosomal.
También hay mecanismos de introducción
del transgén mediados por vectores (liposomas,
plásmidos bacterianos o virus). Los liposomas ca-
tiónicos se encuentran cargados positivamente e
interaccionan con la carga negativa del DNA, siendo
su principal ventaja la protección del transgén has-
ta su llegada al núcleo, aunque presentan una baja
e�iciencia de transfección. Los plásmidos bacteria-
nos utilizados como vectores de transfección deben
contener las secuencias que permitan la expresión
del transgén en la célula eucariota: promotor euca-
riótico, secuencias de poliadenilación, péptido líder
o secuencias que faciliten el posterior aislamien-
to de la proteína, etc. Especial atención requiere la
utilización de virus manipulados para aprovechar
la e�iciencia de la infección viral como método de
introducción de DNA, utilizándose actualmente vec-
tores que carecen de casi todas las secuencias del
genoma vírico original, de los que se citarán algu-
nos ejemplos más adelante.
La introducción del transgén en el interior de
la célula eucariota ha de ser monitorizada de ma-
nera e�icaz. La mayoría de los genes introducidos
no con�ieren a la célula ninguna característica espe-
cial que las distinga de las células no transfectadas,
por lo que junto al gen de interés hay que introdu-
cir genes marcadores. Se diferencian dos tipos de
marcadores: a) genes señal que con�ieren una carac-
terística diferencial a las células portadoras, como
puede ser un color distinto y b) genes de selección
propiamente dichos, que con�ieren una venta-
ja proliferativa que permite eliminar las células no
portadoras. Entre los genes señal más utilizados se
encuentran el que codi�ica la proteína �luorescente
verde (GFP) y la β-galactosidasa, responsables de la
coloración verde y azul respectivamente de las célu-
las en las que se expresan. Otros genes señal, como
los que codi�ican la β-glucurodinasa (color azul), la
334
luciferasa (color amarillo) y la cloranfenicol acetil
transferasa (CAT) que origina un producto de mi-
gración diferencial en una cromatogra�ía de capa
�ina, son utilizados exclusivamente en análisis de
expresión transitoria, por el mayor grado de toxici-
dad de las proteínas codi�icadas.
En los ensayos de transferencia génica a célu-
las eucariotas animales, los genes de selección que
incluyen los vectores suelen ser de dos tipos: a) ge-
nes que con�ieren resistencia a antibióticos y b)
genes implicados en el metabolismo de las bases ni-
trogenadas.
Los genes que con�ieren resistencia a anti-
bióticos más utilizados en transfección son: neo
(aminoglicósido fosforibosil transferasa) que con-
�iere resistencia a neomicina o a su análogo G418;
puro (puromicin acetil transferasa) que con�iere
resistencia a puromicina; e higro (higromicina B
fosfotransferasa) que con�iere resistencia a higro-
micina. Todos ellos actúan como genes de selección
positiva, es decir, las células que han captado el DNA
recombinante, que incluye un gen de resistencia a
un antibiótico, serán las únicas capaces de crecer
en un medio de cultivo al que se le ha añadido di-
cho antibiótico, que será inactivado por la acción
del producto del gen mediante la transferencia de
un grupo acetilo en el caso del gen puro, de un fosfa-
to como en el caso del gen higro, etc.
Un segundo tipo de genes de selección son los
que intervienen en la síntesis de novo o en el reci-
clado celular de las bases púricas o pirimidínicas.
Los genes tk+ (timidinaquinasa) y hprt+ (hipoxantin
fosforibosil transferasa) actúan reciclando nucleósi-
dos de timina y guanina respectivamente, mediante
la fosforilación. Para poder utilizarlos como genes
marcadores, las células receptoras deben carecer
de esta función génica (tk- y hprt-). El mecanismo
de acción es el siguiente, tras la transfección, las cé-
lulas se ponen a crecer en un medio de cultivo en
presencia de aminopterina, compuesto que inhibe
la síntesis de novo de las bases nitrogenadas. Una
célula tk- o hprt- no podría crecer en presencia de
aminopterina salvo que hubiera sido transfectada
con un DNA exógeno portador del gen tk+ o hprt+.
El gen hstk+ (timidina quinasa de herpes sim-
ple), funciona como un gen de selección negativa. En
este caso las células hstk- que capturan el gen hstk+
mueren en presencia del compuesto químico ganci-
clovir, que es un análogo de guanina, tóxico para la
célula. La quinasa producto del gen hstk+ fosforila el
ganciclovir que se incorpora al DNA durante la re-
plicación causando la muerte celular (Figura 14.5).
La aplicación de este gen de selección negativa se

Figura 14.5: Selección positiva (en presencia del antibiótico) y negativa (en presencia de ganciclovir) de célula
transfectadas. Disponible en color.
verá durante el proceso de obtención de ratones
knockout.
14.4.1. Vectores virales
El mecanismo de infección viral ha convertido a los
virus en el vehículo de DNA preferido en los ensa-
yos de transfección. Están compuestos por un DNA
o RNA rodeados de una cubierta proteica y, en al-
gunos casos, una envuelta lipoproteica, y durante el
ciclo biológico viral su genoma se puede integrar en
el genoma de la célula a la que infecta. El genoma
del virus consta de todos los genes necesarios para
su replicación y empaquetamiento, por lo que tie-
ne que ser manipulado convenientemente para que
pueda ser utilizado como vector. Los vectores vira-
les deben prescindir de aquellas partes del genoma
que permitan su replicación en las células u orga-
nismos infectados, y deben tener la capacidad de
albergar el DNA de interés que se quiere transferir,
de ahí que reciban el nombre de virus recombinan-
tes defectivos. Se pueden diferenciar 4 etapas en el
proceso de transfección mediado por vectores vi-
rales: 1) construcción del vector viral conteniendo
el gen que se quiere transferir; 2) transferencia del
DNA recombinante a células empaquetadoras, que
incluyen en su genoma los genes virales ausentes en
el vector, pero que son necesarios para la construc-
ción de las partículas virales; 3) obtención de los
viriones defectivos; y 4) infección con los viriones
a las células diana trans�iriendo el DNA de interés.
En la �igura 14.6 se muestra un ejemplo de transfec-
ción mediada con un vector retroviral, portador de
las secuencias LTR (long tandem repeats) del retro-
335
Transferencia génica
virus, que delimitan la región transcrita que se va a
empaquetar en las partículas víricas. Sin embargo,
el vector carece de los genes gag, pol y env, que co-
di�ican las proteínas que forman la cápside del virus
y la transcriptasa inversa, imprescindibles para la
formación de los viriones. Estos genes forman par-
te del genoma de las células empaquetadoras donde
se producirán los virus defectivos.
Los vectores virales más utilizados derivan
de diferentes tipos de virus: Retrovirus (oncovirus
murinus tipo C y lentivirus derivados del HIV-1),
Adenovirus (serotipos 2 y 5), Adenoasociados y
Herpesvirus (herpes simplex HSV), etc.
14.4.2. Transferencia génica para inactivación
o modificación de genes endógenos
El análisis genético clásico está basado en la apa-
rición aleatoria de mutaciones que producen un
cambio fenotípico detectable y heredable, que da
información sobre la función del gen responsable
de ese fenotipo particular. Es decir, el fenotipo da
información sobre el genotipo. Sin embargo, la Inge-
niería genética ha proporcionado las herramientas
para abordar el análisis en sentido contrario, es
decir, los genes son modi�icados in vitro y se intro-
ducen en células u organismos donde analizar las
consecuencias de la modi�icación, proporcionando
pistas sobre la función del gen. Este tipo de análisis
recibe el nombre de Genética reversa ya que el ge-
notipo nos da información sobre el fenotipo.
Hay diferentes estrategias para la modi�ica-
ción de los genes en el laboratorio, dependiendo
de si la mutagénesis que se persigue es al azar o
Métodos en biociencias
Figura 14.6: Construcción de virus retrovirales defectivos en células empaquetadoras portadoras de
los genes gag, pol y env. Disponible en color.
dirigida a un sitio especí�ico. En general, se recu-
rre a una combinación de enzimas de restricción,
polimerasas o nucleasas y ligasa que permiten la in-
serción o deleción de nucleótidos de una molécula
de DNA clonada. También, el tratamiento del DNA
con algunos agentes químicos (Bisul�ito sódico) o
análogos de bases (2-aminopurina, 5-bromouracilo,
etc.), que producen cambios en los apareamien-
tos de las bases durante la replicación, tiene como
consecuencia la introducción de cambios tras un
ciclo de síntesis in vitro. El principal problema de
estos métodos químico-enzimáticos es que se pue-
den producir múltiples sustituciones en un único
mutante, lo que complica la interpretación de los
resultados. En la actualidad casi todos estos mé-
todos han sido reemplazados por los que utilizan
oligonucleótidos sintéticos de secuencia conocida.
Una forma sencilla de introducir la mutación es me-
diante la utilización de cebadores que incluyan la
sustitución en ampli�icaciones por PCR. Una única
modi�icación en la secuencia del cebador no impide
su unión a la región homóloga, y una vez anillado y,
siempre que la diferencia no se encuentre en la po-
sición 3’, la polimerasa lo utilizará para la síntesis
de la nueva cadena. Esta cadena recién sintetizada
incorpora el cambio y servirá de molde para la sín-
tesis de nuevas cadenas en los siguientes ciclos de
replicación por PCR.
336
Una vez introducido el DNA recombinante con el
gen modi�icado en las células, este se puede integrar
al azar en una región del genoma receptor median-
te recombinación heteróloga o, por el contrario,
producir el reemplazo del gen endógeno mediante
recombinación homóloga. Este tipo de recombina-
ción es muy frecuente en bacterias y levaduras pero
muy rara en células de mamífero. La sustitución di-
rigida de genes o «gene targeting» proporciona una
herramienta muy útil para inactivar genes, pero al
tratarse de un hecho raro (3.3x10-7 de las células
transfectadas) se han desarrollado estrategias para
seleccionar o enriquecer las células transfectadas
en las que se ha producido la recombinación homó-
loga. Una de estas estrategias denominada de Doble
selección (positiva-negativa) es la que se utiliza
desde la década de los 80 del siglo pasado para la
sustitución dirigida de genes en células madre em-
brionarias (ES) de ratón, que pueden cultivarse de
forma inde�inida en placas de Petri y están capacita-
das para originar cualquier línea celular.
El sistema de doble selección se basa en la uti-
lización de dos genes marcadores de selección, que
forman parte de la molécula de DNA recombinante
portadora del gen de interés. Uno de los marcado-
res es un gen de selección positiva de resistencia a
un antibiótico (neomicina) que se introduce en el
centro del gen de interés inactivándolo, y el segun-

Figura 14.7: Sistema de doble selección.
do gen marcador es el hstk+ de selección negativa
que se sitúa en la molécula a continuación del gen
clonado. El primero permitirá la selección de cé-
lulas transfectadas frente a las que no lo hicieron,
y el segundo permitirá discriminar entre aquellas
en las que la integración en el genoma celular se
produjo al azar o en el sitio homólogo al gen clo-
nado. En la mayoría de las integraciones al azar
la recombinación tiene lugar en los extremos de
la molécula transfectada, por lo que los dos mar-
cadores se incorporan al genoma. Sin embargo, la
recombinación homóloga requiere del intercambio
con los fragmentos de DNA celulares homólogos, in-
corporándose de esta manera solo el marcador neo+
y no hstk+. Por lo tanto, la doble selección en pre-
sencia del antibiótico y de ganciclovir (análogo a la
guanina activado por el gen hstk+ nocivo para las cé-
lulas) asegura el crecimiento de las células en las
que se produjo la recombinación homóloga, ya que
el ganciclovir matará las células transfectadas con
el DNA recombinante integrado al azar y que expre-
san hstk+ (Figura 14.7).
La posibilidad de manipular genéticamente
los ratones, organismos cuya organización genómi-
ca y �isiología es parecida a la de los humanos, ha
convertido al ratón en el organismo modelo prefe-
rencial para el estudio de la función de los genes y
de la causa de enfermedades compartidas (cáncer,
diabetes, ansiedad…) y diferentes a las humanas,
ya que la manipulación de sus genes puede llevar-
los a desarrollar otras patologías que naturalmente
no les afectan. Las células ES modi�icadas de ratón
se introducen en embriones muy jóvenes y se deja
que se desarrollen a término. Estos ratones son una
quimera, dado que solo alguna de sus células estará
337
Transferencia génica
modi�icada, y, cuando alcanzan la madurez, pueden
producir esperma derivado de las células ES modi-
�icadas. Cruzando estos ratones con otros normales,
se conseguirán descendientes heterocigotos para la
mutación, es decir, portadores en todas sus células
de una de las dos copias del gen manipulado, pero
que serán sanos porque la segunda copia del gen,
intacta, seguirá funcionando correctamente. El cru-
zamiento entre ratones hermanos heterocigotos
permitirá la obtención de ratones homocigotos para
la mutación (knockout), que exhibirán las anomalías
que revelan las funciones normales del gen sustitui-
do en todas las células. La �igura 14.8 muestra un
ejemplo de este procedimiento para la obtención de
ratones knockout.
Los ratones knockout permiten estudiar efec-
tos de los genes cuyos productos génicos han sido
anulados, siempre que estos no sean vitales para
el desarrollo del ratón. Para el análisis de la fun-
ción de estos genes imprescindibles se recurre a
la tecnología Cre/loxP que permite la generación
de ratones knockout condicionales, en los que se
induce la anulación de la expresión del gen en un
tejido o momento particular del desarrollo. El me-
canismo fue descubierto en el bacteriófago P1 y
se basa en la enzima Cre-recombinasa que catali-
za la recombinación entre dos sitios loxP, que son
secuencias especí�icas de DNA de 34 pb. La coloca-
ción y orientación de los sitios loxP a ambos lados
de una secuencia de DNA a recombinar determina-
rán la región a escindir en el genoma, mientras que
la disponibilidad de la enzima Cre establecerá cuán-
do y dónde se produce la recombinación al estar
bajo el control de un promotor especí�ico de tejido.
Métodos en biociencias

Gen de interés
inactivo
neoR

Vector hstk
retroviral

Transfección
CME de ratón
génica

Extracción de neomicina ganciclovir

Blastocistos de ratón (Selección (Selección
positiva) negativa)

Implantación en madre
Reimplante en
pseudopreñada
blastocisto

F1 ratones quiméricos
CME transfectada.
X   Recombinación homóloga
Retrocruces para la obtención de
ratones heterocigotos para el gen
inactivado
X  

Ratón homocigoto para el gen inactivado (knockout)

que mostrará las anomalías que revelan las
funciones del gen sustituido

Figura 14.8: Procesos involucrados en la generación de ratones knockout. El vector con el gen knockout es transfectado
Fig.  1en4.8  
células madre embrionarias (CME) de ratón. Las CME son cultivadas con neomicina, para seleccionar las células que in-
corporaron el vector (selección positiva) y con ganciclovir, el cual selecciona las células que realizaron una recombinación
homóloga (selección negativa). Las CME knockout son implantadas en un blastocisto de ratón y este, a su vez, es implan-
tado en una madre pseudopreñada; la descendencia corresponde a ratones quiméricos. Mediante retrocruces se obtienen
ratones homocigotos knockout para el gen inactivado. Disponible en color.

Normalmente, se desarrollan cepas de ratón
Cre y cepas loxP por separado y se cruzan para ob-
tener una cepa Cre-lox, que ante la presencia de un
inductor inactivará el gen diana exclusivamente en
el tipo celular especi�icado por el promotor (Figu-
ra 14.9).
Edición genómica
Una herramienta muy versátil para la modi�icación
genómica dirigida es el diseño de endonuclea-
sas que corten la doble hebra del DNA nuclear por
secuencias predeterminadas, permitiendo la inte-
gración del transgén por recombinación homóloga,
siempre que esté �lanqueado por secuencias ho-
mólogas a las presentes en el sitio de inserción. Un
ejemplo de estas enzimas endonucleasas son las
ZFNs (zinc �inger nucleases), moléculas híbridas
formadas por un dominio polimérico Zinc-�inger
encargado del reconocimiento y unión especí�ica al
DNA diana, y un dominio nucleasa FokI encargado
del corte. Son necesarias dos moléculas ZFN unidas
a dos secuencias diana contiguas separadas por 6pb
para que se produzca la rotura de la doble hélice. La
frecuencia de recombinación homóloga mediante el
uso de ZFNs es del 1-17% de las muestras, mucho
más alta que la producida en ausencia de las enzi-
mas que ocurre con frecuencias entre el 0.01% y
0.001%. Este sistema se ha utilizado con éxito en
la modi�icación dirigida (knockin) de distintos tipos
celulares en cultivo, incluidos las ES e IPS (células
pluripotentes inducidas) humanas, y para modi�i-
car secuencias del genoma celular en el contexto de
la edición para terapia génica.
La edición genómica empleando las ZFNs es
técnicamente compleja. En los últimos años se ha
comenzado a utilizar un nuevo método de edición
basado en un mecanismo inmunitario adaptati-
vo de defensa presente en bacterias y arqueas, que
ha sido denominado CRISPR/Cas (clustered regu-
larly interspaced short palindromic repeats/crispr
associated genes), y en el que las bacterias pueden

338

Figura 14.9: Ejemplo del procedimiento para la obtención de ratones knockout condicionales me-
diante la tecnología Cre/loxP.
incorporar fragmentos de DNA procedentes de
bacteriófagos, o que han sido transferidos horizon-
talmente desde otras especies mediante procesos
de conjugación o transducción. Los fragmentos in-
corporados al cromosoma bacteriano van a servir
para que la bacteria pueda reconocer nuevas inva-
siones y hacer frente a ellas. El primer locus CRISPR
se identi�icó en E. coli y está constituido por una
serie de repeticiones directas cortas que están se-
paradas por otras secuencias únicas denominadas
espaciadores. Se han identi�icado otros elementos
relacionados con el locus CRISPR como es una se-
cuencia rica en AT que lo precede y que recibe el
nombre de secuencia líder, y un conjunto de genes
próximos al locus CRISPR que codi�ican proteínas
que intervienen en su funcionamiento, y que se les
ha denominado Cas (crispr associated genes).
A raíz de estos descubrimientos se ha desa-
rrollado una nueva tecnología de editado genómico
denominada «tecnología CRISPR-Cas», en la que
se utilizan moléculas de sgRNA (single guide RNA)
para dirigir endonucleasas como Cas9 a secuencias
especí�icas de DNA, donde realizarán cortes en si-
tios concretos de la doble hélice del DNA (DSBs).
Las roturas producidas estimulan los mecanismos
339
Transferencia génica
de reparación de la célula, el de unión de extre-
mos no-homólogos (NHEJ), o bien el mecanismo
de reparación directa por homología (HR: homo-
logy-directed repair). El primero de ellos puede
producir adiciones o deleciones de nucleótidos en
el lugar de la rotura pudiendo dar lugar al knock-
out o silenciamiento del gen al que se ha dirigido
la tecnología CRISPR-Cas. En el segundo mecanismo
se necesita un segmento de DNA como molde para
corregir o reemplazar al gen diana y, aunque este
segundo mecanismo presenta una e�icacia mucho
menor, produce modi�icaciones especí�icas en una
secuencia concreta. Con esta tecnología se pueden
modi�icar desde un único par de bases a fragmen-
tos de centenares de pares de bases, lo que permite
«knockear» o silenciar genes especí�icos, reparar
mutaciones o incorporar un nuevo fragmento de
DNA en una localización concreta del genoma (Fi-
gura 14.10).
14.5. Transgénesis animal
El ratón es el organismo modelo para el estudio de
patologías humanas y también para el ensayo de
Métodos en biociencias

Figura 14.10: Esquema de la edición genómica empleado la tecnología CRISPR-Cas.

La molécula de RNA guía, dirige a la nucleasa Cas9 hacia la secuencia de DNA dia-
na, produciendo una doble rotura en la molécula de DNA duplexa a tres pares de
bases de la secuencia PAM (protospacer adjacent motif). Esta doble rotura puede
ser reparada mediante el mecanismo NHEJ (unión de extremos no homólogos), que
produce adiciones o deleciones en el genoma, o bien mediante el mecanismo HDR
(Reparación por homología directa), que permite modi�icar una secuencia concreta
o bien añadir un fragmento de DNA en una posición especí�ica del genoma. Esque-
ma modi�icado de Liu y Fan, 2014.

fármacos. Sin embargo, las diferencias �isiológicas
y metabólicas con el hombre son muy grandes, por
ello se iniciaron ensayos en otros organismos que
re�lejan mejor nuestra �isiología que la de los mo-
delos de roedores. Los modelos transgénicos de
animales de granja han ido ganando importancia en
la experimentación biomédica y farmacéutica, pero
la transgénesis en especies domésticas es toda-
vía ine�iciente y cara, hecho que se irá solventando
según se vaya disponiendo de auténticas células
madre embrionarias de estos animales.
14.5.1. Métodos de transferencia génica
Los métodos comunes de transferencia génica uti-
lizados con animales domésticos son: la inyección
pronuclear (pronuclear injection, PNI) o citoplásmi-
ca de cigotos con DNA, y la transferencia de células
somáticas (somatic cell nuclear transfer, SCNT)
transgénicas a ovocitos previamente enucleados.
Otros mecanismos de transfección empleados en la
obtención de transgénicos son la inyección de len-
tivirus defectivos portadores del transgén dentro
del espacio perivitelino, y la transferencia de DNA
vía esperma, proceso en el que el transgén se incu-
ba con el esperma para posteriormente inyectarlo
al citoplasma del ovocito y que recibe el nombre
de Inyección Intracitoplásmica de esperma (intra-
cytoplasmic sperm injection, ICSI). La �igura 14.11
muestra un dibujo esquemático de cada una de las
técnicas mencionadas.
Para que el transgén pueda integrarse en el
genoma nuclear, debe haber roturas de la doble he-
bra del DNA receptor (double strand breaks, DSBs).
Aunque el DNA es una molécula muy estable, ciertos
factores introducen cortes en el DNA, ya sea por la
exposición natural a mutágenos �ísicos o químicos
ambientales (radiación de fondo, luz ultravioleta,
radicales de oxígeno) o bien por la acción de enzi-
mas codi�icadas por genes incluidos en el sistema
de transferencia, que de forma ectópica catalizan
la recombinación del transgén (sistemas de trans-
posones, recombinasas, endonucleasas de diseño e

340

DNA lineal (transgén)
Cigoto
Inyección
capilar
Zona
pelúcida
Pronúcleos
Inyección pronuclear (PNI): Las Transferencia del núcleo de
moléculas de DNA linearizadas células somáticas (SCNT)
son inyectadas en un
pronúcleo mediante un capilar
fino
DNA plasmídico circular
Cigoto
Inyección citoplásmica de
plásmidos (CPI)
Figura 14.11: Técnicas comunes de transferencia génica en animales.
Fig.
 14.11
integrasas víricas). Cuando la transgénesis no está
dirigida por enzimas, el DNA foráneo se integra al
azar en el genoma y recibe el nombre de «transgé-
nesis pasiva» para diferenciarlo de la «transgénesis
activa» dirigida por los sistemas enzimáticos men-
cionados.
En el núcleo, las roturas de la doble hélice pue-
den ser reparadas por dos vías distintas: sistema de
reparación ilegítima de los extremos rotos (non-ho-
mologous end joining, NHEJ) que genera inserciones
o deleciones en el sitio de rotura; y por recombi-
nación homóloga (HR) a través de un DNA molde
que produce una reparación perfecta de la secuen-
cia, o un reemplazamiento de esta, si el DNA molde
utilizado incluye una modi�icación en la secuencia
de nucleótidos. En el caso de transgénesis pasiva,
es el sistema NHEJ el encargado de la integración
del transgén, con el inconveniente de que no se
integra una sola copia, sino varias de forma conca-
tenada y en regiones del genoma susceptibles de
silenciamiento y modi�icaciones epigenéticas. Por
el contrario, los sistemas de transgénesis activa in-
troducen una única copia del transgén por la acción
previa de las enzimas que producen los DSBs en el
genoma. Además, alguno de estos sistemas enzimá-
ticos como el de las Zinc-�inger nucleasas (ZFNs) y
el de CRISPR-cas pueden asociarse a sistemas de
reparación por HR, abriendo la posibilidad de la
modi�icación o sustitución dirigida de los genes nu-
cleares.
341
Transferencia génica
Lentivirus
Oocito
enucleado Cigoto/Oocito
Célula
transgénica
Transfección mediante
lentivirus: los virus
defectivos son inyectados en
el espacio perivitelino
Células de esperma
cargadas con DNA
Transferencia génica mediante
esperma: el DNA se incuba con el
esperma y después se utilizará
Los transposones o «genes saltarines» se en-
cuentran en los genomas de todos los organismos, y
aunque la mayoría de ellos no son funcionales, algu-
nos están activos (piggyBac, Tol2) y otros han sido
modi�icados arti�icialmente para transferir genes
de forma activa (Sleeping beauty, SB). Normalmente
se utiliza un sistema de transferencia con dos com-
ponentes. El primero de ellos consta de un vector
portador del transgén �lanqueado por las repeticio-
nes terminales invertidas (ITRs) presentes en los
transposones, y el segundo por la transposasa, en-
zima que se encarga del corte del transposón por
el reconocimiento de las secuencias ITRs de los
extremos, y de su integración en el genoma. La en-
zima puede ir codi�icada en un segundo vector, o se
puede inyectar directamente en el citoplasma del
cigoto en forma de mRNA o proteína. Aunque algu-
nos transposones tienen preferencia por motivos
de secuencia cortos, la integración del transgén en
el genoma se produce al azar, y es susceptible de su-
frir «efecto de posición», es decir, que su expresión
dependerá de si la región donde se insertó es una
región transcripcionalmente activa o no.
Un segundo sistema de trangénesis activa en
ovocitos y zigotos ha sido el de la transducción de
retrovirus y lentivirus (pertenecientes a la familia
de los retrovirus complejos) mediante la deposición
de partículas virales portadoras del transgén en el
espacio perivitelino. Estos virus, manipulados ge-
néticamente para impedir la formación de nuevas
Métodos en biociencias

partículas víricas infectivas, son los responsables
de la retrotranscripción del RNA y de la integración
del transgén en el genoma en forma de episoma.
La principal ventaja de la transfección lentiviral es
la alta proporción de transgénicos y la amplia va-
riedad de especies a la que se puede aplicar, desde
pájaros, roedores domesticados y no domesticados,
hasta animales de granja y primates no humanos.
Sin embargo, la baja capacidad de carga del trans-
gén (6-7kpb), el silenciamiento y la integración
preferencial dentro de las unidades de trancripción
que aumentan el riesgo de mutagénesis en el sitio
de inserción, limitan el uso de la transgénesis len-
tiviral.
14.5.2. Proteínas farmacéuticas producidas
por animales transgénicos
La utilización de animales transgénicos como bio-
factorías para la síntesis de proteínas de interés
farmacéutico ofrece ciertas ventajas frente a la pro-
ducción de las mismas en bacterias o incluso en
plantas transgénicas. Entre estas ventajas se en-
cuentran el bajo coste, el alto rendimiento y la gran
calidad de las proteínas sintetizadas, ya que pueden
sufrir las modi�icaciones postraduccionales ade-
cuadas para su correcto funcionamiento. Además,
suponen menos problemas de bioseguridad y éticos.
Sin embargo, otros aspectos di�icultan u obligan a un
estricto control sobre el proceso de puri�icación de
la proteína transgénica, como son la separación de
la proteína sintetizada de su homóloga o equivalen-
te animal y la posible contaminación con patógenos
o priones, susceptibles de activarse en los pacien-
tes a los que será suministrada. También, pueden
existir patrones diferenciales de glicosilación de las
proteínas producidas por los diferentes animales,
que podrían inducir una respuesta inmune en el re-
ceptor con efectos no predecibles. Debido a todos
estos posibles inconvenientes, existen normativas
perfectamente reguladas desde las Administracio-
nes sobre el control de producción de las proteínas
de interés para su comercialización.
El transgén, además de los motivos que deter-
minan su expresión, debe contener las señales que
indiquen el lugar, el nivel de expresión de la proteí-
na y la localización celular. Es decir, debe contener
un promotor potente, activadores de la expresión, y
la secuencia péptido señal responsable de su secre-
ción. Si se pretende que la proteína se secrete en la
leche de un mamífero transgénico, el promotor del
transgén deberá ser el de uno de los genes de las
proteínas de la leche, y si se pretende que la pro-
teína de interés la produzcan gallinas transgénicas
en los huevos, el promotor será el de la ovoalbú-

Cuadro 14.2: Comparación de los sistemas de producción utilizados para la producción de proteínas en animales transgénicos.

Glándula Larva de
Sangre Leche Huevo Semen Orina de seda Drosophila

Nivel de producción teórico +++++ +++++ +++++ +++ ++ ++ ++

Nivel de producción práctico ++ ++++ +++ + + ++ +

Coste de la Inversión +++ +++ +++ + + +++ +++

Coste de Producción ++++ ++++ ++++ ++ + +++++ ++++

Demora en la primera produc- +++ +++ +++ ++ + ++++ ++++

ción

Efecto sobre el organismo ++ +++ +++ +++ +++ ++++ ++++

Modificaciones postraducionales +++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++

Glicosilación ++++ ++++ +++ +++ +++ ++ ++

Estabilidad del producto +++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++

Purificación ++ +++ +++ ++ ++ +++ ++

Patógenos contaminantes ++ +++ +++ +++ ++ ++++ ++++

Productos en el mercado + ++++ ++ + + ++ +

342
 Transferencia génica

Cuadro 14.3: Comparación del tiempo requerido para la obtención de proteínas recombinantes en diferentes especies de animales
transgénicos.

Conejo Cerdo Oveja Cabra Vaca

Meses de Gestación 1 4 5 5 9

Meses en alcanzar la madurez sexual 5 6 8 8 15

Meses transcurridos entre la transferencia 7 16 18 18 33

génica y primera lactación

Número de descendientes 8 10 1-2 1-2 1

L de leche/año 15 300 500 800 8000

Kg de proteína recombinante/año 0.02 1.5 2.5 4 40

mina. Es de esperar que la proteína se encuentre
exclusivamente en la leche o el huevo, aunque se ha
observado en algunos casos cierto grado de expre-
sión en otros tejidos del animal, o unos bajos niveles
de expresión de la proteína in�luenciado por el sitio
de integración del transgén en el genoma.
Además de la leche y el huevo también se han
ensayado otros sistemas, como sangre, orina, se-
men, larvas de Drosophila y glándulas de la seda,
aunque son los primeros los empleados mayori-
tariamente por las empresas biotecnológicas. Por
ejemplo, un alto contenido de proteínas recombi-
nantes biológicamente activas en la sangre, puede
suponer un riesgo para la salud del animal, pero si
la síntesis de la proteína se produce en las glándu-
las mamarias y se localiza en la leche, este problema
dejará de existir. En el cuadro 14.2 se muestra una
comparativa de los distintos sistemas de produc-
ción utilizados.
Los animales utilizados para la producción
de proteínas transgénicas en su leche son conejos,
cerdos, ovejas, cabras y vacas, aunque muestran
diferencias en cuanto al nivel de producción y sen-
sibilidad a los priones. Los conejos ofrecen varias
ventajas: son muy fértiles y producen un gran nú-
mero de descendientes transgénicos capaces de
producir niveles aceptables de proteínas en la le-
che, y son insensibles a los priones. Los cerdos
transgénicos tampoco parecen transmitir enfer-
medades severas a los humanos, y producen mayor
cantidad de leche que los conejos. Los rumiantes
son potencialmente las especies más apropiadas
para producir grandes cantidades de proteínas en
su leche, pero su reproducción es relativamente
lenta, la glicosilación de las proteínas no es tan bue-
na como en conejos y cerdos, y son muy sensibles
a las enfermedades producidas por priones. En el
cuadro 14.3 se muestran las diferencias en cuanto
al tiempo requerido para la obtención de proteínas
transgénicas de interés en los animales transgéni-
cos mencionados.
14.6. Transformación vegetal: plantas trans-
génicas
La Mejora Genética Vegetal se inició de forma «in-
consciente» hace aproximadamente 12.000 años,
cuando los hombres primitivos se hicieron sedenta-
rios y agricultores. Durante un periodo de miles de
años se fueron seleccionando aquellas plantas que
producían más, eran menos tóxicas, no perdían sus
semillas tras la maduración, etc., lo que dio lugar a
la aparición de variedades, algunas de las cuales se
han mantenido hasta nuestros días. A �inales del si-
glo ��� y principios del �� comenzaron a hacerse
cruzamientos dirigidos entre distintos genotipos,
que mediante un proceso de selección dirigida, die-
ron lugar a las variedades cultivadas de las que la
mayor parte de la humanidad se ha alimentado.
Para poder hacer este tipo de mejora es necesario
contar con variabilidad intraespecí�ica y, además,
que los parentales que intervienen en los cruza-
mientos sean sexualmente compatibles.
Como se indicó anteriormente, en los años 70
del siglo �� se descubrieron las enzimas de restric-
ción que, junto con otras enzimas como las ligasas,
polimerasas, etc., dieron origen a la Ingeniería ge-
nética, posibilitando la manipulación y alteración
de los ácidos nucleicos y la obtención de DNA re-

343
Métodos en biociencias
combinante. Estas técnicas han contribuido al
surgimiento de la denominada Biotecnología Mole-
cular, dentro de la que se encuentra la obtención de
plantas transformadas genéticamente o transgéni-
cas. Estas plantas son de gran utilidad para conocer
el funcionamiento, expresión y regulación de los ge-
nes, y además permiten introducir genes concretos
en variedades ya existentes, con el �in de mejorar
determinadas características agronómicas (produc-
ción, resistencia a patógenos, herbicidas, estreses
abióticos, etc). Estas metodologías ponen a disposi-
ción de los mejoradores una poderosa herramienta
y la diversidad genética de cualquier especie, al po-
der eludir las barreras sexuales que las aíslan. Una
de las ventajas de la transformación vegetal es que
solo se ven implicados uno o muy pocos genes, al
contrario de lo que sucede cuando se realizan cru-
zamientos en los que se manejan miles de genes,
algunos no deseados, siendo prácticamente imposi-
ble el seguimiento de cada uno de ellos. Las primeras
plantas transgénicas fértiles se obtuvieron en 1983
por tres grupos de investigación independientes,
empleando la bacteria Agrobacterium tumefaciens
para transformar plantas de tabaco y hacerlas re-
sistentes a un antibiótico.
El objetivo de la transgénesis vegetal es la in-
serción en el DNA nuclear, y en algunos casos, en el
genoma de los cloroplastos, de uno o varios genes
foráneos que se expresen e�icazmente en la planta.
En la obtención de plantas transgénicas se requiere,
en primer lugar, la obtención de células transgéni-
cas que, aprovechando la totipotencia que muchas
de las células vegetales poseen, y empleando me-
dios de cultivo de crecimiento y selección in vitro
apropiados, darán lugar a plantas adultas y fértiles.
14.6.1. Elementos necesarios para la obtención
de plantas transgénicas
Algunos de los elementos son comunes a los trata-
dos en apartados anteriores, pero se vuelve a incidir
sobre ellos atendiendo a las características especí�i-
cas de las células vegetales.
a) El transgén que se desea introducir
en la planta está formado por la región
codi�icante, que en su extremo 5’ ha de
llevar un promotor al que se unirá la RNA
polimerasa para llevar a cabo el proce-
so de transcripción, y en su extremo 3’
una secuencia terminadora que no se
va a traducir y que contiene una señal
de corte y de poliadenilación. La elec-
ción del promotor es muy importante, ya
que, dependiendo de los objetivos que se
344
persigan, el promotor podrá ser: cons-
titutivo, permitiendo la expresión del
transgén en todas las células de la planta;
especí�ico de tejido, con lo que el trans-
gén solo se expresará en determinados
tejidos u órganos; inducible, de tal for-
ma que el transgén solo se expresará bajo
ciertos estímulos como pueden ser la luz,
la temperatura, etc. El conjunto formado
por el promotor, la región codi�icante co-
rrespondiente al transgén y la secuencia
de terminación, recibe el nombre de case-
te de expresión y los diferentes elementos
de este casete pueden tener distinta pro-
cedencia biológica.
b) Vector. El casete de expresión debe es-
tar incluido en un vector, por ejemplo un
plásmido, que permite clonarlo en bac-
terias y obtener su�iciente cantidad de
DNA (transgén y elementos reguladores)
para utilizarlo en el proceso de trans-
formación. En algunos casos (p.ej. en la
transformación mediante Agrobacte-
rium), en el vector también se incluyen
otros genes y secuencias imprescindibles
en el proceso de transferencia e inserción
del transgén en la célula vegetal, intervi-
niendo todos estos elementos de forma
más o menos directa en el proceso de
transformación.
c) Gen de selección. Como se ha indica-
do anteriormente, el vector en el que se
ha clonado el transgén contiene otros ele-
mentos, entre los que se encuentra un gen
que va a permitir la selección de las célu-
las vegetales que han sido transformadas
y que les va a conferir alguna ventaja o
capacidad de supervivencia frente a las
células que no lo han sido. La selección
es positiva cuando el gen de selección
proporciona resistencia a sustancias tó-
xicas como puede ser un antibiótico (p.
ej. el gen npt II que con�iere resistencia a
kanamicina; el gen hpt que con�iere resis-
tencia a higromicina) o un herbicida (p.
ej. el gen pat o bar que con�iere resisten-
cia a phosphinotricina o bialaphos; el gen
cp4epsps que codi�ica la enzima 5-enol-
piruvilsikimato-3-fosfato sintetasa que
con�iere resistencia a glifosato), elimi-
nando aquellas células que no han sido
transformadas. Otra opción de selección
positiva permite a las células transfor-
madas utilizar determinadas sustancias,
 Transferencia génica

Figura 14.12.- Expresión transitoria del gen gus en un embrión haploide de

trigo blando (Triticum aestivum) (izquierda) y en un fragmento de una yema
ajo (Allium sativum) (derecha). Los puntos oscuros (de color azul) corres-
ponden a la reacción de la enzima β-glucuronidasa sobre el sustrato X-gluc
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D glucuronide), que tras su oxidación y dimeri-
zación produce un producto insoluble de color azul intenso.

para su desarrollo y división, mientras ción se clasi�ican en indirectos basados en sistemas

que las células que no se han transforma-
do no pueden utilizar dichas sustancias
por lo que no pueden proliferar. Este es
el caso del gen man A, que posibilita la
utilización de manosa como fuente de
carbono en los medios de cultivo en los
que crecen las células.
d) Genes informadores o chivatos. En la
puesta a punto de distintos procedimien-
tos de obtención de plantas transgénicas,
y también en estudios básicos relacio-
nados con la regulación de la expresión
génica, es frecuente utilizar los denomi-
nados genes informadores o chivatos.
Estos genes codi�ican proteínas que dan
lugar a fenotipos fáciles de detectar. Por
ejemplo el gen gus A codi�ica la enzima
β-glucuronidasa que, en presencia de un
sustrato apropiado (X-Gluc), da lugar a un
producto de color azul que es fácil de vi-
sualizar (Figura 14.12). Otro ejemplo es
el gen gfp que se aisló de una medusa y
que codi�ica una proteína (green �luores-
cent protein) que produce �luorescencia
de color verde, cuando se ilumina con luz
ultravioleta en un transiluminador apro-
piado. Además, este segundo tipo no es
destructivo, al contrario del ensayo con el
gen gus, por lo que es posible seguir man-
teniendo vivo el material analizado.
14.6.2. Métodos de transformación genética
de plantas
Según el mecanismo por el que se trans�iere el
transgén a las células, los métodos de transforma-
biológicos, y métodos directos en los que la intro-
ducción del material genético se lleva a cabo por
procedimientos químicos, �ísico-químicos o mecá-
nicos. A continuación se comentan los principales
tipos.
Métodos indirectos
Las especies bacterianas Agrobacterium tumefa-
ciens y A. rhizogenes infectan a una gran cantidad de
especies dicotiledóneas a las que provocan las en-
fermedades denominadas «agalla de la corona» y
«raíz en cabellera», respectivamente. La causa �inal
de estas enfermedades se encuentra en un plás-
mido de gran tamaño (150-200 Kpb) denominado
Ti (inductor de tumor) o Ri (inductor de raíces)
que poseen las especies bacterianas anteriormen-
te indicadas. Así, se ha demostrado que, cuando A.
tumefaciens infecta a las células vegetales, un frag-
mento del plásmido Ti, denominado T-DNA, es
transferido a la célula en donde se producirá su
integración en algún lugar del genoma nuclear. A
partir de este momento comenzará la expresión
de los genes incluidos en el T-DNA, que codi�ican
hormonas vegetales (oncogenes) e inducen la pro-
liferación celular y la formación de un tumor, que
es la agalla de la corona, junto con otros genes que
codi�ican enzimas que intervienen en la síntesis de
opinas, productos procedentes de la condensación
de ácidos orgánicos o disacáridos y aminoácidos,
que son excretadas por las células vegetales, y uti-
lizadas como alimento por las bacterias.
De forma natural, el proceso de transforma-
ción se origina cuando la planta sufre alguna herida
y comienzan a liberarse compuestos de tipo fenó-
lico, que hacen que la bacteria se una a las células

345
Métodos en biociencias

Señales emitidas por la planta

VirA
2
VirG Citoplasma
3

Región
Ti
vir Receptores
bacterianos
y de Núcleo
la planta

T-DNA CPN 8
7
Bi Bd
1 9
VirD1/D2 4
CPN

Cadena-T Complejo-T
VirD2 Canal de maduro
VirE2 comunicación

6 10 T-DNA
Complejo-T integrado
inmaduro
5
Agrobacterium Célula vegetal

Fig.  14.13  
Figura 14.13: Esquema del proceso de transformación mediante Agrobacterium. El proceso se inicia con el re-
conocimiento y unión de Agrobacterium a una célula vegetal, a través de receptores bacterianos y de la planta
(1), junto con la unión a receptores especí�icos de la bacteria (VirA/VirG) de señales emitidas por la célula ve-
getal como consecuencia de haber sufrido algún tipo de lesión (2). La región vir del plásmido Ti se va a activar
(3) lo que hace que se produzca una copia del DNA-T en cuyos extremos se encuentran los bordes derecho Bd e
izquierdo Bi, y entre ellos los genes que codi�ican los oncogenes y las enzimas productoras de opinas. A conti-
nuación se produce una copia del DNA-T, a cuyo extremo 5’ se le unirá la proteína VirD2 (4), que ayudada por
otras proteínas Vir, permitirá el paso del DNA-T a través del canal de comunicación entre la bacteria y la célula
(5). Tras la asociación con la proteína VirE2 (6), el DNA-T penetrará en el núcleo de la célula (7) a través de los
poros nucleares (CPN). Una vez en el núcleo celular, el DNA-T se sitúa en alguna región del genoma nuclear (8),
en donde se desprende de las proteínas que lo han protegido durante el transporte, integrándose a continuación
en alguno de los cromosomas de la célula (9), pasando a formar parte del material hereditario de la célula (10),
en donde se expresará y replicará. Basado en Tz�ira y Citovsky, 2006. Disponible en color.

vegetales y les trans�iera el T-DNA a través de un ca-
nal producido por Agrobacterium, que viajará hacia
el núcleo, en donde se integrará en el genoma de la
célula vegetal. En todo este proceso interviene un
número considerable de genes, muchos de los cua-
les se encuentran en el propio plásmido Ti (Figura
14.13).
Sin embargo, para la integración del T-DNA
solo son necesarias dos secuencias repetidas direc-
tas de unos 25 pares de bases, que se encuentran
en ambos extremos del T-DNA. Este descubri-
miento fue clave para poder utilizar el sistema de
Agrobacterium como procedimiento para la obten-
ción de plantas transgénicas, ya que se vio que se
pueden eliminar los oncogenes y los genes produc-
tores de opinas y sustituirlos por una secuencia de
DNA que codi�ique el gen o los genes que se deseen
introducir en la planta. Un nuevo avance fue la uti-
lización de vectores binarios en los que se emplean
dos plásmidos, que además se pueden replicar tan-
to en E. coli como en A. tumefaciens. En uno de los
plásmidos, denominado «desarmado» ya que se ha
eliminado los genes que codi�ican las auxinas y las
opinas, se encuentran el borde izquierdo y el dere-
cho del T-DNA. Entre ambos bordes se encuentra un
polylinker que servirá para añadir el casete de ex-
presión del gen que se desea introducir, junto con
un gen de selección y/o marcador. En el segundo
plásmido denominado «helper» se incluyen los ge-
nes (vir) que están implicados en la transferencia
del T-DNA a las células vegetales.

346
 Transferencia génica

Para obtener plantas transgénicas mediante Métodos directos

el uso de Agrobacterium es necesario, en primer lu-
gar, una fase de co-cultivo de las células vegetales
que se deseen transformar con la cepa de Agrobac-
terirum portadora de los plásmidos adecuados. En
esta fase se producirá la transferencia del T-DNA a
algunas de las células. Este proceso se ve favorecido
por la presencia de ciertas sustancias como la ace-
tosiringona y heridas en el tejido vegetal que, tras
la emisión al medio de ciertas sustancias, activan
el sistema de virulencia propio de Agrobacterium.
Tras esta primera fase se emplean medios de cultivo
con antibióticos como la tetraciclina para eliminar
la bacteria, ya que no se necesita pues la transfor-
mación se hizo en la fase anterior de co-cultivo. En
el siguiente paso se utilizan medios de cultivo con-
teniendo un agente de selección, que impedirá el
desarrollo de las células vegetales que no hayan
sido transformadas. La selección se lleva a cabo
mediante la expresión de un gen, que se introduce
junto con el gen de interés, y que le puede conferir
a las células transformadas resistencia a un herbi-
cida, a un antibiótico o la capacidad de metabolizar
alguna sustancia necesaria para el crecimiento de
las células vegetales. Además, el medio de cultivo
tendrá una combinación adecuada de reguladores
de crecimiento que induzcan la regeneración de
plantas completas, a partir de las células transfor-
madas.
Cuando se intentó utilizar A. tumefaciens para
transformar cereales y otras monocotiledóneas, se
encontraron grandes di�icultades, por lo que comen-
zaron a ponerse a punto otros métodos basados en
procedimientos �ísicos, químicos o mecánicos, como
los tres que se comentan a continuación. No obs-
tante, hay que señalar que actualmente es posible
la transformación en algunos genotipos concretos
de monocotiledóneas empleando Agrobacterium,
gracias a la utilización de plásmidos binarios y su-
pervirulentos.
— Método biolístico o de bombardeo con
micropartículas. Se emplean micropro-
yectiles de entre 0.5 y 4 µm de diámetro,
de un elemento pesado e inerte como es el
oro o el tungsteno, que están recubiertos
del DNA que se quiere transferir a las cé-
lulas vegetales. Se necesita un dispositivo
mecánico que dispare estas micropar-
tículas para que puedan atravesar las
paredes y membranas, depositándolas
en el interior celular. Inicialmente se em-
pleó la explosión de pólvora para lanzar
las partículas a gran velocidad sobre sus
objetivos, y posteriormente se han desa-
rrollado otros aparatos que emplean gas
(helio o nitrógeno) comprimido a eleva-

Figura 14.14: Cañón de partículas para la transformación utilizando el método biolístico. La impulsión de la microopartículas
de oro o tungsteno recubiertas de DNA se realiza mediante helio a alta presión que, tras romper el disco de ruptura, impulsa una
membrana plástica (macrocarrier), en cuya parte inferior se encuentran pegadas las micropartículas (microcarriers) cubiertas
de DNA, que vuelan hasta impactar sobre las células vegetales. http://www.bio-rad.com/es-es/product/pds-1000-he-hepta-
systems. http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture19.html.

347
Métodos en biociencias
Figura 14.15: Microfotogra�ías, realizadas con microscopio electrónico de barrido, de un tejido vegetal antes y
después de ser sometido a un disparo con micropartículas.
das presiones. Actualmente se utiliza el
denominado cañón de partículas (Figu-
ra 14.14) que lanza los microproyectiles
a velocidades que pueden alcanzar los
400 m/s sobre las células diana (Figura
14.15) que, en el momento del disparo, se
encuentran situadas en una cámara aisla-
da en la que se hace un vacío parcial para
evitar que las partículas se frenen y se
desvíen al rozar con el aire. Una vez que
las micropartículas se depositan en el in-
terior de la célula, el DNA se desprende
de las mismas y se puede integrar de for-
ma estable en el genoma nuclear o en el
de los cloroplastos, tras un proceso de re-
combinación no homóloga. Esta técnica
se puede emplear, al menos teóricamen-
te, en cualquier especie y tipo de material
vegetal. Además, no son necesarios vec-
tores especiales, ya que incluso se puede
utilizar un casete formado por el DNA co-
rrespondiente al gen de interés junto con
el promotor y la secuencia terminadora,
todo ello unido a un gen de selección que
permita identi�icar las plantas que han in-
tegrado este DNA. Sin embargo, la técnica
no está exenta de problemas, siendo el
principal de ellos la integración de varias
copias del DNA introducido en distintos
lugares del genoma o en tándem, lo que
puede originar en numerosas ocasiones
el silenciamiento génico y por tanto la
ausencia del producto del gen que se pre-
tendía introducir.
— Método de transformación utilizando
sustancias químicas y/o electroporación.
Estos procedimientos se aplican en
protoplastos, es decir células a las que se
ha privado de su pared celular median-
te el empleo de enzimas de tipo celulasa,
348
hemicelulasa y pectinasa. Tras la diges-
tión enzimática, los protoplastos se aíslan
y se utilizan como células diana para la
transformación, empleándose diversas
sustancias que permiten permeabilizar
las membranas plasmáticas, con el �in de
que el DNA las pueda atravesar. Una de
las sustancias más empleada es el polie-
tilenglicol (PEG) que es un policatión que
interacciona químicamente con los fosfo-
lípidos de las membranas, produciendo
poros transitorios por los que puede pe-
netrar el material genético. También el
PEG se utiliza para fusionar protoplas-
tos a los liposomas, que son esferas cuya
super�icie está constituida por una bica-
pa lipídica en cuyo interior se encuentra
el DNA que se desea transferir a la célu-
la y que, una vez fusionados, vierten su
contenido al interior celular. Las mem-
branas celulares también se pueden
permeabilizar empleando la electropora-
ción. Eligiendo la combinación adecuada
de duración e intensidad de la corriente
eléctrica, se consigue desestabilizar las
membranas provocando poros reversi-
bles por los que pueden entrar distintas
sustancias, incluyendo macromoléculas
como es el DNA. El mayor inconveniente
que tiene la utilización de los protoplas-
tos como dianas en experimentos de
transformación es la di�icultad de regene-
rar plantas adultas a partir de ellos. Por
este motivo, su uso más habitual es en ex-
perimentos de expresión transitoria para
estudiar secuencias promotoras o regula-
doras de la expresión de genes, y en los
que general no es necesaria la integración
del DNA en el genoma de la célula, y me-
nos aún la regeneración de plantas.

— Otros métodos �ísicos para la introduc-
ción de DNA en las células vegetales son
el empleo de �ibras de carburo de si-
licio y la microinyección. En el primer
caso se trata de �ibras de entre 0.3 y 0.6
µm de diámetro y de una longitud de 10
a 100 µm que se añaden a un medio en
el que se encuentran en suspensión cé-
lulas aisladas, proembriones, callos, etc.,
junto con plásmidos conteniendo el case-
te de expresión y algún gen marcador y/o
de selección. Tras una agitación vigoro-
sa, se consigue que las �ibras atraviesen
las paredes y las membranas celulares
arrastrando con ellas copias del plásmi-
do, que de esta manera habrán pasado al
interior de las células. Una vez en el in-
terior el DNA se podrá integrar en uno
o varios lugares del genoma, y tras las
correspondientes fases de selección y re-
generación, será posible obtener plantas
adultas transgénicas. A pesar de la sen-
cillez y poco coste del método, aún no
constituye un procedimiento de elección
para la transformación vegetal por la baja
e�icacia que se consigue, así como por
la gran toxicidad de las �ibras de carbu-
ro de silicio empleadas. En el caso de la
microinyección se utiliza un micromani-
pulador y pipetas con microcapilares que
permiten la introducción directa de DNA
en el citoplasma o incluso en el núcleo de
las células. Permite introducir orgánulos
celulares como mitocondrias y cloroplas-
tos e incluso cromosomas completos, por
lo que es una técnica con una gran poten-
cialidad en programas de mejora genética
vegetal. Sin embargo, tiene algunos in-
convenientes como el manejo de una sola
célula en cada inyección, y además se re-
quiere personal altamente capacitado e
instrumentación costosa.
14.7. Terapia génica en la especie humana
La terapia génica implica la modi�icación de la in-
formación genética de las células, con la �inalidad
de corregir algún defecto genético o de dotarlas
de alguna nueva característica. Es uno de los tra-
tamientos médicos más recientes para curar, o
al menos paliar, los síntomas de enfermedades
hereditarias o de enfermedades que supongan alte-
raciones de la información genética, como es el caso
349
Transferencia génica
del cáncer. Según el tipo celular al que va dirigida
la terapia, se puede clasi�icar en terapia de célu-
las gaméticas y terapia de células somáticas. En el
primer caso, la modi�icación genética se introduce
en las células germinales, en el cigoto o en embrio-
nes de pocas células, por lo que se verán afectadas
todas o casi todas las células del individuo y, ade-
más, el cambio genético se podrá transmitir a sus
descendientes. Este hecho ha planteado problemas
ya que los efectos a largo plazo son impredecibles,
pudiendo ser peligrosos y éticamente reprobables,
por lo que, a día de hoy, no se utiliza para modi�i-
car genes nucleares. Sin embargo, recientemente si
se ha comenzado a aplicar este tipo de terapia en
enfermedades mitocondriales, que son transmiti-
das exclusivamente por vía materna. En este caso,
una de las opciones es la obtención de cigotos con
tres parentales: una mujer sin enfermedad mito-
condrial, que aportaría un óvulo enucleado, una
mujer afectada por una enfermedad mitocondrial,
que aportaría el núcleo haploide del óvulo y �inal-
mente un espermatozoide que contribuiría con otro
núcleo haploide, que al fecundar al núcleo del óvulo
dará lugar a un cigoto sin la enfermedad mitocon-
drial. En el caso de la terapia de células somáticas,
solo se modi�ican determinadas células o tejidos,
permaneciendo esta alteración en el individuo que
ha sido tratado sin transmitirse a sus descendien-
tes. Aunque la terapia génica todavía no forma parte
de la rutina de la práctica médica, ya se han apro-
bado centenares de protocolos y en la página: http:
//www.genetherapynet.com/clinical-trials.html, se
puede encontrar una información permanentemen-
te actualizada de los mismos.
Las células somáticas que se utilizan en tera-
pia génica se pueden modi�icar fuera del cuerpo
(terapia ex vivo), o sin extraerlas del paciente (te-
rapia in vivo). En cualquiera de los casos, las células
que se van a modi�icar deben reunir una serie de ca-
racterísticas, siendo la más importante que puedan
permanecer vivas durante largos periodo de tiem-
po, para que el gen que se les ha introducido y el
producto que codi�ica puedan ejercer un efecto te-
rapéutico en el paciente. Así, las células madre son
las más apropiadas para la modi�icación genética,
ya que pueden dividirse un gran número de veces
dando lugar a un clon de células modi�icadas y, en
principio, sanas.
Los objetivos de la terapia génica van a depen-
der del tipo de células a las que vaya dirigida. Así,
pueden ser células que presentan alguna mutación
en un gen, y lo que se persigue es «curar» ese defec-
to; o bien el objetivo puede ser la eliminación de un
determinado tipo de célula, como es el caso de las
Métodos en biociencias

Figura 14.16: Principales estrategias empleadas en terapia génica humana. (a) Adición de una copia
normal del gen mutado, (b) adición de un gen que con�iere una nueva característica, (c) «knowdown»
de un gen utilizando el mecanismo de interferencia de RNA, mediante el empleo de siRNA, (d) edita-
do genético mediante el método de CRISPR-Cas, para introducir cambios especí�icos en el genoma.

células tumorales. En cualquier caso, la terapia gé-
nica requiere la introducción de material genético
en las células dañadas empleándose, como se indicó
anteriormente, diferentes vehículos y metodologías
(virus, plásmidos, liposomas, electroporación, etc).
En la �igura 14.16 se muestran esquemáti-
camente las estrategias básicas de manipulación
genética encaminadas a la terapia génica.
La mayoría de los ensayos de terapia génica
que se están realizando están encaminados a tratar
enfermedades monogénicas, causadas por la pérdi-
da de función de un gen concreto (Figura 14.16a).
Los primeros éxitos se consiguieron en enfermos
con inmunode�iciencia combinada grave (SCID),
en los que los linfocitos B y T presentan disfuncio-
nes debido, en algunos casos, a una mutación en el
gen IL2RG localizado en el cromosoma X, y en otros,
a una mutación en el gen ADA que codi�ica para
una adenosina desaminasa y que se encuentra lo-
calizado en el cromosoma 20. Para el tratamiento,
se extrajeron células madre de la médula ósea, se
transformaron empleando retrovirus portadores de
la versión normal de uno u otro gen, y a continuación
se reintrodujeron en los enfermos. La mayor parte
de los pacientes tratados consiguieron una buena
recuperación del sistema inmunitario, pero algunos
desarrollaron leucemia linfoblastoide aguda de cé-
lulas T, debido a que la inserción del plásmido con el
transgén activó al proto-oncogén LMO2.
El cáncer es una enfermedad genética, aun-
que afortunadamente en la mayoría de los casos no
hereditaria. Se están utilizando diferentes tipos de
terapia génica para intentar eliminar las células tu-
morales. Una de ellas consiste en la adición de un
gen (Figura 14.16b) que va a permitir dirigir las
células del sistema inmunitario contra las células
tumorales. Por ejemplo, en pacientes con linfomas
de linfocitos B, se les extrajeron linfocitos T a los
que se les trans�irió un gen quimérico que codi�i-
ca para un receptor antigénico (CAR) que reconoce
el marcador CD19 de la super�icie de las células B.
Los linfocitos T modi�icados expresaron el gen qui-
mérico y fueron reinsertados en el paciente, donde
produjeron una reversión en el avance del linfoma.
La adición de un nuevo gen en determinados tipos
celulares también puede utilizarse para combatir
enfermedades infecciosas. Así, se han transformado
células musculares con un gen que codi�ica un an-

350
proceso de degradación de moléculas de mRNA o bien impidiendo la traducción
del mRNA que tengan secuencias complementarias al siRNA. En la Figura 14.17,
se muestra un esquema del mecanismo de silenciamiento mediado porTransferencia
RNA. génica

Figura 14.17: Esquema de silenciamiento génico por RNA. (1) Formación de moléculas de
RNA con estructuras duplexas intracatenarias en el núcleo, que son procesadas por el complejo
enzimático drosha y son exportadas al citoplasma por la enzima exportina. Una vez en el cito-
plasma son procesadas por dicer a moléculas miRNA que son reconocidas por el complejo RISC,
que desnaturaliza el RNA duplexo y lo dirige hacia las regiones 3’UTR complementarias de los
mRNA, produciendo un bloqueo de la traducción. (2) Moléculas de RNA duplexo presentes en el
citoplasma son procesadas a siRNA por dicer siguiendo un proceso similar al anterior que �ina-
lizará con la unión a regiones complementarias de moléculas de mRNA, que serán degradadas.

ticuerpo contra ciertos patógenos. La secreción de complementarias de bases aparearán, o bien pue-
estos anticuerpos al torrente circulatorio produce
Figura 14.17. Esquema de silenciamiento génico den originarse
por RNA.tras 1. la transcripción
Formación de una de de
de moléculas las
una vigilancia permanente del sistema inmunitario, cadenas de una secuencia de DNA a una molécula
RNA con estructuras duplexas intracatenarias en el núcleo, que son procesadas por el complejo
que puede prevenir futuras infecciones por virus de RNA originada con secuencias complementa-
enzimático
como el HIVdrosha
o el dey la
son exportadas al citoplasma porrias
gripe. la enzima
invertidasexportina. Una vez en
que al aparearse denelorigen
citoplasma
a una
son procesadas
En el caso por
de quedicerunaa enfermedad
moléculas miRNA
genéticaque estructura
son reconocidas por el(duplexo-simplexo).
de tallo-lazo complejo RISC, que Las
desnaturaliza el RNA duplexo y lo dirige
se haya producido por una ganancia de función en hacia las regiones
moléculas 3’UTR
de complementarias
RNA duplexo son de los
cortadas mRNA,
por una
produciendo
algún gen, lounque
bloqueo
da lugar de alalatraducción.
aparición de 2.un
Moléculas
pro- de RNA duplexo
ribonucleasa presentes
denominada en el citoplasma
«dicer», formándoseson pe-
procesadas
ducto tóxicoa osiRNA
que está por dicer siguiendo
presente un proceso
en un momento del queños fragmentos de entre 20 y 22 nucleótidos
similar al anterior que finalizará con la unión a
desarrollo
regiones o tipo celular inapropiado,
complementarias de moléculas el de de te- queque
tipomRNA, constituyen
serán el siRNA. Estos fragmentos se unen
degradadas.
rapia que se realiza es la denominada de inhibición al complejo proteico inductor del silenciamiento del
o de bloqueo (Figura 14.16c), en la que o bien se RNA «RISC» (RNA induced silencing complexes) dan-
El siRNA se puede emplear do
impide la transcripción del gen, o bien se eliminan
eninicioterapia
al procesogénica, siguiendo
de degradación de moléculasdosde
procedimientos:
o se impide que actúen a) sus directamente,
productos. Una de para
las lo
mRNA cualo bienseimpidiendo
sintetizan artificialmente
la traducción del mRNA
opciones es emplear el mecanismo que tenga secuencias complementarias al siRNA. En
moléculas de RNA duplexodecon interferencia
un tamaño de 22 pb que tengan secuencias
por RNA (iRNA) que se ha encontrado en muchos la �igura 14.17 se muestra un esquema del mecanis-
complementarias
eucariotas incluyendoal los mRNA
mamíferos,derivado
y que causadel mo gen que se quiere
de silenciamiento mediadosilenciar.
por RNA. Estas
moléculas se incluyen en liposomas que podrán fusionarse con las en
silenciamiento génico. Se trata de un mecanismo de El siRNA se puede emplear membranas
terapia géni-
defensa innato que protege a las células de la inva- ca, siguiendo dos procedimientos: a) directamente,
celulares, y una vez alcanzado el citoplasmapara
sión de virus y también de un exceso de actividad de
delolas células, comenzarán a ejercer
cual se sintetizan arti�icialmente moléculas
sulosefecto los siRNA;
transposones. b) utilizando
Este mecanismo virus
se activa ante recombinantes
la de RNA duplexo para
con transformar
un tamaño de 22 laspbcélulas
que ten-
presencia de moléculas de RNA duplexas, que pue- gan secuencias
con una construcción (casete de expresión) que una vez integrada en el genoma y complementarias al mRNA derivado
den aparecer por transcripción de las dos cadenas del gen que se quiere silenciar. Estas moléculas
de una secuencia de DNA, que al tener secuencias se incluyen en liposomas, que podrán fusionarse

351
Métodos en biociencias
con las membranas celulares y una vez alcanzado
el citoplasma de las células comenzarán a ejercer
su efecto; b) utilizando virus recombinantes para
transformar las células con una construcción (ca-
sete de expresión) que, una vez integrada en el
genoma y transcrita, dará lugar a una molécula de
RNA con estructura de tallo-lazo que se procesará
y dará lugar a siRNA, que silenciará el gen elegi-
do. Hay que tener en cuenta que el silenciamiento
nunca es total, de ahí que a este tipo de procedi-
miento se le denomine como knockdown. Una de
las enfermedades en las que se está ensayando esta
metodología es la Corea de Huntington, ya que si-
lenciando el alelo mutante del gen que codi�ica para
la huntingtina, se pretende disminuir el efecto tóxi-
co de la proteína alterada.
La edición genómica es una estrategia más
para la terapia génica (Figura 14.16d) y han co-
menzado a llevarse a cabo los primeros ensayos
en animales, para luego poder transferir los resul-
tados obtenidos a humanos. Así, en un modelo de
ratón con hemo�ilia debido a una mutación en el
gen del factor IX de coagulación, se ha transferido
un gen que expresa una ZFN (zinc �inger nucleases)
junto con un DNA molde. En este experimento, y
tras la correspondiente edición génica por adición
del DNA molde, se consiguió reconstruir la secuen-
cia completa del gen del factor IX. Otra opción que
permite la edición genómica es la inactivación de
genes especí�icos que, por ejemplo, codi�ican pro-
teínas que son necesarias para que se produzca una
determinada infección vírica. Así, para la infección
de los linfocitos T por el virus del sida, es necesario
que estos linfocitos expresen un co-receptor deno-
minado CCR5 (chemokine co-receptor 5). Mediante
la edición génica, empleando ZFN, se ha consegui-
do inactivar el gen que codi�ica para CCR5, con lo
352
que las células T modi�icadas han resultado ser re-
sistentes a la infección del HIV en ensayos in vitro.
Dado el gran avance que está habiendo en los
últimos años en la terapia génica se puede prever
que, en un futuro no muy lejano, será una más de las
herramientas con la que cuente la Medicina para tra-
tar tanto enfermedades genéticas como infecciosas.
Bibliografía
Garrels W, Ivics Z, Kues WA. 2012. Precision Genetic En-
gineering in Large Mammals. Trends in Biotechnology
30:386-393.
Hourdebine LM. 2009. Production of Pharmaceutical Pro-
teins by Transgenic Animals. Comp Immun Microbiol Infect
Dis 32:107-121.
Liu L, Fan XD. 2014. CRISPR-Cas System: A Powerful Tool
for Genome Engineering. Plant Mol Biol 85:209-219.
Robl JM, Wang Z, Kasinathan P, KuroiwaY. 2007. Transgen-
ic Animal Production and Animal Biotechnology. Theriog-
enology 67:127-133.
Santiago Y, Chan E, Pei-Qi L, Orlando S, Zhang L, Urnov,
FD et al. 2008. Targeted Gene Knockout in Mammalian
Cells by Using Engineered Zinc-Finger Nucleases. PNAS
105:5809-5814.
Strachan T, Goodship J, Chinnety P. 2015. Genetics and
Genomics in Medicine. Garland Science. ISBN 978-0-8153-
4480-3.
Tzfira T, Citovsky V. 2006. Agrobacterirum-mediated Ge-
netic Transformation of Plants: Biology and Biotechnology.
Current Opinion in Biotechnology 17:147-154.
Wang D. 2014. State of the Art Human Gene Therapy: Part
II. Gene Therapy Strategies and Clinical Applications. Dis-
cov Med 18:151-161.

Optogenética
Carolina Roza Fernández de Caleya
La optogenética es una técnica mediante la cual es
posible modi�icar el comportamiento de las neu-
ronas usando una fuente de luz. Esta herramienta
comenzó a utilizarse a principios del siglo ���, sien-
do mencionada como «el método del año» en 2011
por la revista Nature Methods (2011). La optoge-
nética se de�ine como «la integración de técnicas
genéticas y ópticas con objeto de activar o inhibir
una función especí�ica en un grupo concreto de cé-
lulas en tejidos vivos». Puede considerarse como la
técnica más novedosa en el campo de las biociencias,
y si bien en la actualidad es utilizada fundamental-
mente en Neurociencias, ofrece un gran potencial
en otras áreas de conocimiento en aproximaciones
básicas y aplicadas.
La técnica se desarrolló a partir del descubri-
miento de ciertas algas unicelulares que poseían
unas proteínas en su membrana que se compor-
taban como canales iónicos en respuesta a luz. La
optogenética surge tras la introducción en células
excitables –como neuronas– de genes microbianos
exógenos que codi�ican dichas proteínas sensibles
a luz. El aspecto más llamativo de esta técnica es
que permite, mediante la activación/inhibición de
una población discreta de neuronas especí�icas, un
control muy exacto de un proceso biológico en un
sistema intacto. Hasta su desarrollo no existía nin-
15.
gún método que permitiera el estudio in vivo de
células individuales dentro de su contexto, algo cru-
cial para entender cualquier proceso biológico. En
neurociencia destacan las aplicaciones en las que la
activación de una neurona en particular es capaz de
provocar un comportamiento complejo en un ani-
mal despierto en movimiento, como hacer que se
despierte súbitamente tras haberle inducido el sue-
ño o provocar que se mueva en círculos al encender
una luz que es capaz de iluminar un grupo especí�i-
co de neuronas.
La optogenética es una técnica interdisciplinar
que requiere conocimientos de ingeniería genética,
técnicas de iluminación y métodos capaces de de-
tectar los cambios inducidos.
15.1. Origen
En el año 1979 Francis Crick sugirió en un trabajo
publicado en Scienti�ic American que el mayor reto
en neurociencia es la necesidad de conseguir el con-
trol preciso de un grupo de neuronas sin alterar a
sus vecinas. Los métodos tradicionales basados en
la aplicación de estímulos eléctricos carecen de la
precisión adecuada puesto que no son capaces de
distinguir entre distintas poblaciones neuronales.
Métodos en biociencias
En diferentes conferencias Crick llegó a especu-
lar que la luz podría ser un modo e�icaz dado que
podría ser aplicada a modo de pulsos controlados
y usando un amplio rango de colores (longitudes
de onda) en localizaciones discretas. Si bien en ese
momento parecía imposible conseguir que una
neurona de un cerebro de mamífero pudiera res-
ponder a un estímulo lumínico, en el campo de la
microbiología ya se había identi�icado, en 1971, la
bacteriorodopsina, una bomba iónica bacteriana
que se activaba con la luz verde y que llevó, poste-
riormente, a la caracterización de varios miembros
de esta familia: halorodopsinas (1977) y las canal-
rodopsinas (2002). La característica fundamental
de estas moléculas es que son proteínas únicas que,
en respuesta a un estímulo lumínico en espectro vi-
sible, permiten el �lujo de iones; es decir, combinan
un dominio sensible a luz y un dominio que permite
el paso de iones a través de membrana (este domi-
nio se comporta de modo similar a cualquier canal
iónico que se encuentra en células de mamíferos).
Si bien la solución al reto propuesto por Crick
en los años 70 ya existía, tuvieron que pasar más de
30 años para que ambos conceptos se unieran dan-
do lugar a una nueva técnica: la optogenética.
En el año 2000 tras la secuenciación del DNA
del alga luminiscente Chlamydomonas reinhardtii
se observaron dos secuencias similares a la de bac-
teriorodopsina. Los grupos de Hegemann y Nagel
demostraron que la inserción de dichas secuencias
en oocitos de Xenopus fue capaz de codi�icar pro-
teínas funcionales capaces de permear cationes en
respuesta a la luz azul. Estas proteínas, conocidas
como Canalrodopsina-1 y 2 (ChR1 y ChR2, del in-
glés channelrhodopsin1 y 2), y fundamentales para
las respuestas a luz de Chlamydomonas, podrían
entonces insertarse en neuronas de diferentes ani-
males mediante técnicas de ingeniería genética. De
este modo, al ser estimuladas con luz, se provocaría
un cambio en el potencial de reposo de una neu-
rona: es decir, ¡una respuesta! Sin embargo, para
llegar a este punto, había que tener en cuenta que
las células eucariotas no manejan fácilmente mate-
rial genético microbiano; por otra parte, el correcto
funcionamiento de las canalrodopsinas requiere
la presencia de trans-retinal, un cofactor químico
esencial para la absorción de fotones.
Finalmente, el equipo de Deisseroth en Stan-
dford consiguió introducir ChR2 en células de
mamífero en cultivo mediante técnicas de trans-
fección y ya fue capaz de provocar respuestas
eléctricas y cambios en los impulsos nerviosos
de dichas neuronas al aplicar pulsos de luz azul.
Contra todo pronóstico, el experimento funcio-
354
nó porque las células de mamífero (y de todos los
vertebrados) contienen de modo natural cantida-
des su�icientes de trans-retinal (ver más adelante).
Esto facilitó enormemente el desarrollo de la opto-
genética, puesto que para que una neurona pueda
responder a la luz solo se requiere la inserción en
las células diana de un único componente genético:
la canalrodopsina.
Desde 2005, el número de herramientas op-
togenéticas y su aplicabilidad se ha expandido
enormemente tanto por el descubrimiento de nue-
vas opsinas (el alga Volvox carteri expresa una
canalrodpsina que responde a luz amarilla, VChR1)
como por la modi�icación de las existentes de modo
que se puedan activar con diferentes longitudes
de onda mejorando su penetración en los tejidos.
Incluso ha sido posible acoplar los dominios sensi-
bles a luz de las rodopsinas a receptores acoplados
a proteínas G, de modo que se puede interferir en
el funcionamiento ya no solo de células excitables
(neuronas y células musculares) sino en otros even-
tos bioquímicos de cualquier tipo celular.
Este increíble desarrollo ha llevado a que, a
día de hoy, sea posible evocar o inhibir compor-
tamientos complejos en animales despiertos en
movimiento.
15.2. Bases moleculares
La optogenética incluye el desarrollo e inserción
dentro de células diana de genes que hagan a dichas
células responder a estímulos de luz –canalrodpsi-
nas–. Pero también requiere técnicas asociadas que
permitan la aplicación de luz en dichas células y he-
rramientas que permitan la «lectura» de los efectos
derivados de su activación para poder interpretar la
función de determinada población de neuronas en
un proceso neuro�isiológico determinado.
En este capítulo se tratarán cada uno de estos
aspectos.
15.2.1. Canalrodopsinas
Las canalrodopsinas son proteínas consistentes en
un canal permeable a iones y un dominio activado
por luz. En la naturaleza son expresadas por una se-
rie de microorganismos con diversas funciones: en
muchos procariotas, las canalrodpsinas sirven para
mantener el potencial de membrana y la homeos-
tasis iónica (necesaria para síntesis de ATP); otros
microorganismos han desarrollado opsinas que, en
respuesta a luz, modulan sus elementos motrices
 Optogenética

Figura 15.1: (A) Estructura de un dímero de ChR2 en el que se aprecian 7 dominios transmembrana, extremos C y N-terminal y el domi-
nio de unión al retinal. Modi�icado de Kato et al. 2011. (B) La llegada de un fotón provoca la isomerización de todo-trans a 13-cis retinal.
El retinal, que se encuentra de modo natural en todas las células de vertebrados, se mantiene unido a las canalrodopsinas microbianas. La
reacción provocará un cambio conformacional en la proteína que determinará la apertura de un canal catiónico

para dirigirse a ambientes iluminados que favorez-
can la fotosíntesis. Lo más fascinante es la sencillez
de su estructura, en el sentido de que un único gen
codi�ica tanto el dominio sensible a luz como el do-
minio efector responsable del movimiento iónico.
Para entender el funcionamiento de las
canalrodpsinas, hay que tener en cuenta las caracte-
rísticas de cada uno de estos dominios. En términos
generales, cuando se aplica un pulso de luz sobre
la canalrodopsina, la absorción de un fotón (en el
dominio opsina) provoca un cambio conformacio-
nal en la proteína que determinará la apertura del
dominio canal. La estructura de los dominios opsi-
nas determinará las propiedades relacionadas con
la absorción de luz (como longitud de onda, capaci-
dad de absorción o sensibilidad a luz), mientras que
la estructura de los dominios canal determinará las
propiedades cinéticas del canal iónico (tales como
apertura, inactivación, selectividad iónica o intensi-
dad de corriente).
La canalrodopsina mejor caracterizada es
ChR2; su cristalización ha sido fundamental para
entender su funcionamiento y establecer los sitios
(aminoácidos) determinantes de sus propiedades
tanto ópticas como de canal. Esto ha hecho posible,
mediante técnicas de mutagénesis dirigida, alterar
la estructura de las canalrodpsinas (modi�icar su
espectro de absorción o propiedades cinéticas del
canal) para optimizar su funcionalidad en diferen-
tes condiciones experimentales. En la �igura 15.1 se
muestra la estructura cristalizada de ChR2.
15.2.2. Dominios sensibles a luz
Cada opsina requiere la incorporación de retinal,
un cofactor orgánico derivado de la vitamina A res-
ponsable de la absorción de fotones. El complejo
opsina-retinal da lugar a la rodopsina. Las opsinas
se subdividen en dos subfamilias.
Las opsinas animales (tipo II) se encuentran
fundamentalmente en los fotoreceptores de las re-
tinas de eucariotas donde son responsables del
proceso de la fototransducción, y, por lo tanto, res-
ponsables de la visión (aunque una pequeña fracción
está implicada en regular los ritmos circadianos y la
pigmentación). Las opsinas tipo II funcionan como

355
Métodos en biociencias
receptores acoplados a proteínas G y utilizan el 11-
cis retinal. En conos y bastones, tras la absorción del
fotón, se produce la isomerización a todo-trans re-
tinal; como este proceso implica su disociación de
la opsina, para cada nuevo ciclo de activación debe-
rá reclutarse un 11-cis retinal. Este mecanismo de
acción ha inspirado el diseño de opsinas sintéticas
para el control de eventos bioquímicos (activación
de proteínas G con luz) en animales despiertos.
Las opsinas microbianas (tipo I) se encuentran
en procariotas, algas y hongos y utilizan el isómero
todo-trans-retinal, el cual isomeriza a 13-cis retinal
tras la absorción iónica, revirtiendo a todo-trans de
modo muy rápido. Al contrario que en las opsinas
tipo II, durante este proceso el retinal se mantiene
unido mediante enlace covalente a la opsina, lo cual
favorece y acelera ciclos de activación repetitivos
(~5 ms). Afortunadamente, los tejidos de mamífe-
ro examinados hasta la fecha contienen cantidades
su�icientes de retinal, con lo que no es necesario
suplementar las células diana con este componen-
te para asegurar un control óptico adecuado. Este
hecho fortuito ha sido fundamental para el rápido
desarrollo de la optogenética.
Las opsinas microbianas, al igual que las
animales, están formadas por siete dominios trans-
membrana (Figura 15.1).
Su estructura incluye un dominio de unión a
retinal (dominio opsina) que determina sus carac-
terísticas espectrales (la longitud de onda óptima
de absorción viene determinada por el carácter hi-
drofóbico de los aminoácidos en este motivo) y un
dominio efector, que es capaz de provocar el mo-
vimiento de iones a través de la membrana. Esto
puede ocurrir bien porque actúen como bombas
iónicas, traslocando iones (de modo similar a la
bomba Na+/K+/ATPasa) o como verdaderos canales
iónicos que permiten �lujo de iones. Si bien se deno-
minan dominios efectores, hay que tener en cuenta
de que trata de la misma entidad molecular –sigue
siendo opsina– en la que se encuentra el dominio de
absorción de luz.
Bombas activadas por luz
La primera bomba iónica microbiana descrita fue la
bacteriorodpsina (BR). Esta molécula es una proteí-
na transmembrana capaz de traslocar protones, en
contra de gradiente, en respuesta a luz desde el me-
dio intracelular al espacio extracelular.
Cuando el todo-trans retinal absorbe el fotón
se produce un cambio de conformación en la proteí-
na que permite el movimiento de H+. El color de BR
356
es púrpura, el más e�iciente para absorber luz verde
(500-650 nm, óptimo en 568 nm). Las halobacte-
rias, o haloarchaea, se encuentran en ambientes
saturados en sal y expresan altos niveles de BR en
bajas condiciones de oxígeno, lo que les permite
mantener un gradiente protónico para sintetizar
ATP en ausencia de respiración. BRs también se
encuentran en proteobacterias acuáticas (PRs) y,
en este caso, cada especie tiene su espectro de ac-
ción ajustado según la profundidad del océano en
la que habitan, pudiendo responder a longitudes
de onda entre el azul y el verde. El estudio de es-
tas BRs demostró que las variaciones en el espectro
de absorción están determinadas por cambios en
un único aminoácido. Si bien las BRs podrían expre-
sarse en neuronas para provocar hiperpolarización
y, por lo tanto, inhibir la actividad neuronal, se tu-
vieron que descartar porque provocan acidi�icación
del medio extracelular.
Otro tipo de bomba iónica es la halorodopsina
(HR), la cual es capaz de mantener el gradiente de
membrana transportando iones cloruro (Cl-) desde
el medio extracelular al interior. Es activada con luz
amarilla. Una forma de HR descrita en Natronomo-
nas pharaones (NpHR), fue la primera canalrodpsina
utilizada para de inhibir el comportamiento (expre-
sada en C. elegans) por la hiperpolarización celular
inducida con luz amarilla.
Canales activados por luz
Las canalrodopsinas son opsinas que permiten el
paso pasivo y no selectivo a diferente tipo de catio-
nes a través de la membrana plasmática. En ciertas
algas también median procesos de señalización ce-
lular a través de una extensión C-terminal. En la
�igura 15.1, que muestra la estructura del cristal de
ChR2, se observa que tiene dominios N y C-terminal
complejos, pero para las aplicaciones optogenéticas
solo se utiliza el fragmento 7-TM, dado que en altas
condiciones lumínicas contribuye al 80% de la co-
rriente total.
La primera canalrodposina descrita fue ChR1,
identi�icada en Chlamydomonas reinhardtii, un alga
verde unicelular de agua dulce y templada. Pos-
teriormente en el mismo organismo se describió
ChR2. Ambas tienen cinéticas rápidas de activación
y desactivación. Cuando se introducen en neuronas,
las ChRs se insertan en la membrana plasmáti-
ca y evocan cambios en el potencial de membrana
en reposo en respuesta a luz azul (máxima absor-
ción 470nm). Cuando el todo-trans retinal absorbe
un fotón se provoca un cambio conformacional de
la proteína-canal transmembrana que abre un poro
 Optogenética

Figura 15.2: En el panel superior se presenta un esquema del funcionamiento de las moléculas de la optogenética. Las canalropodsinas
conducen cationes y despolarizan neuronas cuando son iluminados (ChR2 y VChR1). Las halorodopsinas transportan iones cloruro al inte-
rior celular provocando una hiperpolarización, cuando son iluminados con luz amarilla (NpHR). Las OptoXRs son quimeras de rodopsinas
acopladas a proteínas G, en respuesta a luz verde activan vías de segundos mensajeros. El panel inferior presenta el objetivo �inal de la op-
togenética: modular la actividad de una neurona por medio de la luz. En este caso, la iluminación con luz azul provocaría en la neurona
el disparo de potenciales de acción (entrada de cargas positivas a través ChR2) que serían inhibidos al iluminar la misma neurona con luz
amarilla (entrada de cargas negativas a través de NpHR).

de ~ 6 Å permeable a Na+, H+, K+ y Ca2+. En el orden
de milisegundos, el retinal vuelve a la conformación
inicial, cerrándose el poro. La principal desventaja
de ChR2 es su alto nivel de desensibilización, ya que
tras la primera iluminación se reduce en un 80% su
conducción y requiere ~25 s para su completa recu-
peración en oscuridad.
Posteriormente se describieron canalrodopsi-
nas como VChR1 que se excita con luz roja (535 nm)
y que se expresa de modo natural en el alga Volvox
carteri.
En la �igura 15.2 se muestra una imagen resu-
men de las opsinas bacterianas que funcionan como
canales y bombas iónicas o como receptores acopla-
das a proteínas G.
Las propiedades distintivas de las opsinas bac-
terianas vienen dadas por diferentes características
en su respuesta a la luz y las propiedades cinéticas
del canal.
Conductancia de los canales
La cantidad de cationes que �luyan a través de un ca-
nalrodopsina determinará si la despolarización de
su membrana es su�iciente como para alcanzar el
potencial umbral y provocar el disparo de potencia-
les de acción. Ese �lujo de iones o «fotocorriente»,
viene determinado por la sensibilidad de la luz de
la opsina (probabilidad de absorción y posterior
probabilidad de reacción), su espectro de absor-

357
Métodos en biociencias
ción (longitud de onda de la luz a la que responden)
y la intensidad de iluminación que reciba por uni-
dad de área (mW/mm2). En condiciones óptimas, la
conductancia estimada de un canal único de ChR2
es inferior a 1 pS (Siemens), muy por debajo de la
conductancia de cualquier otro canal de membra-
na. Esta conductancia va a determinar la efectividad
de la despolarización inducida por luz. En una célu-
la de 50 MOhm (valor típico de resistencia en una
neurona de cerebro) la presencia de 500.000 cana-
les funcionales que se abrieran simultáneamente
provocarían una despolarización de ~15 mV, insu�i-
ciente para alcanzar el potencial umbral de disparo.
Por lo tanto, es imprescindible optimizar la expre-
sión de los canales en las células diana.
Selectividad
Todos los canales son permeables a H+, Na+, K+ y Ca2+
y tienen un potencial de equilibrio (o potencial de re-
versión) de ~0 mV, con lo que las despolarizaciones
que se consiguen no son muy fuertes. Es importante
conseguir modi�icaciones que mejoren la selectivi-
dad del canal y optimicen el �lujo de iones.
Cinética
Tras abrirse, las ChRs, han de cerrarse rápidamente
después para conseguir la repolarización de la neu-
rona. La rapidez de apertura y cierre o «fotociclo» es
un factor crítico para conseguir una manipulación
precisa del potencial de membrana que, además,
determinará la frecuencia de disparo de dicha neu-
rona (es decir, la velocidad para generar potenciales
de acción). Teniendo en cuenta que ciertas neuro-
nas son capaces de disparar a frecuencias de 200
Hz, deberían ser capaces de completar fotociclos de
~5 ms. Sin embargo, existe una correlación nega-
tiva entre amplitud de fotocorriente y cinética del
canal: a nivel termodinámico se explica porque la
estabilización del estado abierto del canal ralentiza
el cierre del canal.
Desensibilización y recuperación
En presencia de iluminación continua o inten-
sa la respuesta de las ChR2 decae en un 80%. Esto
requiere la expresión de 5 veces más canales fun-
cionales para conseguir una despolarización por
encima del umbral tras la desensibilización y evitar
fallos en el disparo. Para ser capaces de evocar dis-
paros consistentes con pulsos de luz prolongados,
358
las ChR deben exhibir desensibilización mínima du-
rante la iluminación y recuperarse rápidamente en
oscuridad.
Respuesta al espectro
En algunas ChRs, los componentes de las corrientes
máxima y del estado estacionario pueden tener pi-
cos de excitación su�icientemente separados en el
espectro. En este caso, es posible utilizar una longi-
tud de onda para abrir el canal y otra diferente para
cerrarlo, consiguiendo un control muy exacto de las
fotocorrientes. A este tipo de canalrodpsinas se las
denomina de «función escalonada».
Tráfico y localización en membrana
Mientras que una baja expresión o una agregación de
ChR puede reducir la efectividad de la despolariza-
ción, una sobre-expresión de proteína exógena puede
ser tóxica o afectar las propiedades de membrana.
15.2.3. Modificaciones genéticas
de las canalrodopsinas
A día de hoy y a pesar de la cristalización de ChR2
–en su conformación en oscuridad–, todavía existen
muchas incógnitas sobre los motivos y residuos que
determinan los parámetros anteriores. Sin embar-
go, desde que ChR2 fuera descrita por primera vez
se han desarrollado mutantes especí�icos, identi�i-
cado ChR en otras algas o construido quimeras que
combinan varias ChRs con objeto de modi�icar su se-
lectividad de activación por luz, cinética o magnitud
de las corrientes que evocan. Ciertas modi�icacio-
nes puntuales aceleran su cinética, de modo que
serían capaces de seguir frecuencias de hasta 200
Hz. Otras mutaciones consiguen retrasar el cierre
del canal después de su activación óptica de modo
que se tiene ahora una canalrodopsina super sensi-
ble a luz azul cuyo cierre puede controlarse con un
pulso de luz verde o amarilla. Otras mutaciones son
capaces de aumentar la fotocorriente. Mutaciones
dirigidas a cambiar el espectro de activación permi-
ten que la expresión de diferentes canalrodopsinas
en un mismo tejido pueda determinar modulacio-
nes dobles. La mayoría de estas mutaciones se han
elegido en base a homologías de los dominios T3-
T7 entre ChRs y BRs, dado que esta última es una
de las proteínas de membrana mejor caracteriza-
das. Otras aproximaciones se basan en la búsqueda
de nuevas opsinas para llevar a cabo comparaciones
genómicas que permitan entender las bases mole-
culares de su funcionamiento.
 Optogenética

Cuadro 15.1: En esta tabla se recogen algunos ejemplos de mutaciones que mejoran alguna de las características de las canalrodpsinas.
Modi�icada de Zhang et al. 2010.

Opsina Organismo Activación  Propiedades Sistemas Experimentales

nm)

ChR2 Salvaje Chlamydomonas 470 Rápida activación y desactivación (t, ~10ms) .

reinhardtii In vitro: neuronas en
Usado para provocar disparos unitarios o cultivo, rodajas cerebro
trenes de frecuencias hasta ~ 40 Hz). ratas y ratones

ChR2 (H134R) 470 Mayor fotocorriente y selectividad a Na+,

cinética lenta (t,~18 ms), menor inactivación.
Buena expresión neuronal In vivo: C. elegans, D.
melanogaster, pez ce-
ChETAs Chlamydomonas 470-495 bra, pollo, ratón, rata y
reinhardtii Inactivación más rápida (t, ~ 4 ms), activación
primates
a frecuencias 200 Hz (interneuronas)

Función Escalona- 470 activas

da ChRs (C128A, In vitro: neuronas en
Desactivadas por luz
C128S, C128T) (546 inacti- cultivo
vas)

VChR1 Volvox carteri 535-589 In vitro: neuronas en

Espectro diferente a ChR2
cultivo

NpHR, eNpHR Natromonas 589

Bomba de se Clrequiere
- aplicación
. Utilizada para de luz In
hiperpolarizar constante. La en
vitro: neuronas activa-
pharaonis cultivo
ción con luz amarilla (590
con alta resolución temporal. Inhibe disparos nm) permite activación
de potencial de acción. Manti
independiente deene de modo
ChR2 y por loIntanto
vivo: C.la modulación
elegans, y
sostenido hiperpolarizaciones
bidireccional de la actividad neuronal ratones si se expre-
san simultáneamente en la misma célula.
opto a1 AR Sintéticas 500 In vitro: células HEK
Uno
Activa proteínas Gq yde
Gslos primeros
respectivamente pasos para llevar a cabo
opto b1 AR cualquier experimento de optogenética es elegir la
In vivo: ratones
opsina, lo cual va a determinar posteriormente la
En cualquier caso, hay que tener en cuenta longitud de onda y la intensidad de luz necesaria
que las mejoras en algunas propiedades pueden su- para poder activarla.
poner una desventaja para otras (un aumento de
fotocorriente puede alterar simultáneamente la ci-
nética de cierre). En el cuadro 15.1 se muestra un 15.3. Expresión de canalrodopsinas
resumen de los efectos más relevantes consegui- en células diana
dos con mutagénesis dirigida y la �igura 15.3 ilustra
algunos ejemplos de mutaciones que optimizan al- Uno de los factores limitantes en optogenética es la
guno de los parámetros anteriores. baja tolerabilidad de las células de mamífero por el
Como se había indicado, los efectos inhibi- material genético microbiano, pero con técnicas de
torios se consiguen con las bombas iónicas, en biología molecular es posible insertar genes de op-
particular NpHR. Hay que tener en cuenta que, en sinas en fragmentos de DNA mamífero asegurando
este caso, la absorción del fotón va a provocar la que estos se transporten al sitio adecuado y den lu-
traslocación de un único ion, con lo que las corrien- gar a proteínas funcionales.
tes que se generan a través de estas bombas iónicas Además, como la conductancia de un canal
son inferiores a los picosiemens. Por lo que para es tan pequeña, es fundamental que se optimice la
conseguir los efectos hiperpolarizantes deseados transcripción, traducción, plegamiento, trá�ico e in-

359
Métodos en biociencias

Figura 15.3: Mutaciones dirigidas a mejorar las fotocorrientes de ChRs. En (A) se muestra el resultado de una mutación (en C 128) de ChR2
que aumenta la fotocorriente y disminuye la desensibilización cuando se expresa en un oocito. En (B) se muestran las respuestas, en forma
de potenciales de acción, evocadas por pulsos de luz azul a 40 Hz cuando ChR2 y diferentes mutantes se expresan en neuronas piramidales.
Nótese cómo la ChR2 salvaje (wt) solo es capaz de disparar durante los primeros segundos, y los diferentes mutantes (HR, TC y ET/TC) con-
siguen mejorar la precisión temporal del disparo (fotociclo más corto). Además, el mutante TC es mucho más sensible, puesto que es capaz
de responder a muy bajas intensidades de luz. Modificado de Berndt et al. 2011.

serción en membrana. Una vez que se ha clonado la
opsina deseada (ChRs, VChRs, NpHR o variaciones
de estas), es posible mejorar sus niveles de expre-
sión en neuronas de mamífero sustituyendo codones
microbianos por otros mamíferos (denominadas
«ChRs humanizadas»). Otras modi�icaciones se ba-
san en la inclusión de los denominados motivos de
trá�ico, como los del retículo endoplásmico. Otra
variante es conseguir que las opsinas se puedan in-
sertar en diferentes partes de la neurona añadiendo
elementos de localización especí�icos. Por ejemplo,
existen fusiones ChR2 con el dominio de unión mio-
sina Va con la que se consigue la localización de las
ChR2 en el árbol dendrítico de las neuronas. Una
fusión con el dominio ankirina G de los canales de
Na+ dependientes de voltaje permitiría su localiza-
ción en el segmento inicial de las neuronas (o sitio
donde se genera el potencial de acción tras el proce-
so de integración somático). ChR2 unida al dominio
PDZ (responsable de la agrupación de canales tipo
NMDA) permitiría una localización preferencial
post-sináptica.
Ahora, para conseguir el control preciso de
determinada población neuronal, es fundamental
expresar de forma especí�ica las canalrodpsinas en
la población de interés, lo cual se consigue funda-
mentalmente mediante tres abordajes.
15.3.1. Sistemas de expresión víricos
El uso de vectores virales es el método más po-
pular para la administración de herramientas
optogenéticas en sistemas intactos. Los vectores
víricos basados en lentivirus y virus-adeno-asocia-
dos (AAV) han conseguido la expresión de opsinas
en un amplio rango de animales experimentales,
incluyendo primates. La expresión vírica tiene nu-
merosas ventajas, como puede ser la rapidez y
�lexibilidad de la implementación, elevada potencia
derivada de una alta copia de genes (> 109 unidades
de transducción/ml y >1012 copias genómicas/ml
para lentivirus y AAV respectivamente) cuya expre-
sión funcional se consigue en ~2-3 semanas (si bien
en ocasiones pueden necesitarse periodos de ~6
semanas) y los altos niveles de expresión se man-
tienen durante largos periodos de tiempo (varios
meses) sin que se hayan reportado efectos adver-
sos.
Lo más importante es asegurar la especi�icidad
para su inserción en la población neuronal deseada.

360

Si bien existen virus que atacan de modo especí�ico
poblaciones neuronales (por ejemplo, herpexvirus),
lo más frecuente es utilizar promotores especí�icos.
El problema es que no se pueden utilizar fragmentos
muy grandes de promotores para empaquetarlos
junto con las opsinas en un virus y a día de hoy sigue
siendo un reto el encontrar fragmentos promotores
de tipos neuronales específicos lo suficientemente
pequeños para ser empaquetados en cargas virales.
Una de las estrategias que se han utiliza-
do para conseguir especi�icidad en la expresión es
el diseño de vectores virales dependientes de re-
combinasa Cre, aprovechando el amplio banco de
ratones transgénicos que expresan recombinasa
Cre en diferentes tejidos y tipos celulares. De este
modo, cuando un AAV portador de una ChR + re-
combinasa Cre se inyecta en un ratón, dicha ChR
solo se expresará en aquellas células que contengan
recombinasa Cre.
15.3.2 Ratones transgénicos
Si bien es más complejo que la expresión vírica, la
expresión de la opsina en el sitio deseado es más
�iable. Las líneas de ratones Thy1:ChR2-EYFP y
Thy1:NpHR-EYFP expresan ChRs bajo el promotor
Thy1. Aunque Thy1 se encuentra de modo general
en todas las neuronas de proyección, la activación
especí�ica de la neurona diana se consigue al esti-
mular de modo preciso el lugar de interés.
15.3.3 Electroporación
Esta aproximación se utiliza en neuronas embrio-
narias mediante la inyección in utero. Como se usan
plásmidos desnudos, que permiten la inserción de
DNA de cualquier tamaño, se pueden utilizar pro-
motores más largos que mejoren la especi�icidad de
la expresión
15.4. Aplicación de luz
La optogenética se fundamenta en la aplicación de
luz. Una vez que la opsina elegida se expresa en la
célula de interés habrá que pensar cómo se apli-
ca la luz teniendo en cuenta cual es el objetivo del
experimento. No es lo mismo conseguir provocar
disparos rápidos en una preparación in vitro de ro-
daja de cerebro que evocar un comportamiento con
la aplicación prolongada de luz en un animal des-
pierto; en la inmensa mayoría de organismos la luz
no alcanza el interior del cerebro. Ya se ha explica-
do que la fotocorriente en una neurona depende de
361
Optogenética
varios factores de la opsina expresada: longitud de
onda, intensidad y duración de la luz y el estado tras
la primera iluminación
Cuando se iluminan células en cultivo a través
de un microscopio la intensidad de luz azul (473
nm) necesaria para provocar la apertura de ChRs y
manipular la actividad neuronal ha de ser de ~1-10
mW/mm2. Para un estudio en cultivo bastaría con
dividir toda la intensidad de la luz emitida por el
área iluminada, pero si se aplica en una rodaja in
vitro o en un cerebro intacto hay que tener en cuen-
ta la profundidad y el volumen de tejido que tienen
que ser expuestos a luz, dado que la luz proyecta-
da sobre una rodaja declina exponencialmente al
aumentar la profundidad. La solución en este caso
no pasa por aumentar la intensidad, dado que tam-
bién aumentaría su difusión, pudiendo llegar, por
ejemplo, a la retina (lo que provocaría un efecto
no especí�ico en estudios en animales despiertos
en movimiento). Un exceso de iluminación puede
provocar fototoxicidad en células vecinas e inclu-
so aumentos locales de temperatura que podrían
dañar las células. Afortunadamente, las longitudes
de onda más largas dispersan menos y, por lo tanto,
pueden llegar a zonas más profundas. Parte de las
modi�icaciones de las ChRs han tenido como objeti-
vo expandir su espectro de activación, consiguiendo
ChRs activadas con luz roja. Finalmente, hay que te-
ner en cuenta la posibilidad de cambiar según se
requiera el tamaño de los pulsos de luz y la frecuen-
cia de aplicación.
Las fuentes de luz que se usan son láser o
LEDs. En cualquier caso, tienen que poder utilizar
diferentes longitudes de onda que abarquen el es-
pectro de activación de diferentes opsinas. Además,
la intensidad de emisión debe ser ajustable, pues-
to que pueden existir variaciones en la expresión de
las opsinas en diferentes condiciones experimen-
tales y debe mantenerse constante a lo largo del
experimento.
El uso de láser o LED vendrá dado por las re-
querimientos experimentales de cada laboratorio.
Hay cierta tendencia a inclinarse por fuentes LED,
dado que son más económicas, �iables y más fáci-
les de controlar que los láser. Además, existen LEDs
de muchos colores (variedad en el espectro de emi-
sión). Su pequeño tamaño permite su incorporación
en implantes �ijos en animales de experimentación
que permiten la aplicación de luz sin cables. Sin em-
bargo, aunque un LED individual puede emitir hasta
5 vatios de luz, esta se emite en todas las direccio-
nes en vez de en un haz coherente. Por lo tanto, al
acoplarlo a una �ibra óptica se pierde la mayor par-
te de esta intensidad, llegando al sitio de interés
intensidades de pocos milivatios (insu�icientes para
Métodos en biociencias

Figura 15.4: Video-secuencia (1-6: fotogramas tomados a intervalos de 60 ms) de una larva mutante de pez cebra (que
expresa ChR2 en ciertas células del techo óptico) en natación libre que por efecto de estimulación lumínica en su campo
de natación, comienza a nadar marcha atrás . (Modi�icado de Fajardo et al. 2013). En 7 se muestra la superposición de
los 6 fotogramas anteriores, la línea horizontal representa la escala (1 mm).

activar ChR2). Los láser, sin embargo, no sufren este inserción de las opsinas tiene que ser suplementada
problema. con retinal) o pez cebra. Los estudios en estos orga-
nismos sencillos ofrecen la gran ventaja de que al
ser transparentes, la luz aplicada llega directamen-
15.5. Lectura optogenética te a sus neuronas. En la �igura 15.4 se muestra un
en diversos modelos animales

No hay que perder de vista que la optogenética es

una estrategia para estimular células excitables.
Para poder evaluar los efectos de la activación op-
togenética de una población de neuronas se utilizan
técnicas de neurociencias basadas en la visualiza-
ción o registro de actividad neuronal.
Los colorantes sensibles a voltaje (VSD)
que sirven para monitorizar la actividad eléctri-
ca de una población de neuronas in vivo e in vitro
son moléculas lipo�ílicas cuyas propiedades ópti-
cas de absorción o emisión dependen del potencial
de membrana de la neurona. Son perfectamente
compatibles con la optogenética puesto que sus es-
pectros de absorción (por ejemplo, RH-155, ~700
nm) están su�icientemente separados de los espec-
tros de absorción de los de las ChR2, VChR1 y NpHR.
Las técnicas de electro�isiología se utilizan
tanto en preparaciones in vitro como in vivo. La
primera lectura electro�isiológica en un experimen-
to in vivo se consiguió acoplando un electrodo de
metal al sistema de iluminación. Precisamente los
implantes crónicos para la aplicación de luz se es-
tán combinando con matrices de multielectrodos
Figura 15.5: En la �igura se muestra un esquema de un
para conseguir registros electro�isiológicos de una implante crónico de una �ibra óptica en un cerebro de
población de neuronas ratón. Con el animal anestesiado y utilizando atlas anató-
micos y coordinadas esterotáxicas, se introduce una guía
Sin embargo, la evaluación del comportamien- hasta el núcleo/estructura que se desee estimular con
to en un animal despierto en movimiento sigue luz. Esta guía, que se �ija al cráneo del ratón con cemen-
siendo la lectura más espectacular que se puede to dental, sirve para insertar la �ibra óptica. Las �ibras
están conectadas a fuentes de iluminación remotas (lá-
hacer con las técnicas de optogenética. Se han es- ser o LED) o montadas sobre el propio implante (LEDs
tudiado comportamiento en organismos sencillos miniatura)de modo tal que los ratones se pueden mover
como C. elegans, Drosophila (en estos dos casos, la libremente con estos implantes �ijos.

362

Figura 15.6: En esta �igura se muestra un ejem-
plo del efecto de activación optogenética sobre el
comportamiento de un ratón despierto utilizando
el test de preferencia de lugar. En este tipo de es-
tudios se monitoriza automáticamente el tiempo
que los ratones pasan en cada uno de dos com-
partimentos conectados entre sí. En el caso de este
experimento, cuando el ratón está en el comparti-
mento de la izquierda, se provoca la estimulación
optogenética de neuronas situadas en la habénula
lateral (un tipo de neuronas denominadas «re-
compensa-negativo» que se activan con estímulos
«negativos»). Como se aprecia en el panel superior,
la activación en ratones ChR2 provoca un compor-
tamiento aversivo dado que los ratones evitan ese
compartimento (la línea señala un menor recorri-
do total). Sin embargo, los ratones controles, que
no expresan ChR2, se mueven indistintamente en
ambos compartimentos (nótese que el recorrido
del ratón es similar en ambos compartimentos) in-
cluso durante la estimulación con luz. Adaptado de
Stamakis y Stuber 2012.
ejemplo del control del comportamiento motor evo-
cado por luz en una larva de pez cebra.
A día de hoy, los estudios más llamativos son
los que se han llevado a cabo en ratones despiertos
y los que han generado mayor cantidad de publica-
ciones. Mediante la inserción de diferentes opsinas
en estructuras especí�icas encefálicas, ha sido po-
sible controlar circuitos neuronales implicados en
funciones superiores complejas. Para este tipo de
estudios es imprescindible conseguir la estimu-
lación de las células diana mientras el animal se
mueve libremente, de modo que el comportamien-
to evocado pueda relacionarse directamente con la
activación especí�ica de un circuito (y no a manipu-
laciones del experimentador). Como se esquematiza
en la �igura 15.5, esto se consigue mediante el im-
plante crónico de �ibras ópticas en el cerebro de los
animales experimentales. Dichos implantes pueden
363
Optogenética
incluir sistemas de registro electro�isiológico mi-
niaturizado.
Con estos arreglos ha sido posible contro-
lar circuitos implicados en la regulación del ciclo
sueño-vigilia (estimulación optogenética en el hipo-
tálamo), circuitos relacionados con en el control del
miedo y ansiedad (estimulación optogenética en la
amígdala), circuitos relacionados con la adicción
(estimulación optogenética en el núcleo accum-
bens) o la aversión, (ver �igura 15.6). Con respecto
a patologías neurológicas, el uso de herramientas
optogenéticas ha sido capaz de generar o inhibir
alteraciones motoras típicas de la enfermedad de
Parkinson en ratones.
Pero quizás una de las aplicaciones más llama-
tivas ha sido la recuperación de la visión en animales
con un tipo de ceguera provocada por la pérdida de
fotorreceptores en la retina (retinitis pigmentosa).
En la misma línea, la expresión de NpHR en conos
insensibles en retinas humanas ex vivo (obtenidas
de pacientes con retinitis pigmentosa) fue capaz de
restaurar el proceso fototransducción normal. La
gran ventaja de este tipo de aplicaciones optogené-
ticas es que la activación de las opsinas se consigue
con la luz natural y abre las puertas a una posible te-
rapia génica en pacientes con este tipo de ceguera.
Bibliografía
Berndt A, Schoenenberger P, Mattis J, Tye KM, Deisseroth
K, Hegemann P et al. 2011. High-efficiency Channelrho-
dopsins for Fast Neuronal Stimulation at Low Light Levels.
PNAS 108(18):7595-600. doi: 10.1073/pnas.1017210108.
Busskamp V, Duebel J, Balya D, Fradot M, Viney TJ, Siegert
S et al. 2010. Genetic Reactivation of Cone Photoreceptors
Restores Visual Responses in Retinitis Pigmentosa. Science
329:413-7.
Fajardo O, Zhu P, Friedrich RW. 2013. Control of a Specific
Motor Program by a Small Brain Area in Zebrafish. Front
Neural Circuits. 7:67.
Kato HE, Zhang F, Yizhar O, Ramakrishnan C, Nishizawa T,
Hirata K et al. 2012. Crystal Structure of the Channelrho-
dopsin Light-gated Cation Channel. Nature. 482(7385):369-
74.
Lin JY. 2011. A User’s Guide to Channelrhodopsin Variants:
Features, Limitations and Future Developments. Exp
Physiol 96 1:19:25.
Stamatakis AM. Stuber GD. 2012. Activation of Lateral
Habenula Inputs to the Ventral Midbrain Promotes Behav-
Métodos en biociencias
ioral Avoidance. Nature Neuroscience 15:1105–1107
Zhang F, Gradinaru V, Adamantidis AR, Durand R, Airan RD,
de Lecea L et al. 2010. Optogenetic Interrogation of Neural
Circuits: Technology for Probing Mammalian Brain Struc-
tures. Nat Protoc 5(3):439-56. doi: 10.1038/nprot.2009.226.
Epub 2010 Feb 18.
364
http://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/
En el sitio web, desarrollado por el laboratorio del Dr.
Deisseroth en Standford, se tiene acceso abierto a los
trabajos de revisión más relevantes de su laboratorio.
Incluye una lista con la secuencia y propiedades de las
diferentes ChR, protocolos para la preparación de vecto-

La imagen digital
Una imagen puede de�inirse, de modo general, como
una representación visual de los elementos �ísicos
(objetos) que nos rodean. Estas representaciones
pueden ser realizadas mediante diferentes medios
y técnicas: pinceles (pintura), buriles (grabados),
cámaras (fotogra�ía, vídeo), etc. Cuando las imáge-
nes son obtenidas, editadas y presentadas mediante
dispositivos digitales (cámaras fotográ�icas, vídeos,
ordenadores, escáneres, fotocopiadoras…) se les
denomina genéricamente imágenes digitales.
Según el modo de representación, las imá-
genes digitales pueden agruparse en dos grandes
bloques:
a) Los mapas de bits (bitmaps), también
llamadas imágenes rasterizadas, que no
son otra cosa que un conjunto de píxeles.
b) Los grá�icos o imágenes vectoriales en
los que el objeto es representado por sus
atributos matemáticos.
Aunque en este capítulo se tratará la representa-
ción mediante mapas de bits, es conveniente citar,
de forma general, las principales características de
estos dos tipos de imágenes. En los mapas de bits
la imagen se forma mediante una matriz de píxeles
que llevan aparejada información sobre la luz, cada
píxel se puede manipular individualmente y son es-
16.
Guillermo Bodega
Julio Bodega
pecialmente idóneos para las técnicas de fotogra�ía
y vídeo. En los grá�icos la imagen se genera a partir
de entes denominados vectores, que pueden con-
siderarse como conjuntos de puntos controlables
mediante algoritmos matemáticos. Los vectores es-
tán formados por las denominadas curvas de Bézier,
que permiten mucha �lexibilidad a la hora de gene-
rar imágenes. Por ello se utilizan principalmente
en diseño grá�ico y representaciones de dibujo in-
dustrial. Por último, los archivos de los grá�icos son
de menor tamaño que los archivos de los mapas de
bits.
16.1. Los mapas de bits
16.1.1. Conceptos generales. El píxel
Una imagen digital recibe este nombre pues lo que
representa puede codi�icarse como un conjunto de
números (dígitos). La cuestión que surge de forma
inmediata es cómo es posible transformar una ima-
gen en números. El procedimiento que permite esa
transformación recibe el nombre de digitalización
y para ello es imprescindible fragmentar en unida-
des discretas los dos componentes de toda imagen:
el espacio y la luz (intensidad o tono). La fragmenta-
Métodos en biociencias
Figura 16.1: Izquierda: melanocito de la escama de un pez. Derecha: imagen aumentada del
cuadro de la imagen del lado derecho. La cuadrícula se ha añadido para facilitar la visuali-
zación de los píxeles.
ción del espacio se hace dividiendo la super�icie de
la imagen en pequeñas unidades de super�icie per-
fectamente ordenadas en �ilas y columnas (Figura
16.1). Cada unidad de super�icie recibe el nombre
de píxel (picture element). Esta división es compara-
ble a la que puede presentar la super�icie del suelo
de una habitación, donde cada una de las baldosas
sería equiparable a un píxel.
La fragmentación de la luz, más correctamente
de la intensidad de la luz, se hace mediante la gene-
ración de niveles discretos de intensidad luminosa.
En una imagen en blanco y negro la intensidad de
luz se podría representar como una función cuyos
extremos son el blanco (máxima intensidad de luz)
y el negro (ausencia de luz), con grises intermedios
que se distribuyen de forma continua. Para poder
facilitar la digitalización es fundamental dividir esta
luz continua en niveles discretos a los que se da un
valor numérico. Dado que en este caso se ha consi-
derado una imagen en blanco y negro, estos niveles
discretos reciben el nombre de niveles de gris (Fi-
gura 16.2).
Recapitulando, la imagen digital no es otra
cosa que un conjunto de píxeles, ordenados numéri-
366
camente en �ilas y columnas, que llevan asociado un
número que representa un nivel de intensidad de
luz asignado a todos y cada uno de ellos; por tanto,
la imagen ya no es otra cosa que números (dígitos).
16.1.2. Tamaño de imagen y la resolución
El tamaño de una imagen digital lo determina el
número de píxeles que la componen, y se obtiene
multiplicando el número de píxeles que hay en una
�ila por los que hay en una columna. Por ejemplo,
si una imagen posee 40 píxeles por �ila y 30 píxeles
por columna, esa imagen tendrá 1200 píxeles
(40x30). En principio parece lo mismo indicar 1200
píxeles que 40x30; sin embargo, el 40x30 es más
útil pues también informa del formato de la imagen;
nótese que con 1200 píxeles pueden darse diferen-
tes formatos (30x40, 60x20, 50x24...) que generan
imágenes más planas, más altas o más cuadradas.
El píxel es la unidad de super�icie; sin embargo, es
adimensional hasta que la imagen no se sustancia
en una super�icie, es en ese instante cuando el píxel
adquiere una determinada dimensión y entonces es
más correcto hablar de resolución.
Figu-
 La imagen digital

Figura 16.3: Efecto de la resolución sobre el tamaño del píxel. Los cuadrados miden 1 pulgada
de lado (2.54 cm). En el cuadrado A (resolución de 5 ppp) el tamaño del píxel es de 50 mm, en el
cuadrado B (resolución de 10 ppp) de 2.5 mm, en el C (resolución de 20 ppp) de 1.25 mm, y en el
D (resolución de 40 ppp) de 0.62 mm.

La resolución de una imagen impresa es el nú-
mero de píxeles por unidad de longitud, donde la
pulgada (inch) es la unidad de uso más común y
equivale a 2.54 cm (Figura 16.3). Por ello la resolu-
ción se abrevia como ppi (pixel per inch) o ppp (píxel
por pulgada).También se utiliza el cm como unidad
de longitud (ppcm). Para transformar estas unida-
des de resolución solo hay que realizar el cociente:
ppcm=ppi/2.54. Por ejemplo, 300 ppp equivalen a
119 ppcm. El concepto de resolución permite saber
lo que mide un píxel. Por ejemplo, para una reso-
lución de 300 ppp cada píxel mide 84.6 μm: solo
hay que dividir 25400 μm de una pulgada entre los
300 píxeles que tiene cada una. El poder de reso-
lución del ojo humano ante una imagen impresa
es de 0.2 mm (200 μm), por lo que teóricamen-
te se podrían ver píxeles mayores de este tamaño.
A un tamaño de 200 μm por píxel le corresponde
una resolución de 127 ppp, por lo que, teóricamen-
te, resoluciones inferiores a este valor permitirían
distinguir los píxeles de una imagen, efecto que se
conoce como pixelado de la imagen (Figura 16.4).
El empleo de 200 ppp como resolución de escaneo
es bastante usual en los escáneres, y es razonable
pues no genera una imagen demasiado grande e in-
cluso permite un cierto grado de ampliación sin que
se produzca el pixelado; nótese que a esa resolución
se puede ampliar 1.57 veces (200/127) hasta que el
píxel alcanza el tamaño de 200 μm. Cuando se tra-
ta con imágenes que van a utilizarse en internet la
resolución óptima suele ser de 72 ppp, valor sensi-
blemente menor que el de las imágenes impresas.
En numerosas ocasiones la representación y
edición de imágenes digitales se realiza mediante
ordenadores personales, por lo tanto, es necesario
tener siempre presente que la resolución de la ima-
gen tratada está limitada por la de la pantalla del
ordenador. Para aclarar esto considérese un orde-
nador de 21.45 pulgadas (longitud de la diagonal),
con resolución de pantalla de 1920x1080 píxeles
(formato 16/9), lo que signi�ica que el ancho de la
pantalla será de 18.7 pulgadas y su resolución de
103 ppp (1920/18.7), por lo que ninguna imagen
representada en la pantalla podrá aparecer con una
resolución mayor que esa.

Figura 16.4: Efecto de pixelado en el melanocito de la �igura 16.1. La resolución de la imagen de la

izquierda es de 20 ppp, la del centro de 75 ppp y la de la derecha de 200 ppp.

367
Métodos en biociencias
El número de píxeles de una imagen puede ser
cambiado: reducido o aumentado. Si se aumenta se
dice que se está interpolando o remuestreando y
para ello hay que «inventarse» píxeles. Si se redu-
ce, se habla de interpolación a la baja o reducción.
La interpolación genera nuevos píxeles y les adju-
dica un valor de intensidad de luz en función de los
píxeles circundantes, aunque considerándolos de
diferente manera según el método. La interpolación
bilineal, bicúbica y de vecino más cercano (nearest
neighbor) son los métodos más habituales.
La resolución también puede ser modi�icada,
y hay dos maneras de hacerlo. (a) Sin interpolar, en
este caso solo varía la resolución pero no el tamaño
en píxeles de la imagen; por ejemplo, una imagen
de 10 x 5 cm con una resolución de 300 ppp tiene
0.697 Mp, pero podría pasar a tener 400 ppp y el
mismo tamaño (0.69 Mp) a cambio de hacerla más
pequeña (7.5 x 3.75 cm). (b) Interpolando, en este
caso se mantiene el tamaño y se modi�ica solo el nú-
mero de píxeles al alza o a la baja; por ejemplo la
imagen podría ser de 400 ppp o de 200 ppp pero
siempre de 10 x 5 cm; en el primer caso tendría 1.24
Mp y 0.31 Mp en el segundo.
El tamaño (número de píxeles) de una imagen
es un parámetro a tener en cuenta dependiendo del
uso que se le vaya a dar, pues parece obvio que con-
viene adecuar el número de píxeles de una imagen
teniendo en cuenta su formato �inal; por ejemplo,
no tiene mucho sentido utilizar imágenes con un
número muy alto de píxeles si el resultado �inal va a
ser una imagen de pequeño tamaño.
16.1.3. Resolución de entrada, de salida
y de impresión
La resolución de entrada hace referencia a dispo-
sitivos de captura de imágenes como pueden ser
cámaras o escáneres, y es la resolución de digita-
lización de la imagen. El valor de la resolución de
entrada puede ir de 50 a 6000 ppp, pero es nece-
sario hacer algunas consideraciones. De copias
fotográ�icas normalmente no se pueden sacar más
de 400 ppp en el mejor de los casos, de negativos
o diapositivas se puede ir por encima de los 1600
ppp. Por otra parte, los fabricantes suelen exagerar
las características técnicas de los aparatos digita-
les que ofrecen en el mercado. En muchas ocasiones
no aclaran los conceptos de resolución óptica (li-
mitada por las lentes del dispositivo) y resolución
digital que aumenta el tamaño de la imagen pero no
resuelve pues se consigue mediante interpolación.
La resolución de salida se re�iere a la que el
ordenador envía desde un programa a un disposi-
368
tivo para imprimir. Es necesario saber cuál será el
tamaño �inal de la imagen para saber cuál es la re-
solución de salida adecuada. Baste recordar que a
menos de 127 ppp se empieza a notar el píxelado.
Dicho de otra manera, la resolución adecuada de
salida debe ser aquella en la que los píxeles de la
imagen que se va a imprimir midan menos de 200
μm (poder de resolución del ojo humano).
La resolución de impresión hace referencia al
número de puntos que la impresora pinta en cada
pulgada de papel, y se suele indicar con el término
«dpi» (dots per inch). Una buena calidad se obtiene
a partir de 200 dpi o más, tal como hacen las im-
presoras de tinta y las impresoras láser, pero no las
matriciales. El rango de dpi que los fabricantes indi-
can en las impresoras de inyección de tinta suele ir
de 1200 a 9600 dpi, que parecen valores muy altos,
pero, en realidad, hacen referencia al número de go-
tas de tinta por pulgada de papel (Figura 16.5). Una
impresora necesita como mínimo 4 gotas para pin-
tar un píxel (las gotas son redondas y los píxeles
cuadrados), si además utiliza el sistema CMYK (de
4 colores) tendrá que usar 16 gotas por píxel (4 go-
tas por cada color); luego, en realidad, un modelo de
2880 dpi pintará a 180 dpi (2880/16).
16.1.4. Bit. Byte. Sistema binario
El bit (b), acrónimo de binary digit, es la unidad de
información, y un conjunto de 8 bits recibe el nom-
bre de byte (B). A su vez, 1024 B son 1 KB, 1024 KB
son 1 MB, 1024 MB son 1 GB, y así sucesivamente.
El empleo de 1024 obedece a que al trabajar en el
sistema binario se utilizan potencias de 2. Es relati-
vamente frecuente la confusión entre píxeles y bits,
para evitarlo es importante tener en cuenta que los
píxeles son unidades de super�icie y los bits unida-
des de información. Además, para la cuanti�icación
de píxeles no se utiliza el sistema binario pues 1 Mp
son 106 píxeles.
El uso del sistema binario ocupa mayor infor-
mación; con el uso de dos bits en el sistema binario
solo se pueden generar 4 posibilidades (00, 01, 10,
11), pero al utilizar el sistema decimal se pueden
generar hasta 100 posibilidades (desde el 00 hasta
el 99). Entonces cabe hacerse la siguiente pregunta:
¿por qué usar el sistema binario si este ocupa más
información? La razón principal es que la notación
binaria es más segura: al existir solo dos posibili-
dades es más di�ícil la producción de errores. En el
sistema binario si un dígito no es el 0 ha de ser for-
zosamente el 1; sin embargo, en el sistema decimal
existen 10 posibilidades, y si un valor no es 0 pue-
de ser cualquiera de los otros nueve. Es interesante
 La imagen digital

En
Figura 16.5: Diferencia entre punto y píxel. El cuadrado del lado izquierdo representa los píxeles de una imagen
digital. En el cuadrado del centro se han incluido círculos teñidos con diferentes niveles de gris que representan
los puntos de impresión. En el cuadrado del lado derecho se aprecian los puntos de impresión de una imagen real.

constatar que en los sistemas biológicos, donde el

mantenimiento de la información se da en el DNA, este caso se ha empleado 1 B de información, pues
se utiliza un sistema cuaternario. La «base» es la se han incluido 8 posiciones y, al ser un sistema
unidad de información del DNA Tema 16,hay
y solo página 7
4 posi- binario, solo se puede alcanzar hasta el número
bilidades: A, T, C y G. Sin embargo, en las proteínas, 255, 256 posibilidades (28) incluyendo el 0; en un
8
que no se usan como elementos 255, 256 posibilidades sistema
de almacenamien- (2 ) incluyendo
decimal el se 0; en un sistema
alcanzarían decimal de
100 millones llegaríamos
to de información y cuya unidad hasta los 100 millones
de información es de posibilidades: desde el 0 hasta
posibilidades: desde el 0 hasta el 99.999.999. Lael 99.999.999. La
el aminoácido, se pueden utilizartransformación inversa, transformación
hasta 20 varian- es decir, de decimal a binario, es también
inversa, es decir, de decimal a bi-muy sencilla.
tes (sistema vigesimal). En relación con el DNA,
Para explicar y
la conversión
nario,esessuficiente
también muy ver elsencilla.
siguiente
Paraesquema,
explicar donde
la toma
en aras de guardar información de forma absoluta-
como ejemplo el númeroconversión
19. es su�iciente ver el siguiente esquema,
mente estable, parece lógico pensar que un sistema 19∟2
binario, que solo usase dos bases, podría ser más 1 9∟2
seguro. Sin embargo, esto podría conducir a cade- 1 4∟2
nas de DNA excesivamente largas y tan estables que
0 2∟2
pudiesen afectar a la aparición de mutaciones, base
0 1
de la diversidad biológica y, en de�initiva, del mante-
Se trata de ir tomando los restos resultantes de dividir el número y los
nimiento de la vida. Visto así podría pensarse que el donde usa el número 19 como ejemplo. Se trata de
cocientes entre 2 y ordenarlos en sentido contrario: 1 0 0 1 1
uso de un sistema cuaternario para almacenamien- ir tomando los restos resultantes de dividir el nú-
to de información en los seres vivos es el resultado mero y los cocientes entre 2 y ordenarlos en sentido
de un compromiso entre el tamaño 1.5. Profundidad
de la estructura de color
contrario: 1 0 0 1 1
La profundidad
que ha de guardar la información, su estabilidad y la de color determina el número máximo de colores y tonos
posibilidad de generar cambios. (nivel de luz o intensidad luminosa) que pueden adjudicarse a un píxel, y
dependerá
A veces puede ser útil conocer del número de bits asociados a cada píxel que conforma la imagen.
la equivalencia
Para lasTransformar
entre números binarios y decimales. imágenes en blanco y negro se utiliza una información comprendida entre
un número binario en decimal 1esymuy sencillo:
8 bits, lo que 16.1.5.
bas-puede Profundidad
generar imágenesdeque color
poseen desde sólo dos tonos
ta multiplicar el valor del número binario
(imágenes por su con sólo blanco y negro) hasta 256 niveles (blanco, negro y
binarias
La profundidad de
valor de posición; por ejemplo:254 niveles de gris intermedios)(Figura color determina el número máxi-
16.6).
mo de colores y tonos (nivel de luz o intensidad
Número binario 1 1 0 0 1 1 1 0 luminosa) que pueden adjudicarse a un píxel, y de-
penderá del número de bits asociados a cada píxel
x que conforma la imagen. Para las imágenes en blan-
co y negro se utiliza una información comprendida
Valor por posición 20 21 22 23 24 25 26 27
entre 1 y 8 bits, lo que puede generar imágenes que
= poseen desde solo dos tonos (imágenes binarias con
solo blanco y negro) hasta 256 niveles (blanco, ne-
Valor decimal 1 2 0 0 16 32 64 0 = 115 gro y 254 niveles de gris intermedios)(Figura 16.6).

Figura 16.6. Imagen del melanocito de la figura 16.1 con 256 (A), 8 (B), 4 (C) y 2 (D) niveles de gris.
369
Desde un punto de vista fisiológico puede parecer excesiva la utilización
de 256 niveles de gris para una imagen pues se cree que, en el mejor de los
casos, el ojo humano puede distinguir sólo hasta 80 niveles de gris. Es obvio, y
Métodos en biociencias
Figura 16.6: Imagen del melanocito de la �igura 16.1 con 256 (A), 8 (B), 4 (C) y 2 (D) niveles de gris.
Desde un punto de vista �isiológico puede pa-
recer excesiva la utilización de 256 niveles de gris
para una imagen pues se cree que, en el mejor de los
casos, el ojo humano puede distinguir solo hasta 80
niveles de gris. Es obvio, y después se demostrará,
que el uso de 256 niveles conlleva un mayor tama-
ño en el archivo de la imagen; sin embargo, su efecto
puede considerarse despreciable dada la velocidad
de procesamiento y la capacidad de almacena-
miento de los ordenadores actuales. No obstante,
en algunos casos puede ser muy razonable la utili-
zación de lo que se llaman imágenes binarias pues
solo tienen blanco y negro. En este caso solo se uti-
liza 1 bit por píxel en vez de 8, lo que conlleva una
disminución considerable en el tamaño del archivo.
El uso de este sistema binario es especialmente útil
en el caso de imágenes de textos, como es el caso de
letras negras sobre fondo blanco.
En las imágenes en color se utilizan dos va-
riantes: el sistema RGB (red, green, blue), que forma
la imagen de color usando tres canales, y el siste-
ma CMYK (cyan, magenta, yellow, black), que la
forma utilizando 4 canales. Normalmente cada ca-
nal utiliza 1 B, por tanto la codi�icación de color en
el sistema RGB es de 3 B, y de 4 B para el sistema
CMYK. Dado que cada canal tiene 256 niveles, el
sistema RGB es capaz de generar 28 x 28 x 28 colo-
res, alrededor de 16.7 millones de colores. Número
que parece más que su�iciente para obtener una
imagen �idedigna de la realidad. Obviamente, el sis-
tema CMYK es capaz de generar un mayor número
de colores, alrededor de 4275 millones de colores.
En general, el uso del sistema RGB es útil en imáge-
nes cuya visualización se va a realizar en pantalla;
si, por el contrario, el �in de la imagen es ser impre-
sa en papel se suele utilizar el sistema CMYK.
370
16.1.6. Archivos: tamaños y formatos
Puede de�inirse el formato como la forma en que se
almacena la información de la imagen en un archivo.
A día de hoy existen más de 50 formatos diferentes
pero solo algunos se han popularizado tanto que se
pueden considerar estándar.
En principio, los formatos pueden clasi�icarse
según la calidad de imagen que ofrecen, y así se dis-
tinguirán los formatos sin pérdida de información
y los formatos con pérdida de información. Los pri-
meros, generan �icheros muy grandes y «pesados»
ya que incorporan toda la información relativa a la
imagen; los segundos son más «livianos» ya que eli-
minan parte de la información de la imagen. Un gran
número de los formatos utilizados en la digitaliza-
ción de imágenes suelen tener formato reducido. A
continuación se enumeran algunos de los formatos
más utilizados en el tratamiento digital de la ima-
gen:
— RAW (palabra inglesa que signi�ica cru-
do, no procesado). Este formato suele
estar disponible en cámaras y elementos
de captura avanzados. El formato RAW
es propio de cada fabricante y en los �i-
cheros que genera se almacena toda la
información de la imagen «en bruto»
(sin modi�icación de lo que se capturó).
Actualmente es el formato que se utili-
za como negativo en la fotogra�ía digital.
En los �icheros raw se pueden utilizar
profundidades de color de 48 bits. Con-
cretamente, en cámaras fotográ�icas, se
trabaja con una profundidad de color de
12 o 14 bits.
— TIFF (tagged image �ile format). Este for-
mato tampoco reduce la información de
las imágenes por lo que ofrece una muy
buena calidad de imagen. El formato
TIFF tiene la ventaja de permitir el trat-

amiento de las imágenes con multitud
programas de edición estándar (Pho-
toshop, Paint, Core, etc.). Sin embargo,
actualmente, está en desuso, sobre todo
en las cámaras digitales profesionales, ya
que los �icheros son excesivamente pesa-
dos y su manejo requiere gran cantidad
de memoria y recursos. En los �icheros
tiff se puede trabajar con profundidades
de color que alcanzan los 64 bits. A pesar
de esta cifra, en los �icheros tiff que se
generan en cámaras fotográ�icas se suele
trabajar con 8 bits de profundidad de col-
or.
— PSD (Photoshop document). Se trata de
un �ichero original de ADOBE y, al igual
que el formato tiff, está catalogado como
un formato sin pérdidas. Los �icheros
psd también son muy extensos por lo
que pueden de�inirse como «pesados».
Este tipo de formato es muy utilizado en
el retoque fotográ�ico. La profundidad
de color de estos �icheros es de hasta 64
bits y poseen, prácticamente, la misma
calidad que los de formato tiff.
— BMP (bitmap). Este formato es original
de Windows por lo que es el que utiliza
ese sistema operativo para guardar sus
imágenes. Los �icheros con este forma-
to llegan a utilizar hasta 24 bits y se les
pueden aplicar compresiones sin pérdida
de calidad. Se utilizan, principalmente, en
aplicaciones que requieran imágenes con
poco «peso», como pueden ser imágenes
decorativas en pantallas (escritorio, fon-
dos), murales digitales, etc.
— JPEG. Es un formato original de The
Joint Photographers Experts Group. Es,
quizá, el formato más conocido para la
compresión de fotogra�ías digitales; de
hecho, la mayoría de los dispositivos
digitales soportan este formato. Algunas
de sus principales características son
que los �icheros que se generan en este
formato son menos pesados que los de
los anteriormente citados y que dicho
formato es compatible con internet (web).
El formato jpeg es comprimido por lo que
su calidad está limitada; no se aconseja
editar imágenes con soporte jpeg. No
obstante, cuando en un dispositivo se
genera un �ichero jpeg, el software ofrece
diferentes calidades de compresión. El
formato jpeg soporta 24 bits. Por último,
371
La imagen digital
es conveniente indicar que el año 2000,
The Joint Photographers Experts Group
creó un nuevo formato jpeg denominado
JPEG2000 (jpeg2), en el que se ha
alcanzado un compromiso óptimo entre
el peso del �ichero y la calidad de imagen.
— PICT (picture imagen). Original de Mac,
se utiliza en aplicaciones de grá�icos y de
diseño de páginas de Mac OS como for-
mato de archivo para la transferencia de
imágenes entre aplicaciones.
— GIF (graphics interchange format). Es un
formato utilizado habitualmente para
representar grá�icos e imágenes de co-
lor indexado en documentos HTML en
internet y otros servicios en línea. Este
formato comprimido está diseñado para
minimizar el tamaño de los archivos y el
tiempo de transferencia electrónica.
Todo archivo de imagen lleva incluido, además del
tipo de formato, su tamaño desde el punto de vis-
ta de unidades de información ocupadas; es decir, el
número de bits que ocupa. El valor del tamaño guar-
da una relación directa con el número de píxeles de
la imagen y con el número de niveles de luz emplea-
dos. La expresión que permite obtener el «peso» de
una imagen es:
T=MxNxk
donde T es el tamaño en bits, M y N son el número de
píxeles por ancho y alto de la imagen y k el exponen-
te de 2 en la expresión L = 2k, donde L es el número
de niveles de luz. Lógicamente, para transformar el
tamaño en bytes solo hay que dividir entre 8.
16.2. Sistemas de análisis digital
de imagen
Los sistemas de análisis digital de imagen (DIAS, di-
gital image analysis system) son sistemas capaces
de digitalizar la imagen y llevar a cabo tratamientos
posteriores con el �in de adecuarla para permitir su
análisis. Es obvio que los tratamientos de adecua-
ción dependerán del tipo de análisis a realizar. En
general el equipo esencial de un DIAS consiste en
un sistema de captación de imagen y un computa-
dor con un programa de gestión de imágenes que
permite su almacenamiento, tratamiento y análisis.
Métodos en biociencias
16.2.1. Sistemas de captación
Un buen DIAS debe ser capaz de captar cualquier
imagen, sea cual fuere el soporte en el que esta se
encuentra. A día de hoy, los sistemas más usuales de
captación son las cámaras fotográ�icas o los escá-
neres. Muy básicamente, una cámara está formada
por un sensor o transductor sobre el que un sistema
óptico (lente) enfoca la imagen. El sensor está for-
mado por la agrupación de elementos fotosensibles
discretos llamados fotocélulas que convierten las
señales luminosas en electricidad. En una clara ana-
logía con el ojo de vertebrados, el cristalino sería la
lente, la retina el sensor, y los conos y bastones re-
tinianos las fotocélulas. Los escáneres, al menos los
de tipo plano que son los más usados, son dispositi-
vos que constan de un cristal que sirve para colocar
la muestra, y debajo se ubica un brazo acoplado a un
motor que sirve para hacer el escaneo. Asociado al
brazo va un sistema de iluminación y el sensor. La
luz re�lejada por la muestra es captada por el sen-
sor que funciona de modo análogo al ya visto en la
cámara.
Las cámaras suelen nominarse en función del
tipo y modo de operar de sus sensores, y así tene-
mos cámaras CCD (charge coupled device), CMOS
(complementary metal-oxide-semiconductor) y CID
(charge injection devices). Estas últimas son las de
mayor calidad pues, entre otras ventajas, corrigen
mejor dos problemas que afectan a los sensores: la
saturación por señales no muy altas y el blooming,
efecto ocasionado cuando una fotocélula recibe
una luz muy intensa y la corriente generada pue-
de afectar parcialmente a las fotocélulas vecinas.
La señal eléctrica de la fotocélula es ampli�icada,
transformada y convertida después en una señal di-
gital mediante un conversor analógico-digital (ADC,
analog to digital converter). No confundir con un
dispositivo DAC (digital to analog converter), que
opera exactamente al revés. El ADC puede formar
Figura 16.7: A la izquierda, esquema que ilustra el efecto de la corrección gamma sobre el voltaje. A
la derecha, el efecto que dicha corrección podría generar sobre el brillo de los diferentes niveles de gris
a la hora de generar la imagen. En este caso el efecto se logra sobre los grises intermedios pues ambas
respuestas empiezan y terminan en los mismos puntos.
372
parte de la propia cámara (lo más usual) o disponer-
se fuera de ella. El tamaño actual de las fotocélulas
suele ser de 4-5 μm lo que les ha permitido alcanzar
una resolución mejor que la de la antigua película
fotográ�ica, donde el tamaño de grano de la sal de
plata rondaba los 10 μm.
A continuación se explicarán algunas carac-
terísticas básicas de los sensores que afectan al
proceso de captación de imagen como son sensibili-
dad, rango dinámico, gamma, resolución, respuesta
espectral y el escalado de nivel de gris. Algunas de
ellas son modi�icables y permiten variar la imagen
capturada de modo que pueda ser más idónea para
conseguir el �in que se persigue.
La sensibilidad de�ine la intensidad de luz mí-
nima capaz de generar una respuesta electrónica en
la fotocélula. El rango dinámico determina la ampli-
tud de respuesta considerada como la capacidad de
responder de forma correcta a intensidades lumi-
nosas bajas y altas. La gamma hace referencia a la
relación entre el estímulo luminoso y la respuesta
electrónica (Figura 16.7) y es un parámetro sobre el
que se puede interactuar para conseguir respuestas
lineales o con mayor o menor contraste en determi-
nadas partes del espectro de intensidad luminosa.
La resolución viene determinada por el número
de fotocélulas que incorpora el sensor, y será el fac-
tor limitante del número de píxeles que alcance la
imagen capturada. La respuesta espectral viene de�i-
nida por la diferente sensibilidad de las cámaras en
función de la λ de la luz incidente. El escalado del ni-
vel de gris hace referencia a la relación que hay entre
la respuesta electrónica de la fotocélula y el valor de
gris asignado a cada píxel. Al igual que en el caso de
la gamma, lo mejor es que la respuesta de escalado
sea lineal; sin embargo, existen otras posibilidades
de escalado no lineales cuya representación genera
funciones de tipo logarítmicas, exponenciales, si-
nusoidales o de otros tipos (Figura 16.8).
 La imagen digital

Figura 16.8: Efectos de diferentes curvas de escalado.

Incluso se pueden llevar a cabo reasignaciones gen obtenida no necesariamente tiene que coincidir
arbitrarias al aplicar paletas (LUT, look up table). con la realidad y, además, puede seguir necesitando
Las LUT reasignan nuevos niveles de gris a los ya
existentes en función de criterios establecidos por todavía una serie de tratamientos que la capaciten
el diseñador de la paleta. También se pueden aplicar aún más para poder ser analizada.
paletas de color, que consiste en reasignar colores a
determinadas fases de gris (una fase es un conjun-
to de niveles de gris próximos). Una de las paletas
de color más comunes es la «rainbow» pues divide 16.2.2. Procesado de la imagen
los niveles de gris en 7 fases y a cada una de ellas le
asigna un color del arco iris (Figura 16.9). Algunos Es un conjunto de procedimientos que constituye
programas de análisis permiten el diseño de paletas
un tratamiento cuyo �in es la restauración, mejora
propias en función de las características de nuestra
imagen, herramienta muy útil en tanto que la paleta y/o preparación de la imagen con el propósito de
está confeccionada teniendo en cuenta las peculia- hacerla apta para su análisis. Existen dos grandes
ridades de nuestra imagen. En el fondo esto no es
más que una reasignación del nivel de gris total y tipos de operaciones: píxel a píxel, y por grupos de
absolutamente arbitraria con el �in de conseguir píxeles.
una imagen �inal más apta para su estudio o para
hacer mucho más evidente la zona donde se quiere
centrar la atención.
En principio, parece que lo ideal es que la ima-
gen captada y la realidad fuesen idénticas, pero en
el proceso de captación siempre se producen mo-
di�icaciones que causan diferencias entre la imagen
real y la captada. Algunas de los características vis-
tas no son modi�icables; otras, como la gamma y el
escalado de nivel de gris, sí lo son y permiten actuar
sobre el proceso de captación de imagen con el ob-
jeto de obtener una imagen con las características Figura 16.9: Aplicación de la paleta de color rainbow (imagen
más idóneas posibles en función del estudio que se inferior) a la imagen de una electroforesis con 256 niveles de gris
va a realizar sobre ella. Por ello esta primera ima- (imagen superior). Disponible en color.

373
 Métodos en biociencias
Figura 16.10: (A) Imagen del melanocito de la �igura 16.1 con su histo-
grama. (B) La normalización abre el histograma, genera píxeles blancos y
negros que antes no existían y mejora el contraste. (C) Inversión de la �igura
B y su histograma correspondiente.
Operaciones píxel a píxel
Se aplican a todos y cada uno de los puntos de la
imagen y suelen ser sencillas. Hay dos tipos básicos:
modi�icación del histograma y operaciones aritmé-
ticas con la imagen.
El histograma de una imagen se obtiene al re-
presentar en abscisas el nivel de gris (hay 256
niveles) y en ordenadas el porcentaje relativo de
Figura 16.11: Imagen del melanocito de la �igura 16.1: sin modi�icar (A), tras aplicar un �iltro de suavizado (B)
y tras aplicar uno de enfatizado (C).
374
cada nivel en esa imagen, considerando el 100%
aquel nivel de gris presente en el mayor número
de píxeles (Figura 16.10). En general imágenes de
poco contraste dan histogramas agrupados, pues
poseen pocos niveles de gris; por el contrario, las
imágenes de mucho contraste los suelen tener am-
plios –abarcan todos los niveles de gris– y con picos
bien diferenciados. Al modi�icar el histograma se
persigue reasignar el valor de gris de los píxeles, y
se puede hacer extendiendo o acortando el rango;
lo más usual suele ser el estiramiento pues da más
profundidad a la imagen. Existen algunas formas
muy particulares de modi�icación del histograma
entre las que destacan la normalización y el ecuali-
zado. Normalizar consiste en que los nuevos valores
ocupen todo el rango de gris, desde 0 a 256 (Figu-
ra 16.10). La ecualización consiste en buscar valores
máximos y mínimos y reasignar píxeles entre los
diferentes niveles de gris para conseguir una distri-
bución más uniforme y un histograma más plano.
Otra posibilidad es la inversión, obtenida al transfor-
mar cada nivel de gris en su complementario, efecto
que genera una imagen negativa.
Las operaciones aritméticas con la imagen
pueden ser de dos tipos: con una o con varias imáge-
nes. Con una imagen se puede multiplicar, sumar o
restar un escalar a la matriz de datos de esa imagen
produciendo un desplazamiento del histograma.
Con varias imágenes lo que se hace es sumar, res-
tar o multiplicar el píxel de una imagen con el píxel
correspondiente de la otra imagen. Esto puede lle-
gar a ser muy útil; por ejemplo, al restar se detectan
diferencias entre imágenes, pues los puntos iguales
quedan en negro y solo los distintos aparecen como
tal. También sirve para corregir defectos de ilumi-
nación mediante máscaras o sumar distintos planos

Figura 16.12: Imagen del melanocito de la �igura 16.1: sin modi�icar (A), tras detectar márgenes mediante un
operador laplaciano (B) y tras la aplicación de un operador cardinal de tipo sur (C).
de foco para obtener una imagen completamente
enfocada.
Operaciones con grupos de píxeles
Este tipo de procedimientos se suelen llevar a cabo
para modi�icar aquellos píxeles que son muy distin-
tos a sus vecinos; por ejemplo, los puntos conocidos
como ruido de fondo que aparecen en muchas imá-
genes. Su eliminación se lleva a cabo mediante
operaciones entre píxeles vecinos o los llamados
�iltros matriciales. Normalmente consiste en es-
coger un pequeño grupo de píxeles, entre 9 y 49
dependiendo de que la matriz sea de 3x3 hasta 7x7
píxeles, y modi�icar alguno de ellos (normalmente
uno y en posición central) en función del valor de
los demás que le rodean. Así se tienen los �iltros de
suavizado (el de la media, los gaussianos o el de la
mediana) en los que se disminuyen las diferencias
de alguno con respecto a sus vecinos, o los de enfa-
tizado, que hacen lo contrario (Figura 16.11).
16.2.3. Segmentación
El objeto de la segmentación es separar los ele-
mentos o componentes de interés del resto de la
imagen, por lo que podría considerarse como una
disección de la imagen digital. Sin duda alguna, el
paso más importante en un proceso de segmen-
tación es precisar con exactitud los límites de los
objetos que se quieren medir, de modo que estos
queden identi�icados de manera clara. El resul-
tado será una nueva imagen de carácter binario
desde el punto de vista del análisis, pues solo con-
tendrá dos tipos de píxeles: píxeles con interés para
el análisis, a los que se mantiene con sus caracte-
375
La imagen digital
rísticas, y píxeles sin interés analítico que, desde
este punto de vista, al ser anulados es como si no
existieran. Conviene diferenciar entre una imagen
binaria desde el punto de vista de la segmentación
y una imagen binaria en relación con los niveles de
gris. En el primer caso se considera imagen binaria
porque los píxeles útiles para el análisis se marcan
como 1 y los que carecen de él como 0. Es por ello
una imagen binaria lógica en la que todos los da-
tos que llevan aparejados los píxeles marcados con
1 se mantienen, los de los píxeles marcados con 0
se pierden. En una imagen binaria en relación con
los niveles de gris lo que ocurre es que solo hay dos
niveles de gris: el 0 y el 256; por ello solo apare-
cerán píxeles negros y blancos. La confusión entre
ambas imágenes binarias se suele producir porque
en la imagen binaria lógica –obtenida en la segmen-
tación– a los píxeles marcados como 1 se les aplica
el nivel de gris 256 (blanco) y a los marcados como
0 se les asigna el nivel 0 (negro). Por ello, la imagen
binaria lógica resultante del proceso de segmenta-
ción también es una imagen binaria desde el punto
de vista de niveles de gris.
Todos los algoritmos que se usan en un pro-
ceso de segmentación se basan en dos criterios:
discontinuidad y similitud entre píxeles vecinos. El
criterio de discontinuidad se basa en detectar cam-
bios bruscos en el nivel de gris, y de este modo se
pueden detectar puntos, líneas y bordes. El crite-
rio de similitud consiste en seleccionar áreas con
píxeles cuyo nivel de gris es idéntico o similar, y se
suele hacer por el procedimiento de crecimiento de
región o la umbralización. Desde un punto de vista
más pragmático, los programas de tratamiento de
imagen digital suelen ofrecer menús con distintos
métodos de segmentación. Los más usuales son: el
 Métodos en biociencias
Figura 16.13: Imagen de una electroforesis, inmunomarcaje con �luores-
cencia infrarroja (A). Transformación de color a niveles de gris (B). Segmen-
tación por umbralización y procedimiento manual, pues la segunda señal de
la �ila inferior de la �igura B se borró manualmente (C). Disponible en color
marcado de bordes, la umbralización, la segmenta-
ción automática y la segmentación múltiple.
El marcado de bordes se puede realizar (a)
per�ilando manualmente los contornos, ya sea uti-
lizando tableros digitalizadores o con herramientas
de edición de los programas de dibujo, o (b) detec-
ción de bordes automática. Los bordes se pueden
representar por sus per�iles y a estos tratarlos como
curvas a las que se aplican sucesivas derivadas. Esta
es la base de los operadores (también llamados �il-
tros) laplacianos, direccionales como el Sobel, el DOG
(doble gaussiano y una resta), o los LOG (primero �il-
tro gaussiano y luego un enfatizado) (Figura 16.12).
La segmentación por umbrales consiste en se-
leccionar el nivel superior e inferior del gris que
contiene el objeto u objetos de interés, y el resto se
elimina al no estar comprendido entre esos valores
(Figura 16.13). Esto, como ya se vio, conlleva una
binarización de la imagen pues se da valor 1 a los
píxeles de dentro del rango escogido y valor 0 a los
que quedan fuera. Lo di�ícil es de�inir los umbrales,
pero para ello existen algunas herramientas de ayu-
da. Por ejemplo, un puntero que indica el nivel de
gris de cada punto que se marca con él, el editor de
la matriz, que permite ver el nivel de gris de cada
píxel del área seleccionada; o, de carácter más ge-
neral, el histograma de niveles de gris, que facilita
la elección de umbrales en función de los picos y va-
lles que presenta.
376
La segmentación automática se basa en utili-
zar un algoritmo que busca umbrales y selecciona el
más idóneo para segmentar; suele dar buenos resul-
tados con imágenes de histogramas bimodales. La
segmentación múltiple es muy útil cuando en una
imagen se quieren seleccionar objetos que tienen
tres o más fases, ya se vio que una fase es un gru-
po de niveles de gris próximos. Este procedimiento,
en teoría, generaría tantas imágenes binarias como
fases, o una única imagen en la que a la máscara de
cada fase se le identi�ica con un número o aplicán-
dole un color.
La segmentación por crecimiento de regio-
nes puede ser útil para imágenes de contornos muy
complejos y consiste en buscar un píxel o un peque-
ño grupo de píxeles (se le llama semilla) dentro del
objeto. A esta semilla se van añadiendo píxeles con-
tiguos si cumplen un criterio de selección, que suele
ser estar dentro de un umbral de desviación con
respecto al nivel de gris de la semilla. Si es así, al
nuevo píxel se le asigna el valor del píxel semilla. El
proceso se puede repetir varias veces hasta alcan-
zar el resultado deseado.
16.2.4. La imagen binaria y su modificación
Una vez obtenida la imagen binaria de segmenta-
ción suele ser necesario tratar esta para facilitar su
análisis. En realidad se podría considerar como el
re�inado y �inalización del proceso de segmentación
cuyo �in es dejar la imagen lista para ser analizada.
Las de�iciencias más habituales que presentan las
imágenes binarias obtenidas tras la segmentación
suelen ser la presencia de píxeles aislados, contac-
tos entre objetos distintos debido a su proximidad,
objetos agujereados, fragmentación no deseada de
objetos u objetos partidos en el límite de la imagen.
Además del procedimiento de borrado manual, los
procedimientos más usuales empleados para corre-
gir estas de�iciencias suelen ser técnicas de erosión
y dilatación, apertura y cierre, rellenado y contor-
no; también pueden ser útiles otros procedimientos
como la esqueletización o la eliminación de bordes.
Todos estos procedimientos tienen en cuenta
una característica del píxel que es la conectividad,
propiedad que hace referencia a la existencia de
contacto entre un píxel con otros y sirve para de�inir
un conjunto de píxeles. Por ello, a un objeto selec-
cionado en el proceso de segmentación se le puede
considerar un conjunto de píxeles conectados cuyo
valor lógico asociado es 1. Un píxel cuadrangular
que no esté localizado en un borde de la imagen
 La imagen digital

Figura 16.14: Esquema de una operación de apertura y de una de cierre. Cedido por J.F. Pertusa, Universitat
de València (ver bibliogra�ía).

siempre está interconectado con otros 8: 4 por sus píxeles de valor lógico 0. La esqueletización es un
caras y otros 4 por sus vértices. proceso de erosión iterado, y se puede considerar
La dilatación consiste en la adición por cone- como un proceso de simpli�icación de la imagen
xión de un píxel o más a aquellos píxeles colocados
pues al �inal se obtiene un objeto conectado, cen-
en el exterior de la imagen de modo que ni un solo
punto exterior (ya sea cara o vértice) de los píxeles trado y que mantiene la forma original. El �in de la
de la antigua imagen quede sin cubrir. La erosión eliminación de bordes es suprimir los objetos que
es la operación conceptualmente opuesta. La di- contactan con los márgenes de la imagen. Es una
latación aumenta el área del objeto y la erosión la operación imprescindible en biología pues si no se
disminuye por lo que puede ser un buen procedi- hace se pueden medir objetos cortados que pueden
miento de eliminación de objetos con un número de
falsear resultados.
8 píxeles o inferior. Ambos procedimientos pueden
condicionarse direccionalmente pues se puede lle-
var a cabo el proceso por un lado de�inido por un
ángulo. La apertura y cierre se suelen usar para
juntar o separar objetos y resultan de la combina-
ción de un proceso de erosión seguido de dilatación
(apertura) o de dilatación seguido de erosión (cie-
rre) (Figura 16.14).
El rellenado se podría de�inir como una di-
latación interna y consiste en transformar de 0
a 1 aquellos píxeles encerrados en una estructu-
ra de píxeles con valor lógico 1. Puede ser de gran
ayuda para terminar procesos de segmentado de
estructuras tubulares o con huecos en su interior.
Al aplicar la operación conocida como contorno Figura 16.15: (A) Imagen segmentada de la �igura 16.13. Sobre
se seleccionan únicamente los píxeles más exter- ella se identi�ican los objetos (B) y se determina su área y su DOI
nos del objeto, aquellos que están en contacto con (tabla).

377
Métodos en biociencias

Las imágenes binarias también son suscepti-

Plano de formación
bles de sufrir operaciones aritméticas, pero el modo de la imagen
de operar con ellas tiene que producir como resul-
tado una nueva imagen binaria. Para ello se opera
con el álgebra de Boole, es decir, se usan operadores
booleanos. Los operadores lógicos que se aplican
son AND, OR, XOR y NOT. AND representa el pro-
ducto lógico y OR la suma lógica. El operador XOR
resulta de la combinación de AND y OR, y NOT pro-
duce el cambio del valor del píxel (ver cuadro).

Fi-
a b AND OR XOR NOT a NOT b
gura 16.16: Distancia focal del objetivo de una cámara fo-
0 0 0 0 0 1 1
0 1 0 1 1 1 0
1 0 0 1 1 0 1
que, a su vez, resulta muy familiar a la mayoría de
1 1 1 1 0 0 0 las personas ya que se utilizará en diversas face-
tas de su vida cotidiana es el de la fotogra�ía digital.
El nacimiento de la tecnología digital y, consecuen-
16.2.5. Medida temente, la masiva aparición de las denominadas
cámaras digitales, han dado lugar a que la fotogra�ía
Una vez que, en función del objetivo que se persi- digital pase a ser considerada una técnica impres-
gue, la imagen binaria lógica está perfectamente cindible a la hora de obtener (capturar), editar y
preparada, se pasa al proceso de medida. Existen generar (imprimir) imágenes reales. Uno de los
dos grandes grupos de medidas: parámetros mor- ámbitos de aplicación de esta técnica también es
fométricos (topología del objeto) y parámetros el cientí�ico, y es por ello por lo que en este tema
densitométricos (intensidad lumínica). es conveniente, a nivel general, exponer algunos de
Entre los morfométricos destacan: número, sus fundamentos.
área y perímetro de objetos, diámetro, longitud y
anchura, feret, orientación, centro de masas, elon-
gación, rugosidad, distancia entre objetos… y entre 16.3.1. Conceptos generales de la óptica
los densitométricos destacan la densidad óptica y sistema de exposición de la cámara
(DO) y la DO integrada (DOI); muy útiles en biología
pues permiten calcular concentraciones o conte- Distancia focal. Tipos de objetivos
nidos de sustancias en función de su nivel de gris Puede de�inirse como lente o lentes objetivo al dis-
(Figura 16.15). La DO de un píxel viene de�inida por positivo óptico (y electro-mecánico) cuya misión
la fórmula: es captar la luz que proviene de los objetos que
DO = -log10 (255 / nivel de gris) componen una escena para formar con ella imáge-
La DO de un objeto representa la media de la DO de
todos los píxeles que forman parte del objeto. DOI
se obtiene al multiplicar DO por el área del objeto.
8 mm
20 mm
35 mm
Objeto 1 2 3 4 5 6 7 8 50 mm
85 mm
Área 153 152 154 147 216 143 196 159 200 mm
OBJETIVO 0º
DOI 133.62 105.72 121.16 110.24 138.33 95.76 135.6 95.96 12º
28º
46º
63º
94º
16.3. La fotografía digital 180º

Un campo en el que se aplica gran parte de los con- Figura 16.17: Variación de la distancia focal respecto al ángu-
ceptos que se acaban de exponer en este capítulo y lo de captación de imagen.

378
 apertura de diafragma, menor profundidad de campo, y viceversa. Por ello
también interesa que un objetivo pueda cerrar mucho el diafragma lo que s
consigue si el objetivo dispone de valores de f altos.
La imagen digital
La figura 16.18 muestra una serie de diafragmas con diferentes aperturas

nes nítidas en la super�icie de la película fotográ�ica

o, en el caso de imágenes digitales, el sensor de
imagen. Independientemente de sus cualidades
constructivas, la característica más destacable de f2
f2 f2.8
f2.8 f4
f4 f5.6
f5.6 f8
f8 f11
f11 f16
f16 f22
f22
un objetivo es su distancia focal. La distancia focal
se expresa, generalmente en mm, y es la distan- Figura Figura16.18.
16.18:Diferentes
Diferentesaperturas
aperturasde dediafragma
diafragmaen enrelación
relacióncon conelel número
núme- f.
cia que existe entre el centro óptico del conjunto ro f.
de lentes (lugar donde se cruzan los rayos3.1.3. de luz,
Velocidad de obturación
próximo al diafragma) y el plano donde se forma la Se define como velocidad de obturación al valor del tiempo durante el qu
imagen, que es el plano de la película fotográ�ica o
está abierto el escala
obturador de la cámara. Por lo (valores
tanto, controlando dicho valo
del sensor (Figura 16.16). una de aperturas de diafragma de
también puede regularse la cantidad de luz que
f): 1 - 1.4 - 2 - 2.8 - 4 - 5.6 - 8 - 11 - 16 - 22 - 32 - llegará al sensor. La velocidad d
Las cámaras, tanto analógicas comoobturación
digita- se cuantifica mediante el parámetro s, y se mide en segundo
45. Tomando el sentido ascendente de esta serie de
les, incorporan diferentes tipos de objetivos que,
(obsérvese que aunque nos refiramos a la velocidad,
valores el salto, o paso, de uno a otro suponerealmenteuna nos estamo
en una primera clasi�icación, pueden dividirse en:
refiriendo aldisminución
tiempo). Losdevalores de s
luminosidad 1/2. obedecen a la siguiente escala de tiempo
objetivos �ijos y objetivos zoom. Los objetivos �ijos
en segundos: …60”, Entre30”, 15”, 8” 4”números
los diferentes 2” 1”, 1/2 que(0,5”),
aparecen 1/4, en 1/8, 1/15, 1/30, 1/60
son aquellos que poseen una distancia focal �ija y,
1/125, 1/250, los 1/500…
objetivos de una cámara se pueden encontrar,
por ello, no pueden variar su ángulo de visión; por
el contrario, los objetivos zoom pueden variar su por ejemplo, estos dos casos (a) 14-42 mm 1:3.5-
3.1.4.
distancia focal y, consiguientemente, el ángulo de El 5.6,de(b)
valor 16-45 mm 1:4. En el primer ejemplo, las
exposición
visión (Figura 16.17). Considerando los objetivos El medidas
valor de dadas
exposición en mm hacen
(EV, referencia
exposition a unpuede
value) obje- definirse como u
parámetro
de distancia focal variable, puede establecerse una tivo
que con
asocia distancia
a los dosfocal variable
conceptos comprendida
relacionados entre
con la cantidad de luz qu
nueva clasi�icación: 14 y 42 mm, la segunda relación indica que
llega al sensor de imagen de una cámara: la apertura de diafragma y el tiempo d ese ob-
obturación. jetivo posee una
Se cuantifica apertura
mediante de diafragma máxima de
la expresión:
— Objetivos angular y gran angular (ojo de 3.5 cuando trabaja con distancias focales de 14 mm
y una apertura de 5.6 cuando trabaja N 2con distancias
pez). Los angulares poseen distancias fo- EV = log 2
cales cercanas a los 28 mm; los grandes focales de 42 mm; en el segundo ejemplo, t los valo-
angulares, distancias en torno a losDonde, 12 res numéricos
N representa indicandel
la apertura quediafragma
se trata de (f) un
y t objetivo
(la velocidad de obturació
mm. (s). Por lo tanto, analizando la expresión anterior, se16 puede
con distancia focal variable comprendida entre y conseguir u
— Objetivos estándar. Con distancias focales 45 mm, pero en este caso, para ambas distancias
determinado valor de exposición para diferentes valores de f y s. En la literatur fo-
próximas a los 50 mm (poseen un ángulo relacionada cales
con la el apertura
campo de máxima de diafragma
la fotografía, existenes tablas
de 4. en las que se indica
de visión próximo al humano). Resulta interesante indicar que una
cuales son los valores de exposición más adecuados para diferentes condicione propiedad
— Teleobjetivos. Con distancias focales com-
de iluminaciónimportante
y sensibilidadde undel objetivo
sensor es(valor
que puedaISO). capturar la
prendidas entre los 70 y los 800 mm. mayor cantidad de luz, lo que se traduce en que su
máxima apertura corresponda a un número f bajo
3.2 La cámara digital
Por su importancia en biociencias son destacables (p. ej. 1.4 o 2.8), pero esto conlleva un notable so-
los objetivos denominados «macro». Este tipo de brecosto en el precio.
3.2.1. Fundamentos
objetivos pueden obtener imágenes de elementos Es conveniente indicar que la apertura de
con relación de escala de 1:1, por lo que resultan De diafragma
modo general, una cámara fotográfica puede definirse como u
está directamente relacionada con la
idóneos para la fotogra�ía de seres vivos deelemento
peque- que sirve para captar y guardar las imágenes de aquellos elementos
profundidad de campo (la profundidad de campo
ño tamaño o de detalles anatómicos. Los macros se hace referencia a la máxima distancia entre la que
fabrican con distancias focales comprendidas entre dos puntos, uno anterior y otro posterior al plano
50 y 200 mm.

Apertura del diafragma

El diafragma es un dispositivo que incorpora el ob-
jetivo y cuya misión es la de controlar o regular la
cantidad de luz que llegará al sensor de imagen
(o a la película fotográ�ica) de la cámara mediante
un sistema de apertura y cierre del mismo. La ca-
racterística más importante de un diafragma es su
rango de luminosidad y se representa por la letra
f (f=distancia focal/diámetro de la abertura efec-
tiva del objetivo). Los objetivos suelen presentar
de enfoque, aparecen enfocados en la toma fotográ-
�ica), estableciéndose una relación inversa entre los
dos conceptos, es decir, a mayor apertura de dia-
fragma, menor profundidad de campo, y viceversa.
Por ello, también interesa que un objetivo pueda
cerrar mucho el diafragma lo que se consigue si el
objetivo dispone de valores de f altos.
La �igura 16.18 muestra una serie de diafrag-
mas con diferentes aperturas.

379
Métodos en biociencias
Velocidad de obturación
Se de�ine como velocidad de obturación al valor
del tiempo durante el que está abierto el obtura-
dor de la cámara. Por lo tanto, controlando dicho
valor también puede regularse la cantidad de luz
que llegará al sensor. La velocidad de obturación se
cuanti�ica mediante el parámetro s, y se mide en se-
gundos (obsérvese que aunque se hace referencia a
la velocidad, realmente se está haciendo referencia
al tiempo). Los valores de s obedecen a la siguiente
escala de tiempos en segundos: … 60”, 30”, 15”, 8” 4”
2” 1”, 1/2 (0.5”), 1/4, 1/8, 1/15, 1/30, 1/60, 1/125,
1/250, 1/500…
El valor de exposición
El valor de exposición (EV, exposition value) puede
de�inirse como un parámetro que asocia a los dos
conceptos relacionados con la cantidad de luz que
llega al sensor de imagen de una cámara: la aper-
tura de diafragma y el tiempo de obturación. Se
cuanti�ica mediante la expresión:
donde N representa la apertura del diafragma (f) y
t la velocidad de obturación (s). Por lo tanto, ana-
lizando la expresión anterior, se puede conseguir
un determinado valor de exposición para diferen-
tes valores de f y s. En la literatura relacionada con
el campo de la fotogra�ía, existen tablas en las que
se indican cuales son los valores de exposición más
adecuados para diferentes condiciones de ilumina-
ción y sensibilidad del sensor (valor ISO).
Figura 16.19: Aspecto constructivo general de una cámara digi-
tal. Tomada de la página web http://escuela–fotogra�ia–digital.
com
380
16.3.2 La cámara digital
Fundamentos
De modo general, una cámara fotográ�ica puede
de�inirse como un elemento que sirve para cap-
tar y guardar las imágenes de aquellos elementos
y objetos que conforman las escenas reales. Las
primeras cámaras se remontan al concepto de cá-
mara oscura (camera obscura), que no es otra cosa
que un cubículo cerrado y oscuro en su interior, en
el que, mediante un pequeño ori�icio practicado en
una de sus paredes, se captaba la luz proveniente
del exterior proyectándola sobre otra pared fron-
tal a la del ori�icio. Alhacen de Basora (965-1040),
cientí�ico musulmán, gran pensador, matemático,
astrónomo y �ilósofo, ya la utilizó para examinar in-
directamente los eclipses solares hace más de 900
años. Posteriormente, aparecieron las primeras len-
tes (objetivos) y también los primeros materiales
fotosensibles (haluros de plata), conformando las
denominadas cámaras analógicas, y consiguiendo
en ellas que la luz quedase «grabada» en los cita-
dos materiales que, a su vez, estaban depositados
sobre un soporte (rígido –vidrio– en las primeras
cámaras, �lexible –celuloide– en las más modernas).
Actualmente, las cámaras digitales incorporan al-
gunos elementos que son comunes a las cámaras
analógicas, pero, a su vez, incorporan otros electró-
nicos e informáticos que hacen que las imágenes
capturadas queden grabadas en un soporte digi-
tal (tarjetas de memoria, discos magnéticos, etc…)
La �igura 16.19 muestra a grandes rasgos el aspecto
constructivo de una cámara digital genérica.
El funcionamiento de las cámaras digitales se
basa en la ejecución de tres tareas primordiales: (1)
captar la luz, (2) transformar la luz en imágenes, y
(3) guardar la imagen en un soporte digital.
MEDIDA Y ENFOQUE PROCESO DE CAPTURA
Obturador
Pentaprisma
Obturador Espejo abierto abierto
Sistema de Visor
medición Diafragma
y enfoque correcto
Sensor
Sensor
y enfoque correcto
medición Diafragma
Sistema de Visor
Obturador abierto
Espejo abierto
Pentaprisma
Obturador
MEDIDA Y ENFOQUE PROCESO DE CAPTURA
Figura 16.20: Etapa de medición y captura de luz de una escena.
 La imagen digital

Captar la luz focando). Una exposición adecuada es totalmente

necesaria a la hora de formar imágenes: las escenas
Para llevar a cabo la primera tarea han de comple-
tomadas con exposiciones de�icientes aparecerán
tarse una serie de pasos, así, por medio de las lentes como imágenes con gran pérdida de detalles en las
del objetivo y un sistema de espejos se capta la luz zonas de oscuridad; por el contrario, si se sobre-
re�lejada o emitida por los objetos que componen expone la toma para esa misma escena, la pérdida
una determinada escena para que pueda ser me- de detalle se producirá en las zonas más claras. Los
dida mediante un fotómetro con el propósito de dispositivos que incorpora una cámara digital para
determinar un valor de exposición correcto en la realizar una correcta exposición son: el �lash (puede
Tema 16, página 25
toma. Una vez realizada la medida (situación pre- ser externo e interno), el fotosensor (proporciona
via al disparo), el sensor de imagen está preparado un valor de la cantidad de luz que entra a través del
para recibircual sea la de
la cantidad luz luz
concorrecta
la queque se de�ine
capture la imagen). Este último control es muy
objetivo; con ese valor se puede controlar de for-
de forma más necesario
precisa ala la hora Los
escena. de conseguir
elementos colores
en- reales
ma manualen o las imágenes.elEs
automática, importante
valor de la apertura de
cargados deseñalar
completar queesta primera de
la mayoría etapa
lasson: las actuales
cámaras diafragmatambién
y tiempo incorporan un sistema
de exposición), el control dia-
lentes objetivo, el fotómetro,
electrónico el espejo o prisma,
de estabilización de imagen, el que resulta
fragma (abre omuycierrapráctico a la hora
el diafragma de
para controlar la
sensor de imagen y un sistema electrónico
formar imágenes con gran nitidez y precisión. de me- cantidad de luz que va a recibir el sensor de ima-
dida y control. gen), el control de tiempo de exposición (indica al
En la �igura 16.20 se muestran de manera muy obturador el tiempo que ha de permanecer abier-
3.2.4. Guardar la imagen en un soporte digital
grá�ica los dos pasos que conforman la primera etapa. to para una toma correcta) y el control de balance
Esta es la tarea que realmente marca las diferencias entre las cámaras
de blancos (genera en la imagen un blanco «au-
digitales y las cámaras analógicas. Para llevarla téntico»,aseacabo sesea
cual requieren
la luz condos etapas:
la que se capture la
Transformar la luz en imágenes
conversión de la imagen en señales eléctricas, que son las que poseen la
imagen). Este último control es muy necesario a la
información de dicha imagen
La luz que alcanza el objetivo es simplemente luz y almacenamiento de esta información en un formato
hora de conseguir colores reales en las imágenes. Es
y nada más,digital.
no es en sí una imagen. Para que la luz importante señalar que la mayoría de las cámaras
que capta la cámaraLa conversión
pueda convertirse de laenluz (imagen) en
imágenes actuales
señalestambién incorporan
eléctricas un sistema
es realizada por electrónico
el
han de llevarse a cabo dos
fotosensor quepasos
es unprevios: el enfoque
dispositivo de estabilización de imagen,
formado por una matriz o conjunto de fotodiodos que resulta muy prác-
y la exposición. El enfoque consiste que en adaptar la tico a la hora de formar imágenes con gran nitidez
o fotocélulas (elementos transforman la energía luminosa en energía eléctrica)
lente objetivo de modo y precisión.
y que en elque se pueda
mercado formar la
aparece ima- dos diferentes tecnologías, CCD -charged
según
gen del objeto enfocado sobre el sensor de imagen
coupled device-, y CMOS -complementary metal oxide semiconductor-. La señal
de la cámara. Los elementos que ayudan a enfocar Guardar
en una cámaraeléctrica
digitalrecogida en cada
son: el visor una debien
(el elemento las áreas (cada la imagen
cuatro en un soporte
fotodiodos digital
se obtiene la
información
enfocado aparece nítido;de luz y color delaun
prácticamente, pixel -patron
mayoría Esta de Bayer-)
es la tarea quequerealmente
conforman el sensor
marca las diferencias
es proporcional a la cantidad
de las cámaras incorporan como visor una pantalla de luz (fotones)
entre que
las ha incidido
cámaras sobre
digitales y ella,
las y ha
cámaras de
analógicas.
LCD, liquid ser
cristal display) y/o
transformada enun una señal
visor digital
óptico Para llevarla
ba-mediante a cabo se
un conversor derequieren
tipo A/D. dos etapas: conver-
sado en un pentaprisma (Figura 16.20),oelcarga
El almacenamiento botónde la sión de la imagen
información enenunseñales
soporte eléctricas,
digital seque son las
disparador realiza por medio de una memoria interna y una tarjeta de memoria. En ely almace-
(generalmente, medio pulsado hace de que poseen la información de dicha imagen
controladormomento
de enfoque), el emisorlade luz infrarro- namiento de esta información en un formato digital.
de capturar imagen, la información de dicha imagen pasa a un chip de
ja (es un sistema de enfoque automático utilizado La conversión de la luz (imagen) en seña-
memoria interna, -circuito integrado de procesamiento- donde permanece de forma
tanto en cámaras analógicas como digitales), y el les eléctricas es realizada por el fotosensor que es
temporal
anillo de enfoque hasta(suele
manual que, llevar
posteriormente,
una escala es un trasladada
dispositivo desde
formado esepor chip
unahasta
matriz una
o conjunto
tarjeta de memoria (Compact
en la que se indica la distancia a la que se está en- Flash, xD-Picture Card, SDcard, etc.) donde queda
de fotodiodos o fotocélulas (elementos que trans-
almacenada de forma permanente. Las tres tareas descritas anteriormente pueden
ser representadas según el esquema gráfico de la figura 16.21.

Escena
Óptica

CCD A/D RAW

(datos)

PROCESADO DE
IMAGEN
- Espacio de color
- Ajuste luminosidad Compresión JPEG
- Balance blancos (datos)
- Nitidez
- Contraste

Figura 16.21. Fases en el funcionamiento de una cámara digital.

Figura 16.21: Fases en el funcionamiento de una cámara digital.

3.3. Tipos de cámaras

Existen multitud de criterios a 381

la hora de clasificar las cámaras digitales:
utilización (profesionales, aficionado, etc), por su aspecto constructivo y tamaño
Métodos en biociencias

forman la energía luminosa en energía eléctrica)
y que en el mercado aparece según dos diferentes
tecnologías, CCD (charged coupled device), y CMOS
(complementary metal oxide semiconductor). La se-
ñal eléctrica recogida en cada una de las áreas (cada
cuatro fotodiodos se obtiene la información de
luz y color de un píxel: patrón de Bayer) que con-
forman el sensor es proporcional a la cantidad de
luz (fotones) que ha incidido sobre ella, y ha de ser
transformada en una señal digital mediante un con-
versor de tipo A/D (ver epígrafe 16.5).
El almacenamiento o carga de la información
en un soporte digital se realiza por medio de una
memoria interna y una tarjeta de memoria. En el
momento de capturar la imagen, la información
de dicha imagen pasa a un chip de memoria inter-
na, –circuito integrado de procesamiento– donde
permanece de forma temporal hasta que, poste-
riormente, es trasladada desde ese chip hasta una
tarjeta de memoria (Compact Flash, xD-Pictu-
re Card, SDcard, etc.) donde queda almacenada de
forma permanente. Las tres tareas descritas an-
teriormente pueden ser representadas según el
esquema grá�ico de la �igura 16.21.
16.3.3. Tipos de cámaras
Existen multitud de criterios a la hora de clasi�icar
las cámaras digitales: utilización (profesionales, a�i-
cionado, etc.), por su aspecto constructivo y tamaño
(compactas, ré�lex, etc.), por el tamaño del sensor
(full-frame, 4/3, etc.), etc. En estas breves notas se
clasi�icarán las cámaras por sus prestaciones y ta-
maño constructivo, ya que ambos criterios están
muy relacionados. Así se distingue entre:
— Cámaras compactas. Están muy exten-
didas en el mercado; tienen un tamaño
reducido por lo que son muy útiles para
el viaje. Su principal inconveniente es que
el sensor de imagen es muy pequeño por
Tema 16, página 27
lo que sus prestaciones se ven algo redu-
cidas, si bien, cada vez incorporan más
ajustes con lo que se puede mejorar sus
prestaciones relativas a la creatividad.
— Cámaras bridge o intermedias. Son algo
mayores en tamaño que las compactas
y, por lo tanto, también es algo mayor
el sensor, por lo que alcanzan mejores
niveles de calidad de imagen. Estas cá-
maras incorporan una mayor cantidad
de ajustes que las anteriores y su objeti-
vo es de distancia focal variable y no es
intercambiable. La calidad de imagen de
estas cámaras es sensiblemente superior
a la las compactas. En el mercado, estas
cámaras están dirigidas a un público a�i-
cionado.
— Ré�lex o DSLR. Poseen un tamaño de sen-
sor signi�icativamente mayor que las
cámaras intermedias, de lo que se deri-
va una calidad de imagen muy superior
a las anteriores. Estas cámaras posibi-
litan el intercambio de objetivos con lo
que pueden captar cualquier situación o
escena. También, por el gran número de
funcionalidades de que disponen, per-
miten muchas posibilidades creativas.
Un elemento característico de estas cá-
maras es el visor de tipo ré�lex, que es el
que da nombre a la cámara, y constituye
un elemento muy importante a la hora
de obtener buenas tomas. El mercado de
este tipo de cámaras está orientado hacia
usuarios a�icionados avanzados y profe-
sionales por lo que existe gran variedad
de modelos con diferentes funcionalida-
des y precios.
— Cámaras EVIL (electronic view�inder inter-
changeable-lens). También denominadas
CSC (compact system cameras) o MILC
(mirrorless interchangeable-lens camera),
son cámaras de tipo compacto que permi-

COMPACTA
COMPACTA BRIDGE
BRIDGE EVIL
EVIL REFLEX
RÉFLEX
Figura 16.22. Diferentes
tipos de cámaras digitales en función de su tamaño y prestaciones
Figura 16.22: Diferentes tipos de cámaras digitales en función de su tamaño y
prestaciones
3.4. Modos de funcionamiento

Los modos de funcionamiento de una cámara digital pueden definirse

382
como las distintas formas posibilidades que la cámara proporciona al usuario a la
hora de capturar una imagen o escena determinada. A modo general puede
decirse que, salvo las compactas más básicas, todas las cámaras presentan los

ten intercambiar diferentes objetivos. El
visor de estas cámaras no es de tipo pen-
taprisma, como en las ré�lex, sino que es
un visor electrónico. Una diferencia cons-
tructiva muy importante a destacar en
ellas es la ausencia de espejo ya que la luz
que recoge el visor es la que proporciona
directamente el sensor de imagen, y no la
que pasa por el pentaprisma a través del
espejo situado delante del sensor en las
cámaras ré�lex. Este tipo de cámara está
siendo muy aceptada en el mercado y está
dirigida, según el modelo, tanto al a�icio-
nado como al usuario profesional.
— Cámaras de formato medio. Su sensor tie-
ne un tamaño considerablemente mayor
que el de las cámaras ré�lex o EVIL. Este
tipo de cámaras está orientado al usuario
profesional y cientí�ico ya que sus compo-
nentes son de gran calidad y precisión, lo
que, por otra parte, eleva ostensiblemen-
te su precio.
En la �igura 16.22 se muestran diferentes tipos de
cámara en función de su tamaño y prestaciones.
16.3.4. Modos de funcionamiento
Los modos de funcionamiento de una cámara
digital pueden de�inirse como las distintas posibi-
lidades que la cámara proporciona al usuario a la
hora de capturar una imagen o escena determinada.
De modo general puede decirse que, salvo las com-
pactas más básicas, todas las cámaras presentan los
mismos modos de funcionamiento:
— Modo automático (Auto). La cámara, se-
gún la luz de la escena, controla de forma
automática: el balance de blancos, la
apertura del diafragma y la velocidad de
obturación. También puede controlar de
forma automática el disparo del �lash.
Este modo es cómodo de utilizar pero
limita totalmente la creatividad del usua-
rio.
— Modo programa �lexible (P). Este modo
de funcionamiento permite al usua-
rio controlar ciertos ajustes, como son:
el balance de blancos; el �lash y diferen-
tes valores de f y s para un determinado
EV. Con este modo de funcionamiento se
puede alcanzar un cierto grado de com-
promiso entre el control automático y el
manual.
383
La imagen digital
Figura 16.23: Dial de selección de modos de funcionamiento de
las cámaras digitales.
— Modo automático con prioridad a la
apertura (A). Con este modo se selec-
ciona manualmente la apertura de
diafragma y la cámara controla auto-
máticamente la velocidad obturación.
Además, también manualmente, se pue-
den seleccionar otros ajustes como son
la sensibilidad (ISO), el balance de blan-
cos, etc. Generalmente, esta opción se
utiliza para controlar de forma personal
los enfoques variando la profundidad de
campo.
— Modo automático con prioridad a la veloci-
dad del obturador (S). Seleccionando este
modo de funcionamiento, se elige ma-
nualmente la velocidad del obturador (s)
y la cámara controla de modo automático
la apertura del diafragma. Al igual que en
el caso anterior, con el modo S se pueden
ajustar manualmente el balance de blan-
cos y la sensibilidad. Esta opción se utiliza
cuando se requiera un control del tiempo
de exposición para, o bien congelar una
imagen o, por el contrario, para que se
grabe con apariencia de movimiento.
— Modo manual (M). Este modo posibilita
ajustar de forma manual, prácticamen-
te, todos los parámetros de la máquina.
Es un modo que suelen utilizar los profe-
sionales de la fotogra�ía, pues así, en una
determinada toma no se deja nada al azar.
— Modo escena (SCN). Este modo posibilita
la toma de imágenes con ajustes progra-
Métodos en biociencias

grá�icas mediante un sensor incorporado en ellas

(fotómetro) y, aunque es un método muy cómodo
para el fotógrafo, en numerosas ocasiones presenta
grandes problemas a la hora de ejecutarlo (con-
trastes, re�lejos, etc.). Las cámaras, según el tipo,
utilizan diferentes sistemas de medida de luz re�le-
jada, los tres más frecuentes son:

— Medición matricial. El fotómetro toma la

Figura 16.24: Sistemas de medición.
mados para diferentes tipos de escenas:
fuegos arti�iciales, luces interiores, pai-
sajes nevados, etc. Lo suelen incorporar
casi todas las cámaras compactas y ya
también algunos modelos de cámaras
profesionales.
Generalmente, los modos de funcionamiento pue-
den seleccionarse con un dial de fácil acceso en la
parte superior de las cámaras fotográ�icas (Figura
16.23).
16.3.5. Sistemas de medición
La medición de la luz de una determinada escena se
puede hacer de dos modos: a) midiendo la luz in-
cidente sobre la escena, y b) midiendo la luz que
re�lejan los elementos que conforman la escena. En
el primer caso, la medida se realiza con la ayuda
de un fotómetro externo situado en la misma esce-
na (siempre que esto sea posible) y es un método
de medida muy bueno ya que la luz medida no se
ve alterada por re�lejos, absorciones, etc., se utiliza
frecuentemente en cine y también en televisión. El
segundo método es el que utilizan las cámaras foto-
medida de la luz de cada una de las zonas
que componen la escena y la cámara cal-
cula el promedio de todas ellas con el �in
de calcular un valor de exposición (EV)
adecuado. Este método se utiliza cuando
se quiere tener un EV correcto para una
escena completa. El problema que pue-
de presentar el método es que, cuando
existen contrastes, puede darse el caso de
que ciertas zonas queden sobreexpues-
tas y otras subexpuestas. Lo cierto es que
muchas cámaras mediante ciertos algo-
ritmos pueden corregir este problema.
— Medición ponderada al centro. Es un mé-
todo muy parecido al anterior, con la
salvedad de que es al centro de la imagen
al que se le da mayor peso a la hora de
calcular la medida. Es un método muy uti-
lizado en gran número de ocasiones pero
presenta el problema de que el fondo de
la foto que no sea la zona central puede
quedar con de�iciencias o exceso de luz.
— Medición puntual. Es un método que se
utiliza cuando se desea conocer la canti-
dad de luz que re�leja un objeto concreto
de una escena o una parte del mismo. Con
este sistema de medida solo se obtendrá
un buen resultado de exposición para la
zona medida. La �igura 16.24 muestra las
diferentes zonas de que la cámara utiliza

Figura 16.25: Relación la temperatura de color y el color de emisión de diferentes fuentes de luz. Disponible en color.

384
 La imagen digital

Figura 16.26. Diferentes posibilidades del balance de

blancos en las cámaras digitales. (AWB, automatic white Figura 16.27: Representación del tono
balance,). (colores RGB –rojo, verde, azul–, y comple-
mentarios CMY –cian, magenta, amarillo).
Disponible en color.

según los tres sistemas de medición an-

teriores.
metro denominado balance de blancos (WB, white
balance). Por lo tanto, el balance de blancos hace la
16.3.6. Conceptos generales función de un �iltro de color (en las cámaras ana-
de la fotografía digital
lógicas el balance de blancos se ajusta mediante la
instalación de un �iltro de color en el objetivo).
La temperatura de color
Según el tipo de cámara digital, el usuario
La temperatura de color de una fuente de emisión puede elegir diferentes ajustes de temperatura de
de luz puede de�inirse como el valor de tempera- color para el balanceo de blancos. En las cámaras
tura en grados K al que irradiaría un cuerpo negro de a�icionado siempre se da una opción de balan-
para obtener un color como el de la fuente. Así, a ceo automático con la que, según la luz que recibe
la luz blanca se le asocia una temperatura de color el sensor, la cámara elige una temperatura de color
de 5500 K, aproximadamente; a los tonos rojizos, de forma automática (esta opción da, en la mayoría
anaranjados y amarillos, una temperatura com- de los casos, muy buenos resultados). En cámaras
prendida entre los 2000 K y los 5000 K; y a los más avanzadas, además del balanceo automáti-
tonos azulados, una temperatura comprendida en-
co, se ofrece la posibilidad de elección de algunas
tre los 6000 K y los 18000 K, según se desplazan
temperaturas de color características de fuentes
hacia el violeta.
de emisión comunes, como son: lámparas incan-
La �igura 16.25 muestra los patrones de color
descentes y �luorescentes, luz de día, sombras, días
en K para distintas situaciones de luz que pueden
nublados, etc. En cámaras profesiones, además de
presentarse a la hora de captar una escena.
estas posibilidades, se ofrece la elección de tempe-
raturas de color por medio de su valor en K dentro
Balance de blancos (WB) de un amplio rango. La �igura 16.26 muestra cómo
aparece la parametrización del balance de blancos
Como consecuencia de que una determinada fuen-
te de luz pueda irradiar con una frecuencia de en las cámaras digitales estándar.
emisión preponderante que no corresponda a
la da la luz blanca (por ejemplo, una bombilla in-
candescente irradia con una temperatura de color
correspondiente a unos 3200 K, aproximadamente),
los blancos «auténticos» de un objeto iluminados
por esa fuente aparecerían con una ligera tonali-
dad cálida (amarilla-anaranjada); si lo que se desea
es corregir este efecto para obtener un blanco «au-
téntico» de dicho objeto, entonces hay que aplicar
una corrección para el color de esa fuente, y di-
cha corrección puede ser aplicada directamente en Figura 16.28: Cualidades del color: tono, brillo y satu-ra-
la cámara digital mediante la elección del pará- ción. Disponible en color.

385
Métodos en biociencias

cen la posibilidad de visualizar estas características

del color incluso antes de realizar la toma.

Figura 16.29: Efecto del ruido sobre una imagen.
Tono, brillo y saturación
De una forma sencilla, se de�ine como tono de una
imagen u objeto a su color preponderante, si bien,
sería más preciso de�inirlo como la longitud de onda
de la radiación del color que domina dicha imagen.
Los tonos generalmente se representan mediante
una posición angular en el denominado círculo cro-
mático (Figura 16.27).
Se de�ine como brillo, o luminosidad, de un
objeto la cantidad de luz que emite o re�leja. Consi-
derando el caso de un color concreto, el brillo puede
ser evaluado por la claridad u oscuridad que pre-
senta.
Por último, la saturación indica el grado de pu-
reza de los colores. La máxima saturación se da para
los colores puros (tonos vivos), y la mínima, para los
tonos en gris (tonos muertos).
La �igura 16.28 muestra de modo visual estas
tres cualidades del color.
Actualmente, la mayoría de las cámaras digi-
tales, en su modo de EDICIÓN, permiten variar el
tono, brillo y saturación en las tomas realizadas.
También, existen cámaras
Tema 16, muy
página 33 avanzadas que ofre-
El ruido
Las cámaras digitales, a la hora de procesar las imá-
genes que capturan, generan de forma sistemática
variaciones indeseables en su información que se
traducen en cambios de brillo y color puntuales en
el mapa de píxeles que conforma la fotogra�ía. Este
efecto es el denominado ruido digital.
El ruido digital aparece por múltiples causas
intrínsecas al dispositivo de captura. Algunas son:
limitación �ísica del sensor (cuanto más pequeño,
más ruido puede generar), pequeñas variaciones
de luminosidad en la imagen, calor generado en la
propia máquina fotográ�ica (emisión de infrarrojo
que puede ser captada por el sensor), errores en la
lectura realizada por el sensor (limitaciones en los
componentes electrónicos), errores de redondeo
en la conversión A/D, condiciones de luz muy ba-
jas (generan mucha aleatoriedad en la medida), etc.
El ruido aparece, generalmente, en capturas
realizadas sobre escenas con muy baja iluminación
ya que, en estas condiciones, hay que ampli�icar las
señales eléctricas que capta el sensor y, por lo tanto,
también se ampli�ican las señales indeseables que
originan el ruido. El equivalente al ruido digital en
las cámaras analógicas es el tamaño de grano de los
haluros de plata utilizados en la película fotográ�ica:
cuanto mayor es el grano (ISO alto) mayor es la pro-
babilidad de que dichos granos puedan visualizarse
en la imagen dotándola de cierta granulosidad. Este
efecto a veces no tiene porqué resultar indeseable
cuando se trata de fotogra�ía artística o creativa.
Por último, indicar que el ruido puede ser eli-
minado mediante la utilización de �iltros, que no son

200 ISO 1600 ISO 20000

ISO
Figura 16.30. Relación sensibilidad-ruido.
Fi-

4. FOTOCÉLULAS
Bajo este término, pueden definirse aquellos dispositivos electrónicos,
386 en otra de naturaleza eléctrica. Su
capaces de convertir una señal luminosa
funcionamiento se basa en el denominado efecto fotoeléctrico. En los dispositivos
de captura de imagen para su posterior tratamiento digital, las fotocélulas son los
 La imagen digital

Figura 16.31: Constitución �ísica de un fotodiodo.

más que programas informáticos que tratan la in- valor de sensibilidad alto posibilite la toma de fo-
formación de los píxeles que conforman la imagen, togra�ías con bajos tiempos de exposición, por lo
de forma que, para asignar el valor correspondien- que será aconsejable en fotogra�ías nocturnas o de
te al color y brillo de cada uno de ellos, ponderan su baja iluminación, si bien, como ha sido comentado,
valor y el de sus vecinos más próximos. siempre hay que tener presente el ruido.
En la �igura 16.29 se pone de mani�iesto la En la �igura 16.30 se muestra la relación entre
presencia de ruido en una imagen tomada de una el ruido y la sensibilidad correspondiente a diferen-
cámara digital. tes tomas de una misma escena capturada con una
cámara digital.
Sensibilidad
Puede de�inirse la sensibilidad de una cámara fo- 16.4. Fotocélulas
tográ�ica digital como la cualidad controlable por
el dispositivo para poder captar la luz que le lle- Bajo este término pueden de�inirse aquellos dis-
ga. Así, si se quiere realizar una toma fotográ�ica de positivos electrónicos capaces de convertir una
una escena con muy baja iluminación, se tendrá que señal luminosa en otra de naturaleza eléctrica. Su
ajustar en la cámara un valor de sensibilidad alto; funcionamiento se basa en el denominado efecto fo-
por el contrario, si la escena está muy bien ilumi- toeléctrico. En los dispositivos de captura de imagen
nada, no hará falta ajustar un valor alto, sino que para su posterior tratamiento digital, las fotocélu-
con valores bajos será su�iciente. Por las razones ya las son los elementos ordenados matricialmente
comentadas en la sección anterior, el aumento sig- que conforman el sensor de imagen. Existen dife-
ni�icativo de la sensibilidad en una toma conlleva
una notable pérdida de calidad de la imagen proce-
sada debido a la aparición del ruido digital en ella.
Por lo tanto la sensibilidad y el ruido son conceptos
contrapuestos.
Al igual que en las cámaras analógicas, las cá-
maras digitales ajustan la sensibilidad por medio
del valor ISO (normativa de la International Stan-
dard Of�ice) y con unas mismas escalas: 100, 200,
400, etc. En las cámaras digitales un aumento de
la sensibilidad se traduce en una mayor ampli�ica-
ción de las señales eléctricas que genera el sensor
de imagen, por lo que con pocos fotones incidentes
se pueden alcanzar notables valores en la ampli-
Figura 16.32: Comportamiento �ísico de un fotodiodo.
tud de la señal. Esto implica que la elección de un

387
Métodos en biociencias
Figura 16.33: (a) Filtro de Bayer: cada píxel recibe información de 4 fotocélulas. (b) Sensi-
bilidad del ojo humano hacia el color de la luz. Disponible en color.
rentes tipos de fotocélulas, pero para los sensores
de imagen se utilizan los denominados fotodiodos.
Los fotodiodos son elementos electrónicos muy
simples que están formados por una unión semi-
conductora de tipo P/N (la letra P hace referencia
a que el semiconductor ha sido dopado o contami-
nado con un elemento cuyo efecto es el de reducir
el número de electrones libres, o lo que es lo mismo
favorecer un mayor número de huecos –ausencia
de electrones–; por el contrario, la letra N indica
que el material dopado dispone de mayor número
de electrones libres), en la que como material se-
miconductor de tipo P se suele utilizar silicio (Si)
dopado con boro (B), y para el tipo N se utiliza el
fósforo (P) como dopante. Sobre las capas de semi-
conductor se disponen sendos contactos metálicos
con el �in de poder utilizar la carga eléctrica que se
genera en el dispositivo. La �igura 16.31 muestra la
disposición de sus elementos constitutivos.
Cuando la radiación luminosa incide sobre el
fotodiodo, una determinada cantidad de fotones
generan en la zona de transición de la unión semi-
conductora cierto número de pares electrón-hueco,
que, debido al campo eléctrico existente en dicha
zona, no se recombinan de nuevo (en las zonas P y N
sí lo hacen) sino que se separan generando un gra-
diente de carga en ella y, por lo tanto, un potencial
entre los contactos de la fotocélula. Este potencial
es proporcional a la cantidad de luz incidente sobre
el fotodiodo (Figura 16.32) y será el que se utiliza a
la hora de cuanti�icar la luz que reciben todas las fo-
tocélulas del sensor de imagen.
En el sensor, la luz proveniente de una determi-
nada escena y que ha atravesado las lentes objetivo
de la cámara será concentrada en cada una de las
fotocélulas que lo componen, para lo que se utilizan
millones de microlentes, cada una dispuesta sobre
cada fotocélula, y cuya misión es la de dirigir la luz
hacia el centro de las fotocélulas con el propósito
388
de que no se pierda en los bordes (zonas muertas).
En ningún caso, las microlentes tienen por objeto
enfocar la imagen capturada pues esa misión ya ha
sido encomendada y cumplida por las lentes obje-
tivo. Las fotocélulas son insensibles al color y, por
ello, solo pueden cuanti�icar la cantidad de luz (in-
tensidad y no tono) que llega a ellas. Para conseguir
saber la cantidad de fotones que con una determi-
nada frecuencia (color) llega a las fotocélulas, se
instala sobre ellas un �iltro de color (rojo, azul o ver-
de). Existen muchos tipos de �iltros pero uno muy
utilizado es el denominado �iltro o matriz de Bayer
(Figura 16.33a), en el que para cada píxel se utilizan
cuatro fotodiodos sobre los que se han situado dos
�iltros verdes, pues la luz verde es la que mejor per-
cibe el ojo humano y, por tanto, la que mayor detalle
de las escenas ofrece, uno rojo y otro azul, en una
disposición tal que no haya ningún rojo y azul jun-
tos (distribución homogénea) (Figura 16.33b).
Como se explicó anteriormente, cuando la luz
llega al material fotosensible (zona de la unión P-N)
su energía se trans�iere a los electrones y en las ca-
pas del fotodiodo se genera un potencial eléctrico,
por desplazamiento de carga, proporcional al haz
de fotones incidentes (intensidad luminosa). Se-
gún transcurre el tiempo de exposición, cada una
de las fotocélulas se va cargando eléctricamente en
función de la luz que reciben, variando dicha carga
desde un valor cero hasta el de saturación (máxima
carga). Una vez transcurrido el tiempo de exposi-
ción, el sensor de imagen tiene almacenada en cada
una de sus fotocélulas toda la información de la
luz de la escena tomada mediante valores de car-
ga eléctrica estática. Para poder leer estos valores y
convertirlos en datos, de modo que a cada píxel de
la imagen se le pueda asignar un color, es necesaria
una captura ordenada de los mismos según están
dispuestos en la matriz del sensor. Para esta misión
existen dos tecnologías diferentes: CCD (dispositi-
vo de carga doble, charged coupled device) y CMOS

Figura 16.34: Sensor con tecnología CCD y sensor con tecnología CMOS.
(semiconductor complementario de óxido metálico,
complementary metal oxide semiconductor). No se
entrará en detalles sobre cuál es el funcionamien-
to de uno y otro tipo de tecnología; sin embargo,
es conveniente indicar que en los sensores CCD,
los valores del carga eléctrica en las fotocélulas se
van tomando uno a uno y de columna en columna
(es decir: primer elemento, primera �ila de la pri-
mera columna; segundo elemento, segunda �ila de
la primera columna, etc., hasta completar todos
los elementos de la primera columna, para pasar
a la segunda columna e ir completando el proce-
so) siendo, posteriormente, convertidos en tensión,
ampli�icados y, �inalmente, transformados en un có-
digo digital. En los sensores con tecnología CMOS
los valores de carga de las fotocélulas se convier-
ten en tensión y ampli�ican en la misma fotocélula
y, realizado este proceso, ya pueden ser asignados
a los píxeles y codi�icados digitalmente de forma si-
multánea, columna a columna (y no uno a uno como
sucedía en los sensores CCD). Esto implica que la
velocidad de transferencia de datos en los sensores
CMOS será notablemente mayor que en los CCD.
Figura 16.35: Transformación A/D. Vref representa
el valor de la señal con que la entrada analógica a
digitalizar será comparada. Vcc representa el valor
de tensión que alimenta al circuito electrónico del
conversor A/D.
389
La imagen digital
La �igura 16.34 ilustra el funcionamiento de
estas dos tecnologías.
16.5. Conversores A/D y D/A
La transformación de una señal analógica en otra
digital y viceversa se realiza con la ayuda de unos
dispositivos electrónicos denominados conversores
A/D y D/A, respectivamente. A continuación, y de
modo general, se expone el funcionamiento y carac-
terísticas básicas de dichos dispositivos.
16.5.1. Conversores A/D
Los conversores A/D son dispositivos electrónicos
cuya misión es establecer una relación directa entre
el valor de una señal eléctrica (generalmente expre-
sada en V) y una expresión digital o código digital
(combinación de estados binarios 0 y 1). La �igura
16.35 muestra de forma grá�ica la operación de con-
versión A/D.
La transformación A/D se realiza en base a los
siguientes procesos o etapas:
— Muestreo. Consiste en captar a intervalos
regulares de tiempo el valor de la mag-
nitud analógica que se desee convertir
(señal de entrada). En multitud de ocasio-
nes, las señales analógicas son variables
en el tiempo, por lo que para conseguir
una �iel reproducción digital de dichas se-
ñales, la frecuencia de muestreo debe ser
ostensiblemente mayor que la de la se-
ñal muestreada (al menos del doble). En
sensores de imagen el muestreo se ha de
realizar sobre los valores estáticos de po-
tencial acumulado en las fotocélulas y, en
Métodos en biociencias
Figura 16.36: Conversión A/D.
este caso, los tiempos de muestreo están
referidos al tiempo que transcurre en-
tre medidas de potencial de fotocélulas
consecutivas y son del orden de los nano-
segundos.
— Cuanti�icación. Se de�ine como el proce-
so mediante el cual la señal de entrada se
compara en cada instante con un valor de
referencia. Realmente es el primer paso
digitalizador ya que, como se verá poste-
riormente, del proceso de comparación
solo se pueden obtener como resultado
valores discretos (true o false).
— Digitalización. Es la etapa en la que, por
medio de un codi�icador, se consigue trans-
formar la señal entregada por los compa-
radores en un código binario.
Dependiendo de las exigencias de precisión, calidad,
uso, etc., en el mercado existen multitud de tipos de
conversores A/D, que en una primera instancia po-
drían clasi�icarse en: conversores de salida en serie
y conversores de salida en paralelo; estos segundos
se pueden subdividir en: conversores de bucle ce-
rrado y conversores de bucle abierto; por último, los
de bucle cerrado se subdividen en: conversores de
contaje continuo y de aproximaciones sucesivas.
A modo de ejemplo, y para clari�icar el funcio-
namiento de estos dispositivos, en la �igura 16.36 se
muestra la arquitectura electrónica de un conversor
de salida en paralelo (tendrá tantas salidas como bi-
tes entregue el codi�icador) y bucle abierto:
En la �igura anterior Vx representa la señal de
entrada que se quiere digitalizar, Vref, representa la
tensión de referencia con la que se comparará para
cada instante de muestreo la señal de entrada, y
que, según sea esta última (mayor o menor que la
390
Figura 16.37: Conversor D/A. Vcc representa el valor
de tensión que alimenta al circuito electrónico del
conversor D/A.
de referencia), a la salida de cada uno de los com-
paradores (circuitos electrónicos integrados, CIs,
denominados ampli�icadores operacionales) entre-
gan, o bien un valor nulo (0 lógico), o bien un valor
de saturación (1 lógico). Con la señal de los com-
paradores, a través del codi�icador, la señal será
transformada en un código binario según un con-
junto de valores 0 y 1, dependientes del número de
bits que se codi�iquen.
Para clari�icar todo lo comentado anterior-
mente sobre el funcionamiento del conversor de la
�igura se puede tomar el siguiente ejemplo: supón-
gase que se desea digitalizar una señal dependiente
del tiempo que oscila entre 0 y 4 V. En el ejemplo
anterior, como se van a utilizar cuatro resistencias
en serie, habría que disponer de un codi�icador de
2 bits (2nº bits=4); al mismo tiempo, la tensión de re-
ferencia (Vref) sería de 4 V, con lo que para el primer
comparador (en el orden de arriba abajo en la �igu-
ra) la Vref sería de 4 V, para el segundo comparador
Vref= 3 V, para el tercero Vref= 2 V, y para el inferior
Vref= 1 V. Por lo tanto, cuando llegue al conversor una
señal de, por ejemplo, 3.3 V, el cuarto comparador
entregará un 1 (ya que 3.3>1), el tercer comparador
entregará un 1 (ya que 3.3>2), el segundo un 1 y el
cuarto un 0, por la misma razón que los anteriores.
Así, a la entrada del codi�icador quedaría:
0
1
1
1
Esta señal ha de ser ahora codi�icada para que de
ella se obtenga un valor digital real de dos bits, que-
dando a la salida del codi�icador: 1 1, que equivale
al valor decimal: 3. Claro está que todos los valores
menores o iguales a 1 V equivaldrán al código bi-

Figura 16.38: Conversor D/A de resistencias pon-
deradas. S0, …, S3, representan los estados binarios
0 (0 V, masa) y 1 (5 V, Vr). R0, …, R3, junto a Rf y el ampli�i-
cador operacional 741 con�iguran el circuito sumador de
las señales de entrada, V0 representa la señal analógica de
salida.
nario: 0 0; los valores menores o iguales a 2 pero
mayores a 1: 0 1; los menores o iguales a 3 y mayo-
res a 2: 1 0; y los menores o iguales de 4 y mayores
a 3: 1 1.
La conversión del ejemplo es una conversión
muy pobre ya que solo se han utilizado 4 resisten-
cias para determinar el nivel de tensión y por lo
tanto solo se puede codi�icar con dos bits. Si, por
ejemplo, se hubiesen tomado 256 resistencias, se
podría haber codi�icado con 8 bits (28) y, por lo tan-
to, para la señal de ejemplo se hubiese alcanzado
una resolución de 0.015 V en la conversión.
16.5.2. Conversores D/A
Se denominan así aquellos dispositivos electrónicos
que transforman una señal digital (codi�icada) en
otra equivalente de tipo analógico (generalmente,
en valores de tensión eléctrica). La señal codi�ica-
da se introducirá en el conversor como un conjunto
de señales eléctricas que solo pueden tener dos
estados: true (por ejemplo, 5 V) y false (0 V). La �i-
gura 16.37 muestra esquemáticamente este tipo de
transformación de señal.
391
La imagen digital
Del mismo modo que los conversores A/D,
dependiendo de calidad, posibilidades de utiliza-
ción, etc., en el mercado existen diferentes tipos de
conversores D/A, que, pueden ser clasi�icados en:
conversores serie y conversores paralelo; a su vez,
los conversores paralelo pueden subdividirse como
dispositivos de conversión directa y de conversión
secuencial; por último, los de conversión directa se
clasi�ican en conversores con resistencias pondera-
das y con redes en escalera.
Para entender cómo funciona a nivel básico un
conversor D/A se toma como ejemplo un conversor
con resistencias ponderadas (Figura 16.38).
En el circuito anterior la señal de salida en fun-
ción de los valores de las resistencias y los estados
binarios de entrada viene dada por la expresión:
V0/Rf=Vr(S0/R0+…+ S3/R3). Por lo tanto, en función
de los valores de S (0 o 1) se obtendrán diferentes
valores de salida V0.
Aplicando estos conceptos a un caso real en el
que, considerando el conversor anterior, y Vr=5 V, y
Rf=1 KΩ, R0=2 KΩ, R1=4 KΩ, R2=8 KΩ, R3=16 KΩ, las
tensiones de salida ante diferentes códigos sería:
0 0 0 0 V0=0 V
0 0 0 1 V0=5(1/16)=0.31 V
0 0 1 0 V0=5(1/8)=0.62 V
1 1 1 1 V0=5(1/2+1/4+1/8+1/16)=4.68 V
En el ejemplo anterior, al haber considerado un con-
versor D/A de 4 bits, la resolución de la señal de
salida será de 5/24=0.31 V.
Por último, puede ser útil indicar que los con-
versores D/A son, por ejemplo, muy utilizados en
lectores de audio ya que convierten la señal digital
proveniente de un lector láser en una salida de au-
dio analógica que, posteriormente, será ampli�icada
y conducida hasta los altavoces. Los conversores de
audio suelen tratar señales de 12 bits.
 Índicede
Índice de términos
términos
A* Autótrofos 124
Auxina 117, 122, 123
Avidina 150
Aberración cromática 182 Azul de tripano, azul tripán 166, 202
Aberración esférica 182
Aberraciones, microscopía electrónica 209
Absorción (luz) 177
ABTS 146
B
Acetato de uranilo 217
Bacteriorodopsina 354
Acetilcolinesterasa 271
Bálsamo de Canadá 202
Ácido fosfotúngstico 222
Baño de órganos 295, 296, 302, 305, 306
Acidófilos 132
Basófilos 132
Acoplante, microscopio acústico de barrido 237
BCIG (bromocloro indolil galacto piranósido) 146
Actividad de agua 132
Beta-galactosidasa 146
Acuorina 316, 317, 319
Bioelectricidad 286
Adquisición, citometría de flujo 166, 167
Bioluminiscencia 146
Aerobios estrictos 132
Biorreactores 133, 145, 150
— facultativos 132
Biotina 306, 307
— microaerófilos 132
Birrefringencia 185
Agar 126
Bitmaps 365
Agrobacterium 344, 345, 346, 347
Bluescript 332, 333
Alcalófilos 132
BMP, formato 371
Alcohol deshidrogenasa 267
Bola de agarosa 156
Aldolasas 255
BOLD 314
Alexa Fluor 146
Bomba de secado 218
Álgebra de Boole, imagen digital 377
Bombas de vacío 210
Alineamiento, citometría de flujo 168
Bombillas 180
Aminoetilcarbazol (AEC) 146
Aminooxidasas 255
Amplificación (de señales eléctricas) 288-290, 292,
295, 297, 300 C
Anaerobios aerotolerantes 132
— estrictos 132 Cabinas de flujo laminar 103
Análisis cuantitativo 139 Callo 117, 119. 120
— de difracción 207 Calva de lisis (ver placa de lisis)
— de partícula única (single-particle cryo-EM) Cámara oscura 380
223 Cámara tipo bridge 382
— semicuantitativo 139 Cámara tipo evil 382
Androgénesis 123 Cámara tipo réflex 382
ANINEs 324 Cámaras CCD, CMOS y CID 372, 381, 388
Antígeno (stripping) 159 Cámaras compactas 381
Antígenos multi- y polivalentes 140 Cámaras de contaje (Neubauer o Fuchs-Rosenthal)
Apertura numérica 183 113
Aposición (impronta) 198 Cámaras estenopeicas 189
Araldita 216 Cameleon 318
Atacado, microscopía electrónica 224 Campo cercano-campo lejano 235
Autoclave 104 Campo claro, microscopía electrónica 207
Autótrofos 124

* En general, con el fin de evitar reiteraciones, los términos que aparecen en los epígrafes del índice no han sido incluidos en este glosario.
Métodos en biociencias

Campo oscuro, microscopía electrónica 207 Controles negativos 167

Canal de fluorescencia 168, 170 Conversión analógica-digital 289, 372, 388
Canal iónico 285-287, 297-306, 354-355 — digital-analógica 372, 390
Canalrodopsina 1, ChR1 354, 356 — tiempo de 391
Canalrodopsina 2, ChR2 354, 363 Corrección a infinito 182
Cantiléver 229 Cortes histológicos 198
Cantiléver vibración 232 — semifinos 216
Capilares de vidrio 293, 297 — ultrafinos 216
Carboxilasas 255 Cósmido 331
Carga retrógrada 320, 326 Cre/loxP 337, 339
Catalasas 255 Criodesecación 195
Cavitación gaseosa 27 Criofijación 195
Celoidina 197 Criopreservador 109
Célula excitable 285-287, 294, 298 Crioprotección 198
Células empaquetadoras 335, 336 Criostatos 199
Células en suspensión 166 Criosustitución 195
CEMOVIS 223 Criotomos 199
Centrífuga 33 Criotransfer 222
Centrifugación 32 Crioultramicrotomo 223
— analítica 38 CRISPR/Cas 338, 339, 340, 341, 350
— diferencial 35 Cromatografía de adsorción 56
— isopícnica 38 — de exclusión por tamaño 58
— preparativa 34 — de partición 56
— zonal 37 — iónica 57
Cera de carnauba 224 Cromógeno 201
Cetoglutarato deshidrogenasa 266 Cuadrupolo 63
CGH (hibridación genómica comparativa) 96, 97 Cubreobjetos 202
Chips, proteins 76
Cuchilla microtomo 198
Ciclotrón 311
Cuchilla ultramicrotomo 216
Citoquímica en criofractura 220
Cultivo celular primario 108
Citoquinina 117
— crecimiento 112
Citrato de plomo 217
— de explantes 101
Clonación en agar 111
— fases 112
— en anillos 111
— puro 129, 130
— por dilución límite 111
— viabilidad 108
Cloronaftol (4-CN) 146
— material fungible 105
CMYK (cyan, magenta, yellow, black) 370
— tipos 101
CNV (variación número de copias) 93, 94
Current-clamp 297
Coeficiente de sedimentación 32
Curva de desnaturalización 90, 91
Coinmunoprecipitación 158
Curvas de Bézier 365
Colina deshidrogenasa 271
Colina O- acetiltransferasa 271
Coloración vital 202
Colorantes de exclusión 202 D
Coma 291, 292
Concanavalina-A 248 Deaminasas 255
Condensador 181 Decarboxilasas 255
Constante de afinidad 140 Densidad de muestreo 190
— de disociación, Kd 319 Densidad óptica 378
Contador Coulter 113 — óptica integrada 378
Contraste dependiente de la oxigenación de la Densitometría, análisis de imagen 378
sangre 314 Derivaciones 290

396
 Índice de términos

Descomplementación 106
Desenmascaramiento de antígenos 155
E
Desfase (luz) 177
Deshidrogenasas 255 EDS (energy dispersive spectroscopy) 212
Desintegración 275 EDX (energy dispersive X-ray) 212
Desmoenzimas 255 Efecto «moiré» 191
Desolvatación 61 — fotoeléctrico 387
Desorción con láser 61 — citopático 136, 137
Desoxirribonucleasas 82 Electrocromismo 323
Despegado de células 108 Electrodo 287, 288, 290-300, 302, 305-307
Desplazamiento de Stokes 188 Electroespray 60
Detección multiparamétrica 165 Electroforesis 47, 83, 86, 87, 90, 92, 93, 94
Detector anular de campo oscuro 213 — bidimensional diferencial 69
— de electrones retrodispersados 212 — bidimensional 52
— de radiación 276 — capilar 53
— de rayos X 212 — de múltiples zonas 50
— Everhart-Thornley (ETD) 212 — en gel 49
— GDD 214 — en papel 48
Detergentes 29 — zonal 48
Determinantes antigénicos 140 Electroinmunotransferencia 158
Dextrano 318, 320 Electrones Auger 206
Diafragma, cámara fotográfica 378 — retrodispersados 206
Diaminobenzidina (DAB) 146 — secundarios 206
Diauxia 134 — transmitidos 206
Difractograma 207 Electroporación 331, 333, 348
Digestión enzimática 45 Electropulido 224
Digitalización 389 Elemento focalizador, (SAM) 237
Digoxigenina 145 Elemento hijo 284
Dilatación, imagen digital 376 — padre 284
Dilución seriada 131 ELISPOT 159
Dinitrofenol 145 Embriogénesis somática 119, 120
Disco de Airy 183 Emisión de campo 209
Disolventes orgánicos 29 — por aniquilación 310
Dispersión (luz) 177 — termoiónica 209
— angular 169 Enclaustrado 197
— delantera 169 Enfoque 380
— elástica 206 Enlace peptídico 41, 65
— inelástica 206 Enzima de restricción 329, 330, 332
— mecánica y enzimática 166 — de Schardinger 264
Distancia de trabajo 178 Enzyme Comission 254
Distribución unimodal 167 Epilepsia 291
DNA integrity number 83 Epimerasas 255
— microsatélite 93, 94 Epítopos 140
— minisatélite 93 Erosión, imagen digital 376
— satélite 93 Error de OFFSET 391
DNAsas 82 Escalado del nivel de gris 372
Doble haploide 112, 123 Escáner 372
Dot blot 159 Esferas magnéticas 158
Dot-plot 170 — paramagnéticas 158
Dots per inch 368 Espectrometría de dispersión de longitud de onda
Duplicación de biomasa 129 213
— de células 129 — de masas 59

397
Métodos en biociencias

Espectros MS/MS 65 Fluoresceína 146

Espectroscopia 312 Fluorescencia 164, 187, 274
— de pérdida de energía de electrones 213 — de moléculas individuales 192
Esqueletización, imagen digital 377 Fluorocromo 70, 164-165, 188
Estado estacionario 135 Fluoróforos Cy 146
Esterasas 255 Formvar 217
Estereomicroscopios 178 Forward scatter, FSC 169
Esterilización 104 Fosfatasa alcalina 146
Estreptavidina 150 Fosfatasas 255
Estudios in silico 101 Fosfoglucoisomerasa 266
— in vitro 101 Fosfogluconato deshidrogenasa 267
— in vivo 101 Fosforescencia 274
Estufas secas 102 Fotocátodo 278
Éter acetoximetil, AM 317, 318, 319, 30 Fotocorriente 357-361
Excitación multifotónica 189 Fotodiodos 387
Exoma 87 Fotodiodos 387
Explante 115 Fotómetro 380
Extensión 198 Fotosensor 381
Extracción-solubilización 44 Fotótrofos 124
Extremófilos 132 Fototubo 278
Fraccionamiento subcelular 46
Fragmento Fab 141, 144
F Fragmento Fc 141, 144
Frecuencia de resonancia 314
Farmacogenómica 98 FRET 91, 92
Fase de latencia, retraso 128 Frotis 198
— de muerte 128 FT-ICR 64
— estacionaria 128 Fuente de iluminación 180
— exponencial, logarítmica 128 Fuentes de electrones 208
Fermentadores 133 Función de dispersión del punto 190
Fibra óptica 361, 362 Fura-2 317
Fijación in toto-in vivo 196
— microscopía electrónica 216
Filamento de carbono 220 G
— microscopía electrónica 209
Filtración 30, 31 Gamma, análisis de imagen 372
Filtrado (de señales eléctricas) 288, 290, 292, 295, Gamma-globulina 140
297 GCaMP 318, 319, 321
Filtro analizador 185 Gel de agarosa 49
— de Bayer 388 — de poliacrilamida 49
— divisor de haz 188 Gelatina 197
— polarizador 185 Genética forense 98
— barrera 188 Genoma 42
— de acetato 104 Genoteca 331
— de colores 181 Giberelina 117
— de nitrato de celulosa 104 GIF, formato 371
— HEPA (high efficiency particulate air) 104 Ginogénesis 123
— matriciales 374 Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 266
— ULPA (ultra low penetration air) 104 Glucantransferasa 268
FITC 146 Glucosa oxidasa 146
Fitohormona 116, 117 Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 267
Flujo de tapón 134 Glucosidasas 255

398
 Índice de términos

Gradiente de densidad 36 Interpolación 368

Grosor del cubreobjetos 183, 202 Ioduro de propidio 202
Grupo cromóforo 201 — de sodio 278
Grupo auxocromo 201 iRNA 351
Isobárico 70
Isocitrato deshidrogenasa 265, 266
H Isoelectroenfoque 51
Isomerasas 255
Halo de fase 186 Isótopo 274
Haploide 120 Isótopos estables 71
Hapteno 140, 145 iTRAQ, marcaje químico 72, 74
Hemocitómetro 113
Heterótrofos 124
Hexoquinasa 266 J
HGPRT (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa)
143 JPEG, formato 371
Hidrolasas 255
Hidroxibutirato deshidrogenasa 268
Hielo amorfo 195 K
Hipertermófilos 132
Histograma, citometría de flujo 170 KASP 92
Knockout 335, 337, 338, 339
Histograma, imagen digital 373
Knockdown 352
— ecualizado 374
— normalización 374
Homogeneización 23
Homogeneizador de aspas 26
L
— de esferas 26
Laboratorio de cultivos 102
— Potter 26
Lactato deshidrogenasa 267
Horno pasteur 104
Lámparas germicidas 104
HPLC 54
— UVGI (ultraviolet germicide irradiation) 104
Huella peptídica 66
Láser 178, 361, 362
LC-MS/MS 67
Lectinas 248
I LED 181, 361, 362
Liasas 255
Imagen binaria 375 Ligasa 255, 329, 330
— vectorial 365 Lightcycler 91, 92
Impedancia Z 237 Lijas de carburo de silicio 224
Impregnación metálica 202 Líneas celulares establecidas 108
Impresoras 368 Lioenzimas 255
In-cell western 159 Lipasas 255
Inclusión en resinas 216 Líquido de centelleo 277
Incubador de CO2 102 — intermedio 197
Índice mitótico 114 Litótrofos 124
Inmunoensayo 139 Luciferasa 146
Inmunogloblulina 140 Luminol 146
Inmunopurificación 156
Inmunotécnica, captura de anticuerpo 149
— captura de antígeno 149 M
— doble anticuerpo 149
Interactoma 76 Malato deshidrogenasa 266
Interferencia (luz) 178 MALDI 62

399
Métodos en biociencias

Mapa funcional 321, 326, 327 — HIER 155

Mapas de bits 365 — LSAB 150
Marcador azul 323 — MICA (mirror image complementary
— electrocrómico 323 antibody) 152
— exógeno 315 — OPT 253
— lento 323 — PIER 155
— nernstiano 323 — RCA (rolling circle amplification) 152
— rápido 323 — TSA (tyramine signal amplification) 152
Marcaje enzimático 16O/18O 73 Mezcla completa 134
— metabólico SILAC 71 Microarrays, proteins 76
— método directo 145 Microdisector 192
— método indirecto 145 Microesferas 158
Matrices de multielectrodos (MEAs) 295, 296 — magnéticas 110
Medición matricial 383 Microinyección 319, 320, 326, 334, 349
— ponderada al centro 384 Microscopía de fluoróforo único 192
— puntual 384 — PALM/STORM 192
Medida ratiométrica 317, 327 — SIM 191
Medio de caza 281 — STED 191
— de marcaje 281 Microscopio de contraste por modulación
— de montaje 202 Hoffman 187
— selectivo HAT 143 — de detección de fase 232
— semisólido 126 — de fuerza lateral 232
Medios complejos 126 — de objetivo simple o común 178
— cromogénicos 127 — invertido y con contraste de fase 104
Medios de cultivo 107 — simple y compuesto 178
— condicionados 107 Microtomo 198
— definidos, sintéticos 125 — de desgaste 200
— diferenciales 107, 127 — de deslizamiento 199
— enriquecidos 126 — de rotación 198
— líquidos 126 — de serrado 200
— selectivos 107, 127 — de congelación 199
— serum-free media 106 Minianticuerpo 144
— serum reduced media 106 miRNA 351
Membrana de PVDF 158 Mixótrofos 124
— de nitrocelulosa 158 Molécula caliente 273
Mesófilos 132 — fría 273
Metacromasia 201 Momento magnético 78
Metalizado 219 Morfometría, análisis de imagen 378
Método de Bauer 247 Mortero con mazo 25
— de copulación azoica 255 Motores de búsqueda 67
— de disgregación 108 Mutasas 255
— de explantes 108
— de Fontana-Masson 244
— de Gomori 258 N
— de Hanker 259
— de los colorantes azoicos 258 NABP (naftolbifosfato) 146
— de los Tweens 256 Nanoesferas 158
— de Ottolenghi 257 Nanopartícula de oro 147
— de quelación 255 Nanoscopia 191
— del fosfato de plomo de Gomori 259 NBT (nitro blue tetrazolium chloride) 146
— del nonanoato de naftol-AS 256 Neutrófilos 132
— EVS (EnVision System) 152 NGS (secuenciación masiva) 87

400
 Índice de términos

Niveles de gris 366 Poder de resolución, imagen digital 367

NpHR (Np halorodpsina) 356, 357, 359, 361-363 Polarización (luz) 177
Polimerasa 330, 333
Polylinker 332, 346
O POPOP 277
Porta 198
Objetivo, cámara fotográfica 378 Portabloques 198
Objetivo, microscopio óptico 182 Portamuestras, microscopía de barrido 211
Ocular 183 Postfijación 216
Ondas ultrasónicas 236 Potter, homogeneizador 26
Operaciones aritméticas, imagen digital 374 Precipitación-concentración 44
Operadores, imagen digital 375 Prensa de French 26
Óptica de Nomarski 187 Preparaciones ex vivo 294, 295, 300, 302
Organogénesis 119 — in vivo 294
Organótrofos 124 Prisma de Wollaston 187
Ornitina carbamoiltransferasa 270 Probetas, microscopía electrónica 224
Oro coloidal 147 Proteasas 24
Oxidorreductasas 254, 261, 261, 265 Proteínas A y G 147, 158
Proteínas, tinción 69
Proteoma 42
P PSD, formato 371
psf (point spread function) 190
Paleta rainbow 372 Psicrótrofo 132
Paletas LUT 372 Pulgada (inch) 367
Parafina 197 Pulido, microscopía electrónica 224
Paraplast 197 Pulsador (SAM) 237
Pared celular 24 Punto crítico 218
Partículas α 274 Punto isoeléctrico 48, 51
— β 274
Patrón de Bayer 381
Peptidasas 255 Q
Peptidosintetasas 255
Perfusión 196 Q-dots 146
Periodo de semidesintegración 275 Quimioluminiscencia 146
Permeabilización celular 167 Quimiostatos 135
— de la muestra 155 Quimiótrofos 124
— enzimática 29 Quin-2 317
Peroxidasa 146
Pez cebra 359, 362.
PicoGreen 83 R
PICT, formato 371
Piezas Leukart 197 Racemasas 255
Piezoelectricidad 230 Radiación cortical 274
Pinhole lens 189 — nuclear 274
Piruvato quinasa 267 — γ 274
Píxel 366 — detectores 276
Pixelado 367 Radiofrecuencia 64
Placa de lisis 136 Radioinmunoanálisis 282
Plasmalógenos 249 Radiometría 284
Plásmido 331, 332, 334, 341 — 14C 284
Plásmido Ti 345 Radionúcleo 311
Plástico termosensible 192 Radiotrazador 312

401
Métodos en biociencias

Rango dinámico 372 Señal endógena 146

Rasterización 365 Señales ópticas 310, 322, 323, 327
RAW, formato 370 Separador activado por fluorescencia 110
Reacción de Burstone 262 Side scatter, SSC 169
— de Feulgen y Rossenbeck 253, 254 SILAC, marcaje metabólico 71
— de Koelle 257 Silanado 201
— de Nadi 261,262 siRNA 351
Reactividad cruzada 141 Sistema de detección (PSPD) 231
Recuento eléctrico 113 SLAM (scanning laser acoustic microscope) 238
Redistribución de marcadores 323 SNaPshot 93
Reducción-alquilación 44 SNPs (polimorfismos de un único nucleótido)
Reflexión (luz) 177 87,93, 96, 97, 99
Refracción (luz) 177 Sonda AFM 231
Reglas de Cahn-Ingold-Prelog 241 Sonda control posicional 229
Rejillas 217 Sonda movimiento 229
Rellenado, imagen digital 376 Sonda SNOM 235
Reorientación de marcadores 323 Sonda 228
Réplica metálica 219 Sonicador 27
Resolución criterio de Abbe 183 Sorter 173
— criterio de Rayleigh 183 Sorting, citometría de flujo 173
— criterio de Sparrow 183 Southern 93
— en el plano horizontal 183 Splicing alternativo 43
— en el plano vertical 184 SRM 75
— microscopía electrónica 208 Sublimación 221
— SAM 236 Succinato deshidrogenasa 266
Respuesta espectral 372 Sueño 290-292
Respuesta hemodinámica 314, 315 Suero fetal bovino (FBS, fetal bovine serum) 106
Respuestas sinápticas 295, 297, 299, 304, 305 Suplementos (medio de cultivo) 106
Retallado del bloque 216 SYBR Green 90, 91, 95
Retinal 354-357, 362
Retrotranscripción 94, 95
RGB (red, green, blue) 370 T
Rhod-2 317, 318
Ribonucleasas RNAsas 83, 84, 86 Tampón «blotto» (blotto buffer) 158
RISC (RNA induced silencing complexes) 351 Taq DNA polimerasa 83, 89, 90, 91
RNA integrity number 86 TaqMan 91, 92, 94, 95
RNAlater 85 Tautomerasas 255
Rodamina 146 Tautomería 243
Rotor 34 T-DNA 345, 346, 347
Ruido eléctrico 288, 290, 296, 297, 300, 305 Técnicas de post-inclusión (post-embedding) 155
Ruptura celular 24 — de pre-inclusión (pre-embedding) 155
Termociclador 90, 92
Termófilos 132
S Tetróxido de Os 217
Threshold 95
scFv (región variable de cadena sencilla) 144 Tiempo de conversión 391
SDS-PAGE 51 — de duplicación 129
Secado al punto crítico 218 — de generación 112
Secciones histológicas 198 TIFF, formato 370
Sefarosa 156 Tomografía electrónica 223
Selección negativa 334, 337, 338 Trampa iónica 64
— positiva 334, 338, 344 Transaldolasas 255

402
 Índice de términos

Transaminasas 255
Transcetolasas 255
V
Transcriptasa inversa 330, 335
Variación somaclonal 115
Transductor (SAM) 237 VChR1 (Volvox canalrodpsina 1) 357, 359, 362
Transductor molecular 322 Velocidad de dilución 135
Transferasas 255 Ventana, citometría de flujo 168, 170, 171
Transferencia de energía de resonancia de Förster Vibratomo 199
162, 318, 324, 325 Vida media 275
Trazador 273 Vida media biológica 275
TRICTC 146 Visor óptico 380
Tripsina 45 Voltage-clamp 300
Tubo de rayos catódicos 212 Vóxel 190
— fotomultiplicador 278 VSFP 324, 325
— óptico 179
Turbidostatos 135
W
U Western blot 158

UFC (unidades formadoras de colonias) 126, 129,

131 Z
UFP (Unidades formadoras de placas) 136
Ultramicrotomo 216 ZFNs, zinc finger nucleases 338, 341, 352
Umbralización 375
Uridiltransferasa 267

403