NXH VJD

CULTIVO DE MUESTRAS FARÍNGEAS Y
CARACTERIZACIÓN DE Versión: 00
PROCESO AISLAMIENTOS DE Corynebacterium
REDES EN SALUD PÚBLICA spp., PARA LA CONFIRMACIÓN DE 2022-05-XX
DIFTERIA
MEN-R01.5330-XXX Página 1 de 27
1. OBJETIVO
Describir la metodología para el aislamiento de especies toxigénicas de Corynebacterium spp en medio

cistina telurito y detección de la toxina diftérica en cepas toxigénicas por la técnica modificada de Elek.
2. ALCANCE
Este documento se tomará como referencia para realizar el aislamiento de especies toxigénicas de
Corynebacterium spp a partir de hisopados faríngeos, nasofaríngeos, lesiones cutáneas y
seudomembranas en pacientes con sospecha o confirmación de difteria y que haya sido notificados al
sistema de vigilancia epidemiológica.
3. RESPONSABILIDAD
Coordinador de Grupo: tiene la autoridad y responsabilidad para gestionar los recursos necesarios
para ejecutar el ensayo de acuerdo con las especificaciones establecidas en el presente documento.
Responsable Técnico: garantizar el cumplimiento de los lineamientos establecidos en el presente

documento, de igual forma tienen la autoridad para tomar las decisiones técnicas derivadas de la
ejecución del método de ensayo.
Líder Técnico: conocer y aplicar de manera estricta lo establecido en el presente documento para
ejecutar el ensayo. También es responsable de la divulgación, control y revisión periódica del presente
documento. De igual forma tienen la autoridad para tomar las decisiones técnicas derivadas de la
ejecución del método de ensayo.
Personal de apoyo técnico: es responsable de cumplir con lo definido para la ejecución de actividades
relacionadas con lavado, esterilización de material, limpieza y desinfección de áreas, con el fin de que
cumplan con los requerimientos necesarios para la ejecución del ensayo
4. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Cepas de referencia: microorganismos definidos por lo menos al nivel de género y especie, catalogados
y descritos según sus características y preferiblemente de origen conocido. [ISO 11133] Normalmente
obtenidos de una colección nacional o internacional reconocida.
Control/Material de control: un dispositivo, solución o preparación liofilizada prevista para el uso en el

proceso de control de calidad [CLSI EP12-A2].
NOTA 1: la reacción esperada o concentración del analito de interés es conocida dentro de los límites
determinados durante el proceso de preparación y confirmación para el uso previsto.
NOTA 2: Los materiales de control no deben ser usados para calibración dentro del mismo proceso en
que se usen como controles.
Difteria: La difteria clásica es una enfermedad del tracto respiratorio superior caracterizada por dolor de
garganta, fiebre de bajo grado y producción de una toxina por C. diphtheriae que causa la destrucción
celular local de las membranas mucosas y la toxina absorbida puede causar manifestaciones en varios
DIFTERIA
órganos que incluye el miocardio, los riñones y el sistema nervioso. La acumulación de material
inflamatorio y la fibrina dan como resultado la característica "pseudomembrana" adherente que
habitualmente implica la amígdala (s), la faringe y / o la nariz, no obstante, la enfermedad puede afectar
casi cualquier membrana mucosa.
Elek:
LSPD: Laboratorio de Salud Pública Departamental
5. CONDICIONES GENERALES
5.1 Condiciones generales transversales
 Tener en cuenta que los aislamientos deben ser considerados potencialmente peligrosos y
su manipulación debe realizarse por personal autorizado, con los equipos adecuados, de
acuerdo al nivel de seguridad requerido, por lo tanto, las actividades relacionadas deben ser
desarrolladas siguiendo las recomendaciones establecidas en el Manual de Bioseguridad del
INS MNL-A01.0000-001.
 El lavado del material utilizado para la ejecución del ensayo debe realizarse de acuerdo a los
lineamientos establecidos en los instructivos Lavado y empaque de material de laboratorio
INT-R01.0000-003 y Esterilización de material por calor húmedo INT-R01.0000-002.
 Los medios de cultivo utilizados se preparan según lo establecido por los respectivos
fabricantes, y de acuerdo al POE-R01.0000-019 Lineamientos generales para preparación y
manejo de reactivos y medios de cultivo, y las instrucciones de la casa comercial
 Todos los medios de cultivo deben tener un adecuado control de calidad, el cual debe
cumplir lo descrito en el INT-R01.5330-052 control de medios de cultivo.
 Todos los agares deben ser temperados antes de su uso, por lo tanto, deben retirarse de los
refrigeradores o contenedores con algún tiempo de anterioridad al montaje, para que
alcancen temperaturas entre 14 °C y 25 °C.
 La clasificación y disposición de los residuos generados se debe realizar de acuerdo a lo

establecido en el Instructivo Gestión Integral de Residuos INT-A05.0000-002 y documentos
relacionados
 El área debe cumplir con las condiciones ambientales, caracterizadas de acuerdo al POE-
R01.0000-018 control y monitoreo de condiciones ambientales y de instalaciones. Si bien
este ensayo no requiere ninguna temperatura o humedad relativa para su desarrollo, si es
importante garantizar que tales condiciones sean adecuadas para el correcto desempeño de
los equipos involucrados en el proceso
 La manipulación de las muestras, contempla desde el ingreso al INS hasta el transporte al

interior del grupo de Microbiología, por lo tanto, debe seguirse lo establecido en el POE-
R01.0000-008 Revisión solicitud del servicio, y el POE-R01.0000-009 Aseguramiento de la
validez de los resultados, ya que en ellos se establecen puntos importantes de control a nivel
institucional.
DIFTERIA
 Todas las muestras de un caso sospechoso deben recolectarse en medio de transporte

semisólido como el Amies con carbón activado y ser transportadas al laboratorio
inmediatamente después de la recolección o mantener a una temperatura superior de 8 °C si
se presenta retraso en el transporte. Si Amies no está disponible, se pueden utilizar otros
medios de transporte comerciales como el medio de transporte de Stuart.
 Idealmente, las muestras deben recolectarse al comienzo de los síntomas y antes de la

terapia con antimicrobianos o antitoxinas.
 Las muestras post mortem de las vías respiratorias superiores y los órganos vitales pueden
examinarse en los casos en los que se requiere una autopsia para determinar si la difteria
fue la causa de la muerte.
 El INS procesará las muestras y/o aislamientos remitidos por los Laboratorios de Salud
Pública u otras instituciones que lo requieran, y serán enviadas con la ficha de notificación
del sistema para vigilancia para difteria: “Difteria. Código INS 230”.
5.2 Condiciones generales específicas del ensayo
 Como medida preventiva para evitar la contaminación de las muestras y el personal de

laboratorio se debe incluir la separación de las áreas de trabajo, el uso de cabinas de
seguridad biológica, de EPP adecuados incluyendo mascarilla y protección ocular y de
puntas de pipeta con filtro. También que el personal se encuentre vacunado y que sus
vacunas de refuerzo estén actualizadas contra la difteria.
 Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad, debido a que
las cepas productoras de toxinas de C. diphtheriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis
pueden causar enfermedad grave y a veces mortal. Se han notificado informes de
adquisición de infecciones en el laboratorio, por lo que también se recomienda el uso de
asas desechables estériles para la siembra de las colonias en los medios de cultivo.
 Siempre que sea posible limpie de manera rigurosa la cámara de flujo laminar o el área
(mesón) donde va a manipular las muestras y/o cultivos con alcohol al 70%.
 Encender la lámpara de luz ultravioleta y mantenerla por 15 minutos antes de iniciar el

proceso.
 El hisopo para cultivo debe ser manejado en cabina de bioseguridad o el área del
laboratorio asignada para el procesamiento de estas muestras, además se debe tener en
cuenta:
o Si se trabaja con aislamientos de Corynebacterium spp o ADN en el área de

procesamiento de muestras es posible que se genere contaminación cruzada, lo que
impacta el aseguramiento de la validez de los resultados.
o El hisopo siempre debe estar en el medio de transporte Aimes con carbón activado y no
debe incubarse antes de sembrar en cultivo primario, se debe cultivar inmediatamente.
DIFTERIA
 Revise la solicitud de ensayo antes de comenzar el procesamiento de la muestra. En el

caso que la muestra solo venga con orden de cultivo, o por sus condiciones de envío
solo sea apta para cultivo, lleve a cabo el procedimiento descrito en este documento. Si
adicionalmente la muestra requiere ser procesada por técnica de Reacción en Cadena
de la Polimerasa, tenga en cuenta la metodología descrita el MEN-R01.5330-XXX
Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real para el diagnóstico de Difteria,
para la manipulación correcta de las muestras.
 Antes de iniciar la siembra temperar por al menos 10 minutos el agar sangre cistina
telurito que se encuentra de 2°C a 8°C.
 Al realizarla prueba de Elek los aislamientos y controles deben ser sembrados en agar
sangre y no en medio selectivos.
6. FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE ENSAYO
Las especies de corinebacterias potencialmente toxigénicas como C. diphtheriae, C. ulcerans y C.

pseudotuberculosis, se pueden aislar en agar sangre, con la finalidad de lograr una mayor selectividad
se emplean medios que contienen telurito de potasio (K 2TeO3), aprovechando la resistencia natural de
estas especies al telurito (TeR) proporcionada por la proteína de resistencia y disminuir la microbiota
contenida en las muestras faríngeas del sistema respiratorio superior, asimismo, éstas especies
producen cisteinasa la cual contribuye a la pigmentación oscura de las colonias en el medio de agar
sangre cistina telurito causado por la producción de H 2S a partir de la cistina que interactúa con la sal de
telurito, reduciendo el telurito del medio a telurito metálico, el cual precipita y produce el desarrollo de
colonias negras.
Para la confirmación de los aislamientos de Coynebacterium spp se realiza el ensayo de inmunodifusión

de Elek que funciona según el principio de inmunoprecipitación de antígenos y anticuerpos en la
detección de la exotoxina (complejo toxina-antitoxina), visibles en medio semisólidos que se observa
entre las colonias y la fuente de antitoxina
7. LIMITACIONES Y/O INTERFERENCIAS DEL MÉTODO DE ENSAYO
El aislamiento de especies de corinebacterias potencialmente toxigénicas a partir de secreción faríngea

está documentada como la técnica de referencia para el diagnóstico de la tos ferina, sin embargo, la
sensibilidad de este método es muy bajo por diversos factores externos al microorganismo y que no
pueden ser controlados en el laboratorio como son la temperatura de transporte la muestra, la edad del
paciente, el estado de vacunación, el tratamiento antimicrobiano y la carga bacteriana en la muestra.
Las muestras clínicas recolectadas después del inicio al tratamiento antimicrobiano o profiláctico,
probablemente no presenten crecimiento para Corynebacterium spp debido a la reducción del número de
microorganismos, siempre que sea posible se deben utilizar muestras recolectadas antes de la
administración de agentes antimicrobianos. El microrganismo es exigente y de lento crecimiento, por lo
tanto un cultivo negativo no indica que el paciente no tenga la enfermedad, y se puede apoyar el
diagnóstico con el resultado de pruebas sensibles como la PCR.
DIFTERIA
8. RECOLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
Para la realización del ensayo, son adecuados, los hisopados faríngeos, nasales, pseudomembrana y de
lesiones. La muestra ideal son las piezas de pseudomembrana en solución salina, sin embargo, por ser
una toma de muestra tan dolorosa y con riesgo de sangrada este tipo de muestra es recomendada para
los casos de mortalidad. Los aislamientos bacterianos también se recolectan y remiten en el medio
Aimes con carbón activado. Si se requiere ampliar la información, se puede consultar la Guía para la
vigilancia por laboratorio de Corynebacterium diphtheriae.
Las condiciones de envío de muestras y/o aislamientos se describen en el Manual de procedimientos

para la toma, conservación y envío de muestras al Laboratorio Nacional de Referencia y las mismas
deben ser remitidas al INS, la respectiva ficha epidemiológica correspondiente al programa, deben ser
cargadas a la plataforma LabMuestras en el módulo Sivilab.
El manejo de la muestra y/o aislamiento una vez es remitida al Grupo se realiza de acuerdo con lo
establecido en los procedimientos POE-R01.0000-007 Recepción, radicación, conservación y disposición
de muestras, POE-R01.0000-008 Revisión solicitud del servicio, dejando evidencia del proceso en la
operación de la plataforma LabMuestras en el módulo Sivilab.
Las muestras y/o aislamiento deben ser rotuladas con los datos que permitan identificar claramente la
muestra, tales como nombre del paciente, número de documento o historia clínica, consecutivo de la
institución y el código interno asignando por la plataforma LabMuestras.
Para iniciar su procesamiento, se debe revisar que la muestra y/o aislamiento cumpla con los criterios de
envío, de ser así, se debe ingresar a la base de datos FOR-R01.5330-0XX Base de datos - Difteria, para
asignar el número del código interno que identificará la muestra a lo largo del procesamiento y hasta la
emisión del resultado; posteriormente se genera el Registro de los resultados en el FOR. R01.5330-XXX
047 Hoja de datos primarios – Difteria u hoja de trabajo correspondiente. El número de cepario asignado
al aislamiento corresponderá al mismo con el cual ingresa la muestra.
Si el LSPD no cuenta con medios microbiológicos para el aislamiento de especies corineformes pueden
remitir el hisopado de muestra nasofaríngea al INS en medio Amies con carbón activado a temperatura
mayor a 8°C. En el caso que aíslen especies corineformes estos deben ser remitidos en medio de
transporte Aimes con carbón activado o Cary Blair a temperaturas mayores a 8 °C.
Si se requiere, tanto la muestra como el aislamiento pueden ser analizados por PCR del ADN extraído de
especímenes o aislamientos sospechosos de C. diphtheriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis.,
siguiendo lo indicado en el MEN-R01.5330-XXX
9. CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA
Tan pronto llegue la muestra o el aislamiento al INS en el medio de transporte, deberá ser sembrado en
el menor tiempo posible en agar sangre cistina telurito a partir del medio de transporte Aimes con carbón
activado. Posteriormente el medio de transporte deberá ser conservado a temperatura entre 5 °C y 25
°C hasta que se finalice el procesamiento de la muestra y se emita el resultado. Las cepas recuperadas
DIFTERIA
serán almacenadas en criopreservación en una solución de leche descremada (skim milk) al 20% según
los lineamientos INT-R01.5330-041 Manejo de cepas bacterianas de referencia y colección.
Tabla 1. Conservación de muestras
Muestra/Matriz Conservación de muestras
En el recipiente original a temperatura del laboratorio, después

de emitir el resultado descartar la muestra y criopreservar la
Aislamiento bacteriano en medio de transporte
cepa en el caso que se identifique Corynebacterium spp. sean o
no toxigenicas
Exudado faríngeo o nasofaríngeo o de lesiones En el recipiente original a temperatura del laboratorio, después
cutáneas para cultivo de emitir el resultado descartar la muestra
Exudado faríngeo o nasofaríngeo o de lesiones Guardar un alícuota mínimo de 200µL y almacenar de -20°C a -
cutáneas para PCR 70°C por 5 años
En el recipiente original y almacenar de -20°C a -70°C, después
Muestras de membrana o tejido
de emitir el resultado descartar la muestra
Muestra/Matriz Conservación de muestras
Tubo de microcentrífuga a -20°C a -70°C por 5 años, identificado

Eluidos
con el numero interno
Para un aislamiento de Corynebacterium spp criopreservar a -
Aislamiento bacteriano 70°C en Skim Milk al 20% o crioperlas para conservación de
cepas a -20°C, por 5 años, identificado con el numero interno
10. EQUIPOS
 Cabina de bioseguridad Clase II

 Incubadora a 35°C ± 2°C
 Lupa de laboratorio
 Microscopio de luz con objetivo de 100X
 Agitador vórtex
 Micropipetas en un rango de 1 μL a 1000 μL
 Congelador -20 °C ± 5°C
 Refrigerador de 5 °C ± 3 °C
 Ultracongelador -70 ± 10°C
11. REACTIVOS, CONTROLES Y MATERIALES DE REFERENCIA
11.1 Materiales
 Asas bacteriológicas desechables

DIFTERIA
 Cajas de Petri
 Láminas portaobjetos
 Gradillas
 Pipetas Pasteur plásticas
 Papel filtro
 Pinzas estériles
 Escobillones estériles
 Tubos taparosca de 20x125
 Papel de filtro
 Erlenmeyer
 Puntas con filtro estériles
 Toallas absorbentes
 Marcador de vidrio
 Recipiente para descartar puntas y líquidos
11.2.2 Reactivos
 Agar sangre cistina telurito (ver anexo 1 para la preparación)

 Telurito de Potasio al 0.03% (ver anexo 2 para la preparación)
 Solución salina
 Caldo BHI
 Colorantes para tinción de Gram y azul de metileno
 Bioquímicas (ver anexo 3 para la preparación)
 Antitoxina diftérica
 Cistina en polvo
 Medio basal de Elek (ver anexo 4 para la preparación)
 Proteasa peptona No.2
 Hidróxido de sodio 10N, 40% p/v
 Ácido láctico 85% p/v
 Maltosa
 Cloruro de sodio
 Agar bacteriológico
 Agua purificada tipo II
 Suero fetal Bovino (Sigma-Aldrich)
11.3 Materiales de referencia
11.3.1 Control positivo
 Elek, Gram y cultivo: C. diphtheriae CD001
11.3.2 Control negativo:
 Control negativo para Elek: C. diphtheriae CD002

 Control débil positivo para Elek: C. diphtheriae CD013
12. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

DIFTERIA
12.1 Aislamiento de cultivo
 Temperar por al menos 10 minutos el agar sangre cistina telurito que se encuentra de 2°C a 8°C.
 En la cabina de bioseguridad marcar la caja de agar con el número interno obtenido del Sivilab
junto con la fecha del día de la siembra. Mantener las recomendaciones de bioseguridad
mencionadas anteriormente.
 Realizar un extendido con el hisopo del medio de transporte en el primer cuadrante (figura 1), de
la placa de agar sangre cistina telurito.
 Realizar un extendido por agotamiento con un asa desechable estéril de 10 µl en los otros 3
cuadrantes de la placa como se muestra en la figura 1.
 Incubar de acuerdo a lo establecido en el numeral 12.4.
12.2 Siembra de hisopado a partir del medio de transporte.
 El hisopado puede ser una muestra obtenida a partir de frotis faríngeo, de lesiones de piel y/o
frotis nasal.
junto con la fecha del día de la siembra.
12.3 Pseudomembrana en solución salina.
 Macerar la pieza de pseudomembrana en 1ml de caldo BHI o solución salina estéril.
junto con la fecha del día de la siembra.
DIFTERIA
Figura 1. Siembra de muestras faríngeas para diagnóstico de Difteria.
12.4 Incubación de placas de cultivo
 Incubar las placas a una temperatura de 35°C ± 2°C. Se debe tener en cuenta que las placas no
se deshidraten durante el tiempo de incubación.
 Observar las placas después de 18 horas a 48 horas de incubación, para subcultivar y confirmar
colonias sospechosas tan pronto como sea posible y observar si hay colonias de acuerdo a la
morfología, de las figura 2 y 3.
 Si no hay un crecimiento visible, es recomendable examinar la morfología de la colonia con una

lupa de laboratorio. Tener en cuenta las características morfológicas descritas en la Tabla 2.
Tabla 2. Características morfológicas en agar sangre y agar telurito
Especie/biovar Agar Sangre Agar Telurito
C. diphtheriae biovar gravis No hemolítica Gris / negro mate, opaco, 1,5-2 mm de

diámetro, superficie mate, friable, móvil o que
DIFTERIA
tiende a romperse en segmentos pequeños

cuando se toca con un asa
Negro con halo de color castaño negro
Gris / negro, opaco, de 1,5 mm a 2 mm de
diámetro, borde entero y superficie brillante,
C. diphtheriae biovar mitis Pequeña zona de β-hemolisis
variable en tamaño
Gris / negro, opaco, pequeño, 0,5 mm a 1
C. diphtheriae biovar mm de diámetro, superficie brillante, discreto,
Pequeña zona de β-hemolisis
intermedius translúcido, parcialmente con centro negro
Gris / negro, opaco, de 1,5 mm a 2 mm de
diámetro, borde entero y superficie brillante,
C. diphtheriae biovar belfanti Pequeña zona de β-hemolisis
variable en tamaño
Pequeña zona de β-hemólisis,
gris / blanco, seco,
Gris / negro, opaco, muy seco
C. ulcerans consistencia cerosa, circular,
ligeramente convexa con un
borde entero
Pequeña zona de β-hemólisis,
Gris / negro, opaco, muy seco
C. pseudotuberculosis de color crema a naranja,
anillada concéntricamente
No hemolítico, blanco, Gris / negro
C. striatum
húmedo, liso Negro sin halo
No hemolítico, gris / blanco, Gris / negro
C. jeikeium
bajo convexo Negro sin halo
Fuente: Grupo de Microbiología - modificado de OMS

DIFTERIA
Figura 2. Morfología de colonia clásica de C. diphtheriae en medio de agar sangre;
Fuente. Grupo de Microbiología
Figura 3. Morfología de C. diphtheria en medio de agar sangre cistina telurito.
Fuente. Grupo de Microbiología

DIFTERIA
12.5 Pruebas de identificación presuntiva y/o confirmación.
 Cuando se observen colonias sospechosas (figuras 2 y 3), deberán ser aisladas tomando 1 a 3
colonias por separado e inocularlas en agar sangre como se muestra en la figura 4 e incubando
las placas a 35°C ± 2°C.
Figura 4. Aislamiento de colonias sospechosas en agar sangre.
 El crecimiento del biovar C. intermedius puede tomar entre 48 horas a 72 horas, es un biovar de
crecimiento lento dentro de las especies de C. diphtheriae, por lo tanto no se debe descartar las
cajas antes de 3 días.
 Cuando las colonias sospechosas se encuentren aisladas según lo descrito anteriormente, se

debe iniciar con la confirmación de la especie de Corynebacterium spp de acuerdo al algoritmo
de identificación Figura 5 y 6. Registrar los resultados de cada técnica en la hoja de datos
primarios - Difteria FOR-R01.5330-XXX.
 Los aislamientos de cultivos primarios inicialmente se pueden identificar por la apariencia de la

colonia, la tinción de Gram y otras pruebas preliminares de detección.
DIFTERIA
12.6 Examen microscópico y procedimientos de tinción para colonias sospechosas
- Realizar la coloración de Gram de acuerdo a lo descrito en el INT-R01.5330-001 Coloración de

Gram, si el laboratorio cuenta con safranina reemplace por la fucsina para obtener una mejor
coloración.
- Las corinebacterias se presentan como pequeños bacilos Gram positivos ligeramente curvados,
con lados no paralelos y en ocasiones con extremos ligeramente más anchos, lo que da a
algunas de las bacterias una forma típica de masa o de bastones que es característico para
Corynebacterium spp. Se organizan como células individuales, en pares, en forma de V, en
empalizadas o en grupos, con el llamado aspecto de “letras chinas. Algunas cepas tienden a
decolorarse demasiado y puede aparecer Gram variables.
- Otra alternativa de coloración cuando los bacilos no se observan claramente Gram positivos es
la tinción de azul de metileno de Loeffler y la coloración de Albert para gránulos metacromáticos.
12.7 Bioquímicas convencionales
Las colonias aisladas de cultivo se identifican por pruebas bioquímicas y enzimáticas. En el siguiente
algoritmo se presentan las pruebas requeridas para confirmación de Corynebacterium spp:
Figura 5. Algoritmo diagnóstico. Diagrama de flujo que muestra los métodos utilizados en el
aislamiento e identificación de Corynebacterium spp.
DIFTERIA
Figura 6. Algoritmo e identificación de Corynebacterium spp en el Laboratorio Nacional de

Referencia
DIFTERIA
El fundamento, preparación y procedimiento de las anteriores pruebas bioquímicas, se escriben en el

anexo 1.
12.8 Prueba modificada de Elek
El método más utilizado para determinar la toxigenicidad es la prueba de inmunoprecipitación Elek, que
se mejoró para usar un medio Elek superior y aumentó considerablemente la claridad y precisión de la
prueba.
Antes de iniciar el proceso se deben preparar las placas de Elek de acuerdo a lo descrito en el Anexo 4.
Preparación de los discos antitoxinas
• Utilizar discos de papel blanco de 6 mm (referencia Becton Dickinson® Ref 231039), los cuales
vienen listos para su uso.
• Esterilizar los discos en un recipiente que se colocar en el autoclave.
• La antitoxina diftérica, generalmente es suministrada en viales reconstituidos a 1000 UI/ml; debe
ser almacenado a 4ºC.
• Diluya la antitoxina a 500 UI/ml con agua destilada Tipo II estéril. La antitoxina diluida es estable
durante 6 meses si se almacena de 2 °C a 8 °C.
DIFTERIA
• Utilizando pinzas estériles transfiera los discos a un recipiente estéril y con una micropipeta
adicionar 6 µL fuerte de la antotoxina diluida, dejar secar (20 minutos aproximadamente).
• Después de este tiempo los discos quedan listos para ser usados.
Disposición de la prueba de toxigenicidad Elek
• Se debe utilizar cultivos frescos para realizar la prueba

• Etiquetar una caja de Petri preparada según la plantilla de la Figura 7, revise que no haya
humedad en la superficie (colocar la plantilla debajo de la caja) y con un pinza estéril colocar un
disco de antitoxina (500U/mL) en la placa. Se pueden probar dos cepas desconocidas en una
placa.
• Usando un asas de 1 µL tocar la colonia de las cepas de prueba ya las cepas de control (utilizar
un asa para cada cepa), luego colocar esa pequeña cantidad de microorganismo sobre el agar,
siguiendo el orden de la Figura 7.
• Tener en cuenta los controles recomendados en el numeral 13.
• Por último, incubar las cajas aeróbicamente a 35°C ± 2°C durante 24 horas a 48 horas.
Lectura:
Examine cuidadosamente las placas después de 16 horas a 24 horas de incubación y nuevamente

después de 48 horas, utilizando una fuente de luz adecuada.
Busque líneas de precipitación entre las cepas de prueba y las cepas de control positivo fuerte y débil.
La cepa de control negativo no debe presentar ninguna línea de precipitación
No vuelva a incubar durante más de 48 horas, puesto que se pueden desarrollar líneas de precipitación
inespecíficas.
Figura 8. Prueba modificada de Elek para pruebas de toxigenicidad.
D = disco de antitoxina - = sitio de inoculación
13. CONTROL DE CALIDAD ANALÍTICO
A continuación, se encuentran las cepas y controles usados para el control de las pruebas usadas para
la identificación de especies de Corynebacterium spp que pueden ser usadas en cada montaje:
DIFTERIA
Tabla 3. Cepas usadas para control de las pruebas bioquímicas
Pruebas Cepa control positiva Cepa control negativa

Oxidasa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922
Catalasa Staphylococcus aureus ATCC 29213 Escherichia coli ATCC 25922
Urea Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922
Reducción de
Escherichia coli ATCC 25922 --------------------
Nitratos
Denitrificación Nitritos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 --------------------
(ZINC)
Para la prueba de Elek, tener en cuenta los siguientes controles:
• Positivo: toxigéncio C.diphteriae biovar gravis, NCTC 10648

• Positivo débil: toxigéncio C.diphteriae biovar gravis, NCTC 3984 / ATCC 19409
• Negativo: no toxigéncio C.diphteriae biovar belfanti, NCTC 10356
14. ANÁLISIS DE DATOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Lectura de los resultados de las pruebas
Los resultados de morfología macroscópica y microscópica, pruebas bioquímicas, crecimiento en agar

sangre cistina telurio, prueba de Elek y PCR, se deben registrar en el FOR-R01.5330-XXX Hoja de
datos primarios difteria.
En la tabla 5 se presentan los resultados de las pruebas bioquímicas para la identificación de

Corynebacterium spp:
Tabla 4.Resultados de las pruebas bioquímicas para la identificación de Corynebacterium spp
a
Actividad cistinasa determinada en agar Tinsdale
b
Prueba de CAMP reversa observada en agar sangre de cordero
DIFTERIA
Interpretación de la prueba de Elek
• Para validar la prueba, los controles negativos no deben presentar precipitación y los controles
positivos tanto débiles como fuertes deben presentar precipitación visible.
• Las líneas clásicas de precipitación forman un "arco" con los controles positivos indicando que la
cepa es productora de toxina.
• Los aislamientos que formen líneas de precipitación se consideran positivos para la producción
de toxina difteria y se etiquetan como "toxigénicos".
• Los aislamientos que no formen líneas de precipitación después de 48 horas de incubación se
consideran negativos para la producción de toxina difteria y están etiquetados como "no
toxigénicos".
• Las cepas no toxigénicas no mostrarán estas líneas. Líneas secundarias de precipitación
debidas a los antígenos solubles distintos de la toxina diftérica pueden ser producidos tanto por
agentes toxigénicos como no toxigénicos. Ver Figura 2.
Figura 9. Prueba modificada de Elek para pruebas de toxigenicidad
15. EMISIÓN DEL INFORME DE RESULTADOS
Los resultados se digitarán en la columna en la casilla “cultivo” del FOR-R01.5330-XXX Base de datos
Difteria según el criterio de codificación e interpretación registrado en la base. Si se tiene observaciones
adicionales durante el proceso, se debe escribir en la columna de observaciones de la base de datos, la
información consignada permite realizar análisis estadísticos en caso de requerirlos.
El informe de resultados se realiza de acuerdo a los lineamientos detallados en el procedimiento

Elaboración, revisión, modificación y emisión del Informe de Resultados POE-R01.0000-010 y las
consideraciones indicadas para la emisión de informes a través de la plataforma LabMuestras – Sivilab.
16. EXÁMENES COMPLEMENTARIOS
En algunos casos puede ser necesario complementar las pruebas de confirmación con los blancos
Corynebacterium tox gene (Coryne_tox) C. diphtheriae rpoB (Diphtheriae_rpoB) C. ulcerans/
pseudotuberculosis rpoB (CUP_rpoB) que se encuentra en el MEN-R01.5330-XXX PCR tiempo real para
diagnóstico de difteria o con otras plataformas de ensayo como la colorimetría avanzada (ver MEN-R01-
5330-019 Identificación y confirmación de bacterias Gram negativas por colorimetría avanzada) o por
DIFTERIA
espectrofotometría de masas (ver MEN-R01-5330-038 Identificación microbiana por espectrometría de

masas).
17. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
- Funke G, Bernard KA. Coryneform Gram-Positive Rods. Manual of Clinical Microbiology 2015. p.
474-503.
- Holt, J., Krieg, N., Sneath, P., Staley, J., & Williams, S. (1994). Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology (Ninth Edition ed.). (W. R.Hensyl, Ed.) Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.
- MacFanddin. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.

Tercera edición. 2000. Editorial médica Panamericana
- Manual de procedimientos para la toma, conservación y envío de muestras al Laboratorio

Nacional de Referencia octubre de 2020. https://www.ins.gov.co/BibliotecaDigital/Manual-toma-
envio-muestras-ins.pdf.
- Wirsing, C.-H., Riffelmann, M., & Coenye, T. (2011). Manual of Clinical Microbiology (Vol. 1). (J.
Versalovic, K. Carroll, G. Funke, J. Jorgensen, M. Landry, & D. Warnock, Edits.) Washigton: ASM
press.
- WHO laboratory manual for the diagnosis of diphtheria and other related infections. Organización
mundial de la salud. 2021.
18. CONTROL DE CAMBIOS
FECHA
VERSION APROBACION DESCRIPCIÓN
aaaa mm dd
00 2022 06 XX Creación del documento
ELABORÓ REVISÓ APROBÓ
Efraín Andrés Montilla Escudero

Andrea Melissa Hidalgo Carolina Duarte Valderrama
Fabiola Rojas Baquero
Líderes técnicos Responsable técnico Coordinadora
Grupo Microbiología Grupo Microbiología Grupo Microbiología
DIFTERIA
19. ANEXOS
Anexo 1. Agar sangre cistina telurito
El telurito de potasio del medio sirve para inhibir el desarrollo de muchas especies bacterianas de la
microbiota normal del tracto respiratorio superior, incluyendo muchas especies de Streptococcus y
Staphylococcus. El C. diphtheriae se desarrolla de manera adecuada, produciendo colonias grisáceas
después de 24 horas a 48 horas de incubación.
Medios y reactivos
Agua purificada tipo II ……………………….………………………………………………. 250 mL

Agar Infusión de cerebro y corazón………………….. ………… ………………………....... 13 g
Sangre de cordero desfibrinada……………………...………………………………………12,5 mL
Telurito de potasio al 0.3% (anexo 2)……..................................................................... 37,5 mL
L-Cistina (no confundir con L-Cisteína)……………………… ………………………….. 12,5 mg
Preparación:
• Colocar en erlenmeyer o botella de laboratorio de 500 mL, 250 mL de agua purificada tipo II + 13
g de agar Infusión de cerebro y corazón (BHI). Disuelva, luego lleve a ebullición de acuerdo con
las recomendaciones del fabricante.
• Esterilizar a 15 libras de presión, a 121 °C por 15 minutos.
• Mantener a 47,5 °C ± 2,5°C en un baño serológico el medio después de esterilizado como
mínimo por 15 min.
• Con el medio temperado agregar 37,5 mL de telurito de potasio al 0,3% y mezclar.
• Agregar 12,5 mg de L-Cistina y mezclar
• Agregar 12,5 mL de sangre de cordero y mezclar
• Servir en placas de Petri
• Realizar los controles de calidad pertinentes
• Mantener los medios refrigerados de 2 °C a 8 °C.
Nota: para la mezcla se recomienda utilizar planchas donde funcionen las barras magnéticas de
mezcla.
Anexo 2. Telurito de potasio al 0.3%
Reactivos
Agua destilada o purificada tipo II …………………………… ………………………….. 400 mL
Telurito de potasio ………………………………………………………………………… 1200 mg
Preparación:
• Colocar en un matraz de Erlenmeyer o botellas de laboratorio el agua y el telurito de potasio y

mezclar hasta disolver.
• Esterilizar al vacío con unidades de filtro desechables de 500mL.
• Mantener la solución refrigerada de 2 °C a 8 °C.
DIFTERIA
Anexo 3. Pruebas bioquímicas
Prueba de la oxidasa
El dehidrocloruro de tetrametil-parafenilendiamina al 1% se emplea para la determinación del citocromo

oxidasa. Este reactivo actúa como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxígeno. En su estado
reducido es incoloro, pero en la presencia del citocromo oxidasa del microorganismo y el oxígeno
atmosférico se oxida formando el azul de indofenol.
Materiales
Reactivo: solución acuosa al 1% de Tetrametil-p-fenil diamina hidrocloruro
Tiras comerciales (Merck, Difco).
Procedimiento:
- Realice la prueba a partir de un cultivo de 24 horas a 72 horas de crecimiento, a partir de un
medio que no contenga azúcares. El crecimiento en un medio que se ha acidificado debido a la
fermentación de carbohidratos no debe emplearse ya que la acidez inhibe la enzima citocromo
oxidasa.
- Tomar un portaobjetos de vidrio limpio o caja de petri.
- Colocar papel filtro encima del portaobjeto o la caja petri.
- Impregnar con tres gotas de solución acuosa aproximadamente al 1% de N,n,n,n-tetrametil-p-
fenil diamina hidrocloruro el papel filtro en un solo punto.
- Frotar de una a tres colonias en la superficie impregnada con el reactivo.
- Realizar la prueba a partir de un medio que no contenga azúcares. El crecimiento en un medio
que se ha acidificado debido a la fermentación de carbohidratos no debe emplearse debido a
que la acidez o la alta concentración de hidrogeno inhibe la enzima citocromo oxidasa.
- Una prueba positiva desarrolla de un color violeta oscuro en la zona en donde quedó
impregnada la colonia.
Lectura
Positivo: desarrollo de un color violeta oscuro

Negativo: no hay desarrollo de color
Control de calidad
La prueba debe realizarse simultáneamente con dos cepas control
Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

DIFTERIA
Prueba de la catalasa
La enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno (H 2O2) en oxígeno y agua. La liberación del
oxígeno se puede observar a simple vista por la formación de burbujas.
Materiales
Peróxido de hidrógeno al 30%
Portaobjetos
Procedimiento
- Con un asa tome varias colonias de 24 horas a 72 horas de crecimiento.
- Colóquelas sobre un portaobjetos de vidrio limpio.
- Agregue una gota del peróxido de hidrógeno al 30%.
Lectura
La formación inmediata de burbujas denota una prueba positiva.
Control de calidad
La prueba se debe realizar con un control negativo y uno positivo.
Control positivo: Staphylococcus. aureus ATCC 29213
Control negativo: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Desoxirribonucleasa (DNasa)
Permite determinar la capacidad del microrganismo de producir DNAsa que hidroliza las moléculas de
ADN, el ADN no hidrolizado precipita en presencia de HCL 1M.
Esto puede ser visualizado de diferentes maneras, ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1N y
observando halos transparentes alrededor del crecimiento del microorganismo o incorporando al medio
indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (que viran a rosado cuando la prueba es positiva).
Reactivo: agar DNAsa triptosa

NaCl
Azul de toluidina ó verde de metilo
Preparación
- Siga las indicaciones de la casa comercial.
- Esterilice a 121 ºC durante 15 min.
- Adicione el azul de toluidina ó verde de metilo
- Distribuya el agar en cajas de Petri estériles.
- Mantener refrigerada de 2 °C a 8 °C.
Inoculación
DIFTERIA
- Realice una siembra del microorganismo por la técnica de agotamiento o solamente una estría
- Incube a 35ºC ± 2ºC de 18 horas a 24 horas.
- Pasado el tiempo de incubación, se observa el viraje del indicador a rosado alrededor de las
estrías.
- Revelar inundando la caja con HCL 1M.
Resultado positivo: halo claro alrededor de las colonias.

Resultado negativo: ausencia de halos.
Control positivo: Staphylococcus aureus

Serratia marcescens
Control de calidad (ver control de calidad de los medios de cultivo).
Pirazinamidasa
Caldo de nitratos
Determina la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato a nitrito o nitrógeno libre.
Preparación
- Distribuya 2 mL del caldo en tubos tapa rosca 13 x 100.
- Esterilice a 121ºC durante 15 min.
- Mantener refrigerada de 2°C a 8°C.
Inoculación
- Tome una colonia de un cultivo puro y suspéndala en el medio, incube a 35 °C ± 2 ºC por 24 horas.
- Realice la lectura
- Agregue directamente al tubo con el cultivo 1mL del reactivo A (alfa-naftilamina y ácido acético 5N) y
1mL del reactivo B (ácido sulfanílico y ácido acético 5N).
Resultado positivo: color rojo (reducción de nitratos a nitritos).

Resultado negativo: no aparece color en este caso se debe continuar con la fase 2.
Fase 2:
Agregue directamente al tubo con los reactivos A y B un gramo de zinc en polvo.
Resultado positivo: continúa incoloro (reducción de nitratos a nitrógeno libre).

Resultado negativo: color rojo
Control positivo
- Escherichia coli ATCC 25922: color rojo: reducción de nitratos a nitritos
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: incoloro al agregar el polvo de zinc.
Prueba de la urea
DIFTERIA
Fundamento: este medio es recomendado para detectar la presencia de la ureasa especialmente de las
especies del género Proteus, también puede ser usado para otras Enterobacterias, que hidrolizan la urea
más lentamente, incubando el medio por un período más largo de tiempo (48 h).
La urea al ser hidrolizada produce amonio que reacciona en solución formándose carbonato de amonio,
compuesto que alcaliniza el medio.
Preparación:
Siga las instrucciones de la casa comercial.
Inoculación:
- Tome una colonia aislada del microorganismo, con asa recta.

- Siembre en la superficie del tendido, haciendo una estría.
- Incube a 35°C ± 2ºC por 24 horas a 48 horas.
- Realice la lectura
- Un cambio de color rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa del microorganismo.
Un color amarillo indica que la reacción fue negativa.
Control positivo: Providencia stuartii ATCC 25827: crecimiento en la porción inclinada y color fucsia.
Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922: crecimiento en la porción inclinada. No hay cambio de
color.
Fermentación de carbohidratos (glucosa – maltosa - sucrosa - xilosa - manitol)
Utilizando como base el caldo rojo de fenol, determinar la capacidad de fermentar un carbohidrato con
producción de ácidos (ácido pirúvico y otros ácidos), y eventualmente la producción de gas. Se utiliza un
medio líquido que contiene un carbohidrato, del cual la mayoría de las bacterias quimiótrofas pueden
obtener energía, ya sea por fermentación o respiración; peptona y un indicador de pH que permite
detectar la producción de ácidos (característica de la fermentación de la glucosa). Además, en la
fermentación se produce gas (CO2 o una mezcla de H2 y CO2). El H2 es insoluble y se detecta por la
formación de una burbuja en una campana Durham presente en el medio.
Reactivos: Glucosa, maltosa, sucrosa, xilosa o manitol

Proteasa de peptona
Púrpura de bromocresol
Cloruro de Sodio
Agua destilada
Preparación
- Esterilice el caldo a 121ºC durante 15 minutos.
- Dispense el caldo en tubos y agregue una campana de Durham invertida
- Mida el pH desde estar entre 6,8 ± 0,2.
- Mantener refrigerada de 2ºC a 8ºC.
Inoculación
- Con un asa inocular el tubo con una o varias colonias
- Se incuba a 35ºC ± 2ºC de 18 horas a 24 horas.
DIFTERIA
Resultado positivo: se produce un viraje del indicador a color amarillo. Si se produce gas, puede
observarse en la campana de Durham.
Resultado negativo: las bacterias no fermentadoras no producen viraje o producen viraje hacia el pH
alcalino (púrpura o violeta).
Hidrólisis de almidón o Glicógeno
Permite determinar la presencia de amilasas que hidrolizan el almidón presente, generando dextrinas y
maltosa.
Inoculación
- Sembrar por cada prueba cuatro cajas que se revelan a las 24 horas, 2, 3 y 10 días.
- Incubar a 35ºC ± 2ºC de 18 horas a 24 horas.
- Inundar la caja con Lugol de Gram (KI+I).
Control de calidad (ver control de calidad de los medios de cultivo).
Resultado positivo: halo café alrededor de las colonias.

Resultado negativo: color azul violeta.
Reacción de CAMP
Permite determinar la capacidad de una bacteria para producir y elaborar el factor CAMP, que actúa de
manera sinérgica con la β-hemolisina de S.aureus (β-lisina) sobre eritrocitos en un medio de agar
sangre para producir un fenómeno lítico en la unión de los dos microorganismos.
Inoculación
- Con un asa estriar Staphylococcus en una línea recta que atraviese el centro de un agar sangre
- Estriar el microorganismo o los microorganismos de prueba n una línea recta de 2 a 3 cm de
largo y perpendicular (es decir, en ángulo recto) al inóculo estafilocócico sin tocar el inóculo.
- Incubar a 35ºC ± 2ºC de 18 horas a 24 horas en 5 a 10 % de CO2 o incubadora de CO2
Interpretación
Reacción CAMP positiva:
- Producción de una característica zona en punta de flecha.

- La zona de hemólisis sinérgica se extiende en toda la profundidad del agar sangre
- La zona clara (hemólisis sinérgica) está rodeada por una zona más grande, oscurecida, donde la
β hemolisina estafilocócica alteró pero no produjo la lisis de los eritrocitos.
Reacción CAMP negativa:
Ausencia del fenómeno en punta de flecha cuando se incuba.

DIFTERIA
Control positivo: Staphylococcus aureus

Streptecocccus del grupo B.
Anexo 4. Medio base de Elek
Se debe preparar dos soluciones:
Solución A: 500 ml
• En erlenmeyer o botella de laboratorio colocar 500 mL de agua Tipo II con 20 g de proteasa-

peptona No.2.
• Añadir 3,25 mL de hidróxido de sodio al 10 N a la solución anterior. Nota: tener precaución al
añadir el NaOH, es una solución caústica y puede causar quemaduras.
• Calentar hasta ebullir, luego dejar enfriar y filtrar los fosfatos usando papel de filtro Whatman
(preferiblemente Whatman glass fibra gf/f o filtro por vacío de 500ml Millipore)
• A la solución filtrada agregar 700 µl de ácido láctico al 85%
• Luego añadir 3 gramos de maltosa
• Ajustar el pH a 7,8 ± 0,2 con HCL 1N o 5N
• Marcar adecuadamente
• Mantener la solución refrigerada de 2°C a 8°C.
Solución B: 500 ml
• En un Erlenmeyer colocar 5 g de cloruro de sodio y 10 g de agar bacteriológico a 500 mL de

agua purificada Tipo II.
• Calentar hasta disolver y mantener a 50°C.
• Ajustar pH a 7,8 ± 0,2 con NaOH 1N.
Preparación del medio de agar Elek
Materiales:
Solución A
Solución B
Baño serológico
Tubos de vidrio tapa rosca
Procedimiento:
• Mezclar solución A y B pre-temperados a 50°C

• Dispensar en tubos de vidrio tapa rosca para un volumen de 12 mL.
• Esterilizar por autoclave a 116 °C a 10 libras durante 10 minutos.
• Marcar adecuadamente
• Mantener la solución refrigerada de 2°C a 8°C hasta su uso.
Nota: la peptona proteasa base 2 debe ser de un lote con propiedades conocidas
Anexo 5. Preparación de las placas de Elek
• Fundir 12 ml de agar base Elek dejando reposar el tubo tapa rosca en un baño serológico a 50°C
(guardado en 2°C a 8°C, ver anexo 3).
DIFTERIA
• Para fundir el agar, colocar los tubos en un vaso de precipitado de un litro que contenga
suficiente agua para cubrir el nivel de agar en los tubos y aflojar las tapas de acuerdo con el
número deseado de tubos (uno por placa requerida).
• Calentar el vaso de agua usando una plancha caliente para fundir los tubos del agar.
• Una vez fundido, dejar los tubos de agar se enfríen en un baño serológico a 50°C.
• En cabina de bioseguridad, añadir 3 ml del suero fetal bovino estéril al tubo con los 12 mL del
agar base Elek.
• Nota: el suero fetal bovino se encuentra a temperatura de congelación (-20°C), se recomienda
dejar el día antes de 2°C a 8°C para que se descongele.
• Mezclar suavemente y distribuir 5 mL en 3 cajas de petri de 60 mm x 13 mm. Deje que el medio
se solidifique con la tapa entreabierta para evitar la humedad en la tapa.
• Las placas Elek preparadas solo se pueden mantener durante 24 horas de 2°C a 8°C
• Nota: si las placas se refrigeran durante la noche, justo antes de usar, girar las placas boca
abajo y colocarlas en una incubadora de 35ºC ± 2ºC durante 15 min a 20 min para eliminar la
humedad.

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CULTIVO DE MUESTRAS FARÍNGEAS Y

Describir la metodología para el aislamiento de especies toxigénicas de Corynebacterium spp en medio

Responsable Técnico: garantizar el cumplimiento de los lineamientos establecidos en el presente

Control/Material de control: un dispositivo, solución o preparación liofilizada prevista para el uso en el

LSPD: Laboratorio de Salud Pública Departamental

5.1 Condiciones generales transversales

 La clasificación y disposición de los residuos generados se debe realizar de acuerdo a lo

 La manipulación de las muestras, contempla desde el ingreso al INS hasta el transporte al

 Todas las muestras de un caso sospechoso deben recolectarse en medio de transporte

 Idealmente, las muestras deben recolectarse al comienzo de los síntomas y antes de la

5.2 Condiciones generales específicas del ensayo

 Como medida preventiva para evitar la contaminación de las muestras y el personal de

 Encender la lámpara de luz ultravioleta y mantenerla por 15 minutos antes de iniciar el

o Si se trabaja con aislamientos de Corynebacterium spp o ADN en el área de

 Revise la solicitud de ensayo antes de comenzar el procesamiento de la muestra. En el

6. FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE ENSAYO

Las especies de corinebacterias potencialmente toxigénicas como C. diphtheriae, C. ulcerans y C.

Para la confirmación de los aislamientos de Coynebacterium spp se realiza el ensayo de inmunodifusión

7. LIMITACIONES Y/O INTERFERENCIAS DEL MÉTODO DE ENSAYO

El aislamiento de especies de corinebacterias potencialmente toxigénicas a partir de secreción faríngea

8. RECOLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

Las condiciones de envío de muestras y/o aislamientos se describen en el Manual de procedimientos

Tabla 1. Conservación de muestras

Muestra/Matriz Conservación de muestras

En el recipiente original a temperatura del laboratorio, después

Muestra/Matriz Conservación de muestras

Tubo de microcentrífuga a -20°C a -70°C por 5 años, identificado

 Cabina de bioseguridad Clase II

11. REACTIVOS, CONTROLES Y MATERIALES DE REFERENCIA

 Asas bacteriológicas desechables

 Agar sangre cistina telurito (ver anexo 1 para la preparación)

11.3 Materiales de referencia

11.3.1 Control positivo

 Elek, Gram y cultivo: C. diphtheriae CD001

11.3.2 Control negativo:

 Control negativo para Elek: C. diphtheriae CD002

12. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

12.1 Aislamiento de cultivo

 Incubar de acuerdo a lo establecido en el numeral 12.4.

12.2 Siembra de hisopado a partir del medio de transporte.

 Incubar de acuerdo a lo establecido en el numeral 12.4.

12.3 Pseudomembrana en solución salina.

 Macerar la pieza de pseudomembrana en 1ml de caldo BHI o solución salina estéril.

 Incubar de acuerdo a lo establecido en el numeral 12.4.

Figura 1. Siembra de muestras faríngeas para diagnóstico de Difteria.

12.4 Incubación de placas de cultivo

 Si no hay un crecimiento visible, es recomendable examinar la morfología de la colonia con una

Tabla 2. Características morfológicas en agar sangre y agar telurito

Especie/biovar Agar Sangre Agar Telurito

C. diphtheriae biovar gravis No hemolítica Gris / negro mate, opaco, 1,5-2 mm de

tiende a romperse en segmentos pequeños

Fuente: Grupo de Microbiología - modificado de OMS

Figura 2. Morfología de colonia clásica de C. diphtheriae en medio de agar sangre;

Fuente. Grupo de Microbiología

Figura 3. Morfología de C. diphtheria en medio de agar sangre cistina telurito.

Fuente. Grupo de Microbiología

12.5 Pruebas de identificación presuntiva y/o confirmación.

Figura 4. Aislamiento de colonias sospechosas en agar sangre.

 Cuando las colonias sospechosas se encuentren aisladas según lo descrito anteriormente, se

 Los aislamientos de cultivos primarios inicialmente se pueden identificar por la apariencia de la

12.6 Examen microscópico y procedimientos de tinción para colonias sospechosas

- Realizar la coloración de Gram de acuerdo a lo descrito en el INT-R01.5330-001 Coloración de

12.7 Bioquímicas convencionales