“Coloración de Frotis sanguineo”

Dr. Avelino Callupe Paul

2DA ESPECIALIDAD EN HEMATOLOGÍA - 2021

paul.avelino@uwiener.edu.pe
 HISTORIA DE LA COLORACIÓN EN HEMATOLOGÍA

✓ 1879: Paul Ehrlich - utilizó mezclas de ácido (fucsina) y colorantes básicos

(azul de metileno) para diferenciar las células.
Leonidovich Romanowsky

✓ 1891: Dmitri Leonidovich Romanowsky médico ruso, desarrollado técnicas que

utilizan una mezcla de eosina Y y azul de metileno que producía un tono
sorprendente, un hermoso distintiva sombra púrpura.
✓ 1902: William Boog Leishman, James Homer Wright introdujo metanol como
disolvente. William Boog Leishman

✓ 1904: Gustav Giemsa mejoró esta técnica al estandarizar las soluciones

colorantes y agregando glicerol para aumentar la estabilidad.

Gustav Giemsa
 OBJETIVO DE COLORACIÓN

La coloración del frotis de sangre periférica, permite la identificación de leucocitos

gracias a sus propias características resaltadas por un colorante apropiado, así
como observar la morfología de los eritrocitos y las plaquetas.

✓ Los colorantes son derivados del método Romanowsky (Wright, Leishman, Giemsa) y los
colores panópticos (Jenner-Giemsa y May-Grunwald-Giemsa).

✓ El colorante Wright se usa principalmente en el continente americano; en Gran Bretaña,

se usa el colorante Leishman y en Francia, el colorante May-grunwald-Giemsa

✓ La coloración May-grunwald-Giemsa y la coloración Wright son las más comunes. Hay

variedad de coloraciones según el país, ello explica las diferencias en el color de los
atlas en los libros de hematología.
 PRINCIPIOS GENERALES DE LA COLORACIÓN

Tinción de Romanowsky:

Cualquier combinación de:

✓ Eosina Y (colorante ácido o aniónico):

Se une a sitios catiónicos (citoplasma y Hb)

✓ Azul de metileno (colorante básico, catiónico o Azure B):

Se une a sitios aniónicos (núcleo y ARN)

Buffer:
✓ Se utiliza para mantener un pH adecuado.
✓ Na2PO4 0,05 M (pH 6,4) o dH2O (pH 6,4-6,8)
 PRINCIPIOS DE COLORACIÓN ROMANOWSKY

Las coloraciones de Romanowsky es una tinción policromática

Componentes:
✓ Metanol: fija las células para que se deslicen
✓ El colorante de azul de metileno ARN, ADN: color azul grisáceo
✓ El colorante eosina tiñe la hemoglobina, los gránulos de eosina
de color rojo anaranjado.
✓ Eosina + Azul de metileno = complejo de eosinato de tiazina.

El complejo no colorea ningún color a menos que se utilice un

tampón añadido: fosfato de sodio 0,05 M (pH 6,4) y añejado
agua destilada (pH 6,4-6,8)
 COLORACIÓN DE ROMANOWSKY

✓ Giemsa
✓ Jenner
✓ Wright
✓ Field
✓ Leishman
✓ May-Grunwald-Giemsa,
✓ Wright-Giemsa,
✓ Jenner-Giemsa,
✓ Azure B-EosinY, etc
 COLORACIÓN RÁPIDA DE ROMANOWSKY

Sumerja en metanol para fijar por 1 minuto Portaobjetos microscópico seco sobre papel de filtro Sumerja en tinción B (eosina) durante 5 segundos

Frotis delgadas secas Lavar inmediatamente con agua del grifo. Sumerja en la tinción A (azul de metileno) durante 10 segundos Lavar inmediatamente con agua del grifo.
COLORACIÓN MANUAL DE EXTENDIDOS
SANGUINEOS
❑ Se Recomienda la coloración dentro de la hora con Romanowsky
❑ Fijarlo dentro de la hora con metanol.

 REACTIVOS:
 2.5 g. de wright
 0.3 g. de giemsa
 12.5 ml. De glicerina
 1000 ml de metanol
 MATERIALES:
 Mortero
 Botellas color caramelo
 Embudo
 Probeta graduada
 TIPOS DE COLORACIÓN

Coloración Wright-Giemsa

Coloración Leishmania

Colorante Giemsa

Coloración May Grunwalt-Giemsa

 COLORACIÓN WRIGHT

✓ Ampliamente utilizado, este método permite una buena diferenciación celular gracias al
colorante Wright. Este se compone de azul de metileno, eosina y azul de metileno en solución
en metanol.

✓ Colorante tiene una solución o polvo listo para usar que se disuelve en metanol en las
proporciones recomendadas por el fabricante. Tampón con un pH cercano a 6,8.

✓ Los núcleos son rojo púrpura (basocromatina) y rosa (oxicromatina), Los citoplasmas acidófilos
(granulocitos) son rosados. Los citoplasmas basófilos (linfocitos y monocitos) son azules, Los
citoplasmas policromatofílicos son grisáceos con áreas rosadas y azules.

✓ Los gránulos de neutrófilos son marrones,

✓ Las granulaciones eosinofílicas son de color naranja,
✓ Las granulaciones basófilas son de color púrpura oscuro,
✓ Las granulaciones azurofílicas son de color púrpura-púrpura.
✓ Los trombocitos son visibles y de color rosa violáceo (lila)
 FACTORES QUE CAUSAN VARIACIÓN EN
COLORACIÓN FACTORES QUE CAUSAN VARIACIÓN EN LA COLORACIÓN ROMANOWSKY
COLORES OBSERVADOS EN LA COLORACIÓN ROMANOWSKY Apariencias Posibles Causas
Componente celular Color Demasiado azul Preparación incorrecta de stock, concentración de eosina
NUCLEO
baja, Coloración de stock expuesta a la luz del día.
Cromatina Purpura
Lote de solución madre en mal estado.
Nucléolo Azul claro
CITOPLASMA Colorantes impuros en concentración.
Eritroblasto Azul intenso Tiempo de coloración corto.
Eritrocito Rosado Solución colorante acido.
Reticulocito Azul gris Extendido sanguíneo grueso.
Linfocito Celeste
Tiempo inadecuado en solución de buffer.
Metamielocito Rosado
Demasiado rosado Incorrecta cantidad de azur B.
Monocito Gris – plomo
Colorantes impuros en concentración.
Mielocito Policromatico
PH del buffer muy bajo (acido).
Neutrofilo Rosado
Promielocito Azul Excesivo lavado en la solución del buffer.
Basofilo Azul Coloración pálida Solución de colorante demasiado antiguo.
GRANULOS Lote de solución madre en mal estado.
Promielocitos Rojos o purpuras Incorrecta preparación del colorante especialmente Azur A.
Basófilos Purpuras o negros Temperatura del ambiente muy alta.
Eosinofilos Rojos Naranjas Gránulos de lo neutrófilos no coloreados Insuficiente Azur B
Neutrofilos Purpuras
Gránulos de los neutrófilos negros Excesivo Azur B
Granulaciones Toxicas Purpura oscuros
Plaquetas Purpura
azulados (Pseudogranulaciones toxicas)

OTRAS INCLUSIONES
Depósitos de coloración en la lámina Colorante no cubrió completo el extendido.
Cuerpo Auer Purpura Colorante no ha sido filtrado antes del uso.
Anillos Cabot Purpura Backgraound azul en el extendido Inadecuada fijación.
Cuerpo Howell Jolly Purpura Muestra con colecta de heparina como anticoagulante.
Cuerpo dohle Purpura claro Otras anormalidades de coloración Contaminantes del colorante.
VARIACIONES EN LA COLORACIÓN
VARIACIONES EN LA COLORACIÓN
VARIACIONES EN LA COLORACIÓN
 MÉTODOS AUTOMATIZADOS EN
COLORACIÓN

✓ Se tardan entre 5 y 10 minutos en teñir un lote de frotis

✓ Las diapositivas se sumergen automáticamente en el colorante
en el buffer y una serie de enjuagues.
Desventajas
✓ El proceso de tinción ha comenzado, no hay frotices para STAT
se puede agregar en el lote posterior.
✓ Las soluciones acuosas de colorantes son estables solo para 3-6
horas una vez usado.
 MÉTODOS AUTOMATIZADOS EN
COLORACIÓN
V-Chromer® III
• Protocolos de tinción estandarizados Automated slide stainer
• Carga simultánea de varias estanterías deslizantes
• Tinción simultánea según diferentes protocolos de tinción
• Sistema abierto para trabajar con reactivos de varios
fabricantes
• Pantalla del instrumento para monitorear continuamente
el proceso de tinción
• Las evaporaciones y los olores se neutralizan gracias al
filtro de carbón.
V-Chromer Mini II
• No se requiere campana extractora
• Tinción de alto rendimiento.
• 5 racks deslizantes simultáneamente en función de los
programas, Capacidad del soporte de portaobjetos 30
portaobjetos

https://www.youtube.com/watch?v=jkuyDyMtXlo&t=37s
MÉTODOS AUTOMATIZADOS EN
COLORACIÓN

AEROSPRAY- PRO
EXTENDIDOS SANGUINEOS SEGÚN CLSI – H20

❖ Ph apropiado 6.2 - 7.0

❖ Los leucocitos debería estar bien
preservado
❖ Los cambio por los efectos del
anticoagulante como vacuolización
o forma nuclear debe ser minina
❖ >2% de leucos pueden haberse lisado
o formar restos nucleares.
❖ Debe ser reproducible la coloración
 FIN

paul.avelino@uwiener.edu.pe