Fases Móviles

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Tipos de disolventes para HPLC

Agua

Disolventes orgánicos
— Metanol
— Acetonitrilo
— THF
— Diclorometano
— Hexano

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Propiedades solventes (Fase Reversa)

Metanol
— Donador de protones
— El eluyente más débil

Acetonitrilo
— Aceptador de protones
— Fuerza de elución intermedia
— La menor viscosidad

Tetrahidrofurano (THF)
— Aceptador de protones
— Eluyente fuerte
— Los mayores efectos sobre la selectividad

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Modificadores

Reactivos de par iónico

Orgánicos
— Ac. Acético / Acetatos
— Ac. Fórmico / Formiatos
— TFA
— TEA

Inorgánicos
— Ac. Fosfórico / Fosfatos

Otros

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Propiedades de los eluyentes

Pureza (Grado HPLC)

UV Cutoff

Miscibilidad

pH

Efectos de mezcla

Estabilidad

Propiedades físicas y toxicológicas

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UV CUTOFF de algunos solventes

SOLVENTE UV CUT OFF

n-pentano 190
iso-octano 215
Tolueno 285
Benceno 280
Cloroformo 245
Metanol 205
THF 230
Acetona 330
iso-propanol 205
Etanol 210
Acetonitrilo 190

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UV CUTOFF de algunas fases móviles

Ac. Acético 1% 230 SDS 10mM 190

TFA 0,1% 205 HCl 190
(NH4)2HPO4 50 mM 205
TEA 1% 235
PIC A 1 vial/L <200
PIC B6 1vial/L 225
PIC B6 Low UV 190
PIC D4 1 vial/L 190 NH4CH3COO 10mM 205
NH4HCO3 10 mM 190
HEPES 10 mM 225
K(1-2)H(2-1)PO4 10 mM 190
NaCl 1M 208
NaCOO 10mM 200
BRIJ 35 0,1% 190

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Propiedades de los solventes

Polaridad

Viscosidad (aumento de P)

∆P= 1000 η L F
π r2 d2p η viscosidad

Punto de ebullición (trabajo a Tª)

Miscibilidad (gradientes)

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Polaridad

POLAR
H2O
MeOH
ACN
THF

CH2Cl2

Hexano
NO POLAR ©2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 9
Mezclas de igual polaridad
% Metanol % ACN % THF
90 87 62

80 73 52

70 60 43

60 50 36

50 40 30

40 32 23

30 22 16
30

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Propiedades de los disolventes

Indice Disolvente Viscosidad Punto Número de

Polaridad (20ºC) Ebulicion Miscibilidad
-0.4 Iso-Octano 0.50 99.2 29
0.0 N-Hexano 0.31 68.7 29
0.0 Ciclohexano 0.98 80.7 28
2.3 Tolueno 0.59 101.6 23
3.4 Cloruro de Metileno 0.44 39.8 0
4.2 Tetrahidrofurano 0.55 66.0 17
4.3 Acetato de Etilo 0.47 77.1 19
4.3 1-Propanol 2.30 97.2 15
4.3 2-Propanol 2.35 117.7 15
5.2 Etanol 1.20 78.3 14
5.4 Acetona 0.32 56.3 15.17
6.2 Acetonitrilo 0.37 81.6 11.17
6.2 Ac. Acético 1.26 117.9 14
6.4 Dimetilformamida 0.90 153.0 12
6.5 Dimetilsulfóxido 2.24 189.0 9
6.6 Metanol 0.60 64.7 12
7.3 Formamida 3.76 210.5 3
9.0 Agua 1.00 100.0 -

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Viscosidad de Mezclas

Viscosidad de mezclas
3

2.5
A c e to ne
2
Viscosity (cp)

THF

1.5 M e tha no l

A c e to nitrile
1
Etha no l
0.5

100
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90
Volume % Wa te r

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Mezclas de Disolventes: Preparación
500 ml MeOH 500 ml H2O

500 500

250 250

1000

750

500

970 mL 1:1
250
1000 mL
mezcla mas
rica en agua

500 ml MeOH H2O

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Preparación de fase móvil

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Soluciones Tampón-
Tampón-Buffer

Las soluciones tampón, también conocidas como buffer, son

disoluciones que están compuestas por el ion común de un
ácido débil o una base débil. Y el mismo ion común en una
sal conjugada, ambos componentes deben de estar
presentes.

La función de una solución tampón es la de resistir los
cambios de pH cuando se le agregan ligeras cantidades de
ácido o base

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Tampones en HPLC

Tampón pK Rango de pH

Fosfato pK 1 2,1 1,5 - 2,7

pK 2 7,2 6,6 - 7,8
pK 3 12,3 11,7 - 12,9

Citrato pK 1 3,1 2,5 - 3,7

pK 2 4,7 4,1 - 5,3
pK 3 5,4 4,8 - 6,0

Acetato 3,8 3,2 - 4,4

Formiato 4,8 4,2 - 5,4

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Cuando se utilice un tampón, se debe utilizar un reactivo de
buena calidad y filtrarlo con un filtro de 0,45 µm.

No se debe dejar el tampón en el sistema de HPLC. Se
recomienda aclarar todos los conductos fluídicos con agua
con calidad HPLC antes de cerrar el sistema y dejar agua
destilada en su interior o bien aclarar con un 90% de agua
de calidad HPLC:10% de metanol cuando el instrumento se
va a dejar sin usar más de un día. Se debe utilizar un
mínimo de 45 mL para las unidades equipadas con un
desgasificador por vacío.

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 Gradientes

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Gradientes

Es una técnica cromatográfica, que tiene

como objetivo reducir el tiempo de
separación, incrementando la fuerza de
elución de la fase móvil durante el tiempo

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Gradientes
Columna: Resolve C18 5 µ 3,9 ∗ 150 mm
Flujo: 1 ml/min.
Temperatura: 35 ºC
Muestra : 9 Alquilfenonas
Volumen de Inyección: 5 µl

10 min
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Gradientes

40% a 100 % acetonitrilo

curva 6

Columna: Resolve C18 5 µ 3,9 ∗ 150 mm

Flujo: 1 ml/min.
Temperatura: 35 ºC
Muestra : 9 Alquilfenonas
Volumen de Inyección: 5 µl

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Gradientes

5 6
7

8
9

10

11

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¿Por qué utilizar gradientes?

Mezclas complejas con componentes de polaridad dispar

Desarrollo de métodos

Reducir el tiempo total de análisis

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Precauciones cuando se usan gradientes

Miscibilidad / Compatibilidad solventes

Pureza de los solventes

Realizar blancos de gradiente

Vuelta a condiciones iniciales al final del gradiente

Tiempo de equilibrado

Reproducibilidad tiempos / areas

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Gradiente en blanco

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1000

750

500

250

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Preguntas???
Preguntas ???

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