A.

Determinación de la actividad antifúngica CMI por el método de

microdilución.

La sensibilidad se evaluó mediante microdilución en caldo BHI, de acuerdo

con la metodología propuesta por CLSI (Clinical Laboratory Standard

Institute) para el género Cándida.

a. Medio de cultivo

b. preparación de las diluciones del antifúngico37.

Se preparó una solución madre, pesando la cantidad suficiente de

polvo para obtener una concentración de 40000 ug/ml de anti fúngico

a ensayar, se disolvió en agua destilada estéril. (0.4 g de extracto seco

en 10 ml de agua destilada estéril)37.

A partir de la solución madre se preparó la serie de diluciones, se

siguió el método de las diluciones dobles seriadas aditivas, utilizando

como diluyente BHI.

Seguidamente se realizó una dilución 1/5 añadiendo a todos los tubos

4 ml de BHI, con lo que la concentración del antifúngico en los tubos

fue 10 veces mayor que la concentración final deseada (de 40000

μg/ml a 78.13 μg/ml).

Se realizó según lo que se muestra en la tabla hasta determinar la CMI

y CMF.

Tabla Nº1. Diluciones del antifúngicos soluble en agua.

 Tubo Concentración Transferir A un tubo con Concentración Tubo
resultante

n°1 40000 µg/ml 1 ml 1 ml de BHI 20000 µg/ml n°2

n°2 20000 µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de BHI 10000 µg/ml n°3

n°3 20000 µg/ml 0,5 ml 1.,5 ml de BHI 5000 µg/ml n°4

n°4 5000µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de BHI 2500 µg/ml n°5

n°5 5000 µg/ml 0,25 ml 0,75 ml de BHI 1250 µg/ml n°6

n°6 5000 µg/ml 0,25 ml 1,75 ml de BHI 625 µg/ml n°7

n°7 625 µg/ml 0,5 ml 0,5 ml de BHI 312.5 µg/ml n°8

n°8 625 µg/ml 0,25 ml 0.75 ml de BHI 156.25 µg/ml n°9

n°9 625 µg/ml 0,25rnl 1.75 ml de BHI 78.13 µg/ml n°10

c. Llenado de las placas de microdilucion

Se utilizaron placas de microdilución estériles de 96 pocillos. Se

dispensaron 100 μl de los antifúngicos a una concentración 2x en las

columnas de la 1 a la 10 con una micropipeta.

El contenido del tubo nº 1 con ayuda de una micropipeta, tomaron 100 μl

y llenaron los pocillos de la columna nº 2. Con el contenido del tubo nº 2 llenaron

los pocillos de la columna nº 3. Con el contenido del tubo nº 3 llenaron los pocillos

de la columna nº 4. Etc. y así hasta la columna nº 11, que se detecten la CMI y

CMF. Los pocillos de la columna nº 12 se llenaron con 100 μl de inoculo (control

de crecimiento). Los pocillos de la columna nº 1 se llenaron con 200 μl de BHI

(control de esterilidad).

d. Preparación del inóculo

 Se preparó tocando con el asa de cultivo 5 colonias ³1 mm y de 24 h

de crecimiento en placa de agar glucosado de Sabouraud (SDA). que

se resuspenden en un tubo de solución salina (ClNa 0,85%). Se agita

bien y, con ayuda de un espectrofotómetro (longitud de onda: 530

nm), se ajusta a una densidad óptica 0,5 McFarland, añadiendo la

cantidad necesaria de solución salina. Esta solución tiene una

concentración aproximada de 1x106 - 5x106 UFC/ml. Posteriormente

se realizó una dilución 1:1000 con medio BHI (concentración de

1x103 - 5x103). Esta última dilución es la que se utilizó para inocular

las placas de antifúngico. La concentración final de levaduras en las

placas será de 0,5x103 - 2,5x103.

e. Inoculación de las placas37.

Se inocularon con 100 μl de la suspensión de levadura desde el pocillo

2 hasta el 12. La columna nº 1 que contendrá 200 μl de BHI, se utiliza

para el control de esterilidad del medio. La columna nº 12 no

contendrá antifúngico pero tendrá la misma concentración de

disolvente que los pocillos con antifúngico. Es el control de

crecimiento.

f. Incubación de las placas

C. albicans se incubaron, sin agitación, en atmósfera normal, a

35ºC durante 48 horas. Tras este periodo de incubación se procedió

a leer los resultados.

g. Lectura de los resultados

 El procedimiento experimental, se realizó 3 veces, para poder

compararlos CMI, encontrados en los resultados diversos. La lectura se

realizó a las 48 horas de incubación para Cándida albicans

La concentración más baja de antifúngico que no mostró cambio de

turbidez; es decir, el primer pocillo en el que se produjo el cambio de

turbidez se tomó como el valor de la CMI. El promedio de tres valores

fueron calculados y se reportaron como la CMI. (Veces que repite el

experimento); luego a partir de la CMI se determinó la CMF.

Lectura espectrofotométrica se realizó con un espectrofotometro de luz

visible modelo 1205 Vis marca "UNICO". De los pocillos de que se

realizó la concentración de mínima inhibitoria, se tomaron los 200 ul de

las muestras asi como el control y se diluyeron en 800 ul de agua

destilada, completando los 1000 ul. Se procedió de esta forma a leer al

espectrofotómetro con una longitud de onda de 415 nm. Posteriormente

se restó a todos los pocillos la absorbancia del medio, es decir la

absorbancia del pocillo de la columna nº 1.

D, Determinación de la concentración mínima fungicida CMF38

Se determinó transfiriendo 100 ul de los pocillos sin crecimiento de las

CMI a placas de agar Saboraud para hacer el recuento del número de

colonias viables tras 48h de incubación a 35ºC.

La CMF se definió como la concentración más baja que redujo de

crecimiento ≥ 99% con respecto al inoculo inicial.