Versión Final Informe Seminario de Título Bastián Ponce Rivera

UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO
Facultad de Medicina
Escuela de Química y Farmacia
“AISLAMIENTO DE PIPERINA A PARTIR DE PIMIENTA NEGRA

COMERCIAL (GOURMET) Y ESTUDIO DE SU ACTIVIDAD CITOTÓXICA EN
CÉLULAS RAW 264.7 TIB – 71”
Unidad de investigación para optar al título de Químico Farmacéutico.
Autor:
Bastián Andrés Ponce Rivera
Director: Dra. Maite Rodríguez Diaz
Codirector: Dra. María Carolina Otero Acuña
Santiago de Chile, 2019.


Autor:
Dra. Maite Rodríguez Díaz Dra. María Carolina Otero Acuña
Director Codirector


Comisión correctora:
Profesor(a) Corrector: QF. Carmen Sandoval Moraga
Profesor(a) Corrector: Dra. Maritza Díaz Gómez

ACTA DE CALIFICACIONES
NOTA FINAL DE SEMINARIO DE TÍTULO
Con fecha 18 de agosto de 2021, fue entregado el Seminario de Título del estudiante Bastián
Andrés Ponce Rivera, RUT: 18.738.460-5 quien, para optar al título de Químico
Farmacéutico, ha presentado el tema “AISLAMIENTO DE PIPERINA A PARTIR DE
PIMIENTA NEGRA COMERCIAL (GOURMET) Y ESTUDIO DE SU ACTIVIDAD
CITOTÓXICA EN CÉLULAS RAW 264.7 TIB – 71”.
Las calificaciones obtenidas por el Sr. Ponce Rivera en este proceso, son las siguientes:
Comisión Evaluadora:
Director / CoDirector
Prof. Dra. Maite Rodríguez Díaz / = 7,0
Prof. Dra. Carolina Otero Acuña = 7,0
Prof. Corrector Dra. Carmen Sandoval Moraga = 7,0
Prof. Corrector Dra. Maritza Díaz Gómez = 6,8
Nota Final = 6,9
Doy fe de la veracidad de esta información
Q.F. Catalina Cano Abásolo

Secretaria Académica
COMISIÓN CORRECTORA
QF. Carmen Sandoval Moraga, Químico Farmacéutico de la Universidad de

Chile. Magíster en Educación, Mención Currículo, Universidad de Concepción.
Magíster en Atención Farmacéutica en Farmacia Comunitaria, Universidad de
Valencia, España. Magíster en Seguimiento Farmacoterapéutico, Universidad de
Granada, España.
Dra. Maritza Díaz Gómez, Licenciada en Química, Universidad de La Habana con

Reválida en la Universidad de Chile. Magister en Química, Escuela de Química,
Universidad de La Habana. Doctorado en Ciencias Farmacéuticas, Instituto de
Farmacia y Alimentos de la Universidad de La Habana. Docente Escuela de
Química y Farmacia, Universidad Andrés Bello.
DIRECTORA
Dra. Maite Rodríguez Díaz. Químico Farmacéutico Universidad Central de Las

Villas (UCLV), Santa Clara, Cuba. Magíster en Química Farmacéutica. Instituto
de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Doctor en Ciencias Mención
Química, Universidad de Chile. Docente de Botánica y Farmacognosia,
Farmacoquímica I y II en Universidad Andrés Bello.
CO-DIRECTORA
Dra. María Carolina Otero Acuña, Doctorado en Inmunología en Konstanz,

Alemania. Postdoctorado en Física, Universidad de Goettingen. Postdoctorado
en farmacología, Pontificia Universidad Católica de Chile. Docente de Biología
Celular, Inmunología y Física en Universidad Andrés Bello.
DEDICATORIA
A mi familia Marta, Reinaldo, Fabián, Ignacio,
Jack, Princesa y Bonnie

AGRADECIMIENTOS
Tantas personas a quien agradecer por formar parte de mi formación profesional,

en primer lugar, a la Dra. Maite Rodríguez por ser una gran docente, por poner
toda su confianza en mí y permitirme realizar este proyecto de investigación, por
apoyarme y motivarme en todo momento.
Agradecer también a la Dra Verónica Romero y Valeria Jorquera por su apoyo

durante mis años de formación y por todo el conocimiento entregado.
A mis amigas Mónica y Rocío que estuvieron presente cada uno de mis días de
universidad. A mi amiga Cristina que me acompaña hasta el día de hoy después
de haber terminado los estudios.
A mi familia Marta, Reinaldo y Fabián que han tenido una paciencia enorme
conmigo, por siempre estar apoyando y motivándome cuando me veían dudar de
todo, si no fuera por la presión impuesta por ellos no habría llegado tan lejos.
También a Jack, Princesa y Bonnie que son mi familia canina, gracias por dar
ese amor incondicional siempre.
Quienes me conocen de cerca saben que soy alguien de pocas palabras, pero
siempre que digo algo es sincero, por lo que las personas nombradas en esta
sección realmente son importantes para mí.
Una vez más gracias a todos ustedes por estar siempre ahí dándome fuerza de
una u otra manera en los momentos más complicados de mi paso por la
universidad.
INDICE DE CONTENIDOS
INDICE DE FIGURAS ......................................................................................... 8
INDICE DE TABLAS ......................................................................................... 10
INDICE DE ANEXOS ........................................................................................ 11
RESUMEN ........................................................................................................ 13
ABSTRACT ....................................................................................................... 14
Capítulo I: Introducción ..................................................................................... 15
Capítulo II: Hipótesis ......................................................................................... 25
Capítulo III: Objetivos ........................................................................................ 27
Capítulo IV: Metodología .................................................................................. 29
Capítulo V: Resultados ..................................................................................... 62
5.1. Procedimiento 1 ..................................................................................... 63
Capítulo VI: Discusión ....................................................................................... 84
Capítulo VII: Conclusiones .............................................................................. 101
GLOSARIO ..................................................................................................... 103
GLOSARIO DE ABREVIATURAS................................................................... 105
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 106
ANEXOS ......................................................................................................... 109

INDICE DE FIGURAS
Figura 1Clasificación general de alcaloides. Obtenido de "Farmacognosia"

Kuklinski, C. ...................................................................................................... 18
Figura 2 Estructura de piperina ........................................................................ 20
Figura 3 Biosíntesis de piperina. Obtenido de Piperine - Type Amides: Review of
Chemical and Biological Characteristics. Koma, S. .......................................... 20
Figura 4 Esquema general de procedimiento de extracción y aislamiento de
piperina ............................................................................................................. 30
Figura 5 Representación placas cromatográficas A y B ................................... 44
Figura 6 Representación placas cromatográficas C y D .................................. 45
Figura 7 Representación de placa multipocillo con sus concentraciones ........ 54
Figura 8 Representación de placa multipocillo con sus concentraciones (segundo
MTT) ................................................................................................................. 60
Figura 9 Cristales de piperina luego de lavado del extracto concentrado ........ 63
Figura 10 Cristales de piperina un mes después de la recristalización ............ 64
Figura 11 Cristales de piperina después de eliminar la solución recristalizante66
Figura 12 Cristales de piperina luego de su lavado y filtrado ........................... 67
Figura 13 Cristales de piperina formados una semana después de la
recristalización .................................................................................................. 69
Figura 14 Cristales formados un mes después de la recristalización............... 70
Figura 15 Placa cromatográfica A observada a 254 nm .................................. 71
Figura 16 Placa cromatográfica B observada a 254 nm .................................. 72
Figura 17 Placa cromatográfica C observada a 254 nm .................................. 74
Figura 18 Placa cromatográfica D observada a 254 nm .................................. 75
Figura 19 Enumeración de los átomos de piperina (excluyendo los H). Obtenido
de MestReNova ................................................................................................ 76
Figura 20 Absorbancia a 570 y 630nm del primer MTT ................................... 79
Figura 21 Absorbancia real de los pocillos y porcentaje de viabilidad celular del
primer MTT ....................................................................................................... 80
Figura 22 Gráfico de viabilidad celular en primer MTT..................................... 80
Figura 23 Absorbancia a 570 y 630nm del segundo MTT ................................ 81
segundo MTT .................................................................................................... 82
Figura 25 Gráfico de viabilidad celular en segundo MTT ................................. 82
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Valores obtenidos en etapa de pesado de pimienta negra molida

(procedimiento 1) .............................................................................................. 31
(procedimiento 2) .............................................................................................. 34
(procedimiento 3) .............................................................................................. 39
Tabla 4 Soluciones sometidas a ensayo de identificación de alcaloides .......... 43
Tabla 5 Soluciones utilizadas en el primer ensayo de MTT ............................. 48
Tabla 6 Soluciones utilizadas en el segundo ensayo de MTT .......................... 49
Tabla 7 Rf calculado para cada banda observada en la placa cromatográfica A
.......................................................................................................................... 72
Tabla 8 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica B ............. 73
Tabla 9 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica C ............. 74
Tabla 10 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica D ........... 75
Tabla 11 Resumen de información recopilada del espectro 1H RMN de piperina.
Obtenido de MestReNova ................................................................................. 77
Tabla 12 Señales observadas en espectro 13C RMN. Obtenido de MestReNova
.......................................................................................................................... 78
Tabla 13 Señales observadas en espectro 13C RMN DEPT. Obtenido de
MestReNova ..................................................................................................... 79
Tabla 14 Media de viabilidad celular para cada condición en el primer MTT ... 81
Tabla 15 Media de viabilidad celular para cada condición en segundo MTT ... 83
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1 Cromatografía en capa fina, placa E. Observada a 254 nm ............ 109

Anexo 2 Espectro 1H RMN experimental de piperina. Obtenido de MestReNova
........................................................................................................................ 109
Anexo 3 Ampliación de espectro 1H RMN en el rango de δ 0,75 - 4,0. Obtenido
de MestReNova .............................................................................................. 110
Anexo 4 Ampliación espectro 1H RMN en el rango de δ 5,5 – 6,5. Obtenido de
MestReNova ................................................................................................... 110
MestReNova ................................................................................................... 111
Anexo 6 Espectro 13C RMN experimental de piperina. Obtenido de MestReNova
........................................................................................................................ 112
Anexo 7 Ampliación espectro 13C RMN en el rango de δ 20 – 50. Obtenido de
MestReNova ................................................................................................... 113
MestReNova ................................................................................................... 114
Anexo 9 Espectro 13C RMN DEPT experimental de piperina. Obtenido de
MestReNova ................................................................................................... 115
Anexo 10 Ampliación espectro 13C RMN DEPT en el rango de δ 20 – 50.
Obtenido de MestReNova ............................................................................... 116
Anexo 12 Espectro 1H RMN simulado de piperina. Obtenido de MestReNova
........................................................................................................................ 117
Anexo 13 Ampliación espectro 1H RMN simulado, en el rango de δ 1,5 – 3,5.
Anexo 16 Resumen de información recopilada del espectro 1H RMN simulado de
piperina. Obtenido de MestReNova ................................................................ 120
Anexo 17 Espectro 13C RMN simulado de piperina. Obtenido de MestReNova
........................................................................................................................ 121
Anexo 18 Ampliación espectro 13C RMN simulado, en el rango de δ 20 – 50.
Anexo 20 Señales observadas en el espectro 13C RMN simulado de piperina.
Anexo 21 Espectro 1H RMN simulado del DMSO. Obtenido de MestReNova 123
Anexo 22 Espectro 13C RMN simulado del DMSO. Obtenido de MestReNova
........................................................................................................................ 124
Anexo 23 Fórmulas de Absorbancia real y porcentaje de viabilidad celular
utilizadas en ensayoMTT ................................................................................ 124
RESUMEN
Los alcaloides son un grupo con una gran variedad estructural presentando así
un amplio abanico de actividad farmacológica, lo que hace que este grupo sea
de gran interés en la industria farmacéutica y en el ámbito de la medicina. La
piperina, un alcaloide proveniente de la pimienta negra ha sido estudiada
ampliamente y se ha observado efectos sobre distintas líneas celulares (HeLa,
4T1, U2OS) siendo de gran interés como un fármaco antineoplásico, además de
mostrar efecto antirreumático, inhibición de glicoproteína P y disminuir los niveles
séricos de colesterol.
En este trabajo pretende extraer y aislar la piperina a partir de pimienta negra
comercial, caracterizarla y luego evaluar su actividad citotóxica sobre la línea
celular RAW 264.7.
Para realizar la extracción y purificación de la piperina se realizan tres
procedimientos distintos utilizando como base el procedimiento entregado por la
Real Sociedad de Química de 2017. En estos procedimientos se obtuvieron
rendimientos de 9,7%, 9,9% y 1,5%. La caracterización se realizó mediante
cromatografía en capa fina y resonancia magnética nuclear, con lo que se
comprobó que el compuesto obtenido y con el que se trabajará en la evaluación
de citotoxicidad corresponde a la piperina. La citotoxicidad se evaluó mediante el
ensayo de MTT observando una disminución de la viabilidad celular de manera
dosis dependiente.
Este trabajo añade información preliminar respecto a la citotoxicidad de la
piperina en un tipo celular distinto a los considerados normalmente en otros
estudios.
ABSTRACT
The alkaloids are a group with a large structural variety showing a wide range of
pharmacological activity, what make this group of great interest in the
pharmaceutical industry and in the field of medicine. Piperine, an alkaloid from
black pepper has been extensively studied and effects have been observed on
different cell lines (HeLa, 4T1, U2OS) being of great interest as an antineoplastic
drug, in addition to showing antirheumatic effect, P-glycoprotein inhibition and
lower serum colesterol levels.
This work aims to extract and isolate piperine from commercial black pepper,
characterize it and then evaluate its cytotoxic activity on the RAW 264.7 cell line.
To carry out the extraction and purification of piperine, three different procedures
are carried out using as basis the procedure provided by the Royal Society of
Chemistry of 2017. In these procedures, yields of 9,7%, 9,9% and 1,5% were
obtained. Characterization was carried out by thin layer chromatography and
nuclear magnetic resonance, whit which it was verified that the compound
obtained and with which we will work in the cytotoxicity evaluation corresponds to
piperine. Cytotoxicity was evaluated by the MTT assay, observing a decrease in
cell viability in a doce-dependent manner.
This work adds preliminary information regarding the cytotoxicity of piperine in a
different cell type from those normally considered in other studies.
Capítulo I: Introducción
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
La farmacognosia, etimológicamente proviene de dos conceptos pharmacon

(medicamento o veneno) y gnosis (conocimiento), por lo que su traducción es, el
conocimiento de los medicamentos o venenos, diferenciándose estos
únicamente en la dosis(1), idea expuesta por Paracelso en la que dijo “¿Hay algo
que no sea veneno? Todas las cosas son veneno y no hay nada que no lo sea.
Solamente la dosis determina que una cosa sea o no veneno”(2). En sí la
farmacognosia corresponde a la ciencia que estudia todas las sustancias de
origen natural: vegetal, microbiano y animal que posean efectos biológicos
(terapéuticos o tóxicos) o utilidad como excipientes(3).
Algunos objetivos de la farmacognosia son:
- Establecer la composición química de la droga con respecto a los

principios activos.
- Obtener extractos de la droga que contengan los principios activos.
- Establecer las propiedades farmacológicas de las drogas.
- Investigar nuevos principios activos que puedan ser el punto de partida en
el diseño de nuevos fármacos.
- Controlar la calidad de las drogas, métodos para comprobar el contenido
requerido de principio activo, asegurar la ausencia de productos tóxicos y
evitar falsificaciones y adulteraciones.
Esto hace que la farmacognosia sea un pilar fundamental en el marco de la

medicina actual, la que se encuentra constantemente con el desafío de encontrar
nuevos fármacos para optimizar las terapias actuales, ya sea por aparición de
resistencia al tratamiento (infecciones o algunos tumores)(4) o por aparición de
efectos adversos que llevan a discontinuar las terapias.
Enfocándonos en el reino vegetal, la fitoquímica puede ser considerada una rama

de la farmacognosia, donde la fitoquímica es la ciencia dedicada a aislar, analizar,
elucidar la estructura química y caracterizar la actividad biológica de los
Introducción
productos del metabolismo de los vegetales(5) . Siendo de mayor interés los

productos del metabolismo secundario como: los isoprenoides (terpenos, aceites
esenciales, saponinas, etc), derivados fenólicos (cumarinas, flavonoides, taninos,
quinonas, etc) y los alcaloides(3), metabolitos que pueden considerarse principios
activos. Siendo los alcaloides uno de los metabolitos de mayor importancia por
su gran variedad de propiedades farmacológicas.
Alcaloides
Los alcaloides son un grupo de compuestos con gran variedad estructural,

haciendo difícil poder definirlos, pero se acepta que son compuestos orgánicos
nitrogenados, de origen natural, con carácter más o menos básico, en los que el
nitrógeno forma parte de un heterociclo y poseen actividad farmacológica incluso
a dosis bajas. Además se pueden identificar mediante reacciones de
precipitación con los reactivos generales de alcaloides(1,3). Es importante
mencionar que las características mencionadas no son suficientes para incluir la
totalidad de los alcaloides conocidos, existiendo excepciones a algunas de las
características, generando dos grupos: uno corresponde a los pseudoalcaloides,
que normalmente poseen la mayoría de las características generales, pero no
provienen de los aminoácidos y el otro grupo es el de los protoalcaloides que son
compuestos en los que su átomo de nitrógeno no se encuentra en un sistema
heterocíclico(1).
Otra definición para los alcaloides puede ser la entregada por Pelletier, quien dijo
“Un alcaloide es un compuesto orgánico cíclico que contiene nitrógeno en su
estado de oxidación negativo, el cual es de distribución limitada entre los
organismos vivos”(6).
En los vegetales, los alcaloides pueden ser sintetizados a partir de la ruta del
ácido shikímico y la ruta del ácido mevalónico(3), se encuentran principalmente
en vegetales superiores (la mayoría presentes en las Dicotiledóneas). Es común
encontrar los alcaloides en tejidos periféricos de los vegetales (ej: corteza,
semillas, frutos, etc). Pueden encontrarse en estado libre, como sales o como
Introducción
alcaloides N-óxidos. Normalmente las especies que contienen alcaloides

difícilmente contienen un único alcaloide.
La mayoría de los alcaloides poseen oxígeno en su estructura y son sólidos

cristalizables siendo generalmente incoloros o blancos, mientras que aquellos
que carecen de oxígeno son líquidos e incluso volátiles a temperatura
ambiente(1,7).
Se pueden clasificar según su estructura y su origen
Figura 1Clasificación general de alcaloides. Obtenido de "Farmacognosia"

Kuklinski, C.
La detección de los alcaloides se realiza mediante reacciones de precipitación,
utilizando reactivos específicos, también conocidos como reactivos generales de
Introducción
alcaloides. El fundamento de esta reacción se encuentra en la capacidad que

poseen los alcaloides (debido a su nitrógeno), de combinarse con metales y
metaloides (ej: bismuto, mercurio, yodo). El reactivo de Dragendorff, el reactivo
de Wagner y el reactivo de Mayer son los reactivos generales de alcaloides más
utilizados para realizar ensayos cualitativos para alcaloides(1).
El método general de extracción de alcaloides se realiza humedeciendo la droga

vegetal con agua o una solución hidroalcohólica acidificada, aumentando la
solubilidad de los alcaloides en estas soluciones, luego se agrega un solvente
orgánico como éter o cloroformo, para poder eliminar pigmentos u otros
compuestos diferentes a los alcaloides mediante agitación en un embudo de
decantación y descartando la fase orgánica. Posteriormente a la fase acuosa se
le agrega bicarbonato de sodio en exceso haciendo precipitar los alcaloides,
finalmente los alcaloides son separados mediante filtración o adicionando un
solvente orgánico(7). Una vez separados los alcaloides deben purificarse, proceso
que puede realizarse mediante recristalización del alcaloide de interés.
Pimentero común (Piper nigrum)
Es una enredadera perenne, perteneciente a la familia de las Piperáceas

(Piperaceae). Planta cultivada en el archipiélago Malayo, en Sudamérica (Brasil)
y las Indias Occidentales, de la cual su fruto, una drupa de 4 a 8 mm de diámetro(1,
6, 8), se utiliza como especia en gastronomía y en la medicina tradicional(9).
La pimienta negra (Piper Nigrum) corresponde al fruto seco y sin madurar.

Contiene entre 1 – 2,5% de aceites volátiles, de 5 – 9% de alcaloides cristalinos
dentro de los que se encuentra principalmente la piperina y piperetina, además
de contener resinas(7). Algunos autores han reportado un contenido de piperina
de 10% en la pimienta negra(10). Otros autores también mencionan la presencia
de al menos 10 alcaloides presentes en la pimienta negra, siendo algunos de
estos la piperina, chabamida, pellitorina, retrofractamida A, isopiperoleína B y
pirroperina(11).
Introducción
La piperina, el principal alcaloide de la pimienta negra, de fórmula C 17H19NO3, y

peso molecular 285,342 g/mol(4), también se encuentra presente en los frutos de
Piper longum(12). Fue aislada por primera vez en el año 1819(7).
Figura 2 Estructura de piperina

Es un alcaloide piperídinico, siendo el producto de la reacción entre la piperidina
y el piperoil-CoA (ácido pipérico-coenzima A). Su ruta biosintética es la vía
metabólica del ácido shikímico(13).
Figura 3 Biosíntesis de piperina. Obtenido de Piperine - Type Amides: Review

of Chemical and Biological Characteristics. Koma, S.
Introducción
La piperina es un compuesto casi insoluble en agua (40 mg/L a 18°C) y en éter

de petróleo, más soluble en alcohol, cloroformo y éter (1 g en 15 mL, 1,7 mL y 36
mL respectivamente) y completamente soluble en benceno y ácido acético.
Posee estereoisómeros: isopiperina, chavicina e isochavicina(14).
Propiedades farmacológicas de piperina
Se han reportado una gran variedad de efectos farmacológicos para este

alcaloide, los que han sido evaluados por diferentes autores.
Bhalekar M. y colaboradores en 2017 realizaron dos formulaciones (gel y

nanopartículas lipídicas), ambos conteniendo piperina, con el objetivo de evaluar
su eficacia tópica y oral en el tratamiento de la artritis en ratas inducida por CFA
(ácidos grasos cetilados). En este estudio se concluyó que ambas formulaciones
tienen potencial como medicamento antirreumático, efectos logrados por la
inhibición de la expresión de IL–6 y MMP-13(15).
Tunsophon S. y Chootip K. observaron que la administración de 40mg/Kg de

piperina produce una reducción en la acumulación de grasa en el hígado, además
de un efecto restaurador en la esteatosis en ratas hiperlipidémicas. Estos efectos
se deben a una inhibición parcial de lipasas pancreáticas y generación de
enzimas antioxidantes(9).
Se ha estudiado cómo la piperina afecta la farmacocinética de otros fármacos.

Bedada S. y colaboradores observaron un aumento de la biodisponibilidad del
diclofenaco en pacientes sanos luego de administrar cápsulas de 20 mg de
piperina una vez al día durante diez días, demostrando así, la inhibición del
CYP2C9 por la piperina(16).
Zhang Jian y colaboradores evaluaron el efecto de la piperina in vitro en células

humanas de osteosarcoma (U2OS y HOS), observando una reducción de la
viabilidad celular de manera dosis y concentración dependiente, con una IC50 de
72µM para la línea celular HOS y 126 µM para U2OS a las 72 horas, además de
encontrar un efecto antimigratorio de las células debido a la inhibición de la
Introducción
expresión y activación de las metaloproteinasas de matriz -2/-9 de ambas líneas

celulares.(17).
Paarakh P. y colaboradores estudiaron el efecto de la piperina en células

epiteliales de adenocarcinoma (cáncer cérvico-uterino, HeLa) exponiendo el
cultivo durante 24 horas a distintas concentraciones del agente en estudio,
obteniendo como resultado un efecto citotóxico con una CI50 de 61,94 µg/mL(4).
Lai L. evaluó la citotoxicidad de la piperina mediante MTT en las líneas celulares

4T1 (células correspondientes cáncer de mama) y NIH3T3 (fibroblastos).
Obteniendo una IC50 de 105 ± 1,08 µM a las 48 horas y 78,52 ± 1,06 µM a las 72
horas para la línea celular 4T1 observando un efecto dosis y tiempo dependiente,
mientras que para NIH3T3 se observó un efecto citotóxico menos marcado con
una CI50 de 232 ± 1,15 µM a las 48 de tratamiento. Estudió el efecto inhibitorio de
crecimiento de tumor mamario in vivo producido por la línea celular 4T1 en ratas,
este efecto se observó al administrar la piperina a dosis de 2,5 y 5 mg/Kg.
Además, evalúo la posibilidad de inhibir la metástasis pulmonar generada por las
células 4T1, observando menos metástasis en las ratas que fueron tratadas con
dosis de 5 mg/Kg de piperina(18).
Platel, K. junto a Srinivasan, K. estudiaron el efecto de varias especias utilizadas

en los alimentos como condimentos o de los principios activos presentes en estas
especias, sobre las enzimas de la mucosa intestinal en ratas Wistar al administrar
continuamente la especia o principio activo junto al alimento por ocho semanas.
En este estudio se observó que la administración continua de piperina incrementó
la actividad de la lipasa, maltasa y sacarasa(19).
Duangjai, A. y colaboradores estudiaron y compararon la actividad de un extracto

etanólico de pimienta negra y de piperina sobre la absorción del colesterol,
analizando: el efecto de estos sobre la solubilidad y el tamaño de las micelas de
colesterol, la absorción de colesterol en células Caco-2 y también su acción sobre
los transportadores Niemann-Pick C1 – like 1 (NPC1L1) y scavenger receptor
class B type I (SR-BI). En este estudio se observó que las soluciones utilizadas
Introducción
disminuían la cantidad de colesterol absorbido por las células Caco-2 ya

diferenciadas y que además promovían la internalización de ambas proteínas
(NPC1L1 y SR-BI), lo que favorece la disminución de la absorción del
colesterol(20).
Dogra, R. evaluó los efectos de la piperina sobre el sistema inmunológico en ratas

Swiss administrando por 5 días dosis orales de 1,12, 2,25 o 4,5 mg/kg. Con la
dosis más alta se observó una disminución de la población celular en el bazo y
el timo, lo que podría ser responsable de la disminución en la actividad de las
células formadoras de anticuerpo, además de una reducción en la respuesta de
la IgM(21).
Todos estos efectos de la piperina hacen que sea un compuesto de gran interés
para el área de la medicina y salud. También ha llamado la atención de la
población en general por sus efectos sobre las enzimas digestivas y la absorción
del colesterol, además se ha observado inhibición de la adipogénesis en estudios
in vitro(22, 23), haciendo que la piperina sea vendida y consumida en algunos
países como un suplemento alimenticio sola o en combinación con curcumina
para disminuir de peso y grasa corporal(24), lo que puede fomentar un uso
excesivo o sin supervisión de estos suplementos ignorando posibles riesgos
como interacciones farmacocinéticas debido a su capacidad inhibidora de
algunas isoformas de los citocromos del CYP450 y de la PGP, también debe
considerarse que la piperina ha sido estudiada como agente antineoplásico,
antimetastásico y tal como se comentó previamente ha mostrado citotoxicidad en
distintas líneas celulares.
Es importante destacar que la evaluación de la actividad citotóxica de un

compuesto es requisito tanto para compuestos que se quiere utilizar con fines
cosméticos o farmacéuticos, como para los compuestos que se están estudiando
como posibles agentes anticancerígenos. Como se ha podido observar en los
estudios antes mencionados, en la actualidad los ensayos preliminares de
citotoxicidad se realizan in vitro, enfocándose principalmente en el crecimiento o
supervivencia celular.(25)
Introducción
Debido a que el Químico Farmacéutico es el profesional responsable de la

dispensación de medicamentos y quien está a cargo de la dirección técnica de
las farmacias, parece de gran relevancia tomar en cuenta productos y
compuestos como la piperina que son utilizados y comercializados como
suplementos alimenticios, que muchas veces son dejado de lado en temas de un
perfil de seguridad completo. Esto motiva a que en este trabajo se busque
agregar más datos acerca de la actividad citotóxica de la piperina en otra línea
celular, en este caso RAW 264.7, ya que no se logró encontrar información
respecto a su actividad en esta línea celular, además estas células corresponden
a macrófagos murinos, un tipo celular no epitelial comparado a las HeLa, 4T1 y
U-2OS mencionadas en los estudios previos. De todas maneras, los resultados
entregados respecto a la toxicidad observada se consideran resultados
preliminares, esperando que en un futuro se sigan realizando este tipo de
estudios, además de estudios de tolerancia e idealmente farmacovigilancia ya
que existe la posibilidad de que los estudios in vitro respecto a la toxicidad de
piperina no se correlacionen con los que se pueden observar in vivo por la gran
cantidad de variables que pueden influir en su seguridad.
Capítulo II: Hipótesis
Hipótesis
2. Hipótesis
La piperina aislada a partir de pimienta negra comercial presenta actividad

citotóxica en cultivos celulares de la línea celular RAW 264.7
Capítulo III: Objetivos
Objetivos
3. OBJETIVOS
Objetivo general:
Aislar piperina a partir de pimienta negra comercial y evaluar su actividad

citotóxica en cultivo celular de la línea RAW 264.7
Objetivos específicos:
1) Extraer, aislar y purificar piperina mediante una técnica de extracción

convencional con disolvente
2) Identificar y caracterizar estructuralmente la piperina aislada, mediante las
técnicas cromatográficas y espectroscópicas
3) Evaluar la actividad citotóxica de piperina obtenida mediante ensayo de
viabilidad celular en línea celular RAW 264.7
Capítulo IV: Metodología
Metodología
4. METODOLOGÍA
4.1 Obtención de pimienta negra molida comercial
Se utilizó como material de partida para llevar a cabo la obtención de piperina, la

pimienta negra molida de marca comercial Gourmet (100g), adquirida en
comercios de Santiago de Chile, entre los meses de marzo y abril de 2019. El
estándar empleado fue adquirido como fármaco de referencia USP.
Procedimiento para extraer y aislar la piperina
Se realizaron tres extracciones en distintas ocasiones y cada una basada en el

procedimiento entregado por la Real Sociedad de Química 2017, a la que se le
realizaron distintas modificaciones en cada proceso de extracción.
En la figura 4 se muestran las etapas principales del procedimiento de extracción

y aislación de piperina.
Figura 4 Esquema general de procedimiento de extracción y aislamiento de

piperina
Metodología
4.1.1 Procedimiento 1
a) Pesado de la droga vegetal
En una balanza granataria se pesó y taró un vidrio de reloj, luego con una
espátula se comenzó a añadir sobre el vidrio de reloj la pimienta negra molida.
Luego de pesar la cantidad requerida, se traspasó la pimienta a un matraz de
fondo redondo de 250 mL. Ya agregada la pimienta en el matraz se volvió a pesar
el vidrio de reloj para poder calcular la cantidad real de pimienta negra agregada.
Los valores obtenidos en la balanza granataria se muestran en la tabla 1

(procedimiento 1)
Material Peso (g)
Vidrio de reloj* 34,52
Pimienta negra molida 25,02
Vidrio de reloj** 0,03
*El peso obtenido corresponde a la tara.
**Corresponde al pesaje que se realiza al vidrio de reloj luego de traspasar la pimienta negra al matraz de
fondo redondo.
Cantidad real agregada de pimienta negra molida
Pimienta negra − Vidrio de reloj∗∗ = Pimienta negra real agregada
25,02g − 0,03g = 24,99g
b) Extracción por reflujo
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de CH 2Cl2 y se agregó al

matraz de fondo redondo que contenía la pimienta negra molida.
La extracción se realizó mediante reflujo, para esto se instaló el sistema de reflujo

fijando el condensador en el soporte universal mediante una nuez y uniendo a su
vez el matraz de fondo redondo con pimienta negra molida y diclorometano al
extremo inferior del condensador, el matraz también se fijó al soporte universal
utilizando una nuez.
Metodología
Para calentar el contenido del matraz de fondo redondo se utilizó un baño

termorregulado, el que fue llenado con agua destilada, conectado a la corriente
eléctrica, encendido y configurado a una temperatura de 42°C.
Al llegar a la temperatura definida, se abrió el paso al agua refrigerante y se bajó

el matraz de fondo redondo junto al condensador de manera que el matraz quede
en contacto con el agua destilada del baño termorregulado. Una vez comenzada
la ebullición del DCM se mantuvo en este estado durante 20 minutos. Pasado
este tiempo, se apagó y desconectó el baño termorregulado, además el matraz
junto al condensador se elevaron unos siete centímetros aproximadamente
terminando el contacto entre el matraz de fondo redondo y el agua destilada,
facilitando el enfriamiento de la solución.
c) Filtración al vacío
Paralelamente al enfriamiento de la solución extractiva, se armó el sistema de

filtración al vacío, uniendo el embudo Büchner al matraz Kitasato y conectando
este a la bomba de vacío. El papel filtro se fijó al embudo Büchner añadiendo 5
mL de diclorometano sobre el papel filtro ya posicionado en el embudo.
La filtración al vacío se realizó bajo la campana de extracción y se llevó a cabo

únicamente cuando la solución extractiva alcanzó la temperatura ambiente.
Para realizar el arrastre total del contenido del matraz de fondo redondo se utilizó
50 mL de DCM en dos porciones de 15 mL y una de 20 mL aproximadamente.
La solución filtrada se trasvasijó a un nuevo matraz de fondo redondo de 250 mL,

mientras la pimienta negra retenida en el embudo Büchner fue descartada.
d) Obtención y lavado de extracto concentrado de pimienta negra
Bajo campana de extracción se rotavaporó el filtrado a 41°C hasta eliminar en su

totalidad el diclorometano. El extracto se selló con Parafilm, se almacenó
protegido de la luz y a temperatura ambiente durante 72 horas.
Metodología
Pasado los 3 días, nuevamente bajo campana de extracción, se colocó el matraz

con los cristales en un baño de hielo, en el mismo baño se enfrió 100 mL de éter
hasta llegar a 0°C. Una vez alcanzada esta temperatura se comenzó a lavar los
cristales con porciones de 10 o 15 mL aproximadamente de éter, se agitó
suavemente hasta obtener una solución traslúcida de color café claro y se
trasvasijó la solución a un vaso precipitado de 150 mL. El proceso se repitió hasta
que el éter se mantuviera incoloro o hasta que los cristales se vieran limpios.
El vaso precipitado con la solución de lavado se selló con Parafilm y se almacenó

a 4°C aproximadamente y protegido de la luz. Esta solución se utilizó para realizar
la identificación cualitativa de alcaloides.
e) Recristalización y obtención de cristales de piperina
A los cristales limpios se le añadió 90 mL de hexano y 30 mL de acetona. En una

placa calefactora manteniendo agitación constante se calentó la solución hasta
lograr la completa disolución de los cristales.
La solución se rotavaporó a una temperatura de 55°C hasta eliminar

aproximadamente 40 mL de la solución. Luego se dejó enfriar la solución, se selló
el matraz con Parafilm y se almacenó a temperatura ambiente y protegido de la
luz hasta poder observar los cristales de piperina.
Finalmente, los cristales de piperina se separaron de la solución mediante

filtración por gravedad.
f) Rendimiento del proceso
En una balanza analítica se taró un vaso precipitado de 50 mL, luego con la ayuda
de unas pinzas y una espátula, los cristales obtenidos en el embudo Büchner se
colocaron en el vaso precipitado. Una vez traspasada la totalidad de los cristales
se pesaron en la misma balanza analítica utilizada para tarar el vaso precipitado,
luego se selló con Parafilm y se almacenaron protegidos de la luz y a temperatura
ambiente. Finalmente se calculó el rendimiento del procedimiento realizado.
Metodología
a) Pesado de droga vegetal
espátula se comenzó a añadir sobre el vidrio de reloj la pimienta negra molida.
Luego de pesar la cantidad requerida, se traspasó la pimienta a un matraz de
fondo redondo de 250 mL. Ya agregada la pimienta en el matraz se volvió a pesar
el vidrio de reloj para poder calcular la cantidad real de pimienta negra agregada.
Los valores obtenidos en la balanza granataria se muestran en la tabla 2

(procedimiento 2)
Material Peso (g)
fondo redondo.
Cantidad de pimienta negra molida real agregada:
25,02g − 0,01g = 25,01g
b) Adición de solvente (hexano para desengrasado)
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de hexano y se agregó al

c) Desengrasado
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de C 6H14 y se agregó al

El desengrasado se realizó mediante reflujo, para esto se instaló el sistema de

reflujo fijando el condensador en el soporte universal mediante una nuez y
Metodología
uniendo a su vez el matraz de fondo redondo con pimienta negra molida y hexano
al extremo inferior del condensador, el matraz también se fijó al soporte universal


la ebullición del hexano se mantuvo en este estado durante 30 minutos. Pasada
la media hora se apagó y desconectó el baño termorregulado, el matraz junto al
condensador se elevaron unos siete centímetros aproximadamente terminando
el contacto entre el matraz de fondo redondo y el agua destilada, facilitando el
enfriamiento de la solución.
d) Filtración al vacío
Mientras la solución del matraz se enfriaba, se instaló el sistema de filtración al

vacío bajo la campana de extracción. El sistema de filtración al vacío estaba
compuesto por una bomba de vacío, una manguera, un matraz Kitasato, un
embudo Büchner y un papel filtro. El papel filtro se fijó al embudo Büchner
utilizando 5 mL de hexano.
Una vez la solución alcanzó la temperatura ambiente se encendió la campana de

extracción y se procedió a filtrar la solución. Para arrastrar la totalidad del
contenido del matraz se utilizó 50 mL de hexano dividida en 2 porciones de 15
mL y una de 20 mL aproximadamente.
La solución filtrada se trasvasijó a un vaso precipitado de 250 mL, se selló

utilizando Parafilm y se almacenó a temperatura ambiente y protegido de la luz.
Esta solución se utilizó para realizar la identificación cualitativa de alcaloides.
Metodología
La pimienta retenida en el embudo Büchner se agregó a un nuevo matraz de

fondo redondo utilizando una espátula.
e) Extracción por reflujo
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de CH2Cl2 y fue agregado al

matraz de fondo redondo que contenía la pimienta negra recuperada a partir de
la filtración al vacío.
Para realizar la extracción de la piperina se utilizó el sistema de reflujo ya armado

en la etapa de desengrasado. Sin embargo, en esta ocasión el baño
termorregulado se configuró a una temperatura de 42°C.
Al llegar a esta temperatura se abrió el paso del agua refrigerante y se acopló el

matraz de fondo redondo al condensador y se colocó a una altura en la que el
matraz pudiera estar en contacto con el agua destilada del baño termorregulado.
La extracción ocurre en un período de 20 minutos, tiempo que comienza a
contarse una vez ebulle la solución. Pasado este tiempo se apaga y desconecta
el baño termorregulado, y el matraz se eleva junto al condensador
aproximadamente siete centímetros terminando el contacto entre el matraz y el
agua del baño termorregulado.
f) Filtración al vacío
En el momento en que la solución llegó a la temperatura ambiente, se filtró al

vacío, para esto el papel filtro se fijó al embudo Büchner utilizando 5 mL de
diclorometano.
Para arrastrar la totalidad del contenido del matraz se utilizó 50 mL de DCM

dividido en 2 porciones de 15 mL y una de 20 mL aproximadamente.
La solución filtrada se trasvasijó a un matraz de fondo redondo y se selló con

Parafilm, mientras la pimienta negra retenida en el embudo Büchner fue
descartada.
Metodología
g) Obtención y lavado del extracto concentrado de pimienta negra
La solución presente en el matraz de fondo redondo fue rotavaporada a una

temperatura de 42°C, hasta eliminar en su totalidad el diclorometano. El extracto
obtenido se selló con Parafilm y se almacenó a temperatura ambiente y protegido
de la luz durante un día.
Para lavar el extracto se preparó un baño de hielo, en el que se colocó el matraz

de fondo redondo con el extracto y se enfrió 100 mL de éter contenidos en un
vaso precipitado de 150 mL. Con el éter a 0°C se procedió a agregar porciones
de entre 10 y 15 mL aproximadamente al matraz con el extracto, se agitó
suavemente hasta obtener una solución traslúcida de color café claro, esta
solución se trasvasijó a un vaso precipitado de 150 mL. Se repitió el proceso
hasta agotar los 100 mL de éter o hasta que la solución dentro del matraz se
mantuviera incolora.
La solución obtenida a partir del lavado se selló y guardó a 4°C aproximadamente

y protegido de la luz. Esta solución se utilizó para realizar la identificación
cualitativa de alcaloides.
h) Recristalización
Al matraz de fondo redondo con el resto del extracto se le añadió 70 mL de

hexano y 10 mL de metanol. Se introdujo un agitador magnético, se conectó el
matraz de fondo redondo al condensador utilizado en las etapas de
desengrasado y extracción. Se abrió el paso del refrigerante al condensador y
con una placa calefactora se calentó la solución a ebullición, se mantuvo bajo
agitación constante hasta disolver completamente el extracto. Una vez disuelto
el extracto se detuvo la agitación, se disminuyó la temperatura y se apagó la
placa calefactora.
Posteriormente la solución del matraz de fondo redondo se rotavaporó a una

temperatura de 65°C evaporando 10 mL aproximadamente de la mezcla de
Metodología
solventes. Finalmente se selló el matraz con Parafilm y se almacenó a

temperatura ambiente y protegido de la luz.
i) Limpieza y obtención de cristales de piperina
Se realizó un ensayo de limpieza de cristales inicial, en el que se tomó dos

cristales relativamente pequeños y cada uno se colocó en un tubo de ensayo a
los que luego se les añadió 1 mL de éter, un tubo de ensayo fue sometido a
agitación manual por 5 minutos con pausas intermedias mientras que el otro tubo
de ensayo se almacenó a 4°C aproximadamente por 24 horas.
Una vez visto los resultados del ensayo de limpieza de cristales, para conseguir
los cristales limpios, se filtró la solución mediante filtración por gravedad
utilizando un matraz Kitasato, un embudo Büchner y papel filtro. La filtración se
realizó vaciando cuidadosamente el contenido del matraz de fondo redondo sin
verter los cristales formados sobre el embudo Büchner, luego se lavaron los
cristales a temperatura ambiente utilizando 50 mL de éter, agitando suavemente
disolviendo los contaminantes y se dejó macerando durante 24 horas. Pasado el
día, la solución resultante fue filtrada por gravedad utilizando un matraz Kitasato,
un embudo Büchner y papel filtro, se vertió completamente el contenido del
matraz de fondo redondo. Los cristales retenidos en el matraz y los
correspondientes al ensayo de limpieza de cristales fueron recogidos utilizando
pinzas, colocados sobre un vidrio de reloj previamente tarado y pesados en una
balanza analítica. Luego se traspasaron los cristales a un vaso precipitado de 50
mL, se selló utilizando Parafilm y se almacenaron a temperatura ambiente y
protegidos de la luz.
La solución de lavado se trasvasijó a un vaso precipitado de 100 mL, se selló con

Parafilm, se almacenó a 4°C y protegido de la luz. Esta solución se utilizó para
realizar la identificación cualitativa de alcaloides.
Finalmente, con el peso de los cristales se calculó el rendimiento del

procedimiento.
Metodología
a) Pesado de droga vegetal
espátula se comenzó a pesar la pimienta negra molida, al pesar la cantidad
requerida se traspasó la droga vegetal a un matraz de fondo redondo de 250 mL.
Una vez agregada la totalidad de la pimienta negra en el matraz, se pesó
nuevamente el vidrio de reloj para poder calcular la cantidad real de pimienta
negra que se utilizó.
Los valores obtenidos en la balanza granataria se muestran en la tabla n

(procedimiento 3)
Material Peso (g)
fondo redondo.
Cantidad de pimienta negra molida real agregada:
25,08g − 0,00g = 25,08g
b) Desengrasado
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de C6H14 y se agregó al
El desengrasado se realizó mediante reflujo, para esto se instaló el sistema de

reflujo fijando el condensador en el soporte universal mediante una nuez y
uniendo a su vez el matraz de fondo redondo con pimienta negra molida y hexano
al extremo inferior del condensador, el matraz también se fijó al soporte universal
Metodología


la ebullición del hexano se mantuvo en este estado durante 30 minutos. Pasada
la media hora se apagó y desconectó el baño termorregulado, el matraz junto al
condensador se elevaron unos siete centímetros aproximadamente terminando
el contacto entre el matraz de fondo redondo y el agua destilada, facilitando el
enfriamiento de la solución.
c) Filtración al vacío
Mientras la solución del matraz se enfriaba, se instaló el sistema de filtración al

vacío bajo la campana de extracción. El sistema de filtración al vacío estaba
compuesto por una bomba de vacío, una manguera, un matraz Kitasato, un
embudo Büchner y un papel filtro. El papel filtro se fijó al embudo Büchner
utilizando 5 mL de hexano.
Una vez la solución alcanzó la temperatura ambiente se encendió la campana de

extracción y se procedió a filtrar la solución. Para arrastrar la totalidad del
contenido del matraz se utilizó 50 mL de hexano dividida en 2 porciones de 15
mL y una de 20 mL aproximadamente.
La solución filtrada se trasvasijó a un vaso precipitado de 250 mL, se selló

utilizando Parafilm y se almacenó a temperatura ambiente y protegido de la luz.
Esta solución se utilizó para realizar la identificación cualitativa de alcaloides.
La pimienta retenida en el embudo Büchner se agregó a un nuevo matraz de

fondo redondo utilizando una espátula.
Metodología
d) Extracción por reflujo
En un vaso precipitado de 150 mL se midió 100 mL de CH2Cl2 y fue agregado al

matraz de fondo redondo que contenía la pimienta negra recuperada a partir de
la filtración al vacío.
Para realizar la extracción de la piperina se utilizó el sistema de reflujo ya armado

en la etapa de desengrasado. Sin embargo, en esta ocasión el baño
termorregulado se configuró a una temperatura de 42°C.
Al llegar a esta temperatura se abrió el paso del agua refrigerante y se acopló el

matraz de fondo redondo al condensador y se colocó a una altura en la que el
matraz pudiera estar en contacto con el agua destilada del baño termorregulado.
La extracción ocurre en un período de 20 minutos, tiempo que comienza a
contarse una vez ebulle la solución. Pasado este tiempo se apaga y desconecta
el baño termorregulado, y el matraz se eleva junto al condensador
aproximadamente siete centímetros terminando el contacto entre el matraz y el
agua del baño termorregulado.
e) Filtración al vacío
En el momento en que la solución llegó a la temperatura ambiente, se filtró al

vacío, para esto el papel filtro se fijó al embudo Büchner utilizando 5 mL de
diclorometano.
Para arrastrar la totalidad del contenido del matraz se utilizó 50 mL de

diclorometano dividido en 2 porciones de 15 mL y una de 20 mL
aproximadamente.
La solución filtrada se trasvasijó a un matraz de fondo redondo y se selló con

Parafilm, mientras la pimienta negra retenida en el embudo Büchner fue
descartada.
Metodología
f) Obtención y lavado del extracto concentrado de pimienta negra

La solución presente en el matraz de fondo redondo fue rotavaporada a una
temperatura de 42°C, hasta eliminar en su totalidad el diclorometano. El extracto
obtenido se selló con Parafilm y se almacenó a temperatura ambiente y protegido
de la luz durante un día.
Pasado el día, los cristales en el matraz de fondo redondo se lavaron añadiendo

porciones de 10 mL aproximadamente de éter a temperatura ambiente al matraz,
se agitó suavemente hasta que el éter comenzara a tomar una coloración café
claro, se trasvasijó esta solución cuidadosamente a un vaso precipitado de 150
mL evitando traspasar los cristales al vaso precipitado. Se repitió el proceso hasta
que la solución dentro del matraz se mantuviera incolora.
El vaso precipitado con la solución de lavado se selló con Parafilm y se almacenó

a 4°C aproximadamente y protegido de la luz. Esta solución se utilizó para realizar
la identificación cualitativa de alcaloides.
g) Recristalización
Al matraz de fondo redondo con los cristales se le añadió 100 mL de hexano y

10 mL de metanol, se introdujo un agitador magnético, el matraz de fondo
redondo se conectó al condensador utilizado en las etapas de desengrasado y
extracción. Se abrió el paso al refrigerante y con una placa calefactora se calentó
la solución a ebullición, se mantuvo agitación constante hasta que se disolvieron
completamente los cristales. Al alcanzar la disolución total, se detuvo la agitación,
se disminuyó la temperatura y se apagó la placa calefactora.
Luego la solución del matraz se rotavaporó a una temperatura de 65°C hasta

eliminar 10 mL aproximadamente de la mezcla de solventes. Finalmente se selló
el matraz con Parafilm, se almacenó a temperatura ambiente y protegido de la
luz.
Metodología
h) Obtención de los cristales
El contenido del matraz se filtró por gravedad utilizando un matraz Kitasato, un

embudo Büchner y papel filtro. Los cristales se recogieron con la ayuda de pinzas
y espátula, se colocaron sobre un vidrio de reloj previamente tarado y se pesaron
en la misma balanza analítica utilizada para tarar el vidrio de reloj. Luego los
cristales se traspasaron a un vaso precipitado de 50 mL, se selló utilizando
Parafilm y se almacenaron a temperatura ambiente y protegidos de la luz.
Finalmente, con el peso de los cristales obtenidos se calculó el rendimiento del

procedimiento.
4.2 Test realizados durante proceso de extracción y aislación de piperina

4.2.1 Identificación cualitativa de alcaloides
Para realizar la identificación de alcaloides, se tomó 2 mL de cada una de las

soluciones mencionadas en la tabla “n”, agregando estas a distintos tubos de
ensayo y añadiendo luego 4 gotas del reactivo de Dragendorff. Se repitió el
mismo procedimiento una vez más, pero en esta ocasión en lugar del reactivo de
Dragendorff se añadió 2 gotas del reactivo de Wagner
La tabla 4 resume las soluciones en las que se realizaron los ensayos
Tabla 4 Soluciones sometidas a ensayo de identificación de alcaloides

Procedimiento Solución Reactivo
Dragendorff
1 Lavado de extracto
Wagner
Dragendorff
Desengrasado
Wagner
Dragendorff
2 Lavado de extracto
Wagner
Dragendorff
Lavado de cristales
Wagner
Dragendorff
Desengrasado
Wagner
3
Dragendorff
Lavado de extracto
Wagner
Metodología
4.2.2 Identificación y comparación de cristales mediante Cromatografía

en Capa Fina
Se realizaron cuatro cromatografías, en donde las primeras dos cromatografías

(placa A y B) se hicieron comparando los cristales obtenidos en los
procedimientos 1 y 2, incluyendo además el precipitado formado en la solución
de desengrasado contra el estándar de piperina. Las dos últimas cromatografías
(placa C y D) se realizaron comparando los cristales obtenidos en los
procedimientos 1, 2 y 3 contra el estándar de piperina.
Las figuras 5 y 6 representan las placas cromatográficas identificando las

muestras que se comparan en estas.
Figura 5 Representación placas cromatográficas A y B

Metodología
Figura 6 Representación placas cromatográficas C y D

Se utilizaron dos fases móviles distintas, una correspondía únicamente a acetato
de etilo, mientras la otra fase móvil correspondía a una mezcla hexano:acetato
de etilo en proporción 5:3.
a) Preparación de fase móvil y cámaras cromatográficas
Para las cámaras cromatográficas de las placas A y C se le añadió la cantidad

suficiente de acetato de etilo para lograr una altura de solución de 0,5 cm
aproximadamente dentro de cada cámara cromatográfica.
Mientras que para las cámaras cromatográficas de las placas B y D se le añadió

la cantidad suficiente de la mezcla hexano:acetato de etilo (5:3). Esta solución se
preparó en un vaso precipitado de 50 mL, al cual se le agregó 25 mL de hexano
y 15 mL de acetato de etilo.
b) Preparación de soluciones de cristales a comparar por cromatografía

en capa fina
Metodología
Las soluciones para sembrar en las placas cromatográficas se prepararon de la

siguiente manera.
Solución estándar: se tomó una punta de espátula de la piperina USP y se

colocó en un tubo eppendorf de 1 mL, luego se agregó 1 mL de metanol y se
disolvió completamente. Esta solución se preparó una segunda vez luego de un
mes.
Solución de cristales (Procedimiento 1): en una balanza analítica se pesó y

taró un vaso precipitado de 15 mL, con una espátula se tomó y pesó 2,7 mg de
cristales. Luego se agregó 4 mL de metanol y se agitó hasta disolver
completamente los cristales.


Solución de precipitado proveniente del desengrasado: en una balanza

analítica se pesó y taró un vaso precipitado de 15 mL, con una espátula se tomó
y pesó 5,1 mg de cristales. Luego se agregó 4 mL de metanol y se agitó hasta
disolver completamente los cristales.
c) Preparación de placas cromatográficas
Luego de preparar las cámaras cromatográficas y las soluciones a sembrar para

comparar, se prepararon cuatro placas cromatográficas de gel de silice, trazando
con lápiz grafito dos líneas rectas a un centímetro de los extremos superior e
inferior de cada placa cromatográfica.
Metodología
Posteriormente se sembraron las soluciones preparadas en las respectivas

placas cromatográficas.
d) Cromatografía en capa fina
Una vez listas las placas cromatográficas, con la ayuda de pinzas se introdujo
cada una de las placas a una cámara cromatográfica y se esperó hasta que la
fase móvil alcanzara el frente de solvente del extremo superior, al alcanzar esta
delimitación se retiró la placa cromatográfica de la cámara y se dejó secar a
temperatura ambiente. Luego se observaron las placas cromatográficas bajo la
lámpara UV a una longitud de onda de 254 nm y de 365 nm, al visualizar las
bandas de extinción de cada compuesto en las placas se marcaron con lápiz
grafito, para finalmente medir la distancia recorrida por cada compuesto y calcular
el factor de retención para cada uno de estos.
4.2.3 Evaluación del punto de fusión de los cristales
Este ensayo se realizó para una muestra de cristales provenientes de los tres
procedimientos realizados en esta investigación.
Para llevar a cabo la medición del punto de fusión, se utilizó un fusiómetro,

capilares con un extremo redondo y una pequeña muestra de cada uno de los
cristales. En primer lugar, se tomó una muestra de los cristales del procedimiento
1 con el extremo abierto del capilar, y se hizo bajar la muestra a través de este
volteando el capilar y golpeando suavemente el extremo redondo con el mesón,
luego se encendió y configuró el fusiómetro a una temperatura de 127°C.
Mientras aumentaba la temperatura del bloque en el fusiómetro, se introdujo el
capilar con la muestra en el bloque y se observó a través de la lupa. Al alcanzar
la temperatura se configuró nuevamente la temperatura en un rango desde 128°C
a 134°C hasta observar el cambio de estado de los cristales en el capilar. Se
repitió este proceso para los cristales provenientes del procedimiento 2 y 3.
Metodología
4.3 Caracterización de los cristales mediante resonancia magnética

nuclear (RMN)
Los espectros de resonancia magnética nuclear de protones ( 1H-RMN), de

carbono (13C-RMN) y DEPT se analizaron en un espectrómetro BRUKER modelo
AVANCE DXR-300.
Las muestras analizadas por espectroscopia 1H-RMN de piperina fueron

disueltas en DMSO.
Todos los espectros analizados utilizaron como patrón interno tetrametil silano.
En la asignación de los espectros se utilizan las siguientes abreviaciones:
singulete (s); doblete (d); triplete (t); cuadruplete (c); multiplete (m).
4.4 Ensayo de citotoxicidad (viabilidad celular)
Se realizaron dos ensayos MTT, cada uno se hizo por triplicado, designando las
concentraciones de estudio en las columnas de la placa y dejando las filas “B” y
“C” de esta para replicar el ensayo dos veces más.
Las soluciones utilizadas para el primer ensayo de MTT se muestran en la tabla

5.
Tabla 5 Soluciones utilizadas en el primer ensayo de MTT

Concentración de piperina
Solución Volumen (mL)
(µg/mL)
Disolución de piperina1 1 10500 µg/mL
Solución stock1 1 500 µg/mL
Solución 1 1 100 µg/mL
Control positivo 0,1 0 µg/mL
Control solvente1 1 0 µg/mL
Control negativo1 1 0 µg/mL
Metodología
Las soluciones utilizadas en el segundo ensayo de MTT se muestran en la tabla

6.
Tabla 6 Soluciones utilizadas en el segundo ensayo de MTT

Concentración de piperina
Solución Volumen (mL)
(µg/mL)
Disolución de piperina2 1
Solución stock2 1 500 µg/mL
Control positivo 0,1 0 µg/mL
Control solvente2 1 0 µg/mL
Control negativo 1 0 µg/mL
4.4.1 Primer MTT

a) Preparación de cultivo celular en placa multipocillo
Para realizar el ensayo se utilizó la línea celular RAW 264.7 TIB – 71, se sembró
5 x 104 células por cada pocillo y con una micropipeta p200 se agregó 100 µL de
medio RPMI, luego se dejó incubar en la estufa a una temperatura de 37.2°C por
24 horas.
b) Preparación de soluciones
Cada una de las soluciones descritas se prepararon aproximadamente 23 horas

después de la incubación de las células en la placa multipocillo
Disolución de piperina1
En una balanza analítica se pesó y taró un vidrio de reloj, con la ayuda de una
pinza se tomó y pesó 10,5 mg de cristales de piperina obtenidos por el
Procedimiento 2, estos cristales se traspasaron a un tubo Falcon de 10 mL. Luego
se añadió 1 mL de DMSO medido con una pipeta aforada de 1 mL. Se tapó el
Metodología
tubo Falcon y se agitó la solución hasta disolver completamente la piperina,

obteniendo una solución de concentración 10,5 mg/mL.
Esta solución se utilizó para preparar la solución stock de piperina, a partir de la

cual se realizarán las diluciones correspondientes.
Con el objetivo de trabajar con mayor facilidad al momento de calcular la alícuota

a tomar para preparar la solución stock1, se procedió a calcular la concentración
en µg/mL.
Para esto debemos considerar que 1 mg corresponde a 1000 µg, por lo tanto:
𝑚𝑔
10,5 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝑔
Concentración de disolución de piperina1 = = 10500 µ𝑔/𝑚𝐿
1 𝑚𝑔
Preparación de la solución stock1 (500µg/mL)
Para preparar esta solución a partir de la solución inicial (Disolución de piperina)

se calculó el volumen necesario para obtener una nueva solución de
concentración 500 µg/mL con un volumen final de 1 mL.
𝐶2 𝑥𝑉2
Utilizando la fórmula “n”, 𝑉1 = y sabiendo que C1 corresponde a la
𝐶1
concentración de la solución “Disolución de piperina”, 10500 µg/mL; C2 es la

concentración de la solución stock1, 500µg/mL y V2 es el volumen final de la
solución stock1 1 mL (1000 µL). Con estos datos tenemos que:
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 500 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 47,6 µ𝐿
𝐶1 10500 ⁄𝑚𝐿
Por lo tanto, se debe tomar 47,6 µL de la solución “Disolución de piperina1”
Luego se calculó el volumen de medio RPMI necesario para completar 1000 µL

utilizando la ecuación “n”.
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑅𝑃𝑀𝐼 = 1000 µ𝐿 − 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑚𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝐷𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑅𝑃𝑀𝐼 = 1000 µ𝐿 − 47,6µ𝐿 = 952,4 µ𝐿

Metodología
Finalmente, dentro de la campana de flujo laminar se preparó la solución stock 1

tomando 47,6 µL de la solución inicial con una micropipeta p200 y agregando
este volumen a un tubo eppendorf estéril, luego con una micropipeta p1000 se
tomó 952,4 µL de medio RPMI, se agregó al tubo eppendorf estéril, se tapó y
agitó la solución.
A partir de la solución stock1 se procedió a preparar las soluciones 1, 2 y 3 a las

concentraciones descritas en la tabla 5.
Preparación de la solución 1 (100 µg/mL)
El volumen que debe tomarse de la solución stock 1 para preparar esta solución
se calculó a partir de la fórmula “n”
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 100 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 200 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿
Por lo tanto, se debe tomar 200 µL de la solución stock1.
Luego se calculó el volumen de medio necesario para completar un volumen de

1000 µL.
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑅𝑃𝑀𝐼 = 1000 µ𝐿 − 200 µ𝐿 = 800 µ𝐿
Finalmente, dentro de la campana de flujo laminar se preparó la solución 1

tomando 200 µL de la solución stock1 con una micropipeta p200 y agregando
tomó 800 µL de medio RPMI, se agregó al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó
la solución.
se calculó a partir de la fórmula:
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 10 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 20 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿
Metodología

1000 µL.

tomando 20 µL de la solución stock1 con una micropipeta p200 y agregando este
volumen a un tubo eppendorf estéril, luego con una micropipeta p1000 se tomó
980 µL de medio RPMI, se agregó al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la
solución.
se calculó a partir de la fórmula.
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 1 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 2 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

solución.
Preparación de la solución “control solvente”

Metodología
Esta solución se preparó de la misma manera en que se preparó la solución

stock1, con la única diferencia que en esta ocasión se utilizó como solución de
partida el DMSO al 100%.
Dentro de la campana de flujo laminar se tomó 47,6 µL de la solución de DMSO

al 100% con una micropipeta p200 y agregando este volumen a un tubo
eppendorf estéril, luego con una micropipeta p1000 se tomó 952,4 µL de medio
RPMI, se agregó al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la solución.
Control positivo
El control positivo corresponde a las células sembradas a las que se les añade
únicamente 100 µL de medio RPMI.
Control negativo
El control negativo corresponde a las células sembradas a las que se les añade
100 µL de DMSO al 100%
c) Exposición de las células a piperina
Pasada las primeras 24 horas de incubación, la placa con células se sacó de la

estufa y dentro de la campana de flujo laminar se procedió a quitar el medio de
crecimiento (RPMI) a cada pocillo utilizando una micropipeta p200, luego se
añadió a los pocillos 100 µL de las soluciones de piperina preparadas, del control
de solvente, además de los controles positivos y negativos, todo esto según la
concentración correspondiente a cada uno de los pocillos, tal como se muestra
en la figura 7.
Metodología
Figura 7 Representación de placa multipocillo con sus concentraciones

Luego de agregar los controles y soluciones a cada uno de los pocillos, las células
son incubadas nuevamente a 37.2°C por 24 horas.
d) Adición de MTT
Pasada las 24 horas de exposición a la piperina, se sacó la placa de la estufa y

dentro de la campana de flujo laminar se quitó cada una de las soluciones de los
pocillos y se agregó a cada uno de estos 100 µL de la solución de MTT. Al
terminar de agregar esta solución, se incuban nuevamente las células a 37,2°C
durante 5 horas.
e) Disolución de cristales de formazan y lectura de absorbancia
Luego de las 5 horas de incubación de las células se procede a disolver los

cristales de formazan formados en los pocillos, para esto se utiliza una pipeta
multicanal p200 con la que se agregan 100 µL de alcohol isopropílico a cada
pocillo de la fila A y se comienza a solubilizar el formazan mediante resuspensión
de la solución de los pocillos durante 3 minutos. Se repitió el mismo proceso para
las filas B y C.
Metodología
Ya disueltos los cristales de formazan, se midió la absorbancia de los pocillos a

dos longitudes de onda, 570 y 630 nm utilizando el lector híbrido de placa
multipocillo BioTek Synergy H1.
Luego utilizando Excel se calculó la absorbancia real de cada pocillo producida

por el formazan, seguido por el cálculo del porcentaje de viabilidad celular.
Finalmente, con estos datos y utilizando el programa GraphPad Prism 6 se realizó
un gráfico de columnas del porcentaje de células vivas para cada condición en
estudio y se realizó el análisis estadístico mediante ANOVA de una vía.
4.4.1.1 Segundo MTT

a) Preparación de cultivo celular en placa multipocillo
Para realizar el ensayo se utilizó la línea celular RAW 264.7 TIB – 71, se sembró
5 x 104 células por cada pocillo y con una micropipeta p200 se agregó 100 µL de
medio RPMI, luego se dejó incubar en la estufa a una temperatura de 37.2°C por
24 horas
b) Preparación de soluciones
Cada una de las soluciones descritas a continuación se prepararon

aproximadamente 23 horas después de la incubación de las células en la placa
multipocillo.
Disolución de piperina2
En una balanza analítica se pesó y taró un vidrio de reloj, con la ayuda de una
piensa se tomó y pesó 11,1 mg de los cristales de piperina obtenidos en el
Procedimiento 2, estos se traspasaron a un tubo eppendorf. Luego, utilizando
una micropipeta p1000 se tomó y añadió 1 mL de DMSO, se tapó el tubo
eppendorf y se agitó la solución hasta la disolución total de los cristales,
obteniendo una solución de concentración 11,1 mg/mL.
A partir de esta solución se tomó una alícuota para preparar la solución de

piperina (solución stock2) que se utilizará para obtener las disoluciones de
Metodología
piperina. Para trabajar con mayor facilidad al momento de realizar los cálculos de
la alícuota a tomar para preparar la solución stock2, se procedió a calcular la
concentración de la disolución de piperina en µg/mL.
Sabiendo que 1 mg corresponde a 1000 µg, tenemos que la concentración de la

solución es:
mg
11,1 ⁄mL x 1000 µg
Concentración de disolución de piperina2 = = 11100 µg/mL
1 mg
Preparación de la solución stock2
Para preparar esta solución a partir de la solución “Disolución de piperina2” se

calculó el volumen necesario para obtener una nueva solución de concentración
500 µg/mL con un volumen final de 1 mL.
El volumen que debe tomarse de la solución “Disolución de piperina2” se calculó

a partir de la fórmula:
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 500 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 45 µ𝐿
𝐶1 11100 ⁄𝑚𝐿
Por lo tanto, se debe tomar 45 µL de la solución “Disolución de piperina 2”
Luego se calculó el volumen de medio RPMI necesario para completar 1000 µL.
Finalmente, dentro de la campana de flujo laminar se preparó la solución stock 2

tomando 45 µL de la solución inicial con una micropipeta p200 y agregando este
solución.
A partir de esta solución se prepararon las soluciones 4, 5, 6, 7 y 8 a las

concentraciones descritas en la tabla 6.
Metodología
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 100 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 200 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

tomó y añadió 800 µL de medio RPMI al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la
solución.
El volumen que debe tomarse de la solución stock2 para preparar esta solución
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 80 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 160 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

solución.
Metodología
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 50 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 100 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

solución.
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 30 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 60 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

volumen a un tubo eppendorf estéril, luego con una micropipeta p1000 se tomó y
añadió 940 µL de medio RPMI al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la
solución.
Metodología
µ𝑔
𝐶2 𝑥𝑉2 10 ⁄𝑚𝐿 𝑥 1000 µ𝐿
𝑉1 = = µ𝑔 = 20 µ𝐿
𝐶1 500 ⁄𝑚𝐿

1000 µL.

volumen a un tubo eppendorf estéril, luego con una micropipeta p1000 se tomó y
añadió 980 µL de medio RPMI al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la
solución.
Preparación de la solución “control solvente”
Esta solución se preparó de la misma manera en que se preparó la solución

stock1, con la única diferencia que en esta ocasión se utilizó como solución de
partida el DMSO al 100%.
Dentro de la campana de flujo laminar se tomó 45 µL de la solución de DMSO al

100% con una micropipeta p200 y agregando este volumen a un tubo eppendorf
estéril, luego con una micropipeta p1000 se tomó 955 µL de medio RPMI, se
agregó al tubo eppendorf estéril, se tapó y agitó la solución.
Control positivo
El control positivo corresponde a las células sembradas a las que se les añade
únicamente 100 µL de medio RPMI.
Metodología
Control negativo
El control negativo corresponde a las células sembradas a las que se les añade
100 µL de DMSO al 100%
c) Exposición de las células a piperina
Pasada las primeras 24 horas de incubación, la placa con células se sacó de la

estufa y dentro de la campana de flujo laminar se procedió a quitar el medio de
crecimiento (RPMI) a cada pocillo utilizando una micropipeta p200, luego se
añadió a los pocillos 100 µL de las soluciones de piperina preparadas, del control
de solvente, además de los controles positivos y negativos, todo esto según la
concentración correspondiente a cada uno de los pocillos, tal como se muestra
en la figura 8.
Figura 8 Representación de placa multipocillo con sus concentraciones (segundo

MTT)
Luego de agregar los controles y soluciones a cada uno de los pocillos, las células
son incubadas nuevamente a 37.2°C por 24 horas.
Metodología
d) Adición de MTT
Pasada las 24 horas de exposición a la piperina, se sacó la placa de la estufa y

dentro de la campana de flujo laminar se quitó cada una de las soluciones de los
pocillos y se agregó a cada uno de estos 100 µL de la solución de MTT. Al
terminar de agregar esta solución, se incuban nuevamente las células a 37,2°C
durante 5 horas.
e) Disolución de cristales de formazan y lectura de absorbancia
Luego de las 5 horas de incubación de las células se procede a disolver los

cristales de formazan formados en los pocillos, para esto se utiliza una pipeta
multicanal p200 con la que se agregan 100 µL de alcohol isopropílico a cada
pocillo de la fila A y se comienza a solubilizar el formazan mediante resuspensión
de la solución de los pocillos durante 3 minutos. Se repitió el mismo proceso para
las filas B y C.
Ya disueltos los cristales de formazan, se midió la absorbancia de los pocillos a

dos longitudes de onda, 570 y 630 nm utilizando el lector híbrido de placa
multipocillo BioTek Synergy H1.
Luego utilizando Excel se calculó la absorbancia real de cada pocillo producida

por el formazan, seguido por el cálculo del porcentaje de viabilidad celular.
Finalmente, con estos datos y utilizando el programa GraphPad Prism 6 se realizó
un gráfico de columnas del porcentaje de células vivas para cada condición en
estudio y se realizó el análisis estadístico mediante ANOVA de una vía,
considerando un valor p < 0,05 como significancia estadística.
Capítulo V: Resultados
Resultados
5. RESULTADOS
5.1. Procedimiento 1
5.1.1 Observación de cristales en extracto concentrado
Luego de los 3 días que se almacenó el extracto concentrado se observó la

presencia de cristales, los que tenían forma espiga, un color amarillo crema y se
encontraban en grupos alrededor de núcleos de cristales
En la figura 9 se muestran los cristales de piperina formados en el extracto

concentrado.
Figura 9 Cristales de piperina luego de lavado del extracto concentrado

5.1.2 Identificación cualitativa de alcaloides en solución de lavado de
extracto concentrado.
Luego de añadir los reactivos de Dragendorff a un tubo de ensayo y el reactivo

de Wagner al otro tubo de ensayo, cada uno con la solución de lavado del
extracto concentrado y su posterior agitación no se observó la formación de un
precipitado en los tubos de ensayo
Resultados
5.1.3 Formación de cristales de piperina
Una semana después de la recristalización se observó la formación de los

primeros cristales de piperina, los que tenían forma de aguja, eran de un color
café, se encontraban agrupados alrededor de distintos núcleos de cristal.
Un mes después de la recristalización no se observó mayor crecimiento de los

cristales, ni formación de nuevos núcleos de cristales.
La figura 10 muestra los cristales obtenidos un mes después de la recristalización
Figura 10 Cristales de piperina un mes después de la recristalización

El peso final de los cristales de piperina fue 0,2414 g.
Al medir el punto de fusión de estos cristales se obtuvo un rango de temperatura

entre 129 – 132°C
5.1.4 Rendimiento del procedimiento
En primer lugar, y considerando que se utilizó 24,99 g de pimienta negra en el

procedimiento, se calculó el máximo de piperina que se puede obtener según
bibliografía, a este valor se le llamó “Piperina teórica”.
Resultados
a) Piperina teórica
De acuerdo a lo descrito por Ault, A., la pimienta negra contiene 10% de piperina
24,99 g x 10
Piperina teórica = = 2,499 g
100
b) Porcentaje de rendimiento
Una vez calculada la piperina teórica se procedió a calcular el porcentaje de

rendimiento del procedimiento.
0,2414 g
Porcentaje de rendimiento = x 100 = 9.7%
2,499 g
El rendimiento del procedimiento 1 es de 9.7%.
5.2 Procedimiento 2
5.2.1 Identificación cualitativa de alcaloides en solución desengrasante
Al añadir el reactivo de Dragendorff al primer tubo de ensayo y el reactivo de

Wagner al segundo tubo de ensayo, cada uno conteniendo 2 mL de la solución
desengrasante y luego de agitar cada tubo de ensayo se observó la formación
de precipitado marrón rojizo
5.2.2 Observación de precipitado en solución desengrasante
Al ser guardada la solución desengrasante durante un día, se observó la

formación de un precipitado de color blanco que cubría casi la totalidad del fondo
del vaso precipitado en el que se encontraba la solución.
Un día después de obtener el extracto concentrado se observó la formación de

cristales con la forma de pequeñas agujas amarillas, dispersos alrededor de toda
la pared del matraz de fondo redondo.
Resultados
5.2.4 Identificación cualitativa de alcaloides en solución de lavado de

extracto concentrado
Teniendo dos tubos de ensayo con la solución de lavado del extracto

concentrado. Después de agregar el reactivo de Dragendorff a uno de estos tubos
de ensayo y el reactivo de Wagner al otro tubo de ensayo y luego de agitar la
solución no se observó la formación de precipitado en ningún tubo de ensayo.
5.2.5 Cristales de piperina
Tres días después de la recristalización se observaron los cristales de piperina,

con forma de aguja y la mayoría se encontraban agrupados alrededor de un único
núcleo de cristal. Se encontraban cubiertos por una sustancia de aspecto oleoso.
La figura 11 muestra la apariencia de los cristales de piperina, luego de eliminar

la solución recristalizante.
Figura 11 Cristales de piperina después de eliminar la solución recristalizante

Resultados
5.2.5.1 Identificación cualitativa de alcaloides en solución de lavado

de cristales de piperina
Se preparó dos tubos de ensayos conteniendo la solución obtenida luego de lavar

los cristales de piperina. Después de agregar el reactivo de Dragendorff a uno de
estos tubos de ensayo y el reactivo de Wagner al otro tubo de ensayo y luego de
agitar las soluciones no se observó la formación de precipitado en ningún tubo
de ensayo.
La figura 12 muestra los cristales limpios luego de ser filtrados.
Figura 12 Cristales de piperina luego de su lavado y filtrado

Los cristales con forma de aguja y color mostaza se encontraban agrupados
principalmente en un único punto, mientras una menor cantidad se encontraban
en grupos más pequeños o como un único cristal. El peso final de los cristales de
piperina fue 0,2464 g. Al medir el punto de fusión se obtuvo un rango de
temperatura de 129 – 132°C.
5.2.6 Rendimiento del procedimiento
Considerando que la pimienta negra utilizada en el procedimiento fue 25,01 g se

calculó la cantidad de piperina teórica que debería obtenerse como máximo
según bibliografía.
Resultados
De acuerdo con lo descrito por Ault, A., la pimienta negra contiene 10% de
piperina
25,01 g x 10
100

0,2464 g
Porcentaje de rendimiento = x 100 = 9,9%
2,501 g
El rendimiento del procedimiento 2 es de 9,9%.
5.3 Procedimiento 3
5.3.1 Identificación cualitativa de alcaloides en solución desengrasante

de Wagner al otro tubo de ensayo, cada uno con la solución obtenida a partir del
desengrasado de la pimienta negra, se agitó la solución y se observó la formación
de un precipitado marrón rojizo en ambos tubos de ensayo.
Un día después de concentrar el extracto se observó la presencia de cristales

con forma de aguja, estos eran pequeños de un tamaño máximo de 0,5 cm
aproximadamente
5.3.3 Identificación cualitativa de alcaloides en solución de lavado

de Wagner al otro tubo de ensayo, cada uno con la solución obtenida a partir del
lavado del extracto concentrado, se agitó la solución y no se observó la formación
de precipitado en ningún tubo de ensayo.
Resultados
5.3.4 Cristales de piperina
Una semana después de la recristalización se observa la formación de los

primeros cristales de piperina, con forma de espiga y de un color amarillo claro
casi traslúcido.
La figura 13 muestra los cristales formados en la primera semana posterior a la

recristalización
Figura 13 Cristales de piperina formados una semana después de la

recristalización
Semanas después se observó la formación de nuevos núcleos de cristales, por
lo que se guardó la solución durante un mes. Al paso de este tiempo no se
observó mayor crecimiento en los cristales, ni formación de nuevos núcleos de
cristales.
La figura 14 muestra los cristales obtenidos un mes después de la

recristalización.
Resultados
Figura 14 Cristales formados un mes después de la recristalización
Los cristales se encontraban completamente limpios, la mayoría se encontraban

en pequeños grupos, mientras otros pocos estaban aislados. El peso final de los
cristales fue de 0,0387 g, y la temperatura de fusión dio un rango de 129 – 131°C.
5.3.5 Rendimiento del procedimiento.
Considerando que la pimienta negra utilizada en este procedimiento fue 25,08 g,

se calculó la cantidad teórica de piperina que debería obtenerse según
bibliografía.
De acuerdo con lo descrito por Ault, A., la pimienta negra contiene 10% de
piperina
25,08 g x 10
100

0,0387
Porcentaje de rendimiento = x 100 = 1,5%
2,508 𝑔
Resultados
El rendimiento del procedimiento 3 es de 1,5%.
5.4 Identificación y comparación de cristales obtenidos contra estándar

de piperina mediante cromatografía en capa fina
5.4.1 Placas cromatográficas A y B
Al observar las placas cromatográficas bajo la lámpara UV a las longitudes de

onda de 254 nm y 365 nm, se visualizó la presencia de una banda de extinción
principal para cada una de las soluciones sembradas en la placa, coincidiendo
aparentemente con la del estándar. Además, se observó otra banda de extinción
menos visible para todas las soluciones a excepción de la solución estándar, esta
última banda fue retenida antes que las bandas principales.
La figura 15 muestra la placa cromatográfica A, en la que se utilizó acetato de

etilo como fase móvil.
Figura 15 Placa cromatográfica A observada a 254 nm

La tabla 7 muestra los Rf de las bandas observadas para cada solución sembrada
en la placa cromatográfica A
Resultados
Tabla 7 Rf calculado para cada banda observada en la placa cromatográfica A

Solución sembrada Rf
Estándar de piperina 0,73
0,48
Cristales procedimiento 1
0,73
0,48
0,75
0,56
Precipitado del desengrasado
0,78
La figura 16 muestra la placa cromatográfica B, en la que se utilizó una mezcla

de hexano:acetato de etilo (5:3) como fase móvil.
Figura 16 Placa cromatográfica B observada a 254 nm

en la placa cromatográfica B
Resultados
Tabla 8 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica B

Solución sembrada Rf
0,09
0,28
0,09
0,28
0,09
Precipitado del desengrasado
0,28
5.4.2 Placas cromatográficas C y D
Al observar estas placas bajo la lámpara UV a una longitud de onda de 254 nm,
se visualizó la presencia de una banda de extinción principal para cada una de
las soluciones sembradas, las que coincidían con la entregada por el estándar
de piperina. Además, se observó la formación de otras dos bandas de extinción
más tenues para las soluciones correspondientes a los cristales del
procedimiento 1 y del procedimiento 2, una de estas bandas fue menos retenida
que la principal, mientras que la otra banda presentó mayor retención que la
principal, coincidiendo con una segunda banda de extinción entregada por la
solución perteneciente a los cristales del procedimiento 3, esta última era aún
más tenue y pequeña que las demás señales observadas.
La figura 17 muestra la placa cromatográfica C, en la que se utilizó acetato de

etilo como fase móvil.
Resultados
Figura 17 Placa cromatográfica C observada a 254 nm

en la placa cromatográfica C.
Tabla 9 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica C

Soluciones sembradas Relación de frentes (Rf)
0,39
Cristales procedimiento 1 0,71
0,77
0,40
0,77
0,39
0,71
Resultados
La figura 18 muestra la placa cromatográfica D, en la que se utilizó una mezcla

de hexano:acetato de etilo (5:3) como fase móvil.
Figura 18 Placa cromatográfica D observada a 254 nm

La tabla 10 muestra los Rf de las bandas observadas para cada solución
sembrada en la placa cromatográfica D.
Tabla 10 Rf para cada banda observada en la placa cromatográfica D

Soluciones sembradas Relación de frentes
0,07
0,31
0,07
0,31
0,07
0,25
Resultados
5.5 Caracterización de los cristales mediante resonancia magnética

nuclear
Con el fin de orientar con mayor facilidad la descripción y análisis de los espectros
1H-RMN, 13C-RMN y DEPT se asignó un número o letra a cada carbono de la
estructura de la piperina. La figura 19 muestra la identificación de cada carbono
de la piperina.
Figura 19 Enumeración de los átomos de piperina (excluyendo los H). Obtenido

de MestReNova
5.5.1 Espectro 1H RMN
En el espectro 1H RMN (visualizado en los anexos 2, 3 y 4) se observó un

singulete correspondiente a los protones del metilendioxi del C-19 a δ 6,05.
También se apreció las señales de los protones pertenecientes al anillo
piperidínico, a δ 3,51; 1,60 y 1,48 para los átomos 3 y 5; 2 y 6; 1 respectivamente.
La totalidad de las señales observadas en el espectro 1H RMN y la información

obtenida para cada una de estas se resumen en la tabla 11.
Resultados
Tabla 11 Resumen de información recopilada del espectro 1H RMN de piperina.

Obtenido de MestReNova
Átomo de carbono Integral/N° de
Peak Multiplicidad J*
correspondiente protones
3y5 3,51 4 Singulete -
- 3,34 0,94 ≅ 1 Singulete -
2,52 – 2,50
- 0,77 doble triplete 1,60; 1,60; 3,32
(2,51)**
1 1,60 – 1,59 2 Doblete 4,96
2y6 1,48 4 Singulete -
19 6,05 2 Singulete -
6,69 – 6,66
8 1 Doblete 14,5
(6,68)
- 6,85 0,32 Singulete -
6,91 – 6,89
11 1 Doblete 6,2
(6,90)
14 6,93 1 Doblete 2,9
7,00 – 6,96
10 y 17 1,74 ≅ 2 Multiplete -
(6,98)
7,19 – 7,17
13 0,78 ≅ 1 Multiplete -
(7,18)
7,25 – 7,21
9 1,19 ≅ 1 Multiplete -
(7,23)
*Corresponde a la constante de acoplamiento en Hz
**Corresponde al peak principal
5.5.2 Espectro 13C RMN de piperina
En el espectro 13C RMN se observó la señal del carbono carbonílico a δ 164,7 en

C-7. Además, se logró observar la señal correspondiente al metilendioxi a δ
101,8. Sin embargo no se logró apreciar claramente todas las señales esperadas
para los átomos correspondientes al anillo piperidínico, logrando identificar
únicamente el C-1 a δ 24,6
Las señales observadas en el espectro 13C RMN se resumen en la tabla 12.

Resultados
Tabla 12 Señales observadas en espectro 13C RMN. Obtenido de MestReNova

N° del(los) átomo(s) de carbono(s) Desplazamiento químico (ppm)
1 24,60
2y6
39,40 – 40,60
3y5
19 101,80
17 105,90
14 108,90
13 121,20
8 122,90
10 126,20
12 131,30
11 138,10
9 142,20
16 148,20
15 148,40
7 164,70
5.5.3 Espectro 13C RMN DEPT de piperina
En el espectro 13C RMN DEPT se observó la señal negativa del carbono

perteneciente al metilendioxi (C-19) a δ 101,8. Del anillo piperídinico se apreció
únicamente la señal de C-1 a δ 24,6. Además de no poder observar las señales
restantes del anillo piperidínico, se puede apreciar la falta de peaks al comparar
este espectro con el 13C RMN, estas señales corresponden a los carbonos
cuaternarios de la piperina.
Las señales observadas en el espectro 13C RMN DEPT se resumen en la tabla

13.
Resultados
Tabla 13 Señales observadas en espectro 13C RMN DEPT. Obtenido de

MestReNova
Desplazamiento químico Tipo de señal
24,60 Negativa
101,80 Negativa
105,90 Positiva
108,90 Positiva
121,20 Positiva
122,90 Positiva
126,20 Positiva
138,10 Positiva
142,20 Positiva
5.6 Ensayo de citotoxicidad

5.6.1 Primer MTT
La absorbancia observada a 570nm y 630nm para cada una de las condiciones

se muestra en la figura 20.
Figura 20 Absorbancia a 570 y 630nm del primer MTT

La absorbancia promedio del blanco a 570 nm fue de 0,046423077.
Para calcular la absorbancia real y el porcentaje de viabilidad celular se utilizaron

las fórmulas del anexo 23. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 21.
Resultados

primer MTT
Una vez calculado estos porcentajes se realizó un gráfico de columna con el
promedio del porcentaje de viabilidad celular para cada condición en estudio. La
figura 22 muestra el gráfico obtenido.
Figura 22 Gráfico de viabilidad celular en primer MTT

Las concentraciones que mostraron una diferencia significativa en la viabilidad
celular respecto al control positivo presentan un “*”.
Resultados
La media de la viabilidad celular para cada condición se resume en la tabla 14
Tabla 14 Media de viabilidad celular para cada condición en el primer MTT

Condición de estudio Viabilidad celular (%)
Control positivo 100
500 µg/mL 58,77
100 µg/mL 55,35
10 µg/mL 92,4
1 µg/mL 89,24
Control solvente 58,33
Control negativo 0
Luego de realizar el análisis estadístico mediante ANOVA de una vía, se observó

una diferencia significativa al comparar la viabilidad celular de las condiciones
500 µg/mL, 100 µg/mL y control solvente con respecto al control positivo. No hubo
diferencia significativa comparando el control positivo con las condiciones 10
µg/mL y 1 µg/mL. Se encontró diferencia significativa entre la condición 100
µg/mL y las condiciones 10 y 1 µg/mL. Además, al comparar el control solvente
con los 500 µg/mL y los 100 µg/mL no se observó una diferencia significativa
5.6.2 Segundo MTT
La absorbancia observada a 570nm y 630nm para cada una de las condiciones

se muestra en la figura 23.
Figura 23 Absorbancia a 570 y 630nm del segundo MTT

La absorbancia promedio del blanco a 570 nm fue de 0,047848485.
Resultados
Para calcular la absorbancia real y el porcentaje de viabilidad celular se utilizaron

las fórmulas del anexo 23. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 24.

segundo MTT
Con estos últimos resultados se realizó un gráfico de columna con el promedio
del porcentaje de viabilidad para cada condición de estudio. La figura 25 muestra
el gráfico obtenido.
Figura 25 Gráfico de viabilidad celular en segundo MTT

Resultados
Las concentraciones que mostraron una diferencia significativa en la viabilidad

celular respecto al control positivo presentan un “*” mientras que la diferencia
significativa obtenida para los 500µg/mL respecto al control solvente se
representa con doble “*”.
La media de la viabilidad celular para cada condición se resume en la tabla 15.
Tabla 15 Media de viabilidad celular para cada condición en segundo MTT

Condición de estudio Viabilidad celular (%)
Control positivo 100
500 µg/mL 0
100 µg/mL 24,76
80 µg/mL 50,1
50 µg/mL 71,79
30 µg/mL 83,58
10 µg/mL 84,54
Control solvente 23,3
Control negativo 0
Al realizar el análisis estadístico se observó que todas las condiciones aplicadas

a excepción de los 30 µg/mL y 10 µg/mL presentaban diferencia significativa al
compararlas con el control positivo. Hubo una diferencia significativa entre el
resultado obtenido para los 500 µg/mL respecto al control solvente, pero no hubo
diferencias al comparar la viabilidad celular de los pocillos de 100 µg/mL de
piperina con los del control solvente. Se observó diferencia significativa al
comparar las condiciones 80 µg/mL, 50 µg/mL, 30 µg/mL y 10 µg/mL con la de
100 µg/mL. No se observó diferencias significativas entre las condiciones 30
µg/mL y 10 µg/mL.
Capítulo VI: Discusión
Discusión
6. DISCUSIÓN
“Obtención de pimienta negra”
Se eligió utilizar una marca comercial por dos razones: la primera, es la

imposibilidad de poder recolectarla directamente ya que es un producto
importado en Chile. La segunda, es asegurar que la identidad de la droga vegetal
utilizada corresponde a la pimienta negra, ya que la empresa que la comercializa
debe realizar ensayos de identificación.
Además, se prefirió utilizar la droga vegetal molida principalmente porque de esta

manera aumenta la superficie de contacto de esta con el solvente extractivo,
facilitando la extracción de los compuestos presentes en la droga vegetal. Se
valoró la posibilidad de utilizar pimienta negra entera como materia prima y
posteriormente molerla en un mortero, pero de esta manera no se puede
asegurar el obtener partículas tan pequeñas como las entregadas por la industria.
Extracción y aislación de piperina.
La modificación realizada al procedimiento 1 fue:
- El tiempo de reposo del extracto de pimienta negra para permitir la

formación de cristales de piperina en el extracto fue de 72 horas
aproximadamente, este tiempo se debió a que se esperaba que estos
cristales se formaran a los pocos minutos de concentrar el extracto, lo que
no ocurrió y se optó por almacenar el extracto concentrado por un día
esperando observar los cristales luego de este período. Sin embargo, la
revisión no se pudo llevar a cabo como se esperaba, sino que se realizó
pasado 3 días.
Este período de reposo permitió tener cristales de piperina con un mayor tamaño
del esperado e incluso agrupados alrededor de varios núcleos de cristales.
Se realizaron los ensayos de identificación de alcaloides con el reactivo de

Draggendorf y el reactivo de Wagner a la solución de lavado del extracto de
Discusión
pimienta negra para evaluar la posibilidad de perder piperina durante esta etapa.
Estos ensayos dieron resultados negativos, lo que puede significar que no se
está perdiendo piperina en la solución de lavado o que la cantidad de piperina
que se está eliminando es mínima por lo que este tipo de ensayos (cualitativos)
no es capaz de identificarlo.
En la etapa de recristalización, luego de disolver la piperina del extracto y permitir

el enfriamiento de la solución, no se formaron los cristales de piperina
inmediatamente, por lo que se decidió almacenar esta solución por unos días
hasta la formación de los cristales de piperina. Se tomó esta decisión debido a
que existe literatura donde mencionan que la cristalización puede demorar desde
unos pocos minutos hasta días para distintos compuestos, además no se
encontró en la literatura información acerca del tiempo requerido para la
cristalización de piperina posterior a la recristalización. Los primeros cristales de
piperina se lograron observar una semana después de realizar la recristalización
de estos y seguían formándose a medida que pasaban los días, llegando al límite
de formación aproximadamente un mes después de la recristalización.
Debido al tiempo necesario para obtener los cristales de piperina luego de la

recristalización del procedimiento 1, se decidió realizar modificaciones a este con
el objetivo de poder lograr la cristalización de la piperina con un menor tiempo de
espera, a esta extracción y aislación se le denominó procedimiento 2. Los
cambios realizados en este nuevo procedimiento fueron los siguientes:
- Se agregó una etapa inicial de desengrasado mediante reflujo, para

eliminar la mayor cantidad de impurezas presentes en la pimienta negra
antes de realizar el proceso de extracción de piperina, esto basado en el
hecho de que al tener una menor cantidad de compuestos distintos a la
piperina (impurezas) en el extracto final y por ende en la solución
recristalizante, puede permitir que las moléculas de piperina interaccionen
entre sí con mayor facilidad, lo que disminuiría el tiempo necesario para la
formación de los cristales.(26)
Discusión
- El tiempo de reposo que se mantuvo el extracto de pimienta negra para

permitir la formación de cristales de piperina en el extracto fue de 24 horas
aproximadamente, se decidió acortar el tiempo de espera, ya que
transcurridas las 24 horas se observó la presencia de pequeños cristales,
que ya podían ser lavados y sometidos a una posterior recristalización.
- La recristalización se realizó con una mezcla de solventes distinta,
utilizando en este procedimiento una mezcla de 70 mL de hexano con 10
mL de metanol. Se disminuyó el volumen de hexano, debido a que otro
factor que influye en el proceso de recristalización es el volumen total
utilizado durante el proceso, siendo más efectivo el proceso mientras
menor sea el volumen utilizado. Además, se eligió el metanol como
segundo solvente ya que existe literatura donde la recristalización se
realiza utilizando alcohol como solvente(10), el volumen de metanol
utilizado se obtuvo como resultado de la adición consecutiva de 2 mL de
metanol cada pocos minutos, hasta la disolución completa del extracto
concentrado de pimienta negra.
Se evaluó la pérdida de piperina en la solución resultante de la etapa de

desengrasado utilizando el reactivo de Draggendorf y el reactivo de Wagner,
dando resultados positivos a la presencia de alcaloides ambos ensayos. Además,
en la solución desengrasante se observó la formación de un precipitado blanco
sin la necesidad de agregar algún reactivo, teniendo en cuenta la baja solubilidad
de la piperina en hexano y la presencia de alcaloides en la solución
desengrasante, se consideró la posibilidad de que este precipitado
correspondiera a piperina que se solubilizó durante el reflujo con hexano, por lo
que se tomó una muestra de este precipitado para compararlo mediante
cromatografía en capa fina con los cristales obtenidos en ambos procedimientos
y con un estándar de piperina USP. Debido a estas observaciones se esperaría
ver una disminución en el rendimiento del procedimiento 2 respecto al
procedimiento 1.
Discusión
Como resultado de las modificaciones en el procedimiento 2 se consiguió obtener

cristales de piperina “post” recristalización en un período de 3 días, la mayor parte
de estos cristales se encontraban concentrados en un único núcleo formando un
cristal de mayor tamaño que los obtenidos por el procedimiento 1, a pesar de
esta observación se mantuvieron los cristales en la misma solución
“recristalizante” al menos una semana más, ante la posibilidad de que siguieran
formándose cristales o estos aumentaran de tamaño, pero esto no ocurrió.
Además, es importante mencionar que estos cristales se encontraban cubiertos
por impurezas, por lo que se les debió realizar una limpieza mediante
“maceración” en éter por 24 horas aproximadamente. A la solución resultante de
este lavado se le realizó ensayos de identificación de alcaloides, en los que no
se logró observar la presencia de estos, descartando así una pérdida significativa
de piperina al limpiar los cristales.
La selección del solvente que se utilizó para limpiar los cristales se basó
principalmente en que el éter es un solvente que ya había sido utilizado en frío
en la etapa de lavado del extracto concentrado de pimienta negra, y luego de
tener los resultados del ensayo “limpieza de cristales” se determinó la
temperatura a la que estos serían limpiados.
Con la intención de obtener cristales de piperina mucho más limpios y esperando

lograr la misma velocidad de formación de cristales se realizó un nuevo proceso
de extracción y aislación que se denominó procedimiento 3, basado en el
procedimiento 2, al que se le hicieron algunas modificaciones, estas se describen
a continuación:
- El lavado de los cristales presentes en el extracto concentrado de pimienta

negra se realizó a temperatura ambiente en lugar de hacerlo en un baño
de hielo y con éter frío. Se decidió hacerlo de esta manera ya que por lo
observado al limpiar los cristales de piperina provenientes del
procedimiento 2, el éter a temperatura ambiente no generaba una pérdida
significativa de piperina, además disolvió las impurezas mucho más rápido
facilitando su eliminación.
Discusión
- La recristalización se realizó utilizando 100 mL de hexano y 10 mL de

metanol. En esta ocasión se aumentó el volumen de hexano esperando
que de esta manera disminuyera el volumen de metanol requerido para
disolver todos los componentes presentes en el resto del extracto, a pesar
de esto el volumen de metanol fue el mismo. Se quiso disminuir la cantidad
de metanol ya que es un solvente en que la piperina es soluble, lo que
puede influir negativamente en la posterior cristalización de esta.
Para asegurar que no se estaba perdiendo piperina con esta nueva forma de
lavar el extracto, a la solución resultante de esta etapa se le realizó los ensayos
para identificar alcaloides con el reactivo de Draggendorf y el reactivo de Wagner,
dando ambos ensayos resultados negativos a la presencia de alcaloides.
Los cristales de piperina obtenidos en este procedimiento tenían una apariencia

más limpia como resultado del lavado más efectivo que se realizó a los primeros
cristales presentes en el extracto de pimienta negra. Sin embargo, se obtuvo una
cantidad de cristales de piperina “post” recristalización mucho menor a la
obtenida en los procedimientos anteriores, además la formación de los primeros
cristales ocurrió a la primera semana luego de realizar la recristalización y
siguieron formándose hasta aproximadamente un mes después de la
recristalización, teniendo un retraso similar al observado en el procedimiento 1.
Cromatografía en capa fina
Los cristales obtenidos en los procedimientos 1 y 2 se sometieron a CCF junto al

precipitado observado en la solución desengrasante y un estándar USP de
piperina para compararlos mediante el Rf observado para cada muestra. En la
placa cromatográfica A en la que se utilizó acetato de etilo como fase móvil se
obtuvo un Rf para el estándar de piperina de 0,73, coincidiendo con este valor la
principal banda de extinción entregada por los cristales del procedimiento 1. Los
valores de Rf para los cristales del procedimiento 2 y el precipitado de la solución
desengrasante fue de 0,75 y 0,78 respectivamente no coincidiendo con el Rf del
estándar de piperina, pero visualmente se observa una inclinación ascendente
Discusión
de las bandas de extinción de cada una de las muestras hacia el extremo superior
izquierdo de la placa, lo que puede indicar que al momento de entrar en contacto
la placa cromatográfica con la fase móvil no lo hizo de forma pareja teniendo el
primer contacto el extremo inferior izquierdo modificando los valores de Rf para
los compuestos que se encontraban a este lado, esta idea puede ser respaldada
por lo observado en la placa cromatográfica B en la que se utilizó una mezcla de
hexano:acetato de etilo (5:3) como fase móvil, donde el Rf principal para cada
muestra sembrada es de 0,28 coincidiendo con el Rf del estándar de piperina. La
presencia de una segunda banda de extinción mucho más tenue para cada
muestra en ambas placas cromatográficas, indica que los cristales obtenidos en
los procedimientos realizados no son completamente puros.
Los cristales obtenidos en el procedimiento 3 también se sometieron a CCF junto

a los cristales de los procedimientos 1 y 2 para comparar el Rf entregado por
estas muestras respecto al estándar USP de piperina. En la placa cromatográfica
C (acetato de etilo como fase móvil) se observa una banda de extinción principal
para cada muestra de cristal con un Rf de 0,71 el que coincide con el Rf del
estándar de piperina utilizado. Se observó la presencia de una segunda banda
de extinción tenue para las tres muestras de cristal con un Rf menor que el de la
banda principal, lo que nuevamente indica que estos no se encuentran
completamente puros, también se observó una tercera banda de extinción mucho
más “leve” para los cristales del procedimiento 1 y 2, con un Rf mayor que el de
la banda principal. Una situación similar ocurrió en la placa cromatográfica D
(mezcla de hexano:acetato de etilo (5:3) como fase móvil), donde a pesar de que
los compuestos presentes en las muestras de los tres cristales no lograron
separarse completamente se pueden observar tres bandas de extinción para los
cristales pertenecientes a los procedimientos 1 y 2, mientras que para los
cristales del procedimiento 3 se observan sólo 2 bandas de extinción. La
aparición de una tercera banda de extinción en la solución perteneciente a los
procedimientos 1 y 2 se puede deber a dos razones, una corresponde a la posible
contaminación de las soluciones mientras que la otra razón puede ser la posible
degradación de la piperina, ya que para estas últimas cromatografías se utilizó la
Discusión
misma solución que se usó en las primeras cromatografías y el tiempo que

transcurrió entre las cromatografías A y B con las cromatografías C y D fue de
aproximadamente un mes. Se podría descartar la posibilidad de la contaminación
ya que las cromatografías C y D se realizaron con una solución del estándar de
piperina recién preparado, mientras que al realizar una cromatografía adicional
(Anexo 1) en la que se utilizó la primera solución estándar de piperina preparada
para las cromatografías A y B, con esta solución también se observó una banda
de extinción adicional con un Rf mayor que la banda principal, de esta manera
las tres soluciones preparadas con anterioridad presentan un patrón similar, esto
más el hecho de que para cada siembra en cada cromatografía se utilizó un
capilar distinto se descarta la posibilidad de que las tres soluciones hayan sido
contaminadas con el mismo agente.
Evaluación del punto de fusión
El rango de temperatura de fusión visualizado para los cristales de los tres

procedimientos fue similar al reportado en la literatura 130°C (Merck Index), 131
– 135°C (USP), teniendo un rango de 129 – 132°C para los cristales de los
procedimientos 1 y 2; y un rango de 129 – 131°C para los cristales del
procedimiento 3. Los rangos de T° obtenidos no son tan amplios, lo que indica
que el compuesto a evaluar contiene pequeñas cantidades de impurezas.(27)
Rendimiento de los procedimientos
Respecto al rendimiento de cada procedimiento, este se calculó utilizando como

base el porcentaje de piperina contenido en la pimienta negra informado según
Ault. A., quien menciona que la pimienta negra puede llegar a contener un 10%
de piperina respecto a su peso seco, obteniendo de esta manera un rendimiento
del 9,7% para el procedimiento 1, un rendimiento de 9,9% para el procedimiento
2 y de 1,5% para el procedimiento 3. A pesar de que el procedimiento para aislar
Discusión
la piperina descrito por Ault A., es distinto al utilizado en este trabajo y debido a
esto no se pueda esperar obtener los mismos resultados, los rendimientos
obtenidos son bajos. Los factores que pueden haber influido de mayor manera
se dividen en dos grupos, los dependientes del procedimiento de extracción y los
que no dependen del procedimiento de extracción. A su vez, los no dependientes
del proceso de extracción se pueden subdividir en las prácticas agrícolas durante
el cultivo de Piper nigrum L., y en la logística de las empresas de alimentos.
Dentro de las prácticas agrícolas se pueden encontrar la preparación del terreno,
la utilización de fertilizantes, el sistema de regadío, el momento en que se realizó
la recolección de los frutos; etc; mientras que dentro de la logística de las
empresas alimenticias se encuentra el proceso de secado, de molienda, etc.
Todos estos factores pueden afectar directamente en el contenido de piperina en
la pimienta negra y no son controlados por quien realiza la extracción de piperina.
Los factores dependientes del proceso de extracción son los solventes, el

volumen de estos utilizados tanto para extraer como recristalizar el compuesto
en cuestión, la presión y temperaturas en las que se trabaja y la técnica de
extracción. Respecto a estos factores según lo observado en la solución
desengrasante del procedimiento 2, la cromatografía realizada para las placas A
y B, además del rendimiento similar entre el procedimiento 1 y el procedimiento
2 a pesar de esperarse una disminución en el rendimiento de este último, se
puede asumir que la pimienta negra con la que se trabajó tenía un contenido
mayor de piperina que el que se logró aislar con estos procedimientos, dando a
entender que para extraer la totalidad de piperina se requiere una mayor cantidad
de DCM que el utilizado o en su defecto realizar la extracción mediante Soxhlet
en lugar de reflujo manteniendo de esta manera un gradiente de concentración
favorable, permitiendo una extracción más completa. Además, se debe
considerar que para poder obtener una disolución completa de los componentes
del extracto de pimienta negra se utilizó en todos los procedimientos un segundo
solvente durante la recristalización, ya sea acetona en el procedimiento 1 o
metanol para los procedimientos 2 y 3, ambos solventes tenían la capacidad de
disolver la piperina, por esta razón, para evitar que tenga un impacto negativo en
Discusión
el rendimiento final se rotavaporó la solución recristalizante antes de que se enfríe

intentando eliminar el mayor volumen posible de acetona o metanol sin llegar a
sobresaturar la solución en caliente, pero esta acción no asegura la completa
eliminación de estos solventes por lo que no se descarta un impacto negativo en
el rendimiento..
En lugar de agregar un segundo solvente durante la recristalización una opción

más viable podría haber sido solubilizar la mayor cantidad de sustancias posibles
con C6H14 y luego realizar una filtración de la solución en caliente, eliminando de
esta manera todas las impurezas insolubles sin el riesgo de que la piperina se
mantenga disuelta luego que se enfriara la solución. Un factor que influyó en
tomar la decisión sobre agregar un segundo solvente al recristalizar fue que el
procedimiento que se utilizó como base en la extracción y purificación de piperina
sugería utilizar una mezcla hexano/acetona, lo que hizo pensar que la adición de
un segundo solvente podría ser favorable o incluso necesario durante la etapa
de recristalización de piperina.
La diferencia de los rendimientos obtenidos entre el procedimiento 2 y 3 pueden

deberse principalmente al volumen total utilizado para la recristalización, ya que
la diferencia procedimental entre ambos son: la temperatura del solvente utilizado
en el lavado de los cristales presentes en el extracto concentrado y el volumen
de solventes utilizado en la recristalización, donde en el procedimiento 3 se
añadió 30 mL de hexano respecto al segundo procedimiento, entre estos cambios
realizados se evaluó la presencia de alcaloides en la solución resultante del
lavado de los cristales en el extracto y no se logró observar una reacción positiva
frente a los reactivos de Wagner y Draggendorf, descartando la pérdida
significativa de piperina en esta etapa, lo que deja como única posibilidad la
variación del volumen de solvente como factor procedimental que influyó en el
rendimiento.
Discusión
Identificación/caracterización de piperina mediante RMN
Análisis espectro 1H RMN
Para poder analizar el espectro 1H RMN se realizó un análisis teórico de la

estructura de la piperina, de manera que se predice la aparición de 11 señales
en el espectro (sin considerar su multiplicidad), sin embargo, en el espectro
experimental se observó 13 peaks principales. También se utilizó la información
de espectro 1H RMN de piperina entregada en “Encapsulation of the Piperine
Present in Piper tuberculatum Species Using Multilamellar Vesicles and
Determination of its Antioxidant Power” en el que destacan 11 señales. (28)
Además, se realizó una simulación del espectro 1H RMN (Anexos 12 a 16) con
dos objetivos: llevar a una comparación más amplia de datos teóricos y
experimentales y facilitar la asignación de las señales a cada grupo de protones
de la estructura. En esta simulación se observó sólo 10 señales, esto debido al
acoplamiento de las señales de los protones de los carbonos N° 1, 2 y 6.
Las dos señales adicionales presentes en el espectro obtenido

experimentalmente se observan a δ 2,51 y 3,34; la primera de estas señales
debido al corrimiento químico que presenta y a que su integral no alcanza a ser
un entero, puede corresponder a trazas de DMSO sin deuterar, ya que este fue
el solvente utilizado para realizar el espectro. En el anexo 21 se muestra el
espectro 1H RMN simulado del DMSO.
Para las señales pertenecientes al anillo piperidínico se espera que aparezcan

en el campo alto desde 0,1 a 1,5 ppm aproximadamente, esto debido a que no
se encuentran cerca de átomos muy electronegativos que puedan desproteger
los núcleos de los protones, a excepción de los átomos de hidrógenos
pertenecientes a los átomos N° 3 y 5 que son los que se encuentran unidos
directamente al átomo de nitrógeno, por lo que la señal de estos puede
presentarse desde 3,5 a 4,5 ppm aproximadamente. Experimentalmente se
observó la señal correspondiente a los protones del carbono N° 1 a 1,59 - 160
ppm como un doblete e integrando para 2 protones, la señal de los protones de
Discusión
los carbonos N° 2 y 6 a 1,48 ppm como un singulete e integrando para 4 protones,

la señal de los protones de los carbonos N° 3 y 5 se observó como un singulete
a 3,51 ppm que integra para 4 protones. Para las señales entregadas por los
protones de los átomos de carbono N° 1, 2 y 6 se observó una diferencia respecto
a lo esperado teóricamente ya que la señal perteneciente al átomo N° 1 debería
encontrarse en una zona del campo más alta que la de los átomos N° 2 y 6, esta
misma situación se observó en el estudio utilizado como comparación. Respecto
a la integral entregada para cada una de las señales corresponde a lo esperado
para cada peak, mientras que la multiplicidad también es distinta a lo esperado.
Al visualizar la señal para los átomos N° 1, 2 y 6 en la simulación realizada, se
puede observar un acoplamiento en la señal de ambos grupos de protones, esta
anomalía tanto para la simulación como para los resultados experimentales
pueden sugerir la posibilidad de que existan otros factores más difíciles de
analizar que afecten en la generación de estas señales y es lo que podría explicar
lo observado.
Ya que los protones que tienen como átomo vecino sólo un oxígeno, estos
presentan señales desde los 3,5 a 4,5 ppm aproximadamente (29), se debe esperar
que los protones del metilendioxi generen señales en un campo más bajo debido
a la presencia de 2 átomos de oxígeno como vecinos, además de observarse
como un singulete por la ausencia de átomos de hidrógeno adyacentes.
Experimentalmente en el anexo 4, la señal para metilendioxi se observó como un
singulete a δ 6,05 e integrando para 2 protones; coincidiendo con lo esperado
teóricamente, para confirmar que esta señal correspondía a los protones del
metilendioxi se visualizó la simulación del espectro 1H RMN en el que la señal
aparece a δ 5,9 y también se comparó con la información entregada por el estudio
en el que se notifica un singulete a δ 6,01 que integra para 2 protones.
Las señales de los protones correspondientes a la cadena insaturada y al anillo

aromático pueden observarse desde los 5 a 8 ppm aproximadamente,
dependiendo el desplazamiento de la cantidad de insaturaciones.
Experimentalmente estas señales se observaron en un rango desde δ 6,68 a 7,23
Discusión
y cada señal integró para la cantidad de protones esperada teóricamente. En la

simulación estas señales se observaron en un rango de δ 6,45 a 7,61.
Análisis espectros 13C RMN y 13C RMN DEPT
Identificación/asignación de los átomos de carbono en el espectro
Para poder asignar los átomos de carbono a cada una de las bandas de
absorción presentes en el espectro, se realizó inicialmente una visualización de
la estructura de la piperina y se analizó teóricamente la cantidad de señales que
debía presentar y su desplazamiento químico aproximado, resultando en un total
de 15 señales a pesar de tener en su estructura 17 carbonos, esto debido a que
posee dos pares de átomos de carbono químicamente equivalentes (los átomos
N° 2 y 6 junto a 3 y 5). Respecto al desplazamiento químico los átomos del anillo
piperidínico se deben observar en el campo alto a frecuencias inferiores a 80
ppm(29), llegando incluso hasta los 20 ppm para los átomos del anillo que se
encuentren más alejados del átomo de nitrógeno, en este caso correspondería al
átomo N°1. Para el carbonilo se espera observar su señal en la zona más baja
del campo desde los 160 ppm hasta más de 200 ppm, por otro lado para los
átomos del benceno y cadena insaturada sus señales deben aparecer dentro del
rango de 110 a 150 ppm, finalmente para el átomo del metilendioxi debe
observarse alrededor de los 90 a 110 ppm, ya que un átomo de carbono unido
por un enlace simple a un oxígeno se observa hasta los 90 ppm, por lo que el
metilendioxi al corresponder a un átomo de carbono unido a dos átomos de
oxígeno debe encontrarse menos protegido, provocando un desplazamiento
químico hacia el campo bajo.
Como una herramienta adicional para el análisis, se realizó una simulación del
espectro 13C RMN (anexos 17 a 20) con el programa MestReNova, el cuál asigna
a cada señal del espectro generado los átomos de carbono correspondientes.
Discusión
Además se utilizó la información proporcionada por el espectro 13C RMN DEPT

(anexos 9 a 11) en el que destacan 9 bandas de absorción, 7 en la zona positiva
y 2 en la zona negativa del espectro, las señales positivas coinciden con la
cantidad de carbono “CH” de la piperina, sin embargo, se nota un déficit de
señales negativas, ya que se espera observar 4 bandas correspondientes a los
átomos N° 1, 2 y 6, 3 y 5, 19 que corresponden a los carbonos “CH2”, pero sólo
se aprecian 2 peaks negativos correspondientes a los átomos N° 1 y 19. Por otra
parte, al cruzar información entre ambos espectros, observando los picos
presentes en el espectro 13C RMN que no se encuentran en el 13C RMN DEPT y
con la ayuda del espectro simulado se logró identificar las señales
correspondientes a los carbonos cuaternarios, siendo los átomos N° 12, 16, 15 y
7, visualizándose a 131,3; 148,2;148,4 y 164,7 ppm respectivamente.
La información entregada por la simulación y la predicción teórica se comparó

con el espectro obtenido experimentalmente, donde este último presenta un total
de 20 bandas de absorción a diferencia del espectro simulado que entrega 15
señales coincidiendo este último con la predicción teórica. La presencia de 5
bandas de absorción adicionales en el espectro experimental se observa en el
anexo 7.
En el anexo 18 se observan 3 picos de absorción a 23,4; 24,8 y 45,4 ppm para

los átomos N° 1; 2 y 6; 3 y 5 respectivamente, mientras que en el anexo 7 se
observan 8 bandas de absorción, una de estas a 24,6 ppm para el átomo N°1 y
las 7 señales restantes van desde el rango de 39,4 a 40,6 ppm, estas señales
deberían corresponder tanto para los átomos N° 2, 3, 5 y 6, además no se
descarta el hecho de que también correspondan a los átomos de carbono del
DMSO, ya que su señal aparece aproximadamente a 40,1 ppm (anexo 22).
Ensayo de citotoxicidad
La evaluación de la citotoxicidad de la piperina se realizó mediante el ensayo

MTT, el cual se basa en medir la actividad metabólica de las células luego de ser
expuestas por un período determinado a un compuesto de interés.
Discusión
Se realizó un primer ensayo MTT con un amplio rango de concentraciones para

identificar de forma general el rango de concentraciones en el que se observa
toxicidad celular asociada a la piperina. En este ensayo hubo una disminución
significativa en la viabilidad celular para las concentraciones de 100 y 500 µg/mL
respecto al control positivo el cual corresponde al 100% de viabilidad celular. Los
resultados para las concentraciones de 100 y 500 µg/mL no presentaron
diferencias entre ellas y tampoco al compararlas con el control solvente, sin lograr
discernir si la disminución de la viabilidad celular se debe a la piperina o a la
presencia del DMSO. El no presentar una disminución significativa de la
viabilidad celular con las concentraciones de 1 y 10 µg/mL indica de manera
general que la citotoxicidad de la piperina es dosis dependiente, siempre y
cuando la toxicidad observada para las concentraciones 100 y 500 µg/mL no se
deban al DMSO.
Debido a estos resultados y esperando determinar de manera más precisa la

concentración a la que la piperina presenta citotoxicidad se decidió repetir el
ensayo, esta vez utilizando una mayor cantidad de concentraciones dentro del
rango de 10 y 100 µg/mL que son las concentraciones intermedias que
presentaron distintos resultados en el primer MTT, se mantuvo la concentración
de 500 µg/mL para corroborar si la toxicidad producida por la piperina era
“saturable” al no presentar diferencias con los 100 µg/mL.
En este segundo ensayo MTT los pocillos correspondientes a la concentración

de 500 µg/mL presentaron 0% de viabilidad celular, superando el efecto citotóxico
observado en los pocillos correspondientes a la concentración de 100 µg/mL y
control solvente de este nuevo ensayo, este resultado indica que la piperina a
concentraciones elevadas posee una marcada citotoxicidad, contradiciendo los
resultados obtenidos en el primer MTT, aunque no se puede descartar por
completo que la citotoxicidad observada se deba a un efecto conjunto producido
también por la presencia del DMSO ya que en este nuevo ensayo la
concentración de 100 µg/mL presentó una disminución de la viabilidad celular
similar a la producida por el control solvente. Las concentraciones 50 y 80 µg/mL
Discusión
además de presentar una disminución significativa de la viabilidad celular

respecto al control positivo, mostraron una disminución respecto al control
solvente, confirmando de esta manera que la piperina presenta citotoxicidad
independiente al solvente. Estos resultados sumados al hecho de que las
concentraciones de 10 y 30 µg/mL no presentaron disminución significativa de la
viabilidad celular respecto al control positivo, muestra que el efecto citotóxico de
la piperina es dosis dependiente.
La diferencia en los resultados observados para la concentración de 500 µg/mL

de cada ensayo puede deberse principalmente a la baja solubilidad que presenta
la piperina en solución acuosa, lo que provocó que al preparar esta solución se
formara una suspensión de la piperina en el medio utilizado. El hecho que no sea
una solución homogénea puede generar una gran variabilidad al momento de
agregar esta solución al pocillo con células. Considerando esta situación es
probable que los resultados del segundo MTT sean más representativos, ya que
se realizaron teniendo más experiencia práctica en el manejo de los materiales y
preparación de la solución de piperina en medio de cultivo respecto al primer
MTT.
Como se mencionó previamente el ensayo MTT se basa en la medición de la

actividad metabólica, sin entregar más información respecto a si la citotoxicidad
observada corresponde a una disminución de la actividad metabólica o a una
reducción del número de células(25), por lo que en este estudio no se elucidó el
mecanismo por el cual se generó la toxicidad celular.
Se han propuesto mecanismos de citotoxicidad de la piperina para algunas líneas

celulares (U2OS y 4T1), estos mecanismos son la detención del ciclo celular en
las fases G2 y M para ambas líneas celulares y también la inducción de la
apoptosis por aumento de la actividad de la caspasa 3 para las células 4T1(17, 18).
Hay que considerar que estas líneas celulares corresponden a células epiteliales,
mientras que las células RAW 264.7 corresponden a macrófagos, por lo que no
se puede asumir que el mecanismo de toxicidad sea el mismo. Por esta razón se
espera que para futuros estudios se evalúen marcadores celulares al exponer las
Discusión
células RAW 264.7 a la piperina para lograr elucidar el o los posibles mecanismos
de citotoxicidad.
.
Capítulo VII: Conclusiones
Conclusiones
7. CONCLUSIONES
Se logró aislar y purificar la piperina a partir de pimienta negra molida utilizando

3 variaciones de un mismo procedimiento, el rendimiento fue bajo para todos los
procedimientos. En base a lo discutido el procedimiento en general puede ser
mejorado para aumentar el rendimiento final que tan sólo fue de 9,9% en el mejor
de los casos.
Se identificó el compuesto cristalizado como piperina luego de comparar los Rf

de los cristales con un patrón estándar USP de piperina, medir el punto de fusión
para cada cristal, al realizar la resonancia magnética nuclear a los cristales del
procedimiento 3 y llevar a cabo el análisis correspondiente para cada espectro
obtenido. A pesar de que no se calculó el porcentaje de impurezas en los cristales
finales, se puede decir que el contenido de impurezas fue bajo, ya que de otra
manera los ensayos realizados para su identificación hubiesen presentado gran
cantidad de interferencia o resultados fuera de los esperados.
Se logró evaluar el efecto citotóxico de la piperina en cultivos celular de la línea

celular RAW 264.7, observando un efecto dosis dependiente, sin embargo, se
realizó el ensayo MTT sólo dos veces por lo que estos resultados pueden ser
considerados como preliminares y se deben repetir dichos ensayos para obtener
un resultado más representativo.
Dado que el ensayo MTT mide la actividad metabólica sin considerar ningún
marcador celular no fue posible elucidar un posible mecanismo de citotoxicidad
de la piperina.
Se recomienda profundizar en el estudio de los mecanismos de citotoxicidad y

actividad farmacológica de la piperina, ya que es un metabolito secundario con
amplias perspectivas en relación al uso terapéutico.
GLOSARIO
Principio activo: Sustancia o mezcla de sustancias dotadas de efecto

farmacológico específico, o bien, que sin poseer actividad farmacológica, al ser
administrada al organismo la adquieren.
Dispensación: Acto por el cual el químico farmacéutico proporciona un

medicamento a una persona, generalmente para cumplir con la prescripción de
un profesional habilitado, a través del cual se le informa y orienta sobre su uso,
influencia de los alimentos, interacciones con otros medicamentos,
reconocimiento de potenciales reacciones adversas, condiciones de su
almacenamiento u otra información relevante, todo ello de acuerdo a lo
autorizado en el registro.
Citotoxicidad/actividad citotóxica: Capacidad que pueden poseer células o

compuestos químicos de producir muerte celular o alterar la actividad metabólica
de la célula
Ensayo MTT: Es un ensayo colorimétrico de citotoxicidad metabólica en la cual

se evalúa la actividad metabólica de la célula luego de exponer las células al
compuesto en estudio (posible componente tóxico), en el ensayo MTT, la
actividad metabólica que se estudia es la capacidad de las células de reducir una
sal de tetrazolio (MTT o XTT) soluble en agua a formazan, un compuesto púrpura
e insoluble en medio acuoso
Suplemento alimenticio/dietario: Producto que contiene un ingrediente alimenticio

destinado a complementar la alimentación o nutrición del paciente. (La piperina
en sí no corresponde por definición a un suplemento alimenticio, pero así es como
se vende y lo que indica su rótulo de envase)
RAW 264.7: Corresponde a macrófagos murinos producidos en rata con virus de

leucemia murina de Abelson.
Patrón estándar USP: Corresponde al compuesto químico con un alto grado de
pureza obtenido a través de la farmacopea de los Estados Unidos y que se utiliza
para demostrar la identidad, concentración, pureza y calidad de medicamentos,
suplementos alimenticios y principios activos.
Cromatografía en capa fina: Es una técnica de separación e identificación de

compuestos químicos, que se fundamenta en la distinta polaridad que presentan
los compuestos. Generalmente se utiliza una placa de gel de sílice como fase
estacionaria, mientras que el solvente utilizado como fase móvil es más variable
e incluso se utilizan mezclas de solventes.
Banda de extinción: Corresponde a las marcas observables en la placa

cromatográfica, ya sea a simple vista o mediante luz UV generadas por los
compuestos que han sido adsorbidos durante la cromatografía
Droga vegetal: La planta o parte de ella sin procesar, usadas con un propósito
medicinal o farmacéutico.
Impurezas: Cualquier componente que no esté definido como constituyente de la

materia prima o producto. En este caso las impurezas corresponde a cualquier
compuesto adicional que se haya extraído de la pimienta negra que no
corresponda a piperina.
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
CFA: Ácidos grasos acetilados
IL – 6: Interleucina 6
MMP – 13: Metaloproteinasa de matriz 13
CI50: Concentración inhibitoria 50
IgM: Inmunoglobulina M
USP: Farmacopea de los Estados Unidos
DCM/CH2Cl2: Diclorometano
C6H14: Hexano
1H-RMN: Resonancia magnética nuclear de protones
13C-RMN: Resonancia magnética nuclear de carbono 13
DEPT: Ampliación sin distorsión por transferencia de polarización
DMSO: Dimetilsulfóxido
µg: Microgramo
µL: Microlitro
mg: Miligramo
mL: Mililitro
nm: Nanómetro
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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tuberculatum Species Using Multilamellar Vesicles and Determination of its
Antioxidant Power
(29) Química Orgánica. Mc Murry J. 8th edición. Determinación estructural:

Espectroscopía de resonancia magnética nuclear. (p 465 – 474).
ANEXOS
Anexo 1 Cromatografía en capa fina, placa E. Observada a 254 nm
Anexo 2 Espectro 1H RMN experimental de piperina. Obtenido de MestReNova

Anexo 3 Ampliación de espectro 1H RMN en el rango de δ 0,75 - 4,0. Obtenido
de MestReNova

MestReNova
MestReNova
Anexo 6 Espectro 13C RMN experimental de piperina. Obtenido de
MestReNova
MestReNova
MestReNova
Anexo 9 Espectro 13C RMN DEPT experimental de piperina. Obtenido de
MestReNova
Anexo 12 Espectro 1H RMN simulado de piperina. Obtenido de MestReNova


El análisis realizado al espectro 1H RMN simulado se resume en la tabla del
anexo 16.
Anexo 16 Resumen de información recopilada del espectro 1H RMN simulado

de piperina. Obtenido de MestReNova
Átomo de carbono Peak Integral/N° de Multiplicidad J
correspondiente protones
1 1,67 3 - Multiplete -
2y6 1,70 3 - Multiplete -
3y5 3,38 – 3,35 4 - Multiplete -
19 5,9 2 Multiplete -
17 6,85 1,52** Singulete -
10 6,87 0,42** Singulete -
* Corresponde a la constante de acoplamiento en Hz
**Ambos peak muestran una especie de “acoplamiento” al momento de visualizar a qué átomo corresponde
a cada señal, esto puede explicar que los valores de la integral sean 1,52 y 0,42, los que al sumarlos daría
1,94 dando un valor cercano a 2, valor que correspondería teóricamente a los 2 protones que entregan las
señales observadas.
Anexo 17 Espectro 13C RMN simulado de piperina. Obtenido de MestReNova

El análisis realizado al espectro 13C RMN simulado se muestra en el anexo 20.
Anexo 20 Señales observadas en el espectro 13C RMN simulado de piperina.

N° del(los) átomo(s) de Carbono Desplazamiento químico
1 23,42
2y6 24,89
3y5 45,40
19 102,12
17 108,83
14 108,97
13 122,18
8 122,37
10 128,64
12 131,27
11 137,09
9 142,79
16 148,30
15 149,21
7 166,55
Anexo 21 Espectro 1H RMN simulado del DMSO. Obtenido de MestReNova
Anexo 22 Espectro 13C RMN simulado del DMSO. Obtenido de MestReNova
Anexo 23 Fórmulas de Absorbancia real y porcentaje de viabilidad celular

utilizadas en ensayoMTT

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UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO

Escuela de Química y Farmacia

“AISLAMIENTO DE PIPERINA A PARTIR DE PIMIENTA NEGRA

Unidad de investigación para optar al título de Químico Farmacéutico.

Bastián Andrés Ponce Rivera

Director: Dra. Maite Rodríguez Diaz

Codirector: Dra. María Carolina Otero Acuña

Santiago de Chile, 2019.

Escuela de Química y Farmacia

“AISLAMIENTO DE PIPERINA A PARTIR DE PIMIENTA NEGRA

Bastián Andrés Ponce Rivera

Dra. Maite Rodríguez Díaz Dra. María Carolina Otero Acuña

Santiago de Chile, 2019.

Escuela de Química y Farmacia

“AISLAMIENTO DE PIPERINA A PARTIR DE PIMIENTA NEGRA

Bastián Andrés Ponce Rivera

Profesor(a) Corrector: QF. Carmen Sandoval Moraga

Profesor(a) Corrector: Dra. Maritza Díaz Gómez

Santiago de Chile, 2019.

Nota Final = 6,9

Doy fe de la veracidad de esta información

Q.F. Catalina Cano Abásolo

QF. Carmen Sandoval Moraga, Químico Farmacéutico de la Universidad de

Dra. Maritza Díaz Gómez, Licenciada en Química, Universidad de La Habana con

Dra. Maite Rodríguez Díaz. Químico Farmacéutico Universidad Central de Las

Dra. María Carolina Otero Acuña, Doctorado en Inmunología en Konstanz,

A mi familia Marta, Reinaldo, Fabián, Ignacio,

Jack, Princesa y Bonnie

Tantas personas a quien agradecer por formar parte de mi formación profesional,

Agradecer también a la Dra Verónica Romero y Valeria Jorquera por su apoyo

INDICE DE FIGURAS ......................................................................................... 8

INDICE DE TABLAS ......................................................................................... 10

INDICE DE ANEXOS ........................................................................................ 11

Capítulo I: Introducción ..................................................................................... 15

Capítulo II: Hipótesis ......................................................................................... 25

Capítulo III: Objetivos ........................................................................................ 27

Capítulo IV: Metodología .................................................................................. 29

Capítulo V: Resultados ..................................................................................... 62

5.1. Procedimiento 1 ..................................................................................... 63

Capítulo VI: Discusión ....................................................................................... 84

Capítulo VII: Conclusiones .............................................................................. 101

GLOSARIO ..................................................................................................... 103

GLOSARIO DE ABREVIATURAS................................................................... 105

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 106

ANEXOS ......................................................................................................... 109

Figura 1Clasificación general de alcaloides. Obtenido de "Farmacognosia"

Tabla 1 Valores obtenidos en etapa de pesado de pimienta negra molida

Anexo 1 Cromatografía en capa fina, placa E. Observada a 254 nm ............ 109

La farmacognosia, etimológicamente proviene de dos conceptos pharmacon

Algunos objetivos de la farmacognosia son:

- Establecer la composición química de la droga con respecto a los

Esto hace que la farmacognosia sea un pilar fundamental en el marco de la

Enfocándonos en el reino vegetal, la fitoquímica puede ser considerada una rama

productos del metabolismo de los vegetales(5) . Siendo de mayor interés los

Los alcaloides son un grupo de compuestos con gran variedad estructural,

alcaloides N-óxidos. Normalmente las especies que contienen alcaloides

La mayoría de los alcaloides poseen oxígeno en su estructura y son sólidos

Se pueden clasificar según su estructura y su origen

Figura 1Clasificación general de alcaloides. Obtenido de "Farmacognosia"

alcaloides. El fundamento de esta reacción se encuentra en la capacidad que

El método general de extracción de alcaloides se realiza humedeciendo la droga

Pimentero común (Piper nigrum)