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FACULTAD DE CIENCIAS –QUÍMICA FARMACÉUTICA

ANÁLISIS INSTRUMENTAL
LABORATORIO ANÁLISIS INSTRUMENTAL

PRÁCTICA No. 4 y 5

PARÁMETROS BÁSICOS EN LA ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO COLORIMÉTRICO

¨DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DEL HIERRO¨

En numerosas técnicas analíticas se aprovecha la reactividad de compuestos orgánicos frente a

compuestos inorgánicos, mediante reacciones de oxido - reducción. Una reacción de oxido-reducción es
una reacción que implica transferencia de electrones, como es el caso de una reducción que significa la
ganancia de electrones.

Generalmente cuando se utilizan tales compuestos orgánicos, éstos pueden llegar a ser bastante
selectivos puesto que, los compuestos orgánicos utilizados para determinaciones colorimétricas por
ejemplo forman complejos para facilitar el revelado de coloración y además se les regula el pH para
facilitar el desarrollo de estas reacciones, teniendo en cuenta que el pH que es una medida de la acidez
de disoluciones definida como el logaritmo negativo de la concentración del ión hidrónio (H3O+) presentes
en mol/L.

Entre los compuestos orgánicos empleados para tal fin se encuentra la hidroquinona y la ortofenantrolina.
La hidroquinona es un derivado fenólico y agente reductor debido a que, el fenol presente en su estructura
se oxida permitiendo fácilmente la reducción de otros compuestos inorgánicos como la plata y el hierro
cuando entran en contacto. Por otro lado, la ortofenantrolina es un compuesto orgánico también
conocido como 1,10- fenantrolina, utilizado principalmente como un indicador de color al formar
complejos estables como lo es en el caso del hierro, ya que este compuesto tiene un par de átomos de
nitrógeno en posición adecuada para que cada uno forme un enlace covalente con el ión hierro.

Es así como la determinación colorimétrica del hierro se basa principalmente en la reducción del hierro
férrico presente en una muestra dada, a hierro ferroso por acción de la hidroquinona. Posteriormente el
hierro ferroso reacciona con la ortofenantrolina y se forma un complejo de color rojo naranja, cuando se
realiza la regulación del pH para que se pueda apreciar tal coloración.

En el caso de la determinación colorimétrica de hierro, la espectrofotometría es de vital importancia para

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así poder conocer la cantidad de hierro presente en una mezcla o muestra problema, generalmente ésta
metodología se realiza principalmente para control de niveles de concentración de hierro en agua, suelos
y alimentos especialmente aquellos fortificados. Por otro lado, a nivel clínico el hierro está presente en la
sangre; sirve para el diagnóstico de los niveles de hierro en la sangre, una deficiencia de éste puede causar
anemia, cansancio, retardos en el aprendizaje, mayores tiempos para la coagulación, por otro lado, un
exceso de este puede causar letárgicas, hinchazón del hígado y muerte por envenenamiento.

Objetivos.

1. Controlar las variables químicas que influyen sobre la estabilidad y el grado de formación del
complejo; estabilidad de la luz, concentración del ligante, pH.
2. Construir la curva de calibración para el sistema en estudio, con el método instrumental
empleado.
3. Determinar los parámetros de validación del método: la linealidad, el error fotométrico o
instrumental, la sensibilidad, el límite de detección, el límite de cuantificación, la repetibilidad, la
reproducibilidad, entre otras.

Procedimiento.

Sistema en estudio

Preparación de reactivos

 Prepare 300mL de una solución patrón de 500mg/L (ppm) en hierro, a partir de sulfato ferroso
amónico reactivo, Fe (SO4)(NH4)2(SO4)·6H2O; con 392.14 g/mol analítico, complete a volumen con
agua desionizada. Determine la concentración final de la disolución preparada en el laboratorio.
 Prepare 250mL de una dilución de 50.00ppm a partir de la disolución anterior de hierro.
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 Preparar 500mL de una solución de ortofenantrolina al 3% p/v en agua desmineralizada, a partir

del reactivo analítico, luego agregue 2ml de H2SO4 a la botella 6M. Revise periódicamente el color
de esta solución y guárdela en frasco oscuro.
 Preparar 500mL de una solución de hidroquinona al 1% p/v en agua desmineralizada, a partir del
reactivo analítico. Revise periódicamente el color de esta solución y guárdela en frasco oscuro.
 Preparar 500mL de una solución de acetato de sodio 2M en agua desmineralizada, a partir del
reactivo analítico.

Curva espectral del complejo, Establecimiento de la longitud de onda analítica.

 Determine la curva espectral del sistema Hierro – Ortofenantrolina , en el rango de 450 a 550 nm
con la disolución diluida de 5,00 ppm (No olvide ajustar 0 absorbancia, con el blanco, cuando
modifique la longitud de onda).
 Calcule el volumen de solución patrón de hierro de 50,00 ppm que permite obtener una
disolución de hierro de 5,00 ppm en un volumen final de 50,00mL.
 Mida con pipeta aforada la alícuota según el cálculo anterior y colóquela en un balón aforado de
50mL.
 Se le agregan 4 ml de acetato de sodio 2M, luego, se le adiciona al balón 4ml de hidroquinona,
luego 4ml ortofenantrolina, se agita y se deja en reposo por 5 min. complete a volumen con agua
desmineralizada.
 En otro balón simultáneamente, prepare el blanco de reactivos con 20 ml de agua, 4 ml de
acetato de sodio 2M, más 4ml de hidroquinona y luego 4ml ortofenantrolina, se agita y se deja
en reposo por 5 min, para luego llevar a afore con agua desmineralizada.
 Realice lecturas cada 10 nm iniciando de 450 a 550 nm, utilice el balón del blanco como referencia
para ajustar el equipo espectrofotómetro UV-Vis cada vez que cambie la longitud de onda y
establezca la longitud de onda de máxima absorbancia (Lmax), esta será la longitud de onda
analítica para el sistema en estudio.

Formación del complejo o desarrollo de color

 Calcule el volumen de solución patrón de hierro de 50,00 ppm que permite obtener una disolución
de hierro de 5,00 ppm en un volumen final de 50,00mL.
 Mida con pipeta aforada la alícuota según el cálculo anterior y colóquela en un balón aforado de
50mL.
 Se le agregan 4 ml de acetato de sodio 2M, luego, se le adiciona al balón 4ml de hidroquinona,
luego 4ml ortofenantrolina, se agita y se deja en reposo por 2 min. complete a volumen con agua
desmineralizada.
 En otro balón simultáneamente, prepare el blanco de reactivos con 20 ml de agua, 4 ml de acetato
de sodio 2M, más 4ml de hidroquinona y luego 4ml ortofenantrolina, se agita y se deja en reposo
por 2 min, para luego llevar a afore con agua desmineralizada.
 Utilice el balón del blanco como referencia para ajustar el equipo espectrofotómetro UV-Vis y
realice 5 lecturas de la absorbancia cada 3 min (15 min.), colocando el espectrofotómetro en la
Lmax que será la longitud de onda analítica para el sistema en estudio.
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Determinación de la estabilidad del color del complejo Fe+2 – Ortofenantrolina frente a la luz

 Coloque en el espectrofotómetro la Lmax que será la longitud de onda analítica para el sistema en
estudio.
 Prepare dos soluciones patrón del complejo de 5,00 ppm en hierro de acuerdo con el
procedimiento base (de igual forma como se realizó en el paso anterior). Coloque una de las
soluciones en la oscuridad y la otra expóngala a la luz de una bombilla.
 Tome medidas de Absorbancia, cada cinco minutos para las dos soluciones durante ½ hora, no
olvide ajustar el equipo con el blanco de reactivos.
 Haga una gráfica de A vs tiempo para cada solución en la misma hoja de Excel. Discuta y concluya
sobre la estabilidad del complejo y el momento en el que se obtiene la mayor lectura de
absorbancia.

Determinación del efecto de la concentración de ortofenantrolina en la intensidad del color del

complejo Fe2+ - Ortofenantrolina

 Tome en cuatro balones de 50,00 mL, las alícuotas para preparar 4 disoluciones patrón de 5,00
ppm en Hierro en cada uno, de acuerdo con el procedimiento base, se le agregan 4 ml de acetato
de sodio 2M, luego, se le adiciona al balón 4ml de hidroquinona, y se cambia el volumen de
ortofenantrolina así: 0.5 mL, 1.0 mL, 2 mL y 4,0 mL, mida la absorbancia contra el blanco a la Lmax
y según la mejor condición luz-oscuridad-tiempo determinada en el paso anterior.
 Grafique Absorbancia del complejo vs concentración de Ortofenentrolina en la disolución.
 Escoja el valor óptimo del ortofenentrolina.

Determinación del efecto del pH en la intensidad del color del complejo Fe3+ - Ortofenantrolina

Tome en cuatro balones de 50,00 mL, las alícuotas para preparar disoluciones patrón de 5,00 ppm en
Hierro en cada una, de acuerdo con el procedimiento base, pero variando pH entre 1,0; 4,0 y 10,0.

 En un vaso de 50mL agregue 5,00mL de Fe2+ de 50,00 ppm y H2O hasta un volumen aproximado
de 20mL. Se le agregan al balón 4ml de hidroquinona, luego 4ml ortofenantrolina, NO adicione
solución de acetato de sodio, sumerja los electrodos del pH-metro y ajuste el pH a 1,0
(aproximado), adicionando gotas de HCl 1M a la solución. A continuación, prepare los otros
balones ajustando de igual manera el pH con HCl o NH3. Se agita y se deja en reposo por 2 min.
complete a volumen con agua desmineralizada.
 Repita el procedimiento para los otros valores de pH cercanos a 4 y a 10. adicionando gotas de
HCl o NH3 concentrados o diluidos según el caso.
 Anote el valor de pH obtenido con las cifras que da el instrumento. Lea la absorbancia y utilice el
blanco para calibrar el equipo a Lmax.
 Construya la gráfica de Absorbancia del complejo vs pH.
 Escoja el valor de pH óptimo para la formación del complejo.
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Construcción de la curva de calibración del complejo Fe3+ - Ortofenantrolina

 Rotular 6 balones aforados de 50ml con concentraciones de 1, 2, 4, 6, 8 y 10 ppm. Calcule el

volumen de solución patrón de hierro de 50,00 ppm que permite obtener cada una de estas
disoluciones de hierro de 1, 2, 4, 6, 8 y 10 ppm en un volumen final de 50,00mL.
V1xC1=V2xC2

 A cada balón se le añade aproximadamente 20 ml de agua; se le agregan 4 ml de acetato

de sodio 2M, para ajustar aproximadamente el pH entre 3,5 – 4,0
 Se le adiciona a cada balón 4ml de hidroquinona y luego 4ml ortofenantrolina, se agita y
se deja en reposo por 2 min. A continuación, se completa con agua hasta el aforo de cada balón
y se homogeniza
 En otro balón rotulado como blanco, se prepara el blanco de reactivos con 20 ml de agua, se le
agregan 4 ml de acetato de sodio 2M, mas 4ml de hidroquinona y luego 4ml ortofenantrolina, se
agita y se deja en reposo por 2 min, para luego llevar a afore.
 Recibir una muestra problema (8mL) en un tubo de ensayo, después colocar la muestra problema
en el balón de 250ml, diluir hasta el aforo y homogenizar.
 Tomar una alícuota de 10ml del balón con la muestra problema diluido (balón de 250ml) y
trasládelo a un balón de 50ml.
 Añadir 15ml de agua, adicionar 4ml de la solución de acetato de sodio, agregar al balón 4ml de
hidroquinona, 4ml de ortofenantrolina, agitar y se deja en reposo por 2 min. A continuación,
completar con agua hasta el aforo y homogenizar.
 En el espectrofotómetro UV-Vis previamente calibrado con la solución blanco a la Lmax. (longitud
de onda de máxima absorbancia), leer los patrones y el problema.
 Realizar, la gráfica de calibración teniendo en cuenta los resultados de Absorbancia de cada uno
de los patrones y su concentración en el programa Excel, determine el R2 (coeficiente de
determinación) y la ecuación de la recta.
 Determine la concentración de la muestra problema en el balón de 50 mL empleando dos de los
métodos que conocen. A partir de este dato calcule la concentración de Fe2+ presente en la
muestra inicial (balón de 250 mL) y los gramos de Fe2+
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Determinación de la repetibilidad y construcción de la carta de dispersión para el sistema del

complejo Fe3+ - Ortofenantrolina.

 Prepare 4 veces una solución patrón (tres balones) del complejo concentración de 5,0 ppm en
Fe2+, según el procedimiento establecido con los parámetros optimizados.
 Lea la absorbancia para cada una y utilice el blanco para calibrar el equipo a Lmax.

Determinación de la Precisión.

 Mida 10 veces la absorbancia de cada una de las soluciones patrón preparadas en el numeral
anterior, llevando a cero la Absorbancia con la solución blanco antes de cada medida.
 Determine los parámetros estadísticos: media aritmética, desviación estándar, coeficiente de
variación e intervalo de confianza de los resultados.

Determinación del límite de detección para soluciones del complejo Fe3+ - Ortofenantrolina

 Mida la absorbancia 10 veces de la solución blanco.

 Calcule el límite de detección
 Calcule el límite de cuantificación.