“Microepidemiología comparativa de brotes de virus de la influenza

aviar patógena en una población de aves silvestres”

Comprender la dinámica epidemiológica del virus de la influenza aviar altamente
patógena (IAAP) en las aves silvestres es fundamental para orientar medidas eficaces de
vigilancia y control. La propagación de H5 IAAP ha sido bien caracterizada en grandes
escalas geográficas y temporales. Sin embargo, la información sobre la dinámica
detallada y la demografía de brotes individuales en aves silvestres es escasa y se
desconocen parámetros epidemiológicos importantes. Presentamos datos de una
población silvestre de aves longevas (cisnes mudos; Cygnus olor) que ha experimentado
tres brotes de IAAP H5 relacionados en la última década, específicamente, H5N1
(2007), H5N8 (2016) y H5N6 (2017). Se disponía de datos demográficos detallados y se
realizaron muestreos intensos antes y después de los brotes; por lo tanto, la población es
excepcionalmente adecuada para explorar la epidemiología natural, la evolución y la
ecología del IAAP en aves silvestres. Mostramos que las características epidemiológicas
clave siguen siendo notablemente consistentes en múltiples brotes, incluido el momento
de la incursión del virus y la duración del brote, y la presencia de una fuerte estructura
de edad en la morbilidad que probablemente surge de una estructura de edad
equivalente en las respuestas inmunológicas. La previsibilidad de estas características a
lo largo de una serie de brotes en una población natural compleja es sorprendente y
contribuye a nuestra comprensión de IAAP en aves silvestres.
Este artículo forma parte del número temático "Modelización de brotes de enfermedades
infecciosas en humanos, animales y plantas: enfoques y temas importantes". control'.
INTRODUCCIÓN:
Los virus de la influenza aviar altamente patógena (IAAP) representan una amenaza
continua y grave para la salud humana y animal. Además, la propagación de IAAP a las
aves de corral de granja puede causar un gran daño económico, a través de la reducción
de la producción, las restricciones comerciales y los costos directos de las medidas de
control de emergencia, como el sacrificio de ganado [1]. Si bien las aves acuáticas
silvestres son el principal reservorio huésped de los virus de influenza aviar de baja
patogenicidad (IABP), la mayoría de las cepas altamente patógenas se han detectado en
el pasado principalmente en aves de corral [2] o en humanos, donde ocasionalmente
causan enfermedades graves [3]. Sin embargo, un linaje extenso y diverso de IAAP se
desvía de este paradigma: los virus que pertenecen al clado 2.3.4.4 del subtipo H5 de
influenza aviar y que descienden del linaje GsGd (A/goose/Guangdong/1/1996) parecen
transmitirse de manera eficiente entre las aves silvestres [4 ]. La propensión de este
virus a la circulación en las aves silvestres se ha asociado con la diversificación del
virus a través del reordenamiento del genoma y con su propagación mundial sin
precedentes. Se han detectado cepas del linaje GsGd en América del Norte, África,
Europa y Asia [4].
En el contexto de la aparición y persistencia de H5 IAAP, comprender la dinámica
epidemiológica de la influenza aviar en aves silvestres es fundamental para el desarrollo
de medidas de vigilancia y control efectivas que apunten a salvaguardar la salud del
ganado y las poblaciones humanas. Datos sobre IAAP en aves silvestres en cada brote
Las ubicaciones suelen limitarse a la fecha de detección confirmada del virus, el número
de aves muertas y las especies hospedantes involucradas. Las compilaciones de dichos
informes se utilizan para estudiar las distribuciones geográficas y temporales de los
casos de IAAP detectados en aves silvestres a escala continental o regional [5–8 ].Por el
contrario, los análisis detallados a nivel de población de la epidemiología y la
transmisión de IAAP para brotes individuales son raros. Casi no hay datos disponibles
sobre el impacto de los brotes secuenciales o las incursiones del virus en la misma
población de aves silvestres, a pesar de la existencia de al menos un sitio donde se
detectó IAAP en cinco ocasiones diferentes [9]. La escasez de información a nivel
individual para las poblaciones de aves silvestres afectadas por IAAP significa que
siguen sin conocerse los parámetros epidemiológicos clave que podrían utilizarse para
perfeccionar las medidas de vigilancia y control.
Es necesario comprender las respuestas inmunológicas al IAAP en las aves silvestres
para comprender y predecir el riesgo de que el virus se vuelva enzoótico en las
poblaciones de aves silvestres. Solo en Europa, los estudios serológicos sugieren que
hasta un tercio de las aves silvestres de algunas especies pueden haber sido infectadas
por IAAP [8]. Sin embargo, en la mayoría de las poblaciones silvestres, es difícil
capturar la misma ave varias veces durante largos períodos de tiempo, lo que dificulta la
evaluación de la duración de las respuestas inmunitarias específicas del virus de la
influenza aviar (VIA), o el grado en que la exposición inicial podría ayudar a proteger
contra infecciones posteriores. . Los estudios experimentales de desafío en el laboratorio
han demostrado que la infección primaria de patos con algunos IAAP H5, o con ciertos
IABP, puede prevenir la diseminación del virus en el desafío posterior con IAAP H5
(por ejemplo, [10,11]). Sin embargo, tales estudios a menudo están limitados por el
requisito experimental de un período de tiempo corto entre la infección primaria y la
secundaria, lo que dificulta evaluar el efecto protector de infecciones previas en
poblaciones de aves silvestres, donde la infección primaria puede ocurrir años antes de
la exposición secundaria. Cuantificar la duración durante la cual las aves silvestres
retienen anticuerpos contra IAAP y IABP, cómo se distribuyen estas respuestas dentro
de una población y cómo influyen en la susceptibilidad a la exposición posterior a H5
IAAP, son aspectos importantes para comprender la base biológica de los patrones de
infección que observamos en todo el mundo.
Aquí, informamos la "microepidemiología" detallada de los brotes recurrentes de H5
IAAP, que ocurrieron en una sola población de aves silvestres mientras esa población
estaba bajo observación y muestreo longitudinal. Este escenario inusual nos permitió
cuantificar las respuestas serológicas dentro de la población afectada antes y después de
una epidemia de IAAP. Nuestra población de estudio comprende una gran población de
cisnes mudos (Cygnus olor) que han sido infectados naturalmente por tres virus IAAP
diferentes pertenecientes a dos clados genéticos (2.2 y 2.3. 4.4) durante la última
década; H5N1 en 2007/08 [12], H5N8 en 2016/17 y H5N6 en 2017/18. Es importante
destacar que estas aves han sido objeto de estudios ornitológicos durante más de 60 años
y, por lo tanto, se dispone de información demográfica detallada para la población y las
aves individuales dentro de ella. Por lo tanto, la población es particularmente adecuada
para explorar la epidemiología natural, la evolución y la ecología del IAAP en aves
silvestres con un alto grado de precisión y certeza. Mostramos que las características
epidemiológicas clave son consistentes y predecibles a través de múltiples brotes en una
población natural compleja y discutimos las implicaciones de estos hallazgos para la
transmisión de IAAP en aves silvestres.
MATERIAL Y MÉTODOS:
a) Sitio de campo, población y muestreo:
La laguna Fleet (Dorset, Reino Unido, 50.65378N, 2.60288W) alberga una gran
población de cisnes mudos (Cygnus olor) salvajes, centrada en Abbotsbury
Swannery. El tamaño de la población cambia estacionalmente y entre años, pero
normalmente oscila entre 600 y 1000 aves. Los cisnes nacidos en el sitio se marcan
con marcadores de identificación únicos aproximadamente 24 h después de la
eclosión que se reemplazan con anillos de adultos aproximadamente a los cuatro
meses de edad. Relativamente pocas aves que eclosionan localmente se alejan de la
Flota [13]. Cada 2 años, todos los cisnes presentes en la laguna Fleet son capturados,
anillados, pesados y registrados, cuando es posible, su año de nacimiento y/o sexo.
Como consecuencia, se conocen datos detallados sobre la fecha de eclosión y el
sexo de la mayoría de los cisnes en Fleet Lagoon. Las aves individuales pueden
identificarse mediante identificaciones únicas que llevan en dos anillos de patas
diferentes (un anillo de metal, suministrado por el British Trust for Ornithology, y
un anillo de Darvic, que permite la identificación visual de largo alcance). Las aves
que se pensaba que estaban en la población en el momento de cada brote se
estimaron a partir de los datos del censo, de acuerdo con los detalles del material
complementario electrónico. Tenga en cuenta que en este documento, usamos el
término "juveniles" para referirnos a las aves que tienen menos de 1 año, y "adultos"
para referirnos a las aves que son mayores.
Se recolectó un total de 519 muestras de sangre de 404 cisnes en Fleet Lagoon
durante junio de 2017, julio de 2017, noviembre de 2017, enero de 2018 y junio de
2018 (licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido PPLP516CDFB6).
También se tomó un hisopo cloacal y un hisopo orofaríngeo de cada ave de la que se
tomaron muestras de sangre.
b) Pruebas serológicas:
Los sueros se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra la
nucleoproteína (NP) del VIA utilizando el AIV IDEXX Influenza A AbELISA, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron ensayos de inhibición de
la hemaglutinación (HI) para cada muestra que dio positivo por NP-ELISA usando
dos antígenos inactivados, IABP H5N3 (A/Teal/England/7394-2805/06) y IAAP
H5N8 (A/Turkey/England/052131/16 ). Los ensayos de HI se realizaron de acuerdo
con los métodos estándar (se proporcionan más detalles en el material
complementario electrónico).
c) Vigilancia epidemiológica durante brotes de IAAP:
Los cisnes muertos encontrados en el sitio de Swannery son informados por el
personal a la Agencia de Sanidad Animal y Vegetal (Reino Unido) (ASAV) y
pueden someterse a una autopsia y a pruebas para detectar enfermedades de
notificación obligatoria. Tras la detección de IAAP H5 en el sitio en diciembre de
2007, diciembre de 2016 y diciembre de 2017, se recolectaron hisopos orofaríngeos
y cloacales de todas las aves muertas de cualquier especie, cuando fue posible, y se
 procesaron en ASAV (en el material complementario electrónico se proporcionan
más detalles sobre la vigilancia del sitio durante los años del brote).
No todas las aves que murieron durante el brote de H5N8 pudieron ser analizadas
para VIA. Los análisis epidemiológicos para el brote de H5N8 realizados aquí (ver
más abajo), por lo tanto, asumen que las aves muertas no analizadas que se
encontraron durante el brote de H5N8 fueron positivas para IAAP (consulte el
material electrónico complementario, figura S1 para obtener detalles sobre qué aves
fueron analizadas). La tasa típica de mortalidad de aves ajustada por edad en las
mismas semanas durante años sin epidemia es dramáticamente más baja (aprox. 12
muertes registradas por cada 1000 aves; datos promediados entre 2009 y 2015) que
la tasa de mortalidad observada durante el pico de la epidemia H5N8
( aproximadamente 143 muertes por cada 1000 aves, basado en el tamaño de la
población contemporánea). Por lo tanto, podemos suponer razonablemente que casi
todas las aves no analizadas en el momento del brote de H5N8 murieron de IAAP.
d) Detección y secuenciación de ARN viral:
Se analizaron hisopos cloacales y orofaríngeos individuales para detectar la
presencia de VIA en ASAV. El ARN se extrajo con los minikits de ARN
QIAampViral y las muestras se analizaron para detectar la presencia de ARN del
virus de la influenza aviar utilizando protocolos de PCR cuantitativa con
transcriptasa inversa (RT-qPCR) publicados anteriormente [15–17] (consulte el
material complementario electrónico para obtener más detalles).
Las muestras positivas para H5N8 de enero de 2017 se transcribieron inversamente,
se amplificaron mediante un método de PCR multiplex y se secuenciaron mediante
el dispositivo MinION de Oxford Nanopore Technologies, siguiendo una adaptación
de los métodos anteriores [18]. Las muestras positivas para H5N6 de enero de 2018
se secuenciaron en un IlluminaMiSeq utilizando un enfoque metagenómico no
específico (consulte el material complementario electrónico para obtener más
detalles sobre los enfoques de secuenciación).
e) Análisis filogenético:
Se descargó de GISAID (www.gisaid.org) un conjunto de datos de cepas H5
euroasiáticas con fechas de recolección en o posteriores a 2013 y se usó para la
reconstrucción filogenética (consulte el material complementario electrónico para
obtener detalles del conjunto de datos). Las alineaciones para cada segmento se
completaron utilizando la versión de MUSCLE implementada en Geneious 8.1.7.
Las filogenias del reloj molecular se estimaron para el gen VIA HA utilizado el
enfoque de la cadena bayesiana de Markov Monte Carlo (MCMC) implementado en
BEAST [19–21]. La señal temporal adecuada para el análisis del reloj molecular se
confirmó utilizando TempEst. Se calcularon dos corridas MCMC independientes de
150 000 000 pasos bajo un modelo de reloj molecular estricto, un modelo de
sustitución de nucleótidos SRD06 y un previo coalescente de tamaño de población
constante. Los árboles fueron muestreados cada 20 000 pasos, con el primer 10%
descartado como quemado. La convergencia de las ejecuciones de MCMC se
verificó con Tracer y los árboles de máxima credibilidad de clade se calcularon con
TreeAnnotator.
Para los otros siete segmentos, se estimó un árbol filogenético preliminar utilizando
la unión de vecinos, con distancias genéticas de Jukes-Cantor. Si se observaron
varios clados grandes genéticamente distintos (típicamente representando genes
 internos reordenados), entonces se extrajo el clado que contenía las secuencias de
este estudio. Estas secuencias extraídas luego se usaron para estimar las filogenias
de máxima verosimilitud (MV) usando PhyML, incluyendo Réplicas de arranque de
100ML para evaluar el soporte estadístico. Se eligió un modelo de sustitución
apropiado para cada filogenia de MV utilizando el enfoque BIC implementado en
jModelTest.
f) Análisis epidemiológicos:
Los números básicos de reproducción (R0) para los brotes de H5N8 y H5N6 se
estimaron usando el paquete R0 [27]. R0 no se estimó para el brote de H5N1 porque
se observaron muy pocos casos durante ese brote. El número de cadáveres de cisnes
observados se utilizó como indicador indirecto de los recuentos de casos de IAAP.
Se especificó una distribución para el tiempo de generación de la epidemia, obtenida
de estudios de laboratorio que observaron el tiempo entre la inoculación
experimental de gansos o patos con H5N8 y el tiempo hasta la infección
subsiguiente de las aves de contacto.
La mayoría de las muertes ocurrieron en aves juveniles (menores de 1 año).
Probamos los posibles efectos del último peso conocido o la edad exacta sobre la
probabilidad de muerte de aves juveniles. Se conocen fechas exactas de nacimiento
para casi todas las aves nacidas en la población, y todos los juveniles se pesan en
septiembre u octubre del año de su nacimiento. Para todos los juveniles anillados, se
calculó la edad exacta (en días) para el día en que fueron pesados, y se ajustó un
modelo lineal generalizado para calcular el peso esperado de un ave de esa edad y
sexo. Se calculó la diferencia entre el peso del ave al anillar y su peso esperado. Se
construyó un modelo lineal generalizado para probar si la probabilidad de que un
ave muera se vio afectada por su edad al comienzo del brote y/o qué tan
relativamente bajo o sobrepeso tenía el ave al pesarse por última vez.
La tasa de letalidad (la proporción de individuos que murieron entre todos los
individuos infectados) se estimó de forma aproximada para las aves juveniles en
ambos brotes. No se calcularon las estimaciones para las aves adultas porque el
efecto protector de la exposición primaria al H5N8 tras la exposición posterior al
H5N6 evitaría las comparaciones directas de la virulencia viral. El número de aves
juveniles que habían sido infectadas se estimó sumando el número de aves que
murieron durante el brote y el número de aves que fueron serológicamente positivas
para AIV por ensayo HI (para H5N8) o ELISA (para H5N6) después del brote.
Como no hubo muestras de sangre fueron recolectados antes del brote de H5N8,
asumimos que las aves juveniles eran seronegativas para H5N8 antes del brote y
que, por lo tanto, la presencia de una respuesta de H5N8 representa la
seroconversión después de la infección. El uso de la seropositividad de NP-ELISA
como representante de la seroconversión debida a la infección por IAAP H5N6
parece apropiado porque se encontró que casi todas las aves jóvenes eran
seronegativas mediante este método antes del brote. Sin embargo, enfatizamos que
estas suposiciones hacen que nuestras estimaciones de la tasa de letalidad sean
relativamente crudas. Se estimaron las distribuciones de la tasa de mortalidad entre
los individuos infectados para acomodar los efectos del muestreo y permitir cierta
incertidumbre en el número exacto de aves juveniles presentes en la población en
diciembre de cada año (material complementario electrónico, figura S2)
RESULTADOS:
a) Epidemiología comparativa de los brotes H5N8 2016/17 y H5N6 2017/18:
Los tres brotes de H5 IAAP en Fleet Lagoon fueron sorprendentemente similares en
su duración y tiempo dentro del año calendario (figura 1a). Los primeros casos de
cada brote se detectaron el 27 de diciembre de 2007 para H5N1, el 23 de diciembre
de 2016 para H5N8 y el 31 de diciembre de 2017 para H5N6. El tiempo entre el
primer y el último caso positivo confirmado en cisnes en el sitio (en adelante, el
período del brote) fue de 33 días para H5N1, 32 días para H5N8 y 31 días para
H5N6.
Durante cada uno de los brotes, se observó que varios cisnes giraban
compulsivamente en el agua. Este síntoma se ha observado raramente en el sitio
fuera de los brotes de IAAP. Se observó que varias aves, incluida una que resultó
positiva para H5N6, estaban letárgicas o tenían muy poca coordinación. En los
meses posteriores a los tres brotes, se observó un número inusualmente alto de
cisnes con tortícolis grave (cuellos anormalmente torcidos).

Figura 1. Mortalidad entre cisnes en la Laguna Fleet. (a) Mortalidad entre cisnes
mayores de aproximadamente cuatro meses en Fleet Lagoon durante H5N1
(2007/08), H5N8 (2016/17) y H5N6 (2017/18). Las barras de colores brillantes
indican la cantidad de cisnes muertos observados durante los "períodos de brote" de
IAAP en FleetLagoon (período entre el primer y el último caso positivo confirmado
en cisnes en el sitio para cada subtipo de IAAP). Las barras de colores brillantes
incluyen toda la mortalidad observada durante el período del brote,
independientemente de si las canales fueron analizadas para VIA o VIA positivo.
Las barras de colores pálidos indican la mortalidad observada entre las aves en Fleet
Lagoon en períodos en los que no se detectó IAAP y, por lo tanto, indican el nivel
típico de mortalidad observado entre los cisnes en Fleet Lagoon. Mientras que el
último cisne IAAP H5N1 positivo se encontró en las cercanías de Fleet Lagoon
durante la semana 4 de 2008, un ganso canadiense (Branta canadensis) dio positivo
para IAAP a menos de 1 km de Fleet Lagoon durante la semana 7 de 2008 y está
marcado con un asterisco. Los puntos y las líneas horizontales indican las fechas de
intervalo HPD medianas y del 95 % para el MRCA del clado del brote de Fleet
 Lagoon, según lo estimado mediante métodos filodinámicos. (b) Proporción
estimada de aves de cada grupo de edad que murieron a causa de la infección por
HPAIV durante cada brote, con base en las aves que se creía que estaban vivas en la
población en el momento en que comenzó cada brote. Los colores indican los
respectivos brotes. Se dan intervalos de confianza del 95% de Wald ajustados.
La mortalidad bruta en la población de cisnes fue tres veces mayor para el brote
H5N8 2016/17 que para el brote H5N6 2017/18 (figura 1a). Para la epidemia de
H5N6, 61 cisnes murieron durante el período del brote, de los cuales 51 fueron
confirmados por RT-qPCR como AIV positivos y seis confirmados como VIA
negativos. Las cuatro aves restantes no se analizaron, por lo general porque las
canales estaban incompletas (material complementario electrónico, figura S1). Para
la epidemia H5N8, 182 cisnes murieron durante el período del brote, de los cuales se
confirmó que 18 eran VIA positivos y nueve VIA negativos. La mayoría de las aves
restantes no pudieron someterse a pruebas porque, debido a la escala del brote, se
hizo necesario desechar los cadáveres de aves antes de que se puedan realizar las
pruebas. La proporción más baja de aves positivas a negativas para VIA en el brote
de H5N8 en comparación con el brote de H5N6 probablemente se deba a que las
pruebas de VIA se realizaron solo al principio y al final del primero (material
complementario electrónico, figura S1); si las pruebas se hubieran realizado durante
el pico de mortalidad, una mayor proporción del total de muertes habría sido
atribuible a VIA. La mortalidad ajustada por edad por cada 1000 aves durante el
brote de H5N8 (=143) fue más del doble de la estimada para el brote de H5N6 (=
65) y más de cuatro veces la del H5N1 (= 32).
El número reproductivo básico (R0) se estimó para las epidemias H5N8 y H5N6 a
partir de series temporales del número de canales recuperadas en el sitio y una
distribución estimada del tiempo de generación de la epidemia; este último se
obtuvo de los datos experimentales publicados para los virus H5N8. La distribución
que mejor se ajustaba a este parámetro era una distribución de Weibull con un
tiempo medio de generación de 2,9 días y una desviación estándar de 1. Los valores
estimados de R0 de las dos epidemias fueron similares, aunque la estimación para el
brote de H5N6 2017/18 (R0¼2,69 ; intervalo de confianza del 95 % = 1,40–5,5) fue
considerablemente más incierto que el del brote H5N8 2016/17 (R0 = 2,25;
intervalo de confianza del 95 % = 1,92–2,68). La mayor incertidumbre en la
estimación de R0 para H5N6 2017/18 probablemente se deba al menor número de
casos observados en este brote.
b) Análisis filogenético del reloj molecular:
Se generaron secuencias completas o parciales del genoma del virus para 12
muestras recolectadas durante el brote H5N8 2016/17 y para tres muestras
recolectadas durante el brote H5N6 2017/18. Los árboles filogenéticos preliminares
de ML estimados para cada segmento mostraron que, para H5N8, todas las muestras
de Fleet Lagoon formaron un solo clado bien sustentado, consistente con una sola
introducción al sitio. Para H5N6, todas las secuencias de Fleet Lagoon se agruparon,
pero la monofilia de este grupo fue menos sólida. Posteriormente se estimaron las
filogenias de reloj molecular HA (figura 2) para estimar la fecha de introducción de
cada linaje de brote en las aves de la Laguna Fleet. Para cada brote, estimaciones
posteriores marginales de la fecha del ancestro común más reciente (MRCA) del
clado se obtuvieron de la alineación HA. La fecha mediana estimada del MRCA del
 clado del brote H5N8 fue el 25 de noviembre de 2016 (95 % del intervalo creíble de
densidad posterior (HPD) más alto = 22 de octubre–21 de diciembre de 2016). Para
el H5N6, la fecha mediana del MRCA del clado del brote fue el 17 de noviembre de
2017 (intervalo HPD del 95 % = 1 de octubre–26 de diciembre de 2017). Estas
fechas son sorprendentemente similares entre sí y con las fechas previamente
informadas para el brote de H5N1 en Fleet Lagoon (fecha mediana = tercera semana
de noviembre de 2007, intervalo HPD del 95 % = mediados de octubre a fines de
diciembre de 2007 [12]). En los tres brotes, la fecha mediana de la MRCA precede
al primer caso observado y al aumento de la mortalidad en Fleet Lagoon en
aproximadamente un mes (figura 1a).
Según la filogenia estimada del reloj molecular del segmento HA, los virus H5N8
de Fleet Lagoon pertenecen a un clado bien respaldado con virus que son
principalmente de Europa (figura 2a,b). Sin embargo, el orden de las ramas dentro
de este clado se resuelve mal debido a la gran similitud genética de las secuencias de
los brotes. Se estima que la fecha de divergencia del clado del brote H5N8 con los
virus sin brote más estrechamente relacionados es casi 1 año antes del MRCA del
brote H5N8 en Fleet Lagoon. Por lo tanto, no podemos identificar una ubicación de
origen probable para el virus H5N8 que se introdujo en Fleet Lagoon. Por el
contrario, las secuencias del brote de H5N6 se ubican dentro de un clado de virus
contemporáneos de los Países Bajos (figura 2a,c). de las cepas del Reino Unido y los
Países Bajos significa que es plausible que el brote de H5N6 haya sido introducido
en el Reino Unido por aves migratorias de los Países Bajos.
El único virus H5N6 que se secuenció de un cisne mudo en Fleet Lagoon se ubica
como un grupo externo a los virus muestreados de un pato porrón (Aythya ferina) y
un ganso canadiense (Branta canadensis) que también dieron positivo para HPAIV
en Fleet Lagoon. Se sabía que el cisne mudo residía en Fleet Lagoon. Dado que las
infecciones en los cisnes mudos probablemente se adquirieron localmente, y que el
MRCA de las secuencias del porrón y el ganso es más reciente que el del cisne, el
porrón y el ganso también pueden haber sido infectados localmente.
c) Distribución por edades de la mortalidad:
Se observó un patrón consistente de mortalidad estructurada por edad en las tres
epidemias de IAAP H5 que ocurrieron en Fleet Lagoon: las aves jóvenes tenían más
probabilidades de morir que cualquier otro grupo de edad durante cada uno de los
brotes H5N1, H5N8 y H5N6 (figura 1b). La mayor mortalidad de aves juveniles
ocurrió durante el brote de H5N8, cuando murió el 36% de las aves juveniles.
Probamos la importancia de la diferencia en la mortalidad entre aves juveniles
(menos de 1 año) y mayores para cada brote utilizando pruebas exactas de Fisher
bilaterales. Las aves jóvenes murieron con una frecuencia 16,8 veces mayor que las
aves de todas las demás edades durante el brote de H5N1 (intervalo de confianza del
95 % de la razón de posibilidades = 3,5–106,9; valor de p inferior a 0,001). Las aves
jóvenes murieron con una frecuencia 10,2 veces mayor que las aves de otras edades
durante el brote de H5N8 (intervalo de confianza del 95 % de la razón de
posibilidades = 6,5–16,2; valor de p inferior a 0,0001) y una frecuencia 71,0 veces
mayor que las aves de otras edades durante el brote de H5N6 brote (intervalo de
confianza del 95 % de la razón de posibilidades = 18,2–609,9; valor de p inferior a
0,0001). Por el contrario, durante el mismo período invernal de los años previos sin
epidemia (2009-2015), las aves juveniles no tenían una probabilidad
 significativamente mayor de morir que las aves adultas (razón de probabilidades 1,6;
intervalo de confianza del 95 % de la razón de probabilidades = 0,9–3,1; valor de p
mayor superior a 0,05) (material complementario electrónico, tabla S1).
d) Investigando el efecto de la edad y el peso en la probabilidad de muerte en
menores:
Al inicio de los brotes de H5N8 y H5N6 (diciembre de 2016 y 2017), las aves
juveniles variaban entre 186 y 226 días y 203 y 239 días, respectivamente. Sus
últimos pesos conocidos, medidos en septiembre y octubre de sus respectivos años
de eclosión, variaron entre 4,0 y 12,2 kg. Se construyeron modelos lineales
generalizados para probar si las aves juveniles que murieron durante los brotes de
H5N8 y H5N6 tenían, en promedio, edades o pesos diferentes de las aves juveniles
que sobrevivieron. Al analizar los brotes tanto juntos como por separado, hubo una
tendencia hacia los juveniles de mayor edad y aquellos que estaban por debajo del
peso promedio al momento del anillamiento, con mayor probabilidad de sobrevivir
al brote, pero ninguna diferencia fue significativa (valor de p superior a 0,05)
(complementario electrónico). material, figura S3).
e) Respuestas serológicas:
Para investigar por qué la mortalidad fue significativamente más alta en los
juveniles que en las aves más viejas durante los tres brotes de HPAIV, realizamos
ensayos serológicos en sangre recolectada de cisnes en nuestra población de estudio
en múltiples ocasiones durante 2017–2018. A lo largo del año, la prevalencia de
reactividad de anticuerpos frente a AIV NP en cisnes mayores o iguales a 2 años de
edad fue superior al 90% (figura 3a, verde y negra). Por el contrario, los juveniles
que nacieron en la primavera de 2017 y que se analizaron aproximadamente a los
cinco meses de edad en noviembre de 2017, tenían una prevalencia de reactividad de
anticuerpos de solo el 14 % (figura 3a, azul). Cuando esta cohorte (es decir, las aves
que nacieron en 2017) se desperdiciaron nuevamente a principios de 2018, luego del
brote de H5N6, la prevalencia de reactividad de anticuerpos en los juveniles había
aumentado al 61 % (figura 3a, azul).
Los ensayos de HI se realizaron en sueros recolectados durante junio, julio y
noviembre de 2017 que dieron positivo en la presencia de anticuerpos contra AIV
NP. La mayoría de las aves que estaban vivas en el momento del brote de H5N8
(año de nacimiento = 2016 o antes) eran seropositivas para H5N8 (figura 3b). Entre
este grupo, las aves que habían nacido en la primavera/verano de 2016 (y que, por lo
tanto, tenían menos de 1 año cuando ocurrió el brote de H5N8 a fines de 2016)
tenían una probabilidad significativamente menor de ser seropositivas para LPAIV
H5N3. Ninguna de las aves que nacieron después del brote de H5N8 (año de
nacimiento ¼ 2017) exhibió evidencia de exposición serológica a H5 AIV cuando se
analizaron en noviembre de 2017.
f) Asociación de respuestas serológicas con mortalidad durante H5N6 2017/18:
Por primera vez que sepamos, pudimos explorar si el estado serológico de las aves
silvestres evaluadas antes del brote de H5N6 se correlacionaba con su probabilidad
de morir durante ese brote. Cuatro de las 21 aves que murieron a causa de la
infección viral H5N6 durante el invierno de 2017/18, y de las que se disponía de
muestras de sangre anteriores, mostraron evidencia serológica de exposición previa
a AIV mediante NP-ELISA. Ninguna de las 21 aves que murieron mostró evidencia
de exposición previa a un virus H5 (títulos inferiores a 16), lo que sugiere que estas
 aves seropositivas a AIV habían estado expuestas solo a virus no H5 (material
complementario electrónico, tablas S2 y S3). Si bien esto no excluye la posibilidad
de que la exposición previa a AIV no H5 específico pueda proteger contra la muerte
por infección con HPAIV H5, sí sugiere que la exposición previa a H5,
particularmente a cepas relacionadas, puede ser protectora, y que no todos los
LPAIV son protectores.
g) Seroconversión en aves individuales y duración de anticuerpos:
Se tomaron muestras de sangre de 59 cisnes en más de una ocasión entre junio de
2017 y junio de 2018. De estas, 11 aves se seroconvirtieron para ser seropositivas
para anticuerpos dirigidos contra AIV NP (material complementario electrónico,
figura S4). Solo un ave mostró evidencia de la tendencia opuesta (sero-reversión).
Doce aves fueron analizadas en dos ocasiones distintas (junio/julio y noviembre de
2017) para detectar la presencia de anticuerpos específicos contra H5 utilizando
ensayos de HI. Nueve de las 12 aves tenían títulos de HI que se mantuvieron
estables o cambiaron solo al doble durante este período. Solo dos de las 12 aves
exhibieron una reducción en el título de al menos cuatro veces para HPAI H5N8
(material complementario electrónico, figura S5). Por lo tanto, las respuestas de
anticuerpos contra H5N8HPAIV en muchos miembros de esta población parecen
estar presentes durante al menos 11 meses después de la infección primaria.
h) Estimación de la tasa de mortalidad entre aves juveniles infectadas:
Se tomaron muestras de un total de 64 cisnes vivos durante el pico del brote de
H5N6 en 2017/18 (material complementario electrónico, figura S1). De estos, seis
tenían hisopados cloacales y/u orofaríngeos que dieron positivo para HPAI H5N6,
con valores de umbral de ciclo (Ct) de RT-qPCR inferiores a 37 (cinco eclosionaron
en 2017 y uno eclosionó en 2014). En total, aproximadamente el 19 % (5 de 26) de
las aves juveniles vivas que se tomaron muestras durante el brote de H5N6 dieron
positivo para el virus, mientras que solo aproximadamente el 3 % (1 de 37) de las
aves adultas vivas dieron positivo. Sin embargo, esta diferencia no fue
estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher; razón de probabilidad = 8,3;
p = 0,07). Dos de las aves juveniles que se tomaron muestras cuando estaban vivas y
que dieron positivo para H5N6 durante el brote murieron posteriormente, a los 3 y
11 días después de la muestra. Se confirmó que ambas eran positivas para H5N6
HPAIV al morir. Un pájaro que nació en 2014 y uno de los pájaros que nació en
2017 fueron avistados a principios del verano de 2018, por lo que ambos
sobrevivieron claramente a la infección.
Tres veces menos aves murieron durante el brote de H5N6 que durante el brote de
H5N8, y esta reducción en la mortalidad se observó tanto en aves jóvenes como
adultas. Suponiendo que las aves juveniles en cada año fueran inmunológicamente
ingenuas de manera similar, la reducción en las muertes de aves juveniles
teóricamente podría haber ocurrido porque menos juveniles en general estaban
infectados y/o porque el H5N6 tenía una virulencia más baja que el H5N8. Para
determinar si el H5N6 fue menos virulento en esta población que el H5N8,
estimamos la tasa de letalidad entre las aves juveniles para ambos brotes. Bajo
varios supuestos (detallados en Material y Métodos), estimamos que las tasas de
mortalidad entre las aves jóvenes infectadas pueden haber sido aproximadamente
46% para HPAIV H5N8 y aproximadamente 36% para HPAIV H5N6. Si bien esto
podría sugerir una diferencia en la virulencia del HPAIV en esta población (y quizás
 entre las aves acuáticas relacionadas), la incertidumbre en nuestras estimaciones de
letalidad es alta y, dados los supuestos del modelo, no podemos descartar que las
tasas de letalidad fueran las mismas en ambos brotes (material complementario
electrónico, figura S2). Las estimaciones de la tasa de letalidad son consistentes con
la observación de que entre dos y cuatro de las cinco aves juveniles que dieron
positivo para HPAIV durante el brote de H5N6 murieron más tarde. Por lo tanto, es
posible que el número de aves infectadas fuera simplemente menor durante el brote
de H5N6 que durante el brote de H5N8, tal vez como resultado de una inmunidad
parcial del rebaño debido a la exposición previa de la población al H5N8.
DISCUSIÓN:
Aunque la propagación geográfica y temporal de H5HPAIV ha sido bien caracterizada a
gran escala [5–8], es rara la información detallada sobre la dinámica y la demografía de
los brotes de HPAI en poblaciones individuales de aves silvestres. Si bien las encuestas
longitudinales de la epidemiología de la IAAP en aves silvestres están bien establecidas
(p. ej., [33,34]), la aparente imprevisibilidad de los brotes de IAAP hace que dichos
estudios sean más desafiantes para la IAAP. En este estudio, presentamos datos de una
población silvestre de aves longevas que ha experimentado una serie de brotes de H5
HPAIV, incluidas las epidemias H5N8 y H5N6 presentadas aquí, y el evento H5N1
2007/08 que se informó con más detalle anteriormente [ 12]. Mostramos que el
momento, la duración y los impulsores de la mortalidad en estos brotes son
sorprendentemente consistentes entre años, lo que sugiere que HPAIV puede ser más
susceptible de estudio en la naturaleza de lo que se pensaba anteriormente.
Las "fechas de inicio" estimadas de los tres brotes en Fleet Lagoon son inesperadamente
similares. Esto es válido tanto si se considera que la "fecha de inicio" es la primera
detección de aves positivas, como si se considera que es la fecha del MRCA del clado
del brote, obtenida mediante reconstrucción filogenética. La similitud en las fechas de
inicio entre los años es inesperada dada la ecología muy compleja involucrada y la
ausencia de tendencias claras y repetibles a escalas continentales más grandes. Debido a
que muchas especies de aves acuáticas no pueden alimentarse si los hábitats de las
tierras húmedas se congelan, se sabe que el movimiento y la migración de las aves
silvestres se ven influenciados por los cambios en las temperaturas locales, lo que a su
vez puede influir en la propagación geográfica del AIV[35,36]. Las temperaturas de
otoño y principios de invierno fueron más altas en Europa en 2017 en comparación con
2016 y, en consecuencia, las aves acuáticas generalmente llegaron al Reino Unido más
tarde y en menor número en 2016 que en 2017 [37]. Dada la variación interanual en el
clima europeo y el movimiento de las aves, es sorprendente que los tres brotes en
FleetLagoon comenzaran en momentos muy similares. Sin embargo, los datos de Fleet
Lagoon sugieren que los conteos máximos de otoño de muchas especies diferentes
ocurrieron en el mismo mes de los 3 años (material complementario electrónico, figura
S6), por lo que es posible que la inmigración de aves a Fleet Lagoon fuera menos
variable entre años que en otros años. ubicaciones. Un seguimiento GPS más detallado
de aves migratorias y residentes individuales en Fleet Lagoon ayudaría a resolver los
efectos de la estación y la temperatura en el movimiento y la densidad de las aves, lo
que puede explicar la coincidencia temporal de los brotes que se observan aquí.
Para H5N1, H5N8 y H5N6, se estimó que el MRCA de todas las secuencias de HA del
brote existió a mediados o finales de noviembre de cada año (95 % de intervalo creíble
de HPD aproximadamente de octubre a diciembre) [12], lo que hace posible que cada
HPAIV circuló de forma críptica durante hasta diez semanas en Fleet Lagoon antes de
que se detectaran los primeros cisnes infectados con HPAIV. Por varias razones, parece
poco probable que el virus haya circulado entre los cisnes durante tanto tiempo como
diez semanas antes de que la mortalidad se manifestara en la epidemia. Gran cantidad
de muestras fecales o cloacales de cisnes recolectadas en el sitio el 24 de noviembre de
2016 (n¼69) y el 3 de noviembre 2017(n¼100) dio negativo para ARN de AIV por RT-
qPCR. Dado un tamaño de población de aproximadamente 800 aves, podemos estar
seguros en un 95 % de que menos de aproximadamente el 3,5 % de la población podría
haberse infectado con los virus HPAI H5 en estas fechas. Los estudios experimentales
de H5N1 han demostrado que la mayoría de los cisnes inmunológicamente ingenuos
mueren de infección por H5N1 entre 5 y 10 días después de la infección [38,39]. Aquí,
observamos dos aves que murieron 3 y 11 días después de que se encontrara el ARN de
H5N6HPAIV en los hisopos que se les tomaron. Además, hubo un aumento explosivo
en la mortalidad luego de las primeras muertes detectadas en los brotes H5N8 y H5N8
(figura 1a). Por lo tanto, parece muy poco probable que el virus haya estado circulando
entre la población de cisnes durante más de quince días antes de que se observara un
aumento de la mortalidad. Sin embargo, el virus podría haber sido introducido y
circulado sin ser detectado entre otras especies de aves acuáticas en Fleet Lagoon, antes
de la posterior incursión en la población de cisnes, como se sugirió anteriormente para
el H5N1.
No podemos determinar qué especies pueden haber traído originalmente H5 HPAIV a
Fleet Lagoon. Mientras que la población de cisnes sufrió una mortalidad severa que fue
consistente con la morbilidad observada en los estudios experimentales de desafío
[39,40], no se observó un aumento significativo en la mortalidad para otras especies.
Dos gansos canadienses y un porrón común fueron encontrados muertos y con HPAIV
positivo en Fleet Lagoon (Branta canadensis,n¼1 durante H5N6 yn¼1 durante H5N1;
Aythya ferina, n¼1 durante H5N6). Sin embargo, el análisis filogenético no puede
descartar que estas aves estuvieran infectadas localmente [12]. Es posible que el virus
haya sido introducido por una especie que puede tolerar la infección por HPAIV sin
mostrar síntomas de la enfermedad [41]. Inferimos que todos los HPAIV H5 ingresaron
a Fleet Lagoon en la época del año en que la inmigración de aves acuáticas a Fleet
Lagoon es más alta, como se señaló anteriormente para H5N1 [12]. Las especies que
migran a la Laguna Fleet durante el otoño y principios del invierno (como el porrón
común y otras especies migratorias de larga distancia) son, por lo tanto, vectores más
plausibles del virus que las especies que residen localmente (como el cisne mudo o el
ganso canadiense) (suplemento electrónico -material tario, figura S7), apoyando los
resultados de análisis filodinámicos realizados a escala internacional[4]. El análisis de
datos detallados de conteo de aves de sitios afectados en diferentes países, con un mejor
seguimiento espacio-temporal de los movimientos de las aves, puede ayudar a
determinar qué especies impulsan el movimiento de larga distancia de HPAIV.
Usando conteos diarios de cisnes que fueron encontrados muertos en el sitio, estimamos
el número reproductivo básico medio (R0) para la infección letal en aproximadamente
2.5 para ambos brotes. Esto es un poco más alto que los valores de R0 estimados para
H5N1 a partir de datos de recuento de casos (promedio de R0, 1.6 [42]) y para los virus
del clado 2.3.4.4 H5N2 y H5N8 a través de modelos filodinámicos (promedio de R0 del
gen HA: 1.6–1.7 [43]). Esto puede deberse a que la población de cisnes de Fleet
Lagoons comprende una alta proporción de aves juveniles inmunológicamente ingenuas
entre las cuales el virus podría transmitirse fácilmente, o debido a la alta densidad de
aves en el sitio que se fomenta con alimentación suplementaria regular.
Por primera vez, informamos datos sobre los resultados de mortalidad de aves silvestres
individuales, cuyo estado serológico se había observado inmediatamente antes de la
exposición natural a HPAIV. estas aves habían sido previamente infectadas con un virus
H5. Este hallazgo no es apropiado para pruebas estadísticas debido al bajo tamaño de
las muestras. Sin embargo, ciertamente es consistente con la creciente evidencia de
estudios experimentales de desafío y de datos de observación sobre LPAIV, que las aves
están más protegidas contra la infección por un nuevo AIV si previamente fueron
infectadas por un virus del mismo subtipo que por un virus de un subtipo diferente.
Es difícil estudiar si la edad se correlaciona con la protección contra HPAIV en
poblaciones de aves silvestres, ya que rara vez se conocen las estructuras de edad de la
población y la infección por HPAIV suele ser rara. La exposición previa a ciertos
LPAIV puede reducir la morbilidad tras el desafío con H5 HPAIV [11,40,44,49]. A
medida que las aves envejecen, es cada vez más probable que obtengan respuestas
serológicas al AIV, incluso a una gama cada vez más amplia de subtipos diferentes [50–
60]. Este patrón inmunológico podría conducir a que las aves de mayor edad tengan un
menor riesgo de muerte por infección con HPAIV. Entre los cisnes en Fleet Lagoon,
encontramos que las aves que tenían más de 1 año en el momento de la infección con
HPAIV tenían significativamente menos probabilidades de morir que las aves más
jóvenes durante los tres brotes. Además, las pruebas de aves vivas durante el pico del
brote de H5N6 en 2017/18 mostraron que las aves más viejas tenían ocho veces menos
probabilidades de tener el virus detectable por qPCR que las aves más jóvenes, aunque
esta diferencia no fue significativa. La edad del cisne también se correlacionó
estrechamente con las respuestas inmunológicas contra AIV NP y también contra H5
HA. A pesar de las sugerencias de que las ligeras diferencias en la edad (semanas a
meses) pueden modular el riesgo de mortalidad por exposición al HPAIV, incluso en
ausencia de diferencias en el estado inmunológico [61,62], no encontramos evidencia de
esto entre las aves en Fleet Lagoon y nuestros datos indican que el estado inmunológico
es el factor clave del riesgo de mortalidad en esta población.
No encontramos evidencia de diferencias estacionales en la seroprevalencia de AIV en
los cisnes en Fleet Lagoon, de acuerdo con nuestra conclusión anterior de que es
probable que los anticuerpos contra AIV sean de larga duración en los cisnes [63]. Por
lo tanto, las aves inmunológicamente ingenuas se introducen principalmente en la
población solo a través de la eclosión y no a través de la sero-reversión. Es posible que
los patrones de mortalidad relacionados con la edad sean menos claros en otras especies
de aves, por ejemplo, si las aves adultas sero-revierten con más frecuencia, lo que hace
que los perfiles inmunológicos de adultos y juveniles sean menos distintos [55,64]. La
prevalencia de las respuestas inmunológicas a un virus en una población es un
determinante crítico de si el virus puede mantenerse en ausencia de adaptación
antigénica. La tasa de introducción de aves inmunológicamente ingenuas en las
poblaciones de aves, mediada por las diferencias en la esperanza de vida y la duración
de las respuestas de anticuerpos, debe investigarse con más detalle para un mayor
número de especies para comprender mejor el riesgo de que H5 HPAIV se vuelva
enzoótico en aves silvestres.
Décadas de investigación sobre patógenos humanos han demostrado la importancia de
los estudios de cohortes y los datos demográficos a nivel individual para comprender la
epidemiología de las enfermedades infecciosas. A pesar de esto, los datos a nivel
individual casi nunca están disponibles para brotes en animales o plantas silvestres y, en
cambio, la unidad de estudio suele ser un grupo más grande (p. ej., rebaño, manada o
granja). Los estudios a nivel individual que generan datos de alta calidad a menudo son
poco prácticos o demasiado costosos para implementar en la naturaleza. Aquí, pudimos
explotar los datos demográficos de las aves que se recopilaron con el propósito de la
investigación ecológica longitudinal, para investigar el contexto demográfico de la
transmisión del virus en los animales salvajes. Este enfoque tiene aplicaciones
potenciales para otros brotes emergentes y podría facilitarse mediante una estrecha
colaboración. entre ecólogos, virólogos y epidemiólogos en sitios de alto riesgo. Dichos
análisis tienen el potencial de generar información epidemiológica para las poblaciones
de animales y plantas silvestres que es de la misma calidad que la que se puede lograr
mediante estudios prospectivos de cohortes de poblaciones humanas.
Ética. Las muestras de sangre y los hisopos cloacales y orofaríngeos se recolectaron
bajo la licencia PPL P516CDFB6 del Ministerio del Interior del Reino Unido. La
aprobación ética para el trabajo se obtuvo de la Junta de Revisión Ética y de Bienestar
Animal de APHA Weybridge.
Accesibilidad a los datos. Las secuencias generadas aquí están disponibles en GenBank
(secuencias H5N8, números de acceso MH819084–MH819175) o GISAID (secuencias
H5N6, identificadores GISAID EPI ISL 292223–292225). Los datos primarios
utilizados para generar los resultados presentados aquí, incluidos los archivos de árbol
BEAST XML y MCC, y los reconocimientos de los laboratorios que contribuyeron con
secuencias a GISAID que se usaron en filogenias, están disponibles en el material
complementario electrónico.
Contribuciones de los autores. S.C.H. y O.G.P. concibió la investigación. S.C.H.realizó
el análisis epidemiológico y realizó experimentos de laboratorio serológicos y de
secuenciación y realizó trabajo de campo.S.C.H. escribió el manuscrito. S. F. ayudó con
el trabajo serológico y el trabajo de campo. K.V.P. asistido con análisis estadísticos. N.
L. análisis serológicos respaldados. R.H. coordinó la respuesta al brote y las pruebas
genéticas moleculares de las muestras. C.M.P. recolectó los datos demográficos de los
cisnes. I.H.B. ayudó con el diseño y la interpretación del estudio. O.G.P. editó el
manuscrito y supervisó el trabajo. Todos los demás autores contribuyeron al diseño o
implementación del trabajo de campo o de laboratorio. Todos los autores dieron su
aprobación final para la publicación.
Intereses en competencia. No tenemos intereses en competencia.
Financiamiento. Este trabajo fue apoyado por el Natural EnvironmentResearch Council
(subvención número NE/R002126/1) y por una subvención del John Fell Fund (Oxford,
Reino Unido). K.V.P. cuenta con el apoyo del acuerdo de subvención del Consejo
Europeo de Investigación (FP7/2007–2013) 614725-PATHPHYLODYN. Algunas
investigaciones de vigilancia pasiva fueron financiadas por Defra bajo el proyecto
SV3032.
Agradecimientos. Agradecemos a la Sra. C. Townshend por permitirnos estudiar los
cisnes en el sitio y al personal de Abbotsbury Swannery por ayudarnos a recopilar los
datos demográficos. Gracias al personal de la Agencia de Salud Animal y Vegetal de la
Universidad de Oxford y al Fondo de Vida Silvestre y Humedales (WWT) que
ayudaron con la recolección de muestras de sangre. Gracias a Marjolein Poen por
compartir protocolos para el pretratamiento de sueros de cisne. Reconocemos el uso de
secuencias de la base de datos GISAID EpiFlu y proporcionamos reconocimientos
detallados en el material complementario electrónico.