VIERNES 05 DE AGOSTO DE 2022

Dra Icela Rodríguez Haro

Coordinadora de Bacteriología
OBJETIVOS:

❖ Conocer los medios de cultivo utilizados en la identificación

bioquímica de Enterobacteriaceae.

❖ Conocer, describir y explicar protocolos de identificación

bioquímica de Enterobacteriaceae.
 AGAR TRES AZÚCARES HIERRO
(TSI)
✓ Extracto de carne 3,0g

✓ Extracto de levadura 3,0g

✓ Peptona de caseína 15,0g

✓ Peptona proteosa 5,0g

✓ Dextrosa 1,0g

✓ Lactosa 10,0g

✓ Sacarosa 10,0g

✓ Sulfato ferroso 0,2g

✓ NaCl 5,0g

✓ Tiosulfato de sodio 0,3g

✓ Rojo de fenol 0,024g

✓ Agar agar 12,0g

✓ Agua destilada 1000Ml

pH 7,4 ± 0,2

Hervir. Servir en tubos de 13 x 100mm (3,5mL/tubo),

Autoclavar.
 TRIPLE SUGAR IRON AGAR
FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la
pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados
✓ Glucosa para el desarrollo bacteriano.
Uso La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
En base a la ✓ Lactosa de carbono fermentables.
Medio universalmente fermentación de
empleado para la los hidratos de El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario
diferenciación de ✓ Sacarosa para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato
carbono. de hierro y amonio, es la fuente de iones 𝐹𝑒 3+ ,
enterobacterias. los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y
✓ Producción producen sulfuro de hierro, de color negro.
de gas
El rojo de fenol es el indicador pH , y el cloruro
de sodio mantiene el balance osmótico.
✓ Producción
de ácido El agar es el agente solidificante.
sulfhídrico Por fermentación de azúcares, se producen
ácidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio ácido.
➢Observar el color del medio de cultivo y la producción
de gas.

A.
+-
A/A , Superficie ácida/ profundidad ácida (pico
amarillo/ fondo amarillo): la enterobacteriaceae
fermenta lactosa o sacarosa / fermenta glucosa y
genera gas.

B.
--
K/A , : Superficie alcalina/profundidad ácido (pico
rojo/fondo amarillo): la Enterobacteriaceae
solamente fermenta la glucosa.

C.
-,+
K/A : Superficie alcalina/profundidad amarillo-
enmascarado por el negro (pico rojo/fondo negro):
la Enterobacteriaceae solamente fermenta la glucosa
y genera H2S.
A/A+,- K/A -,- K/A -,+ N/N
1 2 3
 GAS
➢La presencia de burbujas o la ruptura del
medio de cultivo indican que el
microorganismo producen gas.
LISINA HIERRO AGAR (LIA)
✓ Extracto de levadura 3,0g
✓ Dextrosa 1,0g
✓ L-lisina 10,0g
✓ Citrato de Amonio Férrico 0,5g
✓ Tiosulfato de sodio 0,04g
✓ Púrpura de Bromocresol 0,02g
✓ Agar Agar 15,0g
✓ Agua destilada 1000mL
pH 6,7 ± 0,2
Hervir. Servir en tubos de 13 x 100mm
(3,5mL/tubo). Autoclavar.
 USO
MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO PARA DIFERENCIAR MICROORGANISMOS, ESP ECIALMENTE SALMONELLA SPP., BASADO EN LA
DESCARBOXILACIÓN Y DESAMINACIÓN DE LA LISINA Y EN LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO.
Fundamento
➢En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y desaminasa.
➢El citrato de hierro , amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico. El púrpura de bromocresol, es el indicador de pH (su color es amarillo a pH
igual o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el agente solidificante.
➢Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y provocan el viraje del
color púrpura al amarillo.
➢El ambiente ácido favorece la actividad enzimática decarboxilasa y se metaboliza la lisina
a cadaverina elevando el p H del medio de cultivo y tornándolo al color púrpura o violeta.
➢Los microorganismos fermentadores de glucosa que no tienen actividad lisina
descarboxilación, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al color amarillo.
A las 24 horas de incubación se observa el fondo del tubo color amarillo y la superficie de
color violeta debido al consumo de las peptonas que producen alcalinidad.
➢La generación de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medo
debido a la formación de sulfuro de hierro.
➢Las cepas del género Proteus, Providencia y algunas de Morganella, desamina la lisina. Esto
produce un ácido alfa-ceto- Carbónico , en cual con la sal de hierro y bajo la influencia
del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
DESCARBOXILIACION DE LA LISINA

AGAR CITRATO DE SIMMONS
✓Dihidrogeno fosfato de amonio
✓Fosfato dipotásico
✓Cloruro de sodio
✓Citrato de sodio
✓Sulfato de magnesio
✓Agar
✓Azul de bromotimol
✓Agua destilada
pH final 6.9
Principio
• El citrato de sodio es una sal de acido cítrico, un
compuesto orgánico simple que se puede encontrar
como uno de los metabolitos en el ciclo del acido
tricarboxilico (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden
1g obtener energía por medios diferentes a la fermentación
de hidratos de carbono, mediante el empleo de citrato
1g como única fuente de carbono. La cuantificación de esta
característica es importante en la identificación de
muchas enterobacterias.
5g
• Cualquier medio utilizado para detectar la utilización del
2g citrato por las bacterias de estudio debe estar
desprovisto de proteínas e hidratos de carbono como
0.20 g fuentes de carbono.
15 g • Es posible detectar el empleo de citrato de la bacteria de
estudio por la producción de subproductos alcalinos en
un medio de citrato. Este ultimo incluye el citrato de
0.08 g sodio, un anión, como única fuente de carbono, y el
fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
1L
• Las bacterias que utilizan el citrato también pueden
extraer nitrógeno de las sales de amonio en el medio,
produciendo bicarbonato de sodio (NaHCO3) y amoniaco
(NH3), lo que se traduce en un pH alcalino. El azul de
bromotimol, amarillo a un pH por debajo de 6.0 y azul
por encima de uno de 7.6, es el indicador.
 RESULTADOS

➢Se considera una prueba positiva si aparece un color azul profundo

dentro de las 24-48 h, indicando que el microorganismo de estudio
es capaz de utilizar el citrato del medio y de generar productos
alcalinos.
 AGAR BASE UREA
Composición del medio en g/L:
Esta base es usada en la preparación de
✓Peptona de carne 1.0 medios para la diferenciación de
microorganismos, especialmente las
✓Dextrosa 1.0 Enterobacterias con base a la producción de
✓Cloruro de Sodio 5.0 ureasa.

✓Fosfato potásico 2.0

✓Rojo Fenol 0,012
✓Agar-agar 12.0
 AGAR BASE UREA

Fundamento:
La urea es hidrolizada por la enzima
ureasa, formando dióxido de carbono y
amoníaco. Este último proporciona
reacción alcalina al medio, que puede
comprobarse por el viraje del amarillo
al rojo púrpura del indicador de pH rojo
fenol contenido en el medio.
INTERPRETACIÓN
▪Los hidrolizadores rápidos de la urea rápidamente
pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas; las
especies menos activas pueden requerir 3 días o más.

▪Degradadores rápidos de la urea (Proteus spp.): color

rojo en todo el medio.

▪Degradadores lentos de la urea (Klebsiella spp.):

inicialmente rojo sólo en el pico de flauta, que
gradualmente se extiende en todo el tubo.

▪Ausencia de hidrólisis de urea: el medio mantiene su color

amarillo original.
 MEDIO SIM Siembra

✓Por punción profunda

FÓRMULA (en gramos por litro)
Tripteína 20.0
utilizando aguja de
Peptona 6.1
inoculación recta.
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sódio 0.2 ✓Inocular el centro del
Agar 3.5 tubo, y la punción debe
pH final: 7.3 ± 0.2 abarcar 2 tercios de
profundidad del medio de
cultivo desde la
superficie.
 MEDIO SIM
Fundamento
Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes
para el desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido
constituyente de muchas peptonas y particularmente de la tripteína y
puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

Uso
El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Ehrlich o de ✓Medio semisólido destinado a verificar la
Kovac´s, para originar un compuesto de color rojo. movilidad, producción de indol y de sulfuro
de hidrógeno por los microorganismos.
A partir del tiosulfato de sodio los microorganismos pueden generar ácido
sulfhídrico que reacciona con el hierro presente formándose un ✓Es útil para diferenciar miembros de la
compuesto de color negro. familia Enterobacteriaceae.

El agar es el agente solidificante y a esta concentración le otorga al medio

la propiedad de ser semisólido, condición necesaria para detectar
movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del medio o por
crecimiento que difunde mas allá de la línea de siembra del
microorganismo en estudio.
 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
✓Observar la movilidad y el color del medio de cultivo. Luego
realizar la prueba de indol.
✓Movilidad:
Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas
allá de la línea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de
siembra.
Producción de H2S:
Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo a
lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.
Resultado negativo: el medio permanece sin cambio de
color.
Prueba del indol: Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de
Indol Reactivo.
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: el color del reactivo revelador
permanece incoloro-amarillento.
 MEDIO MIO
Medio utilizado en la identificación de
miembros de la familia Enterobacteriaceae en
base a la movilidad, producción de indol y
actividad enzimática ornitina decarboxilasa.
Siembra
✓Por punción profunda utilizando aguja de
inoculación recta.
✓Inocular el centro del tubo, y la punción debe
abarcar 2 tercios de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie.
 FUNDAMENTO
Medio de cultivo altamente nutritivo por la
presencia de extracto de levadura, peptona y El agar es el agente solidificante y a esta
tripteína. concentración le otorga al medio la propiedad de
ser semisólido, condición necesaria para detectar
movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento
La tripteína aporta gran cantidad de triptofano,
del medio o por crecimiento que difunde mas allá
sustrato de la enzima triptofanasa a partir del cual
de la línea de inoculación del microorganismo en
se forma indol que puede ser revelado con el
estudio.
reactivo de Ehrlich (Indol Reactivo o de Kovac´s por
la formación de un compuesto de color rojo.
Los microorganismos fermentadores de glucosa
acidifican el medio de cultivo y producen viraje del
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, la
color púrpura al amarillo. Las condiciones de
ornitina es el sustrato para la detección de la
acidez son favorables para la actividad enzimática
enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de
ornitina decarboxilasa, que actua sobre la ornitina
bromocresol es el indicador de pH, que en medio
generando putrescina, con la consecuente
alcalino es de color púrpura y en medio ácido es
alcalinización del medio de cultivo y viraje al color
amarillo.
púrpura
 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
✓Observar la movilidad y el color del medio de cultivo. Luego
realizar la prueba de indol.
Movilidad:
Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas
allá de la línea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de
siembra.
Producción de H2S:
Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo a
lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.
Resultado negativo: el medio permanece sin cambio de color.
Prueba del indol: Agregar al medio de cultivo 3 a 5 gotas de
Indol Reactivo.
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: el color del reactivo revelador
permanece incoloro-amarillento.
ENTEROPLURI KIT / ENTEROTUBE

• Identificación rápida de enterobacterias

 Agar Hektoen Enteric Agar Salmonella-Shigella

Colonias de Salmonella spp. creciendo sobre

diversos agares selectivos específicos. Las flechas
señalan colonias bien aisladas de las que
seleccionaremos una cantidad significativa que
será lo que llamamos Cepas de Salmonella.
A partir de las cepas se halla los diferentes
serotipos o serovariedades contenidos en la
muestra y a los que se va a someter a pruebas
taxonómicas para confirmar que son Salmonella e
identificar las serovariedades que se pueden aislar
de las muestras de agua de mar.
Agar Bismuto Sulfito
 Serovariedades de Salmonella.
Se conocen más de 2500 serovariedades
 ALGUNAS PRUEBAS TAXONÓMICAS
Kligler Iron Agar

API 20 E, pruebas bioquímicas y enzimáticas

Salmonella +
No inoculado IDENTIFICACIÓN DE Salmonella enterica
Subespecie I

ANTIBIOGRAMA

SEROAGLUTINACIÓN e identificación del serotipo en

el Centro Nacional de Microbiología, Virología e
Inmunología Sanitaria, Majadahonda, España y en el
Laboratorio Europeo de Referencia para Salmonella en
el Institut Pasteur de París
Las bacterias intestinales del grupo de los Coliformes Fecales siempre están asociadas a
las salmonelas en las aguas residuales. Por esa razón, cuando en el medio natural se
detecta salmonela se valoran también los CF para hallar a partir de qué concentración de