Ccayac CR 02

CLAVE:
COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

CCAYAC-CR-02/0
GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 1 DE 20

SUSTITUYE A:
VIGENTE A PARTIR DE: FECHA DE PROXIMA REVISIÓN:
CCAYAC-CR-02/1
2019-04-17 2025-04-17
FECHA DE: 2016-06-24
1. OBJETIVO
Describir los criterios para la aprobación del uso de Métodos Alternativos Microbiológicos.
TA
2. ALCANCE
UL
2.1. En este documento se establece el principio general y criterios técnicos para llevar a cabo el
estudio de comparación entre los métodos alternativos con respecto a los métodos de
referencia, en el campo del análisis microbiológico de alimentos en los siguientes casos:
NS
2.2. La determinación rápida de microorganismos patógenos en muestras de alimentos.
2.3. Si el método alternativo se utiliza de rutina en el laboratorio, funcionando como prueba tamiz,
CO
aportando resultados cualitativos y/o cuantitativos presuntivos.
2.4. Este documento contiene los requerimientos mínimos que deberán cumplir los métodos
alternativos a ser aplicados por los laboratorios de ensayo, para la aceptación e incorporación
DE
rutinaria de métodos alternativos microbiológicos.
3. DEFINICIONES
O
Para fines de este documento se entiende por:

NT
3.1. Exactitud: al grado de concordancia entre los resultados de ensayo y el valor de referencia
aceptado.
ME
3.2. Sesgo: a la diferencia entre los valores esperados de ensayo y el valor de referencia aceptado.
3.3. Límite de Detección Relativa. al mínimo número de microorganismos que puede ser detectado
en un 50% por los métodos alternativos y de referencia.
CU
3.4. Linealidad: a la capacidad del método para dar un resultado que está en proporción a la
cantidad de analito presente en la muestra, esto significa que un incremento en el analito
DO
corresponde a un incremento proporcional o lineal en resultado. Una parte de la validación es

la verificación de la calibración que da una curva de calibración final ajustando la relación entre
las mediciones modificadas y los valores de referencia correspondientes, con el mismo sistema.
Con las mismas escalas en los ejes, esta curva debe ser lineal, teniendo una intercepción nula
CONTROL DE EMISIÓN
Elaboró: Revisó: Autorizó:

Imelda Rocio Guzmán Imelda Rocio Guzmán
Nombre: Alejandro Galindo García
Cervantes Cervantes
Firma y fecha:
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

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(mismos valores bajos) y una pendiente de 1 (mismas unidades en los ejes) y con
características bien estimadas de propagación. La extrapolación por arriba y por debajo de las
concentraciones probadas, no se deben realizar, excepto si es necesario examinar el
comportamiento cercano a la concentración cero.
TA
3.5. Niveles críticos (LC): a la mínima cantidad que se puede detectar (o nula) aunque no se
cuantifica como un valor exacto. Por debajo de este valor, no se puede estar seguro de que el
UL
verdadero valor no es nulo.
3.6. Límite de detección (LOD): a la probabilidad que tiene que ser más del 50% del LC y debe
NS
contar con 95% de detección.
3.7. Límite de cuantificación (LOQ). A la cantidad más pequeñas de analito (que es el número
CO
más bajo real de microorganismos), que puede ser medido y cuantificado con precisión y
exactitud definiéndose en las condiciones experimentales por el método en proceso de
validación bajo las condiciones experimentales.
DE
3.8. Especificidad: es el grado para que un método sea afectado (o no) por los otros componentes
presentes en una muestra compuesta de multicomponentes. Es decir la habilidad de un método
para medir exactamente un analito dado, o estas cantidades, en la muestra sin interferencias de
O
componentes no blancos, tales como un efecto de la matriz o ruido de fondo. Los criterios no
NT
son aplicables para un recuento viable total.

3.9. Inclusividad: es la habilidad de un método alternativo para detectar un analito de interés en un
ME
rango de cepas.
3.10. Exclusividad: es la falta de interferencia de una serie de cepas no blanco del método
CU
alternativo.
DO
4. RESPONSABILIDADES
4.1. Será responsabilidad del fabricante emitir la documentación que avale los lineamientos
establecidos en la presente guía.
4.2. Será responsabilidad del fabricante presentar documentación actualizada que tenga en cuenta
cualquier modificación hecha al producto, que pueda afectar las instrucciones para el uso del
método y/o la realización de este.
4.3. Métodos de análisis. Es responsabilidad del laboratorio revisar y/o verificar el método de
análisis, que cumpla las características requeridas; si esto es posible el proveedor tendrá la
responsabilidad de emitir protocolos de análisis conforme a su certificado de validación; basado
en su sistema de calidad nacional y/o internacional.

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4.4. Para los laboratorios que soliciten autorización en el uso de métodos alternativos posterior a la
fecha de publicación, deberán cumplir con estos criterios desde el inicio.
4.5. La CCAYAC, manifiesta su apertura para recibir comentarios a la presente guía, los cuales
deben ingresarse como sugerencias en la secretaria técnica de la misma Comisión.
TA
5. CRITERIOS
UL
5.1. Criterios Generales
5.1.1. Justificación
NS
Recientemente se ha detectado la necesidad de los laboratorios evaluar rápidamente la calidad
microbiológica de los alimentos para dar respuesta rápida ante las emergencias sanitarias, así
como también el estado microbiológico de las materias primas y productos terminados para
CO
evaluar el procedimientos de fabricación, ha llevado al desarrollo y perfeccionamiento de los
métodos microbiológicos alternativos de análisis; los cuales se caracterizan por ser rápidos y/o
más fácil de realizar que el método de referencia correspondiente, la característica es que la
DE
mayoría de estos son automatizados.
Entre estos métodos alternativos, algunos pueden dar resultados que son equivalentes a las
O
previstas por el método de referencia, mientras que otros pueden dar lugar a resultados que
NT
difieren notablemente es por ello que se hace necesario llevar a cabo un estudio comparativo
entre el método de referencia con respecto al método alternativo.
ME
5.2. Criterios para métodos cualitativos

5.2.1. Protocolo de Estudio
CU
El protocolo de validación comprende principalmente de la comparación de un método

alternativo contra el método de referencia, llevado a cabo en el laboratorio de sitio. Las
DO
técnicas para el desarrollo del estudio de método de comparación están dadas por la naturaleza
cualitativa y/o cuantitativa del mismo.
5.2.2. Categorías de Alimentos
Es de alta prioridad utilizar muestras naturalmente contaminadas con el analito para la
validación de métodos alternativos. Tomando en cuenta que el rango de distribución de la
contaminación de la muestra debe ser representativa de los niveles usualmente encontrados en
el producto.
Es deseable que el muestreo cumpla tanto como sea posible con una buena distribución, con el
propósito de reducir el error analítico y ampliar el rango de validación en productos locales.

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Si no se contara con la cantidad suficiente, es aceptable trabajar con muestras artificialmente

contaminadas; siempre y cuando estas presenten un nivel de contaminación similar a las
naturalmente contaminadas.
El procedimiento de la contaminación artificial de las muestras de ensayo deberá ser descrito en
TA
el reporte de estudio.
Si el método alternativo busca validar todas las matrices de alimentos, puede agrupar en 5
UL
categorías; sin embargo; pueden reducirse a 1, 2, 3 o 4 categorías a solicitud del cliente. Es
apropiado que las muestras ambientales sean incluidas en otras categorías.
NS
Ver Anexo I. Clasificación de los tipos de muestra para estudios de validación
5.2.3. Número de muestras. CO

Por cada categoría de alimento, el número total de análisis deberá ser 60 porciones, de las
DE
cuales se podrá seleccionar tres subcategorías representativas analizando 20 porciones de
cada una, tanto por el método alternativo como el de referencia; por ejemplo:
O
Categoría: Productos de la Pesca Total: 60 pruebas

Crudos 20 pruebas
NT
Tratamiento térmico
Subcategorías: Congelados 20 pruebas
ME
Deshidratados
Fermentados 20 pruebas
CU
Para muestras naturalmente contaminadas seguir el diagrama 1 o 2 según corresponda.
Para muestras artificialmente contaminadas se deberá ajustar el inoculo de tal manera que se
DO
logre una recuperación de al menos un 50% de positivos y un 50% de negativos por alguno de
los dos métodos. Sin embargo este porcentaje es una recomendación; no siendo un porcentaje
absoluto, a condición de que algún número de las porciones probadas sean positivos y algunos
sean negativos.
5.2.4. Preparación de la muestra

5.2.4.1. El análisis para el método de referencia y alternativo se llevara a cabo exactamente de la misma
muestra, dividiendo porciones, que dependerá de las condiciones de metodología descrita a
continuación:

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5.2.4.2. Si la primera etapa de pre-enriquecimiento de los dos métodos es la misma seguir como en el
diagrama 1.
TA
Diagrama 1. Cuando todas las condiciones de la primera etapa de cultivo de ambos métodos
son idénticas.
UL
NS
25 g de la muestra.
CO
Homogenización
DE
Primera etapa de cultivo (por

ejemplo pre enriquecimiento)
O
NT
Incubación
ME
DIVISIÓN
CU
Método de referencia Método alternativo

DO
Segunda etapa, etc. Segunda etapa, etc.
Continuar cada análisis de acuerdo a este protocolo.
5.2.4.3. Si la situación anterior no es el caso, es decir, que el medio de pre-enriquecimiento,

metodología o las diluciones son diferentes; se deberá prepara porciones de la muestra en
paralelo para lo cual se describen las siguientes metodologías:

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5.2.4.4. Mezclar un peso doble de la muestra con un mismo volumen de agua estéril u otro diluyente
sustituible y homogenizar adecuadamente. Dividir en dos porciones teniendo cuidado, en
aumentar la concentración del enriquecimiento primario (en un 10%) esto para compensar el
efecto de la dilución, homogenizando la muestra.
TA
5.2.4.5. La segunda opción es inocular directamente el alimento, con un inoculo inicial suficiente para
permitir la recuperación fraccional del microorganismo en la porción de ensayo y continuar el
UL
análisis. Esta opción puede ser preferible implementarla en productos líquidos pero es
aceptable para cualquier tipo de alimento siempre y cuando se homogenice correctamente.
NS
Diagrama 2. Cuando la primera etapa de cultivo de los dos métodos son diferentes.
CO
Para productos líquidos
DE
Para productos no líquidos 50 ml de la muestra de alimento.
O
50 g de la muestra de alimento +
50 ml de agua u otro diluyente
NT
sustituible.
ME
Completamente homogenizada
la mezcla.
CU
DIVISIÓN
DO
Método de referencia. Método alternativo
50 g del homogenizado (o 25 g 50 g del homogenizado (o 25 g

para productos líquidos) + para productos líquidos) +
medio de cultivo para dar una medio de cultivo para dar una
correcta proporción m/v. correcta proporción m/v.
Continuar cada análisis de acuerdo a este protocolo.

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5.2.5. Protocolo de Medición

El protocolo deberá contener lo siguiente:
 Utilizar una misma categoría de alimento.
 Utilizar 5 microorganismos “objetivo” (dependiendo del alcance de la validación) si es posible;
TA
ocupar un microorganismo “objetivo” asociado con cada tipo de alimento para cada categoría.
 Preferiblemente ensayar 5 niveles de detección, o como mínimo 3 niveles para cada
UL
microorganismo “objetivo” por alimento, de los cuales se describen a continuación:
NS
Primer nivel: Deberá ser el control negativo
Segundo nivel: Deberá ser el nivel teórico de detección
Tercer nivel: Deberá ser un nivel de detección por arriba del nivel teórico
CO
Cuarto y Quinto nivel: Deberán ser mayores que el nivel de detección anterior.
 Replicar cada combinación (tipo de alimento, nivel de contaminación) 6 veces por ambos
DE
métodos. Realizar la preparación de la muestra cómo se describe en el punto siguiente, 4.2.3.
 Aplicando el procedimiento completo del método alternativo y el método de referencia,
incluyendo la preparación de la muestra.
O
 Reportar todas las diferencias significativas entre los métodos, alimentos, cepas y/o niveles.
NT
5.2.6. Cálculo e Interpretación

ME
5.2.6.1. Tratamiento de los datos:

Tabular los datos del par de resultados del método de referencia junto con el método
CU
alternativo, así como calcular los parámetros a continuación descritos por cada categoría de
alimentos (60 muestras) de acuerdo a la siguiente Tabla 1. Resultados pareados del método de
DO
referencia y alternativo.
Tabla.1. Resultados pareados del método de referencia y alternativo:
Respuestas Método de referencia positivo Método de referencia negativo

(R+) (R-)
Método alternativo positivo (A+) +/+ Concordancia positiva (PA) -/+ Desviación positiva (PD) (R-
/A+)
Método alternativo positivo (A-) +/- Desviación negativa (ND) (A- -/- Concordancia negativa (NA)
/R+)

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Expresar los tres criterios de la siguiente manera: Exactitud relativa, especificidad relativa y sensibilidad
relativa.
 Exactitud relativa: AC = (PA+NA)/N x 100%
TA
 Especificidad relativa: SP: NA/N- x 100%
 Sensibilidad relativa: SE: PA/N+ x 100%
UL
Dónde:
N: es el número total de muestras (NA+PA+PD+ND)
NS
N-: es el número total de resultados negativos con el método de referencia (NA +PD)
CO
N+: es el número total de resultados positivos con el método de referencia (PA+ ND)
Por cada porcentaje de AC, SE y SP. Calcular los intervalos de confianza.
DE
- Si el 10% <p<90% calcular el aproximado de los intervalos de confianza de los dos lados en
95%
O
𝑝(1−𝑝)
- Intervalo de confianza al 95% 𝑝 ± 2√ 𝑛
NT
- Para p ≥ 90% calcular el límite de confianza en 95% (uno de los lados) con n ≈ N, N+, N-
respectivamente para p (en %) = AC, SE, SP.
ME
Para este caso es preferible el uso de una tabla binomial para n = 10, 20, 30, 40, 50, 60. Ver
Tabla 2.
CU
Tabla 2. Límite de confianza menor en 95% para p=90% y mayor.

DO

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Ejemplo: n = 20, p = 94 % por lo que el Limite de confianza Menor = 88 %.
Calcular el intervalo de confianza por cada parámetro, por lo que el 95% de las muestras
probadas por el método alternativo caerán dentro de éste.
TA
5.2.6.2. Resultados aberrantes
UL
Analizar los datos utilizando los valores de PD y ND. Como se describe a continuación:
Contar el número total de resultados aberrantes y seguir:
NS
Y = PD + ND (por Ejemplo PD = 2, ND = 10, entonces Y = 12)
CO
Revisar si los dos métodos pueden ser diferentes para el balance de sensibilidad contra
especificidad:
DE
- Para Y< 6 (menos que 6 desacuerdos): prueba no disponible

O
- Para 6 ≤ Y ≤ 22 (por ejemplo: entre 6 y 22 desacuerdos):

NT
La prueba no es disponible; determinar m como el más pequeño de los dos valores de PD y ND

(por ejemplo m = PD = 2, porque PD < ND) y usa la ley binomial de acuerdo a la siguiente tabla
ME
F.1
Si m < M para un dado Y, los dos métodos son diferentes a < 0,05 (2-lados).
CU
Tabla 3. M valores para Y desacuerdos (6 Y 22)

DO
Por Ejemplo, para Y = 12 desacuerdos y m = 2, M = 2 y m < M: así, los dos métodos son
diferentes:
Con p < 0,05.
- Para Y > 22, (más que 22 desacuerdos), usar la prueba McNemar t con la distribución x2 con 1
grado de libertad:
x2= d2 /Y, con d = |PD – ND| y Y=PD + ND

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Los dos métodos son diferentes en α < 0,05 (2-lados) si x2 > 3,841
La prueba de x2 corresponde al mínimo d por cada Y de la siguiente tabla 4. Con una α < 0,05.
TA
(Es decir para un dado Y, d, debe ser igual o superior respecto al valor dado en la tabla 4 para
concluir que los dos métodos son diferentes).
UL
Tabla 4. - d valores para Y desacuerdos (Y > 22)
NS
CO
DE
5.2.7. Resumen de Cálculos

Todos los cálculos deberán resumirse en la siguiente tabla:
O
NT
Tabla 5. Resumen de cálculos.

ME
N+
Sum N- % SP
Matriz PA NA ND PD % AC PA + % SE
N NA+PD
ND
CU
100 × (𝑃𝐴 + 𝑁𝐴) 100 × 𝑃𝐴 100 × 𝐴𝑁
𝑁 𝑁+ 𝑁−
DO
5.2.7.1. Interpretación.
En la tabla se demuestran todos los resultados positivos y negativos.
Teniendo en cuenta que el número de desviaciones positivas y negativas, aportara la capacidad
del método alternativo, para proporcionar más o menos resultados positivos con respecto a la
evaluación del método de referencia.
El reporte del estudio deberá incluir y distinguir los resultados obtenidos con muestras
naturalmente contaminadas de aquellas muestras artificialmente contaminadas.

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5.2.8. Cálculos
5.2.8.1. Comparaciones.
TA
Para cada nivel Li = (i= 0 a 3) y para cada combinación alimento/cepa (j=1 al 5), comprar ambos
métodos basándose en la siguiente tabla:
UL
Tabla 6. Tabla de Comparaciones:
NS
Resultados
Referencia a
CO
Negativos (-) Positivos (+)
N-a
Total
n=6
Método Alternativo b N-b n=6
DE
total a+b 2n – (a+b) 2n = 12
Si el alimento/cepa parece ser comparables, la misma prueba es válida con n > 6 en un grupo
O
de alimentos para cada nivel Li.

NT
Reportar todas las diferencias significativas entre los métodos alimentos/ cepas y/o niveles.
ME
5.2.8.2. Interpretación.
El límite de detección relativa se encuentra entre dos niveles de contaminación con 50% de
CU
detección respectivamente. El límite de detección relativa es por lo tanto expresado como un

rango.
DO
5.2.9. Inclusividad y Exclusividad

Se elige una amplia gama de microorganismos para reducir el sesgo.
Cada cepa debe ser caracterizada bioquímicamente, serológicamente y si es relevante
genéticamente, de preferencia deberá ser aislado del alimento.
A continuación se enlistan las características que deben tener los grupos de microorganismo
“objetivo” y “no objetivo”.
Categorías de grupos “objetivo”.
 Grupo indefinido para el conteo total por ejemplo: coliformes, levaduras, bacterias acido
lácticas.
 Familia por ejemplo: Enterobacteriaceae.

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 Género, por ejemplo: Salmonella, Pseudomonas, Listeria etc.

 Especie, por ejemplo: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
Microorganismos “no objetivo”: Los siguientes deberán cumplir con las siguientes
TA
características:
UL
 Los grupos “no objetivo” (es decir aquellos esperados para ser negativos y ser usados para
pruebas cruzadas) deben ser específicos de acuerdo al grupo objetivo.

NS
Cuando el grupo “objetivo” es una familia: Se deben incluir a distintos géneros. Por ejemplo:
Familia Enterobacteriaceae, Salmonella, (microorganismo “objetivo”) E. coli (microorganismo
“no objetivo”).
 CO
Cuando el grupo “objetivo” es un género: deben incluirse otros géneros considerados para ser
similares al “objetivo”. Por ejemplo: Salmonella typhimurium, (microorganismo “objetivo”)
Salmonella entérica (microorganismo “no objetivo”).
DE
5.2.9.1. Microorganismos “objetivo”

O
Seleccionar al menos 50 cultivos puros de microorganismos típicos para el método alternativo y

NT
el alimento a probar excepto para Salmonella.

Para el método de Salmonella seleccionar al menos 30 cultivos puros de microorganismos.
ME
Microorganismos “no objetivo”:

Seleccionar al menos 30 cultivos puros de cepas que se conozcan causen interferencia con los
CU
microorganismos objetivo y/o cepas que se conozca estén presentes de manera natural para
cada alimento.
DO
5.2.9.2. Inoculación
Cada análisis deberá realizarse una sola vez. Utilizando un cultivo de la cepa, en la dilución de
trabajo. Sin muestra añadida.
 Microorganismos “objetivo”.
El nivel de inoculación deberá ser de 10 a 100 veces el nivel mínimo de detección para el
método alternativo. Se deberá ejecutar el protocolo completo, aun utilizando medio de pre-
enriquecimiento. Cuando es detectado un falso negativo, se deberá repetir la prueba con el
método de referencia.

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 Microorganismo “no objetivo”.

El nivel de inoculo deberá ser similar al mayor nivel de contaminación esperado en el alimento a
aprobar.
La exclusividad puede ser establecida si el medio de enriquecimiento es selectivo y puede ser
TA
remplazado por un caldo no selectivo. Cuando el método alternativo proporciona un resultado
positivo o dudoso con un microorganismo no objetivo. La prueba deberá ser repetida utilizando
UL
el protocolo completo. El método de referencia deberá ser realizado una sola vez.
5.2.9.3. Expresión de Resultados
NS
Los resultados deberán ser resumidos tabla:
Microorganismos
CO
Tabla 7. Presentación de resultados de selectividad.
Resultados
Método de Referencia Método Alternativo
DE
Cepas objetivo Resultado Esperado Resultado Actual Resultado Esperado Resultado Actual
1
2
Etc.,
O
Cepas no objetivo
1
NT
2
Etc.,
ME
5.2.9.4. Interpretación
La interpretación deberá ser realizada por el laboratorio líder o la CCAYAC, el cual deberá
CU
tomar en cuenta aspectos cualitativos y cuantitativos.

DO
5.3. Criterios para métodos cuantitativos
El método de referencia cuantitativo más utilizado es la cuantificación de colonias en placa, sin

embargo; en microbiología este tipo de datos discreto son muy comúnmente truncados; como
por ejemplo solo aplica para placas con no más de 300 colonias y aplicando el factor inverso de
la dilución se obtendrá el resultado final. Por esta razón y por algunos factores que envuelve el
crecimiento de estos microorganismos, los datos obtenidos de las cuentas son normalmente
convertidos a logaritmos para poder obtener de esta manera una distribución simétrica o más
cercana a esta. Con lo que conlleva a realizar un análisis de los datos por medio de
histogramas 30 datos o más bajo las mismas condiciones.

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5.3.1. Categorías de Alimentos.

Como se describe en el Anexo I. Clasificación de los tipos de muestra para estudios de
validación. Los alimentos se dividen en 5 categorías; sin embargo, pueden ser reducidas a 1, 2
o 3 categorías.
TA
Las muestras deben ser naturalmente contaminadas con el analito bajo estudio. Es deseable
que el muestreo cumpla con una buena distribución tanto como sea posible con el propósito de
UL
reducir el error analítico y ampliar el rango de validación en productos locales.
Si no se tiene la cantidad suficiente, es aceptable trabajar con muestras artificialmente
contaminadas; siempre y cuando se trabajen de tal manera que se obtenga un nivel de
NS
contaminación similar a las naturalmente contaminadas.
El protocolo deberá de contemplar que por cada una de las 5 categorías de alimento se deberá
CO
probar al menos 5 niveles de concentración del analito y ser medidos tanto por el método
alternativo como el de referencia, cada muestra deberá ser analizada por duplicado, que
representan globalmente de 10 a 50 mediciones por método y categoría de alimento.
DE
Si el resultado obtenido sugiere que la matriz no es homogénea o debida a variaciones en la
concentración del analito, se examinaran más muestras.
Después de la evaluación independiente por cada categoría de alimento, la evaluación global
O
de la curva de calibración a través de todas las categorías es un ejercicio útil para identificar
NT
cualquier discrepancia entre el ajuste de aplicación, la exactitud y la Repetibilidad propagada

dentro de todo el rango del analito.
ME
5.3.2. Protocolo de Medición.

Curva de calibración.
CU
Para la realización y verificación de la curva de calibración se requiere de varias muestras

diferentes y el número de dosis o concentraciones son una función del rango de concentración
para ser usado en práctica.
DO
Para establecer una curva de calibración se requiere un mínimo de 5 niveles del analito. Los
cuales deben cubrir todo el rango de interés: un mínimo (cero), un punto central, un máximo y
dos niveles intermedios. La elección de la escala tiene que ser realizada antes de elegir los
niveles de concentración, teniendo en cuenta los niveles de contaminación, el límite de
detección esperado. Esto puede influir en la relación entre la desviación estándar y los valores
medios de la respuesta.
Se da prioridad a las muestras contaminadas naturalmente. La palabra “nivel” es usada como
un a priori de la concentración del analito buscado. En principio un diseño óptimo para el
análisis de regresión es obtenido por la selección de una gama apropiada y pertinente de
concentraciones de analito; por no tomar en cuenta muestras con recuentos similares o eliminar
datos repetitivos con resultados similares.

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Las muestras se deben trabajar por duplicado por cada nivel, preparando sub-muestras; al
menos 2 y lo ideal es tener de 5 a 10. Cuando ambos métodos; referencia y alternativo utilizan
la misma dilución decimal realizar la determinación por duplicado en cajas Petri.
Por lo tanto se obtendrá un mínimo de 10 mediciones (idealmente de 25 a 50 utilizando
TA
muestras contaminadas naturalmente).
Si el material de referencia no estuviera disponible, no será posible estimar la exactitud del
UL
método alternativo, sólo se obtendrá la exactitud relativa por mediciones de las mismas sub-
muestras con el método de referencia.
NS
5.3.3. Muestras.
Realizar por lo menos 6 (preferiblemente 10) determinaciones de muestras blanco, las cuales
CO
deben tener como característica principal ser negativas, cero dosis o cercana a cero) para
estimar la línea base o el umbral de propagación.
DE
5.3.3.1. Cálculos
En caso general el nivel crítico y el límite de detección, involucran dos tipos de errores
O
estadísticos: 1. Detecta diferencia no existente (falso positivo) y 2. β (para no detectar una

NT
diferencia verdadera (falso negativo). 1-β es la probabilidad para detectar significativamente un

valor más grande que LC.
ME
5.3.4. Detección y Límites de Cuantificación.

La siguiente característica implica la confiabilidad de la señal o respuesta obtenida con el
CU
método alternativo para detectar una concentración cero, comparada con el método de
referencia. Por lo que determina el sesgo en el extremo inferior de la concentración. El ruido
DO
instrumental es generalmente determinado con 6 muestras blancos independientes.
5.3.5. Sensibilidad Relativa.

Se define como la capacidad del método alternativo para detectar dos diferentes cantidades de
analito medidos por el método de referencia sin el alimento a ensayar, ya sea en un valor
promedio especifico de concentración, o en todo el rango de medición; es decir; es la mínima
variación cuantificada (incremento de la concentración del analito X) que da como respuesta
una variación significante de la señal medida (respuesta Y).
La estimación de la sensibilidad es con el fin de cerciorarse que los valores dados por el método
alternativo no difieran notablemente del método de referencia (menos del 30% de diferencia).

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CCAYAC-CR-02/0

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CCAYAC-CR-02/1
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5.3.6. Inclusividad y Exclusividad.

En microbiología (excepto para el recuento total de la placa) la inclusividad y exclusividad son
establecidas por los análisis de:
TA
 Por lo menos 30 cepas puras positivas (analito a estudio)
 Por lo menos 20 cepas puras negativas (otros analitos) las cuales deben cumplir como
UL
característica que comúnmente causan interferencias con el analito “blanco”.
Seleccionar cepas positivas y negativas que regularmente contaminan los productos bajo
NS
análisis.
Para cepas que no pertenecen a una colección, llevar una identificación completa de las cepas
CO
de ensayo. Así como también el origen real de una cepa de alimento deberá ser conocido.
La inclusividad y exclusividad del método de referencia no necesitan estar establecidas sin ya
son conocidas.
DE
5.3.7. Características Adicionales del Método Alternativo.

Acerca del método alternativo se deberá documentar todas las demás características
O
pertinentes que afectan el funcionamiento del método: por ejemplo, la estabilidad, la fiabilidad,
robustez etc.,
NT
6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA.
ME
6.1. No aplica
CU
7. BIBLIOGRAFÍA
Documentos
DO
ISO-16140, International standard “Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for
7.1 the validation of alternative methods”
8. ANEXOS
Anexo I. Categorías de alimentos pertenecientes a los principales patógenos de transmisión
alimentaria.
Anexo II. Categorías de alimentos pertenecientes a los principales microorganismos no
patógenos.

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Anexo I. Categorías de alimentos pertenecientes a los principales patógenos de

transmisión alimentaria.
Tipo de producto Yersinia Clostridium Listeria E. coli Staphylococcus S. aureus Campylobacter Salmonella Bacillus
TA
spp. perfringens monocytogenes O:157 aureus enterotoxins spp. spp. cereus
&
VTEC
Productos cárnicos
UL
Crudos X X X X X X
Proceso térmico X X X
Congelados X X
NS
Fermentados X X
Curado X X X X
Otros Salsas Pate
Crudos
Proceso térmico
Congelados
X CO
Aves
X X
Otros
DE
Pescado y Productos de la pesca
Crudos X X X X
Proceso térmico
Congelados
O
Ahumados
Otros Salsas
NT
Frutas y Vegetales
Crudos X X X X X
Proceso térmico
ME
Congelados
Secos X
Fermentados
Salados
CU
Concentrados X X
Bajo contenido de
humedad
Otros Hongos
DO
Procesados
Productos Lácteos
Crudos X X X X X X X X
Proceso térmico X
Congelados X X X X X X
Fermentados X X X X X
Secos X X X X
Otros
Chocolate / Panadería
Bajo contenido de
X
humedad
Secos X
Otros Pasteles Natillas
Otros Productos
Especies X X X
Mayonesa X X
Pasta X

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Tipo de producto Yersinia Clostridium Listeria E. coli Staphylococcus S. aureus Campylobacter Salmonella Bacillus
spp. perfringens monocytogenes O:157 aureus enterotoxins spp. spp. cereus
&
VTEC
Productos cárnicos
Huevos y
TA
X
Derivados
Cereal / arroz X
UL
NS
CO
DE
O
NT
ME
CU
DO

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Anexo II. Categorías de alimentos pertenecientes a los principales microorganismos no

patógenos.
Tipo de producto Hongos y Levaduras Bacterias lácticas Cuenta Total Coliformes Escherichia coli
Productos cárnicos
Crudos X X X X
TA
Congelados X X
Fermentados X X
UL
Curado X
Otros X X
Aves
NS
Crudos X X X X
Congelados X X
Otros
Crudos
Proceso térmico
X
X
CO
Pescado y Productos de la pesca
X
X
X
X
X
Congelados X X
DE
Ahumados X X X
Otros
Frutas y Vegetales
Crudos X X X X
O
Proceso térmico X X
Congelados X X
NT
Secos X X X
Fermentados X
Salados X
Concentrados X X
ME
Bajo contenido de
X
humedad
Otros
CU
Productos Lácteos
Crudos X X X
Proceso térmico X X
Congelados X X X
DO
Fermentados X X
Secos X X
Otros
Chocolate / Panadería
Bajo contenido de
X X X
humedad
Secos X X
Otros
Otros Productos
Cerveza X
Aderezos X X
Especies
Mayonesa X X
Pasta
Huevos y Derivados
Cereal / Arroz

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SUSTITUYE A:
CCAYAC-CR-02/1
2019-04-17 2025-04-17
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9. HISTÓRICO DE CONTROL DE CAMBIOS.
CCAYAC-CR-02
TA
Persona que
Página del
Revisión y fecha del elabora los Cambios Relevantes de versión vigente con respecto a la
documento
documento anterior cambios en la anterior
UL
vigente
versión vigente
NS
Todo el Se actualiza el documento de acuerdo a los CCAYAC-P-001
documento y CCAYAC-IT-017 vigentes.
Rev: 1 Alejandro Galindo

CO
Se actualiza logo oficial institucional.
Se elimina el punto que mencionaba como responsabilidad
que el documento hace alusión a los requerimientos
García
2016-06-24 necesarios de los equipos automatizados antes de su
DE
2, 3 adquisición.
Se elimina el punto que mencionaba como responsabilidad

O
que los criterios funcionan como guía para el proceso de

evaluación una vez publicados en la página de COFEPRIS.
NT
ME
CU
DO

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COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 1 DE 20

Para fines de este documento se entiende por:

corresponde a un incremento proporcional o lineal en resultado. Una parte de la validación es

Elaboró: Revisó: Autorizó:

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 2 DE 20

son aplicables para un recuento viable total.

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 3 DE 20

mayoría de estos son automatizados.

5.2. Criterios para métodos cualitativos

El protocolo de validación comprende principalmente de la comparación de un método

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 4 DE 20

Si no se contara con la cantidad suficiente, es aceptable trabajar con muestras artificialmente

5.2.3. Número de muestras. CO

Categoría: Productos de la Pesca Total: 60 pruebas

Para muestras naturalmente contaminadas seguir el diagrama 1 o 2 según corresponda.

5.2.4. Preparación de la muestra

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 5 DE 20

Primera etapa de cultivo (por

Método de referencia Método alternativo

Segunda etapa, etc. Segunda etapa, etc.

Continuar cada análisis de acuerdo a este protocolo.

5.2.4.3. Si la situación anterior no es el caso, es decir, que el medio de pre-enriquecimiento,

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 6 DE 20

Método de referencia. Método alternativo

50 g del homogenizado (o 25 g 50 g del homogenizado (o 25 g

Continuar cada análisis de acuerdo a este protocolo.

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 7 DE 20

5.2.5. Protocolo de Medición

5.2.6. Cálculo e Interpretación

5.2.6.1. Tratamiento de los datos:

Tabla.1. Resultados pareados del método de referencia y alternativo:

Respuestas Método de referencia positivo Método de referencia negativo

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 8 DE 20

 Exactitud relativa: AC = (PA+NA)/N x 100%

Tabla 2. Límite de confianza menor en 95% para p=90% y mayor.

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 9 DE 20

Ejemplo: n = 20, p = 94 % por lo que el Limite de confianza Menor = 88 %.

Contar el número total de resultados aberrantes y seguir:

- Para Y< 6 (menos que 6 desacuerdos): prueba no disponible

- Para 6 ≤ Y ≤ 22 (por ejemplo: entre 6 y 22 desacuerdos):

La prueba no es disponible; determinar m como el más pequeño de los dos valores de PD y ND

Tabla 3. M valores para Y desacuerdos (6 Y 22)

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

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5.2.7. Resumen de Cálculos

Tabla 5. Resumen de cálculos.

100 × (𝑃𝐴 + 𝑁𝐴) 100 × 𝑃𝐴 100 × 𝐴𝑁

"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA, ANTES DE HACER USO DE ESTA VERSIÓN"

GUÍAS PARA LA APROBACIÓN DE MÉTODOS ALTERNATIVOS HOJA: 11 DE 20

de alimentos para cada nivel Li.

detección respectivamente. El límite de detección relativa es por lo tanto expresado como un

5.2.9. Inclusividad y Exclusividad

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