RNA Interference Therapies for an HIV-1 Functional Cure.

Terapias de ARN de interferencia para una cura funcional del VIH-1.

Las drogas para la terapia de VIH previenen el progreso de la enfermedad pero no pueden
eliminar el virus del individuo afectado.
Las terapias que utilizan ARN que utilizan las vías de interferencia del ARN para atacar la
replicación del VIH-1 son una opción para la terapia de trasplante de células y se han
incluido en todas las combinaciones de genes que están ahora en ensayos clínicos.
La terapia antiviral se dirigen a las enzimas transcriptasa inversa, proteasa e integrasa y los
receptores de entrada celular, CD4 y quimiocina C-C tipo 5. Pero sin embargo el VIH-1
persiste en los reservorios resistentes a medicamentos, que son linfocitos T CD4, incluso
después de una terapia larga.
Timothy Brown ha conseguido lo que parece ser una cura funcional permanente mediante
el trasplante de células resistentes al VIH-1, estas fueron células madre hematopoyéticas de
un individuo con deleción homocigótica CCR5∆32/∆32, un genotipo que hace que las
células sean resistentes a la infección por los virus R5 del VIH. Este tratamiento primero se
prescribió para la leucemia mieloide aguda recidivante. Desde el 2007, que él recibió el
tratamiento dejo los antivirales y tiene una cura funcional, es decir el VIH-1 no se está
replicando en el. Sin embargo esta no es una cura, por lo difícil que es conseguir personas
con ese genotipo y también el riesgo de la respuesta inmune.
La idea de trasplantar células para tratar el VIH, ha estado desde la epidemia. Lo primero
que se hizo fue un trasplante autólogo de células de linfocitos T CD4 transducidas ex vivo
con un gen que dirigía la producción de una proteína antiviral o de ARN. Se ha intentado
utilizar proteínas transdominantes Rev del VIH-1 que inhiben la exportación del ARN del
virus empalmado y de longitud completa al citoplasma, un péptido C del gp41 que inhibe la
entrada del virus y una proteína quimérica del motivo tripartito 5 alfa humana-rhesus que se
dirige a la cápside del VIH-1. Otro enfoque es la edición de genes para modificar el gen
CCR5 e imitar CCR5∆32/∆32 del donante con el genotipo resistente a la infección, por
medio del sistema CRISPR/Cas 9, sin embargo esto solo sería efectivo en los virus que
utilicen el CCR5 como receptor para entrar.
Los ARN se han utilizado para buscar la cura debido a su tamaño pequeño y a la poca
posibilidad de causar respuestas inmunes. Se agrupan en dos: los mecanismos basados en el
antisentido para dirigirse al ARN y los que actúan mediante mecanismos de señuelo o
aptámero para dirigirse a las proteínas. Los ARN señuelo se han diseñado para imitar las
estructuras de la respuesta de transactivación y del elemento de respuesta Rev en el ARN
del VIH-1 e inhibir las proteínas reguladoras del VIH-1 Tat y Rev. El problema es que
saturan los componentes de la maquinaria de interferencia de ARN. Los aptámeros de ARN
se han se dirigen contras las proteínas proteasa, integrasa y poliproteína Gag.
Todos los ARN antisentido actúan mediante el emparejamiento de bases con una secuencia
de ARN objetivo, pueden bloquear la traducción del ARN, interferir en el procesamiento
del ARN o reclutar ARNasas que degradan su ARN diana, ribozimas, que pueden unirse a
una secuencia de ARN diana y escindirla y los ARN de horquilla corta que utilizan la
maquinaria de los ARNi para eliminar el ARN diana.
 Vías del ARNi.
Mecanismo de defensa del ARNi.
Todas las células eucariotas pueden utilizar la vía del ARNi para atacar el ARN de doble
cadena extraño y eliminar patógenos. Se procesa el ARNd del patógeno en ARN pequeños
o de interferencia corta, estos se van a asociar con proteínas celulares para formar un
complejo de silenciamiento inducido por ARN, que puede escindir la secuencia de ARN
extraño de la que se derivó ARNsi. Dicer genera los ARNsi y Argonauta escinde los
ARNsi.
Mecanismo de regulación génica postranscripcional del ARNi.
Al igual que los ARNsi, los ARNmi utilizan la vía del ARNi para dirigirse a secuencias de
ARN que son complementarias a su cadena guía. En las células humanas estos derivan de
los promotores de la ARN polimerasa II. Estos forman una estructura de horquilla y se
exporta a través de la exportina 5. Una vez en el citoplasma se recluta la proteína
Argonauta y se forma el miRISC, que tiene como objetivo la represión de la traducción o la
degradación dirigida.
Se han identificado dos miARN derivados del elemento Tar del VIH y se han identificado
varios miARN que contribuyen a la latencia del VIH-1 en los linfocitos T CD4.
Terapias de ARNi.
Los siRNA pueden ser diseñados para disminuir la expresión de cualquier proteína
involucrada en la enfermedad humana y tienen el potencial de ser usados como
medicamentos para tratar muchos desórdenes sin terapias disponibles. Para su entrega a las
células se ha pensado en adenovirus para células que no se dividen y retrovirus para las que
si.
- ARNi pequeños: Se ha demostrado que la entrega de ARNsi a mamíferos puede
provocar una intensa respuesta de ARNi sin activar la vía del interferón. El más
utilizado consiste en dos cadenas de ARN de 21 nucleótidos que forman 19pb con
una saliente de dos nucleótidos en el extremo 3’ de cada cadena. ARNsi canónico.
ARNsi puede entrar directamente en el RISC, mientras que los que sean más largos
si necesitan ser escindidos por Dicer, pero son más efectivos, mejoran el ensamblaje
del RISC, la acumulación de la cadena guía y el reclutamiento de la cadena guía de
las proteínas Ago. Estas secuencias largas son más efectivas para el tratamiento del
VIH.
- ARN de horquilla corta: Los ARNsi también pueden ser entregados a las células a
partir de vectores de ADN que expresan ARNsh. Son expresados normalmente a
partir de promotores de la ARN polimerasa III. La transcripción empieza en 5’ y
termina en 3’. Las longitudes cortas para el tratamiento del VIH, fueron más
efectivas.

Terapias de ARNi para el VIH.

ARNsi anti-VIH.
Sus secuencias podrían adaptarse para dirigirse a las cepas virales particulares de un
paciente y proporcionar un enfoque personalizado de la terapia. Lo complicado es penetrar
los linfocitos donde se replica el VIH. Se necesita que estos ARNsi tengan una larga vida
útil, sean administrados por vía y llevar las cargas virales a niveles indetectables con al
menos una dosis diarias.
ARNsh anti-VIH.
 - ARNsh dirigidos a genes humanos: Los genes TRBP, ALIX y AGT6 son los más
adecuados para la inhibición a largo plazo de la replicación del VIH-1 con una
toxicidad mínima en líneas del linfocito T transducidas con ARNsh. Una de las
ventajas es que sería muy difícil que el VIH-1 desarrollara resistencia a la
eliminación de un factor crítico utilizado para su replicación. Lo difícil es encontrar
los genes que dan efectos secundarios.
- ARNsh contra el ARN-VIH: Se han diseñado ARNsh contra todas las regiones
codificantes y no codificantes del ARN del VIH-1, pero estas deben conservarse en
todas las cepas del VIH-1. Se han descubierto 19 regiones en las que se conservan y
21 ARNsh útiles para esto. 4 fueron útiles en linfocitos T transducidos.(2006).
En el 2007, se identificaron 216 secuencias diana con una conservación superior al
70% y seleccionaron 41. Los ARNsi dirigidos a estas regiones demostraron ser
activos contra la producción de VIH-1, pero no se sabe si esto se pueda extrapolar al
desarrollo de terapias con ARNsh. Uno de los mejores ARNsh dirigido a la región R
de la repetición terminal larga del VIH-1 ha sido evaluado en ratones humanizados
con un ARNsh dirigido al ARNm de CCR5.
Se examinó el ARN del VIH-1 en busca de sitios diana de ribozimas altamente
conservados e identificamos una secuencia en la región Gag que era inhibible por
una ribozima y que se podía utilizar para diseñar un ARNsh.
La ventaja de dirigirse a cepas altamente conservadas en el ARN del VIH-1 es que
puede ser más difícil desarrollar resistencia por mutaciones adquiridas en la
secuencia diana del ARNsh. Sin embargo el VIH puede escapar de esto por
mutaciones en secuencias fuera del sitio diana, que va a dificultar el acceso. Por eso
se debe conservar muy bien la estructura del ARN.
Conclusiones y Perspectivas.
El VIH-1 se puede tratar con fármacos, sin embargo esto puede tener efectos secundarios
que pueden desarrollar un virus multirresistente. Una solución podría ser la terapia con
ARNi, que no genera resistencia y se ha utilizado también el trasplante de CMH resistentes
al VIH, pero este ha presentado varias complicaciones, la única manera posible sería un
trasplante autólogo.
Otra forma para el trasplante de células resistentes al VIH-1 es modificar los linfocitos T
CD4 .
El VIH puede generar resistencia a los ARN pequeños o a los péptidos que se dirigen a su
replicación, por lo que se necesita una combinación de varios genes para mantener
restringido el VIH. Aunque los ARNsh puedan saturar las vías celulares de miARN, se han
expresado contra el VIH-1 de forma segura y en un ratón con trasplante de HSC. El
CRISPR/Cas9 se ha utilizado pero puede tener inmunogenicidad.
Se ha avanzado mucho en la identificación de terapias eficaces de ARNi para la infección
por el VIH-1 y muchos avances en el campo de las terapias de ARNi han sido impulsados
por el deseo de hacer nuevas terapias contra el VIH-1. Las mejoras en las tecnologías de
administración de ARN podrían hacer que las terapias con ARNsi sean candidatas
competitivas para las terapias combinadas contra el VIH-1 y los ARNhc dirigidos a la
replicación del VIH-1 seguramente formarán parte de los enfoques de trasplante de células
resistentes al VIH-1 para curar funcionalmente la infección por este virus.