Un requisito importante para el desarrollo de antivirales es el potencial de neutralización in

vivo. Para abordar esto, utilizamos ratones transgénicos K18-ACE2 que expresan ACE2 humano
como modelo para la infección por SARS-CoV-2. Para determinar si Fu2 podría reducir la
gravedad de la enfermedad cuando se administra en una infección temprana, probamos su
capacidad para neutralizar el virus y proteger a los ratones de los signos de la enfermedad in
vivo. Cuando se administró Fu2-Ty1 de manera profiláctica o terapéutica, observamos que
retrasó levemente la aparición de la enfermedad. Un problema importante con el uso
terapéutico de nanocuerpos es su corta vida media in vivo. Para prolongar la vida media en
suero, fusionamos Fu2 con el nanocuerpo Alb1 que se une a la albúmina sérica de ratón. Los
ratones fueron desafiados con una dosis estandarizada de un aislado de SARS-CoV-2. En los
días 1, 3, 5 y 6 después de la infección, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal
(ip) 600 µg de Fu2-Alb1. Todos los ratones infectados y no tratados experimentaron una
pérdida de peso considerable durante la primera semana de infección, y los ratones infectados
con la variante beta experimentaron un inicio de pérdida de peso ligeramente más rápido. Por
el contrario, el tratamiento con Fu2-Alb1 retrasó el inicio de la enfermedad y protegió a los
ratones de una pérdida de peso severa después de la infección con el virus fundador o la
variante beta. Por lo tanto, Fu2 es un candidato adecuado para la terapia antiviral contra el
SARS-CoV-2 y variantes comunes.

IMAGEN
A - línea de tiempo del experimento. Se desafió a ratones transgénicos K18-ACE2 con 86 PFU
de SARS-CoV-2 (azul, 'tipo salvaje') o 100 PFU de la variante beta (rojo) y se les inyectó Fu2-
Alb1 (Fu2 de vida media extendida) en el momento indicado.

B - Peso de los ratones durante el experimento de desafío. Los ratones no infectados (n  = 18)
se muestran en gris, los ratones infectados no tratados (n  = 15) en negro. La mitad de los
ratones no tratados son controles históricos de experimentos idénticos realizados
previamente. El peso de los mismos ratones de control no desafiados se muestra en el panel
superior e inferior. 

C - Pérdida de peso para el día 5 para cada grupo. Los ratones tratados con Fu2-Alb1 ( n  = 4
animales) experimentaron una pérdida de peso significativamente menor en comparación con
los ratones no tratados ( n  = 7 animales) después de la infección con el virus de tipo
salvaje. Una protección significativa contra la pérdida de peso fue igualmente evidente en los
ratones tratados con Fu2-Alb1 ( n  = 4 animales) en comparación con los ratones no tratados
( n  = 8 animales) después de la infección con la variante beta.

D - Análisis de carga viral en muestras orofaríngeas de ratones en el día 5 en grupos

infectados. Después de la infección con el virus de tipo salvaje, los ratones tratados con Fu2-
Alb1 ( n = 4 animales) tenían cargas virales significativamente reducidas en comparación con
los ratones no tratados ( n  = 7 animales). Los grupos que muestran una pérdida de peso
significativa en comparación con los ratones no infectados se anotan encima de los puntos de
ese grupo. 

DISCUSION
Los nanocuerpos representan una valiosa alternativa a los anticuerpos monoclonales para la
neutralización de virus. Su facilidad de producción, estabilidad térmica y comportamiento
bioquímico robusto, combinado con posibilidades de funcionalización y multimerización
sencillas, los convierten en candidatos adecuados para aplicaciones terapéuticas.
La variante beta del SARS-CoV-2 muestra nueve cambios de aminoácidos en la proteína de
punta. Si bien quedan por determinar las propiedades biológicas de esta variante, dos
sustituciones de aminoácidos en el motivo de unión del receptor son motivo de preocupación
potencial para la eficacia de la vacuna, la eficiencia de neutralización de las terapias con
anticuerpos monoclonales existentes y la dinámica alterada de la propagación del virus. El
nanocuerpo descrito aquí, Fu2, puede neutralizar efectivamente no solo la variante beta, sino
también la variante delta dominante y, por lo tanto, tiene potencial para formar la base para el
desarrollo de intervenciones terapéuticas.

La potencia del nanocuerpo Fu2 monomérico se redujo significativamente, probablemente

debido a la disminución de la afinidad con el RBD de este virus.

Los nanocuerpos suelen tener semividas séricas cortas, que oscilan entre 1 y 3 h, en
comparación con los 6 a 8 días de la IgG1. Esta característica puede influir dramáticamente en
la aplicabilidad para la neutralización de virus. En consecuencia, para Fu2-Ty1, no pudimos
detectar ningún efecto protector cuando se administró de manera profiláctica, mientras que la
administración terapéutica retrasó significativamente el inicio y la gravedad de la enfermedad.
Por el contrario, un heterodímero Fu2-Alb1 de vida media extendida mostró eficacia
terapéutica contra el 'tipo salvaje' y la variante beta, lo que sugiere que las construcciones
basadas en nanocuerpos tienen el potencial para la terapia antiviral SARS-CoV-2.

Además de bloquear estéricamente la interacción de ACE2, el nanocuerpo Fu2 específico de

RBD induce rápidamente la formación de trímeros-dímeros de punta y conduce a la agregación
de viriones. Si bien no podemos determinar la contribución precisa de la agregación a la
neutralización general, esperamos que agregue una capa adicional de protección,
especialmente en situaciones con alta concentración local de viriones y/o Fu2. Con base en
nuestros datos, planteamos la hipótesis de que el nanocuerpo primero se involucra con el RBD
en la 'interfaz principal' conservada, que es la interacción fuerte que se mide por SPR (Fig. 1d).
El RBD de la espiga unida a Fu2 se coloca en la conformación 'hacia arriba', lo que permite
acoplar otro trímero de espiga unido a Fu2. La interacción en la interfase-menor es
sustancialmente más débil pero compensada por los efectos de avidez de los 6 nanocuerpos
del complejo.

Curiosamente, otro estudio informó sobre un nanocuerpo que se une a un epítopo similar al
Fu2 e induce una estructura alargada con dos copias de la espiga con todos los RBD en las
conformaciones ascendentes, pero no pudieron definir la base estructural del fenómeno
observado.

La interacción entre Fu2 y RBD es muy inusual. Este modo de unión a antígeno puede ser poco
común en los repertorios de anticuerpos provocados naturalmente, pero podría lograrse
mediante el diseño de anticuerpos basados en la estructura y podría presentar una estrategia
general para la inmovilización potente de glicoproteínas virales y otros antígenos. Queda por
ver si los nanocuerpos monoméricos biespecíficos de 'diseñador' pueden empujar el sobre de
potencia más allá de lo que es actualmente alcanzable.