REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORESIS

ADRIANA MARIA GIL ZAPATA

Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

BIOCIENCIAS II

ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR

Hebra Templado Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de nucletidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa slo puede iniciar la sntesis de una cadena de DNA a partir de un 3OH libre. dNTPs : desoxirribonucletidos tri-fosfatados DNA Polimerasa

Temperatura

100

Melting 94 oC

PCR

50

Tiempo

DNA de cadena doble

3 5

5 3

Temperatura

100

Melting 94 oC

PCR

50

Tiempo
3 5

DNA de cadena simple

Calor

Temperatura

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

Tiempo
3 5 5

Hibridacin de primers

5 5 3

Temperatura

PCR
100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

30 ciclos

Tiempo
3 5

Calor
5 5

Calor
5 5 3

Temperatura

PCR
100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

30ciclos

Tiempo
3 5 5

5 5

5 5

5 5 3

Temperatura

PCR
100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

30ciclos

0
3 5 5

Tiempo
5

5 5 3

Calor
5 5

Calor
5

Temperatura

100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

PCR

30ciclos

0
3 5 5

Tiempo
5 5

5 5 3

5 5

5 5

5 5

Temperatura

PCR
100

Melting 94 oC

50

Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC

30ciclos

0
3 5 5

Tiempo
5 5

5 5 3

Fragmentos de tamao definido

5 5

5 5

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias 1 2 4 8 16 32 64

0 1 # ciclos

VENTAJAS DE PCR SOBRE OTRAS TECNICAS

ALTA SENSIBILIDAD ALTA ESPECIFICIDAD RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado especfico o productos amplificados previamente)

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR
Proceso que semeja in vitro la replicacin del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, despus de realizar 30 o ms ciclos.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. DENATURACIN 90 a 95 c

CICLO

2. ANILLAMIENTO 55 a 65 c 3. EXTENSIN 72 c

DENATURACION
El ADN sirve de molde para ser copiado. Un aumento de la temperatura o un pH alcalino permite que la cadena se separe. Es reversible

HIBRIDACION
Los primers se unen a los extremos 3 prima de la cadena. La nueva hebra tiene la direccion de 5 a 3 prima. Le dan la especificidad a la PCR.

EXTENSION
Actua la Taq (Termophilus aquaticus) polimerasa. Polimerisa los dNTPs.

PCR MIX
Buffer

Primers

ADN molde

dNTPs (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) ADN Polimerasa (Taq polimerasa) Cloruro de Magnesio (MgCl2) cofactor de la Taq.

Usos de la PCR
Pruebas de identificacin (STRs) Deteccin de enfermedades hereditarias Deteccin de enfermedad viral Clonacin de genes Mutagnesis dirigida Genotipificacin de mutaciones especificas (SNPs)

CLASES DE PCR
PCR MISMATCH RT PCR PCR TIEMPO REAL PCR MULTIPLEX PCR NESTED

Consiste en dos pasos: Transcripcin reversa

RT-PCR
OBJETIVO: Deteccin de la expresin de un gen por presencia de mRNA

PCR
mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

Transcripcin Reversa
1. Purificacin de RNA mensajero 2. Transcripcin reversa a cDNA (DNA copia)

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

Cuantificacin del nmero de copias de DNA presentes en la muestra (diagnstico, monitoreo de carga viral, comparacin entre nmero de copias en diferentes subespecies, etc.) Cuantificacin del mRNA por RT-PCR en tiempo real (anlisis de la expresin de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patolgicas, efecto de drogas, etc) Anlisis de la cintica de la reaccin

PCR en tiempo real

Deteccin y cuantificacin de reporteros fluorescentes. La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR. Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green

TaqMan PCR
Sonda especfica

CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

DNA copy number 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536 131,072 262,144 524,288 1,048,576 2,097,152 4,194,304 8,388,608 16,777,216 33,554,432 67,108,864 134,217,728 268,435,456 536,870,912 1,073,741,824 1,400,000,000 1,500,000,000 1,550,000,000 1,580,000,000

Copies of DNA=2N
1.8E+09 1.6E+09 1.4E+09 DNA copy number 1.2E+09 1.0E+09 8.0E+08 6.0E+08 4.0E+08 2.0E+08 0.0E+00 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle
10 9 8 DNA copy number (log) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR cycle

PCR reagent is the limiting factor!!

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relacin como lnea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR es una reaccin logartmica.

Real Time PCR

PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green. ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS: Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en el DNA o cDNAs de la muestra Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando productos pequeos

Ventajas del PCR en tiempo real

Simple y rpida (semi-automatizada). No hay manipulacin post-PCR. Eliminacin de contaminacin por amplicones. Cuantificacin del DNA o RNA molde inicial. Muy sensible. Deteccin de productos inespecficos con la opcin curva de desnaturalizacin (Melt-Curve). Deteccin de ms de un producto especfico en una misma reaccin. Extraordinariamente especfico.

SHORT TANDEM REPEATS

STRs
D3S1358 vWA FGA DYS 391

Localizacin cromosmica
3p 12p 4p Y

Secuencia
(TCTA)n (TCTG)n (CTTT)n (GCGT)n

Tamao ( pb )
114 - 142 152 - 197 219 - 167 210 - 264

METODOLOGIA DE ANLISIS DEL ADN

EXTRACCION DE ADN: Salting Out, Chelex

Autosmicos: D3S1358, VWA, FGA,

PCR
STRs

THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539.

Cromosoma Y: DYS19, DYS385, DYS389

I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393.
Cromosoma X: DXS8378, DXS9898,DXS8377 HPRTB

ELECTROFORESIS CAPILAR: ABI PRISM 310

D3S1358
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4 Alelo 5 Alelo 6

TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA n Alelo n POLIMORFISMO: Mltiples alelos posibles en la poblacin

KIT COFILER

ELECTROFORESIS

METODOLOGIA DE ANLISIS DEL ADN

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAR
EQUIPO ABI PRISM 310

ELECTROFORESIS
Tcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico. La velocidad de migracin es funcin de la densidad de carga y sta a su vez es funcin de una serie de parmetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza inica, voltaje, interacciones con el soporte.

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO

Catin ( carga + ) Anin ( carga - ) Migra al polo negativo. CATODO Migra al polo positivo. ANODO

La fuerza que ejerce el campo elctrico sobre la partcula cargada, es proporcional a la carga de la partcula y al voltaje del campo elctrico aplicado. F = Q X V

MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO Otra fuerza se opone al movimiento de la partcula y es proporcional al tamao y la forma de ella y a la viscosidad del buffer. Fr = F X V Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partcula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Carga neta de la partcula: Efecto del pH del tampn. Cuando las partculas se colocan en un campo elctrico, estas migrarn hacia el nodo o el ctodo en funcin de la carga neta que posean y sta depende del pH de la solucin en que se encuentran.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Tamao y Forma de la partcula: Segn el tipo de electroforesis, el tamao y la forma de la partcula pueden tener mayor o menor importancia. Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de molculas, segn el tamao, retienen las grandes y dejan pasar las ms pequeas.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Fuerza inica del tampn: En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampn como de las partculas en solucin, por tanto cuanto ms concentrado es el tampn, mayor la proporcin de corriente que transportan, menor la migracin de las partculas y peor la separacin.

FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Potencial del campo elctrico:
A mayor potencial del campo elctrico mayor velocidad de la partcula. Segn el mtodo electrofortico se elige trabajar manteniendo constante el V o A. Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de separacin, pero tambin la temperatura aparecen efectos indeseables como: desnaturalizacin de pr, evaporacin del buffer, aumento de la fuerza inica.

TIPOS DE SOPORTES
El procedimiento electrofortico lleva a cabo sobre dos soportes:: se

1. Soportes No Restrictivos: Las partculas colocadas sobre ellos, se separan nicamente en funcin de su carga elctrica. Los principales soportes son: Papel Acetato de Celulosa Agarosa

TIPOS DE SOPORTES
2. Soportes Restrictivos:
El soporte ejerce algn tipo de resistencia al desplazamiento de las molculas de la muestra. La resistencia estar dada por el tamao del poro del soporte y por el tamao y caractersticas de las molculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son: Geles de Almidn Geles de Poliacrilamida

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL AGAROSA: Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentracin entre 0.5 2 gr %. El tamao del poro es grande y permite el paso de molculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en funcin de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificacin por densitometra.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL POLIACRILAMIDA

Se forman por polimerizacin de la acrilamida con un agente enlazante. El tamao del poro vara, segn la concentracin de la acrilamida y las molculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaos. Soporte ideal para obtener mayor y mejor nmero de separaciones electroforticas. Se puede leer por densitometra. Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

ELECTROFORESIS CAPILAR
POLIMERO POP 4 Soporte restrictivo que permite la separacin de molculas de ADN desde un par de bases en adelante. Se deposita en un capilar de 1 mm de dimetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la seal de los fluorocromos.

ABI PRISM 310

ABI PRISM 310

FLUOROCROMOS

REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS
Obtencin de la Muestra Montaje de la jeringa

Montaje de la muestra

Electroforesis capilar

Deteccin por el laser

Lectura de electroferogramas

ELECTROFEROGRAMA

MARCADOR DE PESO MOLECULAR

LADDER ALLICO

PERFIL GENTICO