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DIARIO • INVESTIGAR • www.fasebj.org

La malabsorción de fructosa induce la expresión de

colecistoquinina en el íleon y el ciego al cambiar la
composición y el metabolismo de la microbiota
Xufei Zhang, *, † Alexandra Grosfeld,‡ Edek Williams,§ Daniel Vasiliauskas,{ Sharon Barretto,k
Lorena Smith,k Mahendra Mariadassou,# Catherine Philippe, * Fabienne Devime, * Chloé Melchior, **
Guillaume Gourcerol, ** Nathalie Dourmap,†† Nicolas Lapaque, * Pierre Larraufie, * Hervé M. Blottière, *
Christine Herberden, * Philippe Gerard, * Jens F. Rehfeld,‡‡ Ronaldo P. Ferraris,§§ J. Christopher Fritton,§
Sandrine Ellero-Simatos,k y Veronique Douard *, 1
* Instituto Micalis, Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Francia;
†Collège Doctoral, Sorbonne Université, París, Francia; ‡Centre de Recherche des Cordeliers, INSERM Unité Mixte de Recherche (UMR) S1138,
Sorbonne Université, Sorbonne Cités, Université Paris – Diderot (UPD), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Instituts Hospitalo –
Universitaires (IHU), Instituto de Cardiometabolismo y Nutrición (ICAN), París, Francia; §Departamento de Ortopedia y
§§Departamento de Farmacología, Fisiología y Neurociencia, Universidad de Rutgers, Newark, Nueva Jersey, EE. UU. {Instituto de Neurociencia
Paris-Saclay, Universidad Paris Sud, Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS), Universidad Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette, Francia;
kToxalim, Université de Toulouse, INRA, Toulouse, Francia; #Mathématiques et Informatique Appliquées du Génome à l'Environnement (MaIAGE),
Unité de Recherche (UR) 1404, INRA, Jouy-en-Josas, Francia; ** Unidad 1073 del INSERM, Universidad de Rouen (UNIROUEN), Universidad de
Normandie, Rouen, Francia;††UNIROUEN, INSERM U1245 y Hospital Universitario de Rouen, Centro de Normandía de Medicina Genómica y
Personalizada, Universidad de Normandía, Rouen, Francia; y‡‡Departamento de Bioquímica Clínica, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague,
Copenhague, Dinamarca

ABSTRACTO: Los niveles actuales de consumo de fructosa a menudo superan la capacidad intestinal para absorber
fructosa. Investigamos el impacto de la malabsorción de fructosa en la función endocrina intestinal y abordamos el
papel de la microbiota en este proceso. Para responder a esta pregunta, un modelo de ratón de malabsorción
moderada de fructosa [cetohexoquinasa mutante (KHK)2/2] y de tipo salvaje (WT) se utilizaron heces y recibieron una
dieta con 20% de fructosa (KHK-F y WT-F) o 20% de glucosa. Colecistoquinina (Cck)ARNm y expresión de proteínas en
el ileumandcecum, así como preproglucagón (Gcg) y neurotensinaNts) La expresión de ARNm en el ciego aumentó en
ratones KHK-F. En ratones KHK-F, la inmunohistoquímica de triple marca mostró una regulación positiva importante
de CCK en células interoendocrinas (EEC) que eran péptido 1 similar al glucagón (GLP-1).+/ Péptido YY (PYY2) en íleon y
colon y GLP-12/ PYY2 en el ciego. La composición de la microbiota cecal se modificó drásticamente en la asociación de
KHK-F con un aumento de las concentraciones de glucosa, propionato, succinato y lactato.Cckexpresión de ARNm y,
en células GLUTaga y humanas NCI-H716 de ratón,CckLos niveles de expresión de ARNm aumentaron en respuesta al
propionato, lo que sugiere un proceso dependiente de la microbiota. La fructosa que llega al intestino delgado puede
modificar la composición y el metabolismo de la microbiota, estimulando así la producción de CCK a partir de las EEC
posiblemente en respuesta al propionato. — Zhang, X., Grosfeld, A., Williams, E., Vasiliauskas, D. , Barretto, S., Smith,
L., Mariadassou, M., Philippe, C., Devime, F., Melchior, C., Gourcerol, G., Dourmap, N., Lapaque, N., Larraufie, P. ,
Blottière, HM, Herberden, C., Gerard, P., Rehfeld, JF, Ferraris, RP, Fritton, JC, Ellero-Simatos,
S., Douard, V. La malabsorción de fructosa induce la expresión de colecistoquinina en el íleon y el ciego al cambiar la
composición y el metabolismo de la microbiota. FASEB J. 33, 7126–7142 (2019). www.fasebj.org

PALABRAS CLAVE: CCK • KHK • propionato

ABREVIATURAS: AB, antibiótico; CCK, colecistoquinina; EEC, célula enteroendocrina; FC, cambio de pliegue; FFAR, receptor de ácidos grasos libres; FROGS, encuentra,
rápidamente, OTU con la solución Galaxy; GCG, preproglucagón; GIP, polipéptido inhibidor gástrico; GI, gastrointestinal; GLP-1, péptido 1 similar al glucagón;
GLUT, transportador facilitado de glucosa / fructosa; KHK, cetohexoquinasa; Math1, factor de transcripción atonal de bHLH 1; NeuroD, diferenciación neuronal;
Neurog, neurogenina; NTS, neurotensina; O-PLS-DA, proyección ortogonal sobre análisis discriminante de estructura latente; OTU, unidad taxonómica operativa;
Pax, caja pareada; PCA, análisis de componentes principales; PYY, péptido YY; qRT-PCR, PCR cuantitativa; AGCC, ácido graso de cadena corta; SCT, secretina; SST,
somatostatina; TPH1, triptófano hidroxilasa 1; WT, tipo salvaje

1 Correspondencia: Instituto Micalis, INRA, Domaine du Vilvert, 78352 Jouy-en-Josas, Francia. Correo electrónico: veronique.douard@inra.fr

doi: 10.1096 / fj.201801526RR

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7126 0892-6638 / 19 / 0033-7126 © FASEB

La ingesta de fructosa aumentó sustancialmente durante las
últimas décadas, llegando al nivel actual. per cápita consumo de
50 a 80 g / d en los Estados Unidos (1) y está aumentando en la
mayoría de los continentes (2). Mientras tanto, el 50% de la
población adulta no puede absorber completamente una carga
de fructosa de 25 g (3). Además, a pesar de ser el grupo de edad
que consume la mayor cantidad de fructosa (4), los niños
muestran la mayor susceptibilidad a la malabsorción de fructosa
(5). La malabsorción de fructosa se asocia comúnmente con
hinchazón, diarrea e hipersensibilidad visceral, así como con
depresión (6). Sin embargo, se desconocen los mecanismos
fundamentales por los que la fructosa conduce a estas
patologías.
En condiciones de ingesta normal de fructosa, la absorción
de fructosa se produce principalmente en el intestino proximal,
en el duodeno y en el yeyuno proximal. El transporte
transepitelial de fructosa está mediado por 2 miembros de la
familia de transportadores facilitadores de glucosa,
transportador facilitado de glucosa / fructosa (GLUT) 5 y GLUT2,
que se expresan en los enterocitos y se localizan en sus
membranas apical y basal, respectivamente (7, 8). La expresión
de GLUT5 está fuertemente regulada por la fructosa luminal de
una manera dependiente de la cetohexoquinasa (KHK) y es
esencial para el transporte intestinal de fructosa (9, 10). Sin
embargo, el transporte intestinal de fructosa es menos eficiente
que el transporte de glucosa (11), y una fracción sustancial de
fructosa llega a las regiones distales del intestino (íleon al colon)
después de una ingesta excesiva de fructosa (12).
Las células enteroendocrinas (EEC) distribuidas a lo largo del
tracto gastrointestinal (GI) liberan péptidos intestinales en
respuesta a estímulos luminales y regulan las funciones
fisiológicas GI y periféricas. Numerosos estudios han
demostrado que los cambios en el flujo de nutrientes en el
intestino pueden modificar la función endocrina a lo largo del
tracto GI a través de modificaciones en la distribución o actividad
transcripcional de los EEC. Por ejemplo, el número de péptido
similar al glucagón-1 (GLP-1) -, polipéptido insulinotrópico
dependiente de glucosa (GIP) - y células positivas al péptido YY
(PYY), así como la densidad de colecistoquinina (CCK) - y células
positivas a neurotensina (NTS) aumentaron en
roedoresmodeloso pacientes inhumanos después de un bypass
gástrico en Y de Roux (13-16). Modelos animales de síndrome del
intestino corto, un fuerte trastorno de malabsorción resultante
de la resección del intestino delgado,Pyy y Gcg niveles de
transcripción en el colon (17). Curiosamente, la transferencia de
la microbiota del paciente con síndrome del intestino corto a
ratas libres de gérmenes aumentó la densidad de células
positivas para GLP-1 en el colon de los animales receptores en
comparación con ratas colonizadas con microbiota convencional,
lo que enfatiza el papel del ecosistema intestinal en la
proliferación intestinal de EEC. y diferenciación (18). Numerosos
estudios han destacado la capacidad de los productos derivados
de la microbiota para regularGcg expresión, secreción de GLP-1
o PYY, o actividades transcripcionales de células L (EEC que
secretan GLP-1 y PYY) (19-21). Sin embargo, aunque ahora está
bien establecido que la mayoría de los EEC secretan más de un
péptido (22), la capacidad de la microbiota para modular
específicamente el panel de hormonas secretadas en los EEC
individuales sigue sin estar clara.
Recientemente, el uso del KHK-knockout (KHK2/2)
modelo de ratón demostró que aunque GLUT5 basal
LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL
expresión permite bajos niveles de absorción de fructosa, el
KHK2/2 los ratones no pueden adaptarse a una mayor
concentración luminal de fructosa (9, 23). Por lo tanto,
representan un buen modelo de malabsorción moderada de
fructosa. Aquí, usamos el KHK2/2 ratones para investigar el
impacto de la malabsorción de fructosa en la función
endocrina de las regiones del intestino delgado (íleon y
ciego, así como el colon) y estudiar el papel de la microbiota
intestinal en la mediación de los efectos de la fructosa.
Encontramos que la fructosa que llega a las regiones distales
del tracto GI es capaz de modificar el panel de péptidos
secretados por las EEC del íleon, ciego y colon (normalmente
dedicadas a la secreción de PYY y GLP-1), particularmente al
estimular la transcripción y secreción de CCK. Demostramos
que este efecto está, al menos en parte, mediado por los
cambios inducidos por la fructosa en las poblaciones de
microbiota y el metabolismo en el intestino delgado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
El presente protocolo recibió un acuerdo por escrito del comité local
de ética animal [Comité d'Ethique en Expérimentation Animale
(COMETHEA) en Jouy-en-Josas, Francia, APAFIS
1620-2015102618572930v2]. KHK2/2 (antecedentes: ratones C57 /
BL6) se obtuvieron de Ronaldo P. Ferraris (Universidad de Rutgers,
Newark, Nueva Jersey, EE. UU.) con permiso de Richard J. Johnson
(División de Enfermedades Renales e Hipertensión, Universidad de
Colorado – Denver, Aurora, CO, EE. UU. ) (24). Los ratones eran un
knockout global de KHK y carecían de ambas isoformas (A y C) de
KHK como describió previamente Diggle.et al. (25). Todo KHK2/2 y los
ratones de tipo salvaje (WT) eran compañeros de camada. Solo se
utilizaron machos y todos los experimentos de alimentación
comenzaron con ratones de 4 a 7 semanas.
Diseño experimental
En el primer experimento, WT y KHK2/2 ratones (6-8 ratones /
grupo) recibieron durante 8 semanas 20% de fructosa (grupos
WT-F y KHK-F, respectivamente) o 20% de glucosa (grupos WT-G
y KHK-G) dietas isocalóricas experimentales basadas en una
fórmula estándar 93G del Instituto Americano de Nutrición
(Research Diets, New Brunswick, NJ, EE. UU.) y que contiene,
además de almidón, 20% de fructosa o 20% de glucosa,
respectivamente.
En el segundo experimento, WT y KHK alimentados con pienso de la misma
edad2/2 los ratones se dividieron en 2 grupos (5-7 ratones / grupo) de peso
corporal similar y recibieron durante 7 días agua corriente o mezcla de
antibiótico (AB) en su botella. La mezcla AB estaba compuesta de vancomicina
(45metrog / ml), estreptomicina (1 mg / ml), colistina (1 mg / ml) y ampicilina (1
mg / ml). Los ratones se alojaron individualmente. Las mediciones del peso
corporal y de la ingesta de alimentos y bebidas, así como los cambios de mezcla
y de cama, se realizaron cada 2 días. Después de los primeros 7 días, se
mantuvo el tratamiento con AB, y tanto el grupo AB como el grupo de agua de
control recibieron una dieta con 20% de fructosa durante 3 semanas. El
acortamiento de este período de alimentación con fructosa a 3 semanas se
validó primero al mostrar que los efectos sobre los niveles de expresión de
péptidos y la composición de la microbiota eran similares después de 3 u 8
semanas de alimentación con fructosa (Fig. Complementaria S1A, B).
Para todos los experimentos, los ratones alimentados se sacrificaron
bajo anestesia. Se recogió sangre a nivel de la vena porta.
7127
Se tomaron muestras y se pesó el ciego. Se tomaron muestras de todo el La eliminación de parafina, la recuperación de antígeno inducida por
intestino delgado y el colon y se lavaron abundantemente con PBS frío. Se calor se realizó en tampón de citrato trisódico 10 mM (pH 6,0)
almacenaron secciones de 1 cm de duodeno, yeyuno medio, íleon y colon durante 40 min a 96ºC. Las secciones se enjuagaron en PBS y se
proximal con ARN posterior (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. bloquearon en reactivo bloqueador de IG de ratón 1/100 (Vector
UU.) En280 ° C hasta la extracción de ARN o fijado en paraformaldehído al Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) Diluido en suero de burro
4% para inmunohistología. El contenido cecal fue muestreado y normal al 1% durante 1 ha temperatura ambiente. A continuación,
almacenado en280 ° C para análisis de ADN bacteriano y metabolitos. El las secciones se incubaron con anticuerpos primarios: anti-CCK de
epitelio del ciego se lavó, seccionó y almacenó como se describe conejo (sc2037, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.),
anteriormente para la extracción de ARN, inmunohistología o análisis del Anti-GLP-1 de ratón (ab23472, 1: 400, Abcam, Cambridge, Reino
contenido de CCK. Unido). , EE.UU.) y anti-PYY de cabra (sc47318, 1:50; Santa Cruz
Biotechnology) durante 16 ha 4 ° C en suero de burro al 1% en PBS.
Después de los enjuagues con PBS, los portaobjetos se incubaron
Extracción de ARN tisular y PCR con los anticuerpos secundarios apropiados (Thermo Fisher
cuantitativa en tiempo real Scientific): IgG anti-conejo de burro conjugado con Alexa Fluor 555
(1: 750), Alexa Fluor 488y, transportador de glucosa / fructosa
facilitado conjugado anti-IgG de ratón de burro (1: 700), y Alexa Fluor
Se extrajo ARNm de secciones de duodeno, yeyuno, ciego y colon
647y, transportador de glucosa / fructosa facilitado conjugado anti-
utilizando el kit de aislamiento MirVana (Thermo Fisher Scientific).
IgG de cabra de burro (1: 500) durante 1 ha temperatura ambiente.
ARN total (2metrog) se transcribió de forma inversa utilizando el kit
Se obtuvieron imágenes de las secciones teñidas utilizando
de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher
microscopía confocal de barrido láser (SP8; Leica Microsystems,
Scientific). Para cuantificar el ARNm del péptido intestinal, se realizó
Wetzlar, Alemania). Se tomaron imágenes de todas las secciones
una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando química SYBR
teñidas con la misma combinación de marcadores usando la misma
Green (Thermo Fisher Scientific). ElB-El gen de mantenimiento de
configuración. La tinción inespecífica con anticuerpos secundarios
actina se utilizó para normalizar la abundancia de ARNm. Los
fue consistentemente insignificante. Para el recuento de células, las
cebadores se enumeran enTabla 1. Para los marcadores de
secciones inmuno-teñidas se escanearon utilizando un escáner de
diferenciación EEC [factor de transcripción atonal bHLH (Math) 1,
portaobjetos digital de alta capacidad (Pannoramic Scan; 3DHistech,
neurogenina (Neurog) 3, diferenciación neuronal (NeuroD) 1, caja
Budapest, Hungría) y las imágenes se analizaron utilizando el
emparejada (Pax) 4 y Pax6], se realizó una preamplificación con
software 3DHistech CaseViewer. Los recuentos se realizaron a ciegas.
cebadores TaqMan prediseñados [Mm00476035_s1, Mn00437606_s1,
Los recuentos se basaron en promedios de 2-4 cortes transversales
Mm01946604_s1, Mm01159036_m1 y Mm00443081_m1 (Expresión
intestinales de cada extremidad para cada animal. Para cada sección,
genética de ensayos bajo demanda; Thermo Fisher Scientific)] con
TaqMan PreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). La
cuantificación de los genes diana preamplificados se logró utilizando
qPCR en tiempo real basado en ensayos de expresión génica
TaqMan con los mismos cebadores TaqMan prediseñados. ElB-Se
utilizó el gen de actina (Mm00607939_s1) para normalizar la
Análisis de contenido cecal
abundancia de ARNm.

Las concentraciones de péptido CCK en extractos de tejido cecal se

Inmunohistoquímica
Se fijaron íleon, ciego y colon en paraformaldehído fresco al 4%
en PBS (pH 7,3) durante la noche a 4ºC y luego se incluyeron en
parafina. El 5-metroSe obtuvieron m secciones. Después
midieron usando un radioinmunoensayo interno específico, como lo
detalló anteriormente Rehfeld (26).
El contenido cecal de WT y KHK2/2 Los ratones alimentados con fructosa con
o sin AB se analizaron en busca de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y
ácidos grasos de cadena ramificada mediante cromatografía de gases, como
describió anteriormente Lan. et al. (27).

TABLA 1. Cebadores utilizados para qRT-PCR en tiempo real

Imprimaciones, 59–39
Adhesión al banco de genes
Nombre del gen (abreviatura) número Adelante Contrarrestar

Cebadores de ratón
B ActinaB-actina) NM_007393 CTAAGGCCAACCGTGAAAAG ACCAGAGGCATACAGGGACA
Polipéptido inhibidor gástrico NM_008119 CAGGTAGGAGGAGAAGACCTCAT CCTAGATTGTGTCCCCTAGCC
(Gip)
Colecistoquinina (Cck) NM_031161 GCTGATTTCCCCATCCAAA GCTTCTGCAGGGACTACCG
Péptido YY (Pyy) NM_145435 CCTACCCTGCCAAACCAG GGACATCTCTTTTTCCATACCG
Preproglucagón (Gcg) AF276754 CACGCCCTTCAAGACACAG GTCCTCATGCGCTTCTGTC
LeptinaLep) NM_008493 CAGGATCAATGACATTTCACACA GCTGGTGAGGACCTGTTGAT
Neurotensina (Nts) NM_024435 AGCTGGTGTGCCTGACTCTC CCAGGGCTCTCACATCTTCT
Somatostatina (Sst) NM_009215 CCCAGACTCCGTCAGTTTCT GGGCATCATTCTCTGTCTGG
SecretinaSct) NM_001309439 CGATGCTACTGCTGTTGCTG TCTGAGTGTCTTGGGGTCCT
Triptófano hidroxilasa 1 (Tph1) NM_009414 CACAGTTCAGATCCCCTCTACA GAACGTGGCCTAGGAGTTCA
Cebadores humanos
B ActinaB-actina) NM_001101 ATTGGCAATGAGCGGTTC GGATGCCACAGGACTCCA
Preproglucagón (Gcg) NM_002054 TCTGTTCTACAGCACACTACCAGA AGCTGCCTTGTACCAGCATT
Neurotensina (Nts) NM_006183 TGACCAATATGCATACATCAAAGA CTTCATGAACTTCTCCTGTTTCC
Colecistoquinina (Cck) NM_000729 AGAGAACGGATGGCGAGTC CATTCGTCCAGAAGGAGCTT

7128 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org ZHANG ET AL.

 Los contenidos cecales se analizaron mediante espectroscopia de
RMN (1H-NMR). Brevemente se extrajeron 80-100 mg del contenido cecal
con 500metrol tampón de fosfato (0,2 M, pH 7,4) en D2O que contiene 1%
(p / v) de 3- (trimetilsilil) propionato de sodio. Después de agitar con
vórtex, cada muestra se sometió a un ciclo de congelación-
descongelación en nitrógeno líquido y posteriormente se homogeneizó
con un lisador de tejidos (Qiagen, Hilden, Alemania) a 20 Hz durante 40 s
seguido de centrifugación a 10.000gramo durante 10 min a 4 ° C. Se
recogieron los sobrenadantes y el sedimento restante se extrajo una vez
más como se describió anteriormente. Los sobrenadantes obtenidos de
las 2 extracciones se combinaron y centrifugaron a 10.000gramo durante
10 min a 4 ° C. Un total de 600metroSe transfirió 1 sobrenadante a un
tubo de RMN (diámetro exterior, 5 mm) en espera del análisis de RMN.
Todo1Los espectros de H-NMR se obtuvieron en un espectrómetro de
NMR Bruker DRX-600-Avance (Bruker, Billerica, MA, EE. UU.) En la
plataforma de metabolómica Axiom (MetaToul, Toulouse, Francia) como
se describió previamente en detalle por Lukowicz et al. (28).
Extracción de ADN de microbiota y cuantificación
de qPCR en tiempo real
Todo el ADN de las bacterias se extrajo del contenido del ciego
utilizando el kit de aislamiento de ADN Gnome (MP Biomedicals,
Santa Ana, CA, EE. UU.). Las cuantificaciones del ADN bacteriano total
y los filos específicos se realizaron en 10 ng de ADN mediante qPCR
en tiempo real siguiendo el procedimiento previamente descrito por
Furet.et al. (29). La qPCR en tiempo real se realizó utilizando las
siguientes sondas específicas de los 4 filos principales: Firmicutes
(928F-Firm-59-TGAAA-CTYAAAGGAATTGACG-39 y 1040-FirmR-59-
ACCATGCA-CCACCTGTC-39), Bacteroidetes (MIBF-59-GGCGACCGGCG-
CACGGG-39 y MIBR-59-GRCCTTCCTCTCAGAACCC-39),Proteobacterias
(1080gramoF-59-TCGTCAGCTCGTGTYGTGA-39 ygramo1202R-59-
CGTAAGGGCCATGATG-39) y Actinobacteria (Act920F3-59-
TACGGCCGCAAGGCTA-39 y Act1200R-59 -TCRTCCCCACCTTCCTCCG-3
9) con SYBR Green PCR 23Mezcla maestra (Thermo Fisher Scientific)
como se describió anteriormente. Todas las reacciones de qPCR en
tiempo real se llevaron a cabo en un volumen final de 25metrol con
0,2 metroM concentración final de cada cebador y 5 metrol de
diluciones apropiadas de muestras de ADN. Las amplificaciones se
llevaron a cabo utilizando el siguiente perfil de rampa: 1 ciclo a 95 ° C
durante 10 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 sy 61 ° C
durante 1 min. El número total de bacterias se infirió a partir de las
curvas estándar promediadas como se describió anteriormente en
las refs. 29–31. Para la cuantificación de Firmicutes, Bacteroidetes,
Actinobacteria y Proteobacteria, se generaron curvas estándar a
partir de diluciones en serie de una concentración conocida de ADN
genómico deLactobacillus acidophilus, Bacteroides fragilis,
Bifidobacterium adolescentis,y Escherichia coli, respectivamente.
Secuenciación de ARNr 16S
La región V3-V4 de los genes de ARNr 16S se amplificó usando
MolTaq (Molzym, Bremen, Alemania) y los cebadores V3F: 59-
TACGGRAGGCAGCAG-39 y V4R: 59-ATCT-TACCAGGGTATCTAATCCT-39
(32). Los amplicones purificados se secuenciaron utilizando la
tecnología de secuenciación MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.)
En la plataforma GeT-PLaGe (Genotoul, Toulouse, Francia). Las
lecturas de los extremos emparejados obtenidas de la secuenciación
de MiSeq se analizaron utilizando la tubería compatible con Galaxys
denominada Find, Rapidly, Operational Taxonomic Units (OTU) con
Galaxy Solution (FROGS) (33). Para el preprocesamiento, se
mantuvieron las lecturas con una longitud de $ 380 pb. Las
herramientas de agrupación y eliminación de quimeras siguieron las
pautas de FROGS (33). La asignación se realizó utilizando la base de
datos Silva (https://www.arb-silva.de/). Las OTU con abundancias
inferiores al 0,005% se eliminaron del análisis (34).
LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL
Cultivo celular GLUTag y NCI-H716 y expresión de
ARNm de péptidos
La línea celular GLUTag proporcionada por Daniel Drucker
(Mount Sinai Hospital, Toronto, ON, Canadá) y NCI-H716
(CCL-251; ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) Se mantuvieron a 37 ° C y
5% de CO2 a 95% de humedad hasta un 80% de confluencia,
luego se divide y se transfiere a matraces T75 nuevos. ml) y
estreptomicina (10,000 metrog / ml). La composición del medio
de mantenimiento celular NCI-H716 fue RPMI-1640 con 2 g / L de
glucosa (Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero
bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina al 1% (10,000 U / ml) y
estreptomicina (10,000metrog / ml) y 2 mM L-glutamina. Para el
ensayo, 24 a 48 h antes del estudio, las células GLUTag se
sembraron en placas de 6 pocillos recubiertas previamente con
membrana basal de matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE.
UU.) Y las células NCI-H716 se sembraron en placas estándar de
12 pocillos , ambos con el mismo medio que para su
mantenimiento. A; 80% de confluencia, las células GLUTag se
incubaron en DMEM de glucosa 1 mM y las células NCI-H716 se
incubaron en glucosa 1 mM y RPMI de glutamina al 1%. Cada
medio se complementó con FBS al 1% y penicilina y
estreptomicina al 1%. Para los experimentos, el medio se utilizó
como control de glucosa 1 mM o se completó para alcanzar 25
mM de glucosa, 25 mM de fructosa, 10 mM de lactato, 2 mM de
propionato, 2 mM de succinato o 25 mM de glucosa + 10metroM
forskolina + 10 metroM 3-isobutil-1- metilxantina (control
positivo) durante 24 h. Luego, los sedimentos celulares se
utilizaron para la extracción de ARNm con Trizol (Thermo Fisher
Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Estos
experimentos se repitieron 3 veces para GLUTag (para cada
experimento, cada condición se realizó por triplicado) y 4 veces
para las células NCI-H716. La transcripción inversa y la qPCR en
tiempo real se realizaron como se describió anteriormente y los
cebadores se enumeran en la Tabla 1.
análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism v.5
(GraphPad Software, La JollaCA, EE. UU.) Y los datos se expresaron
como medias 6 SEM. Por todos los medios obtenidos deen vivo
experimentos con más de 2 grupos, se realizó ANOVA de 1 vía
seguido de Tukey post hoc La prueba después del ANOVA inicial
mostró efectos significativos. Para medios de 2 grupos, un
estudiantet se realizó la prueba. Las medias de los datos de
expresión de péptidos de GLUTag y NCI-H716 se compararon
mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de
comparación múltiple de Dunn.
Los datos de secuenciación 16S se analizaron utilizando los
paquetes Phyloseq (29) y ggplot2 (35) R además de scripts
personalizados. Las muestras se enrarecieron a profundidades de
muestreo uniformes antes de calcular las diversidades de
composición dentro de las muestras (riqueza observada y Simpson
inverso) y la diversidad de composición entre muestras (Bray-Curtis).
También se realizó un análisis de coordenadas principales en las
diferencias de Bray-Curtis para obtener una representación
bidimensional de las muestras. Los datos de diversidad alfa se
analizaron utilizando ANOVA de 1 vía. Se realizó una prueba ANOVA
permutacional multivariante en las matrices de Bray-Curtis usando
9999 permutaciones aleatorias y con un nivel de significancia de
0.01. Las abundancias relativas de filo se compararon mediante la
prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Dunn porque no
satisfacían la suposición normal del ANOVA estándar.PAGSlos valores
se ajustaron mediante la corrección de Holm. Se utilizaron recuentos
de OTU sin refinar sin procesar para producir gráficos de abundancia
relativa y para encontrar taxones con abundancias
significativamente diferentes en KHK-F y WT-F. Un modelo binomial
negativo
7129
se ajustó a cada OTU, utilizando DESeq2 (36) con parámetros predeterminados,
para estimar los cambios logarítmicos (FC) de abundancia. Valores dePAGSse
corrigieron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento BH para
controlar la tasa de falsos descubrimientos y se seleccionaron OTU
significativas en función del tamaño del efecto (FC.8 o FC, 1/8), ajustadoPAGS
valor(,0,001) y prevalencia (abundancia relativa .0,1% en al menos la mitad de
las muestras).
1Los datos de H-NMR se centraron en la media antes del análisis
mediante el análisis de componentes principales (PCA) y la proyección
ortogonal en el análisis discriminante de estructura latente (O-PLS-DA)
como describió anteriormente Lukowicz et al. (28).
RESULTADOS
La malabsorción de fructosa afecta los
parámetros intestinales
Como era de esperar, en los ratones WT, la dieta con fructosa
(WT-F) indujo una regulación positiva significativa de Glut5
expresión en el yeyuno en comparación con los ratones
alimentados con dieta de glucosa (WT-G) (Fig. suplementaria S2
A). La supresión de KHKgen impidió esta inducción de Glut5
expresión por fructosa. En el KHK2/2 En ratones, la alimentación
con fructosa (KHK-F) se asoció con un aumento significativo en el
peso del ciego y un agrandamiento del epitelio del ciego en
relación con los mutantes KHK alimentados con glucosa (KHK-G)
o los grupos WT-F o WT-G (Figura suplementaria S2ANTES DE
CRISTO). También se observaron cambios morfológicos en los
tejidos del íleon y del ciego, como un aumento significativo de la
longitud del invillus en el íleon y la longitud de la cripta +
vellosidad en el ciego del KHK-F en comparación con los ratones
WT-F (Tabla complementaria S1). No se observaron diferencias
en la profundidad de la cripta del colon. A nivel fisiológico, ni la
supresión deKHK ni la dieta con fructosa afectó el peso corporal,
la ingesta diaria de alimentos o la adiposidad del epidídimo
(Tabla complementaria S2).
La malabsorción de fructosa afecta el patrón de expresión de péptidos
intestinales a lo largo del tracto gastrointestinal
Estudios anteriores demostraron que los cambios en el flujo de
nutrientes podrían modificar la expresión de péptidos
intestinales en áreas específicas del intestino (13-16). Por lo
tanto, investigamos el impacto de la malabsorción de fructosa
en el patrón de expresión de los principales péptidos intestinales
a lo largo del tracto gastrointestinal. En el duodeno y yeyuno, no
se observaron cambios significativos en la expresión del péptido
intestinal entre los 4 grupos excepto por una disminución enPyy
Expresión de ARNm en el yeyuno de KHK-F en comparación con
ratones WT-F y WT-G (Figura 1A, B). Por el contrario, en el íleon y
el ciego, la malabsorción de fructosa se asoció con cambios
importantes en la expresión del ARNm del péptido (Fig.1CD). Los
niveles de expresión de Cck El ARNm fue 5 y 9 veces mayor en el
íleon y el ciego, respectivamente, de KHK-F que en los otros 3
grupos de ratones. La expresión deGcg fue 1,8 y 3 veces mayor
en el íleon y el ciego, respectivamente, de KHK-F en comparación
con los otros 3 grupos. A pesar de queNts Los niveles de
transcripción fueron similares en el íleon en los 4 grupos, su
expresión se incrementó 6 veces en el ciego de KHK-F en
comparación con los otros 3 grupos. Aumentos más modestos
enPyy1,6 veces) y Sst (codificación para
7130 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org
somatostatina) (1,7 veces) la expresión de ARNm también se
midió en el ciego de ratones KHK-F en comparación con el
grupo KHK-G y WT-F. En el colon, se observó una expresión
más variable para la mayoría de los péptidos (Fig.1MI) y solo
Pyy La expresión de ARNm fue significativamente mayor en
el KHK-F en comparación con los ratones WT-G. GIP, Sct (
codificación de secretina), y Tph1(que codifica triptófano
hidroxilasa 1, una enzima de la vía de síntesis de serotonina)
Los niveles de expresión de ARNm no cambiaron en
respuesta a fructosa o malabsorción de fructosa en ninguno
de los segmentos GI.
La malabsorción de fructosa afecta la población de
tipos de células CCK-positivas en el intestino delgado
El L-células pueden sintetizar GLP-1 (expresado a partir de
Gcggen) y PYY. Estas células se localizan principalmente en el
intestino grueso (íleon, ciego y colon), mientras que la CCK
normalmente es sintetizada por otros EEC, las células I
localizadas principalmente en el duodeno y el yeyuno
proximal. Sin embargo, estudios recientes demostraron que
se puede expresar más de 1 péptido en cada célula L o I (37).
Para determinar si los cambios en la expresión de péptidos
estaban respaldados por un aumento en el número de EEC o
un cambio en el patrón de expresión de péptidos en las
células existentes, cuantificamos el número de células
positivas a CCK, GLP-1 y PPY (CCK+, GLP-1+ y PYY+) en el íleon,
ciego y colon de los ratones KHK-F y WT-F. También se
realizó un marcado triple por inmunohistoquímica de CCK,
GLP-1 y PYY para determinar qué tipo de célula soporta el
drástico aumento de CCK en KHK-F. La densidad de CCK+ Las
células aumentaron significativamente en el íleon, ciego y
colon de KHK-F en relación con los ratones WT-F (Figura 2A).
En el íleon, la malabsorción de fructosa también se asoció
con un aumento significativo de GLP-1+ densidad celular
(Fig.2B), mientras que el PYY+ La densidad celular disminuyó
significativamente (Fig.2C). No se observaron cambios en la
densidad en el ciego y el colon para GLP-1+
y PYY+ células. Es importante destacar que el aumentoCck
Niveles de ARNm y CCK1 La densidad celular se traduce en un
aumento de 7 veces en el contenido de péptido CCK en el tejido
cecal del KHK-F en comparación con el WT-F (Fig.2D). El aumento
de CCK+ La densidad celular en el íleon, el ciego y el colon en el
KHK-F en comparación con el WT-F se ilustra en la Fig.2.P.EJ'.
La tinción triple utilizada para investigar la colocalización de
CCK, GLP-1 y PYY mostró 4 tipos de células inmunorreactivas a
CCK en el tracto gastrointestinal distal: CCK+
células que no coexpresan ni GLP-1 ni PYY (CCK+/ GLP-12/ PYY2) (
Fig. 3AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO‴), CCK+ células que
coexpresan PYY pero no GLP-1 (CCK+/ GLP-12/ PYY+) (Fig. 3CAMA
Y DESAYUNO‴), CCK+ células que coexpresan GLP-1 pero no PPY
(CCK+/ GLP-1+/ PYY2) (Fig. 3C – C‴), y CCK+ células que coexpresan
tanto GLP-1 como PYY (CCK+/ GLP-1+/ PYY+) (Fig. 3D – D‴).
En el grupo WT-F, la CCK predominante+ La población
celular en el íleon, ciego y colon fueron las células triple
positivas (CCK+/ GLP-1+/ PYY+) (Fig. 3P.EJ y Tabla
complementaria S3). En el grupo KHK-F, la densidad de este
tipo de células se mantuvo igual que en WT-F (Fig.3P.EJ).
ZHANG ET AL.
Figura 1. KHK2/2 y los ratones WT fueron alimentados con fructosa al 20% (KHK-F o WT-F) o dieta con glucosa al 20% (KHK-G o WT-G) durante 8
semanas. Los niveles de expresión de ARNm de las principales enterohormonas se midieron en ratones KHK-F, KHK-G, WT-F y WT-G en el
duodeno (A), el yeyunoB), el íleon,C), el ciegoD), y el colon proximal (MI). Los valores relativos se normalizaron a los niveles de WT-G (n = 6-8 /
grupo). Todos los valores son medios6 SEM. Las medias se compararon mediante ANOVA de 1 vía seguido de Tukeypost hoc prueba. *PAGS ,
0.05, **PAGS , 0,01, ***PAGS , 0,001.

Más bien, la expansión de CCK+ población celular se debió a
cambios de densidad en otros tipos de CCK+-Tipos de ECE. En el
íleon y el colon, esta expansión se debió principalmente al
aumento de la densidad de CCK+/ GLP-1+/ PYY2 células, mientras
que en el ciego, se debió casi en su totalidad a un aumento
drástico en la densidad de CCK+/ GLP-12/ PYY2 células (Fig.3P.EJ).
La diferenciación de las células progenitoras
intestinales en el linaje enteroendocrino implica la
expresión coordinada de varios factores de transcripción.
Probamos varios de ellos en busca de cambios en la
expresión (Fig. Suplementaria S3).Neurod1, un marcador
tardío para la diferenciación de células progenitoras
intestinales en el linaje EEC, se reguló significativamente
en el ciego del KHK-F en comparación con los ratones WT-
G. Además,Pax6, que actúa aguas abajo de Neurod1y es
un factor de transcripción clave para la diferenciación de
células positivas para GLP-1, se reguló significativamente
en el ciego del KHK-F en comparación con los otros 3
grupos.
La malabsorción de fructosa afecta la composición
y el metabolismo de la microbiota cecal
Nuestros datos apoyan la idea de que la fructosa malabsorbida llega
al tracto intestinal inferior. Esto podría afectar potencialmente a las
poblaciones de microbiota locales. Para abordar esta posibilidad,
investigamos la composición microbiana cecal basada en la
secuenciación de las regiones V3-V4 del ARNr 16S microbiano. A nivel
de OTU, no se observó ningún cambio significativo en la riqueza
entre los 4 grupos de ratones (Figura 4A), aunque el índice de
Simpson inverso indicó un número levemente significativamente
mayor de taxones efectivos en los ratones KHK-F en comparación
con WT-G (Fig.4B). Las matrices de disimilitud derivadas de Bray-
Curtis indicaron que la malabsorción de fructosa (KHK-F) contribuyó
significativamente (PAGS
0,01) a las diferentes composiciones observadas en las comunidades
microbianas del ciego (Fig.C). La abundancia relativa de los 5 filos
principales, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres,
Firmicutes y Proteobacteria, se vio significativamente afectada por la
malabsorción de fructosa (Fig.4D). En

LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL 7131

Figura 2. KHK2/2 y ratones WT fueron alimentados con fructosa al 20% (KHK-F y WT-F, respectivamente) durante 8 semanas. C.A) Distribución de CCK- (
A),GLP-1- (B), y CEE positivos para PYY (C) por área de sección (milímetros cuadrados) de mucosa en el íleon, ciego y colon de KHK-F y WT-F. D)
Contenido de péptido CCK en tejido ciego de KHK-F y WT-F. P.EJ9) Tinción de inmunofluorescencia representativa de células positivas para CCK (rojo) en
íleon (E, E9), ciegoF, F9), y dos puntosG, G9) de KHK-F (E, F, G) y WT-F (mi9, F9, GRAMO9) ratones (n = 5-6 / grupo). Valor de aumento original,3158.
Todos los valores son medias 6 SEM. Las medias se compararon con las de Student.t prueba. *PAGS , 0,05,
* *PAGS , 0,01, ***PAGS , 0,001.

En el nivel de phylum, el impacto de la malabsorción de fructosa
fue sorprendente a nivel de phyla menor con un marcado
enriquecimiento relativo de Actinobacteria y una mayor
disminución de la abundancia relativa de Proteobacteria y
Deferribacteres (Fig. 4D). Las diferencias en Actinobacteria y
Proteobacteria fueron validadas por qPCR en tiempo real (Fig.
Complementaria S1B). A niveles taxonómicos más bajos,
también se observaron diferencias principales al comparar
ratones KHK-F con los otros 3 grupos. La Fig.4E – L representan
las familias más abundantes de los 4 filos principales descritos
anteriormente. Dentro de Actinobacteria, a nivel familiar, los
ratones KHK-F mostraron un aumento significativo importante
en la abundancia relativa de Coriobacteriaceae y
Corynebacteriaceae, siendo esta última familia casi indetectable
en los otros 3 grupos (Fig.4E, F). Dentro de Bacteroidetes,
observamos una mayor abundancia del grupo Bacteroidales
S24-7 en KHK-F en comparación con los otros 3 grupos y de
Bacteroidacae en KHK-F en comparación con ratones KHK-G
yWT-G (Fig.4G, H).Dentro de Firmicutes, a pesar de que no hubo
cambios estadísticamente significativos en general en la
abundancia relativa de las 2 familias principales,
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae, a nivel de género y
especie, la abundancia relativa de algunos miembros dentro de
ambas familias aumentó fuertemente en el KHK-F en
comparación con WT- F (Figura 4Yo, J, M). Además, la abundancia
relativa de Lactobacillaceae aumentó drásticamente en KHK-F
(Fig.K)en comparación con los otros 3 grupos. El análisis de
abundancia diferencial a nivel de OTU reveló que esta mejora en
la familia de Lactobacillaceae está respaldada en gran medida
por el aumento en la abundancia relativa deLactobacillus
johnsonii (Figura 4METRO). De acuerdo con las observaciones a
nivel de filo de Proteobacteria, la abundancia de la familia
Desulfovibrionaceae se redujo significativamente en el KHK-F
como resultado de una disminución importante enDesulfovibrio

7132 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org ZHANG ET AL.

Figura 3. KHK2/2 y los ratones WT se alimentaron con fructosa al 20% (KHK-F o WT-F) durante 8 semanas. ANUNCIO‴) Tinción de triple
inmunofluorescencia representativa de CCK (rojo), GLP-1 (verde) y PYY (azul) en el íleon de ratones KHK-F. Cada juego de paneles(p. ej., A – A
‴) muestra el mismo campo de visión con los canales CCK, GLP-1 y PYY por separado y una imagen combinada. Las flechas rojas muestran los
EEC en los que solo se expresa CCK (CCK+/ GLP-12/ PYY2), las flechas amarillas muestran los EEC en los que se expresan CCK y PYY (CCK+/
GLP-12/ PYY+), las flechas verdes muestran los EEC en los que se expresan CCK y GLP-1 (CCK+/ GLP-1+/ PYY2), y las flechas azules muestran los
EEC en los que CCK, GLP-1 y PYY (CCK+/ GLP-1+/ PYY+) se expresan. P.EJ) Cuantificación de la densidad de las diferentes poblaciones de CCK+
células en el íleonMI), ciegoF), y dos puntosGRAMO) de KHK-F y WT-F (n = 5-6 / grupo). Todos los valores son medios6 SEM. Los recuentos y las
estadísticas se presentan en la Tabla complementaria S3.

simplex y a pesar de mayor D. desulfuricans abundancia (Fig.4L,
M). El análisis de abundancia diferencial identificó 25 especies u
OTU altamente significativas (ajustadas PAGS , 0.001) que fueron
ambos fuertemente (FC .8) positivamente diferencialmente
abundantes entre KHK-F yWT-F (Fig.4METRO) y muy prevalente
(abundancia .0.1% en al menos la mitad de las muestras). Entre
ellos, 6 especies u OTU exhibieron un FC. 1000, lo que significa
que se encontraron casi exclusivamente en ratones KHK-F. De
manera similar, 17 especies u OTU tenían una abundancia muy
reducida (FC, 1/8) de KHK-F en relación con WT-F.
Estos cambios en la composición de la comunidad de
bacterias se asociaron con cambios en la actividad metabólica de
la microbiota intestinal, según se evaluó primero mediante
cromatografía de gases (Figura 5A). Entre los principales AGCC
detectados, la cantidad de propionato aumentó en un 50% en el
contenido de ciego del KHK-F en comparación con el WT-F. De lo
contrario, solo SCFA menores (p.ej, valerato) o SCFA ramificados
como isobutirato e isovalerato mostraron una concentración
más baja en KHK-F en relación con WT-F.
1El perfil metabólico basado en H-NMR de los mismos extractos
cecales confirmó un cambio muy fuerte en la actividad metabólica de
la microbiota sobre la malabsorción de fructosa, como lo ilustra la
separación de los perfiles metabólicos cecales de WT-F vs.KHK-F en el
gráfico de PCA (Fig.5B). Un PLS-DA supervisado
Luego se ajustó el modelo para identificar los metabolitos
significativamente cambiados entre los 2 grupos (Fig.5C). Las señales
discriminatorias más prominentes pertenecen a la glucosa, que se
incrementó fuertemente en KHK-F en comparación con los ratones
WT-F (Fig.5CD). 1H-NMR también confirmó el aumento significativo
en los niveles de propionato detectado por cromatografía de gases y
reveló el aumento de succinato en el KHK-F en comparación con los
ratones WT-F (Fig.5CD). Varios otros metabolitos también fueron más
altos en ratones KHK-F que en WT-F, como lactato, alanina, uracilo,
fumarato e hipoxantina. Una señal de ácido biliar y las señales
adicionales que pertenecen a metabolitos no identificados fueron
menores en los ratones KHK-F que en los ratones WT-F (Fig.D). Es de
destacar que la fructosa en sí no se detectó en el ciego de KHK-F o
WT-F.
Los AB revierten parcialmente los efectos de la
malabsorción de fructosa sobre la expresión
de péptidos en el intestino delgado
Porque la alimentación con fructosa altera la microbiota
intestinal en KHK2/2 ratones, los tratamos con AB para probar
si una población bacteriana reducida o modificada evitaría o
causaría más cambios en la expresión de péptidos en el
tracto gastrointestinal distal en respuesta a la fructosa

LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL 7133

Figura 4. Composición de la microbiota del contenido de ciego recolectado de KHK2/2 o ratones WT alimentados con una dieta de fructosa al 20% (KHK-F
o WT-F) o glucosa al 20% (KHK-G o WT-G) durante 8 semanas (n = 6-8 / grupo). El análisis se basó en la secuenciación del rDNA 16S (región V3-V4).A, B)
Riqueza de especies observadas (A) e índice de Simpson inverso (B) como indicadores de a-diversidad. C) Análisis de coordenadas principales (PCoA) de
la disimilitud composicional de Bray-Curtis a nivel de OTU. D) Abundancia relativa media a nivel de filo en el contenido de ciego de cada grupo. E – L)
Las familias más abundantes de Actinobacteria (E, F), Bacteroidetes (G, H), Firmicutes (I – K), y proteobacterias
(L) phyla. METRO) Representación gráfica de OTUs diferencialmente abundantes entre KHK-F y WT-F que tienen una gran (FC .8 o FC, 1/8) y significativa
(PAGS , 0.001) tamaño del efecto además de abundancias relativas altas (.0.1% en al menos la mitad de las muestras). Cada OTU está representada por
un punto y coloreada de acuerdo con su clasificación taxonómica a nivel familiar. La taxonomía a nivel de género o especie también se indica, cuando
está disponible, junto a cada OTU. Una escala logarítmica (log-2) fue utilizado para el X eje. La riqueza de especies observada y los valores del índice de
Simpson inverso son medias6 SEM. Las medias se compararon mediante ANOVA de 1 vía seguido de Tukeypost hoc prueba. *PAGS , 0,05. ParaD, la
media de cada grupo se representa a lo largo del X eje y el y El eje se refiere a las abundancias relativas normalizadas. Los datos de abundancia relativa
de filo se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis. *PAGS , 0.05, **PAGS , 0,01, ***PAGS , 0.001 indica abundancias de phyla
significativamente diferentes entre KHK-F y KHK-G, #PAGS , 0,05, ##PAGS , 0,01, ###PAGS , 0,001 entre KHK-F y WT-F, y $$PAGS , 0,01, $$$PAGS , 0.001 entre
KHK-F y WT-G (significancia ajustada para la tasa de falso descubrimiento de PAGS , 0,05). ParaE – L, el y El eje se refiere a las abundancias relativas
normalizadas, las líneas indican la mediana y los recuadros indican el primer y tercer cuartiles. Los datos de abundancia familiar se compararon
mediante la prueba de Wilcoxon. *PAGS , 0.05, **PAGS , 0,01 en comparación con KHK-F.

malabsorción. El tratamiento AB no afectó el peso corporal, el
consumo de alimentos o la ingesta de bebidas en el WT o KHK2/2
ratones alimentados con fructosa en comparación con controles
de agua (sin AB) (Fig. suplementaria S4C.A). Las 4 semanas de
alimentación con fructosa agrandaron significativamente el
ciego en el KHK.2/2 ratones en comparación con el WT como se
muestra por el aumento en el peso del ciego lleno y vacío (Fig.
Suplementaria S4D, E). Las 4 semanas de tratamiento AB
exacerbaron el agrandamiento del ciego vacío en el KHK2/2 los
ratones alimentados con fructosa y también aumentaron el peso
del ciego lleno y vacío de los ratones WT. Sin embargo, 4
semanas de tratamiento AB redujeron drásticamente la cantidad
total de bacterias en el ciego a medida que
el resultado de una disminución importante en los 4 filos
principales (Fig. Suplementaria S4F). En el íleon, el tratamiento
AB, independientemente del estado de KHK, no tuvo un efecto
significativo sobre la expresión de ninguno de los péptidos
excepto por una leve disminución en Sst Niveles de ARNm (
Figura 6A). En los ratones KHK-F + AB, el tratamiento con AB
previno parcialmente el aumento dependiente de la mutación
KHK enCck expresión en el íleon pero no tuvo ningún efecto
sobre Gcgexpresión en comparación con los ratones KHK-F (Fig.6
A). En el ciego, el tratamiento AB por sí solo (WT-F + AB) tuvo un
efecto positivo significativo sobre la expresión de Nts y Gcg (
Figura 6B). El tratamiento AB redujo, en un 50 y 40%,
respectivamente, la regulación al alza de Cck y

7134 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org ZHANG ET AL.

Figura 5. Composición de metabolitos del contenido de ciego recolectado de KHK2/2 o ratones WT alimentados con una dieta de fructosa al 20% (KHK-F o WT-F) durante 8
semanas (n = 5-6 / grupo). A) Cuantificación de AGCC en contenido de ciego mediante cromatografía de gases. B) Gráficos de puntuación de PCA obtenidos de
1Espectros de H-NMR de extractos de contenido de ciego de KHK-F o WT-F. C) Gráfico de coeficientes O-PLS-DA relacionados con la discriminación entre
1Espectros de H-NMR de extractos de contenido de ciego de WT-F vs. KHK-F. D) Representación gráfica de barras de la integral relativa en unidades
arbitrarias (au) para diferentes metabolitos (glucosa, lactato, alanina y succinato) en el contenido de ciego. AUC, área bajo la curva; Reino Unido,
desconocido. Todos los valores son medios6 SEM; las medias se compararon con las de Studentt prueba. *PAGS , 0.05, **PAGS , 0,001.

Nts en el ciego de ratones KHK-F, lo que no conduce a
diferencias significativas entre WT-F + AB y KHK-F + AB.
El tratamiento AB en KHK-F + AB abolió por completo
el aumento deSst expresión observada en el grupo
KHK-F pero no tuvo efecto sobre Gcg nivel de
expresión. En el colon, la expresión demostró mayor
variabilidad y no se encontraron diferencias (Fig.6C).
con ratones KHK-F (Fig.7MI). Por el contrario, el tratamiento con
AB no redujo el aumento de succinato observado en el ciego de
los ratones KHK-F. En ambos genotipos, el tratamiento con AB
produjo mayores niveles de lactato.
Activación de la expresión de péptidos por metabolitos
microbianos en líneas celulares GLUTag y NCI-H716

El tratamiento con AB previno parcialmente los
cambios inducidos por la malabsorción de fructosa en
los metabolitos del contenido cecal
Ambos grupos AB (KHK-F + AB y WT-F + AB) tenían contenidos de
AGCC casi indetectables a excepción del acetato, para el cual el
contenido cecal se redujo en la misma proporción en relación
con KHK-F y WT-F (Figura 7A). El tratamiento AB creó un cambio
en los perfiles metabólicos del contenido de ciego obtenido por
1Análisis de H-NMR como se muestra en los resultados de PCA
(Fig.7B) y por 2 modelos PLS-DA supervisados (Fig.7CD). Los AB
evitaron casi por completo el aumento inducido por la fructosa
en los niveles de glucosa cecal en los ratones KHK-F + AB en
comparación
Para determinar si los metabolitos (glucosa, lactato, succinato y
propionato) identificados como aumentados en el ciego de
ratones KHK-F podrían regular Cck, Gcg, yNts Expresión de
ARNm, probamos el impacto de esos metabolitos en la
expresión del péptido enteroendocrino en células EEC, GLUTag y
NCI-H716 de ratón y humano, respectivamente. La exposición de
células GLUTag y NCI-H716 a propionato 2 mM aumentó
significativamente la expresión de ARNm deCck en comparación
con el control, mientras que la glucosa, la fructosa, el succinato y
el lactato no tuvieron ningún efecto (Figura 8A, B). Las células
GLUTag cultivadas con glucosa 25 mM aumentaron
significativamente Gcg La expresión de ARNm en comparación
con el control, mientras que las células cultivadas con fructosa
25 mM también aumentaron Gcg nivel de ARNm, pero no

LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL 7135


Figura 6. KHK2/2 y ratones WT fueron alimentados con fructosa al 20%
durante 3 semanas con (KHK-F + AB o WT-F + AB) o sin (KHK-F o WT-F)
tratamiento AB (n = 5-7 / grupo). Los niveles de expresión de ARNm
de péptidos intestinales se midieron en ratones WT-F, KHK-F, WT-F +
AB y KHK-F + AB en el íleon (A), el ciegoB),y el colon proximal (C). Los
datos se normalizaron a niveles en WT-F. Todos los valores son
medios6 SEM. Las medias se compararon mediante ANOVA de 1 vía
seguido de Tukeypost hoc prueba. *PAGS , 0,05,
* *PAGS , 0,01, ***PAGS , 0,001.
significativamente (P = 0,08) (Figura 8C). Ninguno de los metabolitos
analizados pudo aumentar Gcg expresión en células NCI-H716 (Fig.8
D). En las células GLUTag, Nts La expresión de ARNm se mantuvo sin
cambios después de la exposición a cualquiera de los metabolitos
probados (Fig.8MI), excepto para el lactato 10 mM, en el que una
tendencia a la regulación al alza (P = 0,06). Sin embargo, en NCI-
H716,Nts La expresión fue activada significativamente por
propionato (Fig.8F).
DISCUSIÓN
En nuestro modelo de ratones mutantes KHK alimentados con dieta
de fructosa, la malabsorción de fructosa tuvo un impacto
significativo en el intestino delgado (íleon, ciego y colon), induciendo
cambios importantes en la composición del ecosistema intestinal.
7136 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org
metabolismo de la microbiota y respuesta endocrina
intestinal. Encontramos que la malabsorción de fructosa
regula la identidad funcional del subtipo específico de EEC al
estimular la expresión deCck (y en menor medida Nts y Gcg)
en el íleon y el ciego. Las señales (p.ej, propionato) capaz de
activar las expresiones de péptidos en los EEC del intestino
delgado probablemente se originan a partir de
subproductos del metabolismo de la fructosa por la
microbiota que se modifica drásticamente por la
malabsorción de fructosa.
Cambios en la expresión CCK, CCK+ densidad celular y
CCK+ Subtipos de EEC en respuesta a la malabsorción
de fructosa
Se sabe desde hace mucho tiempo que Cck la expresión y
secreción tienen lugar en las CE del intestino superior. Sin
embargo, resultados recientes (38) han destacado una posible
secreción de esta hormona también en el intestino delgado.
Confirmamos la presencia de CCK+ células en el intestino
delgado de los ratones WT, y utilizando triple etiquetado con
anticuerpos anti-CCK, anti-GLP-1 y anti-PYY, identificamos varios
subtipos de CCK+ células. Por lo tanto, en condiciones normales
de absorción de fructosa (WT-F, Fig.3), el subtipo de EEC
predominante presente en el intestino delgado fue CCK+/ GLP-1+
/ PYY+, aunque también detectamos varios subtipos minoritarios
(Fig. 3 y Tabla complementaria S3). Otros péptidos, no probados
aquí, también podrían coexpresarse con CCK en el intestino
delgado. Sin embargo, nuestros datos corroboran claramente el
nuevo paradigma de que cada EEC puede expresar múltiples
péptidos intestinales (37, 39-42).
El cambio en el CCK+ El número de células juega un papel
importante en la respuesta intestinal a la malabsorción de
fructosa sin excluir el posible aumento en la producción de CCK
por célula. Curiosamente, la densidad del tipo de célula que
expresa CCK normalmente predominante, la CCK triple positiva+/
GLP-1+/ PYY+ células, no aumentó en los ratones KHK-F. De
hecho, las 3 regiones del intestino delgado respondieron de
manera diferente a través de la expansión de diferentes CCK+
subtipos de células. Si esto se debe a diferencias intrínsecas en
las 3 regiones intestinales o diferentes ambientes creados por
fructosa o interacciones fructosa-microbiota es una cuestión
importante que queda por abordar.
Nuestros resultados apoyan aún más la idea de la plasticidad del
sistema endocrino intestinal (43). Aunque permanece indeterminado
qué etapas de la diferenciación EEC (células madre, células
progenitoras, o células diferenciadas) se ven afectadas por el
entorno luminal, en el ciego los cambios en la expresión del patrón
de péptidos se asociaron con un aumento de laNeurod1 y Pax6 pero
no en Neurog3 y Math1expresión. Tanto Neurod1 como Pax6 son
factores de transcripción que se sabe que regulan la diferenciación
de las células que expresan CCK y GLP-1, respectivamente, y ambos
se consideran marcadores tardíos de la diferenciación de las células
progenitoras intestinales en el linaje EEC (44-46). Por el contrario,
Neurog3 es un marcador temprano que controla el compromiso de
los progenitores positivos para Math1 con el destino de las células
endocrinas (47). Por tanto, los cambios en el entorno luminal que
resultan de la malabsorción de fructosa pueden regular el proceso
de diferenciación aguas abajo de Neurog3.
ZHANG ET AL.
Figura 7. Composición de metabolitos del contenido de ciego recolectado de KHK2/2 o ratones WT alimentados con una dieta de fructosa al 20% durante
3 semanas con (KHK-F + AB o WT-F + AB) o sin (KHK-F o WT-F) tratamiento AB (n = 5-7 / grupo). A) Cuantificación de AGCC en contenido de ciego
mediante cromatografía de gases. B) Gráficos de puntuación de PCA obtenidos de 1Espectros de H-NMR de extractos de contenido de ciego de KHK-F,
KHK-F + AB, WT-F y WT-F + AB. C) Gráficos de coeficientes O-PLS-DA relacionados con la discriminación entre 1Espectros de H-NMR de extractos de
contenido de ciego de WT-F vs. KHK-F. D) Gráficos de coeficientes O-PLS-DA relacionados con la discriminación entre 1Espectros de H-NMR de extractos
de contenido de ciego de WT-F + AB vs. KHK-F + AB. MI) Representación gráfica de barras de la integral relativa para diferentes metabolitos (glucosa,
lactato, alanina y succinato) en el contenido de ciego. AUC, área bajo la curva. Todos los valores son medios6 SEM. Las medias se compararon mediante
ANOVA de 1 vía seguido de Tukeypost hoc prueba. *PAGS , 0.05, **PAGS , 0,01, ***PAGS , 0,001, ****PAGS , 0,0001.

El papel de la microbiota en la regulación de la
expresión del péptido intestinal en el íleon, el ciego
y el colon
Es poco probable que la fructosa cambie la expresión del péptido
intestinal en el íleon, el ciego y el colon. Primero, la fructificación
Este contenido probablemente aumenta sustancialmente en el duodeno y
yeyuno en ratones KHK-F (23). Sin embargo, no hay cambios
en Cck u otra expresión de péptidos se detectó en estas regiones. En
segundo lugar, no se detectó fructosa en el contenido ciego de los
ratones KHK-F, lo que sugiere su rápido metabolismo por las
bacterias del intestino delgado. Por otro lado, los cambios drásticos
en la composición de microbiota en ratones KHK-F y el efecto del
tratamiento AB sugieren que la microbiota, y más probablemente los
compuestos que se originan en el metabolismo bacteriano de la
fructosa, están involucrados en

LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL 7137

Figura 8. Cck (A, B), Gcg (C, D),y Nts
(E, F) Expresión de ARNm en células
GLUTag y NCI-H716,
respectivamente, incubadas durante
24 h con glucosa 1 mM (control) o
glucosa 25 mM, fructosa 25 mM,
succinato 2 mM, lactato 10 mM,
propionato 2 mM o glucosa 25 mM +
10 metroM forskolina + 10 metroM 3-
isobutil-1-metilxantina (FSK / IBMX) (
n = 3 / grupo para GLUTag y n = 4 /
grupo para NCI-H716). Los valores
relativos se normalizaron a niveles
de control. Todos los valores son
medios6 SEM. Las medias se
compararon mediante la prueba de
Kruskal-Wallis seguida de la prueba
de comparación múltiple de Dunn. *
PAGS , 0,05.

la respuesta de la CEE a la malabsorción de fructosa. Varios estudios
han demostrado que los cambios en el ecosistema intestinal pueden
afectarL-densidad y función celular (48, 49), y más específicamente, la
falta de bacterias se asoció con un aumento enL-densidad celular y
Gcg niveles de expresión (20, 21). Curiosamente, en nuestro estudio,
el agotamiento bacteriano por sí solo dio como resultado una
regulación moderada deCck, Gcg, y Ntsexpresión en el ciego
independientemente del genotipo. Esto confirma los estudios
previos centrados en la regulación deGcg expresión (20, 21) y
plantea la posibilidad de que existan metabolitos bacterianos que
puedan ejercer un efecto represivo sobre la expresión de varios
péptidos, entre ellos Cck. En el ciego, este efecto puede interferir con
nuestra capacidad para detectar una reversión potencialmente
completa de la malabsorción inducida por fructosa. Cck sin embargo,
nuestro estudio descubrió el potencial de la microbiota intestinal
para regular Cck expresión. Este papel de la microbiota también está
respaldado por nuestras observaciones de que el propionato, un
AGCC producido por bacterias, puede activar específicamente la
expresión deCck en líneas celulares GLUTag y NCI-H716 de ratón y
humano, respectivamente.
El papel potencial del propionato, la glucosa y el lactato en
la regulación de los péptidos intestinales en respuesta a la
malabsorción de fructosa
El aumento concomitante de Cck, Gcg, y Nts La expresión en el
ciego plantea la idea de un posible mecanismo de activación
común. Debido a que el propionato, el lactato, la glucosa y el
succinato eran los principales metabolitos microbianos que
aumentaban en el ciego en respuesta a la malabsorción de
fructosa, eran candidatos plausibles para la activación deCck,
Gcg, y Nts expresión. Curiosamente, nuestroin vitro Los
resultados indicaron que la expresión de Nts y Cck está regulado
por el propionato, pero también que cada péptido podría estar
regulado por diferentes metabolitos que, sin embargo, son
todos resultantes del metabolismo de la fructosa por parte de la
microbiota intestinal.
De nuestro análisis de metabolitos y el in vitro
experimento utilizando células GLUTag y NCI-H716, el
propionato es el candidato más fuerte para la activación de
Cck expresión. Se ha demostrado que regula la secreción de
GLP-1 y PYY.en vivo y in vitro50, 51) y aquí te mostramos

7138 Vol. 33 junio 2019 El diario FASEB X www.fasebj.org ZHANG ET AL.

por primera vez que también puede regular al alza Cck
expresión. En las células NCI-H716, el propionato también activa
la expresión deNts. Los efectos del propionato sobre las células
intestinales están mediados principalmente a través de
receptores acoplados a proteína 2 G, receptor de ácidos grasos
libres (FFAR) 2 y FFAR3 (51, 52). Curiosamente, se encontró FFAR3
en células positivas para CCK en el duodeno y en células
positivas para NTS en el íleon y el colon (53). El propionato
también es un inhibidor de las histonas desacetilasas (54); por lo
tanto, también puede regular la expresión génica mediante el
aumento de la acetilación de histonas (55). Hasta donde
sabemos, ningún estudio se ha centrado en la regulación de CCK
por SCFA, probablemente porque, hasta hace poco, se pensaba
que la abundancia de CCK en el íleon, ciego y colon era
insignificante (56).
También encontramos que la malabsorción de fructosa se
asocia con un aumento dramático en el contenido de glucosa en
el ciego del KHK-F, que probablemente participe en el aumento
de Gcg expresión y GLP-1+ densidad celular en el íleon y el ciego.
De hecho, incluso en el intestino delgado, L-células parecen ser
capaces de detectar la glucosa (37), y como lo demostraron otros
y lo confirmaron aquí en las células GLUTag, la glucosa es un
potente activador de Gcg expresión. Si la glucosa participa en el
cambio de la expresión de CCK y CCK+ La densidad celular en el
intestino delgado de KHK-F queda por aclarar. En vivo, Las
células I duodenales que secretan CCK no parecían estar
equipadas para detectar el azúcar (57). Con base en esto y en la
falta de aumento deCck expresión en respuesta a la glucosa en
las células GLUTag y NCI-H716, la regulación de CCK por la
glucosa en el intestino delgado parece poco probable. Sin
embargo, la regulación de CCK+ Las células del intestino delgado
pueden diferir de las del intestino delgado superior, como se
conjetura fuertemente para el L-células (37).
El lactato, que también se incrementó en el ciego de los
ratones KHK-F, puede estimular Nts expresión en células
GLUTag. Por tanto, podría ser el componente regulador que
activeNts expresión en el ciego del KHK-F. El lactato envía
señales a través del receptor acoplado a proteína G GPR81
(58) o es transportado a las células intestinales por los
transportadores de monocarboxilato (59). La expresión de
GPR81 en el intestino no está bien documentada (60). Los
miembros de la familia de los transportadores de
monocarboxilato se expresan ampliamente a lo largo del
intestino; sin embargo, aún no se ha explorado su presencia
específica y función potencial en las CEE. El succinato, que
después de la glucosa mostró el aumento más fuerte en el
ciego de los ratones KHK-F, no estimulóCck, Gcg, o Nts
Expresión de ARNm en células GLUTag o NCI-H716. Señales
de succinatovía Receptor GPR91 (61), y no se sabe si GPR91
se expresa en las células GLUTag y NCI-H716, por lo tanto, el
papel de señalización del succinato en vivo No puede ser
excluido.
Cambios en la composición y metabolitos
de la microbiota en respuesta a la
malabsorción de fructosa
Proponemos que la glucosa, el lactato, el propionato y el
succinato son subproductos del metabolismo de la fructosa por
LA MALABSORCIÓN DE FRUCTOSA AFECTA LA RESPUESTA ENDOCRINA INTESTINAL
poblaciones de bacterias intestinales que se expanden en el
intestino distal en respuesta a la malabsorción de fructosa. El
efecto más llamativo y significativo que observamos fue el
aumento en abundancia de la familia Lactobacillaceae,
especialmenteLactobacillus johnsonii, en el ciego del KHK-F.
Debido a que los carbohidratos, incluidas la sacarosa y la
fructosa, son la principal fuente de energía que favorece el
crecimiento de Lactobacillaceae (62), estos resultados apoyan la
hipótesis de que la fructosa no absorbida se estaba moviendo
hacia el ciego para convertirse en una fuente de carbono clave
para las bacterias del intestino delgado. La fructosa en sí no se
detectó en el ciego de los ratones KHK-F y probablemente se
convirtió en glucosa (12), que aumentó drásticamente. Un total
de 3 vías metabólicas pueden convertir la fructosa en glucosa en
las bacterias (Fig. Complementaria S5), y las 3 pueden ser
desplegadas por las bacterias que aumentaron en abundancia
relativa en el grupo KHK-F.
Entre los diversos AGCC del contenido cecal, solo el
propionato aumentó en respuesta a la malabsorción de
fructosa. Normalmente, los AGCC se originan por la
fermentación de carbohidratos no digeribles por las
bacterias intestinales (63). En los ratones KHK-F, el aumento
en la concentración de propionato probablemente se deba a
la fermentación de la fructosa malabsorbida.vía glucosa (Fig.
complementaria S5). Un total de 2 vías podrían contribuir a
la formación de propionato bacteriano a partir de
carbohidratos: la vía del succinato y la vía del acrilato (Fig.
Complementaria S5) (64). En el ciego de los ratones KHK-F, el
nivel de algunos intermedios de la vía succinato (es decir,
fumarato y succinato) o vía acrilato (es decir, lactato) fueron
mayores que en el WT-F, lo que confirma que ambas vías
sintéticas fueron estimuladas por la malabsorción de
fructosa. Sin embargo, la acumulación de succinato en el
contenido cecal de KHK-F sugiere que la parte de la ruta del
succinato que actúa aguas abajo del succinato era ineficaz.
Por otro lado, las Lachnospiraceae, que aumentaron en el
grupo KHK-F (Fig.4J), tienen la subunidad de lactoil-CoA
deshidratasa a gen (64), y pueden ser las principales
bacterias que apoyan la producción de propionato a través
de la vía del lactato.
A pesar de que el tratamiento AB eliminó casi por completo el
propionato, el Cck la expresión sólo se impidió parcialmente en
los ratones KHK-F + A, especialmente en el íleon. Por lo tanto,
además del propionato, podría haber otros compuestos que
responden a la malabsorción de fructosa, quizás menos
sensibles al tratamiento con AB, que también pueden inducirCck
expresión.
Curiosamente, se ha sugerido el papel de CCK en el dolor visceral
inmediato en ratones y seres humanos (65-67). En los seres
humanos, la malabsorción de fructosa se ha asociado con
concentraciones séricas elevadas de amilasa y lipasa (68).
Curiosamente, se sabe que la liberación de lipasa y amilasa es
estimulada por CCK (69), lo que respalda la idea de que la CCK
también puede estar elevada en el plasma de pacientes
diagnosticados con una afección de malabsorción de fructosa. Se
necesita una caracterización adicional del contenido plasmático y
cecal de los pacientes con malabsorción de fructosa para probar esta
hipótesis. Sin embargo, nuestros resultados proporcionan una
posible explicación del dolor experimentado por los pacientes con
mala absorción de fructosa e identifican una serie de posibles puntos
de entrada terapéuticos para aliviar esta afección.
7139
CONCLUSIONES
Demostramos que, en respuesta a la malabsorción de fructosa, CCK
es la hormona intestinal regulada al alza más alta en el íleon y el
ciego. También demostramos por primera vez que metabolitos
microbianos como el propionato pueden regular la expresión de
CCK. Nuestros resultados confirmaron la plasticidad de los EEC en
respuesta a cambios en el ambiente luminal. Es importante destacar
que demostramos que esta respuesta a los cambios en el entorno
luminal puede ser específica del subtipo de ECE. En nuestro sistema,
solo algunos CCK+-Los subtipos de ECE, definidos por la combinación
de hormonas que expresan, aumentaron en su densidad en
respuesta a la malabsorción de fructosa. Si el CCK+/ GLP-12 o CCK+/
GLP-1+ las células difieren notablemente en su capacidad de
respuesta funcional y los roles fisiológicos serán temas interesantes
para una evaluación futura. Por lo tanto, la naturaleza de la
respuesta de EEC a cambios específicos del entorno luminal puede
ser una de las características definitorias de los subtipos de EEC con
identidades funcionales distintas.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Los autores agradecen a JP Furet (Instituto Micalis, INRA, Jouyen-
Josas, Francia), F.Rouyer (Instituto de Neurociencia Paris-Saclay,
Université Paris Sud, CNRS, Université Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette,
Francia), y SP Shirazi-Beechey (Instituto de Biología Integrativa,
Universidad de Liverpool, Reino Unido) por compartir reactivos y
equipos. Los autores agradecen a la plataforma bioinformática INRA
Migale (http: //migale.jouy. inra.fr/)para proporcionar recursos
computacionales, la plataforma de secuenciación de alto
rendimiento Genotoul (http: //bioinfo.genotoul. fr /),y la instalación
de histología de UMR 1313 Génétique Animale et Biologie Intégrative
(GABI). Este trabajo contó con el apoyo de becas del Institut
Benjamin Delessert y del INRA. El China Scholarship Council (CSC) y
las becas de doctorado financiadas por INRA para XZ Los autores
declaran no tener ningún conflicto de intereses.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
X. Zhang, A. Grosfeld, E. Williams, RP Ferraris, JC Fritton y
V. Douard diseñaron la investigación; X. Zhang, A.
Grosfeld, E. Williams, S. Barretto, L. Smith, C. Philippe,
F. Devime, N. Dourmap, P. Larraufie, JF Rehfeld, S. Ellero-
Simatos y V. Douard realizó la investigación; X. Zhang, A.
Grosfeld, D. Vasiliauskas, M. Mariadassou, C. Philippe, JF
Rehfeld, S. Ellero-Simatos y V. Douard analizaron los
datos; A. Grosfeld, D. Vasiliauskas, C. Herberden, S. Ellero-
Simatos y V. Douard escribieron el manuscrito; D.
Vasiliauskas, C. Melchior, G. Gourcerol, N. Lapaque, P.
Larraufie, HM Blottière, P. Gerard, RP Ferraris, JC Fritton y
V. Douard contribuyeron a la discusión; V. Douard tiene la
responsabilidad principal del contenido final; y todos los
autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
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Recibido para publicación el 1 de agosto de 2018.
Aceptado para publicación el 18 de febrero de 2019.
ZHANG ET AL.