Análisis Microbiológico Industrial

HIERBAS Y ESPECIAS

Las hierbas y especias son altamente valoradas por sus sabores, colores y aromas,
empleándose ampliamente en la preparación de alimentos en todo el mundo. Las
especias se cultivan generalmente en regiones tropicales y subtropicales, y las hierbas
en regiones templadas, sin embargo, cualquiera que sea la región de producción, estos
materiales están expuestos a contaminación microbiana en las varias etapas
productivas: pre y pos cosecha, procesos de pre almacenamiento, almacenamiento,
distribución, venta y uso.

Originalmente se añadían a los alimentos para cambiar o mejorar el sabor, olor y/o
color, así como para incrementar su vida útil a causa de su naturaleza antimicrobiana y
sus características antioxidantes (Madhavi y col., 1996; Draughon, 2004). En el caso de
las hierbas aromáticas, se utilizan las hojas, troncos, flores y raíces de la planta,
mientras que las especias incluyen las hierbas y las semillas aromáticas (Codex
Alimentarius, 1991; Leung y Foster, 1996). De acuerdo con la comisión del Codex
Alimentarius (1995), el termino especias, que incluye las plantas aromáticas desecados
o a las mezclas de los mismos, utilizados para sazonar, condimentar y dar aroma o
sabor a los alimentos. Este término se aplica por igual a las especias enteras,
quebradas o molidas.

MICROORGANISMOS CONTAMINANTES DE ESPECIAS Y HIERBAS

La mayoría de las especias y hierbas se cultivan aun empleando métodos tradicionales
y son por lo tanto sujetas a mayor contaminación microbiana que las producidas en
forma tecnificada. Además las plantas que las producen crecen a poca altura, lo que
aumenta la posibilidad de contaminación por microorganismos del suelo.

En general, las bacterias patógenas (Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus) se encuentran en forma ocasional. Sin embargo se ha
documentado brotes de salmonelosis originados por el consumo de especias
contaminadas como pimienta negra (D´ Aous, 1994), chile, cúrcuma, paprica (Littley
col. 2003) y anís (Koch y col., 2005). Salmonella spp, es de especial importancia debido
a la popularidad de los alimentos listos para el consumo en los países industrializados
(ICMSF, 2005), y por la tradición de consumir alimentos preparados en las calles en los
países en vías de industrialización. Sin embargo, en un amplio estudio realizado en 303
muestras de especias y hierbas secas (albahaca, mejorana, menta, eneldo, apio, perejil,
comino, alcaravea, anís, hinojo, cilandro, pimienta negra, manzanilla y azafrán, entre
otras), Abou Donia (2008) reporto que las mayores cuentas de bacterias aerobias se
encontraron en menta (10⁸ UFC/G), seguida por manzanilla y perejil (10⁷) y las
menores cuentas se encontraron en pimienta negra (10ᶟ) y azafrán (10⁴)

Este autor también reporta la presencia de Staphylococcus aureus en albahaca menta.

B. subtilis, B. cereus y C. perfringens están también relacionados con enfermedades

transmitidas por alimentos; se encuentran con frecuencia en especias y hierbas,
generalmente a niveles inferiores a 10ᶟ UFC/g, insuficientes para causar infecciones
(Little y col., 2003), pero debido a que sus esporas son resistentes a temperaturas de
cocción, se multiplican a niveles arriba de 10⁶ UFC/g durante el almacenamiento
posterior a temperatura ambiente. Por lo tanto, el peligro sanitario está latente
cuando los alimentos se sazonan con especias o hierbas contaminadas y no se
satisfacen las condiciones de proceso temperatura-tiempo necesaria para la
inactivación de las esporas, además del efecto del almacenamiento posterior a
temperatura inadecuada.

Las esporas de Bacilus cereus se encuentran con frecuencia en los rizomas de plantas
como el jengibre y de algunos miembros del genero Capsicum, como la pimienta de
cayena y la paprika. Una de las especies más empleadas a nivel mundial, la pimienta,
es fácilmente contaminada por microorganismos; los aerobios comúnmente llegan al
orden de 10⁷ UFC/g, así como esporas de Bacillus spp. Otras especias contaminadas
fácilmente son el jengibre, los chiles y la paprika.

En muestras analizadas en México (García y col., 2001) se encontró una contaminación

considerable (10⁵ a 10⁷ UFC/g) de mesofilos aerobios en muestras de ajo en polvo,
semillas de comino y pimienta negra, mientras que las menores cuentas (10² UFC/g) se
encontraron en orégano y hojas de laurel. Bacillus cereus, se presentó en 9,5% de las
muestras, la mayoría empacadas en bolsas de polietileno, Aspergillus niger en 29%,
Rhizopus sp. En 19% y Penicillium sp. Y Cunninghamella en 8%.

Aunque las bacterias termófilas son una microbiota nativa de las especias, se
encuentran generalmente en números muy bajos. Algunos miembros de la familia
Enterobacteriaceae están presentes en hierbas y especias a niveles arriba de 10⁶
UFC/g, mientras que los coliformes totales pueden estar a niveles del orden de 10⁴
UFC/g. en un estudio realizado por Wójcik-Stopczyska y col. (2009) en albahaca,
mejorana, orégano, ajedrea, estragón y tomillo secos, reportaron que la mayor
población de bacterias mesófilas aerobias se encontró en albahaca (10⁵ UFC/g),
seguida por mejorana (10⁴) y estragón (10ᶟ), mientras que las mayores poblaciones de
bacterias termófilas aerobias estuvieron presentes en albahaca (10⁴), seguida por
mejorana y tomillo (10ᶟ). Las cuentas totales del orden de 10ᶟ a 10⁶ UFC/g son
comunes en clavo, nuez moscada y la mayoría de las hierbas.
En las hierbas, las cuentas de levaduras y mohos son alrededor de 10ᶟ a 10⁴ UFC/g, los
mohos se encuentran como esporas, más que en su forma de micelio vegetativo,
principalmente los géneros Aspergillus y Penicillium, y los menos frecuentes Alternaria,
Absidia spp., Mucor spp., Rhizoctomia y Cladosporium spp. La menor contaminación
por mohos se observó en cilantro y comino, mientras que la mayor infección fue en
azafrán e hinojo. Sin embargo, no se detectó la presencia de aflatoxinas (B1, B2, G1 Y
G2) Abou Donia, 2008).

CONTROL MICROBIANO EN ESPECIAS Y HIERBAS

La contaminación Microbiana en especias y hierbas puede ser controlada por varias
técnicas, las más empleadas o eficientes son la fumigación, la erradicación y los
tratamientos térmicos.

Fumigación

El óxido de etileno se reportó por primera vez como un método bactericida eficiente
en los últimos años de la década de 1920; desde entonces se ha empleado como
control microbiano en especias, aunque su uso disminuyo desde 1990, cuando se
empezaron a aplicar métodos de irradiación. El óxido de etileno es un senitizante
recomendado por varias industrias, entre otras las de Estados Unidos (Rushing, 2006),
Australia y Nueva Zelanda, las cuales establecen un límite de uso de 20 mg/kg (ANZFA,
2001). Otros compuestos empleados como fumigantes son el óxido de propileno, el
dióxido de cloro y el ozono. El óxido de propileno es muy eficiente en el control de E.
coli O157:H7 y Salmonella Enteritidis (Danyluk y col., 2005). El dióxido de cloro es un
biocida sumamente eficiente (Simpson y col., 1993) aunque puede producir sabores
residuales. La sanitación con ozono es una metodología empleada en la industria
láctea; tiene la ventaja de degradar pesticidas con mayor eficiencia que el tratamiento
con cloro (Liu y Ruan, 2004). Otros fumigantes son el dióxido de azufre, el bromuro de
metilo y el amoniaco, todos estos son inhibidores de microorganismos con variada
eficiencia, pero sin dejar subproductos residuales.

Irradiación

Las hierbas y especias son algunos delos productos alimentarios en los que más se ha
aplicado esta tecnología, ya que no se afectan sus propiedades físicas o químicas, aun
con dosis tan alta como 10 KGray, a las cuales la población microbiana se reduce en
cinco ciclos logarítmicos. Los alimentos irradiados están obligados a manifestar dicho
proceso en su etiqueta. Sin embargo, debido a la percepción adversa del consumidor
acerca de los procesos de irradiación, esta no se aplica en muchos países (Eustice,
2004).

La radiación gamma, junto con la fumigación con óxido de etileno, se consideran como
los métodos estándar de desinfección de hierbas y especias. Sin embargo, se han
reportado las posibles alteraciones en factores de calidad microbiológica, fisioquima y
sensorial debido a la irradiación. Un caso excepcional es el cilantro, una hierba de alto
riesgo por su facilidad de contaminarse por microorganismos; al ser irradiada se
reduce considerablemente la población microbiana sin dañar su calidad ( Fan y col.,
2003). La radiación gamma no modifica la cantidad de radicales libres o de compuestos
antioxidantes en especias y hierbas. Las dosis de 10 a 50 KG se consideran que
penetran al centro de los productos en cantidades adecuadas para reducir las
poblaciones microbianas a niveles seguros.

El bombardeo de electrones (e-beam) es otro método de irradiación de hierbas y

especias, aunque su penetración es mínima en solidos compactos, además puede
afectar a los compuestos bioactivos presentes. Es, por lo tanto, una tecnología en
desarrollo.

La radiación ultravioleta se emplea para desinfección superficial, ya que no tiene

capacidad de penetración al producto, empleándose como forma de inactivación
parcial de los microorganismos en la superficie (Rushing, 2006). La radiofrecuencia y el
ultrasonido son dos metodologías que se han probado en la reducción de
microorganismos en sólidos, con resultados variables pero poco concluyentes.

Procesamiento térmico

Es el método más empleado en muchos países para la reducción de poblaciones

bacterianas en hierbas y especias; se aplica en tratamientos con vapor, por extracción
térmica o por lecho fluidizado. Estos tratamientos reducen la población de células
viables en 3 o 4 ciclos logarítmicos, además de disminuir lo0s niveles de esporas. Sin
embargo, las propiedades físicas, químicas y sensoriales pueden afectarse.

Tratamiento con vapor

Opera en un sistema continuo en polvos, especias completas o hierbas. La reducción

de la población microbiana se logra por una combinación de calor húmedo y
temperatura a 121°C y presión de 2 bares, lo que da como resultado una cuenta total
final en el producto de 10ᶟ UFC/g, humedad promedio de 11% y actividad de agua
promedio de 0.6, dependiendo del tipo de producto. El contenido final de humedad
puede ocasionar problemas de crecimiento de mohos durante el almacenamiento.

Extrucción

Es un proceso continuo aplicado a hierbas y especias trituradas o en polvo. La

reducción microbiana se logra por una combinación de temperatura y presión debida a
un esfuerzo cortante, suficientemente alta para alcanzar esterilización comercial. La
cuenta total de los materiales producidos es 10ᶟ UFC/g, 14% de humedad máxima
promedio y actividad de agua promedio de 0,6, dependiendo del producto final. El
principal problema de este proceso es que el producto puede cubrirse hasta 30% con
el acarreador, formulado a base de carbohidratos de cereales.

Lecho fluidizado

Las partículas a secar fluyen bajo condiciones controladas, suspendidas en una

corriente de aire, formando un lecho de poco espesor. Posteriormente, el producto es
enfriado a temperatura ambiente. La reducción de la población microbiana es de 3
ciclos logarítmicos, con una cuenta total final promedio de 50,000 UFC/g, dependiendo
del producto. Sin embargo, sobreviven las esporas de microorganismos aerobios
(Torbedo, 2001).

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS Y ACEITES DE HIERBAS Y

ESPECIAS
Las hierbas y especias pueden incorporarse a los alimentos en estado fresco, secas,
como aceites esenciales o como extracto. Las plantas o partes de las plantas que se
utilicen para la preparación de especias secas pueden desecarse natural o
artificialmente; son una fuente importante de componentes antimicrobianos. Ejemplos
de estos compuestos son el cinamaldehido (canela), timol y carvacol (oregano),
eugenol (clavo), timol (tomillo) y vainillina (vainilla) (Fitzgerald y col., 2005).

Los extractos son formas concentradas de compuestos naturales obtenidas por

tratmi9ento de materiales crudos con un disolvente, removiendo posteriormente el
disolvente completa o parcialmente en la preparación. Los aceites esenciales son
mezclas complejas de una gran variedad de compuestos orgánicos; generalmente
representan los principios odoríferos de la plantas de las cuales se obtienen, por ello se
les considera como aceites volátiles, generalmente se obtienen por destilación (Viuda-
Martos y col., 2010). Los extractos y los aceites esenciales se obtienen de varias partes
de las plantas, tales como las flores, botones florales, hojas, cortezas, tallos, raíces y
semillas. Están compuestos por monoterpenos, sequiterpenos y sus derivados
oxigenados tales como alcoholes, aldehídos, esteres, éteres, cetonas y fenoles, y son
los responsables de las propiedades antimicrobianas (Viuda-Martos y col., 2010).

La composición, estructura y grupos funcionales de los compuestos juegan un papel

determinante en su actividad antimicrobiana. Regularmente, los compuestos con
grupos fenólicos (fenoles mono o polioxihidricos) son los más efectivos (Sӧkmen y col.,
2004; Singh y col., 2005). Sin embargo, algunos constituyentes no fenólicos son
también inhibidores efectivos del crecimiento de microorganismos, como el
isotiocianato de alilo, alicina y cinamaldehido, entre otros (Draughon, 2004; Holley y
patel, 2005).
Los fotoquímicos bioactivos pueden dividirse en: fenoles, polifenoles, quinonas,
flavonas, flavonoides, flavonoles, tatinos, cumarinas, torpenoides, alcaloides, lecitinas
y polipetidos. Muchas hierbas, como el tomillo, contienen múltiples compuestos
activos, los cuales pertenecen a los grupos mencionados. Por ello, las especias enteras
presentan actividad antimicrobiana. Sin embargo, los aceites esenciales y extractos
derivados de los mismos también presentan efecto inhibitorio sobre microorganismos
patógenos y de descomposición, debido a que están altamente enriquecidos de
compuestos bioactivos (Draughon, 2004).

Mecanismo de acción

Se han reportado varios mecanismos a través de los cuales los extractos y aceites
esenciales inhiben el crecimiento y la actividad de los microorganismos. En general, los
compuestos fenólicos y los compuestos aromáticos, alteran la estructura y función de
la membrana citoplasmática. La salida de catines monovalentes como el potasio, es el
primer síntoma de daño a la membrana; posteriormente se presenta el flujo de
constituyentes citoplasmáticos, incluyendo ATP. Frecuentemente la pérdida de la
permeabilidad selectiva de la membrana es la causa de la muerte celular. Otras causas
de la alteración en la función de la membrana son la consecuente alteración de la
bomba de protones, ya sea por cambios en el transporte de iones a través de la
membrana o por despolarización de la misma, la interferencia en el sistema de
generación de energía (formación de ATP) en la célula o la inhibición de enzimas
involucradas en la producción de ATP (Jeonh-Ho y Hong, 2009; Viuda-Martos, 2010).
Por otro lado, los compuestos fenólicos se difunden a través de la membrana
alterando la sensibilidad o resistencia de las células (Holley y Patel, 2005).

Dentro de los compuestos responsables de la actividad antimicrobiana de los

extractos y aceites esenciales se encuentran los monoterpenos, como el terpinen-4-ol,
que inhibe la respiración en E. coli y S. aureus debido a que puede solubilizarse dentro
de la membrana provocando un aumento en su volumen, lo cual tiene como
consecuencia un incremento en la permeabilidad y, por lo tanto, una alteración en el
gradiente de pH interno. Otro compuesto importante por su efecto antimicrobiano es
el cinamaldehido, compuesto que imparte el olor característico a los aceites esenciales
de canela; su modo de acción contra Enterobacter aerogenes es a través de la
inactivación de las descarboxilasas endógenas (Holley y Patel, 2005).

Los aceites de tomillo, orégano y mejorana inhiben el crecimiento miceliar y la

germinación de las conidias de Penicillium digitatum, debido a la formación de enlaces
puente de hidrogeno entre los grupos de hidroxilo de los compuestos fenólicos
presentes en los aceites y los sitios activos de las enzimas fúngicas (Holley y Patel,
2005).
La vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehido) es el compuesto mayoritario de las
vainas de vainilla, es uno de los ‘principales saborizantes en el mundo. Su estructura
contiene un grupo aldehído, principal factor en la actividad antifungica contra
Aspergillus orizae, Penicillium expansum, Penicillium sp. , Saccharomyces cerevisiae y
Cándida sake, entre otros, debido a que es un grupo muy reactivo que puede formar
enlaces covalentes con el ADN y las proteínas. Otro grupo importante en su acción
inhibitoria es el hidroxilo unido a un fenol, que caracteriza a los compuestos fenólicos,
el cual puede reaccionar con los sitios activos de las enzimas a través de la formación
de puentes de hidrogeno o puede actuar como un transportador transmembrana de
cationes monovalentes (Fitzgerald y col., 2005).

El ácido cafeico (acido 3,4-dihidroxicinamico) es otro de los compuestos fenólicos con

actividad antimicrobiana que se encuentra ampliamente distribuido en las plantas. En
estudios realizados por Almajano y col., (2007) se encontró que este compuesto es
efectivo contra Pseudomonas aeruginosa, bacteria resistente a varios compuestos
fenólicos como el timol y carvacol; sin embargo, no tuvo efecto sobre E. coli, indicando
que la resistencia al ácido cafeico no depende de la composición de la membrana
celular el microorganismo, si no de la cepa de que se trate. De la misma manera se
observó que el efecto antimicrobiano del ácido cafeico es mayor cuando el pH del
medio es bajo; en estas condiciones se incrementa la proporción de moléculas no
disociadas del ácido en solución. Por lo tanto la actividad antimicrobiana de los
compuestos depende no solo de su estructura, si no de la condiciones delo medio
ambiente, de su concentración en el medio y del microorganismo sujeto a estudio
(Singh y col., 2005; Almajano y col., 2007; Min y Oh, 2009; Bozquez-Molina y col.,
2010).

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN SISTEMAS ALIMENTICIOS

Muchos de los extractos y aceites esenciales y sus componentes han demostrado
actividad antimicrobiana in vitro; sin embargo, cuando se han incorporado a un
producto alimentario se requieren concentraciones más altas (aproximadamente 1 a
3%) para obtener el mismo efecto (Smith-Palmer y col., 1998; Min y Oh, 2009). La
presencia de grasa, carbohidratos, proteínas, sal y el pH del alimento influyen en la
efectividad de estos agentes (Singh y col., 2005; Almajano y col., 2007; Min y Oh,
2009). Su potencia también se reduce cuando la actividad de agua del medio es baja.

Los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo fueron efectivos contra listeria
monocytogenes en caldo triptona de soya; presentan una concentración mínima
inhibitoria de 0,04, 0,075 y 0,03%, respectivamente. Para evaluar su actividad en
alimentos se adicionaron a queso con bajo (16%) y alto (30%) contenido de grasa; sin
embargo, se requirieron concentraciones de 1% de todos los aceites para reducir la
población a <1.0 log.₁₀ UFC/ml en quesos bajos en grasa. El aceite de clavo a una
concentración de 1% fue el único capaz de reducir la población a <1.0 log₁₀ UFC/ ml en
quesos altos en grasa; se requirieron concentraciones mayores a 1% de los aceites de
canela y tomillo para alcanzar un grado de inhibición similar obtenido con el aceite de
clavo. Estos resultados se debieron a que la grasa del queso formo una capa protectora
alrededor de la bacteria protegiéndola de los compuestos bioactivos presentes en los
aceites, o a que la fracción lipídica pudo adsorber a los agentes antimicrobianos
disminuyendo su concentración y efectividad en la fase acuosa (Holley y Patel, 2005).

Los productos elaborados a base de carne requieren altas concentraciones de aceites

esenciales para lograr la inhibición de los microorganismos contaminantes, debido a la
alta concentración de grasa y proteína en el alimento que puede ser utilizada como
nutriente por la microflora presente (Holley y patel, 2005)

El pH es un factor importante en la actividad delos compuestos presentes en los

aceites esenciales y extractos, debido a que determina el grado de ionización de los
ácidos fenólicos, lo cual influye en la hidrofobicidad de estos. El aceite de tomillo
incrementa su solubilidad a pH bajo, lo que provoca que se disuelva más fácilmente en
la fase lipídica de la membrana de las bacterias, potenciando su acción antimicrobiana
(Holley y Patel, 2005).

Actualmente se están desarrollando empaques activos que contienen aceites

esenciales, extractos o sus componentes, los cuales son liberados lentamente del
material del empaque y pueden inhibir más efectivamente a los agentes
contaminantes (Holley y Patel, 2005; Min y Oh, 2009; Bosquez-Molina y col., 2010). Se
ha utilizado con éxito la incorporación de isotiocianato de alilo (principal compuesto
antimicrobiano en el aceite de mostaza) en envases activos de pan de centeno, en
donde se ha logrado inhibir completamente el crecimiento de Aspergillus flavus,
Penicillium commune, Penicillium xorylophilum, Penicillium roqueforti y Penicillium
polonicum, entre otros (Holley y Patel, 2005). Min y Oh (2009) incorporaron aceite
esencial de orégano (Thymus capitatus) a cubiertas elaboradas a partir de colágeno de
pescado, las cuales se utilizaron para cubrir filetes de barbo, inoculados con Salmonella
typhimurium o E. coli O157:H7. La inhibición de ambas bacterias se alcanzó a
concentraciones de aceite esencial mayores a 2%. El aceite esencial de tomillo también
se ha utilizado para controlar el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides y
Rhizopus stolonifer en papaya, obteniéndose una reducción en el crecimiento de los
hongos filamentosos conforme se incrementó la concentración del aceite hasta 0.15%
(p/p); a mayores concentraciones la infección fue más severa por el efecto citotóxico
de sus componentes sobre las epidermis de la frita. Una forma de evitar el daño a las
frutas fue mediante la incorporación de aceite a películas comestibles sobre ambos
microorganismos (Bosquez-Molina y col., 2010).

La mayoría de los bioconservadores provenientes de hierbas y especias son

generalmente reconocidos como seguros (GRAS) para aplicarse en los alimentos que
los conforman, como en el caso de la vainillina (vainilla) y el cinamaldehido (canela)
(Smith y col., 2003; Draughon, 2004; Fitzgerald y col., 2005). Sin embargo; puede
presentarse una inusual hipersensibilidad a algunos de estos componentes por parte
de individuos.

El uso de bioconservador debe seguir un proceso de investigación química, estudios

epidemiológicos, datos clínicos, información demográfica, estudios farmacológicos u
experimentales con seres humanos 8incluyendo a la población sensible) y animales
para identificar si existe algún riesgo al consumir el alimento. Es esencial conocer el
promedio de ingestión diaria para asegurar que no haya consecuencias negativas tanto
nutricionales como de salud (Smith y col., 2003; Draughon, 2004).

CONCLUSIÓN
Las hierbas y especias son altamente valoradas por sus sabores, colores y aromas,
empleándose ampliamente en la preparación de alimentos en todo el mundo. Todas
las especias y hierbas son susceptibles de contaminación microbiana; la prevención de
esta se basa en observar buenas prácticas de higiene durante la producción en el
campo, cosecha y procesamiento, la cual debe incluir una etapa de descontaminación.

Paralelamente, un gran número de extractos y aceites esenciales de hierbas y especias

presentan actividad antimicrobiana. Esta propiedad ha sido empleada para su uso
como conservadores naturales, el cual se ha explorado ampliamente en alimentos. La
mayoría de estos bioconservadores son sustancias GRAS (generalmente reconocidos
como seguros) para aplicarse a los alimentos, aunque se han reportado casos de
hipersensibilidad en algunas personas. La selección de un antimicrobiano se debe
basar en la compatibilidad sensorial y química de sus componentes en el alimento a
tratar, su efectividad contra los microorganismos indeseables, su seguridad y costo.